EP1226235A2

EP1226235A2 - Zellkonstrukte, die für die immuntherapie geeignet sind, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: EP1226235A2
Application number: EP00972821A
Authority: EP
Inventors: Peter Leskovar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2002-07-31
Also published as: WO2001029193A3; WO2001029193A2; AU1141901A

Abstract

Es werden Zellkonstrukte und Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Behandlung von Krankheiten, die durch unerwünschte aktivierte T-Zellen verursacht werden, beschrieben.

Description

Zellkonstrukte, die für die Immuntherapie geeignet sind, deren Herstellung und

Verwendung

Gegenstand der Erfindung sind Zellkonstrukte, die für die Immuntherapie geeignet sind, sowie Verfahren zu deren Herstellung und zu ihrer Verwendung.

Das Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Ursache vieler Erkrankungen auf Vermehrung von unerwünschten aktivierten T-Zellen und in einigen Fällen zusätzlich auf der Gegenwart von unerwünschte Zellen schützenden Zellen, nämlich protektiven Suppressorzellen, beruht. Es wurde daher eine Methode entwickelt, um die unerwünschten T-Zellen und gegenenenfalls die Suppressorzellen wirksam zu entfernen und damit die zugrundeliegende Krankheit zu bekämpfen. Für dieses allgemeine Prinzip sind viele verschiedene Ausführungsformen möglich, die unter anderem von der Art der Krankheit, der Art der zu bekämpfenden Zellen und der Schwere der Erkrankung abhängen. Diese verschiedenen Ausführungsformen werden im folgenden beschrieben. So wird unter anderem ein Präparat bereitgestellt, mit dem maligne Tumoren bekämpft und ein erneutes Auftreten bzw. das Auftreten von Metastasen verhindert werden kann.

Viele Tumortherapien scheitern daran, dass bei der chirurgischen und/oder chemotherapeutischen Entfernung des Tumors nie alle Tumorzellen vernichtet werden und darüberhinaus den Tumor schützende "tumorprotektive" Suppressorzellen nicht erfasst werden. Ein ähnliches Problem tritt auch bei chronischen Virenerkrankungen auf, die schwer zu bekämpfen sind. Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren und ein dafür geeignetes Mittel bereitgestellt, um diese Krankheiten zu bekämpfen. Ein Grundprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, sowohl unerwünschte aktivierte T- Zellen als auch protektive Suppressor-Zellen zu entfernen. Unter unerwünschten aktivierten T-Zellen werden dabei solche Zellen verstanden, die einen pathologischen Effekt haben, z.B. von Viren befallene Zellen, autoaggressive Zellen, Zellen, die das Auftreten von Atherosklerose induzieren, allergische Reaktionen auslösende Zellen und andere Zellen, deren Vermehrung den Organismus stört.

In einer Ausführungsform werden erfindungsgemäß solche Krankheiten bekämpft, bei denen neben unerwünschten T-Zellen auch protektive Zellen vorhanden sind. Beispiele hierfür sind insbesondere neoplastische und durch Viren hervorgerufene Krankheiten.

Erfindungsgemäß wird hierzu folgendes Verfahren durchgeführt:

In einer ersten Stufe wird der überwiegende Anteil der den Tumor oder das Virus schützenden Zellen entfernt. Da diese protektiven Zellen zur Klasse der T-Zellen gehören, die wiederum zu den hämatologischen Zellen gehören, könnte man mit an sich bekannten Methoden die hämatologischen Zellen durch Bestrahlung oder durch Verabreichung von Cyclophosphamid zerstören, wodurch das gesamte Immunsystem zerstört wird und damit auch die T-Zellen depletiert werden. Um den Patienten jedoch nicht übermäßig zu schwächen, ist es vorzuziehen, selektiver vorzugehen und nur die T-Zellen zu entfernen. Für die selektive Entfernung der T-Zellen sind dem Fachmann Verfahren und Mittel bekannt, die hier geeignet sind. Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Mittel ist die Behandlung mit monoklonalen Antikörpern, die gegen T- Zellen gerichtet sind, ggf. konjugiert mit Immuntoxinen. Dies führt zu einer humoralen Bekämpfung der T-Zellen. Beispiele für geeignete Antikörper sind Anti-CD3- Antikörper, die als OKT3 (Orthoclone), ATG oder ATGAM im Handel erhältlich sind. Diese werden nach den Angaben der Hersteller verabreicht, z.B. bis zu 4 Wochen lang täglich oder in regelmäßigen Intervallen. Häufig reicht es aus, die monoclonalen Antikörper 3 bis 15 mal, insbesondere 3 bis 10 mal an aufeinanderfolgenden Tagen je einmal täglich zu verabreichen, um die T-Zellen zu depletieren. Die hier zu verabreichenden Mengen sind die, die vom Hersteller empfohlen werden.

Normalerweise werden bei dieser Behandlung nicht alle T-Zellen und vor allem nicht alle Suppressorzellen erfasst. Erfindungsgemäß werden daher in einer zweiten Stufe die aktivierten T-Zellen angegriffen unter Verwendung von Lymphocyten mit vorbestimmten Zelltod. Hierzu werden bevorzugt PBL's, d.h. periphere Blut- lymphocyten, eines Donors mit Mitomycin C so vorbehandelt, werden, dass sie sich nur noch etwa 3 bis 1 5 mal, bevorzugt 3 bis 5 mal, teilen können und danach absterben. Auf diese Weise wird erreicht, dass die Lymphocyten im Patienten die aktivierten T-Zellen angreifen, bevor sie jedoch eine GvH-Reaktion auslösen können, absterben. Auf diese Weise wird ein weiterer erheblicher Anteil der T-Zellen entfernt. Um ein erneutes Auftreten der Krankheit, d.h. die Bildung neuer Tumoren und Metastasen oder die Entwicklung von Viren, zu verhindern, wird erfindungsgemäß die Entstehung neuer Suppressorzellen, die den Tumor oder die unerwünschten Zellen wieder schützen würden, verhindert. Dazu werden Präparate, die als Zellkonstrukte bezeichnet werden, eingesetzt. Diese sollen dazu dienen, die Immunabwehr des Patienten auf diese Zellen zu richten und somit als eine Art Vakzine verwendet werden. Die Zellkonstrukte sind fusionierte Zellen, die aus der Fusion von Tumorzelle oder virenbefallenen Zelle und MHC ll-positiven Zellen und aus der Fusion von Suppressorzellen und MHC ll-positiven Zellen entstehen. Erstere verhindern, dass sich der Tumor neu bildet und Letztere verhindern, dass sich neue Suppressorzellen bilden.

Möglich sind sowohl Fusionen mit autologen MHC ll-positiven Zellen als auch mit allogenen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sowohl autologe als auch allogene MHC ll-positive Zellen für die Fusion eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Triomas, bei denen eine fremde MHC ll-positive Zelle, eine Patienten eigene MHC ll- positive Zelle und eine Tumorzelle bzw. eine Suppressorzelle verschmolzen wurden. Dies kann erreicht werden, indem MHC Il-Zellen jeweils von einem Donor und dem Patienten gewonnen werden. Verfahren zur selektiven Gewinnung der genannten einzelnen Zellarten sind dem Fachmann bekannt und bedürfen keiner näheren Erläuterung. In der Literatur werden hierzu eine Vielzahl von Verfahren erläutert. Geeignet ist beispielsweise die Technik von Miltenyi. Letztere wird zum Beispiel zur Gewinnung von Tumorzellen eingesetzt in einem Verfahren, das in US-A 61 21044 beschrieben wird und auch für die vorliegende Erfindung geeignet ist. Zur Gewinnung von MHC-ll-positiven Zellen ist unter anderem ein Verfahren geeignet, wie es in US-A 6008002 beschrieben wird. Zur Gewinnung von T-Zellen sind verschiedene Verfahren bekannt, unter anderem eines, das in US-A 5965535 beschrieben wird.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Zellkonstrukte, z.B. Hybridomas, Triomas oder Quadromas, werden üblicherweise dem Patienten durch Infusion, bevorzugt sub- cutan, verabreicht.

Um die natürliche Immunabwehr des Patienten weiter zu stärken wird er bevorzugt in einer weiteren Stufe mit in an sich bekannter Weise klonal postexpanidierten Zellen behandelt. Dazu entnimmt man den Patienten eine Blutprobe, wäscht diese, versetzt sie mit fötalem Kälberserum , IL2 und mitogenen Antikörpern, z.B. Anti CD3 oder Anti CD2 oder Anti CD28, inkubiert mit Tumorzellen, selektiert die effizientesten cytotoxischen T-Zellen (Tc), die gegen die Tumorzellen gerichtet sind, und infundiert dann diese selektierten T-Zellen nach klonaler Postexpansion dem Patienten.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine rezeptorunabhängige Aktivierung von Zellen, die sowohl ergänzend zu den oben beschriebenen Stufen eingesetzt, als auch allein zur Stärkung des Immunsystems allgemein eingesetzt werden kann. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass das Verhältnis von ROI, d.h. reaktiven Sauerstoffzwischenprodukten, zu RNI, d.h. reaktiven Stickstoffzwischenprodukten (reactive oxygen intermediates/reactive nitrogen intermediates) einen Einfluss auf die Zellaktivierung und darüberhinaus einen Einfluss darauf hat, ob T-Zellen in Form von Ts-Zellen oder Tc-Zellen vorliegen. Es wurde gefunden, dass Zellen aktiviert werden können bzw. Ts-Zellen in Tc-Zellen umgewandelt werden können, indem sie mit Xanthinoxidase und deren Substrat Substrat in Kontakt gebracht werden. Als Substrat für Xanthinoxidase kann z.B. Xanthin oder Hypoxanthin verwendet werden. Dadurch werden ROI erzeugt und der Quotient RIO/RNI erhöht. Dies aktiviert die Zellen. Außerdem wurde gefunden, dass membrangängige Substanzen, die das intrazelluläre pHi erhöhren, immunstimulierend wirken und die Ts-Tc-Umwandlung fördern. Beispiele sind NH₃ und Triethanolamin in subtoxischer Dosis.

Die Aktivierung kann in vitro und in vivo erfolgen. Für eine in vitro-Aktivierung werden die Zellen mit Enzym und Substrat in geeigneter Weise inkubiert. Für eine in vivo- Aktivierung müssen Xanthin-Oxidase und Substrat an den richtigen Ort gebracht werden. Mittel hierzu sind dem Fachmann bekannt, geeignet ist beispielsweise Enzym und Substrat in einer schützenden Matrix oder an PEG gebundenes Enzym.

Es wurde nun gefunden, dass dann, wenn in der Zelle RNI überwiegen, die Anzahl der Suppressorzellen steigt, während dann, wenn ROI überwiegen, die Anzahl der Tc- Zellen steigt. Das Verhältnis von RNS zu ROS hat damit Einfluss auf das Verhältnis von Th, zu Th₂ bzw. Tc zu Ts.

Die für die Fusion benötigten Suppressorzellen gewinnt man aus den T-Zellen des Patienten. Dazu muss man einfach nur die peripheren Blutlymphocyten aus dem Blut des Patienten isolieren, was an sich bekannt ist. Diese PBL's enthalten auch die Suppressorzellen, die bei Tumorpatienten erhöht sind. Man kann dann die PBL mit Tumorzellen inkubieren, was alle Zellen, die mit Tumorzellen reagieren, insbesondere tumorspezifische Ts- und Th2-Zellen, aktiviert. Diese dabei gewonnenen Zellen können dann für die Fusion verwendet werden.

Für die Fusion werden MHC ll-positive Zellen und Tumorzellen bzw. T-Zellen eingesetzt. Dabei passiert das folgende: wird eine allogene MHC ll-positive Zelle mit dem Tumor verschmolzen, so presentiert diese Zelle verstärkt auf ihrer Oberfläche fremdes MHC II und Tumorantigen. Dieses aktiviert die T-Zellantwort des Patienten. Darüber hinaus wird von dem Tumor auch noch MHC I presentiert. Möglicherweise ist diese Kombination aus MHC II, MHC I und Tumorantigen besonders hilfreich.

Werden autologe Zellen des Patienten verwendet, so aktiviert zwar nicht das MHC II die T-Zellantwort, aber dadurch, dass eigene MHC ll-positive Zellen verwendet werden, ist die Bindung mit den T-Zellen stärker und dadurch wiederum der Kontakt mit dem Tumorantigen. Eine Kombination von beidem wird als besonders vorteilhaft angesehen.

Die eingesetzten Fusionszellen, die wie eine Vakzine eingesetzt werden, sollen vor allen Dingen gegen Rezidive helfen.

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Prnizip zur Entfernung unerwünschter Zellen, nämlich von autogressiven, allergischen Zellen und GvH-Zellen. In diesem Fall müssen keine Suppressorzellen entfernt werden. Hier können Triomas, die wiederum aus autologen und allogenen MHC ll-positiven Zellen und der unerwünschten Zelle bestehen, eingesetzt werden. Durch diese Triomas wird wiederum die T-Zellantwort gegen die präsentierte unerwünschte Zelle angeregt, wodurch diese Zellen dann entfernt werden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Mittel und ein Verfahren zur Behandlung von Krebvs und Viren bereitgestellt. Ein Prinzip dabei ist es, sowohl die Tumor- oder Viren-tragenden Zellen, als auch diese schützenden Zellen zu entfernen. Wird nur der Tumor entfernt, ohne gleichzeitig die ihn schützenden Zellen zu entfernen, kann sich nach der Behandlung ein neuer Tumor bilden, da es nie gelingen kann, alle Tumorzellen zu zerstören. Um nun sowohl Tumorzellen als auch den Tumor schützende Zellen zu vernichten, wird die Verwendung von fusionierten Zellen vorgeschlagen, die die Immunantwort gegen beide Zellarten verstärken. Überraschenderweise wurde gefunden, dass durch eine Kombination von autologen und allogenen fusionierten MHC ll-positiven Zellen mit den unerwünschten Tumoroder virentragenden Zellen die Immunantwort derart verstärkt wird, dass die letztere Zellen nicht mehr weiter wachsen können, wodurch spätere Rezidive verhindert werden. Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen fusionierten Zellen führen zu einer sehr wirkungsvollen Präsentation der unerwünschten Zellen, die die Immunantwort sehr verstärken können.

Um die Tumorbehandlung weiter zu verbessern, wird vor der erfindungsgemäßen Behandlung eine Entfernung des Tumors vorgeschlagen, insbesondere durch Exzision.

Besonders geeignet zur Entfernung der Suppressorzellen sind die in EP 705 1 1 1 vorgeschlagenen Verfahren. Diese bedürfen daher hier keiner näheren Erläuterung.

Weiterhin wurde gefunden, dass ein hoher Superoxid/Peroxid (0₂70₂ ^{2 "} bzw. H0₂/H₂O^2')-Quotient im Cytosol bzw. im mitochondrialen und/oder mikrosomalen endoplasmatischen Kompartment die Zelldifferenzierung fördert. Mit anderen Worten: die Zellproliferation (Zellteilung) ist mit hohem bzw. erhöhtem Superoxid (0₂ ^', H0₂)-Spiegel, die Zelldifferenzierung dagegen mit erhöhtem Peroxid (0₂ ^2', H₂0₂)-Spiegel assoziiert. Es wurde außerdem gefunden, dass alle Tumorzellen unabhängig vom Typ und Art des Tumors durch einen konstitutiv erhöhten H0₂/H₂0₂ (Superoxid/Peroxid)-Quotienten charakterisiert sind.

Erfindungsgemäß wichtig ist die Unterscheidung zwischen den Th1 - versus Th2- Subpopulationen der DC4-positiven Helfer/Inducer-T-Zellen einerseits sowie zwischen den Tc/CTL versus Ts-Subklassen der CD8-positiven Suppressor/cytotoxischen T-Zellen andererseits. Hiernach ist eine minimale Grenzkonzentration an Peroxidanion (0₂ ² ) bzw. an Wasserstoffperoxid (H₂0₂) im Cytosol bzw. im mitochondrialen Bereich kritisch für die Aufrechterhaltung und Funktion des Th1 vs. Th2- sowie des Tc/CTL- vs. Ts-subsets. Wird diese kritische Peroxidkonzentration durch verringerte 0₂ ^2"-Nachbildung (z.B. durch cAMP1 - Anstieg) oder via chemische Neutralisierung des unmittelbaren Präkursors (H0₂) durch NO unterschritten, wird die Bildung von Th2- bzw. Ts- statt Th1 - bzw. Tc/CTL-Subpopulationen gefördert.

Der Anmelder hat weiterhin gefunden, dass die Antigenpräsentierenden Zellen (APC), primär Makrophagen, im kritischen Moment der Antigen-Präsentierung an naive, Antigen-spezifische T-Zellen durch Sekretion von Peroxidanion (H₂0₂) den Th1 - bzw. Tc-Subset induzieren, während die Sekretion von NO statt H₂0₂ in dieser kritischen Frühphase zur Th2- bzw. Ts-Prädeterminierung führt. Aus den oben dargelegten neuen Erkenntnissen ergeben sich folgende therapeutische Konsequenzen:

(1 ) Durch Manipulierung des absoluten oder relativen Anteils an Superoxid- bzw. Peroxidanion in den Zielzellen können diese entweder in Richtung Proliferation oder Differenzierung gesteuert werden. Mit anderen Worten, man kann von außen entweder eine Erhöhung der Zielzellenzahl oder aber eine Steigerung der Effizienz, d.h. Verfeinerung der Funktion bestehender Zielzellen erreichen. Zu diesem Zwecke kann man z.B. das Enzym Xanthin-Oxidase (XOD) mit dem entsprechenden Substrat Xanthin und/oder Hypoxanthin einsetzen, wobei man durch Kombination mit weiteren Enzymen, der Katalase oder Peroxidase (Glutathion-Peroxidase oder Meerrettich-Peroxidase), primär die Superoxid-(H02)-Bildung und mit einem anderen Enzym, der Superoxid-Dismutase (SOD), sei es Mn-, Cu/Zn- oder Fe-SOD, umgekehrt die Peroxid-(H₂0₂)-Bildung erzielen kann. Die Peroxid-Bildung kann man auch mit dem Enzym Glucose-Oxidase (GOD) und dem entsprechenden Substrat (Glucose) erreichen.

Eine weitere Konsequenz aus den neuesten Erkenntnissen ist die in-vitro- und in- vivo-Steuerung der Th1 - vs. Th2- und/oder Tc- vs. Ts-Bildung via Abfangen der von APC (Makrophagen) abgegebenen H0₂ ^' und/oder H₂0₂-Signale mittels spezifischer Scavengers. Diese Scavengers sind chemisch gut definiert, nicht zuletzt auch hinsichtlich des Wirkmechanismus (Abbindung von 0₂ - vs. 0₂ ² -Anion; einige sind als Radikalfänger in vivo eingesetzt worden). Geeignete Scavenger sind dem Fachmann bekannt und bedürfen daher keiner näheren Erläuterung. Beispiele für geeignete Scavenger sind beispielsweise in "der Sauerstoff", Biochemie, Biologie, Medizin (Autor: E.F. Elstner), Wissenschaftsverlag Mannheim/Wien/Zürich, 1 990, ausgeführt. Versuche haben gezeigt, dass neben den oben genannten "chemischen" Scavengers auch "enzymatische" Scavengers zum Abfangen von H0₂ ^' und/oder H₂0₂-Signalen und hiermit zur präzisen Immunmodulation eingesetzt werden. So können die H0₂-Signale durch Mn-, Cu/Zn- und/oder Fe-SOD, die H₂0₂-Signale durch Katalase und/oder Peroxidase abgefangen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht in der NO-Neutralisierung, die ebenso von den aktivierten und speziell hyperaktivierten bzw. chronisch aktivierten APC (Makrophagen) sezerniert werden, durch NO-Savengers, welche von mehreren Herstellern kommerziell angeboten werden. In einer weitern Ausführungsform werden von subtoxischen Dosen an Ammoniak (NH3) und Ammoniumsalzen einerseits bzw. NH3-Scavengers (z.B. Kombination aus Glutamin-Synthase plus Glutamat und/oder Asparagin-Synthase plus Aspartat) zugesetzt, wodurch die T-Zell-Modulation gesteuert werden kann. Dies wurde vom Anmelder durchgeführte Versuche im Labor bestätigt.

Da einerseits hyper- bzw. chronisch aktivierte Makrophagen durch Sekretion von H0₂ und/oder H₂0₂ abbauenden bzw. H0₂ in H₂0₂ hyperdismutierende SOD- Exoenzyme zum unpassenden Zeitpunkt, z.B. während der Antigenpräsentierung an Neoantigenspezifische naive T-Zellen, zur unerwünschten Immunsuppression Anlass geben können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden daher diese Exoenzyme als unerwünschte Suppressorfaktoren mit entsprechenden Antikörpern neutralisiert.

(2) Erfindungsgemäß wird erstmalig eine Möglichkeit bereitgestellt, die Richtung der Immunabwehr (Th1 /Tc vs. Th2/Ts) während des Erstkontaktes mit dem Fremdantigen ("priming") in vitro und in vivo zu beeinflussen, andererseits eine Subpopulation der T-Zellen in die andere mindestens funktionell umzuwandeln. Hierbei ist hervorzuheben, dass diese Umwandlung nicht von präexistenten Rezeptoren abhängt, weil die Modulation, anders als im Falle der Cytokine, durch membrangängige Mediatoren vermittelt wird.

Die selektive Förderung des Th1 - und Tc-Subsets sowie die in vitro und in vivo Th2- , Th1 - bzw. Ts:Tc-lnterkonversion kann (a) durch "Vorprogrammierung" der APCs (Makrophagen) zur gleichzeitigen Superoxid- und Peroxidbildung oder vorteilhafterweise zur dominierenden Peroxidbildung und (b) durch Zusatz von subtoxischen H₂0₂-Mengen bzw. H₂0₂ ^' und H0₂-generierenden Enzymen erzielt werden. Weiterhin bevorzugt ist der Zusatz von

(a) Ca-Antagonisten, insbesondere Nicardipin und Niphedipin),

(b) Antagonisten der Gs (Gsalpha)-konjugierten Membranrezeptoren, wie 2-AR und A2-purinergen (Adenosin)Rezeptoren, die noch mit Agonisten der Gi (Gial-pha)- konjugierten Rezeptorsubtypen kombiniert werden können, sowie

(c) der Zusatz von Inhibitoren der NO-Synthese (z.B. Inhibitoren der konstitutiven und/oder induzierbaren NO-Synthetasen), die auch kommerziell erhältlich sind. Wird andererseits bei der Zielsetzung einer Antigenspezifischen oder unspezifischen Toleranzinduktion z.B. bei der Knochenmark- oder Organtransplantation eine Th1 :Th2 bzw. Tc:Ts-lnterkonversion angestrebt, so ist der Einsatz von Agonisten Gs-gekoppelter Rezeptoren und/oder Antagonisten von Gi-gekoppelten Rezeptoren sowie iNOS/cNOS-Stimulatoren mit/ohne NO-freisetzenden Präparaten bevorzugt. Die Feinregulierung der T-Zell-Subsetlnterkonversion in vitro (nicht in vivo) kann weiterhin durch Rezeptorunabhängige Einwirkung von Ca-Influx-fördernden Präparaten des Ca-Ionomycin- und Ca-lonophore-A23187-Typs sowie durch diverse Phorbolester (TPA/PMA) erzielt werden. (3) In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als T-Zell- Modulatoren Vertreter einer wichtige Substanzklasse, nämlich die verschiedenen cAMP- bzw. cGMP-spezifischen Phosphodiesterasen (PDEs) erweitert werden, eingesetzt.

Mit Inhibitoren von cAMP-spezifischen PDEs, die in 3 Subklassen (Typ IV, Rolipraminsensitiver Typ VII und IBMX-insensitiver Typ VIII) unterteilt werden, aber auch mit Hemmern der unspezifischen PDEs (Typen I, II und III) kann die Th1 :Th2- bzw. Tc:Ts-Umwandlung gefördert werden. Zudem lässt sich der durch Agonisten von Gs-gekoppelten Rezeptoren und/oder Antagonisten von Gi-gekoppelten Rezeptoren und/oder iNOS/cNOS-Stimulatoren induzierte cAMPi-Anstieg in den Zielzellen verstärken und über längere Zeit aufrechterhalten.

Analog hierzu lässt sich mit Stimulatoren der cAMP-spezifischen und - unspezifischen PDEs (s.o.) ein durch Antagonisten von Gs-gekoppelten Rezeptoren und/oder Ca-Antagonisten und/oder iNOS/cNOS-Hemmer niedrig gehaltener cAMPi- Spiegelin den Zielzellen weiterhin reduzieren. Zudem können diese PDE-Stimulatoren die oben beschriebene Th2:Th1 - bzw. Ts:Tc-Umwandlung stark unterstützen. Besondere Bedeutung könnten die oben besprochenen Hemmer der cAMP- spezifischen und -unspezifischen PDEs bei der Verhinderung der HvGR bei Organtransplantationen sowie der GvHD bei der Knochenmarktransplantation (BMT, SC-T, PBPC-T) erlangen. Da auch während der Zellaktivierung durch Interferon (IFNgamma) ein temporärer cAMPi-Anstieg beobachtet wird, könnte die Hemmung des cAMPi-Abbaus durch cAMP.PDE-lnhibitoren in der kritischen Phase der GvHD- und HvGR-lnduktion diese fatalen Nebenwirkungen bei den Transplantationen verhindern.

(4) Wie die Detailuntersuchungen im Labor des Anmelders zeigten, lassen sich nicht nur durch die Kombination von H02 und H202, sondern auch durch NH3 in subtoxischen Dosen hohe Proliferationsraten von Testzellen (PBLs/PBMs) erzielen, die sogar in PBS (enthält nur Na/K-Phosphat), d.h. in Abwesenheit von Serum (BSA/FCS) und sonstigen Mediumbestandteilen nicht zum Stillstand kommen. Deshalb wird vorgeschlagen, bei suppressiver Lage (a) mit H02 und/oder H202, generiert z.B. durch das System XOD/Xanthin (Hypoxanthin) und/oder NH3 in subtoxischen Dosen die Immunzellen zu stimulieren.

(1 ) Gegenstand der vorliegenden Erfindugn sind Präparate und Verfahren, die auf einer als "Mikroimmunchirurgie" (MIS) bezeichneten Methode aufbauen. Diese MIS- Methode ist näher beschrieben in der Anmeldung EP 0 705 1 1 1 des vorliegenden Anmelders. Zu Einzelheiten dieser Methode wird daher auf diese Anmeldung verwiesen. Ein Gegenstand der Erfindung ist eine auf der MIS-Methode aufbauende Ausführungsform, nämlich die Markierung, genauer gesagt

Transfizierung/Transduzierung der Donor-Effektorzellen (Lymphozyten, PBLs/PBMCs, Agranulozyten, "buffy coat"/-"Lymphozytenkonzentrat") mit der viralen (HSV) Thymidinkinase (TK/tk), gefolgt von einer späteren selektiven in-vivo-Eliminierung der so markierten Donorzellen mittels Ganciclovir. Der Einsatz dieser auf auf HSV- TK/Ganciclovir basierenden, so genannten "Suizid"Technik auf für alle Einsatzgebiete erfindungsgemäß angewendet werden, die für die MIS-Methode in EP 0 705 1 1 1 angegeben sind.

(2) Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung bezieht sich auf die sogenannte "Mikroimmunotargeting"-(MIT)-Technik. Sie weist viele Ähnlichkeiten mit der in EP 0 705 1 1 1 im Detail beschriebenen (MΙS)-Technik auf. Der Hauptunterschied liegt in der in-vitro-Vorbehandlung der Donor-Lymphozyten (PBSs/PBMCs), genauer gesagt, in der Konzentration des zur Brückenbildung zwischen beiden DNA-Strängen der Donor-PBSs eingesetzten, bivalentalkylierenden Antibiotikums Mitomycin C (und anderer, DNA partiell schädigender Verbindungen). Während die MIS-Technik auf der verhinderten Proliferation bwz. auf dem vorprogrammierten Zelltod zwecks erhöhter GvL/GvT-Reaktion bei gleichzeitig verhinderter GvH-Erkrankung aufbaut, beruht die neuere MIT-Technik auf der Übertragung ("Aufoktruierung") des Cytokin-Profils von Donor-PBLs, genauer gesagt Donor-T-Zellen, auf die "falsch programmierten" Patienten-T-Zellen. Wie detaillierte eigene Versuche gezeigt haben, dürfte die in-vivo-Depletierung bzw. Inaktivierung der pathologischen Patienten-T-Zellen bei der MIS-Technik mindestens z.T. auf einer restlichen cytotoxischen bzw. cytolytischen Wirkung der Zelltodvorprogrammierten alloreaktiven Donorzellen basieren. Bei der neueren, erfindungsgemäßen MIT- Technik dagegen scheinen Donor-T-Zellen das Th1 -Cytokinprofil während des innigen ZelhZell-Kontaktes auf die Th2-Suppressor-T-Zellen (Ts) des Tumorpatienten zu übertragen. Bei Autoimmunerkrankungen dürfte die therapeutische Wirkung von MIT-Effektoren auf der Inaktivierung von präaktivierten (autoaggressiven) T-Zellen durch den lokalen Überschuss an Typ1 (proinflammatorischen) Cytokinen beruhen; bekanntlich führt eine weitere Aktivierung von cytokin-, z.B. IL-2-vorinkubierten T- Zellen zu deren Tod (durch Apoptose). Die Erkennung der pathologisch hyperaktivierten (falsch programmierten) Patienten-T-Zellen erfolgt durch deren obligate Postexpression von Klasse-Il-MHC-(HLA-DR/DQ)-Antigenen.

Interessanterweise fungiert solche überaktivierte T-Zelle als nicht professionelle Antigen-präsentierende Zelle (APC), die bei innigem Zel Zell-Kontakt mit der vorprogrammierten Donor-T-Zelle das Cytokinmuster der letztgenannten Zelle "übernimmt", in Analogie etwa zur APC-Beeinflussung durch reife, immunkompetente T-Zellen während des Aktivierungsprozesses durch das prozessierte Fremdantigen.

