DE69326955T2 - Stabilisiertes, kaubares, antimikrobielles nahrungsmittel für tiere - Google Patents
Stabilisiertes, kaubares, antimikrobielles nahrungsmittel für tiereInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft einen kaubaren Gegenstand für Tiere, der ein oder mehrere Enzyme und Substrate zur Erzeugung antimikrobieller Verbindungen beim Kontakt mit Speichel eines Tieres und zusätzlich Katalase oder andere Wasserstoffperoxid abbauende Enzyme in speziellen Mengen enthält, um die Aktivität des kaubaren Gegenstands während der Herstellung und Lagerung zu stabilisieren. Insbesondere werden kaubare und verzehrbare Mittel beschrieben, die beim Kauen Wasserstoffperoxid oder andere antimikrobielle Mittel erzeugen.
- Mehrere natürlich vorkommende antimikrobielle Systeme stützen sich auf die Eignung bestimmter Oxidationsmittel, Stoffwechselprozesse von Bakterien, Pilzen und Viren zu unterbrechen. Verbindungen, wie Hypothiocyanit (OSCN&supmin;/HOSCN), Hypochlorit (OCI&supmin;, HOCI) und Hypoiodit (OI&supmin;, HOI) sind dafür bekannt, daß sie die Glykolyse inhibieren, Prokaryotenzellwände penetrieren und allgemein eine große Anzahl von Prozessen unterbrechen, die für das Überleben niederer Organismen endscheidend sind. Diese Oxidationsmittel entstehen bei der Detoxifikation von Wasserstoffperoxid durch Säugerperoxidasesysteme, wie solchen, die beispielsweise in Speichel, Halsflüssigkeit, Tränenflüssigkeit und Leukocyten gefunden wurden.
- Die antimikrobielle Wirksamkeit der vorstehend erwähnten Oxidationsmittel ist in der Literatur gut dargelegt. Es ist bekannt, daß sie bei Konzentrationen von etwa 10 bis 100 Mikromol pro Liter einsetzt. Das Hypothiocyanit-lon (OSCN&supmin;/HOSCN) erreicht antimikrobielle Wirksamkeit bei etwa 100 Mikromol pro Liter, während Hypoiodit-Ionen und Hypochlorit-Ionen (OI&supmin;, HOI bzw. OCI&supmin;, HOCI) noch bei Konzentrationen von 10 bis 50 Mikromol pro Liter wirksame Inhibitoren sind. Der limitierende Faktor in allen antimikrobiellen Säugerperoxidasesystemen ist gewöhnlich die Verfügbarkeit von Wasserstoffperoxid.
- Die zahlreichen Versuche nach dem Stand der Technik, natürliche antimikrobielle Peroxidasesysteme zu aktivieren oder zu ergänzen, sind allgemein auf den Mundpflegebereich beschränkt. In US-A-4,150,113 und US-A-4,178,362 (Hoogendorn et al.) sind Glukoseoxidase enthaltende Zahnputzmittel zur Reaktion mit Plaque und Speichel-Glukose zur Erzeugung geringer Mengen von Wasserstoffperoxid beschrieben.
- In US-A-4,269,822, US-A-4,564,519 und US-A-4,578,265 (Pellico et al.) sind ferner Zusammensetzungen für Zahnputzmittel beschrieben, die ein Oxidoreduktase-Enzym zusammen mit seinem spezifischen Substrat zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid oder anderen antimikrobiellen Oxidationsmitteln, wie Hypothiocyanit-lon, enthalten. In jedem dieser Formulierungen nach dem Stand der Technik liegen die Oxidoreduktase-Enzyme und -Substrate in wäßriger Lösung vor und sind homogen überall im gesamten Gemisch verteilt.
- In US-A-4,564,519 ist ein kaubares Zahnputzmittel beschrieben, beispielsweise ein Kaugummi oder eine Pastille, das ein Zwei-Enzymsystem zum Erzeugen von Hypothiocyanit-Ionen beim Kauen enthält, oder das anderweitig durch die Feuchtigkeit im Speichel aktiviert wird. Alle vorstehenden Mittel lehren ein Herstellungs- und Mischungsverfahren, durch das die Enzyme und gegebenenfalls die Substrate überall in der gesamten Zusammensetzung homogen verteilt werden.
- Außer in vorstehender US-A-4,564,519 werden andere feste oder kaubare Zusammensetzungen, die zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid oder anderen Oxidationsmitteln beim Aktivieren mit Feuchtigkeit geeignet sind, in US-A-4,320,116, US-A-4,726,948 und US-A-4,929,466 beschrieben. Diese Zusammensetzungen sind für den Verzehr durch Tiere bestimmte Nahrungsmittel, mit denen das Wachstum schädlicher Bakterien innerhalb des Gastrointestinaltrakts des Tieres begrenzt werden. Die Autoren geben auch ein Herstellungs- und Mischungsverfahren an, mit dem die Enzyme und Substrate überall in der gesamten Zusammensetzung homogen verteilt werden.
- Den Fachleuten ist bekannt, daß Enzyme mit ihren entsprechenden Substraten reaktiv sind, wenn sie in wäßriger Lösung zusammen vorhanden sind. Den Fachleuten ist auch bekannt, daß die meisten Enzyme wärmeempfindlich sind und häufig allmählich, aber irreversibel inhibiert werden, wenn sie über ausgedehnte Zeiträume höheren Temperaturen als 5 bis 10ºC ausgesetzt sind. Diese Inhibition ist besonders deutlich, wenn thermolabile Enzyme in wäßriger Lösung solchen Temperaturen ausgesetzt sind. Es ist auch bekannt, daß Wasserstoffperoxid in hoher Konzentration geeignet ist, die Aktivität von Oxidoreduktase- und Peroxidase-Enzymen zu inhibieren oder zu zerstören.
- Weil Haustiere, wie Hunde, keine Art von Mundpflege ausüben können, sind sie einem höheren Risiko für Karies-, Zahnfleischentzündungs- und Parodontose- Erkrankung als Menschen ausgesetzt. Es wäre folglich vorteilhaft, einen kaubaren und verzehrbaren Gegenstand für Tiere bereitzustellen, der Mittel enthält oder erzeugen kann, die zum Vermindern oder Beseitigen von solche Erkrankungen verursachenden Oralpathogenen wirksam sind.
