DE1901517C2 - Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen - Google Patents
Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder DextranasenInfo
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Description
Es ist ist außerordentlich wichtig, die sogenannten
Endohydrolasen. die den Abbau der Polysaccharide bewirken, auf einfache und zuverlässige Weise bestimmen zu können. Ein besonders wichtiges Beispiel in
dieser Hinsicht ist die Bestimmung des Enzyms «■Amylase, das Stärkere und Olykogen hydrolysiert, so
Die Bestimmungen der Λ-Amylase werden in großer Anzahl vorgenommen, z. B. in der Medizin bei Urin- und
Serumuntersuchungen für diagnostische Zwecke.
Die Routineverfahren haben bisher wesentliche Nachteile aufgezeigt, und man kann nicht sagen, daß sie
völlig zufriedenstellend sind. Die Bestimmung der Λ-Amylase ist auch in der Industrie von Bedeutung. In
ähnlicher Weise ist es auch wesentlich, daß man andere
Endohydrolasen, die andere Polysaccharide, z. B. Dextran, hydrolysieren, einfach und zuverlässig bestimmen
kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Reagentien und ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zur
Bestimmung von Endohydrolasen, die Polysaccharide in wäßrigen Proben abbauen.
Der Ausdruck »Polysaccharide« bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen
sowohl auf natürliche als auch auf synthetische Polysaccharide, die die strukturellen Eigenschaften der
natürlichen Stärken, wie Amylose oder Amylopektin oder deren Dextrine, und Dextran aufweisen, wobei sie
infolge dieser Eigenschaften durch die in Frage kommende Endohydrolase, nämlich eine Λ-Amylase
oder Dextranase, abgebaut werden können. Bei dem Hydrolysevorgang baut die Endohydrolasp jlykosidische Bindungen in dem Poiysaccharid oder in dessen
abbaubaren Derivaten ab.
Das erfindungsgemäße Reagens besteht aus einem wasserunlöslichen, jedoch hydrophilen, queiibaren,
enzymatisch hydrolysierbaren dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen des Polysaccharids oder dessen
enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten, wobei die Moleküle durch Brücken mit kovaienten Bindungen
vernetzt sind und in dem Netz ferner kovalent gebundene bestimmbare Gruppen oder Atome vorhanden sind.
Unter dem Ausdruck »bestimmbare Gruppen oder Atome« werden in der nachfolgenden Beschreibung und
in den Ansprächen Farbstoff produzierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen oder radioaktive Isotope oder
Gruppen verstanden, die radioaktive Isotope enthalten. Vorzugsweise werden jedoch aus praktischen Gründen
die Farbstoff produzierenden Gruppen ausgewählt, da es verhältnismäßig einfach ist. Farbmessungen selbst in
herkömmlichen Laboratorien vorzunehmen. Wird jedoch ein besonders hoher Empfindlichkeitsgrad gefordert, kann es ratsam sein, fluoreszierende Gruppen oder
vorzugsweise radioaktive Isotope oder Gruppen, die radioaktive Isotope enthalten, zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Λ-Amylasen bzw. Dextranasen ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Probe ein Reagens der
vorstehend beschriebenen Art. gegebenenfalls in Gegenwart eines Puffers mit dem für das betreffende
Enzym notwendigen pH-Wert, einwirken läßt, nach Ablauf eines bestimmten Zeitraums die nicht gelöste
Substanz des Reagens von der Flüssigk it. in der sich die
gebildeten wasserlöslichen Fragmente des Reagens befinden, trennt und dann die bestimmbaren Gruppen
oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem nicht gelösten Reagens als Maß der Enzymaktivität bestimmt
Das Reagens kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise ist es möglich, mit
Hilfe von bifunktionellen Brückenbildern Moleküle des Polysaccharids oder dessen Derivate, die durch die in
Frage kommende Endohydrolase hydrolysiert werden können, mittels kovaknter Bindungen zu einem
dreidimensionalen Netz zu vernetzen, woraufhin die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalenle
Bindungen an das Netzwerk gebunden werden. Es ist auch möglich, zuerst die bestimmbaren Gruppen oder
Atome durch kovalente Bindungen mit den Molekülen des Polysaccharids oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten zu verknüpfen und dann die
Vernetzung mit Hilfe von bifunktionellen Brückenbildern zu bewirken. Es ist ferner möglich, die Vernetzung
und Einführung der bestimmbaren Gruppen in der gleichen Stufe, z. B. durch Verwendung von bifunktionellen
Brückenbüdem, die auch die bestimmbaren Gruppen oder Atome, z. B. bifunktionelle reaktionsfähige.
