DE3315116A1 - Verfahren zur direkten bestimmung apurinischer und apyrimidinischer stellen in dna - Google Patents

Description

Apurinische und apyriniidinische Stellen (AP-Stellen) in DNA sind Fehler, die auf verschiedene Weise entstehen können; vgl. T. Lindahl und S. Ljungguist in • Molecular Mechanisms for Repair of DNA, -Herausgeber P.C. Hanawalt und R.B. Setlow, Teil A, Seiten 31 - 38, Plenum Press, New York, 1975, und T. Lindahl in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Herausgeber W.E. Cohn, Bd 22 (1979), S. 135 - 192, Academic Press, New York. AP-Stellen können selbst bei normalem pH-Wert durch spontane Hydrolyse der Zuckerbindung zwischen der Desoxyribosegruppe und der Purinbase bzw. Pyrimidinbase entstehen. Ferner treten AP-Stellen nach Modifizierung der Basen auf, die eine Schwächung der N-glykosidischen Bindung bewirken, z.B. Alkylierung der Purine, Sättigung der C₅-C₆-Bindung der Pyrimidine

und Fragmentierung des heterocyclischen Ringes. Weiterhin kann ein Teil der geschädigten Basen durch spezifische DNA-Glycosylasen abgetrennt werden. Schließlich können AP-Stellen in DNA durch einige Antitumor-Antibiotika,wie Bleomycin,erzeugt werden; vgl. W.E.G. Müller und R.K. Zahn in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Herausgeber W.E. Cohn, Bd. 20 (1977) , S. 21 - 57, Academic Press, New York.

AP-Stellen sind für die DNA schwere Fehler. Sie können die ™ Ursache für Mutationen sein; vgl. R.M. Schaaper, B.W. Glickman und L.A. Loeb, Cancer Research, Bd. 42 (1982), S. 3480 - 3485 und R.M. Schaaper, B.W. Glickman und L.A. Loeb, Mutation Research, Bd. 106 (1982), S. 1 - 9,

AP-Stellen sind nicht-kodierende Fehler. 35

Bisher wurden nur intakte AP-Stellen bestimmt, und zwar auf indirekte Art und Weise. Der Test beruht auf der Bestimmung von Strangbrüchen ("nicks") nach chemischer oder enzymatischer Spaltung einer Phosphodiesterbrücke neben der AP-Stelle.

Es ist ferner bekannt, Apurinsäure, d.h. das nach Behandlung von DNA mit verdünnter Mineralsäure erhaltene purinfreie DNA-Derivat, mit Aldehyd-Reagentien, wie Hydroxyl-

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amin, Semicarbazid, Phenylhydrazin oder [ C]-Methoxyamin umzusetzen; vgl. N.M. Coombs und D.C. Livingston, Biochim.-Biophys. Acta, Bd. 174 (1969), S. 161 - 173, insbes, S. 172.

Die verschiedenen bekannten Methoden zur Bestimmung der AP-Stellen in DNA haben verschiedene Nachteile. Einige Methoden sind zeitraubend und arbeitsaufwendig, andere Methoden sind nicht ausreichend empfindlich. Schließlich gibt es Methoden, die nur auf eine begrenzte Zahl von AP-Stellen beschränkt sind, überdies erfordern alle Methoden zwei Schritte (Bruch der DNA und Analyse der Brüche) und bestimmen nur intakte AP-Stellen.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde„ ein Verfahren zur direkten Bestimmung sämtlicher AP-Stellen, intakt oder mit Strangbrüchen verbunden, zu entwickeln, das auf der Umsetzung der nach einem Purin- bzw. Pyrimidin-Verlust entstehenden Aldehydgruope(n) der Desoxyribose-

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gruppe(n) mit [ C]-Methoxyamin beruht*

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur direkten Bestimmung von apurinisehen _:und apyrxmidimischen Stellen (AP-Stellen) in DNA, das dadurch gekennzeichnet c; ist, daß man die zu untersuchende DNA-Probe mit [ C]-Methoxyamin in bestimmter überschüssiger Menge eine ausreichend lange Zeit bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,4

umsetzt, anschließend in saurem Medium das nicht umgesetzte [ C]-Methoxyamin abtrennt und die Radioaktivit des DNA £ cZ-Methoxyamin-Eeaktionsprodukts bestimmt.