- Es wäre auch vorteilhaft, einen derartigen kaubaren, verzehrbaren Gegenstand bereitzustellen, der ein Oxidoreduktase-Enzym zusammen mit seinem entsprechenden Substrat zum Erzeugen von Wasserstoffperoxid beim Kauen enthält.
- Es wäre auch vorteilhaft, einen derartigen enzymatisch aktiven, kaubaren Gegenstand bereitzustellen, der gegen vorzeitige Erzeugung von Wasserstoffperoxid vor der Verwendung stabilisiert wurde, ungeachtet der Feuchtigkeitsmenge, die innerhalb oder auf der Oberfläche des Gegenstands enthalten ist.
- Es wird ein erfindungsgemäßes antimikrobielles Kaumittel für Tiere bereitgestellt, das ein Trägermaterial, wenigstens ein Oxidoreduktase-Enzym und wenigstens ein Oxidoreduktase-Substrat enthält, wobei das Kaumittel für Tiere durch ein folgende Schritte umfassendes Verfahren hergestellt wird:
- a) Bereitstellen eines Trägers;
- b) Auftragen des entweder wenigstens einen Enzyms oder des wenigstens einen Substrats auf den Träger und im wesentlichen Trocknen von diesem darauf oder darin;
- c) Auftragen des jeweils anderen Substrats oder Enzyms auf den Träger und im wesentlichen Trocknen von diesem darauf;
- d) Auftragen einer Katalase auf den Träger;
- wobei die Katalase in einer Menge im Verhältnisbereich von 100 Titrimetrischen Units von Oxidoreduktase zu 1,0 Baker Units von Katalase bis zu 1,0 Titrimetrischen Units von Oxidoreduktase zu 1,0 Baker Units von Katalase eingesetzt wird.
- Mit der vorliegenden Erfindung wird ein kaubares und verzehrbares Mittel bereitgestellt, das beim Kontakt mit Speichel zur Erzeugung eines oder mehrerer antimikrobieller Mittel zum Inhibieren, Vermindern, Normalisieren oder anderweitigen Beseitigen potentiell schädlicher Oralpathogene in der Mundhöhle von Haustieren geeignet ist. Ganz besonders werden Zusammensetzungen beschrieben, die beim Kauen ein Oxidoreduktase-Enzym zusammen mit seinem entsprechenden Substrat in die Speichellösung im Mund eines Tieres freigeben, wobei die nachfolgende enzymatische Reaktion abläuft und dabei Wasserstoffperoxid erzeugt wird. Das so erzeugte Wasserstoffperoxid ist zum Aktivieren des schon im Speichel vorhandenen Speichel-Peroxidasesystems geeignet, das wiederum die potenten antimikrobiellen als Hypothiocyanit-Ion (OSCN&supmin;/HOSCN) bekannten Spezies erzeugt. Die vorstehend erwähnten Zusammensetzungen sollten von ausreichend haltbarer Konstruktion sein, so daß die Verweil- oder Kauzeit im Mund eines Tieres von ausreichender Dauer ist, um die Erzeugung oder Akkumulation einer zum Ansteigen der Hypothiocyanit-Menge im Speichel auf wenigstens etwa 100 Mikromol pro Liter Speichelflüssigkeit geeigneten Wasserstoffperoxidkonzentration zu ermöglichen.
- Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden mit einem geeigneten, von einem Tier bevorzugt gekauten Träger kombiniert. Als Träger, hier auch als Kaumittel bezeichnet, können ungegerbte Haut, zu ungegerbter Haut ähnliche Zusammensetzungen, Kekse oder Trockenfutter für Tiere, gelegentlich als Schrot bezeichnet, eingesetzt werden.
- Im Falle von Tierkeksen, Schrot oder anderem Trockenfutter für Tiere, die offensichtlich eine kürzere Kontaktdauer mit dem Mund eines Tieres haben als ein Kaumittel, beispielsweise ungegerbte Haut und zu ungegerbter Haut ähnliche Mittel, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit einer proportional größeren Menge an Oxidoreduktase-Enzym und -Substrat kombiniert werden, so daß die Wasserstoffperoxid-Erzeugung nachfolgt und sich Wasserstoffperoxid in einer höheren Geschwindigkeit anreichert (entsprechend der erwarteten kürzeren oralen Verweilzeit).
- Sobald in Speichellösung, ergibt sich die nachfolgende allgemeine Reaktion:
- 2 Substrat + O&sub2; + H&sub2;O → 2 reduziertes Substrat + H&sub2;O&sub2; + H&sub2;O
- Als Folge des vorstehenden Reaktionsschemas ist das in der Speichellösung erzeugte Wasserstoffperoxid ist ferner an der folgenden Reaktion beteiligt:
- Das Hypothiocyanit-Ion (OSCN-) liegt in Lösung im Gleichgewicht mit Hypothiocyansäure (HOSCN) vor. Die Verteilung der beiden Spezies ist abhängig vom pH-Wert. Der pka-Wert von Hypothiocyansäure (HOSCN) beträgt 5,3. Weil die Auflösung von Emaille bei pH 5,5 und darunter beginnt und unerwünscht ist und weil auch bekannt ist, daß die ungeladene Spezies Hypothiocyansäure (HOSCN) die mikrobielle Zellwand leichter penetriert und es daher ein wirksameres antimi krobielles Mittel ist, liegt der pH-Wert erfindungsgemäß im bevorzugten Bereich von 5,5 bis 6,5, in dem die HOSCN-Spezies vorherrscht.
- Oralpathogene werden, wie vorstehend beschrieben, von den erhöhten Konzentrationen von so erzeugtem Hypothiocyanit (OSCN&supmin;/HOSCN) inhibiert.
