CN115261252B - 一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用 - Google Patents

一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用，具体为一株Pseudomonasatacamensis，于2022年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.24395，本发明提供的阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)菌株溶磷量峰值高达1554mg/L，具有良好溶磷能力，本发明所提供的的菌剂可用于对小麦根腐病的生物防治，可降低小麦根腐病造成的种植损害；可促进小麦和玉米根系生长，并可以有效降解有机磷农药。

Description

一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用。
背景技术
磷是植物生长的必需大量元素，土壤作为植物磷素的供给源，其速效磷的含量直接影响着植物的生长发育，我国土壤之中含磷量约为40～2500mg/Kg，但95％以上的磷为无效磷，不能被植物吸收利用。而当季施用磷肥的利用率仅10％～15％，绝大部分被土壤中的钙、铁、铝等离子结合成了难溶的磷酸盐，无法被植物利用。磷肥的大量使用对生态环境和农业可持续发展造成了严重威胁。如何释放土壤中的磷元素提高作物的吸收利用率是现代农业发展的重要课题。
解磷微生物可以分解土壤中难溶的磷，显著提高土壤中速效磷的含量，从而增加植物对磷元素的利用率，减少或替代部分磷肥的使用。因此高效的溶磷微生物制备的的微生物菌剂等微生物肥料可以提高磷素的有效性，改善土壤肥力，保护生态环境和农业的可持续发展。
小麦作为我国主要粮食作物之一，广泛种植于北方大部分地区，作为重要的口粮粮食，小麦的产业发展稳产增收直接关乎国家粮食安全和社会稳定，小麦根腐病是影响小麦种植的一种土传病害，通常使用有毒农药进行防治，容易带来环境污染病原菌耐药性等诸多不利，对采用绿色生物防治提出迫切的需求。
中国专利文献CN111057666A(申请号：201911323360.4)公开了一株假单胞菌及其筛选方法与应用，该菌种溶磷量高达496mg/L，该菌应用于植物促生中，可提高蔬菜根系生长，促进蔬菜的生长，但是，该菌株的溶磷量较低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种解磷菌及其菌剂制备方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一株Pseudomonas atacamensis，于2022年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.24395。
上述菌种是由本公司技术团队分离于小麦根际土壤，菌株编号为YHTR 1.210702，经鉴定该菌为阿塔卡马假单胞菌Pseudomonas atacamensis。
上述Pseudomonas atacamensis菌株的培养方法，包括如下步骤：
(1)将Pseudomonas atacamensis菌株接种到液体活化培养基中，在28～35℃条件下，转速180-200rpm，培养24～36h，制得液体种子；
(2)将步骤(1)制得的液体种子，按照接种量以体积百分数计5％～10％接种于液体发酵培养基中，调控pH值至6.5～7.5、通气比为1:(0.5～1)、转速150～250转/分，在23～35℃培养24～48h，制得Pseudomonas atacamensis菌液。
根据本发明优选的，步骤(1)中液体活化培养基每升组份如下：
胰蛋白胨6～8g，酵母粉4～7g，葡萄糖3～5g，磷酸钙1～3g，氯化钠6～10g，余量水。
根据本发明优选的，步骤(2)中液体发酵培养基每升组份如下：
玉米粉8～12g，豆饼粉10～15g，糖蜜液5～10g，鱼粉1～5g，酵母粉1～5g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，磷矿粉1～4g，磷酸钙3～6g，余量水，调整pH值7～8。
根据本发明优选的，步骤(2)中制得Pseudomonas atacamensis菌液的有效活菌数≥150亿/mL。
一种微生物菌剂，包括Pseudomonas atacamensis菌株。
根据本发明优选的，所述微生物菌剂为上述培养方法制得的菌液。
上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在土壤改良中的应用。
根据本发明优选的，上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在土壤有效磷增加中的应用。
上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在植物种植中的应用。
根据本发明优选的，上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在植物促生、增产中的应用。
