DE1901517C2 - Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen - Google Patents

Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen

Info

Publication number
DE1901517C2
DE1901517C2 DE1901517A DE1901517A DE1901517C2 DE 1901517 C2 DE1901517 C2 DE 1901517C2 DE 1901517 A DE1901517 A DE 1901517A DE 1901517 A DE1901517 A DE 1901517A DE 1901517 C2 DE1901517 C2 DE 1901517C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reagent
groups
atoms
reagent according
dye
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE1901517A
Other languages
English (en)
Other versions
DE1901517A1 (de
Inventor
Miroslav Uppsala Ceska
Björn Gustav-Adolf Ingelmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Health AB
Original Assignee
Pharmacia AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia AB filed Critical Pharmacia AB
Publication of DE1901517A1 publication Critical patent/DE1901517A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1901517C2 publication Critical patent/DE1901517C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/003—Crosslinking of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

Es ist ist außerordentlich wichtig, die sogenannten Endohydrolasen. die den Abbau der Polysaccharide bewirken, auf einfache und zuverlässige Weise bestimmen zu können. Ein besonders wichtiges Beispiel in dieser Hinsicht ist die Bestimmung des Enzyms «■Amylase, das Stärkere und Olykogen hydrolysiert, so Die Bestimmungen der Λ-Amylase werden in großer Anzahl vorgenommen, z. B. in der Medizin bei Urin- und Serumuntersuchungen für diagnostische Zwecke.
Die Routineverfahren haben bisher wesentliche Nachteile aufgezeigt, und man kann nicht sagen, daß sie völlig zufriedenstellend sind. Die Bestimmung der Λ-Amylase ist auch in der Industrie von Bedeutung. In ähnlicher Weise ist es auch wesentlich, daß man andere Endohydrolasen, die andere Polysaccharide, z. B. Dextran, hydrolysieren, einfach und zuverlässig bestimmen kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Reagentien und ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen, die Polysaccharide in wäßrigen Proben abbauen.
Der Ausdruck »Polysaccharide« bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen sowohl auf natürliche als auch auf synthetische Polysaccharide, die die strukturellen Eigenschaften der natürlichen Stärken, wie Amylose oder Amylopektin oder deren Dextrine, und Dextran aufweisen, wobei sie infolge dieser Eigenschaften durch die in Frage kommende Endohydrolase, nämlich eine Λ-Amylase oder Dextranase, abgebaut werden können. Bei dem Hydrolysevorgang baut die Endohydrolasp jlykosidische Bindungen in dem Poiysaccharid oder in dessen abbaubaren Derivaten ab.
Das erfindungsgemäße Reagens besteht aus einem wasserunlöslichen, jedoch hydrophilen, queiibaren, enzymatisch hydrolysierbaren dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen des Polysaccharids oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten, wobei die Moleküle durch Brücken mit kovaienten Bindungen vernetzt sind und in dem Netz ferner kovalent gebundene bestimmbare Gruppen oder Atome vorhanden sind.
Unter dem Ausdruck »bestimmbare Gruppen oder Atome« werden in der nachfolgenden Beschreibung und in den Ansprächen Farbstoff produzierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen oder radioaktive Isotope oder Gruppen verstanden, die radioaktive Isotope enthalten. Vorzugsweise werden jedoch aus praktischen Gründen die Farbstoff produzierenden Gruppen ausgewählt, da es verhältnismäßig einfach ist. Farbmessungen selbst in herkömmlichen Laboratorien vorzunehmen. Wird jedoch ein besonders hoher Empfindlichkeitsgrad gefordert, kann es ratsam sein, fluoreszierende Gruppen oder vorzugsweise radioaktive Isotope oder Gruppen, die radioaktive Isotope enthalten, zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Λ-Amylasen bzw. Dextranasen ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Probe ein Reagens der vorstehend beschriebenen Art. gegebenenfalls in Gegenwart eines Puffers mit dem für das betreffende Enzym notwendigen pH-Wert, einwirken läßt, nach Ablauf eines bestimmten Zeitraums die nicht gelöste Substanz des Reagens von der Flüssigk it. in der sich die gebildeten wasserlöslichen Fragmente des Reagens befinden, trennt und dann die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem nicht gelösten Reagens als Maß der Enzymaktivität bestimmt
Das Reagens kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise ist es möglich, mit Hilfe von bifunktionellen Brückenbildern Moleküle des Polysaccharids oder dessen Derivate, die durch die in Frage kommende Endohydrolase hydrolysiert werden können, mittels kovaknter Bindungen zu einem dreidimensionalen Netz zu vernetzen, woraufhin die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalenle Bindungen an das Netzwerk gebunden werden. Es ist auch möglich, zuerst die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalente Bindungen mit den Molekülen des Polysaccharids oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten zu verknüpfen und dann die Vernetzung mit Hilfe von bifunktionellen Brückenbildern zu bewirken. Es ist ferner möglich, die Vernetzung
und Einführung der bestimmbaren Gruppen in der gleichen Stufe, z. B. durch Verwendung von bifunktionellen Brückenbüdem, die auch die bestimmbaren Gruppen oder Atome, z. B. bifunktionelle reaktionsfähige. Farbstoff produzierende Substanzen enthalten, durchzuführen.
