DE69128196T3

DE69128196T3 - Enzymstabilisierung

Info

Publication number: DE69128196T3
Application number: DE69128196T
Authority: DE
Inventors: Timothy Gibson; John Woodward
Original assignee: University of Leeds Innovations Ltd
Current assignee: University of Leeds Innovations Ltd
Priority date: 1990-03-24
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2011-03-26
Also published as: WO1991014773A3; DE69128196D1; WO1991014773A2; DE69128196T2; EP0523130B2; ATE160171T1; EP0523130A1; CA2040815C; GB9006642D0; AU7572091A; CA2040815A1; EP0523130B1

Description

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von Enzymen im trockenen Zustand.
Die PCT/GB/89/01346 offenbart die Stabilisierung von Proteinen, insbesondere Enzymen, mit Kombinationen aus kationischen Polyelektrolyten und cyclischen Polyolen.
Erfindungsgemäß umfaßt ein Verfahren zum Schützen von Enzymen gegen Denaturierung beim Trocknen die Schritte des Mischens einer wässrigen Lösung des Enzyms mit löslichem anionischen Polyelektrolyt und cyclischem Polyol und Entfernen von Wasser aus der Lösung.
Die biologische Aktivität in einem Enzymsystem kann beim Trocknen mit den erfindungsgemäßen Stabilisatoren verbessert werden. Ein Gefriertrocknen der Proben kann angewendet werden. Vakuumtrocknen und Lufttrocknen bei Umgebungstemperaturen ohne Denaturierung ist jedoch bevorzugt.
Zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Aktivität beim Trocknen können die in Anwesenheit des anionischen Polyelektrolyten und cyclischen Polyols getrockneten Enzyme nach längerer Lagerdauer eine Beibehaltung der Aktivität zeigen. Obwohl unterschiedliche Verbindungen eingesetzt wurden, um aktive, getrocknete Enzymzusammensetzungen bereitzustellen, liefert die vorliegende Erfindung ausgezeichnete Eigenschaften bei verlängerter Lagerung.
Das cyclische Polyol kann einen oder mehrere alicyclische Ringe aufweisen und kann mindestens eine Seitenkette haben. Verbindungen mit 5 bis 10 Hydroxygruppen können bevorzugt sein. Nichtreduzierende Polyole sind bevorzugt. Disaccharide oder Trisaccharide und Derivate sind besonders wirksam, aber andere cyclische Polyole, beispielsweise Inositol, können verwendet werden. Das Polyol kann so gewählt werden, daß es sowohl zum Enzym oder anderem Protein als auch zu dem entsprechenden Polyelektrolyten paßt.
Die Verwendung von Lactit ist besonders bevorzugt, obwohl Lactose, Maltose, Saccharose und Cellobiose auch verwendet werden können.
Die Menge an Polyol kann in dem bevorzugten Bereich von 1 bis 20%, weiter bevorzugt von 2 bis 10%, liegen. Die in dieser Beschreibung verwendeten Prozentangaben bezeichnen, wenn nicht anders angegeben, Gewicht zu Volumen einer wässrigen Lösung.
Das anionische Polymer ist vorzugsweise ein Polymer mit anionischen Gruppen, die entlang der Molekülkette verteilt sind. Die anionischen Gruppen, die Carboxy-, Sulfonsäure-, Sulfat- oder andere negativ geladene, ionisierbare Gruppen umfassen, können an an der Kette hängenden Gruppen oder direkt an dem Rückgrat des Polymers gebunden sein.
Natürliche oder künstliche Polymere können eingesetzt werden. Natürliche Polymere, wie derivatisierte Polysaccharide, können bevorzugt werden, da viele synthetische Polymere häufig Rückstände an anorganischen Polymerisationskatalysatoren enthalten. Alternativ können synthetische Polymere verwendet werden, insbesondere dann, wenn sie in starker Verdünnung verwendet werden.
Carboxymethylcellulose und Natriumalginat (reich an Galacturonsäureresten) sind Beispiele von Carboxygruppen enthaltenden Polymeren, Dextransulfat ist ein Beispiel eines Sulfat enthaltenden Polymers. Polymere mit einem Molekulargewicht von 5.000 bis 500.000, vorzugsweise von 5.000 bis 20.000, und weiter bevorzugt von 5.000 bis 10.000, können verwendet weiden. Eine Menge von 0,05 bis 10% (Gew./Vol.) ist bevorzugt, insbesondere von 0,01 bis 10%, weiter bevorzugt 0,5 bis 2%. Die Verwendung von Spurenmengen des Polyelektrolyten liefert überraschenderweise eine ausgezeichnete Stabilisierung, insbesondere bei der Lagerung. Die Verwendung einer minimalen Menge des Polyelektrolyten ist bevorzugt.