根据本发明优选的，上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在防治植物土传病害中的应用。
进一步优选的，所述土传病害为根腐病。
进一优选的，上述应用中，所述植物为玉米、小麦。
上述Pseudomonas atacamensis菌株或上述微生物菌剂在降解有机磷农药中的应用。
根据本发明优选的，所述有机磷农药为辛硫磷农药。
有益效果
1、本发明提供的阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)菌株溶磷量峰值高达1554mg/L，具有良好溶磷能力。
2、本发明提供的菌剂可应用于缺磷土壤中，可将土壤中难溶的磷转化为速效磷供植物吸收利用，减少磷肥使用，有效降解有机磷农药，从而减少环境污染，提高资源利用，实现较好的经济效益和社会效益。
3、本发明所提供的的菌剂亦可用于对小麦根腐病的生物防治，可降低小麦根腐病造成的种植损害；本发明提供的菌剂可促进小麦和玉米根系生长。
附图说明
图1为菌株YHTR 1.210702的解磷圈图片。
图2为菌株YHTR 1.210702对磷酸钙的解磷曲线图。
图3为菌株YHTR 1.210702菌剂不同使用浓度对小麦和玉米20天根部影响图；
图中：从左到右依次为CK、T6、T5、T4、T3、T2、T1。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
本发明提供的阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)简称为“菌株YHTR1.210702”。
实施例1
菌株YHTR 1.210702的筛选
在长势良好的小麦田中，采用随机多点采样，采样数10个，采样深度5-20cm，每个采样点取土50g置于无菌取样袋中，最终将所有土样均匀混合后选取10g，放入100ml无菌水三角瓶中震荡制成土壤悬液，稀释103、104、105倍涂布到无机磷固体培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g(或磷酸铁6g)，琼脂粉15～20g，水1000ml。33℃培养7d，选取周围有透明圈且无重叠的菌落进行划线分离，直至得到纯培养物，转接至LB固体培养基培养保存。
筛选到透明圈明显的菌株YHTR 1.210702，经鉴定为阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)。
阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)细胞形态呈杆状，革兰氏染色阴性，接触酶试验阴性，氧化酶试验阳性。
阿塔卡马假单胞菌(Pseudomonas atacamensis)于2022年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.24395。
实施例2
菌株YHTR 1.210702的解磷特性
分别配制难溶磷源为磷酸钙、磷酸铁、植酸钙的固体培养基，培养基配方如下：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g(或磷酸铁5g或植酸钙5g)，琼脂粉15～20g，水1000ml。将菌株YHTR1.210702依次接种在三种平板上，每个平板接种四点，33℃培养7d，观察菌株是否生长以及是否形成解磷圈，并记录解磷圈直径(单位D/cm)、菌落直径(单位d/cm)，计算D/d比值，以此来确定菌株YHTR 1.210702对不同难溶性磷的解磷能力与解磷效率。解磷结果见图1。菌株YHTR 1.210702对难溶性磷的溶解能力见表1，解磷圈直径与菌落直径比值大小以此为磷酸钙＞磷酸铁＞植酸钙，分别为3.02、2.34、2.16。
表1菌株YHTR 1.210702的解磷特性分析
D/cm d/cm D/d
磷酸钙 2.51 0.83 3.02
磷酸铁 1.36 0.58 2.34
植酸钙 1.34 0.62 2.16
由此可见，该菌株YHTR 1.210702具有显著的解磷溶磷效果。
实施例3
菌株YHTR 1.210702对磷酸钙的解磷曲线测定
采用LB液体培养基对菌株YHTR 1.210702进行活化，按体积比2％的接种量接种到含有150ml无机磷液体培养基的500ml三角瓶中，33℃、170r/min摇床培养，并以未接菌株YHTR1.210702的培养基为对照，每个处理三个重复，每隔24小时取样直至培养到7天。采用钼锑抗比色法检测样品中水溶性磷的含量，菌株YHTR 1.210702溶磷量计算中扣除空白对照。
无机磷液体培养基配方如下：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.036g，硫酸锰0.03g，磷酸钙10g，水1000ml。
解磷曲线见图2，由图2可知在第四天时溶磷量达到最大值1553.52mg/L，随后开始下降，培养到第七天时溶磷量降低到1052.79mg/L，可能是因为菌体大量繁殖消耗了部分可溶性磷，或是因为渗透压改变使磷在菌体内富集。
实施例4
含有菌株YHTR 1.210702微生物菌剂的制备