Das Verfahren der Erfindung eignet sich auch zur Bestimmung von DNA-Glycosylasen, insbesondere von Uracil-DNA-Glycosylasen. In diesem Fall kann eine DNA-Probe mit einer bestimmten überschüssigen Mengen /* ⁴c7-Methoxyamin sowie der zu bestimmenden DNA-Glycosylase unter den vorstehend angegebenen Bedingungen umgesetzt werden, da die DNA-Glycosylaseaktivität nicht durch £ ⁴c7-Methoxyamin beeinflußt wird. Die durch die DNA-Glycosylase gebildeten AP-Stellungen reagieren mit £ c7~Methoxyamin
te Weise bestimmt.

£c7~Methoxyamin und werden auf die vorstehend geschilder-

Bei der Inkubation eines Uracil enthaltenden Polydesoxyribonucleotids mit einer Uracil-DNA-Glycosylase wird eine Anzahl von Methoxyamin-reaktiven Stellen proportional zur Menge des Enzyms und der Inkubationszeit in der DNA gebildet. Diese Stellen sind praktisch gleich der freigesetzten Uracilmenge-

Vorzugsweise wird die Umsetzung mit [¹⁴C] -Methoxyamin bei

pH 7,2 und bei 37°C durchgeführt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist rasch, einfach und empfindlich. Es erfordert nicht die Verwendung von DNA bestimmter Konfiguration und bestimmter Analysenverfahren.

Das Verfahren eignet sich als Routinemethode zur Bestimmung von Fehlern der DNA und zur Feststellung von Reagentien, welche die DNA modifizieren, z.B. cancerogenen oder mutagenen Stoffen.

Materialien und Methoden
Materialien:

NACHQEREIC

Methoxyaminhydrochlorid wurde von. Serva»bezogen, Methansulf onsäuremethylester von I.C.N. Pharmaceuticals Inc. Escherichia coil DNA wurde von VTorthington Biochemical Corp. bezogen. E. coil J^lCf DNA (0,29 , uQL/iig) , £* ⁴Cj-MeUiOXy-

(R)

aminhydrochlorid (3,13 μ€1/μΐηο1ε) und Omnifluor ^wurden von New England Nuclear bezogen. Insta-Gel ^-Lösung wurde von der Packard Instrument Company und Fiberglaspapier des Typs GF/C von Whatman bezogen. Sämtliche anderen Chemikalien waren von analytisch reiner Qualität.

Uracil-DNA-Glycosyläse wurde aus Kalbsthymus hergestellt; .. vgl. M. Talpaert-Borleet al., J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979, S. 6387 bis 6391 und Bd. 257 (1982), S. 1208 bis 1214.

Uracil-enthaltende Polydesoxyribonucleotide (UA)₂₃Q-(ctTrdu) „-

(dT : du = 9) und (dA^_3Q . (dT, PhJ ÖU)

(150 uCi/umole Uracil; dT : dll = 9) wurden nach

der in J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979), S.6387 bis 6391 beschriebenen Methode hergestellt.