Farbstoff produzierende Substanzen enthalten, durchzuführen.
Es gibt viele Arten von bifunktionellen Substanzen, die als bifunktionelle Brückenbildner verwendet werden
können. Beispiele für solche Brückenbildner sind Diepoxyde und die entsprechenden Halohydrine und
Diisocyanate (z. B. Hexamethylendiisocyanat) und Diisothiocyanate.
Solche Brückenbildner können beispielsweise mit Hydroxyl- oder Aminogruppen in dem
Polysaccharid oder in dessen Derivaten, die durch die Endohydrolase hydrolysiert werden können, reagieren,
woraufhin die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt werden.
Beispiele für solche bifunktionellen Epoxyde und Halohydrine sind
Dichlorhydrin, Epichlorhydri«,
-CH2 ■ CH(OH) · CH2- oder
Epibromhydrin,
1,2-ÄthandioIdiglycidyIäther,
1,4-ButandioldiglycidyIäther,
Glycerin-diglycidyläther,
Bis-[23-epoxypropyl]-äther und
1,2,3,4-Diepoxybutan-
Verbindungen setzen sich beispielsweise mit Hydroxylgruppen und Aminogruppen in Gegenwart
einer alkalischen Substanz um. Wenn beispielsweise die
Umsetzung mit Hydroxylgruppen im Polysaccharid stattfindet, dann handelt es sich um eine Brücke vom
Typ
-O-A-O-,
bei der A eine Hydroxylgruppen enthaltende Alkylenbrück..-bedeutet,
die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sein kann. Das
vernetzte Polymere ist unlöslich, aber in Wasser quellbar. Beispiele für A in der vorstehenden Brücke
sind:
-CH2 - CH(OH) -CH2-O- CH2 CH(OH) CH2- oder
-CH2 · CH(OH) -CH2-O- CK2 CH2-O- CH2 · CH(OH) ■ CH2- oder
-CH2 · CH(OH) · CH2 · O · (CH2J4 · O · CH2 · CH(OH) · CH2- oder
-CH2 ■ CH(OH) · CH2 · O · CH2 · CH2 · O CH2 - CH2 O CH2 · CH(OH) · CH2- oder
— CH2 · CH(OH) ■ CH2 · O ■ Ch2 · CH(OH) -CH2-O- CH2 · CH(OH) · CH2- oder
— CH2 · CH(OH) · CH(OH) · CH2 — oder
— CH2 · CH(OH) · CH2 · O · CH2 · CH(OH) -CH2-O- (CH2^ · O · CH2 · CH(OH) · CH2 · O · CH2
• CH(OH) · CH2- oder
-CH2 · CH(OH) · CH2 ■ O · CH2 · CH(OH) · CH2 · O · (CHj)4 · O · CH2 · CH(OH) · CH1 · O - CH2
CH(OH) CH2-
Bei einer besonderen Ausführungsform sind die Moleküle des Polysaccharids mittels aliphatischen
Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt, wobei in den Brücken die Anzahl der Kohlenstoffatome zwischen
2 und 20 (beispielsweise zwischen 3 und 20), vorzugsweise 3 und 15, z. B. zwischen 3 und 10, liegt. Es
ist besonders zweckmäßig. Brücken auszuwählen, die Hydroxylgruppen enthaltende Alkylengruppen mit 3 bis
20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, wie z. B. 3 bis 10 Kohlenstoffatomen,
enthalten, wobei die Gruppen gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sein
können. Solche Hydroxylgruppen enthaltende Brücken machen das Netzwerk hydrophiler, bewirken ein
besseres Quellen in Wasser und verbessern die Eigenschaften dss Netzwerkes.
Die bestimmbaren Gruppen oder Atome können nach verschiedenen Verfahren eingeführt werden.
