CN103409335A - 氨氧化古菌菌群培育方法及其在好氧堆肥中的应用 - Google Patents

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解开治
徐培智
杨少海
逄玉万
顾文杰
黄旭
蒋瑞萍
李苹
黄巧义
卢钰升
付弘婷
易琼
张发宝
唐拴虎
刘春明
董稳军
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Abstract

本发明涉及氨氧化古菌菌群培育方法其在好氧堆肥中的应用,该培育方法,包括以下步骤:第一步:收集含有氨氧化古菌菌群的污泥,配制活性污泥溶液;第二步:以更代培养的方式进行富集培养,得到第1代培养液;第三步:在pH6.5,140rpm/min条件下,30℃恒温对所述第1代培养液进行摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,再进行更代;第四步:将经过摇床培养后的所述第1代培养液进行富集培养,得到第2代培养液,第五步:连续重复进行摇床培养至第5-8代,得到800mL富集氨氧化古菌菌群,采用该培育方法可显著增加堆肥中的氨氧化古菌的数量,促进消化反应的进行,降低N2O的排放,减少氮素的损失。

Description

氨氧化古菌菌群培育方法及其在好氧堆肥中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,尤其涉及氨氧化古菌菌群培育方法及其在好氧堆肥中的应用。 
背景技术
目前,好氧堆肥技术作为有机固体废弃物无害化、资源化和稳定化的一种经济高效技术,已经被广泛应用于畜禽粪便处理。然而,在堆肥过程中氮素的损失量是相当惊人的。比如在2002年,Barrington等人总结了畜禽粪—秸秆、污泥—秸秆、畜禽粪—锯屑等不同组混合废物联合堆肥时,各组混合废物在堆肥过程中的氮损失量约为进料总氮的16%~76%。1992年,Martins等人的研究表明,在污泥堆肥过程中氨态氮的挥发和硝态氮的反硝化造成的氮素损失达43%~70%。堆肥过程中,氮素如此大量损失,不仅会降低其肥料成品的农用营养价值,同时还会产生恶臭、酸雨等新的环境问题。堆肥过程中畜禽粪便所含的有机氮不仅易于被微生物分解转化为氨气,并且在反硝化过程中产生温室气体N2O(一氧化二氮),而气体N2O的增温潜势为是CO2(二氧化碳)的296倍,从而加剧温室效应。 
作为硝化作用的限速步骤,氨氧化作用微生物学研究在氮素生物地球化学循环过程中一直倍受关注。长期以来,研究者普遍认为AOB(Ammonia-oxidizing bacteria的缩写),即变形菌纲的氨氧化细菌,是地球氮素循环过程中最主要的承担者。然而,近年来随着不依赖于培养的现代分子生物学技术的发展与应用,研究者发现了另一类具有氨氧化能力的微生物——AOA(Ammonia-oxidizing archaea的缩写),即氨氧化古菌,其含有AOB的关键酶——氨单加氧酶的全部亚基,是一类完全独立于AOB的进化类群,广泛分布于海洋、土壤、湖泊和矿区等多种生态系统中,且在数量上较AOB占明显优势,在氮循环中起着非常重要的作用。 
目前,对于氨氧化古菌的研究多集中在菌种在自然界分布情况和生化 代谢模型等方面,有关氨氧化古菌在堆肥的氨氧化过程中的应用未见报道。 
由此可见,氨氧化古菌在堆肥的氨氧化过程中的应用显然仍存在技术缺陷,并亟待加以进一步研究完善。本发明人积极加以研究创新,以期探索出一种氨氧化古菌菌群培育及其在好氧堆肥中的应用的完整技术,使其具有实用性。 
发明内容
本发明的主要目的在于,提供一种氨氧化古菌菌群的培育方法,所要解决的技术问题是使用这种培育方法,培育出富集氨氧化古菌菌群,供好氧堆肥之用。 
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的氨氧化古菌菌群培育方法,包括以下步骤: 
第一步:收集含有氨氧化古菌菌群的污泥,配制成密度为12200mg/L的活性污泥溶液; 
第二步:以更代培养的方式进行富集培养,取1L的锥形瓶,加入500mL富集培养基,再加入250mL所述活性污泥溶液,摇匀接种,得到第1代培养液; 
第三步:在pH6.5,140rpm/min条件下,30℃恒温对所述第1代培养液进行摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,再进行更代; 
第四步:将经过摇床培养后的所述第1代培养液用离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,将污泥转入锥形瓶中,加富集培养基定容至800mL,得到第2代培养液,并在pH6.5,140rpm/min条件下,30℃恒温对所述第2代培养液进行第2代培养摇床培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束第2代培养,再进行更代; 
第五步:依据上述第四步所述的第2代培养方法,连续重复进行摇床培养至第5-8代,得到800mL富集氨氧化古菌菌群。 
优选的,所述的氨氧化古菌菌群培育方法,所述富集培养基按照如下方法的配制而成:在1L蒸馏水中加入0.025gKH2PO4,1.25gKHCO3,7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,在pH7.2,温度为121℃,压力为103.4kPa条件下,湿热灭菌 30min,得到所述富集培养基。 
优选的,所述的氨氧化古菌菌群培育方法,所述富集氨氧化古菌菌群的氨氧化细菌的数量为1.0×109~8.0×1010CFU/ml,其氨氮氧化速率为74.39~123.55μg/(m·d)。 
优选的,所述的氨氧化古菌菌群培育方法,所述富集氨氧化古菌菌群的优势菌为未培养的氨氧化古菌和未培养的泉古菌。 
优选的,所述的氨氧化古菌菌群培育方法,所述含有氨氧化古菌菌群的泥土为污水处理厂经A2/O工艺处理回流的污泥。 
氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,包括如下步骤: 
第一步:制备堆肥混合物,将堆肥原料按比例混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为55%~60%,得到所述堆肥混合物; 