Polydesoxyribonucleotid mit apyrimidinischen Stellen ^:■ ■ ₃

Apyrimidinische Stellen wurden in (dA)₂₃₍₎ , fdT, | mit dT : du = 9" durch Uraeil-DNA-Glycosylase nach der von M- Talpaert-Borle et al., Eur. J. Biochem., Bd. 124(1982), S. 435 bis 440, beschriebenen Methode hergestellt. Die Onsetzung _QC V7urde bei einer Konzentration von 0,56 mM Gesamtmicleotide mit 4,5 Enzymeinheiten/ml durchgeführt. Nach

3 stündiger Inkubation bei 37°C ist die Abspaltung von 3

ί H]-Uracil praktisch beendet. Die Reaktion wird abgebrochen und das Polydesoxyribonucleotid mit etwa 50 AP-gvj Stellen pro 1000 Nucleotide isoliert.

-6-

NACHQEREICHT

1 Alkylierte depurinierte DNA

Nicht-markierte und Tritium-markierte E.. coli DNA vurde mit 0,3 M Methansulfonsäuremethylesterlösung alkylißrt und" durch 6stündiges Erhitzen auf 50°C partiell depuriniert. Die erhaltenen DNA's enthielten etwa eine apurinische Stelle pro 20 Nucleotide; vgl. Can. J. Biochem., Bd. 50 (1972), S. 1199 bis 1209. Die Behandlung mit 0,2 molarer Natronlauge lieferte eine säurelösliche Fraktion in einer Menge von 35 %.

Bestimmung der Radioaktivität der säurelöslichen Fraktion

10 μΐ Anteile der radioaktiven DNA-Lösungen wurden mit 100 μΐ Kalbsthymus-DNA-Lösung (200 μg) in ' 0,15 M NaCl₁ 15 mM Natriumcitrat-Puffer pH 7,0 «nd 220 μΐ 7,5 % : Perchlorsäurelösung versetzt. Nach dem Schütteln wird das Gemisch 10 Minuten im Eisbad stehengelassen. Danach wird das Gemisch 10 Minuten bei 12 000 χ g zentrifugiert. Ein Teil des Überstandes wurde mit Wasser auf 0,4 ml aufgefüllt, mit 4 ml.Insta-Geü!·^- Lösung ergänzt und in ein Flüssigkeits-Szintillationsspektrometer gegeben.. .

14

Reaktion mit Γ C]-Methoxyamin

Das Reaktionsgemisch in 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 7,2, enthielt 100 bis 200 μg pro ml DNA oder synthetische Polydesoxyribohucleotide und 3 bis 7 mMol, vorzugsweise 5 nuMoi £ cZ-Methoxyamin-Endkonzentration. Die Kondensationsreaktion wurde 30 Minuten bei 37⁰C durchgeführt.

. NACHQEREIOH

Bestimmung der Radioaktivität der säureunlöslichen Fraktion

Anteile der Reaktionsgemische wurden auf Fiberglas— scheiben aufgetragen, die dann sofort in eiskalte 1 M

14 SaI2säure getaucht wurden. Das freie [ C3-Methoxyamin wurde von der säureunlöslichen £ c7-Methoxyämin-DNA durch 5 maliges Waschen der Glasfilterscheiben mit jeweils 10 ml pro Scheibe 1 M Salzsäure abgetrennt. Danach wird noch dreimal mit Äthanol gewaschen. Hierauf werden die Fiberglasscheiben getrocknet, in 4 ml Toluol eingelegt, das 16 mg Omnifluor ^v-^/enthält, und in einem Flüssigkeits-Szintillationsspektrometer gezählt. Die Werte für das an die säureunlösliche DNA gebundene £ C7-Methoxyamin wurden korrigiert, da an den Fiberglasscheiben noch geringe Mengen freies £ C7-Methoxyamin verbleiben. Diese restliche Menge betrug etwa 0,05 % der Gesamtradioaktivität auf der Fiberglasscheibe.

Ergebnisse

1. Bestimmung von apurinischen und apyrimidinischen Stellen in DNA

.a. Reaktion von Methoxyamin mit apurinischen Stellen in alkylierter. depuriniertar DNA .