Wenn es beispielsweise erwünscht ist, gefärbte Gruppen einzuführen, dann ist es verhältnismäßig einfach, eine
Umsetzung mit reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen zu bewirken, die sich beispielsweise mit
Hydroxylgruppen oder Aminogruppen in dem Polysaccharid oder dessen Derivat umsetzen, z. B. Farbstoff
bildende Substanzen, die sich mit Baumwolle oder Wolle umsetzen, wobei die Substanzen an das
Polysaccharid oder das Polysaccharidderivat durch kovalente Bindungen gebunden werden. In Abhängigkeit
von der Verwendung wird als zweckmäßigste Farbe beispielsweise ein Blau oder Rot ausgewählt. Beispiele
für solche reaktionsfähigen. Farbstoff produzierenden Substanzen sind Cibacronscharlach 2 G. Cibacronblau
3 G. Di? Strukturformeln dieser Substanzen werden in
einem Artikel v^n J. Panchartek et. al. in Coll. Czech.
Chem. Commun., Band 25 (I960), Seiten 2783-2799 beschrieben. Die Einführung von fluoreszierenden
Gruppen kann beispielsweise mit Fluoresceinderivaten, z. B. Fluoresceinisothiocyanat, bewirkt werden. Es gibt
ferner eine Anzahl von Möglichkeiten, bei denen radioaktive Gruppen oder Gruppen, die radioaktive
Isotope enthalten, verwendet werden können. Ein Beispiel besteht in der Einführung einer ein radioaktives
Jodisotop, z. B. 125I, enthaltenden Gruppe. Es ist ferner
möglich, zuerst eine Gruppe ohne Isotope und dann in die Gruppe ein radioaktives Isotop einzuführen. Dies
kann beispielsweise dadurch erzielt werden, daß man zuerst eine Allylgruppe, z. B. mit Hilfe von Allylbromid,
einführt und dann ein radioaktives lodisotoD an die
■ Doppelbindung anhgert.
Der Grad der Substitution mit Bezug auf die bestimmbaren Gruppen oder Atome und vernetzenden
Brücken in den Polysaccharidmolekülen wird so reguliert, daß die Menge der vorhandenen, bestimmba- s
ren Gruppen und Atome für das Bestimmungsverfahren ausreicht, und daB das dreidimensionale Netzwerk in
ausreichender Weise zusammenhält. Der Grad der Substitution wird jedoch nicht so gewählt, daß der
Abbau der Polysaccharidmoleküle in dem Netzwerk durch die in Frage kommende Endohydrolyse hier und
dort verhindert wird. Ein geeigneter Substitutionsgrad in Bezug auf die bestimmbaren Gruppen und vernetzenden
Brücken für das jeweilige Polysaccharid und die in Frage kommende Endohydrolyse kann durch Versuche
vom Fachmann verhältnismäßig einfach bestimmt werden.
Falls das Reagens die Form von Teilchen haben soll,
kann das bei der vorstehend beschriebenen Synthese des Reagens erhaltene Gelprodukt zu der entsprechenden
Korngröße gemahlen werden. Die Synthese des gelförmigen Reagens kann auch als Perlpolymerisationsverfahren
durch Emulgieren des P.eaktionsgemischs
in einer inerten Flüssigkeit, mit der das Reaktionsgemisch nicht mischbar ist, bewirk« werden,
wobei unmittelbar kleine kugelförmige Teilchen erhalten werden. Das erhaltene granuläre Material kann in
geeigneter Weise gesiebt und die Fraktionen mit der entsprechenden Größe können dann isoliert werden.
Eine wesentliche Bedingung der vorliegenden Erfindung
liegt darin, daß die Polysaccharidmoleküle. die mit den kovalent gebundenen, bestimmbaren Gruppen oder
Atomen (z. B. Farbstoff bildenden Gruppen) verknüp't
sind, durch Brücken mit kovalenten Bindungen verbunden
sind. Auf diese Weise ist es für die bestimmbaren Gruppen oder Atome unmöglich, auf andere Weise in
Lösung zu gehen als durch die Hydrolyse der entsprechenden Bindungen in den Polysaccharidmolekülen
des Netzwerkes, nämlich durch die Endohydrolasen. Es ist ferner von Bedeutung, daß das Reagens.
obwohl ir Wasser unlöslich, leicht durch die in Frage kommende Endohydrolase angegriffen werden kann.