第二步:每100公斤堆肥混合物中均匀添加5~10升富集氨氧化古菌菌群,制得发酵混合物;将所述发酵混合物转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵。 
优选的,所述的氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜鸡粪:稻壳:米糠:蘑菇渣为5:1:1:3,混合均匀,并调整水分为55%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加5升富集氨氧化古菌菌群。 
优选的,氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜牛粪:味精废渣:米糠:蘑菇渣为2:1:1:1,混合均匀,并调整水分为60%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加10升富集氨氧化古菌菌群。 
优选的,氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜猪粪:蘑菇渣:泥炭土:米糠为3:2:3:2,混合均匀并调整水分为58%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加8升富集氨氧化古菌菌群。 
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点: 
1、本发明氨氧化古菌菌群的培育方法,能获得数量可观的氨氧化古菌,经MPN-PCR法检测数量可达1.0×109~8.0×1010CFU/ml; 
2、依本发明的培育方法培育的氨氧化古菌菌群,氨氮氧化速率可显著提高,最高可达123.55μg/(m·d); 
3、本发明的氨氧化古菌菌群应用于好氧堆肥,可显著增加堆肥中的氨氧化古菌的数量,促进消化反应的进行,降低N2O的排放,减少氮素的损 失。 
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。 
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下对依据本发明提出的氨氧化古菌菌群培育方法及其在好氧堆肥中的应用其具体实施方式、特征及其功效,详细说明如后。在下述说明中,不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外,一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。 
本发明的一种氨氧化古菌菌群培育及其在好氧堆肥中的保氮减排应用方法通过下述技术方案实现: 
(1)氨氧化古菌菌群的培育 
通过前期的研究,发现某污水处理厂A2/O工艺(Anaerobic-Anoxic-Oxic)的回流污泥中含有大量的氨氧化古菌菌群。利用更代培养的方式进行富集培养:取1L的锥形瓶,加入500mL的富集培养基(1L蒸馏水中加入:0.025gKH2PO4、1.25gKHCO3、7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,调pH7.2,与121℃,高温高压湿热灭菌30min),用250mLρ(SS)为12200mg/L的活性污泥进行接种。在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,进行换代。将剩余的培养液用低速离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,污泥转入锥形瓶中,加富集培养基至800mL,在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,进行第2代培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束。依据上述第2代培养方法连续进行5-8代(所需时间为25-30天)氨氧化古菌的富集培养,氨氧化细菌的数量大大增加,一般从7.5×104~1.2×105CFU/ml增加至1.0×109~8.0×1010CFU/ml,富集前后氨氧化古菌数量相差13333.3~667000.0倍,该菌群的氨氮氧化速率为74.39~123.55μg/(m·d)。 
(2)氨氧化古菌菌群的组成 
本专利氨氧化古菌菌群的优势菌为未培养的氨氧化古菌(uncultured ammonia-oxidizing archaeon),和未培养的泉古菌(uncultured crenarchaeote)。未培养的氨氧化古菌的基因库登录号(GenBank Accession)的基因库序列编号为:JQ305121、JQ305122和JQ305123。未培养的泉古菌的基因库登录号(GenBank Accession)的基因库序列编号为JQ305124、JQ305125、JQ305126、JQ305127和JQ305128。 
(3)氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的保氮减排应用方法 
将堆肥原料按照所需配比混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为55%~60%。每100公斤堆肥混合物中均匀添加5-10升富集氨氧化古菌菌群,并转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵即可。 
具体实施实例: 
实例一: 
(1)氨氧化古菌菌群的培育 
通过前期的研究,发现某污水处理厂A2/O工艺(Anaerobic-Anoxic-Oxic)的回流污泥中含有大量的氨氧化古菌菌群。利用更代培养的方式进行富集培养:取1L的锥形瓶,加入500mL的富集培养基(1L蒸馏水中加入:0.025gKH2PO4、1.25gKHCO3、7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,调pH7.2,与121℃,高温高压湿热灭菌30min),用250mLρ(SS)为12200mg/L的活性污泥进行接种。在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,进行换代。 