将菌株YHTR 1.210702接种到液体活化培养基中，在33℃条件下，经摇瓶培养36h，制得液体种子，将制得的液体种子按照接种量体积比10％接种于液体发酵培养基中，调控pH值至6.5～7.5、通气比为1:0.75、转速180转/分，温度在33±2℃培养48h，制得菌液即微生物菌剂。
所述微生物菌剂有效活菌数≥180亿/ml。
所述液体活化培养基组份如下：胰蛋白胨8g，酵母粉7g，葡萄糖3g，磷酸钙2g，氯化钠10g，水1000ml
所述液体发酵培养基每升组份如下：玉米粉8g，豆饼粉10g，糖蜜液5g，鱼粉5g，酵母粉3g，氯化钠10g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.1g，硫酸亚铁0.1g，磷矿粉4g，磷酸钙3g，余量水，调整pH值7～8。
实施例5
实施例4制备的微生物菌剂在土壤中解磷效果试验
取育苗盒，在育苗盒中加入缺磷土壤400g，分别以加入5ml、10ml、15ml、20ml实施例4制备的微生物菌剂为实验组1：T1、T2、T3、T4，并增加分别加入5ml、10ml、15ml、20ml灭活菌剂为实验组2：T5、T6、T7、T8。另以不加菌剂为对照组CK，在加入菌剂和灭活菌剂10d和20d后分别取样检测土壤中速效磷含量。数据结果见表2。由菌剂实验组T1-T4可知使用菌剂后土壤之中的速效磷可快速增加，10d后最大可为16.65mg/Kg是空白对照的4.76倍，20d后最大为38.57mg/Kg是空白对照的8.85倍。由灭活菌剂实验组T5-T8可知使用灭活菌剂后土壤之中的速效磷稍有增加，10d后最大仅为4.29mg/Kg是空白对照的1.22倍，20d后最大仅为5.08mg/Kg是空白对照的1.16倍。由于灭活菌剂实验组中本发明菌株已被灭活失去扩繁增殖能力，施用后数量不再增加，生理代谢活动亦停止，仅依靠原菌剂已有生理活性物质以及残留培养基组分等仍可起到一定效果但较之于未灭活的菌剂实验组结果相差悬殊；由试验可见本发明提供的微生物菌剂具备优异的解磷溶磷生理活性并在土壤中的解磷效果极佳。
表2使用菌剂后土壤中速效磷含量变化分析(速效磷含量mg/Kg)
CK T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
10d 3.50 13.98 14.31 16.33 16.65 3.67 3.90 4.07 4.29
20d 4.36 32.31 33.62 35.84 38.57 4.50 4.68 4.85 5.08
实施例6
实施例4制备的微生物菌剂对小麦和玉米根部的影响
实验设100倍、150倍、200倍实施例4制备的微生物菌剂稀释液和100倍、150倍、200倍灭活微生物菌剂稀释液分别为实验组T1、T2、T3和T4、T5、T6，以不加菌剂为对照组CK。每个育苗盒装土500g。将种子消毒并催芽3d，选取长势一致的种子栽种到育苗盒中，分别在移栽后和移栽后7d按照每克土0.1ml的添加量添加微生物菌剂稀释液或灭活微生物菌剂稀释液。25d后观察小麦和玉米根部生长情况并测量根鲜重。根部生长情况见图3，根鲜重分析表见表3。由实验结果可以看出该微生物菌剂可明显促进小麦和玉米根部生长。
表3小麦和玉米25d根鲜重分析表(g)
CK T1 T2 T3 T4 T5 T6
小麦 1.1 1.8 1.8 1.6 1.3 1.3 1.2
玉米 1.3 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 1.4
实施例7
小麦根腐病防治试验
小麦根腐病是一种真菌性土传病害，其可侵染小麦种子使其不能发芽或发芽后未及出土，芽鞘即变褐腐烂。轻者幼苗虽可出土，但茎基部、叶鞘以及根部产生褐色病斑，幼苗瘦弱，叶色黄绿，生长不良，植株矮小。
本实验在德州市平原县恩城镇小麦田中选择一小麦根腐病较为严重的区域，随机多点取样选择0-20cm的耕作层土壤，去除石块等杂物，使用灭菌过的混合机对汇总土样均匀混合备用；同样处理方法另选择一处无根腐病小麦田取土制备后备用。土样置于长宽高为32*24*12cm的陶盆中均匀铺满8cm厚，每盆中均匀放置小麦种子(济麦22)100粒，然后覆土2.5cm厚；温室中育苗试验，每个处理3个平行，做如下处理：实验组T1：使用根腐病土壤，小麦种子使用实施例4制备的微生物菌剂50mL拌种处理后正常覆土育苗；实验组T2：使用无根腐病土壤，小麦种子使用实施例4制备的微生物菌剂50mL拌种处理后正常覆土育苗；空白对照组CK1，使用根腐病土壤，小麦种子使用等量清水拌种处理后覆土育苗；空白对照组CK2，使用无根腐病土壤，小麦种子使用等量清水拌种处理后覆土育苗；10天后统计出苗率(见表4)，20天后每盆随机选取20株侧其株高均值(见表5)。
表4、 10天小麦出苗率统计表(％)
CK1 CK2 T1 T2
平行1 82 92 90 93
平行2 78 92 91 93
平行3 81 94 91 94
均值 80.3 92.7 90.7 93.3
表5、 20天小麦株高统计表(cm)
CK1 CK2 T1 T2
平行1 9.6 13.1 12.8 13.5
平行2 10.4 12.5 11.9 13.1
平行3 9.8 13.2 12.0 13.3
均值 9.9 12.9 12.2 13.3
由结果可知本发明涉及的微生物菌剂可显著抑制小麦根腐病的生理活性，降低小麦根腐病对小麦的侵害，对防治小麦根腐病具备良好效果，同时对促进小麦发芽出苗护苗壮苗有一定积极效果。