Der pH-Wert, bei dem das Enzym in Übereinstimmung mit dieser Erfindung getrocknet werden kann, kann für den optimalen Erhalt der Aktivität sowohl beim Trocknen als auch nach der anschließenden Lagerung wichtig sein. Der optimale pH für ein bestimmtes Enzym kann durch einfache Versuche bestimmt werden. Man hat gefunden, daß Chargen von Enzymen aus unterschiedlichen Quellen unterschiedliche Bedingungen für eine optimale Stabilisierung benötigen.
Man hat gefunden, daß Lactatdehydrogenase zwischen pH 6,0 und pH 7,0, insbesondere bei pH 6,0, die höchste Aktivität beibehält.
Peroxydase behält die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von 7,0 bei.
Alkoholoxidase wird auch durch eine Kombination aus anionischem Polyelektrolyten/cyclischem Polyol bei pH 7,0 stabilisiert.
Die Trocknung wird vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 4ºC und 50ºC, insbesondere zwischen 25ºC und 35ºC, durchgeführt.
Das getrocknete Produkt kann als frei rieselndes Pulver hergestellt werden oder es kann Teil eines Teststreifens oder einer anderen analytischen oder diagnostischen Vorrichtung oder Apparatur sein.
Die vorliegende Erfindung findet eine besondere Verwendung bei der Stabilisierung von Enzymen, die die höchste Aktivität bei hohem pH aufweisen, beispielsweise bei alkalischer Phosphatase. Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung die Verwendung eines bestimmten Enzyms in einem Assay-System, bei dem alkalische Reagenzien verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen beschrieben, die in keinerlei Art und Weise einschränkend sind.
Sämtliche Stabilisierungssysteme verwenden Puffer, um stabile pH-Bedingungen beizubehalten.
Eine Pufferlösung, die Na&sub2;HPO&sub4; 1120 (10,855 g) und NaH&sub2;PO&sub4; 21120 (6,084 g) enthält, wurde in 1,0 l destilliertem Wasser gelöst, um eine Lösung mit einem pH von 7,0 und einer Konzentration von 100 mM/l zu ergeben. Diese wurde nach Bedarf verdünnt.
Ein alternativer Puffer ist MOPS (4-Morpholinopropansulfonsäure), 52,25 g/2,5 l destilliertes Wasser, um eine Lösung zu ergeben, die 100 Millimol pro Liter enthält, zu der 4,0 M NaOH für den erforderlichen pH, beispielsweise pH 7, zugesetzt wird.
In den folgenden Beispielen wurden keine Benetzungsmitel verwendet. Dies schließt jedoch deren Verwendung bei den Stabilisierungsystemen nicht aus. Byco A, ein Protein (Gelatine) -hydrolysat, kann beispielsweise als frisch hergestellte Lösung in einer Konzentration von 1% verwendet werden.
Die Enzymlösungen wurden vor Verwendung frisch hergestellt. Eine Stammsuspension von Enzym in einer Ammoniumsulfatlösung wurde zentrifugiert und dann erneut gelöst und gegen einen geeigneten Puffer dialysiert oder zentrifugiert, erneut gelöst und ohne weitere Behandlung verwendet.
Die Konzentrationen des gelagerten Enzyms variierte erheblich, gewöhnlich innerhalb Konzentrationen zwischen 10 bis 5.000 Einheiten Aktivität pro ml Lösung. Die Proteinkonzentration betrug 0,05 mg bis 100 mg/cm³.
Die Nachweissysteme für jedes Enzym waren jene, die gewöhnlich in der veröffentlichten Literatur eingesetzt werden, Bergmeyer, H. U. Methods in Enzymatic Analysis, das die verwendete Standard-Literatur darstellt.
Die Aktivität wurde bei Standard-Temperaturen kinetisch gemessen und die Reaktionsgeschwindigkeit unter Verwendung eines Beckman-Du-50-Spektrophotometers, das mit einem Kinetics Softpac Microprogram ausgestattet war, automatisch aufgetragen.
Die trockenen Zubereitungen wurden durch Mischen der Enzyme, Puffer, anionischen Polyelektrolyten und Polyolen unter Rühren hergestellt. Aliquots wurden in Cuvetten eingefüllt und in einem Vakuumofen über Silicagel als Trocknungsmittel für mind. 4 Std. bei 30 bis 35ºC bei 0,1 mm Quecksilbersäule getrocknet.
Die Stabilität derartiger Zubereitungen wurde durch Lagern bei erhöhten Temperaturen, 37ºC oder 50ºC, untersucht. Die Proben wurden über Silicagel als Trocknungsmittel getrocknet, von Zeit zu Zeit entfernt und in dem für die Enzymbestimmung empfohlenen Assaypuffer wiederhergestellt und auf die verbleibende Aktivität des Enzyms untersucht.

