CN109679858A - 一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用 - Google Patents

一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用。一株解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，2018年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.16104。本发明首次公开了一株通过自然界筛选获得的解磷耐盐的荧光假单胞菌ECO，该菌株与现有已知的荧光假单胞菌相比，耐盐性方面具有显著的优势，可应用于高盐碱环境下的解磷及土壤改良。

Description

一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种环境污染菌。对于人类是一种罕见的机会致病菌。荧光假单胞菌属于假单胞菌属，是化能异养型的革兰氏阴性菌，呈杆状，有鞭毛。能分泌黄绿色荧光色素发出荧光，能产生抗生素、水解酶等代谢产物，在4℃-37℃范围内，中性环境中生长，生理生化特性显著，作为嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。
荧光假单胞菌分类学上属于细菌域、变形菌门、γ-变形菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属。细胞为直的杆菌，大小为0.7-0.8×2.3-2.8微米，不产芽孢，革兰氏染色阴性。有数根极生鞭毛，运动。需氧，进行严格的呼吸型代谢，以氧为最终电子受体。能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。化能营养异养，不需要有机生长因子。氧化酶阳性，接触酶阳性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能从蔗糖合成果聚糖，明胶液化。生长温度范围4-37℃，最适生长温度是25-30℃。DNA中G+C含量是60-61％。广泛分布于自然界，如土壤、水、植物及动物活动环境中。该菌生化能力活跃，可降解许多人工合成化合物，常被用于环境保护。
解磷菌，又称溶磷菌，是指土壤中具有能将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态这种能力的微生物。土壤磷素循环是以微生物活动为中心的。微生物的活动对土壤磷的转化和有效性影响很大。目前，报道具有解磷作用的微生物解磷细菌类有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)、土壤杆菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、黄杆菌(Flavobacterium)、肠细菌(Enterbacter)、微球菌(Micrococcus)、固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Bradyrhizobium)、沙门氏菌(Salmonella)、色杆菌(Clromobacterium)、产碱菌(Alcaligenes)、节细菌(Arthrobacter)、硫杆菌(Thiobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)；解磷真菌类有青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)；放线菌有链霉菌(Streptomyces)；AM菌根菌。
盐碱地是盐类集积的一个种类，是指土壤里面所含的盐分影响到作物的正常生长，根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.5438亿公顷，其中我国为9913万公顷。我国碱土和碱化土壤的形成，大部分与土壤中碳酸盐的累计有关，因而碱化度普遍较高，严重的盐碱土壤地区植物几乎不能生存。改良盐碱地首选需要有能够耐盐碱的菌株对其进行土壤改良，进而使土壤中的盐碱成分能够达到植物能够正常生长的程度。
中国专利文献CN104609992A(申请号201410844584.0)公开了一种盐碱地专用复合菌肥及该复合菌肥的制备方法，属于复合菌肥技术领域。所述复合菌肥，包括如下重量百分比的原料组成：解磷解钾类复合菌剂10％-20％、餐厨垃圾40％-60％、硅藻土30％-40％。其中解磷解钾类复合菌剂是将巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌分别培养离心、冷冻干燥后等量混合获得；餐厨垃圾是将经分拣、除杂并脱水除油的餐厨垃圾粉碎后，加入复合菌剂和混合酶制剂，好氧固态发酵后获得。该复合菌肥将餐厨垃圾和废弃硅藻土等废物利用，并可从根本上改良盐碱土。
以上技术通过利用菌剂和其他成分复配后加入需要改良的土壤中，从而实现对土壤的改良。但由于其菌株为普通菌株，因此限制了该菌剂的应用范围。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，2018年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.16104。
上述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO的培养方法，步骤如下：
(1)取解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO划线于固体活化培养基上，活化培养，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至液体培养基中，摇床培养，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比1％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得菌液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，固体活化培养基为LB固体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化条件为：28～37℃倒置培养1～2天。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体培养基与步骤(3)中的扩大培养基均为LB液体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的摇床培养条件为：28～37℃转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的扩大培养条件为：28～37℃、溶氧20～70％的条件下，扩大培养1～2天。
上述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO在盐碱地土壤改良中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
向待改良盐碱地表面喷施荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液，每亩待改良盐碱地喷施500～1000升，然后旋耕，重复上述喷施、旋耕步骤1～2次，维持土壤温度为25～40℃，改良时间2～5天，即可。
根据本发明进一步优选的，所述的菌液菌体浓度为107～109cfu/mL。
根据本发明进一步优选的，所述的待改良盐碱地含盐浓度不超过9％。
上述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO在盐碱地种植耐盐作物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
向待改良盐碱地表面喷施荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液，每亩待改良盐碱地喷施500～1000升，然后旋耕，重复上述喷施、旋耕步骤1～2次，种植耐盐作物，维持土壤温度为25～40℃，即可。
根据本发明进一步优选的，所述的菌液菌体浓度为107～109cfu/mL。
根据本发明进一步优选的，所述的待改良盐碱地含盐浓度不超过9％。
根据本发明进一步优选的，所述的耐盐碱作物为黑麦草，碱蓬，芦苇，向日葵，苜蓿，豌豆。
有益效果
本发明首次公开了一株通过自然界筛选获得的解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，该菌株与现有已知的荧光假单胞菌相比，耐盐性方面具有显著的优势，可应用于高盐碱环境下的解磷及土壤改良。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
一株解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，2018年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.16104。
培养基
LB固体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。
LB液体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。
实施例1
采集东营盐渍土壤样品2g，置于150mL无菌三角瓶中，加入无菌生理盐水50mL，无菌玻璃珠2g，在28℃、150rpm条件下震荡15分钟，吸取菌液，用无菌水进行梯度稀释，分别稀释至10-3，10-4，10-5倍，各涂布100μL至含有氯化钠浓度为1％、3％、5％、7％、9％的无菌LB固体培养基，在28℃条件下静置培养3d，挑取生长快、菌落大的克隆至50mL含有氯化钠浓度为9％的LB液体培养基，在28℃、150rpm条件下培养3d，即吸取100μL菌液涂布至含有氯化钠浓度为9％的无菌LB固体培养基，挑取单克隆。