Diese Bedingung kann dadurch erfüllt werden, daß das Reagens aus einem hydrophilen, in Wasser quellbaren,
dreidimensionalen lockeren Net/werk besteht, das durch Brücken mit kovalenten Bindungen verbunden ist.
Die bestimmbaren Gruppen oder Atome, z. B. die leicht meßbaren. Farbstoff erzeugenden Gruppen, machen die
Bestimmung verhältnismäßig leicht. Ferner macht die Kombination der vorstehend beschriebenen Kennzeichen
ein besonders »tnpfindliches und zuverlässiges Bestimmungsverfahren möglich, das einfach durchgeführt
werden kann und für Routinearbeiten außeror dentlich geeignet ist.
Wenn die Endohydrolase auf das Reagens einwirkt, werden die Pol>saccharidketten abgebaut und wasserlösliche
Fragmente des Reagens mit daran angeordneten bestimmbaren Gruppen oder Atomen freigesetzt.
Diese Fragmente werden gelöst und können leicht von dem nicht gelösten Reagens, z. B. durch einfaches
Abfiltrieren oder Zentrifugieren getrennt werden. Die Bestimmung wird zweckmäßigerweise dadurch bewirkt,
daß man die die in Frage kommende Hydrolase enthaltende wäßrige Probe mit einer entsprechenden
Menge des Reagens in Berührung bringt und die Probe bei einer für das in Frage kommende Enzym geeigneten
Temperatur eine vorbestimmte Zeitspanne unter Rühren auf das Reagr.rss einwirken läßt. Natürlich wird
die Hydrolyse durch das Enzym bei einem pH-Wert, der für das in Frage kommende Enzym geeignet ist, und in
einer entsprechenden salzhaltigen Umgebung bewirkt. Nachdem das Enzym während des bestimmten Zeitraums
auf das Reagens eingewirkt hat, wird die weitere enzymatische Hydrolyse auf herkömmliche Weise
unterbrochen. Beispielsweise ist es möglich, die weitere Hydrolyse des Reagens durch z. B. Erhitzen oder
Kühlen des Systems, Ändemng des pH-Werts oder durch Zusatz eines geeigneten Inhibitors zu verhindern.
Es ist auch möglich, das Reagens einfach von der Probelosung zu trennen, falls die dazu benötigte Zeit im
Vergleich zu der Reaktionszeit kurz ist. Nach der Abtrennung des Reagens aus der Probelösung werden
die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem ungelösten Reagens als Maß der
Enzymaktivität ermittelt. In dieser Hinsicht ist es am einfachsten, wenn die bestimmbaren Gruppen Farbstoff
produzierende Gruppen sind und der Farbstoff in der Flüssigkeit als Maß der Enzymaktivität bestimmt wird.
Das Reagens wird vorzugsweise in feinteiliger Form verwendet, wobei die kleinen T..'chen so ausgewählt
werden, dali eine große Kontaktoberfache erzielt wird,
obgleich die Teilchen nicht zu klein sein sollten, da dadurch die Trennung der nicht gelösten Substanz und
der Flüssigkeit schwierig wird. Durch Suspendieren der Teilchen unter Rühren in einer geeigneten Flüssigkeit
ist es möglich, die Teströhrchen so zu füllen, daß sie das
gleiche Volumen der erzielten Suspension aufweisen, so daß das Reagens in jedes Reagensglas in der gleichen
Menge mit ausreichender Genauigkeit eingefüllt werden kann. Fehler, die durch Veränderungen der in die
Teströhrchen eingeführten Substanzmenge entstehen, können dadurch reduziert werden, daß man für das
Enzym eine überschüssige Menge des Substrats verwendet.
Das Reagens, das beispielsweise in feinteiliger Form
vorliegt, kann mit einem inerten Material, beispielsweise in Form einer Trägersubstanz, gemischt werden. Es
kann beispielsweise mit einer Papierniasse gemischt werden, so daß ein Papier erhalten wird, das aus einer
Mischung mit dem Reagens besteht, wobei das Papier in für die Analyse geeignete Probestücke geschnitten
werden kann.