采用MPN-PCR法(Kam,et al.1997;Degrange,et al.1998)检测AOA菌群数量,确定其数量的增加。即首先对富集样品细菌总DNA进行提取,并对总DNA溶液进行l0倍梯度稀释,选用10-1、10-2、l0-3、10-4、10-5等各个不同稀释度样品作模板。采用四次重复法进行PCR反应,根据扩增产物的电泳结果计数各样品的阳性反应数,确定数量指标。最后根据反应结果查MPN表,推算每毫升富集样品中氨氧化古菌的数量。 
将剩余的培养液用低速离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,污泥转入锥形瓶中,加富集培养基至800mL,在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,进行第2代培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束。 
依据上述第2代培养方法连续进行8代(所需时间为25天)氨氧化古菌的富集培养,氨氧化细菌的数量大大增加,从7.5×104CFU/ml增加至1.0×109CFU/ml,富集前后氨氧化古菌数量相差13333.3倍,该菌群的氨氮氧化速率为74.39μg/(m·d)。 
(2)氨氧化古菌菌群的组成 
本专利氨氧化古菌菌群的优势菌为uncultured ammonia-oxidizing archaeon(GenBank Accession:JQ305121、JQ305122和JQ305123)和uncultured crenarchaeote(GenBank Accession:JQ305124、JQ305125、JQ305126、JQ305127和JQ305128)。 
(3)氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的保氮减排应用方法 
将新鲜鸡粪、稻壳、米糠和蘑菇渣按5:1:1:3的体积比混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为55%。每100公斤堆肥混合物中均匀添加5升富集氨氧化古菌菌群,转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵即可。应用效果见表1: 
表1添加富集氨氧化古菌菌群对好氧堆肥除臭保氮的效果 
Figure BDA00003237159500061
注:同列数据后不同小写字母表示Duncan检验在P=0.05水平上差异显著; 
*氨平均排放速率是指整个堆肥过程中以氨排放损失的量除以完成整个堆肥过程所需的时间,下同。 
实例二: 
(1)氨氧化古菌菌群的培育 
通过前期的研究,发现某污水处理厂A2/O工艺(Anaerobic-Anoxic-Oxic)的回流污泥中含有大量的氨氧化古菌菌群。利用更代培养的方式进行富集培养:取1L的锥形瓶,加入500mL的富集培养基(1L蒸馏水中加入:0.025gKH2PO4、1.25gKHCO3、7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,调pH7.2,与121℃,高温高压湿热灭菌30min),用250mLρ(SS)为12200mg/L的活性污泥进行接种。在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,进行换代。 
将剩余的培养液用低速离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,污泥转入锥形瓶中,加富集培养基至800mL,在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,进行第2代培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束。 
依据上述第2代培养方法连续进行7代(所需时间为28天)氨氧化古菌的富集培养,氨氧化细菌的数量大大增加,从1.0×105CFU/ml增加至1.4×1010CFU/ml,富集前后氨氧化古菌数量相差140000倍,该菌群的氨氮氧化速率为98.46μg/(m·d)。 
(2)氨氧化古菌菌群的组成 
本专利氨氧化古菌菌群的优势菌为uncultured ammonia-oxidizing archaeon(GenBank Accession:JQ305121、JQ305122和JQ305123)和uncultured crenarchaeote(GenBank Accession:JQ305124、JQ305125、JQ305126、JQ305127和JQ305128)。 
(3)氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的保氮减排应用方法 
将新鲜牛粪、味精废渣、米糠和蘑菇渣按2:1:1:1的体积比混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为60%。每100公斤堆肥混合物中均匀添加10升富集氨氧化古菌菌群,转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵即可。 应用效果见表2: 
表2添加富集氨氧化古菌菌群对好氧堆肥除臭保氮的效果 
Figure BDA00003237159500081
实例三: 
(1)氨氧化古菌菌群的培育 
通过前期的研究,发现某污水处理厂A2/O工艺(Anaerobic-Anoxic-Oxic)的回流污泥中含有大量的氨氧化古菌菌群。利用更代培养的方式进行富集培养:取1L的锥形瓶,加入500mL的富集培养基(1L蒸馏水中加入:0.025gKH2PO4、1.25gKHCO3、7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,调pH7.2,与121℃,高温高压湿热灭菌30min),用250mLρ(SS)为12200mg/L的活性污泥进行接种。在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,进行换代。 