Es gibt viele Arten von bifunktionellen Substanzen, die als bifunktionelle Brückenbildner verwendet werden können. Beispiele für solche Brückenbildner sind Diepoxyde und die entsprechenden Halohydrine und Diisocyanate (z. B. Hexamethylendiisocyanat) und Diisothiocyanate. Solche Brückenbildner können beispielsweise mit Hydroxyl- oder Aminogruppen in dem Polysaccharid oder in dessen Derivaten, die durch die Endohydrolase hydrolysiert werden können, reagieren, woraufhin die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt werden.
Beispiele für solche bifunktionellen Epoxyde und Halohydrine sind
Dichlorhydrin, Epichlorhydri«,
-CH2 ■ CH(OH) · CH2- oder
Epibromhydrin,
1,2-ÄthandioIdiglycidyIäther,
1,4-ButandioldiglycidyIäther,
Glycerin-diglycidyläther,
Bis-[23-epoxypropyl]-äther und
1,2,3,4-Diepoxybutan-
Verbindungen setzen sich beispielsweise mit Hydroxylgruppen und Aminogruppen in Gegenwart einer alkalischen Substanz um. Wenn beispielsweise die Umsetzung mit Hydroxylgruppen im Polysaccharid stattfindet, dann handelt es sich um eine Brücke vom Typ
-O-A-O-,
bei der A eine Hydroxylgruppen enthaltende Alkylenbrück..-bedeutet, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sein kann. Das vernetzte Polymere ist unlöslich, aber in Wasser quellbar. Beispiele für A in der vorstehenden Brücke sind:
-CH2 - CH(OH) -CH2-O- CH2 CH(OH) CH2- oder
-CH2 · CH(OH) -CH2-O- CK2 CH2-O- CH2 · CH(OH) ■ CH2- oder -CH2 · CH(OH) · CH2 · O · (CH2J4 · O · CH2 · CH(OH) · CH2- oder -CH2 ■ CH(OH) · CH2 · O · CH2 · CH2 · O CH2 - CH2 O CH2 · CH(OH) · CH2- oder
— CH2 · CH(OH) ■ CH2 · O ■ Ch2 · CH(OH) -CH2-O- CH2 · CH(OH) · CH2- oder
— CH2 · CH(OH) · CH(OH) · CH2 — oder
— CH2 · CH(OH) · CH2 · O · CH2 · CH(OH) -CH2-O- (CH2^ · O · CH2 · CH(OH) · CH2 · O · CH2 • CH(OH) · CH2- oder
-CH2 · CH(OH) · CH2 ■ O · CH2 · CH(OH) · CH2 · O · (CHj)4 · O · CH2 · CH(OH) · CH1 · O - CH2 CH(OH) CH2-
Bei einer besonderen Ausführungsform sind die Moleküle des Polysaccharids mittels aliphatischen Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt, wobei in den Brücken die Anzahl der Kohlenstoffatome zwischen 2 und 20 (beispielsweise zwischen 3 und 20), vorzugsweise 3 und 15, z. B. zwischen 3 und 10, liegt. Es ist besonders zweckmäßig. Brücken auszuwählen, die Hydroxylgruppen enthaltende Alkylengruppen mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, wie z. B. 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, enthalten, wobei die Gruppen gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sein können. Solche Hydroxylgruppen enthaltende Brücken machen das Netzwerk hydrophiler, bewirken ein besseres Quellen in Wasser und verbessern die Eigenschaften dss Netzwerkes.