- Es ist auch festgestellt worden, daß die Aufnahme von Katalase (E.C. 1.11.1.6) in das Kaumittel in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Oxidoreduktase-Enzym und seinem entsprechenden Substrat die vorzeitige Entwicklung oder Akkumulation von Wasserstoffperoxid während der Herstellung und/oder Lagerung des Kaumittels verhindert. Durch die Katalyse der Zersetzung von Wasserstoffperoxid, das wegen der Anwesenheit von Restfeuchtigkeit innerhalb oder auf der Oberfläche des Kaumittels durch das Oxidoreduktase-Enzym und sein entsprechendes Substrat im Herstellungsverfahren oder während längeren Lagerns gebildet wird, verhindert die Katalase auf diese Weise bis zur gewünschten Verwendungszeit jede merkliche Inhibierung der gewünschten Oxidoreduktase-Aktivität. Es ist jedoch erkennbar, daß zum Zeitpunkt der Verwendung die eine viel größere Affinität für Wasserstoffperoxid als die Katalase aufweisende Speichel-Peroxidase im Speichel für die Oxidation des Thiocyanat-lons (SCN&supmin;), wie vorstehend beschrieben, praktisch das gesamte gebildete Wasserstoffperoxid erfolgreich aufbraucht.
- In seiner einfachsten Form enthält das erfindungsgemäße antimikrobielle Kaumittel für Tiere eine feste, kaubare Zusammensetzung oder ein festes, kaubares Material, auf oder in dem ein Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendes Substrat zusätzlich zu einer spezifischen Menge von Katalase oder eines anderen Wasserstoffperoxid abbauenden Enzyms (mit irgendeinem zugehörigen Sauerstoff aufnehmendem Anion) aufgetragen oder anderweitig abgelagert worden sind. Vor der Verwendung, während der Herstellung und Lagerung wird Wasserstoffperoxid, das als Folge von Restfeuchtigkeit auf dem Kaumittel gebildet wird, durch die vorhandene Katalase zerstört. Beim Kontakt mit Speichel eines Tieres beim Kauen werden das Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendes Substrat in der wäßrigen Lösung aufgelöst, wodurch sie, wie vorstehend beschrieben, unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren. Das gebildete Wasserstoffperoxid wird dann vorzugsweise von der Speichel-Peroxidase (in bezug auf die auch in der Speichellösung vorhandene Katalase) verwendet, um Thiocyanat-Ionen (SCN&supmin;) zu den antimikrobiell wirksamen Hypothiocyanit-Ionen (OSCN&supmin;/HOSCN) weiter zu oxidieren.
- Der Träger wird hier als Teil des Kaumittels für Tiere definiert, der für den Hund oder ein anderes Tier zum Kauen bestimmt ist. Das bevorzugte erfindungsgemäße Trägermaterial ist ungegerbte Haut. Jedoch sind jedes Material, jede Zusammensetzung oder Konstruktion geeignet, die sicher verzehr- und haltbar sind, um ausreichende orale Verweilzeit für das Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendes Substrat zu ermöglichen, um eine Auflösung in der Speichelflüssigkeit zu erreichen. Andere Arten von Trägermaterial, die für die vorliegende Erfindung einsetzbar sind, schließen Kekse oder Kräcker für Tiere ein.
- Der feste, kaubare Träger ist vorzugsweise haltbar genug, um das Tier daran zu hindern, es in weniger als etwa 1 bis 5 Minuten zu verzehren. Diese Zeitdauer ist im allgemeinen ausreichend, um die Einstellung von antimikrobiellen Konzentrationen von Hypothiocyanit-Ionen in einer Höhe von etwa 100 Mikromol pro Liter Speichelflüssigkeit zu ermöglichen.
- Zu geeigneten Oxidoreduktasen gehören, sind aber nicht beschränkt auf, Glukose-Oxidase, Galaktose-Oxidase, Glykolat-Oxidase, Laktat-Oxidase, L-Gulonolakton-Oxidase, L-2-Hydroxysäure-Oxidase, Aldehyd-Oxidase, Xanthin- Oxidase, D-Aspartat-Oxidase, L-Aminosäure-Oxidase, D-Aminosäure-Oxidase, Monoamin-Oxidase, Pyridoxaminphosphat-Oxidase, Diamin-Oxidase und Sulfit- Oxidase. Die bevorzugte Oxidoreduktase ist Glukose-Oxidase.
- Geeignete Substrate sind für die einzelnen ausgewählten Oxidoreduktasen spezifisch und auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel ist D-Glukose ein spezifisches Substrat für Glukose-Oxidase. Zu anderen geeigneten Substraten gehö ren, sind aber nicht beschränkt auf, D-Glukose, D-Galaktose, L-Sorbose, Ethanol, Tyramin, 1,4-Diaminobutan, 6-Hydroxy-L-nikotin, 6-Hydroxy-D-nikotin, 2-Aminophenol, Glykolat, L-Laktat, 2-Desoxy-D-Glukose, L-Gulonolakton, L-Galaktonolakton, D-Mannonolakton, L-2-Hydroxyisocapronat, Acetaldehyd, Butyraldehyd, Xanthin, D-Aspartat, D-Glutamat, L-Aminosäuren und D-Aminosäuren.
- Das erfindungsgemäße antimikrobielle Kaumittel für Tiere umfaßt wenigstens eines der vorstehend aufgeführten Oxidoreduktase-Enzyme zusammen mit seinem entsprechenden, auch vorstehend aufgeführten Substrat. Erfindungsgemäß wird eine bestimmte Menge oder Aktivität von Oxidoreduktase-Enzym als Titrimetrische Units (TU) bezeichnet, die der Menge des Oxidoreduktase-Enzyms entspricht, die zum Erzeugen von 1,1 Mikromol Wasserstoffperoxid pro Minute bei 35ºC und optimalen pH-Bedingungen und optimaler Substratkonzentration jedes einzelnen Oxidoreduktase-Enzyms geeignet ist.
- Im allgemeinen sollten die antimikrobiellen Kaumittel für Tiere wenigstens etwa 1,0 TU des Oxidoreduktase-Enzyms pro Gramm Träger enthalten. Ein bevorzugtes Niveau der Aktivität des Oxidoreduktase-Enzyms liegt im Bereich von 5,0 bis 50 TU pro Gramm Träger.