实施例8
为进一步探索本发明菌株YHTR 1.210702在降解水体中有机磷农药残留的潜在应用效果，利用另外一株具备解磷效果的菌株作为对比，对比菌株为胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus Krassilnikov)ACCC19749(中国农业微生物菌种保藏管理中心)，该菌能促进土壤中磷钾的释放、可用于生产微生物肥料；使用LB液体培养基于500ml三角瓶中33℃、180r/min摇床培养72h获得该菌株菌液；同样方法制备菌株YHTR 1.210702菌液；经检测两种菌液有效活菌数均为≥50亿/ml；取2kg农田浇灌用水，加入辛硫磷农药使其辛硫磷浓度为50mg/kg；实验方案：选取500ml三角瓶9支；分别装入制备的含辛硫磷农药水体200ml；分为3组处理，每个处理3个平行；空白对照组CK：三角瓶中接入纯净水2ml；实验组T1:三角瓶中接入菌株YHTR 1.210702菌液2ml；实验组T2：三角瓶中接入菌株ACCC19749菌液2ml；然后所有处理组放置于摇床中33℃、180r/min避光震荡处理24h；用无菌过滤器过滤后使用GB14875-1994食品中辛硫磷农药残留量的测定方法检测其辛硫磷农药残留量。结果见表6；
表6、各处理辛硫磷农药残留量(mg/kg)
由表6可知，本发明菌株具备显著的降解有机磷农药的效果，24h降解率达88％；而另一解磷菌ACCC19749降解率仅为9.4％。
本发明提供的菌株YHTR 1.210702溶磷量峰值高达1554mg/L，具有良好溶磷能力。本发明提供的菌剂可应用于缺磷土壤中，可将土壤中难溶的磷转化为速效磷供植物吸收利用，减少磷肥使用，从而减少环境污染，提高资源利用，实现较好的经济效益和社会效益；可用于对小麦根腐病的生物防治，可降低小麦根腐病造成的种植损害；可促进小麦和玉米根系生长，并可以有效降解有机磷农药。

Claims (12)

1.一株Pseudomonas atacamensis菌株，于2022 年 2 月 15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.24395。
2.权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株的培养方法，包括如下步骤：
（1）将Pseudomonas atacamensis菌株接种到液体活化培养基中，在28～35℃条件下，转速180rpm,培养24～36h，制得液体种子；
（2）将步骤（1）制得的液体种子按照接种量以体积百分数计5%～10%接种于液体发酵培养基中，调控pH值至6.5～7.5、通气比为1:(0.5～1)、转速150～250转/分，在23～35℃培养24～48h，制得Pseudomonas atacamensis菌液。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤（1）中液体活化培养基每升组分如下：
胰蛋白胨6～8g，酵母粉4～7g，葡萄糖3～5g，磷酸钙1～3g，氯化钠6～10g，余量水。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤（2）中液体发酵培养基每升组分如下：
玉米粉8～12g，豆饼粉10～15g，糖蜜液5～10g，鱼粉1～5g，酵母粉1～5g，氯化钠5～10g，硫酸镁0.1～0.25g，硫酸锰0.1～0.25g，硫酸亚铁0.1～0.2g，磷矿粉1～4g，磷酸钙3～6g ，余量水，调整pH值7～8。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤（2）中Pseudomonas atacamensis菌液的有效活菌数≥150亿/mL。
6.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株。
7.如权利要求6所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为权利要求2所述培养方法制得的菌液。
8.权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株或权利要求6所述微生物菌剂在土壤有效磷增加中的应用。
9.权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株或权利要求6所述微生物菌剂在植物促生中的应用，所述植物为玉米、小麦。
10.权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株或权利要求6所述微生物菌剂在防治植物土传病害中的应用，所述土传病害为根腐病，所述植物为小麦。
11.权利要求1所述Pseudomonas atacamensis菌株或权利要求6所述微生物菌剂在有机磷农药降解中应用。
12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述有机磷农药为辛硫磷农药。
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