取单克隆送青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，经检测，16S rDNA序列含有1320bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，经菌种鉴定，属于Pseudomonas fluorescens，命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，2018年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.16104。
菌种鉴定过程如下：
样品：细菌菌液；
细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，DP302；
TAE缓冲液(50×，1L)：Tris 242g、冰醋酸57.1ml、Na2EDTA.2H2O 37.2g、加水至1L；
琼脂糖：BIOWET，AGAROSE G-10；
2×Pfu PCR MasterMix、D2000DNA Marker、核酸染料，loading buffer等：天根生化科技(北京)有限公司
DNA纯化回收试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，DP214
离心管、枪头等耗材：美国Gene Era Biotech公司(GEB)
引物：由苏州金唯智生物科技有限公司合成，按照合成单加入ddH2O，制成10μM溶液。
1、基因组DNA提取，按DP302试剂盒操作。
2、PCR扩增
2.1通用引物信息
2.2 PCR扩增体系组分及构成
2.3 PCR循环参数
预变性：94℃，3min；变性94℃，30s，退火55，30s，延伸，72℃，1.5min(共35个循环)；延伸72℃，10min；4℃保存。
3、琼脂糖凝胶电泳检测
制备1.0％的琼脂糖凝胶，电泳时电压设置为18V/cm，电泳时间为20min。采用核酸染料进行琼脂糖电泳染色。
4、纯化回收
使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
测序拼接序列及blast比对：
通过序列16S rDNA进行序列比对，发现遗传关系最接近的菌株编号为NR_043420.1。
实施例2
上述荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO的培养方法，步骤如下：
(1)取荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO划线于LB固体培养基上，37℃倒置活化培养2天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，37℃转速为200转/分钟的条件下，摇床培养2天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比1％～10％转接至LB液体培养基中，28℃、溶氧20％～70％的条件下，扩大培养2天，制得菌液。
经检测，菌液的菌体浓度为109cfu/ml。
实施例3
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO在盐碱土壤种植耐盐碱作物中的应用，步骤如下：
向含盐浓度为9％的盐渍土壤中接种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO的菌液，按照质量体积比20：1的比例接种，单位g/ml，种植黑麦草，在温度为28℃的条件下，培养30天，称重检测植物总生物量，以在未接种荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)ECO菌液的盐渍土壤上培养的植物生物量为对照。
含盐浓度为9％的盐渍土壤接种光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液后，植物正常生长，30天的总生物量显著提高，而未接种菌液的盐渍土壤上培养的植物未生长。
实施例4
向含盐浓度为7％，含Ca3(PO4)2浓度为1％的盐渍土壤中接种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO的菌液，按照质量体积比15：1的比例接种，单位g/ml，在温度为37℃的条件下，培养5天，检测土壤中可溶性磷酸盐含量，以在未接种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液的Ca3(PO4)2-盐渍土壤中的磷酸盐含量为对照。
经检测，含盐浓度为7％的盐渍土壤接种光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液后，可溶性磷酸盐含量增加至1312mg/kg，而未接种菌液的盐渍土壤中可溶性磷酸盐含量为85mg/kg，较初始含量无变化。
对比例1
按照实施例3的方法，采用已知菌株NR_043420.1进行相同的植物生长实验，经检测，接种已知菌株NR_043420.1菌液的盐渍土壤上培养的植物在30d内未生长。
按照实施例3的方法，采用已知菌株NR_043420.1进行相同的土壤改良实验，经检测，土壤中可溶性磷酸盐含量为71mg/kg，较初始含量无变化。
结果分析
通过实施例3和实施例4与对比例1中对含盐浓度为9％的盐渍土壤改良和植物生长的数据可以看出，本发明所公开的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO针对盐碱程度严重的盐碱土壤进行作物的种植和生物量的提高具有显著效益，较现有已知的盐碱土壤改良菌剂具有耐盐浓度高、成分简单便于大规模应用的潜在价值。
序列表
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一株解磷耐盐的荧光假单胞菌菌株及其培养方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1320
<212> DNA
<213> Pseudomonas fluorescens(荧光假单胞菌)
<400> 1
ctggtagtgg gggataacgt tcggaaacgg acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga 60
aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg 120
tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca 180
ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 240
gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgttaagaa ggtcttcggg ttgtaaagca 300
ctttaagttg ggaggaaggg cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccgacaga 360
ataagcaccg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat 420
cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggtttgtta agttggatgt gaaatccccg 480
ggctcaacct gggaactgca ttcaaaactg actgactaga gtatggtaga gggtggtgga 540
atttcctgtg tagcggtgaa atgcgcagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac 600
cacctggact aatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 660
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg ggagccttga gctcttagtg 720
gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa 780
tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 840
gagccttacc aggccttgac atccaatgaa ctttctagag atagattggt gccttcggga 900
acattgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 960
cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg taatggtggg cactctaagg 1020
agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac 1080
ggcctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc cgcgaggtgg 1140
agctaatccc tcaaaaccga tcgtagtccg gatcgtagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1200
tcggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta 1260
cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg 1320