将剩余的培养液用低速离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,污泥转入锥形瓶中,加富集培养基至800mL,在pH6.5、140rpm/min条件下30℃恒温摇床培养,进行第2代培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束。 
依据上述第2代培养方法连续进行8代(所需时间为30天)氨氧化古菌的富集培养,氨氧化细菌的数量大大增加,从1.2×105CFU/ml增加至8.0×1010CFU/ml,富集前后氨氧化古菌数量相差6670000倍,该菌群的氨氮氧化速率为123.55μg/(m·d)。 
(2)氨氧化古菌菌群的组成 
本专利氨氧化古菌菌群的优势菌为uncultured ammonia-oxidizing  archaeon(GenBank Accession:JQ305121、JQ305122和JQ305123)和uncultured crenarchaeote(GenBank Accession:JQ305124、JQ305125、JQ305126、JQ305127和JQ305128)。 
(3)氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的保氮减排应用方法 
将新鲜猪粪、蘑菇渣、泥炭土和米糠按3:2:3:2的体积比混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为58%。每100公斤堆肥混合物中均匀添加8升富集氨氧化古菌菌群,转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵即可。应用效果见表3: 
表3添加富集氨氧化古菌菌群对好氧堆肥除臭保氮的效果 
Figure BDA00003237159500091
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。 

Claims (9)

1.氨氧化古菌菌群培育方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步:收集含有氨氧化古菌菌群的污泥,配制成密度为12200mg/L的活性污泥溶液;
第二步:以更代培养的方式进行富集培养,取1L的锥形瓶,加入500mL富集培养基,再加入250mL所述活性污泥溶液,摇匀接种,得到第1代培养液;
第三步:在pH6.5,140rpm/min条件下,30℃恒温对所述第1代培养液进行摇床培养,当数量增加一个数量级后结束第1代培养,再进行更代;
第四步:将经过摇床培养后的所述第1代培养液用离心机以3500rpm/min的转速离心20min,弃去上清液,将污泥转入锥形瓶中,加富集培养基定容至800mL,得到第2代培养液,并在pH6.5,140rpm/min条件下,30℃恒温对所述第2代培养液进行第2代培养摇床培养,当氨氧化菌菌群数量增加一个数量级后结束第2代培养,再进行更代;
第五步:依据上述第四步所述的第2代培养方法,连续重复进行摇床培养至第5-8代,得到800mL富集氨氧化古菌菌群。
2.根据权利要求1所述的氨氧化古菌菌群培育方法,其特征在于,
所述富集培养基按照如下方法的配制而成:在1L蒸馏水中加入0.025gKH2PO4,1.25gKHCO3,7.5g酪蛋白氨基酸,10g酵母提取物,3g柠檬酸钠,2g KCl,0.1gMgSO4·7H2O,10g Na2CO3,在pH7.2,温度为121℃,压力为103.4kPa条件下,湿热灭菌30min,得到所述富集培养基。
3.根据权利要求2所述的氨氧化古菌菌群培育方法,其特征在于,
所述富集氨氧化古菌菌群的氨氧化细菌的数量为1.0×109~8.0×1010CFU/ml,其氨氮氧化速率为74.39~123.55μg/(m·d)。
4.根据权利要求2所述的氨氧化古菌菌群培育方法,其特征在于,
所述富集氨氧化古菌菌群的优势菌为未培养的氨氧化古菌和未培养的泉古菌。
5.根据权利要求2所述的氨氧化古菌菌群培育方法,其特征在于,
所述含有氨氧化古菌菌群的泥土为污水处理厂经A2/O工艺处理回流的污泥。
6.氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
第一步:制备堆肥混合物,将堆肥原料按比例混合均匀后作为堆肥混合原料,并调整水分为55%~60%,得到所述堆肥混合物;
第二步:每100公斤堆肥混合物中均匀添加5~10升富集氨氧化古菌菌群,制得发酵混合物;将所述发酵混合物转入堆肥场所或设备中进行好氧发酵。
7.根据权利要求6所述的氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,其特征在于,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜鸡粪:稻壳:米糠:蘑菇渣为5:1:1:3,混合均匀,并调整水分为55%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加5升富集氨氧化古菌菌群。
8.根据权利要求6所述的氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,其特征在于,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜牛粪:味精废渣:米糠:蘑菇渣为2:1:1:1,混合均匀,并调整水分为60%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加10升富集氨氧化古菌菌群。
9.根据权利要求6所述的氨氧化古菌菌群在好氧堆肥中的应用,其特征在于,所述堆肥原料及其体积比为:新鲜猪粪:蘑菇渣:泥炭土:米糠为3:2:3:2,混合均匀并调整水分为58%;每100公斤堆肥混合物中均匀添加8升富集氨氧化古菌菌群。
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