Alkylierte depurinierte DNA enthält einige Gruppen, die Methoxyainin in einer Reaktion binden, die vom pH-Wert abhängt; vgl. Figur 1. Die Reaktion erfolgt hauptsächlieh im saurera pH-Bereich · und sie fällt scharf ab bei einem pH-Wert oberhalb 8. Andererseits reagiert Methoxyamin nicht signifikant mit unbehandelter DNA; Im pH-Bereidi3 bis 6 erfolgt eine geringe Aufnahme des Methoxyamins. Bei einem pH-Wert von 7,2 liegt das niedrigste Verhältnis der unspezifischen Retention von £ cj-Methoxyamin zur Markierung von spezifisch reak-

— R —

tionsfähigen Stellen in der alkylierten depurinierten DNA.

14
Figur 2 gibt die Menge an [ C]-Methoxyamin wieder, die

von den unbehandelten und alkylierten depurinierten DNA's als Punktion der Reagenz-Konzentration nach 30minütiger Inkubation bei 37°C und einem pH-Wert von 7,2 aufgenom-2Q men wird.

14
Der Einbau von [ C]-Methoxyamin in unbehandelte DNA bleibt vernachlässigbar, selbst mit zunehmender Reagenz-Konzentration. Alkylierte depurinierte DNA behält eine signifikante Menge an Radioaktivität bei, die

von der Reagenz-Konzentration

14
abhängig ist. Sobald die [ C]-Methoxyamin-Endkonzentration 5 mM> erreicht, flacht sich die Einbau-Kurve ab. Es scheint, daß die reaktionsfähigen Stellen der alkylierten depurinierten DNA progressiv besetzt werden. Bei einer Konzentration von 5 itiM haben diese Stellen 57 Moleküle
aufgenommen.

14
57 Moleküle [ C]-Methoxyamin pro 1000 . Nucleotide

14 Die unspezifische Retention des freien [ C) -Methoxyamins an den zur Bestimmung des Einbaus der radioaktiven Verbindung in die säureunlösliche DNA verwendeten Fiberglas-"scheiben . nimmt mit zunehmender Reagenz-Konzentration zu. Um die Hintergrundsstrahlung auf einem annehmbaren Wert zu halten, muß bei dem Test die niedrigste

14
Konzentration an [ C]-Methoxyamin verwendet werden, die noch eine vollständige Umsetzung mit den AP-Stellen innerhalb einer vernünftigen Zeit gestattet, nämlich 5 mM /" C_7-

Methoxyamin Endkonzentration.
35

Figur 3 zeigt die Bindung von [¹ C]-Methoxyamin durch unbehandelte und alkylierte depurinierte DNA bei zwei unterschiedlichen Reagenz-Konzentrationen als Funktion der Zeit (Inkubation bei 37°C und bei einem pH-Wert von

1 4

7,2). Eine längere Inkubation mit 5 mM [ C]-Methoxyamin verursacht keine signifikante Markierung der unbehandelten DNA. Demgegenüber nimmt die Bindung von 14
[ C]-Methoxyamin durch alkylierte depurinierte DNA mit der Zeit zu, und die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Reagenz-Konzentration ab. Die Einbaukurven entsprechend 1 und 5 mM Methoxyamin erreichen das gleiche Maximum. Dies deutet darauf hin, daß die Reaktion der alkylierten depurinierten DNA mit Methoxyamin nach genügend langer Inkubationszeit vollständig abläuft. Die ¹^ Einfügung in Figur 3 zeigt den Logarithmus der Zahl der spezifisch reaktionsfähigen Stellen, die bei einer Methoxvaminkonzentration von 5 mM noch nicht reagiert haben, als Funktion der Zeit. Es handelt sich um eine lineare Beziehung. Aus der Neigung der Geraden errechnet sich der Wert für die kinetische Konstante "von 34,4 M — 1

min . Die Geschwindigkeit der Reaktion hängt von der Temperatur ab. Sie verläuft 8 mal rascher bei 37°C als bei 0⁰C (die Werte sind nicht angegeben).