Claims (10)

1.一株解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO，2018年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号：CGMCC No.16104。
2.权利要求1所述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO的培养方法，步骤如下：
(1)取解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO划线于固体活化培养基上，活化培养，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至液体培养基中，摇床培养，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比1％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，固体活化培养基为LB固体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然；
优选的，所述步骤(1)中，活化条件为：28～37℃倒置培养1～2天。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体培养基与步骤(3)中的扩大培养基均为LB液体培养基，组份如下：
蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然；
优选的，所述步骤(2)中的摇床培养条件为：28～37℃转速为100～200转/分钟的条件下，摇床培养1～2天。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的扩大培养条件为：28～37℃、溶氧20～70％的条件下，扩大培养1～2天。
6.权利要求1所述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO在盐碱地土壤改良中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下：
向待改良盐碱地表面喷施荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液，每亩待改良盐碱地喷施500～1000升，然后旋耕，重复上述喷施、旋耕步骤1～2次，维持土壤温度为25～40℃，改良时间2～5天，即可。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的菌液菌体浓度为107～109cfu/mL；
进一步优选的，所述的待改良盐碱地含盐浓度不超过9％。
9.权利要求1所述解磷耐盐的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO在盐碱地种植耐盐作物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤如下：
向待改良盐碱地表面喷施荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ECO菌液，每亩待改良盐碱地喷施500～1000升，然后旋耕，重复上述喷施、旋耕步骤1～2次，种植耐盐作物，维持土壤温度为25～40℃，即可；
进一步优选的，所述的菌液菌体浓度为107～109cfu/mL；
进一步优选的，所述的待改良盐碱地含盐浓度不超过9％；
进一步优选的，所述的耐盐碱作物为黑麦草，碱蓬，芦苇，向日葵，苜蓿，豌豆。
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