- Das entsprechende Substrat sollte in oder auf dem antimikrobiellen Kaumittel für Tiere in einer Menge von wenigstens 0,1 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts des Trägers (0,001 Gramm Substrat pro Gramm Träger) enthalten sein. Das Substrat liegt in einer bevorzugten Menge von 0,5 bis 10 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts des Trägers vor. Das Substrat liegt am meisten bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 Gewichtsprozent des Gesamtgewichts des Trägers vor.
- Um die Oxidoreduktase-Aktivität des Kaumittels für Tiere gegen vorzeitige Bildung von Wasserstoffperoxid wegen vorhandener Restfeuchtigkeit während des Herstellungsverfahrens oder der Lagerung zu stabilisieren, kann Katalase zusammen mit den vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Komponenten vorteilhaft auf oder in das Kaumittel eingebracht werden. Erfindungsgemäß wird die Katalase-Enzym-Aktivität in Baker Units gemessen, wobei eine Baker Unit (BU) der Katalase-Menge entspricht, die zum Abbau von 264 mg Wasserstoffperoxid in einer Stunde unter den Untersuchungsbedingungen (25ºC und pH 7,0) geeignet ist.
- Im allgemeinen sollte das erfindungsgemäße Kaumittel für Tiere ein Mindestverhältnis von 1 BU Katalase pro 50 TU Oxidoreduktase-Enzym und bevorzugt ein Verhältnis von etwa 1 BU Katalase: 20 TU Oxidoreduktase-Enzym bis etwa 1 BU Katalase: 1 TU Oxidoreduktase-Enzym enthalten. Das am meisten bevorzugte Verhältnis von Katalase zu Oxidoreduktase beträgt von etwa 1 BU Katalase: 10 TU Oxidoreduktase bis etwa 1 BU Katalase: 4 TU Oxidoreduktase.
- Aus Aspergillus niger gewonnene Katalase wird bevorzugt, insbesondere wenn dieser Organismus die Quelle des Oxidoreduktase-Enzyms ist, so daß die beiden Enzyme zur Einstellung des richtigen, vorstehend beschriebenen Verhältnisses kofermentiert und zum Kaumittel als Einzelkomponente hinzugefügt werden können. Jedoch sind andere Katalasequellen, wie Rinderleber, zur Ausübung der vorliegenden Erfindung geeignet.
- Das antimikrobielle Kaumittel für Tiere kann gegebenenfalls Stabilisatoren, Puffersubstanzen, Kofaktoren und/oder Aktivatoren für die vorstehend erwähnten Oxidoreduktase-Enzyme enthalten oder tragen. Solche fakultativen Komponenten sollen die Aktivität stabilisieren und/oder die Denaturierung des Oxidoreduktase-Enzyms während der Herstellung und Lagerung des erfindungsgemäßen Kaumittels für Tiere verhindern. Sie sind auf dem Fachgebiet bekannt. Jede dieser fakultativen Komponenten muß biologisch verträglich und für die Nahrungsaufnahme durch das Tier geeignet sein. Außerdem ist die Eignung und Wirkung einer fakultativen Komponente, wie vorstehend beschrieben, von dem einzelnen, vorliegenden Oxidoreduktase-Enzym abhängig. Solche fakultativen Komponenten sollten nicht wesentlich zur Retention von zusätzlichem Wasser durch das Kaumittel beitragen, um die Wechselwirkung des Oxidoreduktase-Enzyms mit dessen entsprechendem Substrat zu fördern und zu erleichtern.
- Im allgemeinen werden als geeignete fakultative Komponenten polymere Stabilisatoren, wie Gelatine, Albumin und Casein, zusätzlich zu stabilisierenden Salzen, wie Natrium- und Kaliumchlorid, eingesetzt. Als geeignete Pufferkomponenten werden einbasiges Kaliumphosphat, zweibasiges Kaliumphosphat, einbasiges Natriumphosphat und zweibasiges Natriumphosphat verwendet. Diese können zum Einstellen des Speichel-pH des Tieres auf den Wert während des Kauvorgangs zugegeben werden, der für das einzelne, ausgewählte Oxidoreduktase- Enzym optimal ist. Ein geeigneter Kofaktor oder Aktivator (für Glukose-Oxidase) ist Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD). Jede fakultative Komponente, die zur Erhaltung oder Erhöhung der Aktivität eines bestimmten Oxidoreduktase-Enzyms innerhalb der Parameter seiner Verwendung auf einem antimikrobiellen Kaumittel für Tiere beitragen kann, liegt innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung.
- Zusätzlich zum vorstehenden kann das erfindungsgemäße Kaumittel für Tiere ein oder mehrere Peroxidase-Enzyme enthalten, um eine optimale Verwendung des durch das Oxidoreduktase-Enzym und sein entsprechendes Substrat gebildeten Wasserstoffperoxids sicherzustellen. Zu geeigneten Peroxidase-Enzymen gehören, sind aber nicht beschränkt auf, Lakto-Peroxidase, Chlor-Peroxidase, Myelo- Peroxidase und Speichel-Peroxidase. Jede Peroxidase, die zur Oxidation von Thiocyanat-Ionen und Bildung von Hypothiocyanit-Ionen durch Wasserstoffperoxid geeignet ist, kann eingesetzt werden. Die bevorzugte Peroxidase ist Lakto- Peroxidase.
- Zum erfindungsgemäßen Einsatz wird die Peroxidase-Aktivität in ABTS-Units gemessen. Eine ABTS-Unit ist die Peroxidase-Menge, die zur Oxidation von einem Mikromol ABTS (2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)) pro Minute bei 25ºC, 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) und einer Wasserstoffperoxid-Anfangskonzentration von 1,0 M geeignet ist.
- Im allgemeinen kann das antimikrobielle Kaumittel für Tiere gegebenenfalls irgendeine Peroxidase-Menge innerhalb des Bereichs wirtschaftlicher Durchführbarkeit enthalten oder tragen, jedoch liegt eine bevorzugte Menge im Bereich von 10,0 bis 100 ABTS-Units Peroxidase pro Gramm Träger.
- Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch eine Halogenid- oder Pseudohalogenid-Ionenquelle enthalten, die durch das verwendete spezifische Peroxidase-Enzym oxidierbar ist. Eine Thiocyanat-Ionenquelle, wie Kaliumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat oder andere Thiocyanatsalze, kann eingebracht werden, um die Endkonzentration des Thiocyanats im Speichel des Tieres während des Kauvorgangs zu optimieren. Die bevorzugte Thiocyanat-Ionenquelle ist Kaliumthiocyanat. Weil auch Speichel-Peroxidase zur Oxidation von Iodid-Ionen (I&supmin;) zu antimikrobiellen Hypoiodit-Ionen (OI&supmin;, HOI) geeignet ist, kann eine Iodid-Ionenquelle, wie Kaliumiodid, zum Steigern der antimikrobiellen Aktivität des Kaumittels eingebracht werden. Kombinationen von Thiocyanat- und Iodid-Ionen können ebenfalls eingesetzt werden. Außerdem sind bestimmte Peroxidase-Enzyme, wie Chlor- und Myelo-Peroxidase, auch zur Oxidation von Chlorid-Ionen (CI&supmin;) zu Hypochlorit-Ionen (OCI&supmin;, HOCI) durch Wasserstoffperoxid geeignet; wenn diese bestimmten Enzyme in die erfindungsgemäße Zusammensetzung eingebracht werden, wird eine Chlorid-Ionenquelle, wie Natriumchlorid, verwendet. Die Halogenid- oder Pseudohalogenid-Ionenquellen werden in der Zusammensetzung im Bereich von 0,1 Mikromol Halogenid oder Pseudohalogenid pro Gramm Träger bis 10 Mikromol pro Gramm Träger eingesetzt. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Halogenids oder Pseudohalogenids im Träger im Bereich von 0,5 Mikromol bis 5 Mikromol pro Gramm Träger und am meisten bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 Mikromol Halogenid pro Gramm Träger.
- Es hat sich gezeigt, daß erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die sowohl ein Peroxidase-Enzym (keine Katalase) als auch eine Halogenid- oder Pseudohalogenid-Ionenquelle enthalten, einen Einsatz von Katalase zur Stabilisierung gegen vorzeitige Bildung von Wasserstoffperoxid während der Herstellung oder Lagerung erübrigen. Zum Beispiel ist ein Kaumittel, das sowohl Lakto- Peroxidase als auch Kaliumthiocyanat zusätzlich zu einem Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendem Substrat enthält, gegen vorzeitige Bildung von Wasserstoffperoxid stabil, während ein Kaumittel, das nur die Lakto-Peroxidase zusätzlich zu einem Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendem Substrat enthält, nicht stabil ist. In diesen Fällen dienen das Peroxidase-Enzym und eine Halogenid- oder Pseudohalogenid-Ionenquelle demselben Zweck wie die Katalase in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, d. h., zum Entfernen und Zerstören jedes während der Herstellung und Lagerung erzeugten Wasserstoffperoxids.
- Zu den fakultativen Komponenten gehören gegebenenfalls Geschmacks- und Farbstoffe, die die organoleptischen Eigenschaften des Kaumittels für Tiere betreffen und in dem Fachgebiet bekannt sind.
- Im Handel erhältliche rechteckige Kaumittel aus ungegerbter Haut mit Abmessungen von ungefähr 5,08 cm (2 Zoll) Breite und 10,16 cm (4 Zoll) Länge wurden einzeln gewogen und dann über einen Zeitraum von 120 Minuten in eine 15 Gewichts-prozentige (w/w) wäßrige Dextroselösung (D-Glukose) überführt, anschließend entfernt und zum 24 Stunden langen Trocknen in einen auf eine konstante Temperatur von 45ºC eingestellten Ofen eingebracht. Nach dem Trocknen wuchs das der D-Glukose-Ablagerung auf dem Kaumittel aus ungegerbter Haut zuzuschreibende Gewicht durchschnittlich um 2,2 mg pro Gramm Kaumittel. Die trockenen, mit D-Glukose imprägnierten Kaumittel wurden dann auf nur einer Seite mit einer dosierten Sprühung (0,125 ml) einer der nachstehend angezeigten Glukose-Oxidase-Lösungen in Kontakt gebracht und in einem Ofen mit einer konstanten Temperatur von 45ºC 2 Stunden lang getrocknet.
- Deionisiertes Wasser 64,90 g
- Natriumchlorid 16,22 g
- Glukose-Oxidase-Lösung (F100*, Genencor Intl) 18,88 g (Verhältnis von 100 TU Glukose-Oxidase: 1 BU Katalase)
- *F100 : 5000 TU Glukose-Oxidase/ml und Verhältnis von Glukose-Oxidase zu Katalase von 100 : 1 (TU : BU)
- Lösung A: 800 TU Glukose-Oxidase/ml und < 8 BU Katalase/ml
- Deionisiertes Wasser 37,33 g
- Natriumchlorid 9,33 g
- Glukose-Oxidase-Lösung (Oxygo 1500, Genencor Intl) 53,34 g
- Oxygo 1500 : 1500 TU Glukose-Oxidase/ml und Verhältnis von Glukose-Oxidase zu Katalase von 4 : 1 (TU : BU)
- Lösung B: 800 TU Glukose-Oxidase/ml und 200 BU Katalase/ml
- Die endgültige Aktivität der getrockneten Kaumittel wurde zu 10,0 TU pro Gramm Kaumittel berechnet, bezogen auf das vor dem Trocknen aufgetragene Volumen der Glukose-Oxidase-Lösung. Für solche mit Lösung A behandelte Kaumittel wurde ein Gehalt von 0,1 BU Katalase pro Gramm Kaumittel berechnet, während für solche mit Lösung B behandelte Kaumittel ein Gehalt von 2,5 BU Katalase pro Gramm Kaumittel berechnet wurde.
- Die Kaumittel wurden, wie nachstehend skizziert, vor und nach ausgedehnter Lagerung auf die Bildung von Wasserstoffperoxid untersucht.