Eine gewisse Rolle dürfte auch die direkte Inaktivierung von falsch programmierten T-Zellen durch den so genannten "Veto-Effekt" spielen, wobei die zusätzliche Interaktion von B7.1 -(CD80)-, B7.2-(CD86)- und B7.3-(BB1 )-Antigenen auf den hyperaktivierten Patienten-T-Zellen mit den korrespondierenden CD28- und CTLA-4- Strukturen auf den Donor-Effektorzellen zur selektiven Ausschaltung der ersteren führt. Wie detaillierte Versuche gezeigt haben, liegt die kritische Konzentration des Mitomycin C - bei einer 18-stündigen Inkubation - bei 10 /g/ml bzw. 10 μg/1.106 Donor-PBLs/PBMCs. Liegt die Mitomycin-Konzentration bei bzw. über 10 / g/ml, so werden die Donor-Effektorzellen zu MIT-Effektoren programmiert; bei Mitomycin-C- Konzentrationen unter 10 //g/ml resultiert die MIS-Vorprogrammierung der Donor- Effektoren.

(3) Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Verhinderung der Tolranz(re)induktion (a) gegenüber residuellen Tumorzellen und/oder (b) gegenüber allen Arten von Infekten, speziell (retro)viralen Infekten (z.B. EBV- oder CMV-Infekten). Es muss verhindert werden, dass im immunsupprimierten Organismus, z.B. nach Tumorexzision, nach Chemo- und Radiotherapie sowie Knochenmark- und Organtransplantation unreife T-(und B-)- Zellen, die man auch als prä-T-(bzw. prä-B-)-Zellen oder T- bzw. B-Präkursorzellen bezeichnen kann, auf reife T-Zellen des Th2- und Ts-Subtyps treffen. Hierbei denkt man in erster Linie an die tumor- bzw. (retro)virusspezifischen T-(und B-)- Subpopulationen. Die Folge eines solchen in-vivo-Zusammentreffens von "falsch programmierten" immunkompetenten Immunozyten mit deren Präkursoren ist eine Toleranzreinduktion gegenüber den Resttumorzellen bzw. Viren, was deren ungehinderte Vermehrung ermöglicht.

Dieser unerwünschte Kontakt bzw. Fehlleitung der heranreifenden Präkursorzellen in Richtung von Th2 und Ts-Zellen kann durch konsequente in-vivo-Depletion (a) von Th2 und/oder Ts-Zellen, (b) von unreifen T-(und B-)-Zellen, oder aber (c) durch gleichzeitige Depletierung beider Subsets erzielt werden, wobei im letzteren Fall (Punkt (c)) schon eine partielle, weniger konsequente Codepletierung beider Subsets ausreichend ist. Da es bis dato keine Th1 - und Th2-spezifischen Mabs gibt, muss an eine temporäre in-vivo-Depletierung des Th(T4)-Subsets als solchen gedacht werden. Die unreifen Präkursor-T-Zellen können in vivo durch Mabs wie OKT6, OKT9 und/oder OKT10 selektiv eliminiert werden.

Erfindungsgemäß reicht schon die Unterbrechung der fehlgeleiteten Präkursor-T- Zelldifferenzierung ("commitment") zu Th2 bzw. Ts-Zellen durch die selektive invivo-Depletion ("Herausschneiden") dieser prä-T-Zellen mit entsprechenden Mabs (OKT6, OKT9, OKT10) aus, um die labile Phase bis zur Wiedererlangung der Immunkompetenz zu überbrücken. Die Tatsache, dass beim polyklonalen Einsatz von gegen T-Zellen gerichteten Antikörpern, wie z.B. ATG bzw. ALG, die Komplikationen mit sekundären Infekten und/oder lymphoproliferativen Krankheiten (basierend meist auf den reaktivierten EBV-Infekten) viel seltener als beim Einsatz von monoklonalen Mabs (z.B. OKT3) vorkommen, kann durch die gleichzeitige, obwohl temporäre Depletion von reifen T-(Th2, Ts)-Zellen plus deren Präkursoren im ersteren Fall (polyklonale Ak) bzw. der alleinigen Eliminierung der reifen T-Zellen im letzteren Fall (monoklonale Ak/Mab) erklärt werden.

Aus gleichem Grund ist bei der Konditionierung der Tumorpatienten sowohl bei der Behandlung der soliden Tumoren mit "Mikroimmunchirurgie" als auch bei der Knochenmarktransplantation (KMT) der Tumorpatienten (allogene KMT bei Leukämie- und Lymphompatienten sowie autologe KMT bei bestimmten Arten von soliden Tumoren) erfindungsgemäß der Einsatz von polyklonalen Antikörpern (ATG, ALG, ALS) jenem der panT bzw. CD3-spezifischen Mabs vorzuziehen.

Unter den Mabs gibt es allerdings solche, die neben reifen T-Zellen mindestens partiell auch unreife Präkursor-T-Zellen erfassen. Beispiele sind Anti-CD2-Mabs, die sowohl reife T-Zellen als auch Thymozyten erkennen, ferner CD5, CD6, CD7. Die Anti-DC4-Mabs sind deshalb von besonderem Interesse, da sie sowohl die Th2 als auch 75% die prä-T-Zellen (Thymozyten) in vivo eliminieren können (Beispiel: die beiden complementbindenden OKT4- und OKT4A-Mab), wobei Anti-CD4-Mabs generell mit dem Anti-CD8-, mit dem Anti-CD3- und/oder dem Anti-CD2-Mab kombiniert werden können. Der oben genannte Anti-CD6-Mab (OKT1 7) ist deshalb besonders interessant, da er aktivierte Helfer-T-Zellen erkennt und somit die Th2- Fraktion selektiv depletieren kann. Ein weiterer Mab, gerichtet gegen CD2R, ist wegen seiner Selektivität für die aktivierten T(Th2 und TS)-Zellen hervorzuheben. Die alleinige Depletierung, genauer gesagt Codepletierung von Th2-Zellen oder die kombinierte Eliminierung von T4(Th2)- plus prä-T-Zellen (z.B. mit OKT6, OKT9 oder OKT10) verspricht eine effiziente Unterdrückung der Toleranz(re)induktion sowohl gegenüber den residuellen Tumorzellen (nach Behandlung des Primärtumors) als auch gegenüber reaktivierten (retro)viralen Infekten, wenn die Beobachtungen im Tiermodell auch in der Klinik bestätigt werden.

(4) Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Verbesserung der allogenen Knochenmarktransplantation durch die successive Transfusion der Knochenmarkzellen bzw. der CD34 + -Stammzell-(SC/PBPC)-Subpopulation (a) zuerst vom MHC-inkompatiblen Knochenmarkspender und danach (optimal: 7 bis 10 Tage später) des MHC-identischen Spenders. Hierbei sollen die erstgenannten Donorzellen zwecks "Mikroimmunchirurgie" und die letztgenannten zwecks besserer Kooperation mit aυtologen, d.h. Patienten-APCs (Makrophagen) eingesetzt werden. Die letztgenannten HLA-identischen PBLs können bei Patienten mit soliden Tumoren durch Ts- bzw. Th2-(T4)-prädepletierte Patienten-PBLs partiell oder komplett ersetzt bzw. mit diesen kombiniert werden. Die besondere "Stärke" der autologen PBLs ist deren MHC-Identität mit Patienten-APCs und seinen Tumorzellen, während die HLA- identischen Donorlymphozyten den Vorteil einer fehlenden gemeinsamen Vorgeschichte mit Tumorzellen und der hiermit verbundenen Abwesenheit jeglicher prägenerierter tumorspezifischer Th2- und/oder Ts-Subpopulation mit sich bringen. (5) Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein neues Prinzip zur Behandlung von Tumoren, Infekten mit Hilfe von Vakzinen. Das neue erfindungsgemäße Prinzip beruht auf der Erkenntnis, dass die Entwicklung cytotoxischer T-Zellen (CTLs/Tc), die z.B. gegen Tumorzellen oder (retro)viral- befallene Zellen gerichtet sind, eng von den Cytokin produzierenden Helfer-T-Zellen begleitet ist und dass die letzteren nur in der 1 . Phase nach ihrer Aktivierung, d.h. als so genannte "aktivierte naive Th-Zellen" als einziges Cytokin das von den Präkursor-Tc-Zellen (pCTLs) benötigte Typ1 -Lymphokin IL-2 produzieren. Bereits in der 2. Phase ihrer Entwicklun, d.h. als so genannte ThO-Zellen, sezemieren die T4- Zellen neben IL-2 noch IL-4 und andere Th2-Typ-Cytokine; in der 3. Phase werden diese aktivierten, Antigenspezifischen T4-Zellen entweder zum Th1 - oder Th2- Subtyp differenziert. Um die Th2-Typ-Lymphokine, welche junge T4-Zellen in Richtung von Suppressor-T-Zellen (Ts-Zellen) dirigieren, auszuschließen, wird erfindungsgemäß empfohlen, die Präkursor- bzw. naive T4-Zellen in vivo so zu behandeln, dass sie sich nur bis zur 1 . Stufe ("aktivierte naive Th-Zellen") entwickeln können und vor Erreichung der Th2-Cytokintyp-cosezernierenden ThO- Stufe absterben. Zur Erreichung dieses Zieles werden gleiche Prozedu-ren und Substanzen wie bei der Vorprogrammierung des Zelltodes/Suizids bei der in EP 705 1 1 1 be-schriebenen "Mikroimmunchirurgie" eingesetzt. Alternativ hierzu kann durch Zusatz von Anti-T4(CD4)-Mabs und entsprechenden Immuntoxinen eine Situation geschaffen werden, bei der durch entkoppelte, d.h. um 2 bis 5 Tage verzögerte Aktivierung von Helfer-T4-Zellen alle Antigen-(z.B. TSTA TATA)- spezifischen CTLs auf die ausschließlich IL-2 (nicht IL-4) sezernierenden Th ("aktivierten naiven Th-Zellen") auf oder in der Nähe von das betreffende Antigen präsentierenden Makrophagen (und anderen APCs) treffen, was zu einer verstärkten bis ausschließlichen Ts-freien CTL-Generierung führt. Erfindungsgemäß kann auch durch eine Behandlung mit Cyclophosphamid 2 bis 7 Tage vor dem Priming mit dem betreffenden Antigen (z.B. Tumor- und Virusantigen) eine Entkopplung der parallelen Aktivierung von T4- und T8-Zellen erzielt werden, die darin besteht, dass aktivierte pCTLs komplett auf die ausschließlich IL-2-sezernierenden "aktivierten naiven Th- Zellen" treffen.

(6) Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass die gezielte Generierung von ein bestimmtes Antigen der entsprechenden T-Zellen (CTLs) bei gleichzeitiger Unterdrückung der entsprechenden Ts-Zellen insbesondere dann gelingt, wenn der Makrophage bzw. die APC-Zellen zum Zeitpunkt der Präsentierung dieses Antigens (z.B. des Tumor- oder Virusantigens) einen erhöhten Spiegel an ROS/ROI, welcher die Präkursor-T-Zellen in Richtung des Th1 -, nicht Th2-Subtyps dirigiert, aufweist. Da bei der Phagozytose von korpuskularen/partikulären, präaggregierten, prädenaturierten und hydrophobierten Antigenen (z.B. Proteinen) automatisch der ROl/ROS-Spiegel als Folge des "respiratory burst" ansteigt, erzielt man erfindungsgemäß durch gleichzeitige Gabe von partikulären Antigenen (niedrig dosierte Erythrozyten fremder Blutgruppe, inaktivierte Bakterien bzw. deren Lysate, kompletter Freund-Adjuvans/CFA, Lyposen, denaturierte Fremdproteine) den erwünschten Effekt, d.h. einen temporären ROl-Anstieg in APCs während der Präsentierung des Tumor- oder Virusantigens.

(7) Als kritisch für die Generierung von Antigen-(z.B. Tumor- oder Virusantigen)- spezifischen CTLs bei gleichzeitiger Unterdrückung entsprechender Ts-Zellen ist die Anwesenheit von Typ1 -(IL-2)-Lymphokin produzierenden Helfer-(T4)-Zellen an der Oberfläche bzw. im Mikromilieu von dieses Antigen präsentierenden APCs zum Zeitpunkt der Antigenpräsentierung. Dieses Ziel kann erfindungsgemäß, ähnlich wie unter Punkt (6) erwähnt, durch Fremdproteine (z.B. Bakterienlysat) oder aber durch den Einsatz von Histoinkompatiblen (möglichst MHC-I- plus MHC-ll-inkompatiblen) Donor-T-Zellen (Lymphozyten, PBLs) mit vorprogrammiertem Zelltod (d.h. Mikroimmunchirurgievorbehandelten Donor-T-Zellen bzw. -Lymphozyten) erreicht werden. Im ersteren Fall erkennt die T4-Subpopulation des Donors die patienteneigenen MHC-I- und MHC-Il-Strukturen auf dem Patienten-Makrophagen (APCs) und reagiert in beiden Fällen mit der IL-2-Sekretion, wovon u.A. die tumor bzw. virusspezifischen CTLs bzw. deren Präkursoren (pCTLs) profitieren.

(8) Bei dem gentherapeutischen Approach wird erfindungsgemäß empfohlen, als Ziel-(Target)-Zellen für die Gentherapie die Makrophagen, die dendritischen Zellen u.A. APCs vorzusehen, weil sie gegenüber den bisherigen angewandten Tumorzellen und/oder TIL-Zellen den großen Vorteil der gleichzeitigen MHC-II- Expression (neben der MHC-I-Expression) auf ihrer Zelloberfläche mit sich bringen. Hierbei soll sich der patentrechtliche Schutz auf alle bisher eingesetzten Gene (z.B. für Cytokine, LAPs/Adhesine/Integrine etc.) wie sie von der Transfektion Traduktion von Tumorzellen, TIL-Zellen u.A. Targetzellen her bekannt sind, erstrecken. Eine Modifikation sieht Hybridzellen zwischen Patienten- und Donor-APCs (bzw. B-Zellen) vor; andere empfiehlt die MHC-Il-Expression (neben anderen konventionell eingesetzten Genen z.B. für Cytokine und deren Rezeptoren) auf Tumor- und TIL- Zellen vor, erzielbar durch cDNA oder Fusion.

(9) Die in der Patentanmeldung PCT/EP 94/01992 (EP 705 1 1 1 »beschriebene HTT- Technologie, basierend (a) auf der Fusion von Tumorzellen des Patienten mit autologen und/oder allogenen, MHC-ll-positiven Zellen (Makrophagen, Monozyten, dendritischen Zellen, B-Zellen), und (b) auf der Fusion spezialisierter Immunzellen (Th1 , Th2, Tc, Ts etc.) mit maligne transformierten Zellen/Zelllinien (zwecks Immortalisierung der spezialisierten Immunzellen), soll nun durch weitere neue Erkenntnisse und wichtige Verbesserungen ergänzt werden. Zudem soll diese neue Technologie, die sich inzwischen als sehr erfolgreich in der Klinik erwiesen hat, mit all ihren Varianten auf weiteren Indikationsbereichen patentrechtlich geschützt werden.

Wegen des gemeinsamen Wirkungsprinzips, d.h. der neuartigen in-vivo-Eliminierung der pathologisch dysregulierten Immunozyten-Subsets, kombiniert mit Reetablierung von krankheitsbekämpfenden Effektorzellen, soll der Indikationsbereich der HTT- Technologie samt deren Verfeinerungen wie z.B. der HTT-AIT-Technik neben der Behandlung von Tumoren (soliden Tumoren und allen Formen des Blutzellkrebses) nun auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien, Infekten (bakteriellen und(retro)viralen Infekten incl. HIV-Infektion), Arteriosklerose, Abstoßungsreaktion bei Organtransplantaten sowie von GvHD und HvGR (Abstoßung) bei Knochenmark-, Stammzell- und Progenitorzelltransplantation umfassen. Da beim alleinigen Einsatz von Hybridomen, bestehend z.B. aus Tumorzelle plus allogener APC (Makrophage, dendritische Zelle) die Nachrekrutierung neuer Tumorspezifischer Tc (Th1 ) nicht funktioniert, wird empfohlen, autologe APCs mit Tumorzellen, deren Lysaten oder, falls vorhanden, Tumorspezifischen Peptiden zu beladen und mit den Hybridomazellen in den Patienten i.v. oder s.c. zu injizieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination einer MIS/MIT- Behandlung mit der HTT-Technologie, wobei neben der Basistherapie auch alle Modifikationen und Verfeinerungen beider Strategien (MIS/MIT- und HTT-Strategie) als Bestandteile dieser kombinierten Therapie anzusehen sind. Beide Basistherapien wurden in EP 0 705 1 1 1 im Detail erläutert, worauf her verwiesen wird. Es ist hier noch darauf hinzuweisen, dass der später eingeführte Begriff MIS/MIT für "Zelltod- vorprogrammierte allogene Effektorzellen" und die ebenso nachträglich eingeführte Bezeichnung HTT-Technologie für "Hybridoma-CTrioma, Quadroma)-Zellen" steht.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind auch Kombinationen der beschriebenen MIS/MIT- und/oder HTT-Technologie mit anderen immuntherapeutischen Verfahren zur Behandlung von Krebs, bakteriellen und (retro)viralen Infekten, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arteriosklerose, sowie von GvH- und HvG-Komplikationen bei Organ- und Knochenmark- bzw. Stamm- zell/Progenitorzell-Transplantationen. Die Zielsetzung der anfangs erwähnten Hybridoma- bzw. Trioma-bildung aus Patienten-Tumorzellen und autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen ist die Präsentation von Tumorantigenen an der Oberfläche der gemeinsamen Tumor: APC-Hybridzelle, was zur Durchbrechung der präexistierenden Toleranz gegenüber Tumorzellen führt. Nachdem klinische Studien die hohe Effizienz des in EP 705 1 1 1 geschützten Prinzips klar bestätigten, soll dieses Prinzip in einer vervollständigten Form als die so genannte HTT-AIT- Technologie nun auch bei anderen Indikatoren wie Autoimmunerkrankungen, Allergie, Atherosklerose, ferner bei der Behandlung von bakteriellen und (retro)viralen Infekten, incl. HIV, sowie bei der Bekämpfung der GvHD und HvG- Komplikationen bei Organ- und Knochenmarktransplantationen geschützt werden, allerdings unter Berücksichtigung einiger Besonderheiten der einzelnen Krankheitsbilder. So soll z.B. bei Autoimmunerkrankungen durch die Fusion von autoantigenspezifischen, d.h. autoaggressiven T-Zellen mit autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen der besondere Effekt des so entstandenen Zellkonstrukts (Hybridoma- bzw. Triomazellen) therapeutisch genutzt werden, der darin besteht, dass sich nach der subkutanen bzw. intradermalen Inokulation bzw. i.v. Injektion der erwähnten Hybridoma- bzw. Triomazellen eine starke antiidiotypische Abwehrreaktion aufbaut, die in hochselektiver klonotypischer Weise die autoaggressiven T-Zell-Subpopulationen des Patienten in vivo depletiert bzw. inaktiviert.

Auch bei der Behandlung von Allergien kann die Fusion der autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen (APC) mit Allergenspezifischen T-Zellen (meist des Th2-Subtyps) und/oder mit Allergenspezifischen Plasma-(B)-Zellen zur hoch effizienten und hoch selektiven (klonotypischen) in-vivo-Eliminierung bzw. Inaktivierung der Allergieinduzierenden und -aufrechterhaltenden Immunzellen führen. Ähnlich kann bei der Atherosklerose durch die Fusion von autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen mit T- und/oder B-Zellen mit Spezifität z.B. für OxLDL ein Zellkonstrukt gebildet werden, welcher zur selektiven in-vivo- Depletion der bei der Atherogenese aktiv beteiligten Immunozyten-Subklone führen kann.

Auch bei der Organ- und Knochenmarktransplantation kann das neue Prinzip, die HTT-AIT-Technik, Anwendung finden, indem die subkutane Vakzinierung bzw. i.v. Injektion der Hybridoma- bzw. Triomazellen, gebildet durch die Fusion von MHC-ll- positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen) autologen und/oder allogenen Ursprungs mit alloaggressiven T-Zellsubpopulationen, in der selektiven Inaktivierung der HvGR- bzw. GvHR-induzierenden T-Zell-Subklone resultiert.

Bei allen jenen Krankheitsbildern, bei denen autoaggressive oder alloaggressive T- Zellen aktiv beteiligt sind (Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung und GvHD), wird erfindungsgemäß empfohlen, die in-vivo-Depletion dieser Krankheit bzw. Komplikation auslösender T-Zell-Subsets mit einem weiteren Schritt, nämlich der Stabilisierung des aggressionsfreien Zustandes, zu ergänzen. Hierzu eignen sich Antigenspezifische Ts-(und Th2)-Zellen, die man im Falle der Autoimmunkrankheiten durch Koinkubation der Patienten-PBLs mit Autoantigen und immunsuppressiven Zusätzen (CsA, Rapamycin, FK506, Glucocorticoiden, Agonisten von Gs- gekoppelten Rezeptoren wie Adenosin, Adrenalin, PGE2, etc.) generieren kann und die im Falle von Transplantationskomplikationen mittels des oneway-MLC-Ansatzes (in An bzw. Abwesenheit erwähnter immunsuppressiver Zusätze), mit angeschlossener Inaktivierung der alloreaktiven T-Zellsubpopulationen, sei es mit Bestrahlung (50 bis 100 gy) oder mit Mitomycin C (20 bis 50 //g/106 Zellen), in vitro vorgebildet werden. Bei der oben erwähnten in-vitro-Anreicherung der Antigen- spezifischen T-Zellklone, die man z.B. bei der Behandlung der Autoimmunerkrankungen, aber auch der Allergien mit der HTT-AIT-Technik als Fusionspartner benötigt, wird die Koinkubation der Patienten-PBLs mit dem Autoantigen bzw. Allergen sowie mit IL-2 empfohlen, wobei das niedrig zu dosierende IL-2 noch mit IFNgamma und/oder IL-1 2 kombiniert werden kann. Im speziellen Fall der Allergiebehandlung können Hybridoma- bzw. Triomzellen mit Fc- epsilon-R-positiven B-, T- und/oder Mastzellen bzw. Basophilen vorgesehen werden, wobei diese nach der FACS- oder MACS-Vortrennung (in T- und B-Zellen) mit IgE- beladenen Zellaffinitäts-Chromatographiesäulen angerei-chert werden können.

Eine weitere Variante der Allergiebehandlung mit der HTT-AIT-Technik sieht vor, dass die Fusion der MHC-ll-positiven Zellen mit IgE-beladenen, Fc-epsilon-R- positiven Zellen (B-Zellen, Mastzellen, Basophilen) erfolgt. Zu diesem Zwecke kann man Fc-epsilon-R-exprimierende Zellen (B-Zellen, Mastzellen, Basophile) in vitro mit IgR oder der Fc-Untereinheit beladen und anschließend mit autologen Zellen fusionieren. Auf diese Weise wird mittels der HTT-AIT-Technik gegen Allergie generell vakziniert. Wenn man Allergenselektiv therapieren will, so muss auf konventionelle Weise zuerst das Patientenspezifische Allergenspektrum festgestellt werden, um anschließend durch Inkubation der Patienten-PBLs in Anwesenheit von den betreffenden Allergenen und IL-2 die Allergenspezifische T- und/oder B-Zell- Anreicherung vorzunehmen. Die weiteren Schritte (Fusion und s.c. Vakzinierung bzw. i.v. Injektion) sind gleich wie oben.

Die vervollständigte HTT-AIT-Technik bringt auch bei der Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien/Lymphomen zusätzliche Verbesserungen. Im speziellen Fall all jener Blutkrebsformen, die durch die Anwesenheit von bcr-abl-Fusionsprotein charakterisiert sind (z.B. CML), kann die Immunisierung (s.c, i.d. oder i.v.) mit Hybridoma/Trioma-Zellen, bestehend aus bcr-abl-exprimierenden malignen Zellen plus autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen) eine hoch effiziente und selektive in-vivo-Depletion von (Rest)tumorzellen induzieren.

Durch die Fusion von Tumorspezifischen Ts-(und Th2)-Zellen des Patienten mit den MHC-ll-positiven autologen und/oder allogenen APCs (Makrophagen, dendritischen Zellen) kann die durch die MIS-Effektorzellen erzielte in-vivo-Eliminierung von Tumorprotektiven Ts-(und Th2)-Zellen auf zellulärer Ebene noch effizienter und selektiver gestaltet werden; zudem kombiniert der erstmalige Einsatz von zwei Typen fusionierter Zellen, nämlich der TumorAPC-Hybridome ("HTT-Technik") und der Ts:APC-Hybridome ("HTT-AIT-Technik") zwei wichtige Konzepte bei der Tumorbekämpfung, die in-vivo-Generierung neuer tumoriziden CTLs ("HTT-Technik) mit der konsequenten Eliminierung Tumor-protektiver Ts ("HTTAIT-Technik"). Die zusätzliche Heranziehung der MIS/MIT-Strategie lässt weitere Effizienzsteigerung erwarten. Eine wichtige Verbesserung der MIS/MIT-Effektoren, die in EP 705 1 1 1 als "Zelltodvorprogrammierte alloreaktive Donorzellen" bezeichnet wird, besteht erfindungsgemäß in deren Präalloimmunisierung. Hierzu werden Donor-T-Zellen bzw. Donor-PBLs in einer Art one-way-MLC (Donor: responder, Rezipient: Stimulator) 3 bis 5 Tage lang coinkubiert, danach z.B. mit Mitomycin C oder Einbau von 3-H- Thymidin (suicide Dosis) Zelltodvorprogrammiert und als MIS/MIT in vivo eingesetzt. Die Vorteile dieser Kombination aus der MIS/MIT-, HTT- und HTT-AIT-Behandlung seien noch einmal kurz dargestellt: (a) Mit MIS/MIT-Effektoren werden Tumor- protektive Ts-(und Th2)-Zellen Subset- aber nicht Tumorspezifisch eliminiert, (b) Die HTT-AIT-Technik ermöglicht eine gewissermaßen Tumorspezifische Depletion protektiver T-Zellen. (c) Mit MIT-Effektorzellen, die durch höher dosierte (20 bis 50 //g/1.106 Zellen) Mitomycin-C-Vorbehandlung an ihrer cytolytischen Aktivität gehindert, nicht aber an ihrer metabolischen Leistung beeinträchtigt sind, werden APCs (Makrophagen) von der Typ2-(Th2)- zur Typ1 -(Th1 )-Funktion umprogrammiert, wodurch auch naive. Tumorspezifische T-Zellen in Th1 -Richtung vorprogrammiert werden, (d) Die HTT-TEchnik ermöglicht die in-vivo-Bildung der Tumorspezifischen Tc-(Th1 )-Zellen auf zweierlei Weisen, (a) durch Nachrekrutierung neuer, naiver Tc und/oder (b) durch Umprogrammierung präexistenter Ts- in Tc- Zellen. Die neue kombinierte Technik, die sich durch minimale Nebenwirkungen auszeichnet, wird erfindungsgemäß auch bei der Behandlung von LAS/ARC/AIDS empfohlen. Mit der MIS und der HTT-AIT-Technik werden HIV-spezifische, aber auch opportunistische Infekte schützende Ts (Th2) eliminiert; mit der MIT- und der HTT-Technik werden APCs (Makrophagen) in Th1 -Richtung umprogrammiert sowie Th1 - und Tc- statt Th2- und Ts-Subsets induziert.

Eine weitere Effizienzsteigerung wird von der medikamentösen in-vivo-Beeinflussung der immunkompetenten Zellen des Patienten z.B. durch Präparate, die das cAMP/cGMP-Verhältnis in den Immunzellen und/oder den Calnflux in die Ts-(Th2)- Zellen aktiv modulieren, erwartet. Deshalb wird erfindungsgemäß die Kombination mit diesen Präparaten, die in allen Details in EP 705 1 1 1 empfohlen. Hierbei sind Kombinationen dieses phar-makologisch/medikamentösen Therapiekonzepts mit der MIS/MIT- und/oder HTT- bzw. HTT-AIT-Technologie erfindungsgemäß zu empfehlen, da eine additive bzw. synergistische therapeutische Wirkung zu erwarten ist. Dieses pharmakologisch/medikamentöse Therapiekonzept zeigte in der Klinik 80 bis 85%ige Tumorregression sowie ein vollständiges Verschwinden von Metastasen.

Ein wichtiger weiterer Punkt muss angesprochen werden. Da die Fusion mit autologen MHC-ll-positiven Zellen (APC wie Makrophagen und dendritische Zellen) eine inzwischen auch klinisch bestätigte außergewöhnlich effiziente Präsentierung der Oberflächenantigene der Fusionspartnerzelle (z.B. Tumorzelle) ermöglicht, die bei Co-Fusion (Triomabildung) mit allogenen APCs bzw. bei Kombination der Hybridomazellen, basierend auf autologen APCs, mit Hybridomazellen, beruhend auf allogenen APCs, einen weiteren positiven Effekt, nämlich die Th1 -Programmierung des neuen Zellkonstrukts einführt, wird erfindungsgemäß empfohlen, alle konventionellen Immunisierungen mit diesartigen Fusionskonstrukten zu verstärken. Hierbei denkt man in erster Linie an alle Formen von Vakzinen, d.h. jene, die gegen Infekte (bakterielle oder (retro)virale) gerichtet sind, aber auch an alle Ausführungen von Tumorvakzinen. Die Vakzine können dabei entweder subkutan/intradermal oder i.v. appliziert werden. Bei der HTT-AIT-Verfeinerung kann die vorzeitige Schwächung des Immunisierungsprozesses, eingeleitet durch gegenregulierende Pathogen- bzw. Tumor-spezifische Suppressorzellen (Ts, TH2), durch den Einsatz von Hybridomen/Triomen, bestehend aus autologen und/oder allogenen MHC-ll- positiven Zellen, plus Pathogen- bzw. Tumor-spezifischen Ts (Th2), verhindert oder mindestens aufgehalten werden.