Die bestimmbaren Gruppen oder Atome können nach verschiedenen Verfahren eingeführt werden. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, gefärbte Gruppen einzuführen, dann ist es verhältnismäßig einfach, eine Umsetzung mit reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen zu bewirken, die sich beispielsweise mit Hydroxylgruppen oder Aminogruppen in dem Polysaccharid oder dessen Derivat umsetzen, z. B. Farbstoff bildende Substanzen, die sich mit Baumwolle oder Wolle umsetzen, wobei die Substanzen an das Polysaccharid oder das Polysaccharidderivat durch kovalente Bindungen gebunden werden. In Abhängigkeit von der Verwendung wird als zweckmäßigste Farbe beispielsweise ein Blau oder Rot ausgewählt. Beispiele für solche reaktionsfähigen. Farbstoff produzierenden Substanzen sind Cibacronscharlach 2 G. Cibacronblau 3 G. Di? Strukturformeln dieser Substanzen werden in einem Artikel v^n J. Panchartek et. al. in Coll. Czech. Chem. Commun., Band 25 (I960), Seiten 2783-2799 beschrieben. Die Einführung von fluoreszierenden Gruppen kann beispielsweise mit Fluoresceinderivaten, z. B. Fluoresceinisothiocyanat, bewirkt werden. Es gibt ferner eine Anzahl von Möglichkeiten, bei denen radioaktive Gruppen oder Gruppen, die radioaktive Isotope enthalten, verwendet werden können. Ein Beispiel besteht in der Einführung einer ein radioaktives Jodisotop, z. B. 125I, enthaltenden Gruppe. Es ist ferner möglich, zuerst eine Gruppe ohne Isotope und dann in die Gruppe ein radioaktives Isotop einzuführen. Dies kann beispielsweise dadurch erzielt werden, daß man zuerst eine Allylgruppe, z. B. mit Hilfe von Allylbromid, einführt und dann ein radioaktives lodisotoD an die
■ Doppelbindung anhgert.
Der Grad der Substitution mit Bezug auf die bestimmbaren Gruppen oder Atome und vernetzenden Brücken in den Polysaccharidmolekülen wird so reguliert, daß die Menge der vorhandenen, bestimmba- s ren Gruppen und Atome für das Bestimmungsverfahren ausreicht, und daB das dreidimensionale Netzwerk in ausreichender Weise zusammenhält. Der Grad der Substitution wird jedoch nicht so gewählt, daß der Abbau der Polysaccharidmoleküle in dem Netzwerk durch die in Frage kommende Endohydrolyse hier und dort verhindert wird. Ein geeigneter Substitutionsgrad in Bezug auf die bestimmbaren Gruppen und vernetzenden Brücken für das jeweilige Polysaccharid und die in Frage kommende Endohydrolyse kann durch Versuche vom Fachmann verhältnismäßig einfach bestimmt werden.
Falls das Reagens die Form von Teilchen haben soll, kann das bei der vorstehend beschriebenen Synthese des Reagens erhaltene Gelprodukt zu der entsprechenden Korngröße gemahlen werden. Die Synthese des gelförmigen Reagens kann auch als Perlpolymerisationsverfahren durch Emulgieren des P.eaktionsgemischs in einer inerten Flüssigkeit, mit der das Reaktionsgemisch nicht mischbar ist, bewirk« werden, wobei unmittelbar kleine kugelförmige Teilchen erhalten werden. Das erhaltene granuläre Material kann in geeigneter Weise gesiebt und die Fraktionen mit der entsprechenden Größe können dann isoliert werden.
Eine wesentliche Bedingung der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die Polysaccharidmoleküle. die mit den kovalent gebundenen, bestimmbaren Gruppen oder Atomen (z. B. Farbstoff bildenden Gruppen) verknüp't sind, durch Brücken mit kovalenten Bindungen verbunden sind. Auf diese Weise ist es für die bestimmbaren Gruppen oder Atome unmöglich, auf andere Weise in Lösung zu gehen als durch die Hydrolyse der entsprechenden Bindungen in den Polysaccharidmolekülen des Netzwerkes, nämlich durch die Endohydrolasen. Es ist ferner von Bedeutung, daß das Reagens. obwohl ir Wasser unlöslich, leicht durch die in Frage kommende Endohydrolase angegriffen werden kann. Diese Bedingung kann dadurch erfüllt werden, daß das Reagens aus einem hydrophilen, in Wasser quellbaren, dreidimensionalen lockeren Net/werk besteht, das durch Brücken mit kovalenten Bindungen verbunden ist. Die bestimmbaren Gruppen oder Atome, z. B. die leicht meßbaren. Farbstoff erzeugenden Gruppen, machen die Bestimmung verhältnismäßig leicht. Ferner macht die Kombination der vorstehend beschriebenen Kennzeichen ein besonders »tnpfindliches und zuverlässiges Bestimmungsverfahren möglich, das einfach durchgeführt werden kann und für Routinearbeiten außeror dentlich geeignet ist.