- Dieses Verfahren beruht auf der Eignung eines Kaumittels aus ungegerbter Haut, das ein Oxidoreduktase-Enzym und dessen Substrat (Glukose-Oxidase und Glukose) enthält, beim Verwirbeln mit Wasser aus einer künstlichen Speichelzusammensetzung Wasserstoffperoxid zu bilden. Weil in diesem Assay nach einem Unterschied zwischen der während der Herstellung und Lagerung aufrechterhaltenen Oxidoreduktase-Aktivität einer hohen Katalasezusammensetzung und einer niedrigen Katalasezusammensetzung gesucht wurde, wurde ein gekoppeltes Detektionsschema entwickelt, um die vor dessen Entfernung durch die Katalase gebildete Menge von Wasserstoffperoxid genau zu bestimmen. Basierend auf der Annahme, daß ein einzelnes Kaumittel mit einem mittleren Gewicht von 10 Gramm mit ungefähr 15 Millilitern oder Gramm Wasser vom Speichel eines Tieres in Berührung kommen würde, wurde ein repräsentatives Volumen von künstlichem Speichel ausgewählt. In dieser Weise wurde 1,0 Gramm Kaumittel aus ungegerbter Haut mit 1,5 Millilitern künstlichem Speichel (oder irgendeinem beliebigen anderen Vielfachen dieses Verhältnisses) im Testverfahren vereinigt.
- Die Detektion von Wasserstoffperoxid in der "Kaumittelflüssigkeit" beruht teilweise auf dem Verfahren von Mansson-Rahemtullla et al. (1986), Arch. Oral Biol. 31, Seiten 661 bis 668, bei dem ein oxidierbares Chromogen verwendet wird, um die Anwesenheit von Hypothiocyanit-Ionen (OSCN-/HOSCN) zu festzustellen. Für das vorliegende Verfahren ist anzunehmen, daß für jedes Mol Wasserstoffperoxid, das durch das Gemisch von ungegerbter Haut mit künstlichem Speichel erzeugt wird, ein Mol OSCN&supmin;/HOSCN gebildet wird.
- (a) Eine Stammlösung von 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) wurde durch Auflösen von 58,2 mg DTNB in 15,0 ml 0,1 M K&sub2;HPO&sub4; (pH 8,8) und Auffüllen auf 100 ml mit destilliertem Wasser hergestellt.
- (b) Der NBS-Assaypuffer wurde durch Hinzufügen von 0,8 ml 10 mM Mercaptoethanol zu 4,0 ml DTNB-Stammlösung hergestellt, um DTNB zu NBS zu reduzieren. Diese Lösung wurde dann durch Hinzufügen von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 5,6) auf ein Endvolumen von 100 ml aufgefüllt, um den NBS-Arbeitspuffer zu ergeben. Dieser Puffer sollte bei 412 nm eine Absorption von 0,8 bis 1,0 liefern.
- (c) Künstlicher Speichel wurde gemäß der folgenden Formel hergestellt:
- 0,034 M Phosphatpuffer, pH 7,0 1000,0 ml
- Natriumchlorid 1,4600 g
- Kaliumthiocyanat 0,1954 g
- Lakto-Peroxidase (500 ABTS Units/mg) 5,0 mg
- Anmerkung: Ein unbehandeltes Kaumittel aus ungegerbter Haut wurde als Kontrolle laufen gelassen.
- (a) Das zu untersuchende Kaumittel aus ungegerbter Haut wurde mit großen, stabilen Scheren in kleine Quadrate geschnitten, ungefähr 0,64 cm (1/4 Zoll) an einer Seite. 6,0 g Kaumittel-Quadrate aus ungegerbter Haut wurden gewogen und in ein 20 ml Kunststoff-Szintillationsfläschchen mit Schraubdeckel überführt.
- (b) 9,0 ml künstlicher Speichel (vorstehend beschrieben) wurde zu dem Fläschchen hinzugefügt, das dann drei Minuten lang verwirbelt wurde. Während dieses Zeitraums wurden 200 Mikroliter-Proben der "Kaumittelflüssigkeit" in regelmäßigen Abständen (ein Minute, zwei Minuten und drei Minuten) genommen.
- (c) Jedes Aliquot von 200 Mikroliter wurde sofort in ein Röhrchen überführt, in das schon 6,0 ml der NBS-Lösung eingebracht worden waren.
- (d) Das NBS/Aliqout-Gemisch wurde 1 Minute lang bei 15000 · g zentrifugiert.
- (e) Die Absorptionsänderung der Probe wurde bei 412 nm gegen eine Referenz gelesen, die in derselben Art und Weise hergestellt wurde, jedoch unter Verwendung von 200 Mikrolitern "Kaumittelflüssigkeit", die durch Verwirbeln von 6,0 g ungegerbter Kaumittelquadrate mit 9,0 g destilliertem Wasser erhalten wurde. Berechnungen
- [Hypothiocyanit-Ionen in Kaumittelflüssigkeit] = Absorption&sub4;&sub1;&sub2; · 0,00111
- [Wasserstoffperoxid in Kaumittelflüssigkeit] = Absorption&sub4;&sub1;&sub2; · 0,00111
- Eine Zunahme der Absorption von 1,00 bei 412 nm entspricht einer Wasserstoffperoxid- (oder Hypothiocyanit-Ionen-) Konzentration von 1,11 Millimol pro Liter "Kaumittelflüssigkeit".
- Zwölf Kaumittel, welche im Anschluß an die Herstellung 7 Tage lang bei 25ºC und 50% relativer Feuchtigkeit gelagert worden waren, wurden mit dem vorstehend skizzierten Verfahren untersucht. Die durchschnittlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid in Millimol, das durch die erfindungsgemäßen entweder mit der vorstehenden Lösung A oder der vorstehenden Lösung B behandelten Kaumittel gebildet wurde, betrugen wie folgt:
- Wie aus der vorstehenden Tabelle entnommen werden kann, wird ein deutlicher Unterschied in der Eignung des erfindungsgemäßen Kaumittels aus ungegerbter Haut, durch die Wirkung des Oxidoreduktase-Enzyms auf dessen Substrat Wasserstoffperoxid zu bilden, zwischen den mit einem großen Verhältnis von Glukose-Oxidase zu Katalase (Lösung A) behandelten Kaumitteln und solchen mit einem geringen Verhältnis von Glukose-Oxidase zu Katalase (Lösung B) behandelten Kaumitteln beobachtet.