Beispiel 1

Alkoholoxidase (Hansenula polymorpha; eigene Herstellung) Alkoholoxidase 617 U/cm&supmin;³ (Hansenula polymorpha) 16 ul
Lactitol 20% 250 ul
Natriumalginat 2% 250 ul
Natriumphosphatpuffer 10 mMol, pH 7,0 484 ul
Das Gemisch wurde vermischt und ein Volumen von 0,1 ml in Cuvetten wie beschrieben getrocknet, bei 37ºC gelagert und in einer mit Peroxidasefarbstoff verbundenen Reaktion bei 505 nm auf Aktivität untersucht.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 2

L-Lactatdehydrogenase (SIGMA-Typ II L 2500)
L-Lactatdehydrogenase (dialysiert), ca. 4.000 U/cm³ 15 ul
Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, 10 mMol 1110 ul
Diese wurden vermischt und zu einer Lösung von 375 ul des Stabilisators, wie in Tabelle 2 gezeigt, gegeben.
Das Gemisch wurde gut verrührt und 0,1 cm³ wurden in Cuvetten überführt, das wie beschrieben bei vermindertem Druck getrocknet, bei 37ºC gelagert und unter Beobachtung der Bildung von β-NADH bei 340 nm aus L-Lactat und β-NAD in Glycinpuffer bei einem pH von 8,9 untersucht wurde.

Beispiel 3

L-Lactatdehydrogenase (SIGMA-Typ II L-250)
L-Lactatdehydrogenase (dialysiert), ca. 4.000 U/cm³ 15 ul
Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, 10 mMol 1110 ul
Diese wurden vermischt und zu einer Lösung von 375 ul der in Tabelle 3 gezeigten Stabilisatoren gegeben.
Die Gemische wurden gut verrührt und 0,1 cm³ wurde in Cuvetten überführt, wie beschrieben getrocknet, bei 37ºC gelagert und durch Beobachten der Bildung von β- NADH bei 340 nm aus L-Lactat und β-NAD in Glycinpuffer bei einem pH von 8, 9 untersucht.