Eine 30minütige Inkubation bei 37⁰C mit 5 mM Endkonsentration Methoxyamin, die zu einer vollständigen Umsetzung sämtlicher reaktionsfähiger Stellen führt, wurde für den Standard-Test ausgewählt. Unter diesen Bedingungen ist die Menge an eingebautem Methoxyamin proportional zur Anzahl der spezifisch reaktionsfähigen . AP-Stellen in der alkylierten depurinierten DNA; vgl. Figur

Zur Bestimmung der Stabilität des Komplexes nach der Um-

14

setzung der alkylierten depurinierten DNA mit [ C]-Meth-

E. 3 oxyamin wurde das freie markierte Reagenz wegdialysiert gegebenenfalls durch 10 mM Endkonzentration nicht-markiertes Me-

-ιοί thoxyamin ersetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 5 zusammengefaßt. In Abwesenheit von nicht-markiertem Methoxyamin ist der radioaktive Komplex praktisch stabil. In Gegenwart von 10 mM Methoxyamin bei 37 C und pH 7,2 verliert die alkylierte "depuriniefte DNA' fortschreitend das gebundene

14

[ C]-Methoxyamin. Beim Auftragen der Ergebnisse im halb-.

logarithmischem Maßstab wird eine Gerade erhalten, aus der sich eine Halbwertszeit von 42 Minuten für das ge-

14
bundene [ C]-Methoxyamin errechnen läßt. Dies entspricht einer Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit von 0,0167 min . Diese Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit hängt von der Konzentration des unmarkierten Methoxyamins (nicht gezeigt) ab. Dies deutet darauf hin, daß der Verlust an Radioaktivität aus der alkylierten depurinierten DNA auf dem Ersatz des gebundenen [ C]-Methoxyamins durch unmarkiertes Methoxyamin beruht.

Durch Methoxyamin erfolgt kein Abbau der alkylierten depurinierten DNA. Bei der Inkubation von alkylierter de-

3

purinierter [ H]-DNA mit Methoxyamin bei einem pH-Wert von 7,2 und bei 37 C erfolgt keine Zunahme der Radioaktivität in der säurelöslichen Fraktion.

Alkylierte depurinierte [ H]-DNA (100 μg/ml) wurde bei 37°C mit oder ohne Zugabe von 0,2 M Natronlauge oder 5 mM Methoxyamin inkubiert. Nach den nachstehend in Tabelle I angegebenen Zeiten wird die Radioaktivität in der säurelöslichen Fraktion auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

NACHQEREICH Tabelle I

Inkubations- Säurelösliche Fraktion

zeit, mm _NaQH Methoxyamin

15 1,9 36 2,2 2,6

30 - - 2,3 2,6

60 - - 2,4 2,6

120 - - .. 2,7 2,7

,b,.Reaktion von Methoxyamin mit apyrimidinischen Stellen im synthetischen Polydesoxyribonucleotid

Figur 6 zeigt, daß [ C]-Methoxyamin mit den apyrimidinischen Stellen reagiert, die durch Uracil-DNA-Glycosylase in ein Uracil-enthaltendes Polydesoxyribonucleotid eingeführt worden sind. Bei einer Reagenzkonzentration von 5 mM verläuft die Reaktion rasch und erreicht ein Maximum entsprechend der AbsSttigung der apyrimidinischen Stellen nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C. Wie für eine alkylierte depurinierte DNA erfordert die Umsetzung mit 1 mM Methoxyamin Endkonzentration eine längere Reaktionszeit als mit 5 mM Methoxyamin-Endkonzentration. Darüber hinaus hält das Uracil enthaltende Kontroll-Polydesoxyribonucleotid kein C Q7-Methoxyamin zurück. Aus der Einfügung in Figur 6, die den Logarithmus der nicht umgesetzten Stellen bei einer Methoxyamin-Konzentration von 5 mM als Funktion der Zeit angibt, läßt sich eine kinetische Konstante von —1 —1

58,3 M min errechnen.