(10) Gegenstand der Erfindung sind auch zwei Präparate, die bei der Knochenmarkbzw. Stammzell/Progenitorzell-Transplantation eingesetzt werden können. In einer ersten Ausführungsform werden, anders als bei konventionellen Transplantationen, zuerst nur reife, Zelltodvorprogrammierte Donor-T-Zellen (bzw. PBLs/PBMs) bzw. deren Kombination mit reifen Rezipienten-T-Zellen (bzw. PBLs), die im Falle der malignen Erkrankungendes Rezipienten ähnlich wie die Donor-Zellen vorzubehandeln sind, einzusetzen; erst nach 7 bis 14 Tagen sollen nach diesem Protokoll die unreifen Knochenmark- oder Stamm/Progenitorzellen postinfundiert werden. Hierdurch wird die partielle Immunkompetenz des Patienten auch in der kritischen Phase nach der Konditionierung erhalten, was die Infektanfälligkeit und die Gefahr der Reinduktion der Tumorspezifischen Toleranz wesentlich herabsetzt. Zudem kann die partielle Schädigung der unreifen Immunozyten, speziell der HLA-DR/DQ- positiven, durch reife alloreaktive T-Zellen verhindert werden.

Eine zweite Aufsführungsform betrifft die Einführung der allogenen, d.h. Donor-LAK- Zellen sowohl in die Tumortherapie als auch in die Knochenmark- bzw. Stammzell/Progenitorzell-Transplantation. Diese allogenen LAK-Zellen müssen jedoch zuvor mit Anti-panT(CD3)-Antikörpern und/oder Anti-CD8-Antikörpern von den ca. 10% nicht-MHC-rstringierten T-Zellen befreit werden. Alternativ hierzu können die allogenen LAK-Zellen Zelltodvorprogrammiert werden, ähnlich wie für MIS/MIT-Effektorzellen in EP 705 1 1 1 im Detail beschrieben.

(1 1 ) Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Regulation von Th1 -, Th2-, Tc/CTL- und Ts-Subsets der T-Lymphozyten. Nach den Erkenntnissen des Anmelders weisen Th1 - aber auch Tc-Subsets im Vergleich zu Th2- und Ts-Zellen ein erhöhtes intrazelluläres bzw. mitochondriales ROl/RNI-Verhältnis auf. Es werden daher auch pharmakologisch/-medikamentösen Eingriffe und Manipulationen in betracht gezogen, die direkt oder indirekt das Th1 /Th2- bzw. Tc/Ts- bzw. T4/T8- Verhältnis in vitro und/oder in vivo verändern können. Beispiele sind verschiedene Hemmer der RNI-erhöhenden NO-Synthetasen (iNOS, cNOS), die z.B. zur Erhöhung der Th1 -Cytokin- und Reduzierung der Th2-Cytokin-Produktion führen, ferner alle ROI und RNI-generierende bzw. sezernierende Sy-steme sowie alle ROI- und RNI- Scavengers, enzymatischer oder chemischer Natur.

Zudem fand der Erfinder heraus, dass die Tc/CTL- und die Ts-Zelle die gleiche, CD8 + -Zelle darstellen, die sich in zwei "eingefrorenen" funktioneilen Zuständen, dem Tc- bzw. Ts-Zustand, befindet. Ein erhöhter intrazellulärer NO-Spiegel in der Ts-Zelle verhindert die Cai-abhängige Translokalisation der vorgebildeten Perforin- und DC95L (Apo-IL/FasL)-Moleküle zur Zelloberfläche, wodurch die cytolytische Wirkung von Tc verhindert wird. Mehr noch, der innige Kontakt zwischen der Tc- bzw. Ts-Zelle und der MHC-l-positiven Zielzelle ermöglicht zugleich die Penetrierung des membrangängigen überschüssigen NO'-Radikals von der Ts- in die Zielzelle, wodurch das cytosolische H02-Radikal-Molekül chemisch "neutralisiert" wird, was mit einer immunsuppressiven Einwirkung auf die Zielzelle einhergeht. Es werden hier auch alle pharmakologisch/medikamentösen Eingriffe zur in-vitro- oder in-vivo- Umwandlung von Ts- in Tc-Zellen (z.B. bei Toleranzinduktion, oder bei Autoimmunerkrankungen) in betracht gezogen und beansprucht. Da auch die APCs (Makrophagen/Monozyten) durch Änderung des intrazellulären Quotienten von der so genannten "Suppressor-Monozyten"-Funktion in die tumorizide/viruzide/bakterizide Effektorfunktion umgeschaltet werden und zudem einen großen Einfluss auf die Th1 - vs. Th2-Vorprogrammierung der Antigen- spezifischen naiven (nonprimed) T-Zellen nehmen können, wird auch die pharmakologisch/medikamentöse APC-Beeinflussung via Änderung des ROI/RNI- Quotienten in betracht gezogen und beansprucht.

(1 2) Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind weitere technische Verbesserungen der HTT- und HTT-AIT-, wie im folgenden ausgeführt. Dazu gehört die Abwandlung beider, auf ZelhZellFusion basierender Technologien, bei der an die Stelle der ZelhZell-Fusion die Zellkern:Zell- und die Zellkern:Zellkern-Fusion tritt. Dies gilt für Zweier(Hybridomazellen)-, Dreier(Triomazellen)- und Vierer(Quadromazellen)- Kombinationen. Bei allen Fusionstechniken, den "konventionellen" Zel Zell- und den modifizierten Zellkern:Zell- bzw. Zellkern:Zellkern-Fusionstechniken kommt es zur Fusion der Zellkerne und der Chromosome sowie zu der Oberflächen-Coexpression der Gene beider Fusionspartner. Hierbei werden, wie bei viralem Zell-befall und bei der (malignen) Zelltransformation Genprodukte (Peptide/Polypeptide/Proteine) beider Fusionspartner im Kontext mit dem MHC-I-Komplex an der Zelloberfläche exprimiert. Die Gewinnung der benötigten Zellkerne erfolgt mit klassischen Enucleisierungsverfahren (z.B. mit LyseS, mit verschiedenen Tensiden und deren Kombinationen unter Zuhilfenahme von NH4CI oder Saponin etc.).

Eine interessante Anwendung kombinierter Zellkerne:Zell-Fusionsverfahren ist erfindungsgemäß das Einschleusen von Fremdzellgenen (z.B. der fehlenden Gene von profizienten bzw. Wildtyp-Fremdzellen in defiziente autologe Zellen), ohne die Gefahr der Abstoßung fremder Zellen aufgrund von MHC-I- und/oder MHC-II- Mismatch. Ein besonders aktueller Sonderfall ist die Fusion des Donorzellkerns mit Rezipiententhymuszelle, was nach Homing der autologen Thymuszelle im Rezipiententhymus zur gleichzeitigen Rezipient- und Donor-spezifischen thymalen Schulung der heranreifenden T-Zellen führt. Die resul-tierenden immunkompetenten T-Zellen sind, ähnlich wie bei (AxB)F1 -Hybriden, doppelt, d.h. Rezipient- und Donor- MHC-restringiert. In dieser Weise kann auf elegante Weise eine Donorspezifische Toleranz erzielt werden. Ein anderer interessanter Spezialfall ist die Fusion des Donorzellkerns mit der Rezipientenstammzelle, wobei der Donorzellkern einer Donorstammzelle oder somatischer (haematopoietischer) Zelle entnommen werden kann. Auch hier wird durch das gleiche Prinzip des "trojanischen Pferdes" die frühzeitige Abstoßung der fremden (Donor)Zelle verhindert. Bei allen HTT-AIT- Techniken samt deren Modifikationen kann die Fusion erfindungsgemäß entweder chemisch (z.B. PEG oder PEG/DMSO oder PVP oder PEG/PVP), durch Hochfrequenzstrom (Elektrofusion/Elektroporation) oder viral (z.B. SV40) erfolgen.

(13) Eine weitere wesentliche Verbesserung aller auf Fusion basierender Technologien kann erfindungsgemäß durch gezielte, hochselektive Vorannäherung der zu fusionierenden Partnerzellen durch bifunktionelle Antikörper, die an typische Oberflächenstrukturen der zu fusionierenden Zellen binden, erzielt werden. Statt der bifunktionellen Antikörper können auch andere, bi-, tri- oder tetravalente Antikörperkonstrukte eingesetzt werden, wodurch Hybridoma-, Trioma- oder Quadromazellen gewünschter Komposition entstehen können. Hierbei muss die Konzentration der chemischen Fusogene relativ niedrig gehalten werden (bei PEG z.B. bei 35 bis 40%) bzw. die Bedingungen bei der Elektrofusion so gewählt werden, dass die Fusion der vorangenäherten Partnerzellen selektiv, vor der Fusion anderer, nicht vorangenäherten Partnerzellen, erfolgen kann. Bei der Fusion von Patiententumorzellen mit den autologen und/oder allogenen MHC-ll-positiven Zellen (Makrophagen, dendritische Zellen) müssen bivalente Antikörper eingesetzt werden, die einerseits TSTA/TSA/TAA-spezifisch sind und andererseits Strukturen auf Makrophagen (z.B. CD1 6/CD32/CD64, d.h. Fc-gamma-RI/RII/RIII) bzw. auf dendritischen Zellen (z.B. CD83 oder T6) erkennen.

Bei den Hybridomen, bestehend aus dysregulierenden Immunozyten plus autologen oder allogenen APCs (MHC-ll-exprimierenden Zellen), können bispezifische Mabs bwz. Antikörperkonstrukte mit doppelter Spezifität eingesetzt werden, die einerseits typische Oberflächenstrukturen (z.B. Differenzierungsantigene) auf den pathologischen (dysregulierten) Immunzellen und andererseits die erwähnten Membranstrukturen auf den APCs erkennen.

Will man gegen dysregulierte Th2- oder Th1 -Zellen immunisieren, so muss in vitro - wie bei der Th1 - und Th2-FACS-Analyse - zuerst die Saponinperforierung der Th2- Zellmembran erfolgen und anschließend ein bifunktioneller MAB oder Antikörperkonstrukt eingesetzt werden, der die Th2- bzw. Th1 -Zellen an die autologen oder allogenen APCs annähert bzw. bindet. Mit niedrig dosiertem PEG wird dann die selektive Fusion durchgeführt, womit die Basis für eine hochselektive in-vivo-lmmunisierung gegen den Th2- bzw. Th1 -Subset gegeben ist. Im speziellen Fall von Allergien kann durch den Einsatz von bifunktionellen Mabs bzw. Antikörperkonstrukten mit Spezifität für IgE oder Fc-epsilon-R einerseits und für CD1 6. (auf Makrophagen) bzw. CD83 oder T6 (auf dendritischen Zellen) die selektive Bildung von Hybridom- bzw. Triomkonstrukten erzielt werden, welche eine hochselektive Immunisierung gegen IgE-tragende B- und T-Zellen bzw. Mastzellen/Basophilen ermöglicht. Die Effizienz der beschriebenen Allergiebehandlung kann erfindungsgemäß noch weiterhin gesteigert werden, wenn (a) mit Fc-epsilon-Untereinheiten von IgE und/oder (b) mit löslichen IgE-Rezeptoren (sFc-epsilon-R) und/oder (c) mit IgEs ohne Allergenspezifität und/oder (d) mit IgEs, deren Ag-bindende Domäne z.B. durch Einsatz eines oder mehrerer Aminosäurereste gestört ist, die Allergenspezifischen IgEs von der Oberflä-che von Mastzellen und Basophilen verdrängt werden. Mit All-ergen-spezifischen Antikörpern anderer, nicht IgE-Subklasse, z.B. der IgG, IgM und/oder IgA-Subklasse lassen sich erfindungsgemäß die zirkulierenden und (Mastzell)gebundenen so verschieben, dass die Dichte der (Mastzell)gebundenen IgE-Moleküle abnimmt, was gleichfalls zur Schwächung der Aller-giesymptome führt.

Im speziellen Falle der Allergie wird erfindungsgemäß empfohlen, mit den bispezifischen und/oder hybriden Antikörpern, die einerseits das IgE oder den Fc- epsilon-R-Rezeptor erkennen und andererseits MHC-ll-positive Zellen (APCs) binden, via Vorannäherung der Partnerzellen eine hohe Selektivität bei der Hybridoma/Triomabildung anzustreben. Detaillierte Laboruntersuchungen des Anmelders haben noch ein weiteres Phänomen, nämlich die starke Immunstimulierung durch niedrige, subfusogene Konzentrationen an chemischen Fusogenen (PEG, PVP und deren Kombinationen) aufgezeigt. Das Prinzip dürfte die intensivierte Interaktion beteiligter immunkompetenter Zellen in Anwesenheit von fusogenen Polymeren in subfusogenen Konzentrationen sein. Zudem wurde beobachtet, dass die gleichen fusogenen Polymere (PEG, PVP und Kombinationen) bessere kryobiologische Eigenschaften als das allgemein zur Einfrierung von Zellen empfohlene, aber toxische DMSO zeigen. Beide Eigenschaften, die Immunstimulation und die Zellprotektion beim Einfrieren der Zellen sind bei hochmolekularen Polymeren (PEG, PVP) ausgeprägter als bei niedrigmolekularen Vertretern. Der Einsatz erwähnter Polymere (PEG, PVP und Kombinationen) (a) zur Immunstimulation und (b) zur Kryoprotektion ist Gegenstand vorliegender Anmeldung. Weitere Verbesserungen der HTT- bzw. HTT-AIT-Technik betreffen den Einsatz von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern mit Spezifität einerseits für Cytokeratin, andererseits für Differenzierungsantigene und weitere Oberflächenstrukturen, typisch für MHC-ll-positive Zellen (APCs wie dendritische Zellen, Makrophagen/Monozyten und/oder B-Zellen). Da Cytokeratin auf allen soliden Tumoren, aber nicht auf Leukozyten (z.B. APCs) exprimiert wird, ermöglichen diesartige Antikörper eine innige Annäherung der gewünschten Fusionspartnerzellen und hiermit eine hochselektive

Hybridoma/Trioma/Quadromabildung bei suboptimalen Konzentrationen von Fusogenen (z.B. PEG, PVP, PEG/PVP-Kombinationen).

Da die Fusion von Zellen sowohl mit chemischen Mitteln als auch mit physikalischen Mitteln erfolgen kann und sowohl für die chemische als auch die physikalische Fusion verschiedene Verfahren dem Fachmann zur Verfügung stehen, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass immer dann, wenn eine chemische Fusion beschrieben wird, auch eine physikalische Fusion durchgeführt werden kann, z.B. mit Elektrofusion/Elektroporation.

Statt oder neben Cytokeratin-erkennenden Antikörpern können Tumorantigenspezifische Antikörper mit den APC-erkennenden Antikörpern in Form von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern zum Einsatz kommen. Ein wichtiger weiterer Punkt ist die erfindungsgemäße Vereinfachung der klassischen Mab-Gewinnung nach Köhler und Milstein, die das zeit und kostenaufwändige Klonieren in selektiven Medien wie HAT, HT usw. überflüssig macht. Das neue Prinzip besteht in einer gezielten innigen Vorannäherung beider Fusionspartner, der Antigenspezifischen BZellen mit immortalisierenden transformierten Standardzelllinien. Hierbei können z.B. mit FACS- oder MACS- Technik die BZellen des mit dem speziellen Antigen immunisierten Tieres vorselektioniert und mit einem bifunktionellen und/oder hybriden Antikörper, der B- Zell-Differenzierungsantigene und spezifische Strukturen auf der Oberfläche der erwähnten immortalisierenden Zelllinien erkennt, vorbehandelt werden. Die so vorangenäherten Partnerzellen können nun selektiv fusioniert werden. Eine höhere Selektivität wird durch den Ersatz der B-Zell-spezifischen Antikörper durch solche, die nur die aktivierten B-Zellen erkennen, erzielt werden. In diesem Falle und im Falle einer noch selektiveren, klonotypischen Hybridombildung, bei der die Antigenspezifischen B-Zellklone erkannt werden, müssen die Splenozyten des immunisierten Tieres zuerst in vitro in Anwesenheit des spezifischen Antigens präaktiviert werden. Bei dieser klonotypischen Fusion müssen die Mikrotitrationsplatten zuerst mit dem spezifischen Antigen direkt oder indirekt (via Poly-L-Lysin-Behandlung) vqrbeschichtet werden. Alternativ hierzu können alle anderen, bei der konventionellen Mab-Gewinnung praktizierten Selektionsverfahren eingesetzt werden.

Wenn nun die Antigenspezifischen B-Zellen grob oder fein vorangereichert sind, wird durch den Einsatz von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern, die einerseits B-Zell-typische Differenzierungsantigene bzw. aktivierte B-Zellen erkennende Antigene binden und andererseits mit APC-Oberflächenstrukturen interagieren, ist die Voraussetzung für eine selektive Fusionierung der Fusionspartner erfüllt.

(14) Ein weiterer Punkt ist die Immunzytenstimulierung durch Fusogene in subfusogenen Konzentrationen, wobei auch hier eine Selektivität durch Vorannäherung der interagierenden immunkompetenten Zellen erfindungsgemäß durch bifunktionelle und/oder hybride Antikörper erzielbar ist.

(1 5) Noch einige weitere Punkte sollen Erwähnung finden:

(a) Bei Knochenmarktransplantationen (BMT, SCT, PCT) kann durch das Heranziehen von Spendern (einem oder mehreren) die Resistenz gegenüber viralen und/oder bakteriellen Infektionen gezielt auf den Empfänger mitübertragen werden, was klinisch mehrfach gelang.

(b) Als eine neuartige Klasse von Immunmodulatoren (BRMs) wird erfindungsgemäß der Einsatz von (b1 ) Zelltodvorprogrammierten allogenen, MHC-ll-positiven Zellen und/oder (b2) von Zelltodvorprogrammierten Hybridoma/Triomazellen, bestehend aus autologen plus allogenen, MHC-ll-positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Zellen) empfohlen.

(c) Die Th1 /Tc- vs. Th2/Ts-Vorprogrammierung lässt sich durch Vor- oder Nachbehandlung der Hybridoma/Triomazellen, bestehend aus Tumorzellen, autologer APC und/oder allogener APC, im Sinne des Typ1 - vs. Typ-2-Profils (z.B. via Modulation des intrazellulären cAMP-Spiegels oder via Cytokinmodulierung) erzielen.

Eine Modifikation der Fusionstechnik (HTT) sieht vor, die Tumorzelle des Patienten mit autologer und - getrennt davon - mit allogener MHC ll-positiver Partnerzelle zu fusionieren und die entstandenen 2 Typen von Hybridomazellen erneut zu Quadromazellen zu fusionieren, wobei Elektrofusion oder Chemofusion (mit PEG) zum Einsatz kommen kann. Die MHC II +- Zellen (APCs wir DCs oder Makrophagen) sollten zuvor aktiviert sein, z.B. mit IFNgamma oder MDP (Muramyldipeptid). Diese Präaktivierung der Fusionspartnerzellen wird erfindungsgemäß generell empfohlen.

Da nach den neuesten Erkenntnissen eine temporäre Schädigung der mitochondrialen Membran die Freisetzung von H0₂ und H₂0₂ in das Cytosol und mittelbar in den intranukleären Raum ermöglicht, wird empfohlen, mit Fc- und z.T. Cu-Salzen in Kombination mit Ascorbinsäure und verschiedenen org. Säuren (via Fenton- und Haber/Weiss-Reaktion) diese transiente Schädigung der Mitochondrien - und mittelbar der nuklearen Membran zu provozieren. Dies führt nach neuesten Erkenntnissen zur Zellaktivierung, mehr noch, zur Typ1 (Th1 )- Zellvorprogrammierung. Ein weiterer Aspekt ist die direkte Reaktion von Fe³⁺ mit H0₂, was zur Verringerung des H0₂/H₂0₂-Quotienten und hiermit zur Typ1 (Th1 )- Differenzierung auf Kosten der Proliferation, also Umstellung der Zellfunktion von Proliferation zur Differenzierung führt.

Da so unterschiedliche Krankheitsbilder wie Tumor, chronische virale und bakterielle Infekte (inkl. AIDS), Allergien und gar Atherosklerose anscheinend mit einem erhöhten Th2/Th1 -Quotienten einhergehen, wird zur Korrektur dises Quotienten folgendes Verfahren empfohlen: Zuerst müssen reife, dysregulierte T-Zellen des Patienten auf humoraler plus zellulärer Ebene, d.h. mit Mabs (plus Mab- einsparenden Cytostatika) und MIS-Effektoren, radikal eliminiert werden, ohne hierbei die unreifen Vorläuferzellen zu schädigen. Mit MIT-Effektoren, die sich von den erwähnten MIS-Effektoren nur in der Konzentration des zur deren Vorprogrammierung eingesetzten Mitomycin C unterscheiden ( 20ug/ml/ 1 .106 Zellen, statt 10ug/ml/1 .106 Zellen), kann ein hier sehr erwünschter Effekt erzielt werden, nämlich die einseitige Th1 -Zellen), Vorprogrammierung der APCs unf mittelbar (via diese APCs) der nachrekrutierenden antigenspezifischen (z.B.TSA) T- Zellen. Diese einseitige Th1 /Tc-Rekrutierung gelingt, weil die successive zu injizierenden MIT-Effektoren durch die Zelltodvorprogrammierung absterben, bevor sie den Übergang von pTh zu Tho erreichen; somit sezernieren sie nur IL-2 (und evtl. etwas IL-12 und IFNgamma), aber noch keine Th2-Cytokine (IL-4, IL-13, IL- 10). Wenn dagegen die Typ2 (Th2)-Programmierung der nachrekrutierenden T- Zellen angestrebt wird, müssen die APCs direkt oder indirekt (via reife Th2/Ts- Zellen) im Th2-Sinn vorprogrammiert werden.

Tumorvakzinen, die auf einer DC-Transfektion mit tumorspezifischen Antigenen (z.B. MART-1 , MAGE-1 , gp1 5, gp95, gp100) basieren, wobei als Gen-Fähre Viren wie Vakzinia-Virus dienen, können erfindungsgemäß verbessert werden, wenn statt autologen DCs allogene DCs oder beide DC-Typen eingesetzt werden. Hierbei können neben DCs auch andere MHC II + -Zellen eingesetzt werden. Nach der Transfektion autologer und allogener DCs (und anderer MHC II + -Zellen) können diese durch Elektrofusion oder Chemofusion zu Hybridzellen vereint (fusioniert) werden. Zudem können die transfizierten DCs (APCs), mit und ohne Post-Fusion, mit Hybridom- oder Triomzellen, entstandenen durch die Fusion von Patienten-Tumorzellen mit autologen und/oder allogenen APCs (DCs, Makrophagen), sowie mit MIS bzw. MIT Effektoren kombiniert werden. Die Tumorvakzine wird weiterhin verbessert, wenn mit TSA-kodierender cDNA co-vakziniert wird. Eine weitere Verbesserung der Tumorvakzine betrifft die Coinkubation der TSA- kodierenden cDNA mit MHC II -«--Zellen (APCs wie DCs und Makrophagen). Dies führt zur Typ1 (ThD-Tumorabwehr, die durch zelluläre statt humorale Reaktion charakterisiert wird.

Die Umwandlung des Th2/Tc- in den Th2/Ts-Subset /z.B. zwecks Toleranzinduktion oder - Stabilisierung) kann erfindungsgemäß durch Inkubation der Zellen mit Mn- oder Cu/Zn-SOD, ferner mit Catalase und/oder (GSH)-Peroxidase erzielt werden. Der Effekt kann durch Hemmer der NO-Synthase (iNOS, cNOS) verstärkt werden. Günstig wirkt sich eine vorausgehende Zellaktivierung aus.

Eine neuartige Möglichkeit der Spenderspezifischen Immuntoleranz ergibt sich aus der Kombination (a) aus vorbestrahlten Spender-Thymuszellen mit (b) unreifen Knochenmark- oder Stammzellen bzw. T-depletierten PBLs, wobei die letzteren bevorzugt erst mit 2-5 tägiger Verspätung in den Empfänger injiziert werden.

Mit Flavonoiden/Polyphenolen, die selektiv das Enzym COX-2 und somit die Prostaglandin-Synthese hemmen, kann ein Drift von Th2 zu Th1 bzw. Ts zu Tc angestrebt werden. Beispiele: Galagin, Morin, Catechin, Epicatechin. Mit anderen Flavonoiden, die sowohl die Synthese von Prostaglandinen als auch jene von Leukotrienen hemmen, lässt sich eher ein antiinflammatorischer Effekt erzielen. Beispiele: Quercetin, Fisetin, Luteolin, Kampferöl, Taxifolin, Eryodictiol, 3 '4 '- Dihydroxyflavon.

Aus Tierversuchen mit Knochenmarkchimären ist bekannt, dass die besten Ergebnisse bei gleichzeitiger Anwesenheit von Spender- und Empfänger-T-Zellen plus APCs im Empfängertier erzielbar sind. Dies lässt sich klinisch wie folgt realisieren: (a) Zuerst muß mit einer 1 : 1 -Mixtur and Mitomycin C- vorbehandelten (MIS-Effektoren) bzw.unbehandelten Spender-plus Empfänger T-Zellen (oder PBLs) im myeloablativ-vorbehandeltem Empfänger (Patienten) die gegenseitige Toleranz induziert werden, (b) Danach erfolgt die Infusion der 1 : 1 -Mixtur von unreifen Knochenmark- oder Stammzellen bzw. T-depletierten PBLs von Donor und Rezipient . (c) Nun können reife T-Zellen und APCs von Donor und Rezipient post- transfundiert werden. Anmerkung: Dieses Verfahren kann vereinfacht werden, indem als letzter Schritt lediglich reife T-Zellen des Spenders transfundiert werden.

Wie aus dem Tiermodell ebenso bekannt, erweist sich die Infusion von F1 - Hybridzellen in den P1 - oder P2-Rezipienten als sehr günstig. Deshalb wird erfindungsgemäß empfohlen, die bisher bei der Knochenmark-Transplantation (KMT) praktizierte Transfusion von Spenderezellen durch die Transfusion eines 1 :1 - Gemisches aus Spender- plus Empfänger-Knochenmark- oder Stammzellen zu ersetzen. Diese routinemäßig einzuführende Technik würde die oft jahrelange Immunkompromitierung des KMT-Rezipienten, bedingt durch die beeinträchtigte T- Zell APC-Kooperation, verhindern. Eine spezielle Ausführungsform dieses Verfahrens sieht den Einsatz von Hybridzellen aus Spender- und Empfänger- Knochenmark oder Stammzellen, PBLs oder deren T-Zellen- und APC-Fraktion vor; diese Technik kann die Toleranz gegenüber Spender weiterhin erhöhen und der Injektion der 1 : 1 -Mixtur von unreifen Donor- plus Rezipientzellen vorausgehen.

Eine wichtige Erkenntnis aus unseren Labor- und Tierversuchen ist, dass vorprogrammierte/vorimmunisierte reife T-Zellen dann den größten Effekt zeigen, wenn sie in vivo mit unreifen Präkursorzellen (z.B. T-depletierten PBLs) in Kontakt kommen. Erfindungsgemäß wird daher empfohlen, relativ geringe Zahlen an maßgeschneiderten reifen T-Zellen in einen frisch in vivo T-depletierten Empfänger zu injizieren. Hierbei können die maßgeschneiderten Zellen mit zelltod- vorprogrammierender Behandlung (z.B. Mitomycin C, s.MIS- und MIT-Effektorzellen) versehen oder intakt zum Einsatz kommen. Beispiele solcher maßgeschneiderten Zellen sind (antigen-spezifische) Th1 -, Th2-, Ts- und Tc (Tc1 /Tc2/Tc3)-Zellen.

Ein neues Verfahren zur in vivo Umprogrammierung von Suppressor-Monozyten in tumorizide (viruzide/bakterizide) Effektor-Makrophagen besteht in successiver Injektion von MIT-Effektorzellen, stammend von Spender A,B,C,D etc., wobei die Zelltod-Vorprogrammierung die Umstellung der Cytokin-Produktion von Typ1 (IL-2, IFNgamma, IL-1 2) zum Typ2 (IL-4, IL-13, IL-10) verhindert (Zelltod vor Erreichung der Tho-Reifungsstufe).

Unsere Labor- und Tierversuche zeigten, dass beim Mischen von reifen Spenderund Empfänger-T-Zellen (PBLs, Milzzellen), besser jedoch der hieraus abgeleiteten MIS-Effektor-Zellen, eine gegenseitige Toleranz eintritt, die auch den Ausbruch der GvHD bei KMT mit nicht-T-Zell-depletiertem Spendermark im voraus verhindern kann. Deshalb wird erfindungsgemäß empfohlen (a) vor der eigentlichen KMT oder HSCT den Empfänger mit einer 1 :1 -Mixtur aus reifen Spender- und Empfänger-T- Zellen (PBLs) bzw. vorteilhafterweise aus entsprechenden MIS-Effektorzellen zu behandeln, und (b) statt der Spender-KM oder -Stammzellen deren 1 :1 -Gemisch mit entsprechenden Empfängerzellen vorzusehen.

Diese GvHD-freie Technik wird erfindungsgemäß zur Therapie all jener genetischen Erkrankungen empfohlen, die zwar als KMT-„korrigierbar" bzw. „behandelbar" bezeichnet werden, die jedoch in Praxis nur selten durch KMT behandelt worden sind, da die klassische KMT mit beträchtlichen Behandlungsrisiken verbunden ist. Diese Situation könnte sich nun durch die oben beschriebene verbesserte Technik gravierend „ändern". Auch der angestrebte Ersatz der klassischen, mit der myeloablativen Patientenkonditionierung verbundenen KMT durch die simple Supplementierung pathologischer T-Zell-Subklone mit jenen des gesunden Spenders, welche unter nichtablativen Bedingungen erfolgt, geht in die gleiche Richtung. Da diese neuen Techniken, die beide Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind, kein Risiko eines lethalen Ausgangs beinhalten, könnten sie als die bessere Alternative die mit vielen zusätzlichen Problemen behaftete Gentherapie bei diesen genetischen Krankheiten ersetzen.