Beispiel 4

Alkalische Phosphatase (SIGMA p-7640 Typ 1-S)
Alkalische Phosphatase 6 U/ cm³
in Phosphatpuffer, pH 7,0, 100 mMol) 30 ul
destilliertes Wasser 270 ul
Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 10 mMol 1200 ul
Diese wurden vermischt und zu 500 ul gemischter Lösungen der in Tabelle 4 gezeigten Stabilisatoren gegeben.
Die Gemische wurden gut verrührt und 0,1 cm³ wurde in Cuvetten überführt und wie beschrieben getrocknet. Die Reaktionen wurden bei 440 nm durch Freisetzung von Nitrophenol aus dem Substrat 4-Nitrophenolphosphat bei einem pH von 10,5 in 2-Amino-2- methyl-1-propanol/HCl-Puffer untersucht.

Beispiel 5

Meerrettichperoxidase (SIGMA-Typ II), p-8250
Meerrettichperoxidase 20 U/cm³ 300 ul
Natriumphosphatpuffer; pH 7,0, 10 mMol 1200 ul
Diese wurden vermischt und zu 500 ul gemischter Lösungen der in Tabelle 5 gezeigten Stabilisatoren gegeben. Die Experimente wurden ebenfalls unter Verwendung anderer Peroxidasen durchgeführt.
Die Gemische wurden gut verrührt und 0,1 cm³ wurden in Cuvetten überführt und wie beschrieben getrocknet. Die Aktivität wurde unter Verwendung der colorimetrischen Reaktion von 4-Aminoantipyrin und Phenolsulfonsäure mit Wasserstoffperoxid als Substrat, gemessen bei 505 nm, untersucht.

Beispiel 6

β-Galacosidase (SIGMA G-1875 Grad III)
β-Galacosidase 1 U/cm³ 25 ul
(in 100 mMol, pH 7,0 Phosphat) 125 ul
Natriumphosphatpuffer; pH 7,0, 10 mMol 600 ul
Diese wurden zu 250 ul einer Lösung der in Tabelle 6 gezeigten Stabilisatoren gegeben.
Das Gemisch wurde gut verrührt, 0,1 cm wurde in eine Cuvette überführt und wie beschrieben getrocknet. Die Aktivität wurde unter Beobachtung der Freisetzung von O- Nitrophenol bei 405 nm aus dem Substrat O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid in Maleatpuffer bei pH 7,3 gemessen.

Beispiel 7

β-Galactosidase (SIGMA G-1875 Grad III)
β-Galactosidase 1 U/cm³ 25 ul
(in 100 mMol, pH 7,0, Phosphat)
destilliertes Wasser 125 ul
Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 10 mMol 600 ul
Diese wurden zu 250 gl einer gemischten Lösung der in Tabelle 7 gezeigten Stabilisatoren gegeben.
Das Gemisch wurde gut verrührt und 0,1 cm³ wurde in Cuvetten überführt und wie beschrieben getrocknet. Die Aktivität wurde anhand des gleichen Verfahrens wie vorstehend gemessen.

Beisipel 8

Diacetylreduktase (Huhn-Leber), eigene Herstellung
Diacetylreduktase 19 U/cm³ 100 ul
(Natriumphosphatpuffer; 10 mMol, pH 7,0)
Diese wurden zu 250 ul der in Tabelle 8 gezeigten Stabilisatoren gegeben.
Die Gemische wurden gut verrührt und 0,1 ml wurde in Cuvetten wie beschrieben getrocknet, bei 37ºC gelagert und unter Verwendung der Abnahme der Absorption bei 340 nm, was dem Verbrauch an NADH bei der Reduktion von Diacetyl-(2,3-butandion) bei pH 6,1 entsprach, untersucht.

Beispiel 9

Lactatdehydrogenase (SIGMA-Typ II)

Das dialysierte Enzym (15 ul aus 4.000 U/cm³) wurde zu 10 mMol Natriumphosphatpuffer (1110 ul) gegeben und 375 ul einer Lösung von Stabilisatoren wurde zugesetzt, um die in Tabelle 9 gezeigten Konzentrationen zu erhalten. 100 ul Aliquots wurden wie vorstehend getrocknet. Die Aktivität wurde unter Verwendung des gleichen Assaysystems wie in den Beispielen 2 und 3 untersucht.