Experimentell wurde festgestellt, daß alkylierte

. DNA, die apurinische Stellen enthält, sowie eine synthetische doppelsträngige DNA, die apyrimidinische Stellen enthält, wesentlich mehr [¹⁴C]-Methoxyamin bin-

den, als die entsprechenden Kontrollproben, nämlich unbehandelte DNA oder die entsprechende homologe DNA ohne apyrimidinische Stellen.

Es wurden Reaktionsbedingungen aufgefunden, bei denen das höchste Verhältnis von spezifischer zu unspezifischer Bindung von [ C]-Methoxyamin erfolgt. Bei einer 30minütigen Inkubation bei 37°C mit 5 nH [¹⁴C]-Methoxyamin und einem pH-Wert von 7,2 reagieren praktisch sämtliehe spezifischen reaktionsfähigen Stellen (AP-Stellen) in alkylierter depurinierter DNA und in synthetischer DNA, die apyrimidinische Stellen enthält, mit dem

14

[ C]-Methoxyamin. Außerdem sind die Reaktionsgeschwindigkeiten für die apurinischen und apyrimidinischen Stellen, auch wenn sie in sehr verschiedenen Makromolekülen vorliegen, nahezu gleich.

Ferner wurde festgestellt, daß die Umsetzung von Methoxyamin mit AP-Stellen nicht bealeitet ist von der Bildung

" 14

eines Strangbruches, so daß das gebundene [ C]-Methoxyamin durch einfache Bestimmung der Radioaktivität der säureunlöslichen Fraktion gemessen werden kann.

14

Die Reaktion von [ C]-Methoxvamin mit spezifisch reak-25

tionsfähigen Stellen in alkylierter depurinierter DNA verläuft vollständig, sofern die Umsetzung eine ausreichend lange Zeit durchgeführt wird. Es wurde festgestellt, daß die Reaktion irreversibel ist. Der Komplex läßt sich bei einem pH-Wert von 7,2 nicht hydrolytisch spalten.

Die anschließende Inkubation mit unmarkiertem Methoxyamin ist jedoch von einer Abnahme der Radioaktivität begleitet. Dies ist ein Indiz dafür, daß das gebundene Methoxyamin durch das freie Methoxyamin substituiert wird.

NACHQEREICh

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet somit die direkte Bestimmung apurinischer und apyrimidinischer Stellen in DNA₁ die Charakterisierung von Substraten für AP-Endodesoxyribonucleasen, die Entdeckung neuer DNA-Glycosylasen und die Bestimmung ihrer Aktivität.

2. Reaktion von Uracil-DNA-Glycosylase mit Uracil enthaltendem Polydesoxyribonucleotid

(^23CT *^dT' ^^^^O ^{mit einem} Verhältnis von dTrdU . von 15 in einer Konzentration von 0,64 mM : Gesamtnucleotide wird bei 37°C mit (Kurven a und b) oder ohne (Kurven c und.d) Uracil-DNA-Glycosylase (2,3 Einheiten pro ml) unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen

inkubiert.
15

Bei den in Fig. 7 angegebenen Zeiten wird die enzyraatische Reaktion durch Zusatz von 0,5 M KCl Endkonzentration abgebrochen und das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf 70⁰C erhitzt. Das freigesetzte Uracil wird aus der Radioakti-

. vität der säurelöslichen Fraktion (Fig. 7A) berechnet.

Die Zahl der AP-Stellen wird aus der Radioaktivität der säureunlöslichen Fraktion (gebundenes £ c7~Methoxyamin) nach Inkubation unter den Standardbedingungen (pH 7,2; 37°C; 5 mit /⁴⁴Cj-Methoxyamin) (Fig. 7B) berechnet.