Eine wichtige Weiterentwicklung der Zellfusions- bzw. Zeilhybridtechnik (HTT) ist die „anti-idiotyp-Vakzine", bei der nicht, wie bei der klassischen HTT-Technik gegen Tumorzellen per se, sondern gegen die dysregulierten T (und/oder B)-Zellen geimpft wird, so z.B. gegen die tumor-protektiven Ts- und/oder Th2-Zellen, die den malignen Zellen von deren Entstehung an Schutz vor dem Zugriff des Immunapparates bieten. Im speziellen Fakk der Tumorbehandlung wird die Kombination dieser „antiidiotypischen Vakzine" mit der „Antitumorvakzine", bestehend aus Tumorzelle plus autologer und/oder allogener APC (DC, Makrophage), empfohlen.

Diese „anti-idiotyp-Vakzine" eignet sich neben Tumortherapie zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen (HTT-AID), Allergien (HTT-ALL),Atherosklerose (HTT- ATH), viralen und bakteriellen Infekten (HTT-INF), inkl AIDS, sowie zur Prevention oder Bekämpfung der GvHD. Die dysregulierten, d.h. pathologisch (hyper)aktivierten, können durch Zeilaffinitätschromatographie, FACS oder MACS, basierend auf (Hyper)aktivierungsmarkererkennenden Mabs angereichert werden, bevor sie mit autologen und/oder allogenen MHC II + - Zellen (DCs, Makrophagen) fusioniert werden. Diese „atiidiotypische Vakzine" basiert also auf „T-subset"- spezifischer Fusion.

Eine weitere Neuentwicklung, die sogenannte „klonotypische" Antiidiotyp-Vakzine (HTT/AIT-CLO) geht noch weiter in der Selektivität und hierdurch Nebenwirkungsfreiheit der Vakzinierung. Hier werden erfindungsgemäß die antigenspezifischen T- und/oder B-Zell-Klone mit autologen und/oder allogenen MHC 11 + -Zellen fusioniert. Möglich wurde diese „klonotypische" Vakzine durch die Einführung neuer Techniken, bei denen mittels spezieller bifunktioneller Mabs die Ag-aktivierten (und nur diese) T-(und B-)Zell-Klone markiert und FACS- oder MACS- separiert werden. Diese bifunktionellen Mabs zeigen Spezifität für CD45 (pan-Leu) und für Cytokine, z.B. IL-2 oder IL-4. Diese Anreicherungstechnik eignet sich auch für die oben besprochene „T-subset"-spezifische Vakzine. Die Anwendungsgebiete der „klonotypischen" Vakzine entsprechen jenen der „T-subset"-spezifischen Vakzine(s.o.). Die Voraussetzung ist allerdings, dass die spezifischen Antigene (Autoantigene, Allergene) bekannt, bzw. kommerziell erhältlich sind.

Zwei Zellkonstrukte sind erfindungsgemäß besonders geeignet, bereits in sehr niedrigen Konzentrationen eine Art katalytische Wirkung auf die Immunabwehr gegen Tumorzellen auszuüben. Der erste Zellkonstrukt betrifft Triomas bzw. Quadromas, entstanden durch Fusion von Tumorzelle, tumorspezifischer Ts- oder Th2- Zelle sowie autologer und/oder allogener MHC II +- Zelle (DC, Makrophage). Der zweite Zellkonstrukt ist etwas einfacher zusammengestellt; er besteht aus Tumorzelle, autologer und/oder allogener APC (DC, Makrophage).

Eine Abwandlung der HTT-Technik, die bei Vakzinen gegen (retro)virale und bakterielle Infekte eingesetzt werden kann, sieht die Fusion aus Pathogen (z.B. Bakterien) und autologen bzw. allogenen APCs vor.

Die Knochenmark- und Stammzelltransplantation kann durch 2 neue Strategien verbessert werden. Bei der I .Strategie wird durch KM- bzw. Stammzellen des ersten, MHC-inkompatiblen Spenders zuerst eine kontrollierte GvHD induziert, die dann im nächsten Schritt durch in vitro präalloimmunisierte Empfänger- PBLs bzw. T-Zellen zum Stillstand gebracht wird. Bei der 2. Strategie erhält der Empfänger zuerst Zellen eines histoinkompatiblen Spenders und danach (1 -3 Wochen später) Zellen eines histokompatiblen 2. Spenders. Durch die Heranziehung beider neuer Strategien kann die T-Zell Depletierung aus dem Spendermark entfallen. Bei einer 3. Variante erhält der Empfänger zuerst histokompatibles Knochenmark und danach ein eher inkompatibles Transplantat eines 2. Spenders; hier ist das Strategieprinzip die Induktion der Ts (Th2)-Zellen unter sub- GvHD-Bedingungen, die dann die Toleranz gegen den 2., histoinkompatibleren Spender ermöglichen. All diese 3 Strategien können unter myeoloablativen (KMT, SCT, PCT) und non-ablativen (MIS/MIT, DLI/DLT) präparativen Bedingungen eingesetzt werden.

In der Fachliteratur ist oft die Rede von „gemischtem allogenem Chimärismus" als höchstem Ziel bei allogenen Knochenmark- und Stammzeil-Transplantationen (KMT bzw. HSCT). Nach unseren Erkenntnissen ist ein solch gemsichter Chimärismus in der 1 . Phase der KMT bzw. HSCT eher kontraproduktiv, weil er vorzeitig den angestrebten GVM (GVL/GVT) - Effekt zum Erliegen bringt, bevor dieser seinen Antitumoreffekt entfalten kann. Deshalb wird erfindungsgemäß empfohlen in 2 Schritten vorzugehen: a) zuerst soll durch einen zeitlich begrenzten voll-allogenen (Spender-Typ) Chimärismus der Angriff auf residuelle Tumorzellen gestartet werden, um später, nach erfolgter Eliminierung der Resttumorzellen, durch einen echten „gemsichetn allogenen Chimärismus" ersetzt zu werden; der letztere dient hierbei zur Stabilisierung des Toleranzzustandes zwischen Donor und Rezipient. Da für beide Formen des Chimärismus erfindungsgemäß MIS- Effektorzellen stat unmanipulierten reifen T-Zellen (PBLs; DL- Effektoren; Milzzellen im Tiermodell) empfohlen werden, sind in diesem System GVH- oder HVG- Komplikationen zu erwarten.

Durch Präalloimmunisierung der Donor- und Rezipienten- T- Zellen (bzw. PBLs) sowie druch Variierung der MHC-Inkompatibilität und des Mischungsverhältnisses dieser Zellen (z.B. von 0,1 :1 bis 10:1 ) kann man in vivo interessante Effekte erzielen, allerdings müssen die Rezipienten (Patienten) zuvor in myeloablativer oder nicht- ablativer Weise präkonditioniert werden; bei der letzten reichen die in vivo Depletion reifen T-Zellen durch Mabs bzw. Mab- Kombinationen aus. So kann die oben erwähnte Zwischenphase des Donor- Typ- Chimärismus zwecks Eradizierung der Resttumorzellen, gefolgt von der stabilisierenden Phase des echten „gemischten allogenen Chimärismus", elegant durch diese neue Feindosierungstechnik verwirklicht werden.

Weitere Wege zur Toleranzinduktion sind erfindungsgemäß das Injizieren von T- depletierten Donor- PBLs in T- depletierte Rezipienten, wobei diese T-Depletierung durch spezifische Mabs erfolgt; u.U. kann eine radikalere T- Depletierung durch zusätzliche Behandlung mit MIS-Effektoren (in vitro und/oder in vivo) notwendig sein. Diese Toleranzinduktion kann durch Zusatz von allospezifischen Ts und/oder Th2 weiterhin stabilisiert werden.

Ein weiterer Approach ist der gleichzeitige Transfer von reifen allospezifischen Ts- oder eher Th2- Zellen plus unreifen Präkursorzellen, wobei die Toleranzinduktiuon zwecks Tolerierung von Donor- Organtransplantaten in vitro die Injektion prägenerierter, Donor- spezifischer Th21 (Ts)- Zellen des Rezipienten in den T- depletierten Rezipienten voraussetzt, während bei KMT und HSCT allospezifische Donor- und Rezipienten- Th2 (Ts)- Zellen zusammen mit der 1 :1 Mixtur aus unreifen Donor- plus Rezipient- Präkursoren in den myeloablativ oder nicht- ablativ vorbehandelten Empfänger transfundiert werden müssen. Die Basisregel hierbei ist, dass in vitro (z.B. im MLC- Ansatz) prägenerierte, reife Th2 (Ts)- Zellen zu unreifen T-Zell-Vorläuferzellen im Empfänger transfundiert werden müssen.

Bei den gentherapeutischen Ansätzen zur Tumorbehandlung werden Tumorzellen mit costimulatorsichen Strukturen (B 7.1 / B 7.2; CD 40) transfiziert.Dies reicht nach unseren Vorstellungen nur zur Poststimulierung bestehender, TSA- spezif. CTLs und im besten Fall zur teilweisen Umprogrammierung bestehender Ts- in Tc- Zellen, nicht aber für eine novo- Nachrekrutierung tumorizider CTLs; auch dann nicht, wenn zusätzlich Cytokine wie IL-2 oder IFN gamma post-transduziert werden. Erfindungsgemäß könnte die erwähnte Gentherapie (a) durch Cotransfektion mit MHC2-Antigen und/oder (b) durch simple Fusion der Tumorzelle mit MHC II +- Zellen (DCs, Makrophagen) wesentlich verbessert werden. Eine Modifikation dieser Technik sieht vor, entweder die transfizierten Tumorzellen mit APCs (DCs, Makrophagen) des autologen und/oder allogenen Ursprungs zu fusionieren, oder aber die bei der HTT-Technik gebildeten Hybridoma, Trioma oder Quadromazellen nachträglich mit costimulatorischen und/oder cytokine- kodierenden Genen zu transfizieren. Eine weitere Verbesserung der KMT und HSCT sieht vor, die MHC2 + -Zellen des Donors und Rezipienten mit Th2-Cytokinen (IL-4, IL-13, IL-10) zu transfizieren bzw. sie mit Th2- Subset, welcher diese Cytokine sezerniert, zu fusionieren. Bei Organtransplantationen reicht die entsprechenden Transfektion von Donor- APCs. Zur Verstärkung der gegenseitigen Toleranz („gemischter allogener Chimärismus") kann mit Immunsuppression (Glucocorticoiden, CSA etc.) kombiniert werden.

Ein zusätzlicher Weg, die dysregulierten (pathologischen) T-Zell-Subklone unter Kontrolle zu bekommen, ist deren ex vivo klonale Postexpandierung (z.B. die in vitro Stimulierung der TSA- spezif. Ts bzw. Th2-Zellen mit Con A oder die in vitro Postexpandierung von autoantigen-spezif. CTLs bei Autoimmunerkrankungen und von aggressiven CTLs bei GVHD), mit oder ohne Fusion mit autologen oder allogenen APCs, gefolgt von deren Reinjizierung in den Patienten.

Eine zusätzliche Sicherheit bei der Eliminierung etwaigen MIS-Effektorzellen, die eventuell dem vorprogrammierten Zelltod entkommen würden, was bei der MIS- Vorbehandlung mit extrem niedrigen Mitomycin C- Dosen ( -5ug/ml/1 .106 Zellen )nicht auszuschließen ist, ist deren nachträgliche in vivo Depletion durch allospezif., d.h. Spender-MHC-spezif. Mabs bzw. mit Anti-DNP- oder Anti- TNP- Mabs; in letzterem Fall müssten die eingesetzten MIS-Effektorzellen zuvor mit DNP-bzw. TNP- Reagenzien vorbehandelt werden. Beispiel ist die Behandlung etablierter GvHD durch 3rd -party-MIS-Effektorzellen.

Eine wesentliche Verbesserung der MIS/MIT- und der HTT- Technik ist die anschließende Stimulation mit (a) BRMs (b) Interleukinen/ Interferonen (c)Antagonisten der Gs- gekoppelten Rezeptoren (d)immunstimulierenden ROI ( H202, H02)- + NO) Inhibitoren u.a. Immunstimulanzien.

Von speziellem Interesse sind bei dieser Post- MIT/ MIS und Post- HTT- Stimulation auch alle cAMPi- herabsetzenden (z.B. Propranolol) und Th2/Ts hemmenden Substanzen (z.B. Ca- Antagonisten).

Die bei der MIS/ MIT- Technik eingesetzten Anti- CD3- und Anti- CD8- Mabs können auf all jene Mabs, Mab- Kombinationen und daraus abgeleitete Immuntoxine ausgeweitet werden, die in im Detail beschrieben worden sind.

Eine besondere Variante der antiidiotypischen in vivo Eliminierung von pathologisch- dysregulierten T- Zellen sieht vor, den Donor zuerst mit PBLs, T-Zellen, evtl. -i- B- Zellen der Patienten mit autoimmunen und allergischen Erkrankungen gegen klonal präexpandierten Idiotyp des Patienten zu sensibilisieren und nach der vorausgegangenen Toleranzinduktion gegenüber diesem Spender die Antiidiotyp- enthaltenden T (und B) Zellen (PBLs) des so vorsensibilisierten Spenders in den Patienten zu infundieren Diese Technik kann mit der in EP 374 207 bzw. EP 705 1 1 1 behandelten „klonotypischen" HTT-Technik kombiniert werden. Mehr noch, unter Einsatz von inaktivierten (5000 - 10 OOOcgy) oder mit MHC II + -Zellen (DCS, Makrophagen) fusionierten Idiotyp- exprimierenden T- und B-Zellen lassen sich allogene Antiidiotypen in standardisierter Form generieren. So könnten z.B. allogen generierte Antiidiotypen gegen ß(B)-Zellen des Pankreas, allein oder kombiniert mit „klonotypischen" Hybridomen gleicher Spezifität bei Patienten mit Typ 1 Diabetes mellitus eingesetzt werden.

Die schlechten Ergebnisse der DLI (Donor-Lymphozyten-Infusion) bei ALL-Patienten, z.U. CLL-Patienten, lassen sich durch schlechte bis fehlende in vivo Alloreaktivierung der Donor-Lymphozyten in der ersten Gruppe erklären. Deshalb wird erfindungsgemäß empfohlen, die DLI und die MIS- Effektorzellen vor Einsatz gegen den Empfänger (Patienten) in vitro zu allopräimmunisieren. Es sei jedoch erwähnt, dass in diesem Fall die DLs dringend durch MIS-Effektors ersetzt werden müssen, da die Allopräimmunisierung die GvHD Induktion durch DLs noch deutlich steigert.

Eine wichtige Verbesserung der Technik, bei der die CTL-Klone mit höchster tumorizider Wirkung in vitro vorselektionieret und klonal postexpandiert werden, betrifft die Einführung einer vorgeschalteten Patientenvakzinierung (i.d.) durch Hybridoma- oder Triomazellen, bestehend aus Tumorzellen plus autologen und/ oder allogenen MHC Il + -Zellen (z.B. DCs). Auf diese Weise wird die Qualität und Effizienz der zu selektierenden tumoriziden CTLs des Patienten wesentlich erhöht. Eine weitere Effizienzsteigerung der in vitro postexpandierten tumor- lytischen CTLs kann erreicht werden, wenn der Patient vor der Präparation seines tumorspezifischen CTLs mit zusätzlichen modernen Verfahren, wie MIS/MIT vorbehandelt wird. Man könnte dies auch anders formulieren, indem man die Kombination aus MIS/MIT ( + Post-MIS/MIT-Stimulierung mit BRMs), HTT und Postexpandierung der, durch MIS und HTT qualitativ verbesserten CTLs empfiehlt.

Bei allen immunsuppressiven Lagen, incl. Allergischen Erkrankungen, die durch ein erhöhtes Th2/Th1 -Verhältnis charakterisiert sind, wird empfohlen, das intrazelluläre cAMPi (z.B. mit Antagonisten Gs-gekoppelter Rezeptoren) herabzusetzen und gleichzeitig die NO- Synthese (durch Hemmer der iNOS und der cNOS) zu hemmen, da das NO die PG- Synthese stimuliert und die 5- Lipoxygenase hemmt.

Nachdem die Ergebnisse bei der Hochdosis- Chemotherapie, bei der die mitabgetöteten Patienten- Immunozyten durch eigene oder fremde (allogene) Stammzellen ersetzt werden, enttäuschend sind, wird erfindungsgemäß empfohlen, die kritische immuninkompetente Phase durch Zusatz von MIS- Effektorzellen zu Stammzeil- und Knochenmarkzellen zu überbrücken. Auch die z. Z. sehr aktuelle DLI/ DLT- Technik lässt sich wesentlich verbessern bzw. von ihrer Hauptkomplikation, der z. T. lethalen GvHD befreien, wenn (a) statt unbehandelten Donor- Lymphozyten (DLs) die zelltod- vorprogrammierten MIS- Effektorzellen eingesetzt werden, und (b) wenn man beim DLI/ DLT- Verfahren in mehreren Stufen vorginge, indem man zuerst mit einer 1 :1 - Mixtur aus Donor- und Rezipient- MIS- Effektorzellen eine Art temporären „gemischten allogenen Chimärismus" etabliert, der dann den Einsatz nicht- vorhandener DLs ermöglicht.

Ein ähnlicher Mechanismus liegt der feinabgestuften, wiederholten Transfusion von Spender- Lymphozyten zugrunde, die (a) entweder durch abnehmende Mitomycin C- Konzentration (von 20 über 1 5 über 10 bis 5 oder gar 2ug/ml/1 .106 Zellen) vorbehandelt, oder aber (b) von Spendern mit zunehmendem MHC- Mismatch präpariert worden sind. Der letzte Schritt kann immer der Einsatz unbehandelter DLs sein, was den Vorteil bringt, dass die GvM (GvL/ GvT)- Reaktion stufenweise steigt.

Eine interessante Möglichkeit, die GVHD in den Griff zu bekommen, ist der Einsatz (a) von Mabs, gerichtet gegen aktivierte T- Zellen, plus (b) autologen und/ oder allogenen Nk- und LAK- Zellen, wobei bei allogenen Zellen anti- CD3- Mab die etwa 10% an nicht- MHC- restringierten T- Zellen im LAK- Verband präeliminieren kann.

Eine interessante Entwicklung sieht vor, zuerst unter milderen, nicht- ablativen Bedingungen, unter Einsatz von Cyclophosphamid und Mab oder, bevorzugt, nur Mab, mit MIS- Effektorzellen die restlichen Tumor- und (Prämikro)metastasen- Zellen in vivo zu eliminieren. Ob dies direkt oder indirekt, d.h. durch Deblockierung der Patienten- Immunabwehr geschieht, ist irrelevant. Nachdem diesen MIS- Effektorzellen 2- 10 Tage Zeit gegeben wird, um dieser Aufgabe nachzugehen, werden sie nach dem vorprogrammierten Zelltod- von unreifen Donor- Knochenmark- oder Stammzellen ersetzt. Alternativ hierzu kann ein 1 : 1 - Gemisch aus gleichartigen Zellen des Spenders und Empfängers eingesetzt werden. Die erwähnten MIS- Effektorzellen können in einem drei- tägigen MLC durch inaktivierte Empfänger- PBLs (optimal 1 /10 - 1 /2 der Spender-PBLs ) allopräimmunisiert und durch Erhöhung der Donor:Rezipient-Histoinkompatibilität sowie durch verringerte Konzentration des zur MIS- Behandlung eingesetzten Mitomycin C in ihrer Effizienz gesteigert werden. Ein zusätzlicher Effekt ist die Bildung von allotoleranten, reifen Th2- bzw. Ts-Zellen , die später bei der Transfusion von unreifen Donor- bzw. Donor- plus- Rezipient- Präkursorzellen diese zur gegenseitigen Toleranz induzieren.

Ähnlicher Grundgedanke liegt in der erfindungsgemäßen Empfehlung, zuerst mit MIS- Effektorzellen Tumorzellen- und die sie schützenden Ts (Th2)- Zellen auf radikale Weise zu eliminieren, um anschließend mit den MIT-Effektoren die Umprogrammierung der APCs von den Suppressor- Monozyten- in die tumorizide Effektorfunktion zu bewerkstelligen. Der wesentliche Unterschied zwischen MIS- und MIT- Effektorzellen liget in der Konzentration des verwendeten Mitomycin C: während die cytolytischen MIS- Effektoren mit Mitomycin C- Konzentration 10ug/ml/1 .106 Zellen behandelt werden, setzt man bei den nicht- cytolytischen MIT- Effektoren Mitomycin C- Konzentration - 1 5 oder eher - 20ug/ml/1 .106 Zellen ein.

Eine weitere Möglichkeit der Toleranzinduktion beruht (a) auf einer 48h- Inkubation der PBLs in Anwesenheit von Con A, von Gs-Agonisten und/oder starken Immunsuppressiva wie Dexamethason, Cortisol, Methylprednisolon, Prednison, Cγclosporin A, FK 506 oder Rapamycin (b) auf der Coinkubation der so gebildeten Ts- Effektorzellen mit unreifen Zellen (z.B. T- depletierten oder nicht- depletierten PBLs gleicher Person) in Anwesenheit der PBLs jener Person, gegen die Toleranz angestrebt wird, oder aber in Anwesenheit von Lektinen (PHA oder ConA), und (c) auf der Infusion dieser allotoleranten (reifen) T-Zellen in den Empfänger, unmittelbar vor oder mit unreifen Zellen (T-Zell- Präkursoren) des Donors bzw. eines Gemisches (1 :1 ) von Spender- und Empfänger T-Zell- Präkursoren (z.B. T- depletierten PBLs oder KM- bzw. Stammzellen). Das Grundprinzip hier ist jeweils das Aufeinendertreffen unreifer (Spender und/ oder Empfänger)- Zellen auf vorgebildete reife allotolerante T- Zellen.

Anders als bei soliden Tumoren kann die doppelte Impfung, gerichtet (a) gegen Tumorzellen und (b) gegen tumor- protektive Ts/th2-Zellen, bei Patienten mit hämatologischen Tumoren in einem Schritt durchgeführt werden. Hierbei werden PBLs des Patienten mit antologen und/ oder allogenen MHC II positiven Zellen (APCs wie DCs oder Makrophagen) versetzt und durch PEG- Zusatz bzw. durch Elektrofusion fusioniert. Hierbei entstehen u.a. auch Hybridzellen von APCs mit malignen plus solche mit tumor- spezifischen Ts- bzw.Th2-Zellen.

Ein idealer Zellkonstrukt enthält Z.B. maligne (Leukämie)zelle, antologe plus allogene MHC II- positive Zelle oder z.B.Th2/Tc plus autologe und/ oder allogene MHC ll- positive Zelle oder z.B. maligne Zelle plus tumor- spezifische Th2/Ts-Zelle plus autologe und/oder allogeneMHC ll-exprimierende (APC)- Zelle. Da die Wirkung eher eine katalytische ist, reicht schon eine geringe Anzahl solcher Zufallskonstrukte für eine positive Reaktion aus. Mehr noch, die entstandenen katalytisch- wirkenden Zellkonstrukte brauchen weder kloniert noch angereichert zu werden. Es genügt, wenn sie metabolisch aktiv sind, aber nicht proliferieren können; diese letztgenannten Eigenschaften sind wichtig, da die Zellkonstrukte bzw. die Zellsuspension, aus der diese Zellkonstrukte ausgegangen sind, mit Mitomycin C u.a. Zelltod- vorprogrammierende Substanzen vorbehandlet werden sollten, um jegliche Bedenken gegen die Reinjektion von malignen Zellen in den Patienten zu zerstreuen. Alle auf somatischen Hybridzellen basierenden Valezinen können erfindungsgemäß weiterhin verbessert werden, wenn die Partnerzellen (Tumorzellen, APCs) oder Hybridzellen mit starken Oberflächenhaptenen (DNCB, DNBrB, TNCB, TNBrB, DNTS, TNTS) und/ oder viralen Strukturen (z.B. NCD- Viren) xenogenisiert werden. Eine nachträgliche Behandlung der Tumorzellen mit xenogenisierenden Haptenen und/ oder Viren verstärkt den Effekt. Zudem kann mit Mabs (a) gegen Th2 und/oder Ts- Zellen (anti-CD4- und/oder anti CD8-Mabs) bzw. (b) gegen Th2-Cytokine (IL-4, IL13, IL-10) die vorzeitige Bildung von gegensteuernden, TSA ( Tumorvakzine) - bzw. pathogen- spezifischen Th2- bzw.Ts-Zellen verhindert und somit die Ausbeute an Th1 - bzw.Tc -Gedächtniszellen erhöht werden.

Eine weitere Effizienzsteigerung der Impfstoffe kann durch gleichzeitige Injektion von allogenen, präinaktivierten PBLs in den Impfling erzielt werden. Gezielter kann dieser „allostimulierender" Effekt durch Einsatz von MIT- Effektorzellen erfolgen. Durch MIS- Effektorzellen, injiziert 5- 10 Tage nach Vakzinierung, können TSA- bzw. pathogen- spezifische Th2- bzw.Ts-Zellen auf zellulärer Ebene eliminiert werden; diese MIS- Effektoren können mit den oben besprochenen, gegen Th2- bzw. Ts-gerichteten Mabs kombiniert werden.

Die Technik der Xenogenisierung mit starken Haptenen (z.B. DNCB) oder Viren (z.B. NCD- Virus) kann auch in einer anderen Situation praktische Anwendung finden, nämlich bei der „Vormarkierung" der MIS- Effektoren, um das etwaige „Entwickeln" von nicht- oder zu wenig inaktivierten (zelltod- vorprogrammierten) MIS- Effektoren durch nachträgliche Immunisierung des MIS- Rezipienten mit eben diesen starken Haptenen bzw. Viren zu verhindern.

Alle therapeutische Verfahren, beruhend auf der in vitro Selektion und Postexpansion der cytolytischen CTLs, können erfindungsgemäß substantiell verbessert werden, wenn die Patienten zuvor durch s.d./ i.d. Impfung mit Hybridzellen, bestehend aus Tumorzelle plus autologe und/ oder allogene APC (z.B. DC), zur in vivo Generierung von „qualitativ besseren", d.h. effizienteren tumorspezifischen CTLs angeregt würden.

Bei Knochenmark- und Stammzelltransplantation (BMT; HSCT) wird erfindungsgemäß empfohlen, die klassische Transfusion von Donorzellen in den meist myeloablativ vorbehandelten Rezipienten (Patienten) durch 1 : 1 - Gemisch aus Donor- plus Rezipientzellen zu ersetzen. Nachdem sich gezeigt hat, dass die besten Ergebnisse bei Knochenmark- Chimären durch den Transfer (a) von F1 - Hybridzellen in den P1 - oder P2- parentalen Rezipienten und (b) von der Mixtur aus P1 -- P2- plus P2— P1 - Milzzellen erzielt werden konnten, wird erfindungsgemäß empfohlen, (a) das oben erwähnte 1 :1 - Gemisch aus D- und R- Zellen mit (b) reifen D- Zellen zu ergänzen; die letzteren müssen jedoch wegen GvHD- Gefahr durch D- abgeleitete MIS- Effektorzellen ersetzt werden.

Ein weiterhin optimiertes Verfahren sieht vor, die allogene BMT und HSCT (d.h. PBSCT, PBPCT und BMSCT) und abhängig von nicht- voraussagbaren Schwankungen zwischen mitverschleppten Donor- und nicht depletierten Rezipienten- T- Zellen zu machen, indem a priori nach erfolgter myeloablativer oder nicht- ablativer Vorbehandlung des Rezipienten (Patienten) zuerst ein 1 :1 - Gemisch aus reifen D- und R- Zellen (PBLs oder T- Zellen) oder, bevorzugt, aus entsprechenden MIS- Effektorzellen transfundiert wird und erst danach, 3- 10 Tage später, die unreifen Zellen (optimal das 1 :1 - Gemisch aus D plus R- Knochenmarkoder Stammzellen) postinjiziert werden. Hierdurch werden sowohl GVHD als auch HVG (Abstoßung transplantierter Zellen) verhindert und ein gemsichter allogener Chimärismus etabliert.

Zur in vitro Eliminierung residueller Tumorzellen wird empfohlen, dem eben beschriebenen Verfahren die Transfusion von Donor- MIS- Effektorzellen allein voranzuschalten, wobei dem Aufspüren und Eliminieren der Resttumorzellen 3-10 Tage eingeräumt werden. Die Effizienz dieser MIS- Effektorzellen steigt mit dem Grad der Histoinkompatibilität zwischen D und R sowie der in vitro Präalloimmunisierung der MIS- Effektoren gegen den Rezipienten. Anmerkung: (a) Das 1 :1 (D:R)- MIS- Effektorgemisch wird optimal durch D:R- two ways- MLC in vitro, gefolgt von Mitomycin C- Behandlung, hergestellt.

(b) Als unreife Zellen können auch T- Zeil- depletierte D- und R- PBLs eingesetzt werden.

(c) Das 1 : 1 (D:R)-MIS- Effektorgemsich kann auch in Anwesenheit von verschiedenen Immunosuppressiva wie Dexamethason, Cortisol, Cyclosporin A, Agonisten von Gs- gekoppelten Rezeptorsubtypen sowie Th2-Cytokinen (IL-4.IL- 10,TGFß, IL-13) hergestellt werden, um den gemischten allogenen Chimärismus zu beschleunigen.