Wenn die Endohydrolase auf das Reagens einwirkt, werden die Pol>saccharidketten abgebaut und wasserlösliche Fragmente des Reagens mit daran angeordneten bestimmbaren Gruppen oder Atomen freigesetzt. Diese Fragmente werden gelöst und können leicht von dem nicht gelösten Reagens, z. B. durch einfaches Abfiltrieren oder Zentrifugieren getrennt werden. Die Bestimmung wird zweckmäßigerweise dadurch bewirkt, daß man die die in Frage kommende Hydrolase enthaltende wäßrige Probe mit einer entsprechenden Menge des Reagens in Berührung bringt und die Probe bei einer für das in Frage kommende Enzym geeigneten Temperatur eine vorbestimmte Zeitspanne unter Rühren auf das Reagr.rss einwirken läßt. Natürlich wird die Hydrolyse durch das Enzym bei einem pH-Wert, der für das in Frage kommende Enzym geeignet ist, und in einer entsprechenden salzhaltigen Umgebung bewirkt. Nachdem das Enzym während des bestimmten Zeitraums auf das Reagens eingewirkt hat, wird die weitere enzymatische Hydrolyse auf herkömmliche Weise unterbrochen. Beispielsweise ist es möglich, die weitere Hydrolyse des Reagens durch z. B. Erhitzen oder Kühlen des Systems, Ändemng des pH-Werts oder durch Zusatz eines geeigneten Inhibitors zu verhindern. Es ist auch möglich, das Reagens einfach von der Probelosung zu trennen, falls die dazu benötigte Zeit im Vergleich zu der Reaktionszeit kurz ist. Nach der Abtrennung des Reagens aus der Probelösung werden die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem ungelösten Reagens als Maß der Enzymaktivität ermittelt. In dieser Hinsicht ist es am einfachsten, wenn die bestimmbaren Gruppen Farbstoff produzierende Gruppen sind und der Farbstoff in der Flüssigkeit als Maß der Enzymaktivität bestimmt wird. Das Reagens wird vorzugsweise in feinteiliger Form verwendet, wobei die kleinen T..'chen so ausgewählt werden, dali eine große Kontaktoberfache erzielt wird, obgleich die Teilchen nicht zu klein sein sollten, da dadurch die Trennung der nicht gelösten Substanz und der Flüssigkeit schwierig wird. Durch Suspendieren der Teilchen unter Rühren in einer geeigneten Flüssigkeit ist es möglich, die Teströhrchen so zu füllen, daß sie das gleiche Volumen der erzielten Suspension aufweisen, so daß das Reagens in jedes Reagensglas in der gleichen Menge mit ausreichender Genauigkeit eingefüllt werden kann. Fehler, die durch Veränderungen der in die Teströhrchen eingeführten Substanzmenge entstehen, können dadurch reduziert werden, daß man für das Enzym eine überschüssige Menge des Substrats verwendet.
Das Reagens, das beispielsweise in feinteiliger Form vorliegt, kann mit einem inerten Material, beispielsweise in Form einer Trägersubstanz, gemischt werden. Es kann beispielsweise mit einer Papierniasse gemischt werden, so daß ein Papier erhalten wird, das aus einer Mischung mit dem Reagens besteht, wobei das Papier in für die Analyse geeignete Probestücke geschnitten werden kann.
Das Verfahren ist besonders von Bedeutung, wenn eine große Anzahl von «-Amylase-Restimmungen für medizinische Routineuntersuchungen und für industrielle Zwecke vorgenommen werden. Die derzeitigen Routineverfahren zur Bestimmung der Λ-Amylase sind nicht völlig zufriedenstellend, und daher entspricht das erfindungsgemäße Verfahren einem besonders wichtigen Erfordernis. Das Verfahren kann auch zur Bestimmung von Dextranasen angewendet werden.