Das Verfahren ist besonders von Bedeutung, wenn eine große Anzahl von «-Amylase-Restimmungen für
medizinische Routineuntersuchungen und für industrielle Zwecke vorgenommen werden. Die derzeitigen
Routineverfahren zur Bestimmung der Λ-Amylase sind
nicht völlig zufriedenstellend, und daher entspricht das erfindungsgemäße Verfahren einem besonders wichtigen
Erfordernis. Das Verfahren kann auch zur Bestimmung von Dextranasen angewendet werden.
Die Menge der bestimmbaren Gruppen oder Atome in ueii wasserlöslichen Fragmenten, die freigesetzt und
gelöst werden, ist abhängig von der Enzymaktivität in der Probe und vom Zeitraum, innerhalb welchem das
Enzym auf das Reagens einwirkt, tendiert. 15 g NaCI wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde bei 200C
unter Rühren rr't 10 cm1 10 m NaOH-Lösung versetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann ohne Rühren 20 Stunden bei 2O0C aufbewahrt. Anschließend wurden die
Teilchen gründlich mit Wasser gewaschen, dann getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu einer
durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 40 μιτι
gemaiiicn. Die Tc i'chen sind in Wasser unlöslich, aber
quellbar.
19 Ol
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 3cm3 1,4-Butandiol-diglycidyläther
verwendet.
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 5 cm3 1,4-Butandiol-diglycidyläther
verwendet.
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G-A
verwendet. i>
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel I angewandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G
anstelle von Cibacronblau J G-A verwendet.
50 g Stärke (löslich, p.a.) wurden in 200 cm3 Wasser gelöst und bei 20°C mit 10 g Cibacronblau 3 G-A und
15 g NaCl versetzt. Nachdem sich der Farbstoff gelöst 2j
hatte, wurden 10 cm' m NaOH in das System
eingerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend 20 Stunden bei 20°C aufbewahrt und dann tropfenweise
unter Rühren mit 5 cm' 1,4-Butandioldiglycidyläther
versetzt. Das erhaltene Gel wurde dann gemahlen und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Teilchen wurden
nun getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu
einer durchschnittlichen Teilchengröße von 40 μίτι
gemahlen.
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde angewandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G- \ und
4 cm3 !.4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde angewandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G
anstelle von Cibacronblau 3 G-A verwendet.
Beispiel 9 4j
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel I angewandt, jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem
Molekulargewicht (Mu) von 460 000 anstelle von Stärke
verwendet.
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 angewandt jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem
Molekulargewicht von M».= 460 000 anstelle von Stärke
verwendet
Die Reagentien der Beispiele 1 bis 8 wurden mit einer
a-Amylase untersucht, die aus der Bauchspeicheldrüse, dem Blutplasma. Urin, Speichel, Malz und Bacillus
subtilus stammte. In diesen Fällen wurde die Freisetzung des Farbstoffs in geeigneter Weise bei 620 nm für die
blaue Farbe und 510 nm für die rote Farbe gemessen. Ein geeigneter Paffer für die Verwendung bei den
Bestimmungen ist ein 0,02 m Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, der zusätzlich NaQ (z. B.
0,01 M) enthält 0,02% NaN3 können ebenfalls dem Puffer zugesetzt werden, um das Wachstum von
Mikroorganismen zu verhindern. Die Bestimmung wurde vorzugsweise so vorgenommen, daß die gewünschte
Quantität des Reagens in einem Reagensglas mit einem geeigneten Volumen der Pufferlö.mng
versetzt wurde, woraufhin die wäßrige Probe, die die Λ-Amylase enthielt, zugesetzt wurde. Das Reagensglas
und sein Inhalt wurden bei einer geeigneten Temperatur während des beabsichtigten Zeitraums in einem
Thermostaten geschüttelt, woraufhin die enzymatische Hydrolyse abgebrochen wurde, beispielsweise durch
Erhitzen oder Kühlen des Systems oder Verändern des pH-Werts oder durch Zusatz von geeigneten Enzyminhibitoren
auf bekannte Weise oder durch Abtrennen der Teilchen von der Flüssigkeit.