(d) Der besondere Vorteil des oben beschriebenen Verfahrens ist die spätere, d.h. Post- Transplant- Kooperation zwischen T- Zellen und APCs, die bei (a) klassischer KMT und HSCT (b) bei DLI/ DLT und (c) bei von der Seattle- Gruppe vorgeschlagenem Schema basierend auf antologer Transplantation (nach cytoreduktiver Behandlung), gefolgt von allogener Transplantation, nicht gegeben ist.

Eine wichtige neue Erkenntnis ist die wesentliche Verbesserung der MIS/ MIT- und der HTT- Technologie durch Kombination mit BRMs generell (und deren Kombinationen). Als Beispiele seien genannt: poly r/:rC, Bakterienlysat, Levamisol und Th1 -Cytokine wie IL-2, IFNgamma, TNFalpha, IL-12 und IL-1 . Besonders zu empfehlen ist die Kombination von IFNalpha (3x106 U/d s.c, 5 x wöchentlich über 4 Wochen) plus rlL-2 (3-6 x 106 IU/m2 täglich, 5 x wöchentlich, 4 Wochen lang).

Da die Chemotherapie und die Bestrahlung reife und unreife Zellen auf unbekannte Weise schädigt, wird erfindungsgemäß empfohlen, den ersten Teil der Patienten- Leukozyten durch Leukapherese und den restlichen Teil mit Mabs zu eliminieren, wobei die durch Leukopherese abgetrennten Leukozyten nach Behandlung z. B. mit Mitomycin C in den Patienten reinjiziert werden können, um so die kritische labile Zwischenphase, bei der sich Toleranz gegenüber restlichen Tumorzellen reetablieren kann, zu überbrücken.

Die ex vivo Behandlung der Patienten- Leukozyten, die bei Leukämien/ Lymphomen große Mengen an malignen Zellen und bei soliden Tumoren kontaminierende Tumorzellen enthalten können, kann das Problem der fehlenden tumor- spezifischen Mabs beim „purging" des autologen Knochenmarks lösen und somit der autologen Knochenmark- Transplantation bei hämatologischen und soliden Tumoren breitere klinische Anwendung ermöglichen.

Unreife Knochenmark- oder Stammzellen könnten in Zukunft z.T. durch T-Zell- depletierte Donor-PBLs(PBMCs) ersetzt werden. Dies bringt u.a. den Vorteil mit sich, dass die Regenerierungszeit für die Immunabwehr des Patienten verkürzt und die fatale Immuninkompetenzphase überbrückt oder mindestens wesentlich reduziert wird.

Die Effizienz der HTT-Effektoren lässt sich erfindungsgemäß weiterhin steigern, wenn statt unbehandelten Patienten-Tumorzellen die mit cDNA, kodierend für IL-2, IFNgamma oder IL-12 transduzierten Tumorzellen aks Fusionspartner von autologen und/oder allogenen APCs (e.g. DCs) vorgesehen werden. Hiermit könnten Vorteile zweier wichtiger Techniken vereint werden.

Eine Variante dieses Verfahrens sieht vor, zuerst mittels viraler Vektoren (z.B. Vaccinia- oder adenoassoziiertes Virus) die cDNA für TSA-Antigene in die Tumorzelle einzubringen, um die TSA-Membrandichte zu erhöhen und im zweiten Schritt die Fusion mit autologen und/oder allogenen APCs (z.B. DCs) vorzunehmen. Die „Qualität" der so erzeugten HTT-Effektoren könnte durch Kombination beider HTT-Modifikationen, d.h. durch gleichzeitige Fusionierung von Cytokin (Th1 -Typ)- und TSA-transfizierten Tumorzellen mit den APCs (DCs) noch zusätzlich gesteigert werden.

Nachdem in unserem Labor gezeigt werden konnte, dass ROS/ROI, und zwar beide Vertreter das H₂0₂(0₂ ^2~Anion/Peroxid-Anion) und das H0₂ (0₂ ^"Anion/Superoxid- Anion) zur starken Zellstimulation gar in Abwesenheit von ansonsten essentiellen Kulturmediumbestandteilen wie Ca²⁺, Mg²⁺, NEA, FCS/BSA etc. (in reinem PBS) führen und dass andererseits ROS-Entzug im Medium (durch ROS-abbauende Enzyme wir Catalase, Peroxidase und/oder Mn- Cu/ZnSOD) zur Zellsuppression führt, soll die Zellstimulation durch ROS/ROI und alle Vermittler derer Generierung einerseits und sie Zellsuppression durch alle ROS-Scavengers (enzymatische und chemische) patentrechtlich geschützt werden. Zudem soll die Potenzierung einer schnellen Zellstimulation in 2 Schritten, d.h. durch Vorbehandlung der Zellen (z.B. Th1 oder Tc) mit Catalase,. (GSH)-Peroxidase und/oder Mn- bzw. Cu/Zn-SOD im I .Schritt, Auswaschen und Nachbehandlung durch XOD/Xanthin-Hypoxanthin und/oder GOD/Glucose (alternativ : H202) im 2. Schritt geschützt werden. ROS/ROI können mit anderen, rezeptor-unabhängigen Aktivierungsmechanismen, z.B. via Ca- lonophore oder Ca-Ionomycin und/oder Phorbolestern, kombiniert werden. Mit ROS- sowie RNS-generierenden und modulierenden Systemen lassen sich u.U. auch Th1 vs.Th2 sowie Tc vs.Ts- Interkonversionen und Funktionspolarisierungen erzielen. Der besondere Vorteil ist eine schnelle Immunintervention auch bei Abwesenheit entsprechender Rezeptoren wie sie z.B. bei Th1 - bzw. Th2-Typ-Cytokinen vorausgesetzt werden müssen.

Nachdem unsere Tierversuche gezeigt haben, dass eine zeitlich begrenzte Eliminierung von (a) T4-Zellen (b) APCs (Makrophahgen) und (c) B-Zellen in der kritischen Frühphase der Auseinandersetzung mit dem Tumorinokulum (oder Pathogen) den Impfschutz steigert, wird erfindungsgemäß empfohlen, mit entsprechenden Mabs die genannten Leύkozyten-Subsets temporär (zwischen Tag 3 und 10 nach Vakzination) auszuschalten.

Die Rolle von Arginase, einem von Makrophagen sezernierten Exoenzym, liegt u.U. wehiger im Aushungern von Tumorzellen als eher in der verhinderten NO- Generierung tumor-spezif. T-Zellen, was zur Th1 -Polarisierung und partieller Th2 : Th1 (Ts : TcHnterkonversion führen könnte. Deshalb wird erfindungsgemäß der Einsatz von Arginase zur Th2 : Th1 - und Ts : Tc-Interkonvertierung empfohlen.

Da Irritationen oder partielle Schädigung der Membranstruktur generell zur ROI- Steigerung führt, wird dieses Prinzip erfindungsgemäß (a) zur Zellstimulierung und (b) zur Th2 : Th1 - bzw. Ts : Tc-Interkonversion empfohlen. Beispiele sind niedrigdosierte Tenside wie Na-Salz von Gallensäuren, sub-denaturierende Konzentration an SDS, Brij oder Teepol bzw. Tween sowie Digitonin/Saponin.

Nachdem unsere Versuche gezeigt haben, dass Nh3 durch seine Membrangängigkeit und Bindung des intrazellulären H + - Ions zur Zellstimulation führt, wird erfindungsgemäß empfohlen, NH3 sowie NH3-freisetzende Systeme (z.B. Glutaminase/Glutamin, Asparginase/Aspargin) allein oder in Kombination mit anderen, rezeptor-unanhängigen (ROS/ROI, Phorbolesters, Ca lonophore) und - abhängigen Zellstimulatoren (a) zur Zellaktivierung und (b) zur Th1 -bzw. Tc- Subsetpolarisierung einzusetzen.

Die HTT-Technik mit all ihren Modifikationen kann wesentlich verbessert werden, wenn präexistente tumor-spezifische Th2- und Ts-Zellen in vivo präeliminiert werden. Daher wird die HTT-Kombination mit Th2- bzw. Ts-spezifischen Mabs (und polyklonalen Ak) mit/ohne MIS/MIT-Effektorzellen empfohlen.

Da die dauernde Auseinandersetzung mit verschiedenen Krankheitserregern, aber auch mit Autoantigenen etc. zum Anstieg von z.T. falschen, d.h. krankheitsprotektiven oder -fördernden Immunozyten (T-Zell-) Subsets führt, wird erfindungsgemäß empfohlen, von Zeit zu Zeit den Set reifer T-Zellen durch Kombination von T-Zell-spezifischen Mabs plus MIS/MIT-Effektorzellen in vivo zu depletieren und durch nachreifende T-Zellen ersetzen zu lassen. Dies erscheint angesichts der minimalen bis fehlenden Nebenwirkungen diesartiger Behandlung durchaus realistisch.

Denkbar wäre auch eine Behandlung mit geringer Anzahl allogener PBLs bzw. daraus abgeleiteter MIT-Effektorzellen ohne vorausgehende Mab-Behandlung, weil hierdurch eine „Umstimmung" von immunsuppressiver zur immunreaktiver Immunbereitschaft (via Umprogrammierung der akzessorischen Zellen) zu erwarten wäre. Es sei hierbei erwähnt, dass allein durch Zusatz von allogenen PBLs Toleranzdurchbrechung möglich war. Von speziellem Interesse bei diesem Anheben der Basisreaktionsbereitschaft des Immunapparates ist auch die niedrig-dosierte Gabe von verschiedenen Antagonisten Gs-gekoppelter Rezeptoren bzw. Rezeptor- Subtypen, wie z.B. Propranolol oder Cimetidin (Ranitidin) mit oder ohne subdosierte Ca-Antagonisten, wie Nifedipin. Nach Zulassung der iNOS- bzw. cNOS-Hemmer könnte die Kombination mit subdosierten Vertretern dieser Substanzklasse das Spektrum dieser subdosierten Immun-Deblokierer weiterhin erweitern.

Wegen beachtlicher Schwierigkeiten bei der Transfektion der Zielzellen mit viralen Vektoren (niedrige Ausbeute transfizierter Zellen, begrenzte Expressionsdauer der transfizierten Gene, unbekannte Lokalisierung der transduzierten Gene, Probleme bei Steuerung komplizierter Gene, z.B. Thalassämie oder Sichelzell-Anämie, Immunreaktion gegen virale Strukturen auf transfizierten Zellen) wird alternativ die Hybridisierung (Fusion) defizienter Zellen mit profizienten Zellen bzw. Wildtyp-Zellen erfindungsgemäß empfohlen. Hierbei sind alle Hybridisierungsformen, d.h. Zeil : Zell- , Kern : Zeil- und Kern : Kern-Fusionen im Schutzbereich der Erfindung.

In Frage kommen alle, mit Knochenmark-Transplantation „korrigierbare" genetische Erkrankungen, wobei sich grundsätzlich 2 erfindungsgemäßen Lösungen anbieten: (a) Durch verbesserte Knochenmark- und Stammzeil-Transplantation, wie sie in dieser und in der vorausgegangener Anmeldung im Detail beschrieben worden ist, wird durch Wegfall des potentiell lethalen Risikos der Weg zu einer breiten Therapie all dieser genetischen Erkrankungen via verbesserter Knochenmark- und Stammzell- Transplantation eröffnet. Mehr noch, durch relative Unabhängigkeit von der MHC- Identität zwische Donor und Rezipient wird der Kreis der potentiellen Spender essentiell erweitert, (b) Durch Fusion der defizienten Mutante (Patientenzelle) mit profizienter oder Wildtypzelle kann der Defekt der Zelle mindestens im heterozγgoten Sinn behoben werden. Bei Gβndefekten, die nur ein Organ betreffen, sind fusionierte Hybridzellen mit anderen Zellen des Patienten, die diesen Defekt nicht aufweisen, vorgesehen. Bei generalisiertem Gendefekt müssen allogene Partnerzellen herangezogen werden. Um die Abstoßung solcher Zellkonstrukte zu verhindern, muß zuvor Toleranz gegen den Spender etabliert werden oder aber MHC-nicht exprimierende allogene Partnerzellen vorgesehen werden. Beispiele solcher kernhaltigen, MHC-negativen Partnerzellen sind Retikulozyten und K562- Zellen (humane erathroleukämische Zellinie). Alternativ muß eine „Ausverdünnung" der Membran-MHC durch ein erhöhtes Mischverhältnis der autologen (defizienten) mit den allogenen (profizienten) Fusionspartnerzellen (2: 1 , 3: 1 , 4: 1 etc.) angestrebt werden.

Eine weitere HTT-Variante sieht vor, statt Patienten-Tumorzellen die eines anderen Patienten mit gleicher Tumorart (z.B. Melanom oder Nierenzellkarzinom) mit autologen und/oder allogenen APCs(DCs) dieses Patienten oder einer dritten Person zu fusionieren. Es kann aber auch von einer Mixtur der Tumorzellen von Patient I und II ausgegangen werden, oder aber es können Hybridzellen mit Tumorzellen des Patienten I mit jenen des Patienten II gemischt werden. Eine Inaktivierung z.B. mit 10.000-20. OOOcgy oder mit Mitomycin C (20-30) ug/ml; Inkubationszeit : 18 h) kann auf der Stufe der eingesetzten Tumorzellen oder aber der gebildeten Hybridzellen vorgenommen werden.

Da beim „gemischten allogenen Chimärismus" sich die Donor-APCs u.a. auch im Thymus ansiedeln und die Rolle von Thymus-Epithelzellen mitübernehmen, wir empfohlen, in der Endphase der MIS (genauer : MIS-BM/SC)-Behandlung unreife Donor-Knochenmark- bzw. Stammzellen in den Empfänger zu injizieren, um auf diese Weise die ideale Konstellation, d.h. D- plus R-spezifische MHC-Restriktion der heranreifenden T-Zellen zu erzielen, die dann mit D- und R-abgeleiteten APCs optimal kooperieren können.

Vom Tierversuch ist bekannt, dass vorbestrahlte Thymuszelle nach ihrer Injektion in den Empfänger ihre Funktion imThymus übernehmen. Da außerdem von verschiedenen Beobachtungen ein organ-spezifisches Homing von allogenen Thymuszellen erwartet werden kann, wird empfohlen, nach Etablierung der Donor-spezifischen Toleranz (z.B. durch „gemischten allogenen Chimärismus" oder nach einem, in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren) Donor- Thymuszellen in den Empfänger zu injizieren, wodurch künftige Generationen an nachreifenden T-Zellen gleichzeitig D- und R-spezifische MHC-Restriktion erwerben und hiermit eine optimale Kooperation der D- und R-abgeleiteten T-Zellen und APCs garantieren.

Ein wichtiges Prinzip ist die schnelle Nachrekrutierung „maßgeschneideter" Immunozyten (T-Zellen), wenn zuvor die reifen T-Zellen (B-Zellen) in vivo mit Mabs plus MIS-Effektorzellen präeliminiert und danach „maßgeschneiderte" reife T-Zellen injiziert (i.v.) werden. Hierbei reicht schon eine geringe Anzahl an möglichst kurz vor der Injizierung aktivierten T-Zellen mit gewünschten Eigenschaften (z.B. Th1 -, Th2-, Tc-, bzw. Ts-Subset mit oder ohne Antigen-Spezifität)aus, um in kurzer Zeit große Populationen an „maßgeschneiderten" reifen T-Zellen zu generieren. Es können auch „Cocktails" aus genau definierten Ausgangssubpopu-Iationen als eine Art „Primer" zur gezielten Generierung („Vermehrung") der gewünschten T-Zell-Suspensionen eingesetzt werden.

Da wir im Tierversuch zeigen konnten, dass in der Frühphase der Immunantwort gegen das Antigen (z.B. TSA) die Eliminierung von Makrophagen und B-Zellen die vorzeitige Generierung der gegensteuernden Th2- bzw. Tc-Zellen veerhindert, wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, die Knochenmark- und Stammzelltransplantation durch die Transfusion von T-Zellen zu ersetzen und die vorseparierte APC (Makrophagen)- und B-Zell-Fraktion erst später (3-14 Tage nach T-Zell-Transfusion) in den Empfänger zu transferieren. Hierdurch kann einerseits die GvHD-Entstehung verhindert oder verzögert werden; andererseits ist durch die erwähnte Hinausschiebung der gegenregulierenden Th2- und/oder ts-Zellen eine höhere Ausbeute an Ag-spezifischen Th1 - und Tc-Gedächtniszellen zu erwarten.

Anmerkung: (a) Zur Abtrennung der T-Zellen von den APCs und B-Zellen können auf FACS- und MACS-basierrende Separationsverfahren eingesetzt werden. In einer vereinfachten Version werden nur (plastik)adhärente Zellen (APCs) abgetrennt und später postinjiziert. (b)Das gleiche Prinzip, d.h. die vorteilhafte Abwesenheit von APCs und B-Zellen in gewisser Phase der Antigen- oder Alloantigen-spezifischen Immunisierung kann zur Effizienzsteigerung bei der MIS/MIT-Präparation herangezogen werden.

Bei der BMT und HSCT wird erfindungsgemäß eine weitere Technik zur Erzielung des angestrebten „gemischten allogenen Chimärismus" vorgeschlagen, bei der sowohl (a) die Donor- Knochenmark-, Stammzell- oder PBL/PBMCs-Suspension als auch (b) der Empfänger (in vivo) von reifen T-Zellen depletiert werden. Hierbei sind 2 Varianten vorgesehen: Bei der ersten werden nur Anti-CD3-, Anti-CD4- und/oder Anti-CD8- bzw. neben Anti-CD3- weitere pan-T-spezifische Mabs sowohl bei der T- Depletierung der Spenderzell-Suspension als auch, soweit zugelassen, bei der in vivo Vorbehandlung des Rezipienten eingesetzt. Bei der 2. Variante werden die Mabs mit MIS/MIT-Effektoren kombiniert. Anmerkung: Statt oder zusätzlich zu Mabs können polaklonale Ak wie ATG,ALS etc. verwendet werden. Um Kosten zu sparen, kann die Kombination der Ak mit einigen Cytostatika, primär Cyclophosphamid ins Auge gefasst werden. Optimalerweise wird der „gemischte allogene Chimärismus" mit einer 1 : 1 -Mixtur aus (reifen) Donor-plus Rezipient-MIS- Effektoren „stabilisiert".

In generalisierten immunsuppressiven Lagen wird erfindungsgemäß empfohlen, (a) mit H0₂(0₂ ^") und/oder H₂0₂(0₂ ^2')-generierenden bzw. erhöhenden Systemen (z.B. XOD/Xanthin, XOD/Hypoxanthin, GOD/Glucose etc.) (b) mit Antagonisten von Gs- gekoppelten Rezeptoren bzw.Rezeptor-Subtypen (z.B. Propranolol ) (c) mit Th2/Ts- unterdrückenden Ca-Antagonisten und/oder iNOS/cNOS-Hemmern (d) mit Gi- Agonisten und (e) mit BRMs (z.B. Typ1 -Cytokinen) die immunsuppressive Basislage in eine immunresponsive umzuwandeln. Hierbei müssen die Agonisten bzw. Antagonisten in sehr niedrigen (sub-pharmakologischen) Dosen verabreicht werden. Ein weiterer Weg zur „Korrektur" des Th2/Th1 - und des T4/T8-Quotienten ist der Einsatz von enzymatischen und chemischen NO-, z.T. H0₂-Scavengers. Die Tatsache, dass wir bei Kombination von T-depletierenden Mabs mit MIS/MIT- Effektoren klinisch eine schnelle Korrektur beider erwähnter Quotienten beobachten konnten, führte zur erfindungsgemäßen Empfehlung des Einsatzes dieser T- depletierender Techniken allein oder in Kombination mit obigen Systemen zur Behebung der immunsuppressiven Lage des Patienten.

Nach unseren neuesten Erkenntnissen ist der kleinste gemeinsame Nenner aller Tumorzellen, mindestens in deren aktiven , nicht im „dormant"-Zustand, unabhängig von deren Abstammung, Typ und Individualität (a) ein konstitutiv erhöhter H0₂/H₂0₂ ^' bzw. 0₂70₂ ^2_Quotient und/oder erhöhtes H0₂/NO bzw. H0₂( NO + H₂0₂)- Vehältnis (b) ein erhöhter Go/Gp - bzw. PI-PLC - Quotient, genauer gesagt ein konstitutiv erhöhter Aktivierungsgrad Gi PLA2

Entsprechender G-Protein-Subtypen (Go, Gp, G;) bzw. Phospholipasen-Subtypen (PLCPLA2), und (c) ein erhöhter DAG- bzw PKC-Quotient,

PLA PKG wobei DAG für Diacylglycerol, PKC für ProteinkinaseC und PKG für Proteinkinase G steht. Der angestrebte patentrechtliche Schutz betrifft alle aus diesen Erkenntnissen abgeleiteten Maßnahmen (pharmakologischen Interventionen), die via Herabsetzung der genannten Quotienten zur kontrollierten Proliferation entarteter Zellen führen . Als Beispiel seien Antagonisten des alphä1 -AR-Typs und Agonisten des alpha2-AR- Typs gennant.

Die Voretablierung des „gemischten allogenen Chimärismus" durch Injektion eines 1 :1 -Gemisches aus D- und R-MIS-Effektoren in den T-depletierten Empfänger wird nicht nur . bei allogenen BMT und HSCT, sondern auch bei allen Organtransplantationen und bei der später diskutierten

Mikro(Einzelzell)transplantation, der sogenannten ECT (engineered cell transplantation) empfohlen.

Im Folgenden sind noch erfindungsgemäße Ausführungsformen zur Allergie- Behandlung angegeben: Da die Allergie mit einer T-Subset-Verschiebung zugunsten des Th2-Subsets verbunden ist, wird empfohlen (a) mit T-depletierenden Mabs plus MIT/MIS-Effektoren das Th2/Th1 -Verhältnis zu korrigieren (normalisieren) (b) mit Ca Antagonisten (z.B. Nifedipin), cAMPi- und NOi-herabsetzenden Pharmaka (z.B. verschiedenen Gs-Antagonisten und NOS-Hemmern) den sich aufschaukelnden cAMP : NO/PEG2-Kreis zu durchbrechen und (c) mit der HTT-AIT-Technik gegen allergen-spezifische T-Zellen (mittels Hybridzellen, bestehend aus allergenspezifischen T-Zellen plus autologen und/oder allogenen MHC ll-positiven Zellen (z.B. DCs oder Makrophagen) zu vakzinieren. In einer vereinfachten Version wird nur der letzte Schritt, die HTT-AIT-Vakzine, angewandt und evtl. mit dem 1 .Schritt (T- Depletierung in vivo) kombiniert. Zur weiteren Effizienzsteigerung werden Fusionsproteine, bestehend aus Allergen plus IL-12 (oder anderen Th1 - Lymphokinen) empfohlen. Diese Fusionsproteine mit IL-1 2, IFNgamma, IFNalpha und TNFalpha werden übrigens auch bei anderen Verfahren, bei denen Typ1 (proinflammatorische) Immunantwort angestrebt wird, empfohlen, so z.B. bei der Behandlung von Tumor in Infekten, wobei das Antigen jeweils bekannt sein muß.

Wie an anderer Stelle dieser Anmeldung beschrieben, lassen sich Ag-spezifische T- Zellen (z.B. Allergen- oder TSA/TSTA-spezifische T-Zellen) neuerdings durch ein elegantes Verfahren, bei dem die in Anwesenheit des spezifischen Antigens bzw. Allergens oder Alloantigens aktivierten T-Zellen anhand der sezernierten Cytokine erkannt und durch FACS oder MACS sortiert werden können. Durch bispezifische Mabs, die einerseits die T-zelle und andererseits das Cytokin erkennen, werden sezernierte Cytokine festgehalten, um anschließend mit einem 2. Mab (mit Spezifität für das gleiche Cytokin) markiert und der Zelltrenrrung zugängig gemacht zu werden.

Bei Allergien lässt sich die Bindung von IgE and den Rezeptor auf Mastzellen und Eosinophilen durch proteolytisch vorgespaltene IgE-Untereinheiten, die nicht 2 Fc epsilon-Rezeptoren überbrücken können schwächen. Zudem können allergiefördernde Cytokine (z.B. IL-4, IL-5, IL-1 3, z.T. IL-10) durch entsprechende Mabs neutralisiert werden. Auch diese 2 Schritte können mit der sogenannten klonotypischen (HTT-CL,s. später !) HTT-Modifikation kombiniert werden.

Die Tatsache, dass man mit ConA + Gs-Agonisten (d.h. Agonisten Gs-gekoppelter Rezeptoren, z.B. Isoprenalin oder Adrenalin oder Adenosin) nereits nach 48h in vitro Ts (und Th2) generieren kann, die auch nach Behandlung mit Mitomycin C bei 1 : 1 - Mische mit naiven PBLs (T-Zellen) des gleichen Spenders sowohl im PHA- Proliferationsansatz als auch im MLC starke Suppression ausüben, bildet die Basis für den vorgeschlagenen klinischen Einsatz von Mitomycin C- vorbehandelten Spender-Ts bzw. th2-Zellen. Hierbei kann durch vorausgehende in vivo T- depletieruήg (mit Mab + MIS/MIT-Effektoren) und/oder durch Postinjektion von unreifen Spenderzellen (BMCs,HSCs), aber auch T-depeltierten Spender-PBLs eine stabile R : D-Toleranz etabliert werden. Statt D-Zellen kann ein 1 :1 -Gemisch aus (unreifen) R + D-Zellen postinjiziert werden.

Eine interessante neue Technik sieht vor, mit MIS/MIT-Effektorzellen, präpariert aus D- und R*PBLs, die zusätzlich den jeweiligen Partner (D bzw. R) präalloimmunisiert werden können, ein Werkzeug zu besitzen, mit dem sowohl GvHD als auch HvGR (Knochenmark- bzw. Organabstoßung) klinisch unter Kontrolle zu bringen sind. Bei Zeichen eines GvHD-Ausbruchs würden R-spezifische alloreaktive MIS/MIT- Effektoren des Donors, bei HvGR dagegen die D-spezifische alloreaktiven Effektoren des Empfängers eingesetzt werden. Nach jeder dieser Behandlungen ist die i.v. Injektion eines 1 : 1 -Gemisches aus D- und R-MIS/MIT-Effektoren vorgesehen.

Da im Tierversuch 50ug/Maus eines pan-T-spezifischen Mabs (z.B. Anti-Thy1 .2- Mab) über das Angehen oder Abstoßung des Donor-Knochenmarks bzw. des 1 :1 - Gemisches aus Donor-Knochenmark- und -Milzzellen entscheidet, wird erfindungsgemäß empfohlen, bei den nicht-ablativ präparierten Patienten mit Variierung des pan-T-spezifischen Ak (mono- oder polyklonalen Ak) einerseits mit einer, noch herauszufindenden Ak-Dosis, die wahrscheinlich von Individuum konstant bliebe, den „gemischten allogenen Chimärismus" anzusteuern; andererseits bekäme man mit diesen Aks ein Werkzeug in die Hand, das in voraus das Überwiegen des Donors vs. Rezipienten oder umgekehrt vorauszusagen zuließe. Wenn kombiniert mit zelltod-vorprogrammierten D- bzw. R-MIS/MIT-Effektoren, könnte dieses Verfahren sowohl den Ausgang einer Zelltransplantation als auch spätere Korrekturen in vivo ermöglichen. So könnte z.B. der bei der Bekämpfung restlicher Tumorzellen angestrebte temporäre „D-Typ-allogener Chimärismus" später peu-ä-peu durch den D:R-Toleranz-stabilisierenden „gemischten allogenen Chimärismus" ersetzt werden. Hierbei kann der Überschuß an D-Zellen durch R- Zellen „kompensiert" werden. Dieses Verfahren hat große klinische Bedeutung, da es z.B. zur Bekämpfung etablierter GvHD und akuter Organabstoßung eingesetzt werden kann. Ähnlich wie es bei der DLI nach Post-BMT-Rezidiven zum schnellen Ersatz des „gemischten" durch den „Donor-Typ"-allogenen Chimärismus kommt, kann es durch einen Überschuß an R-MIS-Effektoren, speziell den allopräimmunisierten, zur schnellen Depletierung oder Inaktivierung des GvHD- aufrechterhaltenden D-CTLs kommen.

Statt oder zusätzlich zu den MIS/MIT-Effektoren können autologen NK- bzw. die daraus abgeleiteten LAK-Zellen sowie allogene LAK-Zellen, die entweder mit pan-T- spezifischen Mabs von deren T-Zell-Anteil depletiert oder nach Art der MIS- Effektoren Zelltod-vorprogrammiert werden müssen, zum Einsatz kommen.

Obwohl bei der DLI nach Post-BMR-Rezidiven eine „falsche" Reihenfolge, d.h. „gemischter" vor (statt nach) „Donot-Typ" allogenem Chimärismus vorgegeben ist, lässt sich die hieraus resultierende beeinträchtigte T-Zell : APC-Kooperation durch Abbrechung des Prozesses der endgültigen Etablierung von „Donor-Typ"- Chimärismus mit Überschuß an präalloimmunisuerten R-MIS-Effektoren, gefolgt von der Injektion des 1 : 1 -Gemisches aus D + R- MIT-Effektoren sowie des 1 : 1 - Gemisches aus unreifen D + R-Zellen korrigieren. Alternativ hierzu kann mit unbehandelten präalloimmunisierten R-PBLs ( + unreifen R-Zellen) vor Etablierung des voll-allogenen, d.h. Donor-Typ-allogenen Chimärismus interveniert werden. Eine weitere Variante sieht die Infusion der MIT-MACH-Effektoren (d.h.1 :1 -Mixtur aus D + R-MIS-Effektoren) unmittelbar (3-10 Tage) vor DLI/DLT vor.