- Zwölf Kaumittel, welche im Anschluß an die Herstellung 30 Tage lang bei 35ºC und 50% relativer Feuchtigkeit gelagert worden waren, wurden ebenfalls mit dem vorstehend skizzierten Verfahrens untersucht. Die durchschnittlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid in Millimol, das durch die erfindungsgemäßen entweder mit der vorstehenden Lösung A oder der vorstehenden Lösung B behandelten Kaumittel erzeugt wurde, waren wie folgt:
- Die mit Lösung A behandelten Kaumittel hatten die Fähigkeit, Wasserstoffperoxid zu bilden, durch die Langzeitlagerung bei erhöhter Temperatur und mäßiger Feuchtigkeit praktisch vollständig verloren, während die mit Lösung B behandelten Kaumittel ihre jeweilige Aktivität über denselben Zeitraum, unter denselben Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen beibehalten hatten. Dies zeigt ebenfalls die Wichtigkeit der Anwesenheit von Katalase in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zum Erhalten der Oxidoreduktase-Enzym-Aktivität an.
- Gebackene, unbeschichtete Hundekekse wurden unter Verwendung der folgenden Teigzusammensetzung hergestellt:
- Wasser 25%
- Weizenmehl 56%
- Sojabohnenmehl 8%
- Fleisch- und Knochenmehl 7%
- Talg (frei von Antioxidantien) 2%
- Rindergeschmack 2%
- Der vorstehende Teig wurde in die Form von runden Scheiben mit einem Durchmesser von ungefähr 7,62 cm (3 Zoll) und einer Dicke von ungefähr 1,27 cm (¹/&sub2; Zoll) gebracht. Die Keksscheiben wurden bei 204 bis 232ºC (400 bis 450ºF) gebacken, bis ein Wassergehalt von 5 Gewichtsprozent erreicht war (nach ungefähr 30 Minuten).
- Nachdem die Kekse auf Raumtemperatur abgekühlt waren, wurde die folgende Geschmacks/Substrat-Beschichtung in einer Menge von 4,9 Gewichtsprozent vom Keks aufgetragen:
- Wasser 45 kg (100 Pfund)
- Hydrolysiertes Pflanzenprotein 5,9 kg (13 Pfund)
- Rinder/Geflügel-Extrakt 5,9 kg (13 Pfund)
- Dextrose 11,25 kg (25 Pfund)
- Bäckerhefe 0,31 kg (0,7 Pfund)
- Die Geschmacks/Substrat-Beschichtung wurde auf eine Seite des Kekses gesprüht und 2 Stunden lang bei 40,5ºC (105ºF) getrocknet.
- Die mit Geschmack/Substrat beschichteten Kekse wurden dann mit der folgenden Lösung mit einer Auftragungsmenge von 1,9 Gewichtsprozent (w/w) sprühbeschichtet:
- Deionisiertes Wasser 14,85 kg (32,75 Pfund)
- Natriumchlorid 3,74 kg (8,25 Pfund)
- Glukose-Oxidase-Lösung 3,98 kg (8,78 Pfund) (Oxygo 1500, Genencor Intl)
- Oxygo 1500 : 1500 TU Glukose-Oxidase/ml und Verhältnis Glukose-Oxidase zu Katalase von 4 : 1 (TU : BU)
- Die mit Oxidoreduktase sprühbeschichteten Kekse wurden 1 Stunde lang bei 40,5ºC (105ºF) getrocknet und auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach 24 Stunden wurden diese Kekse nach dem Verfahren von Beispiel 1 auf ihre Fähigkeit, Wasserstoffperoxid zu bilden, getestet. Die Ergebnisse sind in Millimol gezeigt.
- Daher zeigt der Hundekeks von Beispiel 2 die Fähigkeit, Wasserstoffperoxid in Mengen zu bilden, die zum Aktivieren des Speichel-Peroxidase-Systems während des Kauens geeignet sind.
- Zusätzlich zu ungegerbter Haut und zu zu ungegerbter Haut ähnlichen Materialien, die als Träger verwendet werden können, schließen andere Trägermaterialien gebackene Kaumittel oder Nahrungsmittel für Tiere ein, wie Katzenschrot und Trockenfutter für Hunde.
- Zusätzlich zum vorstehend beschriebenen Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Kaumittel für Tiere sind andere Verfahren zum Auftragen eines Oxidoreduktase-Enzyms und seines entsprechenden Substrats möglich. Um zum Beispiel den zusätzlichen Trocknungsschritt bei erhöhter Temperatur zu vermeiden, kann ein Kaumittel durch Kontakt seiner Oberfläche mit einem granulierten oder einem sonstigen Feststoffgemisch aus Oxidoreduktase- Enzym, Substrat und vorstehend beschriebenen fakultativen Komponenten zu sätzlich zu Granuliermitteln oder Trägern, wie Stärke, oder proteinähnlichem Material, wie Gelatine, Casein und Albumin, hergestellt werden. Solch ein granuliertes Gemisch haftet an einer schwach gefeuchteten Kaumitteloberfläche, ohne sich aufzulösen, wobei damit eine vorzeitige Reaktion zwischen dem Oxidoreduktase-Enzym und dessen entsprechendem Substrat verhindert wird.
- Die vorhergehende Beschreibung der Erfindung ist bezüglich bestimmter, bevorzugter Ausführungsformen beispielhaft. Für einen Fachmann naheliegende Abwandlungen und Veränderungen zur Erfindung sind in den Schutzbereich dieser Anmeldung und der anhängenden Patentansprüche einzuschließen.