Die Menge der bestimmbaren Gruppen oder Atome in ueii wasserlöslichen Fragmenten, die freigesetzt und gelöst werden, ist abhängig von der Enzymaktivität in der Probe und vom Zeitraum, innerhalb welchem das Enzym auf das Reagens einwirkt, tendiert. 15 g NaCI wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde bei 200C unter Rühren rr't 10 cm1 10 m NaOH-Lösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann ohne Rühren 20 Stunden bei 2O0C aufbewahrt. Anschließend wurden die Teilchen gründlich mit Wasser gewaschen, dann getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu einer durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 40 μιτι gemaiiicn. Die Tc i'chen sind in Wasser unlöslich, aber quellbar.
19 Ol
Beispiel 2
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 3cm3 1,4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispiel 3
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 5 cm3 1,4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispiel 4
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G-A verwendet. i>
Beispiel 5
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel I angewandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G anstelle von Cibacronblau J G-A verwendet.
Beispiel 6
50 g Stärke (löslich, p.a.) wurden in 200 cm3 Wasser gelöst und bei 20°C mit 10 g Cibacronblau 3 G-A und 15 g NaCl versetzt. Nachdem sich der Farbstoff gelöst 2j hatte, wurden 10 cm' m NaOH in das System eingerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend 20 Stunden bei 20°C aufbewahrt und dann tropfenweise unter Rühren mit 5 cm' 1,4-Butandioldiglycidyläther versetzt. Das erhaltene Gel wurde dann gemahlen und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Teilchen wurden nun getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu einer durchschnittlichen Teilchengröße von 40 μίτι gemahlen.
Beispiel 7
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde angewandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G- \ und 4 cm3 !.4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispiels
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde angewandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G anstelle von Cibacronblau 3 G-A verwendet.
Beispiel 9 4j
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel I angewandt, jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem Molekulargewicht (Mu) von 460 000 anstelle von Stärke verwendet.
Beispiel 10
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 angewandt jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem Molekulargewicht von M».= 460 000 anstelle von Stärke verwendet
Beispiel 11
Die Reagentien der Beispiele 1 bis 8 wurden mit einer a-Amylase untersucht, die aus der Bauchspeicheldrüse, dem Blutplasma. Urin, Speichel, Malz und Bacillus subtilus stammte. In diesen Fällen wurde die Freisetzung des Farbstoffs in geeigneter Weise bei 620 nm für die blaue Farbe und 510 nm für die rote Farbe gemessen. Ein geeigneter Paffer für die Verwendung bei den Bestimmungen ist ein 0,02 m Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, der zusätzlich NaQ (z. B. 0,01 M) enthält 0,02% NaN3 können ebenfalls dem Puffer zugesetzt werden, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Die Bestimmung wurde vorzugsweise so vorgenommen, daß die gewünschte Quantität des Reagens in einem Reagensglas mit einem geeigneten Volumen der Pufferlö.mng versetzt wurde, woraufhin die wäßrige Probe, die die Λ-Amylase enthielt, zugesetzt wurde. Das Reagensglas und sein Inhalt wurden bei einer geeigneten Temperatur während des beabsichtigten Zeitraums in einem Thermostaten geschüttelt, woraufhin die enzymatische Hydrolyse abgebrochen wurde, beispielsweise durch Erhitzen oder Kühlen des Systems oder Verändern des pH-Werts oder durch Zusatz von geeigneten Enzyminhibitoren auf bekannte Weise oder durch Abtrennen der Teilchen von der Flüssigkeit.
Die Farbmessung wurde zweckmäßigerweise bei der Flüssigkeit vorgenommen, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren von den Teilchen getrennt wurde.
Die Freiset/unE des Farbstoffs bei den Reagentien der Beispiele I bis 8 unttr dem Einfluß der vorstehend angeführten -»-Amylasen wurde bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise 20 bis 6O0C, bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen ais Funktion von Zeit und Quantität des Enzyms untersucht. Es wurden auch Tests mit unterschiedlichen Reagensmengen vorgenommen.