Die zur Eliminierung dysregulierter T-Zell-Subklone (z.B. Ts/Th2-Zellen bei Tumoren oder Tc-Zellen bei Autoimmunerkrankungen) eingesetzten MIS-Effektoren werden als MIS-BM/SC-Effektoren und jene zur R:D-Toleranzstabilisierung verwandten MIS- Effektoren als MIS-MACH („mixed allogeneic chimerism")-Effektorzellen bezeichnet.

Nachdem wir herausfunden haben, dass H0₂ proliferationsfördernd und H₂0₂ differenzierungsfördernd ist, sind alle Systeme, die H0₂ vs. H₂0₂ generieren, von besonderem Interesse. Zwei Systeme seien in diesem Zusammenhang geschützt : (a) Die H0₂-Bildung durch XOD/Xanthin bzw. XOD/Hypoxanthin, kombiniert mit Catalase und/oder (GSH)-Peroxidase, und (b) Molsidomin/Sydnonimin/SIN-1 , welches bei Zerfall H0₂ plus NO bildet, wobei NO durch verschiedene Scavengers (z.B. Hämoglobin) abgebunden wird.

Wie ein nach BMT induzierter „gemischter allogener Chimärismus" den Einsatz reifer D-Lymphozyten ermöglicht, so erlaubt der Einsatz von MIS-Effektoren eine stufenweise Einführung immer „schärferer", d.h. mit niedrigerer MitomycinC- Konzentration vorbehandelter MIS-Effektoren und zuletzt die Anwendung unbehandelter D-Lymphozyten, hier allerdings, anders als bei der DLI-Technik, ohne GvHD-Komplikation. Ähnlich können MIS-MACH_Effektoren peu-ä-peu durch „schärfere" D + R-Effektoren (1 : 1 -Gemisch) ersetzt werden und zur Effizienzsteigerung durch in vitro (im MLC in Anwesenheit von Gs-Agonisten, ConA und/oder CsA) vorangereicherte allotolerante Ts- und Th2-Zellen versehen werden.

Die MIS/MIT-Technologie folgt 2 Basisprinzipien: (a) Beim 1 . Prinzip werden die MIS-Effektoren ausschließlich zur in vivo Depletion bzw. Inaktivierung der dysregulierten T-Zell-Subsets (Ts/Th2 bei Tumor bzw.Tc bei AID, GvHD und BM- sowie Organabstoßungsreaktion) eingesetzt. Hier kann die BMT bzw. HSCT entfallen ; trotzdem ist eine optimale T-Zell : APC-Kooperation (nach MIS- Behandlung) garantiert, (b) Beim 2. Prinzip werden nicht nur die reifen, dysregulierten T-Zell-Subsets, sondern zusätzlich die unreifen Präkursoren in vivo eliminiert. Hier müssen die unreifen Patientenzellen durch BMT bzw. HSCT ersetzt werden; zwecks uneingeschränkter Post-BMT/HSCT-Kooperation zwischen T-Zellen und APCs wird, wie oben diskutiert, ein 1 :1 -Gemisch aus D + R-Zellen (statt „reiner" D-Zellen!) empfohlen.

Die Effizienz der MIT-, genauer gesagt MIT-BM/SC-Effektoren kann weiterhin gesteigert werden, wenn die in vitro Präalloimmunisierung im one-way-MLC beim D:R-Mischverhältnis von 10: 1 (bzw. > 1 : 1 generell) statt 1 :1 vorgenommen wird.

Wie oben erwähnt, wird bei allogenen BMT und HSCT generell empfohlen (a) statt der „reinen" Donorzellen ein 1 :1 -Gemisch aus Donor- plus Rezipientzellen einzusetzen, und (b) vor jeder (allogener) BMT oder HSCT ein 1 :1 -Gemisch aus MIS- Effektorzellen des Donors plus Rezipienten 3-10 Tage lang im Rezipienten eine Art vorbereitenden „gemischten allogenen Chimärismus" etablieren zu lassen. Durch beide Maßnahmen kann sowohl eine GvHD- bzw. HvGR-lnduktion verhindert als auch eine optimale Post-Transplant-Immunabwehr garantiert werden.

Um lymphoproliferative Erkrankungen als Folge der verloren-gegangenen Kontrolle der B-Zellen (Plasmazellen) durch (eliminierte) T-Zellen zu verhindern, wird empfohlen, gleichzeitig mit T-Zellen die B-Zellen zu depletieren bzw. statt ATG oder ATS eher ALS einzusetzen.

Um die Effizienz von HTT- bzw. HTT-AIT-Effektoren weiterhin zu steigern, wird empfohlen, die autologen bzw. allogenen APCs als Fusionspartner der Tumor (HTT)- bzw. Idiotyp-exprimierenden T-Zelle (z.B. Ts/Th2 bei Tumorpatienten) vor der Fusion zur Expression von MHC II sowie von Costimulator-Strukturen (z.B. B7.1 /B7.2, CD40 etc.) anzuregen. Hierzu kann eine 4-6h Inkubation mit Cytokinen (IFN gamma), H₂0₂ + iNOS/cNOS-Hemmern dienen.

Ein wichtiges Ziel bei der Gentherapie ist die Standardisierung, d.h. Unabhängigkeit von Material des Patienten. Dieses Ziel kann durch Präetablierung der Donor- spezifischen Toleranz nach einem des in der vorliegenden Anmeldung beschriebenem Verfahren erreicht werden. Nach Toleranzinduktion können Knochenmark- und Stammzellen sowie Fibroblasten des Donors bzw. gepoolte Donorzellen als Sekretorzellen z.B. für den Gerinnungsfaktor VIII bzw. IX oder für Insulin (bei IDDM-Patienten), aber auch für verschiedene Enzyme, deren Ersatz eine Reihe von genetischen Erkrankungen „normalisiert", in den Patienten injiziert werden, wobei oft auch die Gesetze des „Zellhomings" für die spontane Ansiedlung dieser allogenen Sekretorzellen in Ursprungsorganen sorgen. Statt unveränderter allogener Sekretorzellen können auch autologe gen-defiziente Zellen mit gleichartigen allogenen (profizienten bzw. Wildtγp-)Zellen fusioniert oder aber das fehlende Gen durch Transduktion (z.B. mittels viraler Genfähren) substituiert werden. ^"

Die HTT- und HTT-AIT-Technik kann auch durch Transfektion entweder der fusionierten Zellkonstrukte oder der eingesetzten Fusionspartner (z.B.Tumorzelle)mit Cytokinen wie IL-2, IFNgamma, TNFalpha oder IL-12 in ihrer Effizienz gesteigert werden. Auch die „Einfrierung" maßgeschneiderter Zelleigenschaften (z.B. Sekretion von Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Hormonen etc.) durch Fusiion mit immortalisierten Partnerzellen ist Gegenstand vorliegender Anmeldung. Hierbei kann von spezialisierten Zellsubtypen (z.B. Th1 , Th2, Tc, Ts etc.) ausgegangen werden oder aber immortalisierte Zellen werden nachträglich mit gewünschten Cytokinen etc. transduziert. Bei all diesen Zellkonstrukten kann z.B. mit Mitomycin C- Vorbehandlung der Zelltod vorprogrammiert werden.

Da der Überstand nach 1 d-MLC sogar die Ts-Entstehung verhindern kann, wird empfohlen, R-PBLs in einem 1 -3tägigen MLC gegen inaktivierte D-PBLs in vitro in D- spezifischen Weise zu aktivieren, in den Patienten zu injizieren und die nachreifenden Patienten-T-Zellen - nach vorausgegangener in vivo-T-Depletion - durch prägenerierte Th1 -Zellen in Richtung neuer Th1 /Tc-Zellen zu trimmen. Hierzu reicht die gleichzeitige Injektion von inaktivierten D-PBLs. Der Antitumor-Effekt basiert auf alloinduzierter Umprogrammierung der Patienten-APCs.

Die simple Generierung der Th1 -Zellen durch 1 -3tägigen MLC-Ansatz kann mit einer Zelltod-Vorprogrammierung innerhalb von 1 -3 Tagen kombiniert werden. Bei Tumorbehandlung kann der Patient successive diese kurzlebige T4-Zellen (bzw. PBLs) verschiedener Spender erhalten, wobei durch den frühen Tod die Umwandlung zur Th2-Cytokine cosezernierenden Tho-Zellen a priori verhindert wird. Bei einem 8-1 2 tägigen (statt 1 -3tägigem) MLC entstehen Ts in Th2. Auch diese Zellen können, mit oder ohne Mitomycin C-Vorbehandlung, als „Primer-Zellen" zur in vivo Nachrekrutierung neuer Ts (Th2)-Zellen aus Präkursoren bzw. naiven T-Zellen eingesetzt werden. Das Problem der Transduktion von Zielzellen mit mehr als 3 Cytokinen kann gelöst werden, indem Tumor- oder TIL-Zellen, transferiert mit jeweils 1 -2 Cytokinen, fusioniert werden. Vorteilhaft ist die zusätzliche Einführung des allogenen Elements durch Cofusion mit allogenen Zellen, optimal allogenen APCs.

Die oft beschriebene ex vivo Anreicherung und klonale Expandierung von tumorspezifischen CTLs kann wesentlich verbessert werden, wenn die Patienten zuvor mit HTT und/oder HTT-AIT-Effektoren, d.h. Hybriden aus Tumorzellen plus APCs und/oder Hybriden aus tumorspezifischen Ts- und/oder Th2-Zellen plus APCs vakziniert werden und wenn die präexistenten tumorspezifischen Ts(Th2)-Zellen durch Mabs plus MIS/MIT-Effektoren in vivo prädepletiert werden. Zudem kann die Zahl tumorizider CTLs weiterhin erhöht werden, wenn die Reinjektion der in vitro präklonierten CTLs mit der Infusion von größeren Zahlen an unreifen bzw. naiven T- Zellen kombiniert wird.

Da NK-Zellen des Rezipienten HvGR und jene des Donors GvHD (mit)induzieren können, wird empfohlen, bei BMT und HSCT Antikörper gegen NK-Zellen und einige Th1 -Cytokine (z.B.lFNgamma, TNFalpha, IL-1 2) anzuwenden.

Schnelle von D-spezifischen R- und R-spezifischen D-Ts bzw.Th2-Zellen ist durch die Zumischung von unreifen Zellen (BMG,HSCs,PBSCs/PBPCs) zu prägenerierten Ts- und, noch besser, Th2-Zellen und nachfolgende Mitogen (Lektin)- bzw.Alloantigen-Stimulierung des Zellgemisches zu erzielen. Hierbei können die Ts- bzw.Th2-Zellen Mitomycin C- oder Strahlen-vorbehandelt sein.

Die MIS-Effektoren können durch Mabs, gerichtet gegen HLA-DR- Oberflächenstrukturen auf begleitenden Suppressor-Subpopulationen, von diesen befreit werden; die cytotoxischen MIS-Effektoren sind (im aktivierten Zustand) HLA- DQ + .

Aufgrund neuester Erkenntnisse über die von uns eingeführte „klonotypische" Impfung lassen sich Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen, aber auch GvHD und HvGR bei BMT und HSCT auf eine elegante Weise nahezu nebenwirkungsfrei im voraus verhindern. Hierbei müssen bei Organtransplantationen die Rezipienten mit Hybridzellen aus autologen und/oder allogenen akzessorischen Zellen plus Donor-T-Zellen bzw. PBLs, welche zuvor im MLC gegen Rezipienten-T- Zellen bzw. PBLs präimmunisiert worden sind, s.c. oder i.d. vakziniert werden. Bei BMT und HSCT müssen die Rezipienten sowohl gegen Hybridzellen aus allopräaktivierten Donor-T-Zellen (bzw. PBLs) plus APCs(DCs) als auch gegen Hybridzellen aus allopräaktivierten Rezipient-T-Zellen (bzw. PBLs) plus APCs (DCs) vor der eigentlichen Transplantation prävakziniert werden. Eine weitere Verstärkung dieser hoch selektiven Strategie ist von der Kombination mit anderen HTT- sowie MIS/MIT-Verfahren zu erwarten.

Eine spezielle HTT-AIT-Modifikation ermöglicht die Vakzinierung gegen autoaggressive T-Zellen, die für den Untergang der Insulin-produzierenden ß- bzw. B-Zellen (Langerhaus-Inselzellen) des Pankreas verantwortlich sind. Hierbei werden die T-Zellen des Typ1 -Diabetikers (IDDM-Patienten) ohne oder mit Präselektion der autoantigen-spezifischen CD4+ und/oder CD8 + cytotoxischen T-Zellen (mittels moderner FACS oder MACS-Anreicherungsverfahren) mit autologen und/oder allogenen MHC JI + -Zellen fusioniert.

Ein wichtiger Schritt in Richtung Standardisierung des Verfahrens ist der Einsatz von IDDM-T-Zellen eines oder mehrerer Typ 1 (juvenil)-Diabetiker als Fusionspartner; in diesem Fall müssen die Hybridzellen zuvor nach Art der MIS/MIT-Effektoren zelltod- vorprogrammiert und in den T-Zell-depeltierten Patienten injiziert werden. Unabhängig von der Provenienz der autoantigen-erkennenden Fusionspartnerzellen (T-Zellen) wird eine Vorbehandlung des IDDM-Patienten mit Mabs plus MIS- Sffektoren empfohlen.

Als Zielzellen für Gentransduktion dienen meist Tumorzellen oder TIL-Zellen. Es wird empfohlen, diese z.B. mit IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IFNgamma, TNFalpha etc. transfizierten Zielzelle mit HTT- und/oder HTT-AIT-Effektoren zu kombinieren. Zudem sollte das Spektrum dieser Zielzellen um Vertreter der MHC II + - Zellen (DCs, Makrophagen) erweitert bzw. diese Zielzellen durch akzessonische Zellen als Transfektionszielzellen partiell oder total ersetzt werden.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren sieht vor, entweder die auf „konventionelle" Weise ex vivo vorselektionierten und klonal postexpandierten tumor-spezifischen CTLsmit Th1 -Cytokinen wie IL-2, IFNgamma und/oder IL-1 2 zu transfizieren und mit autologen und/oder allogenen APCs (DCs, Makrophagen) zu fusionieren, um die so entstandenen Hybridzellen s.c. oder i.d. in den Patienten zu injizieren. Eine andere (bessere) Variante sieht vor, den Patienten zuerst mit HTT- und/oder HTT-AIT- Affektoren zu vakzinieren, um CTLs „höherer Qualität" in vivo zu generieren, diese tumoriziden CTLs mit Th1 -Cytokinen zu transduzieren und die Patienten mit diesen gentechnisch veränderten CTLs bzw. CTL-Sekretor-Zellen, optimal in Kombination mit MIS/MIT-Behandlung, erneut zu behandeln. Das gleiche Mehrschritt-Verfahren kann auch die Effizienz von „klassischen" TIL-Zellen wesentlich steigern, wobei diese TIL-Zellen z.T. mit den tumoriziden CTLs identisch sind. Um eine weitere Effizienzsteigerung zu erzielen, können die CTLs nach Vakzinierung mit Th1 - Cytokine-sezernierenden Konstrukten erneut ex vivo klonal postexpandiert und in den Patienten reinjiziert werden. Die Stabilisierung von Zellen mit maßgeschneiderten Eigenschaften, z.B. antigen- spezifischen oder unspezifischen Th1 ,Th2, Tel , Tc2,Tc3, Ts etc., ohne Malignität kann entweder durch Fusion von Zellgemischen, bei denen die Anzahl der nicht- transformierten gegenüber jener der transformierter Partnerzellen stufenweise gesteigert wird, oder aber durch mehrere hintereinander-geschaltete Fusionsschritte erfolgen. Hiermit kann die Malignität der Zellkonstrukte peu-ä-peu „ausverdünnt" werden, die Stabilität bzw. Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren dagegen trotzdem günstig beeinflusst werden.

Ein weiterer Punkt betrifft die vereinfachte Übertragung der Information z.B. über Cytokin-, Wachstumsfaktor- oder Hormonsekretion, indem die meist mittels viraler Vektoren einzeln eingebrachte cDNA-Information durch simple Fusionierung mit spezielisierten Sekretorzellen ersetzt wird.

Das oben beschriebene Verfahren für die nebenwirkungsarme Behandlung von Typ1 -Diabetikern (IDDM-Patienten) gilt im Prinzip für alle AID (Autoimmunerkrankungen). Wenn das Autoantigen bekannt ist, kann die klonotype Modifikation der HTT- bzw. HTT/AIT- Technik, d.h. die sogenannte HTT-CL bzw. HTT/AIT-CL angewandt werden; ansonsten können die HTT-Effektoren aus panT- oder T-Subset-Fraktion der Patienten-Leukozyten präpariert werden. Auch der Haarausfall bzw. verschiedene Formen der Allopezie können als ein Sonderfall von AID angesehen und folglich nach gleichem patentrechtlich zu schützenden Prinzip behandelt werden.

Beide moderne zelluläre Techniken, die MIS/MIT- und die HTT-Technik können erfindungsgemäß auch bei neuerdings beschriebenen IDDM-Therapien, basierend auf dem für Nierentransplantationen (seit 1999) zugelassenem Mab Daclizumab und den beiden Immunsuppressiva Tacrolimus und Sirolimus, ergänzend oder partiell ersetzend angewandt werden.

Ein interessanter neuer Approach in der Induktion der D-spezifischen Toleranz ist die (a) Transfektion autologer Thymuszellen mit D-MHC II und MHC l-cDNA (des Donors D1 ,D2,D3 etc.) bzw.(b) Fusion autologer Thymuszellen mit MHC I- und MHC ll-exprimierenden Partnerzellen (des Donors D1 ,D2,D3 etc.). Beispiele solcher Zellen sind BMCs, HSCs/PBSCs/PBPCs, embryonale/foetale SCs, T-Zellen und APCs. Durch Homing werden die so veränderten Thymuszellen im Thymus angesiedelt und ermöglichen dort gleichzeitig die R- und D(D1 ,D2,D3 etc.)- spezifischen „thymic education", die sich in R- und D(D1 etc)-spezifischen MHC- Restriktion der nachreifenden T-Zellen äußert. Bei BMT oder HSCT von 1 :1 -Gemisch der Donor- und rezipientzellen ergibt sich nun die ideale Konstellation, dass reife D- und R-Zellen gegenseitige Toleranz aufweisen und zudem T-Zellen und APCs von D und R optimal miteinander kooperieren. Eine weitere Möglichkeit zur D-spezifischen Toleranzinduktion ergibt sich durch Immunisierung bzw. Vakzinierung mit MHC 11 + und MHC 1 + -Zellen des Donors unter stark immunosuppressiven Bedingungen, z.B. nach Injektion von Cyclophosphamid, Glueocorticoiden und/oder Cyclosporin A, Rapamycin oder FK506 in den Rezipienten.

Die Effizienz der HTT-Vakzinen könnte durch Xenogenisierung, d.h. Vorbehandlung mit starken Haptenen wie DNCB, DNBB, TNCB, TNTS etc., aber auch durch Präoder Cofusion mit xenogenen Zellen (a) entweder der Tumor- oder (b) der Hybridzelle weiterhin gesteigert werden. Nach der Vakzinierung mit dieser so veränderten HTT-Hybridzelle könnte z.B. durch Nachbehandlung der Tumoroberfläche (Melanom, Blasenkarzinom) mit Haptenträgern wie Trinitrotoluolsulfonsäure (TNTS) oder z.B. durch BCG-Nachbehandlung der Blase, wenn zur Xenogenisierung BCG-Keime (inaktiviert) eingesetzt worden sind, zusätzliche tumorizide Wirkung der HTT-Basisbehandlung angestrebt werden.

Wie an anderer Stelle in dieser Anmeldung diskutiert, wird die Effizienz von MIS/MIT- und HTT-Effektoren durch gleichzeitige Stimulierung mit BRMs, Cytokinen etc. z.T. dramatisch erhöht. Gegenstand der Erfindung ist daher auch deren Kombination mit den in EP 374 207 und EP 705 1 1 1 aufgeführten Immunstimulanzien bzw. den dort beschriebenen cAMP- bzw. cAMP/cGMP- reduzierenden Pharmaka,

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Kombination (a) aller Varianten zur Ts und/oder Th2-Eliminierung auf humoraler Basis (mit Mabs, Mab- Konjugaten, Mab-Fusionsproteinen, Immunotoxinen etc.), die in den oben erwähnten Patentanmeldungen des gleichen Anmelders (EP 374 207 und 705 1 1 1 ) im Detail beschrieben worden sind, mit (b) MIS/MIT-Technik und ihren Modifikationen und/oder (c) HTT-Technik und ihren Abwandlungen. Auf diese Weise wird u.a. ein besonders konsequenter Weg zur restlosen Eliminierung tumor- protektiver Ts- und/oder Th2-Zellen auf humoralem plus zellulärem Weg, wie er bisher von anderen Gruppen noch nicht in Erwägung gezogen worden ist, patentrechtlich geschützt. Das ist wichtig, wenn man berücksichtigt, dass in unseren Tierversuchen eine konsequente Ts/Th2-Depletion wichtiger als die Eradizierung letzter Tumorzellen für die endgültige Heilung tumorinokulierter Tiere war.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die angestrebte Substitution der Chemotherapie und/oder Radiotherapie bei hämatologischen Tumoren durch spezifische Mabs und evtl. Leukapherese als präparativer Schritt bei allen hier besprochenen, auf MIS/MIT- und HTT-Technik basierenden Verfahren Die Kombination aus Mab-Behandlung und Leukapherese stellt nicht nur bei Leukämien und Lymphomen, sondern auch bei soliden Tumoren einen wesentlichen präparativen Schritt dar; im letzteren Fall soll sie nicht direkt der Eradizierung von malignen Zellen, sondern eher der Coelimination von tumor-protektiven Ts- und Th2- Zellen dienen. Der besondere Vorteil von Mab-Behandlung, Leukapherese und deren Kombination ist die verhinderte Schädigung reifer und unreifer Immunozyten, die angesichts der ausschlaggebenden Rolle deblockierter Patienten-Immunozyten, primär tumor-spezifischen CTLs, bei der Bekämpfung des Resttumors besondere Bedeutung erlangt . Die Leukapherese kann als kostensparender Schritt auch bei allen Varianten der humoralen Ts/Th2-Eliminierung (siehe auch EP 705 1 1 1 ) eingesetzt werden.

Die von V. Schirrmacher eingeführte Therapie mit niedrigdosierter Kombination aus IL-2 plus IFNgamma sowie die Steigerung der Tumortherapie durch Infizierung der Tumorzellen mit ND (Newcastle Disease) Virus kann durch humorale plus zelluläre Ts/Th2-Depletierung wesentlich verbessert werden.

Eine schnelle Th2- und/oder Ts-Generierung kann durch rezeptor-unabhängige Stimulierung mit PMA TPA + Calonophore/Ionomycin + ROS (H02 + H202)- freisetzende Subst. Bzw. Enzyme erzielt werden, wenn zusätzlich Gs-Agonisten + Glucocorticoide + einige Cytostatika (Cyclophosphamid) + CsA (Rapamycin, FK506) anwesend sind.

Umgekehrt lassen sich Th1 - und/oder Tc-Zellen schnell generieren, wenn statt Gs- Agonisten Gs-Antagonisten, iNOS/cNOS-Hemmer und/oder Gi-Agonisten während der Inkubation anwesend sind. Weitere Modulation lässt sich mit verschiedenen Agonisten der 7 cAMP- bzw. cGMP-PDE-Enzyme erzielen. Unsere neuesten Untersuchungen zeigen, dass sich bei Th1 /Tc-Generierung noch mit NH3 und NH3- Generatoren (z.B.Glutaminase/Glutamin) sowie Triäthanolamin die Effizienz steigern lässt, während RNS (NO und NO-freisetzende Systeme) umgekehrt die Th2/Ts- Bildung fördert. Die so vorgebildeten Th1 /Tc bzw. Th2/Ts-Zellen können in vivo nach T-Depletierung oder Injektion von unreifen T-Zellen zur weiteren klonalen Expansion maßgeschneiderten T-Zell-Subsets führen.

Anmerkung: Ein vereinfachtes Verfahren sieht vor, Th2/Ts-Zellen durch cAMPi- steigende plus cAMP-PDE-hemmende Zusätze zu generieren und in einer 1 :1 - Mischung mit frischen PBLs der gleichen Person zu stimulieren. Ähnlich lassen sich Th1 /Tc-Zellen „im Schnellverfahren" durch Coinkubation mit cAMPi-hemmenden und cAMPi-abbauenden PDE-Agonisten generieren.

Eine besondere „punktuelle"/"klonotypische" Toleranzinduktion kann durch Transfektion von maßgeschneiderten Sekretorzellen mit IL-4/IL-13, IL-10 und/oder ß-TGF erzielt werden. (Alternativ hierzu können diese Sekretorzellen mit Th2-Zellen hybridisiert/fusioniert werden). Der Rezipient (Patient) muß temporär T-depletiert werden, um diese Zellkonstrukte nicht abzustoßen. Die konstitutive Sekretion von Th2-Typ-Cytokinen hilft, die Toleranz gegenüber diesen gentechnisch-manipulierten Zellen allogenen Ursprungs zu induzieren und zu stabilisieren. Die eingesetzten Sekretorzellen können wichtige Hormone und Faktoren (z.B. Dopa, Dopamin, Faktor VIII oder IX) sezernieren.

Mehrere Beobachtungen in unserem Labor sprechen für eine Sonderrolle von Adenosin (u.a. A2/P1 (purinergen) Agonisten bei der Aufrechterhaltung der immunsuppressiven Zustandes. Deshalb werden entsprechende A2/P1 -Antagonisten zur primären Suppressionbekämpfung empfohlen.

Bei Vakzinen jeder Art, d.h. des „klassischen" Typs gegen bakterielle und (retro)virale Erreger bzw. gegen Tumorantigen, aber auch bei den neuesten HTT- und HTT/AIT-Vakzinen wird generell empfohlen, nicht nur gegen einzelne Immuπozyten (z.B. Th2, Ts etc.) in der kritischen Post-Vakzinierungsphase (5-1 2d nach Impfung) aktiv (in vivo) zu intervenieren, sondern zusätzlich durch cAMPi- herabsetzende (z.B. Gs-Rezeptor-Antagonisten) bzw. vorexistentes cAMPi- abbauende PDE-Modulatoren sowie cGMPi-erhöhende Substanzen die Entstehung von Pathogen- bzw. TSA-spezifischen Th2 und/oder Ts zu verzögern. Günstig wirkt sich auch die Injektion von Th1 -Cytokinen (in niedrigen Konzentrationen) in denersten Tagen (1 -6 Tag) nach Vakzination aus.

Bekanntlich gelingt die Immunisierung gegen alle (lösliche) Antigene außer den Alloantigenen in vitro nur nach vorausgegangener in vivo Immunisierung. Mit einem Trick kann erfindungsgemäß die in vivo Präimmunisierung entfallen, wenn in vitro autologe und/oder allogene APCs zuerst mit dem (löslichen) Antigen vorinkubiert und danach fusionier werden. Getestet wurde dieses Prinzip (a) durch Fusion von BSA-gekoppeltem Keratin (aus Wolle), (b) vom Peptid aus pflanzlichen Viren (ebenso BSA-gekoppelt) mit NS1 -Myelomzellen, wobei sich überraschenderweise in 100% der Zellen das fusionierte Antigen nachweisen ließ (Die Fusion wurde durch den Bio-Rad Gene Pulzer durchgeführt).

Handelt es sich hierbei um Zellmembranantigene, z.B. TSTA/TSA, so kann die Fusion der APCs zusätzlich mit den Zellen als Quelle dieser membran-assoziierten Antigene co-fusioniert werden. Vorteilhaft ist, die APCs vor oder während der Coinkubation mit dem Antigen durch Th1 -Cytokine (IFNgamma, IL-1 2, IL-2, etc.) zu stimulieren. Mit Hilfe dieser Hybridzellen, die weiterhin nicht geklonnt vorangereichert werden müssen, kann nun in einem neuen Anssatz mit autologen und/oder allogenen PBLs die in vitro Immunisierung gegen (lösliche) Antigene erfolgen. Der nächste Punkt betrifft eine Ergänzung zu den gen-therapeutischen Techniken. Erfindungsgemäß soll die Fusion von Zellen durch Fusion von isolierten Zellkernen, von einzelnen Chromosomen und von isolierten Genen und Genfragmenten mit ganzen Zellen, mit Zellkernen und/oder einzelnen Genen und Genfragmenten ergänzt werden. Geschützt werden sollen auch alle Typen der Fusion mit Zytoplasten; hierbei handelt es sich um zytoplasmatische Restgebilde ohne Kern, die man technisch durch die Zellbehandlung (Entkernung) mittels Cytokalasin B erzielt, wobei neben den Zytoplasten Kerne mit teilweise verbliebener Kernmembran (Karyoplasten) entstehen.

Bei der Inkubation von diesen Karyoplasten mit Zytoplasten (andere Zellen) oder ganzen Zellen in Gegenwart von PEG kommt es zur Fusion. Somit sind patentrechtlich zu schützen: (a) ZelhZell, (b) Kern:Zell, (c) Kern:Kern, (d) Chromosom: Zeil, (e) Chromoson:Kem,

(f) Chromosom:Chromosom und (g) alle obigen Kombinationen mit gereinigtem Gen (inkl. Entsprechende cDNA) und Genfragmenten.

Eine Variante sieht die Einschleusung fremder DANN via Erythrozyten-Membranen vor, die unter hypotonischen Bedingungen für den Fremdkern bzw. für das Fremd- Chromosom geöffnet und im hypertonen Medium versiegelt werden. Diese Technik könnte bei der Toleranzinduktion gegenüber Donor-MHC von Interesse sein. Ähnliches Ziel verfolgt die Fusion fremder (Donor) Zellkerne bzw. Karyoplasten mit autologen Zellen, oder Zytoplasten, wobei zwei Spwzialfälle genannt werden sollen, die Thymusepithelzelle und die HSC.