Aus dem Vergleich der Kurven a und b ist ersichtlich, daß freies Uracil und aoyrimidinische Stellen, welche sich

A 4 ~r
mit £ Cy-Methoxyarain umsetzen, in praktisch gleicher Men-

ge entstehen. Die Zahl der freigesetzten Uracil-Moleküle entspricht der Zahl der gebundenen £ c/ -Methoxyamin-Moleküle.

Legende für die Figuren:

Figur 1: Einfluß des pH-Werts auf die Reaktion von

14
[ C]-Methoxyamin mit alkylierter depurinierter

DNA

Die Reaktionsgemische enthalten 200 [ig/ml entweder unbehandelter (Kurve a) oder alkylierter depurinierter DNA (Kurve b) . Die Reaktionsgemische, werden-mit-5 itiM Endkonzentration

14 ο

t C]-Methoxyamin 30 Minuten bei 37 C inkubiert. Die angegebenen pH-Werte werden nach extensiver Dialyse gegen 1OmM NaCl, 10 mM Kaliumphosphat bei verschiedenen pH-Werten oder nach Zugabe von Salzsäure oder Natron-

14
lauge erreicht. Der Einbau von [ c]-Methoxyamin in D:

wird wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

14
Figur 2: Einbau von [ C]-Methoxyamin in alkylierte depu-

rinierte DNA als Funktion der Reagenz-Konzentration.

Die Reaktionsgemische enthalten 200 mg/ml entweder unbehandelte oder alkylierte depurinierte DNA in 0,1 M Boratpuffer ,pH 7,2·. Sie werden 30 Minuten bei 37°C mit den

14
angegebenen Konzentrationen an [ C]-Methoxyamin inku-

14
biert. Die Mengen an [ C]-Methoxyamin, gebunden an unbehandelte (Kurve a) und an alkylierte depurinierte DNA (Kurve b) wurden nach vorheriger Ausfällung mit Salzsäure wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

'/ ;' Λ y-\y -;;--.;: 3315ΐ 16

Figur 3: Einbau von [ C]-Methoxyarciin in alkylierte, depurinierte DNA als Funktion der Zeit

Die Reaktionsgemische enthalten 200 ug/ml entweder unbehandelte oder alkylierte depurinierte DNA. Die Inkubation erfolgt bei 37°C und einem pH-Wert von 7,2 mit 1 mM

14
(Kurve a) oder 5 mM (Kurve b) [ C]-Methoxyamin für die alkylierte depurinierte DNA und mit 5 mM (Kurve c) für die unbehandelte DNA. Bei den angegebenen Zeiten wird der Einbau von [ C]-Methoxyamin
beschriebene Weise bestimmt.

Einbau von [ C]-Methoxyamin in DNA auf die vorstehend

Einfügung in Figur 3:

Zahl der nicht umgesetzten Stellen (F) als Funktion der Zeit.

Die Zahl der nicht umgesetzten Stellen (F) wird durch Subtraktion der Zahl der umgesetzten Stellen von der Zahl der gesamten Stellen berechnet.

Beide werden bestimmt aus der Menge an eingebautem

14
t C]-Methoxyamin. Die Zeichnung stellt die Änderung von InF mit der Zeit dar.

14
Figur 4: Einbau von [ C]-Methoxyamin als Funktion der

reaktionsfähigen Stellen in alkylierter depuri-

nierter DNA.

Die Reaktionsgemische enthalten unterschiedliche Mengen

an reaktionsfähigen Stellen, die durch Vermischen unter-30

schiedlicher Mengen an unbehandelter und alkylierter depurinierter DNA bei einer Konzentration von 115 ug/ml erhalten werden. Die Reaktionen werden unter Standard-

14

bedingungen durchgeführt, nämlich 5 mM [ C]-Methoxyamin, 0,1 M Boratpuffer, pH 7,2, 30 Minuten bei 37°C. Der Einbau von [ C]-Methoxyamin in DNA wird auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt.