Die Farbmessung wurde zweckmäßigerweise bei der Flüssigkeit vorgenommen, die durch Zentrifugieren
oder Filtrieren von den Teilchen getrennt wurde.
Die Freiset/unE des Farbstoffs bei den Reagentien der Beispiele I bis 8 unttr dem Einfluß der vorstehend
angeführten -»-Amylasen wurde bei verschiedenen
Temperaturen, beispielsweise 20 bis 6O0C, bei verschiedenen
pH-Werten und verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen ais Funktion von Zeit und Quantität
des Enzyms untersucht. Es wurden auch Tests mit unterschiedlichen Reagensmengen vorgenommen.
Als Ergebnis wurde ermittelt, daß die Bestimmungen zweckmäßig<"weise in dem vorgenannten Puffer mit
einem pH-Wert von 7,0 bei beispielsweise 37°C (obgleich höhere Temperaturen bis zu 47° C in einigen
Fällen gewählt werden können) vorgenommen werden. Gewünschtenfalls können die Bestimmungen jedoch
auch bei Raumtemperatur (200C) oder darunter durchgeführt werden, obgleich dann natürlich eine lange
Reaktionszeit erforderlich ist. Für normale Routinebestimmungen der <*-Amylase wählt man zweckmäßigerweise
eine Reagensmenge von 5 bis 10 mg, ein Puffervolumen von I bis 2cm! und ein Volumen der
Enzymprobe von 0,01 bis 0.1 cm3.
Bei den Untersuchungen wurde ermittelt, daß die Freisetzung des Farbstoffs in den anfänglichen Stufen
im wesentlichen eine rektilineare Funktion der Zeit ist. Es wurde ferner gefunden, daß die Freisetzung des
Farbstoffs eine Funktion der Enzymaktivität der Probe ist, wobei ein höherer Grad der Farbstoff-Freisetzung
nach einem bestimmten Zeitraum natürlich einem höheren Grad der Enzymaktivität der Probe entspricht
und daß zuverlässige Kurven oder Tabellen für das Verhältnis zwischen dem freigesetzten Farbstoff und
der Enzymaktivität für das in Frage kommende Reagens leicht aufgestellt werden können.
Zur Erläuterung der Empfindlichkeit des Verfahrens wird darauf hingewiesen, daß 0,04 ^g kristalline
a-Amylase des Bacillus subtilis aus 1 mg des nach Beispiel 6 hergestellten Reagens nach 10 Minuten bei
47°C eine Farbstoffmenge freisetzen, die für die Durchführung des Meßverfahrens ausreichte. (Die
optische Dichte bei 620 nm, d. h. ODewnm betrug etwa
gleich 1 bei den in Frage kommenden Testbedingungen.)
Reine /J-Amylase, ein Exoenzym, sollte aus diesem
Reagens keinen Farbstoff freisetzen. Bei der Untersuchung mit reiner /?-Amylase des Bacillus subtilis fand
keine Freise;zung des Farbstoffs statt
Tests, die mit dem vorstehend beschriebenen Reagens und einer Anzahl von anderen Reagentien, die mit
verschiedenen Mengen der reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen und 1,4-Butandiol-diglycidyIäther
und anderen Brückenbildnern, wie z.B. 1,2-Äthandiol-
19 Ol
Reaktionszeit, Min.
OD620 nm
1,16
2,82
4,22
6,22
2,82
4,22
6,22
10
diglycidyläther und Epichlorhydrin unter verschiedenen Bedingungen hergestellt worden waren, zeigten die
Nützlichkeit der Reagentien bei der Bestimmung der Λ-Amylase. Beispielsweise wurde gefunden, daß die in
den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Reagentien sehr vorteilhaft waren in Bezug auf den Substitutionsgrad
der Farbstoff bildenden Gruppen und vernetzenden Brücken und sich besonders für die Bestimmungen der
nt-Ämylase eignen.