Es wird weiterhin vorgeschlagen, bei dem bereits eingeführten Gerät „Gene gun" neben DANN auch Zellkerne (Karyoplasten), Chromosomen und Chromosomfragmente in die Zelle einzubringen. Dadurch brauchte man keine nähere cDNA Charakterisierung und Isolierung.

Eine hochaktuelle Anwendung könnte bei genetischen Erkrankungen durch

Einbringung des fehlenden oder mutierten Chromosoms bzw.

Chromosombruchstücks durch entsprechendes Material aus profizienten bzw. Wildtyp-Zellen vorgesehen werden.

Das bei der MIS- u. MIT-Technik empfohlene Mitomycin C kann durch zwei weitere Produkte, BMY 25282 und BMY 25067, ergänzt und z.T. ersetzt werden.

Die Qualität der MIS- und MIT-Effektorzellen kann erhöht werden (a) durch vorzeitig (2-5d.) abgebrochenen in vitro MLC-Anssatz zur R-spezifischen Allopräimmunisierung der MIS/MIT-Effektoren, (b) durch hochgradige Präinaktivierung der Stimulator (R) Zellen im oben genannten MLC-Ansatz sowie (c) durch ein hohes Responder (D) : Stimulator (R)- Verhältnis (2: 1 bis 10:1 ). Alle drei Maßnahmen bevorzugen die MIS/MIT-Effektoren mit höchster Affinität für R- Zielzellen und ermöglichen somit eine Selektion der effizientesten Effektoren.

Es ist für den Fachmann selbstverständlich, dass bei allen in dieser Patentanmeldung und ebenso den in EP 374 207 und EP 705 1 1 1 erwähnten Fusions- bzw. Hybridisierungsvorgänge alle bekannten Ausführungsformen, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. chemisch, wie mit PEG, physikalisch, wie mit Elektrofusion/Elektroporation, viral etc. gelten angewendet werden können.

Einer der elegantesten Wege zur Toleranzinduktion wäre nach wie vor die Einbringung der Donor-Thymusepithelzelle in den Empfänger-Thymus. Nachdem von der Behandlung der Immundefizienz mit fötalen Thymus Transplantationen (die George 's Syndrome) bzw. mit kultivierten Thymusepithelzellen (verschiedene T- Zell-Defizienzen) bekannt ist, dass organ-spezifisches „Homing" von injizierten Thymuszellen funktioniert, wird empfohlen (a) nach temporärer D-spezifischer Toleranz die D-Thymusepithelzellen im R-Thymus zu etablieren, (b) durch Kern:Zell bzw. Kern:Zytoplast-Fusionierung die D-spezifische MHC in den Thymus einzuschleusen; (c) zudem führt der „gemischte allogene Chimärismus" zur dauerhaften gleichzeitigen Besiedlung des R-Thymus durch R- und D-abstammende Zellen (Sykes, Sachs et al.). Da die Etablierung des gemischten Chimärismus an mehreren Stellen dieser Anmeldung z.T. in Verbindung mit BMT und HSCT behandelt wird, erscheint dieser letzt genannte Weg als der praktikabelste.

Eine weitere Technik zur in vivo Generierung des „gemischten" allogenen Chimärismus" besteht in der in vivo Anwendung von Anti-CD4 Mabs gefolgt von der Infusion reifer PBLs plus unreifer Knochenmark- und Stammzellen (T-depletierte PBMCs). Zur Erzielung des Donor-Typ allogenen Chimärismus werden statt Anti- CD4- die Anti CD3 (oder die Anti-CD4 plus Anti-CD8) Mabs eingesetzt.

Gemischter allogener Chimärismus kann erfindungsgemäß auch durch T-Zell Depletion der Donor PBLs (in vitro) und der Rezipienten PBLs (in vivo) erreicht werden. Statt der Mabs können entsprechende Mab-abgeleitete Immunotoxine verwendet werden.

Ähnlich wie bei der. Organtransplantation eine gleichzeitige Knochenmarktransplantation (BMT) empfohlen wird, kann bei der standardisierten, vom individuellen Patientenmaterial unabhängigen Gentherapie der Einsatz allogener, gentechnisch veränderter Zellen durch vorausgegangene BMT bzw. HSCT geebnet werden. Da die mit myeloablativer Präparation verbundene konventionelle BMT bzw. HSCT durch die mildere MIS/MIT-BM/SC-Technik (beschrieben in der vorliegenden Anmeldung) ersetzt werden kann, gewinnt diese neuartige, nebenwirkungsarme Kombination hohe Aktualität. Um die Nebenwirkungen weiterhin zu minimieren, wird eine neuartige Technik, die sogenannte „klonotypische" HTT-CL bzw. HTT/AIT-CL-Technik empfohlen. Sie wurde möglich, nachdem neue Techniken zur Isolierung von antigen-soezifischen T- Zellen entwickelt worden sind. Hierbei werden T-Zell-haltige Zellsuspensionen in Anwesenheit des interessierenden Antigens inkubiert mit bispezifischen Antikörpern („catch matrix"), die einerseits an die T-Zellen bzw. Leukozyten (CD45R) und andererseits an ein Cytokin (meist IFNgamma oder IL-4) binden, werden die antigenspezifischen T Zellen markiert und mittels eines zweiten Antikörpers (gegen das Cytokin), dem „detection antibody", FACS- oder MACS- sortiert. Durch Fusion mit autologen und/oder allogenen MHC 11 + Zellen (z.B. DCs) entstehen Zellhybride, die nach s.c. oder i.d. Vakzinierung zur Eliminierung der antigenspezifischen T-Zellen führen.

Bei den spezifischen Antigenen handelt es sich um Pathogene, TSTA/TSA, Autoantigene und Allergene. Somit gewinnt diese .neue „klonotypische" HTT- Modifikation hohe Aktualität, nicht zuletzt wegen der besonders niedrigen Komplikationsrate, bei der Behandlung von resttumor- und Metastasenzellen, von bakteriellen und (retro)viralen Infekten (inkl. HIV), ferner von GvHD, von HvGR (Abstoßungsreaktion), bei Organtransplantation und BMT/HSCT, von Autoimmunerkrankungen (AID) sowie von Allergien. Hierbei ist die klonotypische Vakzine bei Tumorpatienten gegen dysregulierte, tumorprotektive Ts- und/oder Th2- Zellen gerichtet. Bei AID dagegen richtet sie sich gegen autoaggressive Tc-Zellen. Bei der Bekämpfung der GvHD wird gegen die alloreaktiven Tc-Zellen des Donors und bei der HvGR-Behandlung gegen solche des Empfängers vakziniert. Bei Allergien richtet sich die HTT-CL Vakzine gegen allergenerkennende T-Zellen, primär des TH2-Subsets. All diese HTT-basierende Modifikationen werden durch vorgeschaltete MIS/MIT-Bahandlung in ihrer Effizienz gesteigert.

Bei Tumorbehandlung wird mit der klonotypischen HTT-Technik in Kombination mit MIS/MIT gleichzeitig ein GvHD-freier GvM (GvL bzw. GvT)-Effekt mit einer rezidivverhindernder Vakzination gegen dysregulierte T-Zell-Subklone kombiniert. Mehr noch, mit Kombination von Hybridzellen , entstanden durch die Fusion (a) von Patienten- Tumorzellen und (b) von seinen Ts/Th2-Zellen (vorselektioniert in Subset oder Klonotyp-spezifischer Weise), beidesmal mit MHC 11 + -Zellen (autologen und/oder allogenen Ursprungs) kann auf optimale Weise gegen Tumorzellen und sie beschützenden T-Zellen vorgegangen werden.

Bei hämatologischen Tumoren kann die Fusion mit MHC 11 + -Zellen (z.B. DCs oder Makrophagen) gleichzeitig beide Typen von Hybridzellen in einem Schritt erzeugen; wichtig hierbei ist eine Art „katalytische" Wirkung geringster Anzahl an Hybrid- Zellen, weswegen sie weder vorangereichert noch klnonal post-expandiert werden müssen; mehr noch, sie können gar mit MitomycinC vorbehandelt werden, ohne an Wirksamkeit zu verlieren.

Ein Sonderfall der klonotypischen HTT-Vakzinierung betrifft die Impfung gegen allospezifische T-Zellen, die einen eleganten, nebenwirkungsarmen Weg zur D : R- Toleranz ermöglicht. Im Falle von Organtransplantationen wird die Toleranz der Empfänger-T-Zellen gegenüber Donor, bei BMT und HSCT dagegen, eine gegenseitige D:R- bzw. R:D-Toleranz angestrebt. Die neue Technik der Toleranzinduktion basiert auf den oben beschriebenen Prinzip der klonotypischen HTT-Vakzinierung, wobei bei Organtransplantattonen in vitro zuerst im „one way" MLC mit R als Responder- und D als inaktivierter Stimulatorzellen die Effektorzellen von Art der für die Organabstoßung erantwortlichen TC-Zellen prägeneriert und nach Fusion mit autologen und/oder allogenen APCs (z.B. DCs) zur Empfänger- Immunisierung gegen seine eigenen, das Fremdorgan-abstoßenden T-Subsets eingesetzt werden. Bei BMT und HSCT müssen dagegen in 2 getrennten „one way" MLCs, einmal, wie eben für Organtransplantation beschrieben und einmal im MLC mit D als Responder- und R als inaktivierte Stimulatorzellen die Fusionspartnerzellen für autologe und/oder allogene APCs prägeneriert werden. Mit dieser doppelten HTT-Vakzinierung wird bei BMT und HSCT sowohl gegen GvHD als auch gegen GvGR vorimmunisiert.

Die Vakzinen generell (inkl. HIV-Vakzine) können durch MIT-Effektoren verbessert werden. Das basiert auf der Beobachtung, dass allein durch den Zusatz von allogenen Zellen die präexistierende Toleranz gegen ein Modellantigen gebrochen werden kann. Das gleiche Prinzip (Zusatz von MIT-Effektoren) kann sich auch bei der oben besprochenen in vitro Immunisierung gegen (lösliche) Antigene unterstützend auswirken.

Eine wichtige neue Erkenntnis betrifft den Ersatz der konventionellen BMT und HSCT, die mit myeloablativer Empfängerpräparation einhergehen, mit dem den Patienten viel weniger belastenden Transfer von T-depletierten PBMCs, kombiniert mit nicht ablativer Empfänger Präparation.

Durch Einsatz von Antikörpern gegen gewisse Vorstufen von reifen T-Zellen kann erfindungsgemäß die unerwünschte frühzeitige Reinduktion der Toleranz gegenüber restlichen Tumor- und Metastasenzellen verhindert werden. Hierzu eigenen sich besonders Mabs gegen T-Differenzierungsantigene, die nur auf gewissen Präkursor- Subsets exprimiert werden , so z.B. Anti-T6-, Anti-T9-, Anti-T10- und/oder Anti- T1 1 -Mabs.

Auch bei den polyklonalen Ak (ATG, ALG, ALS etc.) gibt es solche, die diese Vorstufen „miterfassen" oder aber „übersehen", was bei der humoralen Komponente der Patientenpräparation (z.B. für die MIS/MIT- oder HTT- Behandlung) mitberücksichtigt werden muß.

Bei autologen BMT und HSCT kann das Hauptproblem, die ineffiziente Beseitigung („purging") kontaminiserender maligner Zellen gelöst werden, indem die unreifen, für Toleranz gegenüber Resttumorzellen empfänglichen Knochenmark- bzw. Stammzellen durch immunkompetente, toleranz-resistente(re) MIS-Effektoren, gefolgt von BMC- bzw. HSC-Reinjektion, ersetzt werden. Die kontaminiserenden Tumorzellen werden während der MIS-Präparation (mit Mitomycin C etc.) unschädlich gemacht.

Aus den bisherigen Erfahrungen im Tiermodell sowie z.T. in der Klinik lässt sich erfindungsgemäß folgendes Mehrstufen-Therapieschema für Tumorbehandlung aufstellen:

(a) Zuerst müssen präexistente, tumor-protektive Ts- und/oder Th2-Zellen radikal in vivo eliminiert werden, wobei aus den Tierversuchen klar hervorgeht, dass die konsequente Ts/Th2- Eliminierung für die Tumorregression wichtiger ist als das unerreichbare Ziel der Aufspürung und Eliminierung der letzten Resttumorzelle. Die radikale Ts/Th2-Eliminierung gelingt nur durch Kombination der humoralen (mit Mabs) plus zellulären (mit MIS/MIT-Effektoren) Ts/Th2-Depletion.

(b) (b) Danach folgt die Phase der APC-Umprogrammierung, die mit MIT-Effektoren und/oder pharmakologisch (durch cAMP/cGMP-herabsetzende und Ts Th2 einseitig hemmende Agonisten bzw. Antagonisten gewisser immunologischer und nicht typisch-immunologischer Rezeptoren gelingt (in feinsten Details in der vorausgegangenen Anmeldung des Gleichen Anmelders beschrieben !).

(c) Nun wird mit 2 Typen der HTT-Zellkonstrukte gleichzeitig oder hintereinander vakziniert, und zwar mit jenen, basierend auf TumorzelkAPC- und denjenigen, beruhend auf Ts/Th2 : APC-Hybriden. Wichtig ist, dass auch während der beiden Typen von HTT-Impfung die Patienten-Makrophagen durch allospezifische Signale zusätzlich im Th1 -Aktivierungszustand gehalten werden. Dies kann durch gleichzeotige Präsenz von MIT-Effektoren, die optimalerweise alle 3-6 Tage durch neue MTT-Effktoren anderer Spender (D1 ,D2,D3 etc.) ersetzt werden, geschehen; in solchem Fall können die APC-Fusionspartnerzellen autologen Ursprungs sein. Es empfiehlt sich trotzdem, Zellkonstrukte mit autologen pluss allogenen MHC II + - Zellen, oder aber die Kombination aus Hybridzellen, beruhend auf autologen APC plus solchen, basierend auf allogenen APCs für die HTT-Vakzine vorzusehen.

Die beschriebene Behandlung kann durch ex vivo klonal postexpandierte tumorspezifische CTLs ergänzt werden, wobei dieser Teilschritt gleich nach MIS- Behandlung erfolgen soll. Hierbei gilt, wie oben ausgeführt, dass die „Qualität" dieser tumoriziden CTLs gesteigert wird, wenn sie dem Patienten erst nach der HTT-Impfung (gegen Tumorzellen allein oder gegen Tumor- plus Ts/Th2-Zellen) entnommen, postexpandiert und reinjiziert werden. Das oben beschriebene Therapienschema ist deshalb ein besonderes, da es sowohl gegen Tumorzellen als auch gegen deren Protektorzellen gerichtet ist und da es später Rezidive durch gleichzeitige Impfung gegen beide „Akteure" effizient verhindern könnte. Bei der einleitend erwähnten in vivo Depletierung der Patienten- T-Zellen mit Anti-CD3-Mabs sei ergänzend erwähnt, dass die humorale in vivo T- Depletierung mit allen Mabs und Mab-abgeleiteten Immunotoxinen sowie Mab- basierenden Fusionsproteinen durchführtbar ist, wie sie in einer der vorausgegangenen Anmeldungen des gleichen Anmelders im Detail beschrieben und geschützt worden sind. Auch die in der gleichen Anmeldung empfohlene Kombination mit Immunstimulanzien, BRMs, Cytokinen etc. hat volle Gültigkeit im Kontext mit dem hier beschriebenen Mehrschrittverfahren.

Eine vereinfachte Version sieht vor, dass die klonotypische HTT-Vakzinierung gegen Tumor (TSTA/TSA) und/oder tumor-protektive Ts/Th2-Zellen von einer gleichzeitigen APC-Costimulierung mit allospezifischen Signalen begleitet werden muß, was durch die Kombination der Vakzine mit MIT-Effektoren erreicht wird.

Da bei der Bildung der Lipoproteinpartikeln oft pro Vesikel nur 1 ApoE-Molekül vorgesehen ist, könnte ApoE bei diätetisch oder anders bedingten Hyperlipidämie zur Mangelware werden. Auch die Tatsache, dass ApoE u.a. von Makrophagen sezerniert wird und dass das Cholesterol mit ApoE-beladen aus dem Makrophagen befördert wird, spricht für eine Sonder-stellung dieses Apoproteins bei der Stabilisierung der Plasmalipide. Deshalb wird empfohlen, die ApoE-codierende cDNA in autologe oder allogene Zellen zu transduzieren, im letzteren Fall nach präinduzierter Toleranz gegenüber Donor (der genetisch prämanipulierter Sekretorzelle).

Mit H0₂-reduzierenden, H₂0₂-erhöhenden, iNOS/cNOS-stimulierenden und cGMP- PDE-hemmenden Substanzen kann allein oder in Kombination mit Cytostatika tumoristatisch bzw. tumorizid eingegriffen werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können auch zusätzlich zu den in EP 705 1 1 1 erwähnten Pharmaka zur Modelierung von „second messengers" und somit von regulatorischen Immunozyten bei verschiedenen Krankheiten, die im Detail in in EP 705 1 1 1 beschrieben worden sind, Modulatoren verschiedener cAMP- und cGMP- spezifischen Phosphodiesterasen (PDEs) eingesetzt werden. Hierbei interessiert oft die Kombination des cAMP- bzw. cGMP-generierenden Systems mit Hemmern der cAMP- bzw. cGMP-spezifischen PDEs, da auf diese Weise die Konzentration des cyklischen Nukleotids und seine Wirkungsdauer erhöht werden können. Von Interesse ist auch der Abbau des präexistenten intrazellulären cAMP- bzw. cGMP- Levels durch Stimulatoren entsprechender PDEs. Ein weiterer Vorschlag zur effizienterer Steuerung der Immunozyten-Funktion ist die Abschaltung der lmmunozyten(hyper)aktivität durch kombinierte Behandlung mit NO-freisetzenden Medikamenten plus Hemmern der cGMP-spezifischen PDE (d.h.PDE V). Auf diese Weise lassen sich z.B. autoaggressive T-Zellen bei AID bzw. alloaggressive CTLs bei GvHD günstig beeinflussen. Die cAMPi-erhöhenden und auf cGMPi-Überhöhung basierenden Hyperpolarisierungseffekte lassen sich zum schnellen Abbau der Zeilüberaktivierung bündeln. Auf der anderen Seite sei die oben erwähnte patentrechtlich geschützte Pharmakaliste um die Okadaische Säure (okadaic acid) ergänzt, die durch Hemmung der Typl und II Phosphatasen zur weiteren Effizienzsteigerung der MIS/MIT-Effektoren beitragen könnte.

Da Laborversuche gezeigt haben, dass ß-AR-Antagonisten wie Propranolol die IL-10- Sekretion durch Makrophagen verhindern und somit die IL-12-Synthese sowie die Th1 -Aktivierung deblockieren, gilt diesen und anderen Antagonisten von cAMPi- erhöhenden, Gs-gekoppelten Rezeptoren besonderes Augenmerk, speziell in de labilen Phase nach Tumorexcision bzw. Chemo(radio)therapie (APC- Umprogrammierungsphase).

Eine wesentliche Verbesserung konventioneller Therapien von hämatologischen Tumoren (Lymphomen/Leukämien) impliziert erfindungsgemäß folgende Schritte:

(a) Stufenweiser Ersatz von Chemo(radio)therapie durch Einsatz von mono- und polyklonalen Antikörpern allein oder kombiniert mit Leukapherese (beide Verfahren müssen gegebenenfalls mehrfach wiederholt werden).

(b) Zusätzliche Anwendung von panT(CD3) und/oder Anti-CD4 + Anti-CD8-Mabs oder entsprechender polyklonaler Ak (ATG,ATGAM,ALG etc.), wobei Kombination mit Anti-T6-, Anti-T9-, Anti-T10- und/oder Anti T1 1 -Mab oder aber polyklonale Ak, die auch T-Präkursoren miterfassen, zu empfehlen sind. Die dysregulierten T-Zell- Subsets, die u.U. die Hauptschuld an der Entstehung und/oder Aufrechterhaltung der hämatologischen Tumoren, auch des B- oder des myeloischen Typs, tragen, müssen radikal, d.h. auf humoraler (mit Abs) und zellulärer (mit MIS/MIT-Effektoren) Ebene entfernt werden, und zwar bei allen, nicht nur T-Zell-basierenden Tumorarten.

(c) Danach kann die gegen Tumor- und tumor-spezifischen Ts/Th2-Zellen gerichtete HTT-Vakzine eingesetzt werden, wobei die Zellfusion durch Zusatz von autologen und/oder allogenen MHC Il +-Zellen (z.B. DCs) zu den Patienten-PBLs in einem Schritt erfolgen kann.

(c) Hinzu können weitere effizienz-steigernde Schritte kommen, wie bei der Behandlung von soliden Tumoren präzisiert (s.o.).

Bei non-myeloablativer Präparation des Empfängers (Patienten) z.B. mit Chemo- oder Radiotherapie lässt sich nach Infusion einer ca. 1 : 1 -Gemisches aus reifen und unreifen Donorzellen mit feindosiertem Anti-T bzw. Anti-T2 +Anti-T8-Mab allogener Chimärismus des Donor-Typs, aber auch des gemischten Typs erzeugen. Wenn die genauen Mab-Konzentrationen klinisch herausgefunden würden, hätten sie eine generelle Gültigkeit, d.h. wären bei verschiedenen Personen gleich oder ähnlich, so dass eine Standardisierung des Verfahrens möglich wäre.

Der besondere Vorteil der hier vorgeschlagenen Reihenfolge : „temporärer Donor- Typ-allogener Chimärismus" (zur Eradizierung der Resttumor- und Metastasenzellen), gefolgt vom „gemischten allogenen Chimärismus"( zwecks Etablierung der D:R-Toleranz) gegenüber der konventionellen, klinisch praktizierten DLI-Behandlung nach Post-BMT-„gemischtem allogenen Chimärismus" ist (a) GvHD- Verhinderung und (b) optimale T (und B) Zell:APC-Kooperation.

Um die zur Etablierung des „gemischten Chimärismus" eingesetzte 1 : 1 "-Mixtur aus D- und R-MIS-Effektoren noch präziser einzustellen, empfiehlt sich ein R:Dx- und ein D:Rx-one way-MLC, deren Vergleich es ermöglicht, den Korrekturfaktor zu ermitteln. Die 1 :1 -Mixtur aus D- und R-MIS-Effektoren kann ohne oder mit 5-7 tägiger Vorinkubation eingesetzt werden, wobei die MIS-Präparation aus den D- und R-PBMCs erst nach dieser Vorinkubation erfolgen soll.

Da Ornithin, Arginin und Putrescin die Tc-Generierung hemmen, sind sie bei (a) Toleranzinduktion und (b) BMT/HSCT/PBPCT neben anderen Immunsuppressiva als Th2- bzw. Ts-stimulierende Zusätze von Interesse.

Ein effizientes Instrumentarium gegen angehende GvHD bzw. HvGR nach BMT und HSCT wären Suspensionen (eingefroren !) aus R-PBLs bzw. R-MIS-Effektoren, die zuvor gegen D allopräimmunisiert worden sind, sowie solche aus D-PBLs bzw. D- MIS-Effektoren, die zuvor gegen R allopräimmunisiert worden sind. Zusätzlich könnten 3rd party PBLs, die (a) gegen R (b) gegen D allopräimmunisiert worden sind, in Bereitschaft gehalten werden.

Alle genetische Erkrankungen, die grundsätzlich mit (allogener) Knochenmark- oder Stammzelltransplantation „korrigierbar" sind, die aber aufgrund der potentiell lethalen Komplikation, welche mit konventioneller BMT und HSCT generell verbunden sein kann, praktisch (mit wenigen Ausnahmen) nicht durchgeführt wird, können nun nach der Ausarbeitung der nebenwirkungsarmen, mit nichtablativer Patientenpräparation kombinierter BMT- und HSCT-Ersatzverfahren, die z.T. Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind, problemlos und risikofrei klinisch angegangen werden. Die Liste dieser genetischen Erkrankungen kann speziellen Monographien, aber auch Immunologie-Lehrbüchern wie jenem von Stites und Stobo entnommen werden. Auch die mehrfach als sinnvoll erkannte Kombination aus Organtransplantation und Knochenmark-Transplantation (des gleichen Donors), die sich wegen des potentiell lethalen Ausgangs der klassischen KMT ebenso klinisch nicht durchsetzen konnte, gewinnt durch die nebenwirkungsarmen Alternativverfahren zur konventionellen KMT neue Aktualität.

Wenn vorhanden, kann die cDNA bzw. die sogenannte „naked DNA", kodierend das interessierende Antigen (z.B. Tumorantigen,Autoantigen, Pathogen, Allergen etc.), in autologe und/oder allogene MHC II + -Zelle gebracht werden (als Plasmid-DNA, frei oder gebunden an Apatit oder eingeschlossen in (kationische) Liposomen). Nun kann sie als Vakzine s.c, i.d. oder i.m. eingesetzt werden bzw. mit verschiedenen HTT-, HTT/AIT- und/oder HTT-CL (HTT/AIT-CL)-Hybridzellen kombiniert werden.

Diese bei Tumor, AID, Allergien, Infektionen und Atherosklerose (induzierendes Antigen, hier: Clamydia pneumoniae) einzusetzende Vakzine kann bei Fehlen der spezifischen cDNA durch Fusion des cDNA-enthaltendes Zellkerns bzw. des entsprechenden Chromosoms, oder aber der intakten, cDNA-haltigen Zellen mit der autologen und/oder allogenen MHC II -4- -Zelle fusioniert werden, wobei man z.B. nicht nur das 1 : 1 Mischverhältnis andererseits wählen und untereinander kombinieren kann. Die gleiche Technik kann man auch bei doppelter Vakzinierung gegen Tumorzelle und gegen tumor-spezifischen Ts- bzw. Th2-Zelle, allein oder kombiniert mit „konventioneller" Vakzine (basierend auf Hybridzellen aus APC plus Tumor- bzw. APC plus Ts/Th2-Zelle, verwenden.

Generell gilt, dass bei der Herstellung der Hybridzellen aus Tumorzelle plus APC neben dem Mischverhältnis 1 : 1 auch z.B. 3: 1 und andererseits 1 :3 vorsehen kann, was zusätzliche Vorteile mit sich bringen kann. Es kann aber auch cDNA einfach vor oder nach Fusion der Tumorzelle mit der APC zugesetzt werden, um die Antigenität des Konstrukts weiterhin zu erhöhen.

Eine besondere Technik sieht vor, die Rezipienten-PBLs bzw. T-Zellen gegen Donor A,B,C,D etc. in getrennten MLC-Ansätzen zu präsensibilisieren, die aktivierten Rezeptor-Antidonor-T-Zellen mit verschiedenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Hormonen etc. zu transduzieren und in den Rezipienten zu reinjizieren. Später kann man durch (inaktivierte) PBLs des Donors A,B,C etc. die gewünschte Cytokinsekretion in vivo induzieren.

Die klinische Erfahrung zeigt, dass bei wiederholter Injektion von MIS/MIT- Effektoren jeweils anderer Herkunft (DonorA,B,C etc.) immer auch eine wiederholte Vorbehandlung mit Mabs erfolgen sollte, also MIS/MIT-Effektoren immer mit Mab- Vorbehandlung kombiniert werden sollten. Eine weitere Verbwsserung betrifft die wiederholte Injektion der Zellhybride aus Patienten-tumorzellen und APVs (z.B. DCs) verschiedener, möglichst stark histoinkompatibler Spender A,B,C etc., wobei dieser Schritt mit ex vivo präexpandierten tumor-spezifischen CTLs kombiniert werden kann. Auch kann der jeweilige Spender zuvor mit IL-12 oder IL-2 und/oder IFNalpha vorbehandelt sein, um die MHC- und Integrinexpression auf der allogenen MHC II + -Fusionspartnerzelle zu erhöhen.

Patentrechtlicher Schutz wird auch für alle Verbesserungen (a) der Tumortherapie mit tumor-spezifischen Mabs und (b) der zellulären Tumortherapie mittels LAK-, TIL- und/oder CTL-Effektorzellen angestrebt, bei denen die hemmende Wirkung von tumor-spezifischen Ts und/oder Th2-Zellen erfindungsgemäß mit der Kombination aus (a) Anti-CD3- bzw. Anti-CD4 plus Anti-CD8-Mabs plus (b) MIS/MIT-Effektoren überwunden wird.

Eine weitere Variante der HTT-Technik sieht vor, die Tumorzellen des Patienten nicht nur mit DCs, sondern auch mit Makrophagen und/oder B-Zellen autologen und/oder allogenen Ursprungs zu hybridisieren.

Alle Ausführungsformen, der HTT- und/oder MIS-Effektoren können auch mit Zellkonstrukten, basierend auf immortalisierten spezialisierten Subklassen (z.B. Th1 , Th2, etc.), kombiniert werden.

Durch Erhöhung der H₂0₂ ^' und/oder Herabsetzung der NO-Konzentration kann erfindungsgemäß (a) die Toleranzdurchbrechung (b) die Th2 : Th1 - bzw. Ts : Tc- Interkonver-sion, sowie (c) eine Verbesserung des Ag-spezifischen „priming" und „boosting" erzielt werden. Darum sind alle entsprechenden H202- bzw. NO- Modulatoren von Interesse.

Die H₂0₂-Erhöhung kann via H0₂-Synthese induziert werden, wobei verschiedene Stimulanzien der NADPH-Oxidase von Interesse sind: (a) lösliche Stimulanzien, wie PMA(1 -2ug/ml), N-Formyl Met Leu Ph (0,5-5uM),Ca-lonophore A23187 (10uM), LPS(10ug/ml), TNFalpha (250mg/ml), IFNgamma (3.103 U/ml), AA (Arachidonsäure)(50uM); (b) partikuläre Stimulanzien, wie hitzeaggregiertes IgG (1 ,5mg/ml), zymosan (1 ,5mg/ml).