Claims (24)
1. Antimikrobielles Kaumittel für Tiere, das ein Trägermaterial, wenigstens ein
Oxidoreduktase-Enzym und wenigstens ein Oxidoreduktase-Substrat umfaßt,
wobei das Kaumittel für Tiere durch ein folgende Schritte umfassendes Verfahren
hergestellt wird:
a) Bereitstellen eines Trägers;
b) Auftragen des entweder wenigstens einen Enzyms oder des wenigstens
einen Substrats auf den Träger und im wesentlichen Trocknen von
diesen Stoffen darauf oder darin;
c) Auftragen des jeweils anderen Stoffes von dem Substrat und dem
Enzym auf den Träger und im wesentlichen Trocknen von diesem Stoff
darauf;
d) Auftragen einer Katalase auf den Träger;
wobei die Katalase in einer Menge im Verhältnisbereich von 100 Titrimetrischen
Units von Oxidoreduktase zu 1,0 Baker Units von Katalase bis zu 1,0
Titrimetrischen Units von Oxidoreduktase zu 1,0 Baker Units von Katalase eingesetzt wird.
2. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 1, bei dem das Oxidoreduktase-Enzym von
Schritt b) und die Katalase von Schritt d) zusammen in einem einzigen Schritt auf
den Träger aufgetragen werden.
3. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 1, bei dem das Oxidoreduktase-Enzym von
Schritt b) und die Katalase von Schritt d) getrennt auf den Träger aufgetragen
werden.
4. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem das Oxidoreduktase-
Enzym aus Glukose-, Galaktose-, Glykolat-, Laktat-, L-Gulonolakton-,
L-2-Hydroxysäure-, L-Aminosäure-, D-Aminosäure-, Monoamin-,
Pyridoxaminphosphat-, Diamin- und Sulfit-Oxidase ausgewählt ist.
5. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 4, bei dem das Oxidoreduktase-Enzym
Glukose-Oxidase ist.
6. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die
Substrate spezifisch für die einzelnen Oxidoreduktasen sind und aus D-Glukose, D-
Galaktose, L-Sorbose, Ethanol, Tyramin, 1,4- Diaminobutan, 6-Hydroxy-L-nikotin,
6-Hydroxy-D-nikotin, 2-Aminophenol, Glykolat, L-Laktat, 2-Desoxy-
D-Glukose, L-Gulonolakton, L-Galaktonolakton, D-Mannonoiacton,
L-2-Hydroxyisocapronat, Acetaldehyd, Butyraldehyd, Xanthin, D-Aspartat, D-Glutamat,
L-Aminosäuren und D-Aminosäuren ausgewählt sind.
7. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 6, bei dem die Oxidoreduktase Glukose-
Oxidase und das Substrat D-Glukose sind.
8. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das
Oxidoreduktase-Substrat auf den Träger aufgetragen und darauf im wesentlichen
getrocknet wird, und danach ein Gemisch des Oxidoreduktase-Enzyms, einer
Katalase, einer zweiten Peroxidase und einer Halogenid- oder
Pseudohalogenid-Ionenquelle, die als Sauerstoffakzeptor für die zweite Peroxidase geeignet ist, auf
den Träger aufgetragen und darauf im wesentlichen getrocknet wird.
9. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 8, das ferner folgende Stoffe zum Auftragen
auf den Träger umfaßt:
- ein Peroxidase-Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lakto-,
Salivary-, Chlor- und Myelo-Peroxidase, und
- eine Quelle von Halogenid- oder Pseudohalogenid-Ionen, die als
Sauerstoffakzeptor für das Peroxidase-Enzym geeignet ist,
wobei die Ionen aus Kaliumthiocyanat, Natriumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat,
anderen Thiocyanatsalzen, Kaliumiodid, anderen Iodidsalzen, Natriumchlorid und
anderen Chloridsalzen ausgewählt sind.
10. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 9, bei dem die Halogenid- oder
Pseudohalogenid-Ionen in dem Träger in einem Bereich von 0,1 Mikromol pro
Gramm Träger bis 10 Mikromol pro Gramm vorliegen.
11. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 10, bei dem die Halogenid- oder
Pseudohalogenid-Ionen in dem Träger in einem Bereich von 0,5 bis 5 Mikromol
pro Gramm Träger vorliegen.
12. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 11, bei dem die Halogenid- oder
Pseudohalogenid-Ionen in dem Träger in einem Bereich von 1 bis 2 Mikromol pro
Gramm Träger vorliegen.
13. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die
Katalase aus A.niger Fermentation gewonnen wird.
14. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der
Träger aus ungegerbter Haut, einem ungegerbter Haut ähnlichen Material,
Keksen für Tiere und Trockenfutter für Tiere ausgewählt ist.
15. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 14, bei dem der Träger ungegerbte Haut
ist.
16. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 14, bei dem der Träger ein Keks für Hunde
ist.
17. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 14, bei dem der Träger Trockenfutter für
Tiere ist.
18. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das
Oxidoreduktase-Substrat von dem Kaumittel für Tiere in flüssiger Form absorbiert
und dann darin getrocknet wird, und die Außenseite des Kaumittels für Tiere mit
dem Oxidoreduktase-Enzym und einer Katalase überzogen und dann darin
getrocknet wird.
19. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das
Niveau der Oxidoreduktase-Enzym-Aktivität bei wenigstens etwa 1,0 TU des
Oxidoreduktase-Enzyms pro Gramm Trägermaterial liegt.
20. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 19, bei dem das Niveau der
Oxidoreduktase-Enzym-Aktivität im Bereich von 5,0 bis 50 TU pro Gramm Träger
liegt.
21. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das
Substrat in oder auf dem antimikrobiellen Kaumittel für Tiere in einer Menge von
wenigstens 0,1 Gewichtsprozent des Trägermaterials vorliegt.
22. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 21, bei dem das Substrat in einer Menge
im Bereich von 0,5 bis 10 Gewichtsprozent des Trägermaterials vorliegt.
23. Kaumittel für Tiere nach Anspruch 9, bei dem die Peroxidase im Bereich von
10,0 bis 100 ABTS-Units der Peroxidase pro Gramm Träger vorliegt.
24. Kaumittel für Tiere nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der
Trocknungsschritt für das Enzym auf dem Kaumittel eine 24 Stunden lange
Trocknung des Kaumittels bei 45ºC umfaßt.
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