Figur 5: Stabilität des Komplexes bzw. der Verbindung aus der Umsetzung von Methoxyamin mit alkylierter depurinierter DNA.

Alkylierte depurinierte DNA (200 ug/ml) wird mit [¹⁴C]-Methoxyamin unter den Standardbedingungen inkubiert, überschüssiges nicht umgesetztes Reagenz wird durch extensive Dialyse gegen 10 mM NaCl, 10 mM Kaliumphosphat pH 7,2 abgetrennt. Die erhaltene DNA enthält 55 Moleküle (N_Q) [ C]-Methoxyamin gebunden pro 1000 Nucleotide. Die Inkubation erfolgt bei 37 C mit (Kurve a) oder ohne (Kurve b) 10 mM unmarkiertem Methoxyamin. Bei den angegebenen Zeiten wird die Menge des noch an DNA gebunde-

14
nen [ C]-Methoxyamins (N_fc) nach Ausfällung in Säure

'5 wie vorstehend beschrieben, bestimmt.

Figur 6: Reaktion von [ C]-Methoxyamin mit einem synthetischen Polymer, das apyrimidinische Stellen

enthält.
20

Die Reaktionsgemische enthalten 174 ug/ml entweder (dA)₂₃₀ . (dT, [³H] dü)₂₃₀ , behandelt mit Uracil-DNA-Glycosylase oder unbehandelte (3A)₂₃₀ Die Inkubation erfolgt bei 37 C, pH 7,2 mit 1 mM (Kurve a)

or 14

^iJ oder 5 mM (Kurveb) [ C]-Methoxyamin für das Polymer mit apyrimidinisehen Stellen und mit 5 mM (Kurve c) für das unbehandelte Polymer. Bei den angegebenen Zeiten

14
wird der Einbau des [ C]-Methoxyamins in das Polymer

auf die vorstehend beschriebene Weise bestimmt. 30

Figur 7: Reaktion von Uracil-DNA-Glycosylase mit Uracil enthaltendem Polydesoxyribonucleotid und Reaktion des erhaltenen apyrimidinischen Polymers mit E Cj-Methoxyamin; Feststellung einer Uracil-DNA-Glycosylase

Fig. 7A freigesetztes Uracil Fig. 7B Zahl der AP-Stellen

Claims (3)

1. VOSSlUS · VOSS! US -.TAU C M:N"E R · M EUNEMANN ■ RAU H

   PATENTANWÄLTE

   SI E B ERTSTRASS E 4 · 8OO O MÜNCHEN 86 · PHONE: (O 8 9) 47 4O75 CABLE: BENZO LPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 +5 3 VOPAT D

   u.Z.: S 348 (Vo/ko.)
   Case: 1/2064 DE

   EUROPÄISCHE ATOMGEMEINSCHAFT (EURATOM) Luxemburg

   Verfahren zur direkten Bestimmung apurinischer und

   apyrimxdinischer Stellen in DNA " 15

   Patentansprüche

   Verfahren zur direkten Bestimmung von apurinisehen und apyrimidinischen Stellen in DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu unter-

   suchende DNA-Probe mit [ C]-Methoxyamin in bestimmter überschüssiger Menge eine ausreichend lange Zeit bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7_F4 umsetzt, anschließend in saurem Medium das nicht umgesetzte

   14
   [ C]-Methoxyamin abtrennt und die Radioaktivität des

   14
   DNA-[ C]-Methoxyamin-Reaktionsprodukts bestimmt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von DNA-

   Glycosylasen, dadurch gekennzeichnet, daß man "die

   14

   Umsetzung der DNA-Probe mit [ C]-Methoxyamin in Gegenwart der DNA-Glycosylase oder nach Inaktivierung der DNA-Glycosylase durchführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei pH 7,2 und bei 37°C durchführt.

   L J