Als Ergebnis wurde ermittelt, daß die Bestimmungen zweckmäßig<"weise in dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 bei beispielsweise 37°C (obgleich höhere Temperaturen bis zu 47° C in einigen Fällen gewählt werden können) vorgenommen werden. Gewünschtenfalls können die Bestimmungen jedoch auch bei Raumtemperatur (200C) oder darunter durchgeführt werden, obgleich dann natürlich eine lange Reaktionszeit erforderlich ist. Für normale Routinebestimmungen der <*-Amylase wählt man zweckmäßigerweise eine Reagensmenge von 5 bis 10 mg, ein Puffervolumen von I bis 2cm! und ein Volumen der Enzymprobe von 0,01 bis 0.1 cm3.
Bei den Untersuchungen wurde ermittelt, daß die Freisetzung des Farbstoffs in den anfänglichen Stufen im wesentlichen eine rektilineare Funktion der Zeit ist. Es wurde ferner gefunden, daß die Freisetzung des Farbstoffs eine Funktion der Enzymaktivität der Probe ist, wobei ein höherer Grad der Farbstoff-Freisetzung nach einem bestimmten Zeitraum natürlich einem höheren Grad der Enzymaktivität der Probe entspricht und daß zuverlässige Kurven oder Tabellen für das Verhältnis zwischen dem freigesetzten Farbstoff und der Enzymaktivität für das in Frage kommende Reagens leicht aufgestellt werden können.
Zur Erläuterung der Empfindlichkeit des Verfahrens wird darauf hingewiesen, daß 0,04 ^g kristalline a-Amylase des Bacillus subtilis aus 1 mg des nach Beispiel 6 hergestellten Reagens nach 10 Minuten bei 47°C eine Farbstoffmenge freisetzen, die für die Durchführung des Meßverfahrens ausreichte. (Die optische Dichte bei 620 nm, d. h. ODewnm betrug etwa gleich 1 bei den in Frage kommenden Testbedingungen.)
Reine /J-Amylase, ein Exoenzym, sollte aus diesem Reagens keinen Farbstoff freisetzen. Bei der Untersuchung mit reiner /?-Amylase des Bacillus subtilis fand keine Freise;zung des Farbstoffs statt
Tests, die mit dem vorstehend beschriebenen Reagens und einer Anzahl von anderen Reagentien, die mit verschiedenen Mengen der reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen und 1,4-Butandiol-diglycidyIäther und anderen Brückenbildnern, wie z.B. 1,2-Äthandiol-
19 Ol
Tabelle 1
Reaktionszeit, Min.
OD620 nm
1,16
2,82
4,22
6,22
10
diglycidyläther und Epichlorhydrin unter verschiedenen Bedingungen hergestellt worden waren, zeigten die Nützlichkeit der Reagentien bei der Bestimmung der Λ-Amylase. Beispielsweise wurde gefunden, daß die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Reagentien sehr vorteilhaft waren in Bezug auf den Substitutionsgrad der Farbstoff bildenden Gruppen und vernetzenden Brücken und sich besonders für die Bestimmungen der nt-Ämylase eignen.
Beispiel 12
Um die Freisetzung von wasserlöslichen Fragmenten, die Farbstoff bildende Gruppen enthalten, als eine Funktion der Reaktionszeit weiter zu erläutern, wurden in der nachfolgenden Tabelle 1 die angewendeten Reaktionszeiten und entsprechenden ODh2Onm-Werte angeführt. Bei dem Test wurden -vArnylase von B. subtilis (0,08 μg/cmJ) und das Reagens des Beispiels 6 (5 mg/cmJ) verwendet. Die Temperatur betrug 60°C.
Die Puffet iübung wai uic lii öeisjiici ΊΊ ucm-Iii leuenc 2» Lösung mit einem pH-Wert von 7,0.
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt die Menge des Farbstoffs in der Lösung mit der Reaktionszeit zu.
35
Beispiel 13
In der nachfolgenden Tabelle 2 wurden die OD^onm-Werte eines Tests mit <vAmylase von B. subtilis angegeben. Die Enzymmenge schwankt zwischen 0,04 und 0,40 (ig/cm'. Die Menge des Reagens (nach Beispiel 6) betrug 7 mg/cmK Die Temperatur betrug 47° C und die Reaktionszeit 10 Minuten. Bei der Pufferlösung handelte es sich um die Lösung nach Beispiel 11 mit einem pH-Wert von 7,0.
Tabelle
Enzym, ug/cm3
OD620 nm
0,04 0,16 0,40 2,27
6,80
10,00
25
30 Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, steigt die Menge des Farbstoffs in der Lösung bei konstanter Reaktionszeit mit zunehmenden Mengen des Enzyms.