Durch Fusion von reifen, spezialisierten Zellen (z.B.Thl , Th2, Makrophagen, NK- Zellen, B-Zellen etc.) mit (a) embryonalen (b) hämatopoietischen Stammzellen entstehen langlebige, aber nicht transformierte Zellen. Ähnliches gilt für die Fusion mit einigen langlebigen, aber nicht transformierten Fibroblasten (zellinien). Durch Fusion von gewebe-spezifischen Zellen, z.B. Herzmuskelzellen, Leberzellen etc. mit embryonalen oder hämatologischen Stammzellen ist erfindungsgemäß die Züchtung von langlebigen Hybridzellen mit gewebespezifischen und multipotenten/tutipotenten Eigenschaften möglich.

Es wird erfindungsgemäß empfohlen, die Transfektion einzelner Zytokine in die Zielzelle (Tumorzelle, TIL, Fibroblasten) durch Fusion dieser Zielzelle mit spezialisierten T-Zell-Subsets (primär Th1 -Zellen) zu ersetzen. Hierbei sollten die Zytokin-sezernierenden Th1 -Partnerzellen zuvor aktiviert werden, z.B. mit inaktivierten allogenen PBLs.

Die konventionelle Gentherapie kann verbessert werden, wenn costimulatorische Strukturen wie B7.1 /B7.2, CD40 etc. mit MHC Il-Coexpression kombiniert werden. Auch ist es vorteilhaft, die Transfektion mit Cytokinen mit der Transduktion von costimulatorischen cDNA (inkl. die MHC Il-Expression ) zu kombinieren. Die mittels viraler Vektoren erzielte Transduktion kann z.T. durch Kern : Zeil bzw. Zell:Zell-Fusion ersetzt werden.

Das Problem der ex vivo Postexpandierung (a) der embryonalen (b) der hämatologischen und (c) der adulten Stammzellen ohne die unerwünschte (partielle) Zelldifferenzierung kann durch H02-Zufuhr, z.B. durch XOD/Xanthin(Hypoxanthin) (bei gleichzeitiger H202-Eliminierung mittels Catalase oder GSH-Peroxidase) gelöst werden.

Die Fusion mit (a) embryonalen (b) adulten (c) hämatologischen Stammzellen verleiht den Hybridzellen Langlebigkeit bzw. ungehinderte Vermehrung ohne Malignität. Die Fusion defizienter Zellen (z. B.Zellen mit Gendeletion oder Punktmutation) bei genetischen Erkrankungen (deren Zahl um 4000 (!) liegt) (a) mit kernhaltigen Präkursorzellen von Erythrozyten (b) mit (präinaktivierten) K562-Zellen (MHC I und ll-negativ) und (c) mit MHC I- und MHC II- nicht exprimierenden profizienten bzw. Wildtyp-Zellen allogener Herkunft, bei denen die entsprechenden MHC -kodierenden Gene entweder durch „gene targeting" oder „gene knock-out" inaktiviert worden sind, führt zu Hybridzellen, die nun in heterozygoter Weise das fehlende Gen aufweisen. Diese Zellhybride können die zeitaufwendige und mit vielen zusätzlichen Problemen behaftete Transfektion des fehlenden Gens mittels retroviraler Vektoren ersetzen.

Nach einer speziellen Variante werden APCs in vivo durch wiederholte Injektion von Anti-CD8-vorbehandelten MIS- bzw. MIT-Effektoren von Donor A,B,C etc. im Sinne von Th1 -Typ-Cytokinen programmiert bzw. umprogrammiert. Wenn der Zelltod der MIS- bzw. MIT-Effektoren auf 3-4 Tage vorprogrammiert ist, werden die APCs von IL-2 (und IFN gamma), aber nicht IL-4, IL-13 oder IL-10 kontinuierlich „umspült". Die bisherige Erfahrungen im Tiermodell und in der Klinik zeigen generell, dass moderne Verfahren zur Immunbekämpfung ohne gleichzeitige oder vorausgehende radikale in vivo Eliminierung der tumor-protektiven Ts- und/oder Th2-Zellen nur zur temporären Besserung (Tumorregression, Metastasenrückgang) führen. Deshalb soll sowohl jede Form der Immunstimulierung (z.B. mit BRMs, Cytokinen etc.) als auch jedes der neuen immuntherapeutischen Verfahren (z.B. die LAK/IL-2, die TIL/IL-2-, alle Varianten der zellulären/adaptiven Immuntherapie mit in vitro vorselektionierten und postexpandierten tumor-spezifischen CTLs etc.) grundsätzlich mit radikaler Ts/Th2-Prädepletion kombiniert werden, wobei alle Kombinationen mit diesen Ts/Th2-depletierenden Verfahren wie MIS/MIT und Ts-, Th2-, T4-, T8-, T3 etc. spezifischen Mabs als Gegenstand der vorliegenden Anmeldung uui betrachten sind. Der besondere Vorteil einer Kombination bestehender Antutumortherapien mit der Ts/Th2-Coeliminierung liegt darin, dass hierdurch (a) temporäre Effekte durch Langzeitwirkung ersetzt und (b) auch Patienten in einer späteren (terminalen) Phase der Krankheit der Therapie zugängig gemacht werden.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind auch alle Kombinationen bestehender immuntherapeutischer Verfahren mit Techniken, die spätere Rezidive verhindern, zu denen z.B. die Vakzinierung gegen die krankheitsinduzierenden bzw. - aufrechterhaltenden T-Subsets, d.h. die Ts- bzw. Th2-Zellen bei Tumor, die autoaggressiven und allergenspezifischen T-Subpopulationen bei AID bzw. Allergien etc. gehören (HTT-AIT Technik).

Bei hämatologischen Tumoren sieht eine stark vereinfachte Therapievariante vor, die PBLs von Kranken mit denen eines oder mehrerer Spender in vitro in verschiedenen Verhältnissen (von 0,1 : 1 über 1 :1 bis 1 : 0,1 ) zu mischen, mit zelltod- vorprogrammierenden Substanzen, z.B. Mitomycin C zu behandeln und in den PBMCs- bzw. T-Zell-depeltierten Patienten zu reinjizieren. Der therapeutische Effekt kann durch (präalloimmunisierte MIS/MIT-Effektoren sowie durch verschiedene HTT- Vakzinen noch weiterhin verstärkt werden.

Die Tatsache, dass naive allospezifische T-Zellen in der ersten Phase, d.h. 1 -3 Tage nach Aktivierung nur IL-2 und etwas IFNgamma sezernieren, wird zur APC- Reprogrammierung im Th1 -Sinne z.B. nach Tumorexcision, Chemo- und Radiotherapie praktisch genützt, wobei auf 2-4 tägige Lebenserwartung vorprogrammierte T-Zellen oder PBLs von Spender A,B,C,D... mit oder ohne T8- Prädepletierung in vivo eingesetzt werden.

Da bei AIDS-Patienten und bei Patienten mit fortgeschrittenemTumor die Immunabwehr generell unterdrückt ist, so dass auch die Immunantwort gegen Neoantigene (z.B. neue Infekte) beeinträchtigt ist, wird erfindungsgemäß bei allen Krankheiten, die mit chronischem Verlauf verbunden sind, vorgeschlagen, von Zeit zu Zeit durch Mabs plus MIS-Effektoren die dysregulierten oder unerwünschten T- Zellen in vivo zu eliminieren, die APCs mit MIT-Behandlung sowie mit Gs-Blockern, Ca-Antagonisten und NOS-Hemmern in subklinischen Dosierung umzuprogrammieren und mit niedrigdosierten BRMs den nun deblockierten Immunapparat des Patienten zu stimulieren. Bei dieser Restimulierung können auch das ROS/RNS-Verhältnis korrigierenden Präparate wie XOD/Xanthin (Hypoxanthin), GOD/Glucose oder diverse, subdosiertes ROS-freisetzende Substanzen eingesetzt werden.

Bei Krankheiten, die mit Knochenabbau (Osteoporose, Paradontose etc.) zusammenhängen, kommt es zur erhöhten Osteoklasten-Aktivität. Theoretische Überlegungen sprechen dafür, dass eine APC-Umprogrammierung von der Suppressor-Monozyt- zur tumorizider/bakterizider Effektor-Funktion, d.h. eine Typ2(Th2) : Typ1 (ThD-Interkonversion der Osteoklast : Osteoblast-Umwandlung entspricht. Deshalb wird zur Remineralisierung bei medizinischen und stomatologischen Erkrankungen der Einsatz (a) von MIT-Effektoren (nach vorausgegangener T-Zell-Depletierung in vivo) (b) von Th2:Th1 - bzw. Ts:Tc- umprogrammierenden Systemen, wie XOD/Xanthin(Hypoxanthin) bzw. GOD/Glucose (c) von Gs-Blockern + Gi-Agonisten, Ca-Antagonisten und NOS-Hemmern sowie von allen übrigen Vertretern dieser Th2:Th1 - bzw. Ts:Tc-modulierenden Substanzklasse empfohlen.

Wie bereits in einer früheren Anmeldung des Anmelders (EP 374 207) erwähnt, wird nicht nur die Rezeptor-Subtyp-spezifische Steigerung der „second messengers" (cAMP, cGMP, Cai etc.), sondern auch eine generrelle Herabsetzung mehrerer „Hintergrund-Signale" durch gleichzeitige Blockierung mehrerer Rezeptoren samt allen Rezeptor-Subtypen empfohlen. Dieses „Herausschneiden" bzw. „Filtrieren" unspezifischer „Hintergrund-Signale" kann mit gezielter Unterdrückung bzw. Aktivierung gewünschter immunrelevanter und nict-immunologischer Rezeptoren bzw. Rezeptor-Subtypen kombiniert werden. Beispiel ist die gleichzeitige partielle Hemmung der alphal -, alpha2-, ß1 - und ß2-Adrenozeptoren oder der H1 - H2-Histaminrezeptoren, wodurch die Hypoergie • oder Anergie der immunkompetenten Zellen durch Überaktivierung verhindert wird. Es gibt Anzeichen dafür, dass die Zelldeblok-kierung durch Herabsetzung überschüssiger „Hintergrund- Signale" zur Th2:Th1 - bzw. Ts:Tc-Umprogrammierung führt.

Die in der früheren Anmeldung EP 705 1 1 1 im Detail besprochenen Hybridzellen sollen um 2 weitere Zellkonstrukte erweitert werden: (a) der erste neuartige Zellkonstrukt besteht aus Th1 - plus nicht MHC-restringierten Tc/CTL-Zellen (b) der 2. Zellkonstrukt ist aus Th1 und APC aufgebaut. Ein weiterer Weg zur Toleranzinduktion besteht in der Generierung von allotoleranten Donor-spezifischen Rezeptor-T-Zellen (bei Organtransplantationen) bzw. von gegenseitig toleranten T-Zellen (bei KMT), indem man in vitro reife T- Zellen bzw. PBLs des einen Partners mit unreifen B-Zellen des anderen Partners vorinkubiert (Veto-Effekt). Auch die Coinkubation von APC-depletierten Donor- und Rezipient-PBLs führt zur Generierung von allotoleranten T-Zellen. Eine Variante sieht vor, die T-depletierten PBLs von Donor und Rezipient mit einem 1 : 1 -Gemisch aus Donor- und Rezipient-abgeleiteten MIS-Effektoren zu versehen und in den Rezipienten zu injizieren, wobei dessen immunkompetente PBMCs in vivo prädepletiert werden müssen. Die hier besprochenen Wege zur Toleranzinduktion können untereinander, aber auch mit anderen, in der vorliegenden Anmeldung diskutierten Verfahren zur Toleranzinduktion kombiniert werden, wodurch die Effizienz zusätzlich gesteigert werden könnte.

Die Tatsache, dass die Kreuzung von ras-transgenen Mäusen mit myc-transgenen Mäusen zur Expression beider Onkogene in den Nachkommen führt, lässt den Schluß zu, dass bei der Fusion zweier Zellen mit je einem typischen (dominanten) Merkmal Hybridzellen entstehen, die beide gewünschte Merkmale exprimieren. Diese Tatsache ermöglicht erfindungsgemäß die Umgehung komplexerer Transfektionen (z.B. mit 3 oder mehr Cytokin-cDNAs) durch Hybridisierung zweier Zellen, prätransduziert mit je 1 -2 Cytokinen oder aber die sonst nicht realisierbare Einbringung von mehr als 4-5 Cytokin-cDNAs. Auf diese Weise könnten z.B. die costimulatorischen Strukturen zusammen mit MHC II in die autologe Tumorzelle transduziert oder aber Konstrukte aus Cytokin-sezernierenden plus costimulatorische Strukturen exprimierenden Partnerzellen gebildet werden, die bisher wegen technischer Probleme nicht realisierbar waren.

Eine besonders schnelle, rezeptor-unabhängige Stimulierung von Immunzellen mit partieller Th2 : Th1 - und Ts : Tc-Umprogrammierung ist von der Kombination (a) von ROS/RNS-Modulatoren wie XOD/Xanthin (Hypoxanthin) + SOD und/oder Ca lonomycin, mit (b) sub-dosoerten Entkopplern der Atmungskettenphosphorylierung (z.B. DNP, Fettsäuren, ADP) zu erwarten.

Die HTT-Effektoren können durch Xenogenisierung der einzelnen Partnerzellen, primär der autologen und/oder allogenen APCs oder aber der Hybridoma- bzw. Triomazellen weiterhin in ihrer Effizienz gesteigert werden. Zur Xenogenisierung eignen sich alle in der Literatur, z.B. in der „Tumorimmunologie" von Warnatz beschriebenen Verfahren. Alternativ hierzu können heterologe Zellen als zusätzliche Fusionspartnerzellen zwecks Xenogenisierung der Zellkonstrukte eingesetzt werden.

Die Fusionstechnik könnte auch bei der Züchtung neuer Pflanzenarten partiell oder ganz die Transfektion der pflanzlichen Keim- bzw. Samenzellen mit Genen z.B. für höhere Resistenz gegen Trockenheit, Frost etc. ersetzen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass die resistenz-kodierende cDNA nicht bekannt sein braucht.

Die neuen Erkenntnisse unserer Gruppe über die Rolle des H02/H202-Quotienten bei der Prolifβration vs. Differentiation der Zelle ermöglichen erstmals die Generierung von Zellen, die zwar eine erhöhte Proliferation aufweisen, jedoch nicht tumorigen sind. Dieses Ziel wird durch vorprogrammierte (konstitutive) leichte Erhöhung der H02-Synthese und/oder reduzierte H202-Generierung erreicht, was durch gentechnologische Manipulierung der Enzyme MnSOD, CuZnSOD, Katalase und/oder GSH-Peroxidase erreicht werden könnte. Durch diese kontrollierte Steigerung der Proliferationsrate könnten Zellen generell in vitro länger am Leben gehalten und spezialisierte Zellen (Th1 ,Th2,Tc,Ts) „stabilisiert" und hierdurch effizienter gestaltet werden.

Toleranz kann auch durch in vitro bzw. in vivo Coinkubation von Donor- und Rezipient-PBLs in Anwesenheit von (a) IL-10 und anderen Typ2/Th2-Cytokinen (b) Gs-Agonisten (c) Hemmern der cAMP-spezifischen PDE(Phosphodiesterase) und (d) NOS-Stimulatoren bzw. NO-freisetzenden Substanzen erzielt werden.

Durch Transfektion der gentechnisch veränderten allogenen Effektor- bzw. Sekretorzellen mit Th2-Cytokinen, z.B. IL-10, kann Toleranz gegen einzelne übertragene Zellen erzielt werden. Umgekehrt kann die Toleranz, z.B. die tumorspezifische Toleranz durch (a) IL-1 2, IFN, TNF und weitere Th1 -Cytokine (b) durch Gs-Antagonisten (c) durch Stimulierung der cAMP-spezifischen PDEs und (d) durch NOS-Hemmer angestrebt werden.

Die von Coley beobachtete Tumorregression bei einigen Patienten, die gleichzeitig an Tuberkulose erkrankt waren, ließ sich nach unserem Verständnis deshalb nicht reproduzieren und später mit BCG und anderen bakteriellen Präparaten verbessern, da die gleichzeitig induzierten Ts-Zellen die Behandlung störten. Erfindungsgemäß ermöglicht eine Kombination mit MIS- und Anti-T-Mab-Vorbehandlung (zwecks Ts und Th2-Präekiminierung) eine wesentliche Verbesserung aller historischer (Coley) und moderner immuntherapeutischer Verfahren, die auf der Immunstimulierung mittels inaktivierter Bakterien (z.B.BIasentumorbehandlung mit BcG und Chemotherapie) oder Bakterienlysate und -extrakte (als BRMs) beruhen.

Aus Tierversuchen kann abgeleitet werden, dass eine kontinuierliche, ununterbrochene Auseinandersetzung des Immunapparates mit dem Antigen zur Toleranzentwicklung gegen dieses Antigen führt. Deshalb wird empfohlen, diesen Kontakt der Immunzellenz.B. mit dem Tumorantigen durch in vitro Züchtung der Patientenleukozyten in Abwesenheit des Tumorantigens künstlich . zu unterbrechen und die so „erholten" immunkompetenten Zellen in den T-depletierten Patienten zu reinjizieren. Hierbei spielt noch ein weiterer Effekt eine positive Rolle, nämlich die Tatsache, dass nur präaktivierte Ts- bzw. Th2-Zellen zur Nachrekrutierung weiterer Ts- bzw. Th2-Zellen führen, während ruhende (Gedächtnis)Ts- bzw. Th2-Zellen bei Reaktivierung der Patienten-Immunozyten erst nach den Th1 - und Tc- Gedächtniszellen des Patienten aktiv werden.

Eine spezielle Technik ermöglicht die Steuerung der nachreifenden, antigenspezifischen und/oder -unspezifischen T-Zellen in Richtung des Th1 - bzw. Tc- Subsets, indem man in vitro und/oder in vivo mit Anti-CD4-Mabs die T4-Zellen von der Oberfläche der Ag-präsentierenden akzessorischen Zellen „fernhält", um sie 3-5 Tage später (als reine T4-Population) in Präsenz von IL-2 (und IFNgamma)- sezernierenden Th1-, genauer gesagt aktivierten pTH1 -Zellen, einseitig in Richtung des CTL/Tc-Subsets zu „programmieren". Einen ähnlichen Effekt erzielt man mit MIS/MIT-Effektoren, deren Lebenserwartung auf 3-5 Tage „vorprogrammiert" wird. Beide Techniken können kombiniert werden.

Ein Alternativverfahren zur MIS/MIT-Technik, das ohne Zelltod-Vorprogrammierung der MIS/MIT-Effektoren auskommt oder eher bei einer kaum zu erwartenden GvHR nach MIS/MIT-Behandlung zur Eliminierung der GvHR-Effektoren eingesetzt werden könnte, sieht die Behandlung von Donor-PBLs bzw. T-Zellen mit starken Haptenen vor, gefolgt von deren Transfusion in den Rezipienten und Immunisierung des gleichen oder eines anderen Donors mit seinen eigenen Haptenisierten PBLs bzw. Donor-MIS/MIT-Effektoren können nun die Donor-MIS/MIT-Effektoren (nach erfolgter Mission oder zwecks Verhinderung eines unerwarteten GvHD- Nebeneffektes) aus dem Rezipienten entfernt werden.

Die Tatsache, dass die Präexistenz von Donor-spezifischen bzw. -kreuzreagierenden Antikörpern und/oder T (und B) Zellen zur schnellen Abstoßung des Transplantats führen kann, wird nun umgekehrt und praktisch zur Verhinderung dieser akuten Abstoßungsreaktion genutzt. Hierzu wird der Donor nach erfolgter Organtransplantation zuerst mit PBLs, B-Zellen, T-Zellen oder Blut des Rezipienten immunisiert. Bei drohender Organabstoßung kann nun das Plasma oder die daraus isolierte IgG. Fraktion (mit oder ohne die Donor-abgeleiteten MIS/MIT-Effektoren) in den Rezipienten injiziert, wobei die für die Organabstoßung verantwortlichen alloreaktiven T-Zellen des Rezipienten eliminiert werden. Das gleiche Prinzip kann auch bei der Bekämpfung der GvHD bzw. HvGR in Knochenmark-Rezipienten angewandt werden.

Ein eleganter Weg zur Th1 -Generierung ist die T-Zell-bzw. PBL-Aktivierung durch mitogene Lektine (z.B.PHA) und/oder mitogene Mabs (Anti-CD3-, Anti-CD2-, Anti- CD28 Mabs) in Anwesenheit von Gs-Blockern (z.B. Propranolol) und/oder Stimulatoren von cAMP-PDE bzw. Inhibitoren von cGMP-PDE. Die Th2-Generierung gelingt dagegen durch mitogene Stimulation in Anwesenheit von Gs-Agonisten und/oder cAMP-PDE-Blockern.

Ein eleganter Weg zur schnellen in vivo Generierung von Th1 - und Ts-Zellen ist die Kombination aus (a) der radikalen T-Zell-Depletion (mittels Anti-T-Zell-Mabs plus MIS-Effektorzellen) (b) der anschließenden Behandlung mit MIT-Effektoren und (c) der Postinjektion aus unreifen Präkursor-T-Zellen bzw. T-depletierten PBLs des Rezipienten (Patienten).

Eine weitere Möglichkeit der Th1 - und Tc-Generierung ist die Behandlung (a) mit ROS (H02, H202)-freisetzenden Systemen (z.B. XOD/Xanthin; GOD/Glucose; niedrig-dosierte, ROS-generierende Cytostatika wie Mytomycin C, Bleomycin, Cyclophosphamid und deren Kombinationen plus (b) mit verschiedenen Zellstimulatoren wie BRMs, Cytokinen oder Lektinen.

Eine Partielle Th2:Th1 - bzw. Ts:Tc-Umprogrammierung kann auch durch die Kombination aus ROS-freisetzenden Systemen plus cAMP-PDE-Stimulatoren bzw. cGMP-PDE-Hemmern angestrebt werden.

Verschiedene wichtige Krankheitsbilder wie Allergie, Atherosklerose oder hämatόlogische Erkrankungen sind oft mit der Verschiebung des Th1 /Th2- Quotienten zugunsten des Th2-Subsets assoziiert. Deshalb muß angestrebt werden, diesen Quotienten zu korrigieren, sei es durch die in vivo Depletierung der unerwünschten T-Zellen und deren Ersatz durch autologe oder allogene T-Zellen autologer T-Zellen aus T-Zell-Präkursoren, oder aber durch die direkte in vivo Umwandlung der Th2- in die Th1 -Zellen.

Einen eleganten neuen Weg stellt die Vakzinierung (a) gegen den Th2-Subset oder (b) gegen den Idiotyp der tumor-spezifischen Ts- und/oder Th2-Zellen dar.

Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch die beigefügten Figuren erläutert. Darin zeigen

Figur 1 die starke Aktiviefung von PBLs durch subtoxische Dosen von Ammoniak

Figur 2 die starke Aktivierung von Lymphozyten durch subtoxische Dosen von

Triethanolamin

Figur 3 die Aktivierung von PBLs durch Zugabe von XOD/Xanthin zum Medium

Figur 4 die Abhängigkeit der Aktivität von Lymphozyten vom Superoxid-gehalt

Figur 5 die starke Aktivierung von PBMCs mit einer Kombination von Ammoniak und

XOD/Xanthin '

Figur 6 den Einfluß von XOD/Xanthin auf die Aktivität von PBLs

Figur 7 die Verbesserungen der Aktivität von PBLs, die mit einer Kombination aus

XOD/Xanthin, Ammoniak und GSH erreicht werden Figur 8 den Einfluß des GOD/Glucose-systems auf immunkompetente Zellen

Figur 9 die rezeptor-unabhängige Aktivierung von PBLs mit XOD/Substrat bzw.

Ammoniak

Figur 10 die Stimulierung von PBLs mit einem iNOS/cNOS-lnhibitor

Figur 1 1 die Stimulierung von Lymphozyten mit einer subtoxischen Dosis von

Ammoniak

Figur 12 den Einfluß der Superoxid-Konzentration auf die Zellaktivität

Figur 13 die stark immunsuppressive Wirkung von Katalase auf PBMCs

Figur 14 die immunsuppressive Wirkung von SNAP auf Lymphozyten

Figur 1 5 die immunsuppressive Wirkung von Natriumprussid auf PBLs

Figur 16 den Einfluß verschiedener SNOG-Konzentrationen auf die PBL-Aktivität

Figur 17 die suppressive Wirkung von Promethazin auf Lymphozyten

Figur 18 die Wirkung von Diethylamid-NONOat- auf PBLs

Figur 19 die Wirkung von Hydroxyguanidin auf die PBMC-Aktivität

Figur 20 die Wirkung von des Phosphodiesterase-Hemmers MDL-1 2, 330 A auf die

PBL-Stimulierung

Figur 21 die Wirkung von XOD/Xanthin auf das PBMC-Wachstum

Figur 22 den Einfluß eines H0₂-Scavengers auf die Zellaktivität von Lymphozyten und

Figur 23 den Einfluß des GOD/Glucose-Systems auf die Aktivität von PBLs.

Claims

Ansprüche

1 . Zellkonstrukt aus aktivierten T-Zellen eines Patienten mit patienteneigenen und/oder -fremden MHC ll-positiven Zellen zur Verwendung als Arzneimittel.

2. Vakzine zur Bekämpfung aktivierter T-Zellen bei einem Säuger umfassend Zellkonstrukte, die durch Fusion von MHC ll-positiven Zellen des zu behandelnden Säugers und/oder MHC ll-positive Zellen eines Donors mit einer aktivierten T-Zelle entstanden sind.

3. Zellkonstrukt nach Anspruch 1 oder Vakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC ll-positive Zellen dendritische Zellen, Makrophagen und/oder B-Zellen sind.

4. Zellkonstrukt nach Anspruch 1 oder Vakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die aktivierten T-Zellen autoagressive Zellen, alloreaktive Zellen, allergische Zellen oder Suppressorzellen sind.

5. Zellkonstrukt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die alloreaktiven Zellen gegen ein Transplantat gerichtete oder eine GvH-Reaktion auslösende Zellen sind.

6. Verfahren zur Herstellung von Zellkonstrukten bei dem man aktivierte T- Zellen eines Patienten mit patienteneigenen und/oder -fremden MHC ll- positiven Zellen fusioniert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man als aktivierte T-Zellen autoagressive Zellen, alloreaktive Zellen, allergische Zellen oder Suppressorzellen verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem man als alloreaktive Zellen gegen ein Transplantat gerichtete oder eine GvH-Reaktion auslösende Zellen verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem man die Fusion der Zellen durchführt, indem man aktivierte T-Zellen und MHC ll-positive Zellen mit bifunktionellen Antikörpern, die selektierbare Marker aufweisen, in Kontakt bringt, wobei die bifunktionellen Antikörper eine T-Zell-spezifische Bindestelle und eine MHC ll-spezifische Bindestelle aufweisen, die mit den spezifisch gebundenen Zellen beladenen Antikörper über den selektierbaren Marker abtrennt und dann die Fusion bewirkt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem als bifunktionelle Antikörper Hybridantikörper verwendet werden.

1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, bei dem die Fusion durch physikalisch, insbesondere durch Elektroporation, chemisch, insbesondere mit PEG, oder viral bewirkt wird.

12. Verfahren zur Behandlung von Krebs oder Viren, das die folgenden Stufen umfasst:

I. Entfernung von tumor- oder virenspezifischen Suppressorzellen

II. ggf. Entfernung aktivierter Suppressorzellen

III. Behandlung mit aus MHC ll-positiven Zellen und Tumorzellen fusionierten Zellen und/oder aus MHC ll-positiven Zellen und Suppressorzellen fusionierten Zellen

IV. ggf. Behandlung mit aktivierten Patientenlymphozyten, die erhalten werden, indem aus einer Blutprobe des Patienten Lymphozyten gewonnen werden, mit Tumorzellen bzw. Virenzellen inkubiert werden, die aktivierten Zellen selektiert und in vitro vermehrt werden und dann in den Patienten zurück infundiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Stufe IV die Lymphozyten mit mitogenen Antikörpern und Interleukinen inkubiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem während und/oder nach der Stufe IV Effektorzellen rezeptorunabhängig aktiviert werden, indem diese mit mit einem Mittel, das den Quotienten ROI/RNI behandelt werden.

1 5. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem als Mittel zur Erhöhung des Quotienten ROI/RNI Xanthinoxidase und deren Substrat verwendet werden.

1 6. Verfahren nach Anspruch 15, wobei als Substrat Xanthin oder Hypoxanthin verwendet wird.

1 7. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem als MHC ll-positive Zellen dendritische Zellen, Makrophagen und/oder B-Zellen verwendet werden.

18. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem sowohl patienteneigene MHC ll- positive Zellen als auch fremde MHC Il-Zellen verwendet werden.

19. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Entfernung der T-Zellen des Patienten durch Verwendung von gegen T-Zellen gerichtete monoclonale Antikörper erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die T-Zellen durch Anti-CD3-Antikör- per entfernt werden.

21 . Verfahren nach Anspruch 12, bei dem aktivierte T-Zellen entfernt werden, indem Donorlymphozyten mit vorbestimmten Zelltod verwendet werden.

22. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem Donorlymphozyten mit Mitomycin C in solcher Dosis vorbehandelt werden, dass sie nach 3 bis 1 5 Teilungen absterben.

23. Verfahren zur Entfernung disregulierter Zellen aus dem Organismus eines Säugers, bei dem man MHC ll-positive Zellen des Patienten und/oder MHC ll-positive Zellen eines Donors mit der disregulierten Zelle fusioniert und die Fusion, ggf. nach Amplifikation, dem Patienten injiziert.

24. Kombination aus Xanthin-Oxidase, einem Substrat für die Xanthin-Oxidase sowie gegebenenfalls Katalase und/oder Peroxidase zur Verwendung als Arzneimittel.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Xanthin und/oder Hypoxanthin ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination aus Xanthin-Oxidase und Xanthin verwendet wird.

27. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein die Superoxid-Bildung förderndes Mittel einsetzt.