Um die Freisetzung von wasserlöslichen Fragmenten, die Farbstoff bildende Gruppen enthalten, als eine
Funktion der Reaktionszeit weiter zu erläutern, wurden in der nachfolgenden Tabelle 1 die angewendeten
Reaktionszeiten und entsprechenden ODh2Onm-Werte
angeführt. Bei dem Test wurden -vArnylase von B. subtilis (0,08 μg/cmJ) und das Reagens des Beispiels 6
(5 mg/cmJ) verwendet. Die Temperatur betrug 60°C.
Die Puffet iübung wai uic lii öeisjiici ΊΊ ucm-Iii leuenc 2»
Lösung mit einem pH-Wert von 7,0.
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt die Menge des Farbstoffs in der Lösung mit der Reaktionszeit zu.
35
In der nachfolgenden Tabelle 2 wurden die OD^onm-Werte
eines Tests mit <vAmylase von B. subtilis angegeben. Die Enzymmenge schwankt zwischen 0,04
und 0,40 (ig/cm'. Die Menge des Reagens (nach Beispiel 6) betrug 7 mg/cmK Die Temperatur betrug 47° C und
die Reaktionszeit 10 Minuten. Bei der Pufferlösung handelte es sich um die Lösung nach Beispiel 11 mit
einem pH-Wert von 7,0.
Enzym, ug/cm3
OD620 nm
0,04 0,16 0,40 2,27
6,80
10,00
25
30 Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, steigt die Menge des Farbstoffs in der Lösung bei konstanter Reaktionszeit
mit zunehmenden Mengen des Enzyms.
Die Reagentien der Beispiel 9 und 10 sowie andere Reagentien mit unterschiedlichen Mengen an Brückenbildnern
und reaktionsfähigen, Farbstoff bildenden Substanzen im Verhältnis zu den Dextranpolymeren
wurden mit Endodextranase von verschiedenen Mikroorganismen nach dem für die Λ-Amylase in den
Beispielen 11, 12 und 13 beschriebenen Verfahren untersucht. Auch in diesem Fall wurde eine Freisetzung
von gefärbten Fragmenten in gleicher Weise erhalten wie bei der Einwirkung von Λ-Amylase auf das
vorstehend beschriebene Reagens für die Λ-Amylase.
Claims (8)
1. Reagens zur Bestimmung von Endohydrolasen der Gruppe «.-Amylasen oder Dextranasen, bestehend aus einem wasserunlöslichen, aber hydrophilen,
quellbaren, enzymatisch hydrolysierbaren, dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen eines Polysaccharids der Gruppe Stärken bzw. Dextrane oder
deren enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten, bei dem die Moleküle durch Brücken mit kovaienten
Bindungen vernetzt sind und in dem Netz kovalent gebundene, bestimmbare Gruppen oder Atome
vorhanden sind.
Z Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens in Teüchenform vorliegt
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid als Stärke,
Amylose oder Amylopektin oder daraus erhaltenes Dextrin vorliegt
4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmbaren Gruppen Farbstoff bildende Gruppen sind.
5. Reagens nach einem der Ansprächt. 1 bis 4.
dadurch gekennzeichnet, daß die vernetzenden Brücken aliphatische Gruppen sind, die 2 bis 20,
vorzugsweise 3 bis 15, Kohlenstoffatome enthalten.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeu Hnet, daß die vernetzenden Brücken Hydroxylgruppen enthaltende Alkylengruppen mit 3 bis 20, μ
vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen sind, die
gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sind.
7. Reagens nach einem der Ansprüche I bis 6. dadurch gekennzeichnet, daß es im Papiei maße als
Trägersubstanz eingearbeitet ist.
8. Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen der Gruppe «-Amylasen oder Dextranasen,
dadurch gekennzeichnet daß man die Probe auf ein Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
gegebenenfalls in Gegenwart eines Puffers mit einem für das in Frage kommende Enzym zweckmäßigen pH-Wert, einwirken läßt, nach Ablauf eines
bestimmten Zeitraumes die nicht gelöste Substanz des Reagens von der Flüssigkeit, in der sich die
gebildeten wasserlöslichen Fragmente des Reagens befinden, trennt und dann die bestimmbaren
Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem nicht gelösten Reagens ah Maß der Enzymaktivität
bestimmt. so
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