Beispiel 14
Die Reagentien der Beispiel 9 und 10 sowie andere Reagentien mit unterschiedlichen Mengen an Brückenbildnern und reaktionsfähigen, Farbstoff bildenden Substanzen im Verhältnis zu den Dextranpolymeren wurden mit Endodextranase von verschiedenen Mikroorganismen nach dem für die Λ-Amylase in den Beispielen 11, 12 und 13 beschriebenen Verfahren untersucht. Auch in diesem Fall wurde eine Freisetzung von gefärbten Fragmenten in gleicher Weise erhalten wie bei der Einwirkung von Λ-Amylase auf das vorstehend beschriebene Reagens für die Λ-Amylase.

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Reagens zur Bestimmung von Endohydrolasen der Gruppe «.-Amylasen oder Dextranasen, bestehend aus einem wasserunlöslichen, aber hydrophilen, quellbaren, enzymatisch hydrolysierbaren, dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen eines Polysaccharids der Gruppe Stärken bzw. Dextrane oder deren enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten, bei dem die Moleküle durch Brücken mit kovaienten Bindungen vernetzt sind und in dem Netz kovalent gebundene, bestimmbare Gruppen oder Atome vorhanden sind.
Z Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens in Teüchenform vorliegt
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid als Stärke, Amylose oder Amylopektin oder daraus erhaltenes Dextrin vorliegt
4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmbaren Gruppen Farbstoff bildende Gruppen sind.
5. Reagens nach einem der Ansprächt. 1 bis 4. dadurch gekennzeichnet, daß die vernetzenden Brücken aliphatische Gruppen sind, die 2 bis 20, vorzugsweise 3 bis 15, Kohlenstoffatome enthalten.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeu Hnet, daß die vernetzenden Brücken Hydroxylgruppen enthaltende Alkylengruppen mit 3 bis 20, μ vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen sind, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sind.
7. Reagens nach einem der Ansprüche I bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß es im Papiei maße als Trägersubstanz eingearbeitet ist.
8. Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen der Gruppe «-Amylasen oder Dextranasen, dadurch gekennzeichnet daß man die Probe auf ein Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7. gegebenenfalls in Gegenwart eines Puffers mit einem für das in Frage kommende Enzym zweckmäßigen pH-Wert, einwirken läßt, nach Ablauf eines bestimmten Zeitraumes die nicht gelöste Substanz des Reagens von der Flüssigkeit, in der sich die gebildeten wasserlöslichen Fragmente des Reagens befinden, trennt und dann die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem nicht gelösten Reagens ah Maß der Enzymaktivität bestimmt. so
DE1901517A 1968-01-15 1969-01-14 Reagens und Verfahren zur Bestimmung von &alpha;-Amylasen oder Dextranasen Expired DE1901517C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE00465/68A SE336915B (de) 1968-01-15 1968-01-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE1901517A1 DE1901517A1 (de) 1970-07-16
DE1901517C2 true DE1901517C2 (de) 1983-01-20

Family

ID=20256615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1901517A Expired DE1901517C2 (de) 1968-01-15 1969-01-14 Reagens und Verfahren zur Bestimmung von &alpha;-Amylasen oder Dextranasen

Country Status (11)

Country Link
US (1) US3676303A (de)
JP (2) JPS5134317B1 (de)
BE (1) BE726843A (de)
CH (1) CH499110A (de)
DE (1) DE1901517C2 (de)
DK (1) DK121822B (de)
FI (1) FI49883C (de)
FR (1) FR2000245A1 (de)
GB (1) GB1251433A (de)
NL (1) NL165218C (de)
SE (1) SE336915B (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1291077B (de) * 1966-06-08 1969-03-20 Demag Zug Gmbh Vorrichtung zur Verriegelung zweier Haengekatzfahrbahnen miteinander
GB1320086A (en) * 1970-09-11 1973-06-13 Boehringer Mannheim Gmbh Agent and method for the determination of hydrolysing enzymes
NL179399C (nl) * 1976-07-13 1986-09-01 Du Pont Werkwijze voor de bepaling van het amylase-gehalte van een monster en reagens-proefpakket daarvoor.