Beispiel 10

Maleatdehydrogenase

20 ul einer Suspension aus Maleatdehydrogenase (SIGMA 410-12 aus Schweineherzmuskel) wurde bei 13.500 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Ausfüllung in 300 ul 5 mMol Phosphatpuffer, pH 6,0 gelöst und für 2 Std. gegen den gleichen Puffer dialysiert.
150 ul des dialysierten Enzyms wurden zu 250 ul Natriumpohsphatpuffer (pH 8, 100 mMol) und 250 ul destilliertem Wasser gegeben. 350 ul Stabilisatoren wurden zu dem Gemisch gegeben, um die in Tabelle 10 gezeigten Konzentrationen zu erhalten und 100 ul Aliquots wurden bei 35ºC getrocknet.
Die Enzymaktivität wurde in 100 mMol Diethanolaminpuffer (pH 9,2) gemessen, der 5 mMol Magnesiumchlorid und D,L-Maleat-Überschuß (10 bis 30 mMol) enthielt. β-NAD (2,4 mMol) wurde zugesetzt und die Bildungsgeschwindigkeit von β-NADH wurde durch Absorption bei 340 nm gemessen. Tabelle 1
Unstabilisiertes Enzym behielt 25% Aktivität nach 1 Tag und 4% Aktivität nach 31 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 2
Unstabilisiertes Enzym behielt 55% Aktivität nach 1 Tag und 46% Aktivität nach 54 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 3
Unstabilisiertes Enzym behielt 55% Aktivität nach 1 Tag und 46% Aktivität nach 54 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 4
Unstabilisiertes Enzym behielt 80 % Aktivität nach 1 Tag und 38% Aktivität nach 23 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 5
Unstabilisiertes Enzym behielt 62% Aktivität nach 1 Tag und 21% Aktivität nach 15 Tagen bei 50ºC bei. Tabelle 6
Unstabilisiertes Enzym behielt 66% Aktivität nach 7 Tagen und 52% Aktivität nach 36 Tagen bei 50ºC bei. Tabelle 7
Unstabilisiertes Enzym behielt 66% Aktivität nach 7 Tagen und 52% Aktivität nach 36 Tagen bei 50ºC bei. Tabelle 8
Unstabilisiertes Enzym behielt 9% Aktivität nach 8 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 9
Unstabilisiertes Enzym behielt 55% Aktivität bei 1 Tag und 46% Aktivität nach 54 Tagen bei 37ºC bei. Tabelle 10
Unstabilisiertes Enzym behielt 14% Aktivität beim Trocknen (Zeit an der Luft) und 2% Aktivität nach 2 Tagen bei 37ºC bei.

Claims

1. Verfahren zum Schützen eines Enzyms gegen Denaturierung beim Trocknen, welches die Schritte umfaßt:

Mischen einer wässrigen Lösung des Enzyms mit löslichem, anionischen Polyelektrolyt, cyclischem Polyol und Entfernen von Wasser aus der Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Polyelektrolyt anionisch funktionalisiertes Polysaccharid umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Polyelektrolyt aus Dextransulfat, Natriumalginat oder Carboxycellulose ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polyol aus Di- oder Trisacchariden ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch. 4, wobei das Polyol aus Lactit, Lactose, Maltose, Saccharose und Cellobiose ausgewählt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Wasser bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 50ºC entfernt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Temperatur 25ºC bis 35ºC beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge an anionischem Polyelektrolyt in der wässrigen Lösung 0,005 bis 10% (Gew./Vol.) beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Menge 0,01 bis 10% beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Menge 0,5 bis 2% beträgt.

11. Verfahren zum Schützen eines Enzyms gegen Denaturierung bei Lagerung, welches die Verwendung eines Verfahrens, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, umfaßt.

12. Getrocknete Enzymzubereitung, die gegen Denaturierung bei Lagerung geschützt ist, die aus dem Enzym, löslichem anionischen Polyelektrolyt, cyclischem Polyol, Puffer und wahlweise einem Benetzungsmittel besteht.