CA1095819A (en) * 1977-01-14 1981-02-17 Eastman Kodak Company Element for analysis of liquids
DE2819298A1 (de) * 1978-05-02 1979-11-08 Boehringer Mannheim Gmbh Alpha -amylasesubstrat und verfahren zu seiner herstellung
DE3001878A1 (de) * 1980-01-19 1981-07-23 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Polysaccharid-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung sowie diese enthaltende mittel
US4403032A (en) * 1980-04-11 1983-09-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Continuous spectrophotometric assay of microbial cellulase
US4321364A (en) * 1980-04-17 1982-03-23 Minister For Public Works For The State Of New South Wales Preparation of soluble chromogenic substrates
EP0040728A1 (de) * 1980-05-19 1981-12-02 Pharmacia Diagnostics Ab Prüfverfahren, welche biospezifische Affinitätsreaktionen umfassen
US4859581A (en) * 1986-03-10 1989-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Endoglycosidase assay

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3089828A (en) * 1960-12-27 1963-05-14 Schwarz Biores Inc Evaluation of proteolytic enzyme activity
FR1508496A (fr) * 1966-01-20 1968-01-05 Warner Lambert Pharmaceutical Produit et procédé pour le dosage de l'amylase

Also Published As

Publication number Publication date
FR2000245A1 (de) 1969-09-05
JPS5134317B1 (de) 1976-09-25
DK121822B (da) 1971-12-06
CH499110A (fr) 1970-11-15
FI49883C (fi) 1975-10-10
JPS5498700A (en) 1979-08-03
US3676303A (en) 1972-07-11
DE1901517A1 (de) 1970-07-16
SE336915B (de) 1971-07-19
GB1251433A (de) 1971-10-27
NL165218C (nl) 1981-03-16
BE726843A (fr) 1969-06-16
NL6900644A (de) 1969-07-17
FI49883B (de) 1975-06-30
NL165218B (nl) 1980-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2839170C2 (de) Chromatographisches Material
DE2524279C2 (de)
DE1901517C2 (de) Reagens und Verfahren zur Bestimmung von &amp;alpha;-Amylasen oder Dextranasen
Okuda et al. β-Glucan synthesis in the cotton fiber (I. Identification of β-1, 4-and β-1, 3-glucans synthesized in vitro)
DE3434104A1 (de) Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure und verfahren dazu
DE1768512B2 (de) Verfahren zur herstellung von in wasser unloeslichen, chemisch oder biologisch wirksamen derivaten von biopolymeren
DE2646879A1 (de) Matrix aus einem in wasser unloeslichen beta-1,3-glucangel und verfahren zu ihrer herstellung
EP0014258B2 (de) Wasserlösliche Makromolekularsubstanzen mit hohem Dispergier-, Suspendier- und Flüssigkeitsrückhaltevermögen und ihre Verwendung als Additiv
DE3001669A1 (de) Anordnung zur optischen messung von physikalischen groessen und stoffkonzentrationen
DE2126680A1 (de) Carcinoembryonisches Antigen
DE2059165A1 (de) Streptokinase in chemischer Bindung an eine Kohlehydratverbindung
DE2317352C2 (de) Perlförmige Zusammensetzung und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE4429018C2 (de) Verfahren zur Herstellung eines Enzyme immobilisierenden Trägers, Träger aus regeneriertem porösen Chitosan in Teilchenform und Verwendung des Trägers
DE3000292A1 (de) Indoxylmaltodextrine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3434082A1 (de) Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure
DE3224217A1 (de) Enzymimmunoassay-methode zur qualitativen und quantitativen bestimmung von substanzen
EP0034692B1 (de) Die Verwendung von Stärkederivaten für Indikatormittel
DE2102514B2 (de) Verfahren zur chemischen kupplung von biologisch wirksamen stoffen an ein hydrophiles polymer
DE2242710A1 (de) Komplex eines biologisch aktiven proteins mit einem polymeren
DE2137774A1 (de) Verfahren zur Gewinnung einer gegen Amylase hochempfindlichen wasserlöslichen Amylose
EP0030363B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von alpha-2-SB-Glykoprotein
DE1940869B2 (de) Amylaseaktivitat
DE2707913A1 (de) Verfahren zum nachweis von rheumatoiden faktoren
EP0005148B1 (de) Alpha-Amylasesubstrat und Verfahren zu seiner Herstellung
DE1673015B1 (de) Verfahren zur radiochemischen bestimmung von vitamin b tief 12

Legal Events

Date Code Title Description
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee