DE10016846A1 - Neue Strategien und Technologieverbesserungen in der Immuntherapie - Google Patents

Abstract

Es wird ein Mittel zur Behandlung von Krebs beschrieben, das eine zur Depletierung bzw. zur Codepletierung von Th2-Zellen geeignete Substanz enthält.

Description

(1) Ein Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung ist die Erweiterung des Patentschutzes, betreffend die in der Patentanmeldung (PCT/EP 94/01992 (US-Patentanmeldung Serial No. 08/564370, Anmelder: P. Leskovar, Prioritätsdatum: 23.6.93) im Detail beschriebene "Mikroimmunchirurgie" (MIS), auf eine weitere Ausführungsform ("Beispiel"), nämlich die Markierung, genauer gesagt Transfizierung/Transduzierung der Donor-Effektorzellen (Lymphozyten, PBLs/PBMCs, Agranulozyten, "buffy coat"/"Lymphozytenkonzentrat") mit der viralen (HSV) Thymidinkinase (TK/tk), gefolgt von einer späteren selektiven in vivo Eliminierung der so markierten Donorzellen mittels Ganciclovir. Hierbei soll der Einsatz dieser auf HSV-TK/Ganciclovir-basierenden, sogenannten "Suizid"-Technik auf all jenen Gebieten patentrechtlich geschützt werden, die in der oben erwähnten Patentanmeldung als Einsatzgebiete für die "Mikroimmuntechnik" näher beschrieben worden sind.

(2) Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist der patentrechtliche Schutz der sogenannten "Mikroimmunotargeting" (MIT)-Technik. Sie weist viele Ähnlichkeiten mit der, in der oben erwähnten Patentanmeldung im Detail beschriebenen "Mikroimmunchirurgie" (MIS)-Technik auf. Der Haupunterschied liegt in der in vitro Vorbehandlung der Donor-Lymphozyten (PBLs/PBMCs), genauer gesagt, in der Konzentration des zur Brückenbildung zwischen beiden DNA-Strängen der Donor-PBLs eingesetzten, bivalent-alkylierenden Antibiotikums Mitomycin C (und anderer, DNA partiell schädigender Verbindungen). Während die MIS-Technik auf der verhinderten Proliferation bzw. auf dem vorprogrammierten Zelltod zwecks erhöhter GvL/GvT-Reaktion bei gleichzeitig verhinderter GvH-Erkrankung aufbaut, beruht die neuere MIT-Technik auf der Übertragung ("Aufoktruierung") des Cytokin-Profils von Donor-PBLs, genauer gesagt Donor-T-Zellen, auf die "falsch programmierten" Patienten-T-Zellen. Wie detailierte eigene Versuche gezeigt haben, dürfte die in vivo Depletierung bzw. Inaktivierung der pathologischen Patienten-T-Zellen bei der MIS-Technik mindestens z. T. auf einer restlichen cytotoxischen bzw. cytolytischen Wirkung der zelltod-vorprogrammierten alloreaktiven Donorzellen basieren. Bei der neueren, patentrechtlich zu schützenden MIT-Technik dagegen scheinen Donor-T-Zellen das Th1-Cytokinprofil während des innigen Zell : Zell- Kontaktes auf die Th₂-Suppressor-T-Zellen (Ts) des Tumorpatienten zu übertragen. Bei Autoimmunerkrankungen dürfte die therapeutische Wirkung von MIT-Effektoren auf der Inaktivierung von präaktivierten (autoaggressiven) T-Zellen durch den lokalen Überschuß an Typ 1 (proinflamatorischen) Cytokinen beruhen; bekanntlich fährt eine weitere Aktivierung von cytokin-, z. B. IL-2-vorinkubierten T-Zellen zu deren Tod (durch Apoptose). Die Erkennung der pathologisch hyperaktivierten (falsch programmierten) Patienten-T-Zellen erfolgt durch deren obligate Postexpression von Klasse II MHC (HLA-DR/DQ)-Antigenen. Interessanterweise fungiert solche überaktivierte T-Zelle als nicht-professionelle antigen- präsentierende Zelle (APC), die bei innigem Zell:Zell-Kontakt mit der vorprogrammierten Donor-T-Zelle das Cytokinmuster der letztgenannten Zelle "übernimmt", in Analogie etwa zur APC-Beeinflußung durch reife, immunkompetente T-Zellen während des Aktivierungsprozesses durch das prozessierte Fremdantigen.

Gewiße Rolle dürfte auch die direkte Inaktivierung von falsch programmierten T-Zellen, durch den sogenannten "Veto-Effekt" spielen, wobei die zusätzliche Interaktion von B 7.1 (CD80)- B 7.2 (CD86)- und B 7.3 (BB1)-Antigenen auf den hyperaktivierten Patienten-T- Zellen mit den korrespondierenden CD28- und CTLA-4-Strukturen auf den Donor- Effektorzellen zur selektiven Ausschaltung der ersteren führt.

Wie detaillierte Versuche gezeigt haben, liegt die kritische Konzentration des Mitomycin C - bei einer 18 stündigen Inkubation - bei 10 ug/ml bzw. 10 ug/1.10⁶ Donor- PBLs/PBMCs. Liegt die Mitomycin-Konzentration bei, bzw. über 10 ug/ml, so werden die Donor-Effektorzellen zu MIT-Effektoren programmiert; bei Mitomycin C-Konzentrationen unter 10 ug/ml resultiert die MIS-Vorprogrammierung der Donor-Effektoren

(3) Eine weitere wichtige Erkenntnis, die patentrechtlich geschützt werden soll, ist die Verhinderung der Toleranz(re)induktion (a) gegenüber residuellen Tumorzellen und/oder (b) gegenüber allen Arten von Infekten, speziell (retro)viralen Infekten (z. B. EBV- oder CMV- Infekten). Es muß verhindert werden, daß im immunsupprimierten Organismus, z. B. nach Tumorexzision, nach Chemo- und Radiotherapie sowie Knochenmark- und Organtransplantation unreife T- (und B-)Zellen, die man auch als prä-T (bzw. prä-B-) Zellen oder T- bzw. B-Präkursorzellen bezeichnen kann, auf reife T-Zellen des Th₂- und Ts- Subtyps treffen. Hierbei denkt man in erster Linie an die tumor- bzw. (retro)virus­ spezifischen T-(und B-)Subpopulationen. Die Folge eines solchen in vivo Zusammentreffens von "falsch programmierten" immunkompetenten Immunozyten mit deren Präkursoren ist eine Toleranzreinduktion gegenüber den Resttumorzellen bzw. Viren, was deren ungehinderte Vermehrung ermöglicht.

Dieser unerwünschte Kontakt bzw. Fehlleitung der heranreifenden Präkursorzellen in Richtung von Th₂ und Ts-Zellen kann durch konsequente in vivo Depletion (a) von Th₂ und/oder Ts-Zellen, (b) von unreifen T- (und B-)Zellen, oder aber (c) durch gleichzeitige Depletierung beider Subsets erzielt werden, wobei im letzteren Fall (Punkt (c)) schon eine partielle, weniger konsequente Codepletierung beider Subsets ausreichend ist. Da es bis dato keine Th₁- und Th₂-spezifischen Mabs gibt, muß an eine temporäre in vivo Depletierung des Th(T4)-Subsets als solchen gedacht werden. Die unreifen Präkursor-T-Zellen können in vivo durch Mabs wie OKT6, OKT9 und/oder OKT10 selektiv eliminiert werden.

Erfindungsgemäß reicht schon die Unterbrechung der fehlgeleiteten Präkursor-T-Zell­ differenzierung ("commitment") zu Th₂- bzw. Ts-Zellen durch die selektive in vivo Depletion ("Herausschneiden") dieser prä-T-Zellen mit entsprechenden Mabs (OKT6, OKT9, OKT10) aus, um die labile Phase bis zur Wiedererlangung der Immunkompetenz zu überbrücken. Die Tatsache, daß beim polyklonalen Einsatz von, gegen T-Zellen gerichteten Antikörpern, wie z. B. ATG bzw. ALG, die Komplikationen mit sekundären Infekten und/oder lymphoproliferativen Krankheiten (basierend meist auf den reaktivierten EBV-Infekten) Viel seltener als beim Einsatz von monoklonalen Mabs (z. B. OKT3) vorkommen, kann durch die gleichzeitige, obwohl temporäre Depletion von reifen T (Th₂, Ts)-Zellen plus deren Präkursoren im ersteren Fall (polyklonale Ak) bzw. der alleinigen Eliminierung der reifen T- Zellen im letzteren Fall (monoklonale Ak/Mab) erklärt werden.

Aus gleichem Grund ist bei der Konditionierung der Tumorpatienten sowohl bei der Behandlung der soliden Tumoren mit "Mikroimmunchirurgie" als auch bei der Knochenmarktransplantation (KMT) der Tumorpatienten (allogene KMT bei Leukämie- und Lymphompatienten sowie autologe KMT bei bestimmten Arten von soliden Tumoren) erfindungsgemäß der Einsatz von polyklonalen Antikörpern (ATG, ALG, ALS) jenem der panT bzw. CD3-spezifischen Mabs vorzuziehen.

Unter den Mabs gibt es allerdings solche, die neben reifen T-Zellen mindestens partiell auch unreife Präkursor-T-Zellen erfaßen. Beispiele sind Anti-CD2-Mabs, die sowohl reife T- Zellen als auch Thymozyten erkennen, ferner CD5, CD6, CD7. Die Anti-CD4-Mabs sind deshalb von besonderem Interesse, da sie sowohl die Th₂ als auch 75% die prä-T-Zellen (Thymozyten) in vivo eliminieren können (Beispiel: die beiden complement-bindenden OKT4- und OKT4A-Mab), wobei Anti-CD4-Mabs generell mit dem Anti-CD8-, mit dem Anti-CD3- und/oder dem Anti-CD2-Mab kombiniert werden können. Der oben genannte Anti-CD6-Mab (OKT17) ist deshalb besonders interessant, da er aktivierte Helfer T-Zellen erkennt und somit die Th2-Fraktion selektiv depletieren kann. Ein weiterer Mab, gerichtet gegen CD2R ist wegen seiner Selektivität für die aktivierten T(Th2 und Ts)-Zellen hervorzuheben.

Die alleinige Depletierung, genauer gesagt Codepletierung von Th₂-Zellen oder die kombinierte Eliminierung von T4(Th₂)- plus prä-T-Zellen (z. B. mit OKT6, OKT9 oder OKT10) verspricht eine effiziente Unterdrückung der Toleranz(re)induktion sowohl gegenüber den residuellen Tumorzellen (nach Behandlung des Primärtumors) als auch gegenüber reaktivierten (retro)viralen Infekten, wenn die Beobachtungen im Tiermodell auch in der Klinik bestätigt werden.

(4) Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Verbesserung der allogenen Knochenmark- Transplantation durch die successive Transfusion der Knochenmarkzellen bzw. der CD34⁺- Stammzell (SC/PBPC)-Subpopulation (a) zuerst vom MHC-inkompatiblen Knochenmark- Spender und danach (optimal: 7-10 Tage später) des MHC-identischen Spenders. Hierbei sollen die erstgenannten Donorzellen zwecks "Mikroimmunchirurgie" und die letztgenannten zwecks besserer Kooperation mit autologen, d. h. Patienten-APCs (Makrophagen) eingesetzt werden.

Die letztgenannten HLA-identischen PBLs können bei Patienten mit soliden Tumoren durch Ts- bzw. Th₂(T4)-prädepletierte Patienten-PBLs partiell oder komplett ersetzt bzw. mit diesen kombiniert werden. Die besondere "Stärke" der autologen PBLs ist deren MHC- Identität mit Patienten-APCs und seinen Tumorzellen, während die HLA-identischen Donorlymphozyten den Vorteil einer fehlenden gemeinsamen Vorgeschichte mit Tumorzeilen und der hiermit verbundenen Abwesenheit jeglicher prägenerierter tumor-spezifischer Th2- und/oder Ts-Subpopulation mit sich bringen.

(5) Als nächstes soll ein neues Prinzip bei der Behandlung von Tumoren, Infekten sowie bei der Entwicklung von Vakzinen generell patentrechtlich geschützt werden.

Es beruht auf der Erkenntnis, daß die Entwicklung von cytotoxischer T-Zellen (CTLs/Tc), die z. B. gegen Tumorzellen oder (retro)viral-befallene Zellen gerichtet sind, eng von den cytokin-produzierenden Helfer-T-Zellen begleitet ist und daß die letzteren nur in der 1. Phase nach ihrer Aktivierung, d. h. als sogenannte "aktivierte naive Th-Zellen" als einziges Cytokin das von den Präkursor-Tc-Zellen (pCTLs) benötigte Typ1-Lymphokin IL-2 produzieren. Bereits in der 2. Phase ihrer Entwicklung, d. h. als sogenannte Th0-Zellen, sezernieren die T4- Zellen neben IL-2 noch IL-4 und andere Th2-Typ-Cytokine; in der 3. Phase werden diese aktivierten, antigen-spezifischen T4-Zellen entweder zum Th1- oder Th2-Subtyp differenziert. Um die Th2-Typ-Lymphokine, welche junge T4-Zellen in Richtung von Suppressor-T-Zellen (Ts-Zellen) dirigieren, auszuschließen, wird erfindungsgemäß empfohlen, die Präkursor- bzw. naive T4-Zellen in vivo so zu behandeln, daß sie sich nur bis zur 1. Stufe ("aktivierte naive Th-Zellen") entwickeln können und vor Erreichung der Th2- Cytokintyp-cosezernierenden Th0-Stufe absterben. Zur Erreichung dieses Zieles werden gleiche Prozeduren und Substanzen wie bei der Vorprogrammierung des Zelltodes/Suizids bei der, in der Anmeldung PCT/EP 94/01992 (US Serial No. 08/564370) beschriebenen "Mikroimmunchirurgie" eingesetzt.

Alternativ hierzu kann durch Zusatz von Anti-T4(CD4)-Mabs und entsprechenden Immuntoxinen eine Situation geschaffen werden, bei der durch entkoppelte, d. h. um 2-5 Tage verzögerte Aktivierung von Helfer T4-Zellen alle Antigen (z. B. TSTA/TATA)-spezifischen CTLs auf die ausschließlich IL-2 (nicht IL-4) sezernierenden Th ("aktivierten naiven Th- Zellen") auf oder in der Nähe von das betreffende Antigen präsentierenden Makrophagen (und anderen APCs) treffen, was zu einer verstärkten bis ausschließlichen Ts-freien CTL- Generierung führt.

Erfindungsgemäß kann auch durch eine Behandlung mit Cyclophosphamid 2-7 Tage vor dem Priming mit dem betreffenden Antigen (z. B. Tumor- und Virusantigen) eine Entkopplung der parallelen Aktivierung von T4- und T8-Zellen erzielt werden, die darin besteht, daß aktivierte pCTLs komplett auf die ausschließlich IL-2-sezernierenden "aktivierten naiven Th-Zellen" treffen.

(6) Eine weitere wichtige Erkenntnis besagt, daß die gezielte Generierung von, ein bestimmtes Antigen erkennenden T-Zellen (CTLs) bei gleichzeitiger Unterdrückung der entsprechenden Ts-Zellen nur dann gelingt, wenn der Makrophage bzw. die APC-Zellen zum Zeitpunkt der Präsentierung dieses Antigens (z. B. des Tumor- oder Virusantigens) einen erhöhten Spiegel an ROS/ROI, welcher die Präkursor T-Zellen in Richtung des Th1-, nicht Th2-Subtyps dirigiert, aufweist.

Da bei der Phagozytose von korpuskulären/partikulären, präaggregierten, prädenaturierten und hydrophobierten Antigenen (z. B. Proteinen) automatisch der ROI/ROS-Spiegel als Folge des "respiratory burst" ansteigt, erzielt man erfindugsgemäß durch gleichzeitige Gabe von partikulären Antigenen (niedrig dosierte Erythrozyten fremder Blutgruppe, inaktivierte Bakterien bzw. deren Lysate, kompletter Freund-Adjuvans/CFA, Lyposomem, denaturuerte Fremdproteine) den erwünschten Effekt, d. h. einen temporären ROI-Anstieg in APCs während der Präsentierung des Tumor- oder Virusantigens.

(7) Als kritisch für die Generierung von Antigen (z. B. Tumor- oder Virusantigen)- spezifischen CTLs bei gleichzeitiger Unterdrückung entsprechender Ts-Zellen ist die Anwesenheit von Typ 1. (IL-2)-Lymphokin-produzierenden Helfer (T4)-Zellen an der Oberfläche bzw. im Mikromilieu von dieses Antigen präsentierenden APCs zum Zeitpunkt der Antigenpräsentierung. Dieses Ziel kann erfindungsgemäß, ähnlich wie unter Punkt (6) erwähnt, durch Fremdproteine (z. B. Bakterienlysat) oder aber durch den Einsatz von histoinkompatiblen (möglichst MHC I- plus MHC II-inkompatiblen) Donor-T-Zellen (Lymphozyten, PBLs) mit vorprogrammiertem Zellrod (d. h. mikroimmunchirurgie­ vorbehandelten Donor T-Zellen bzw. -Lymphozyten) erreicht werden.

Im ersteren Fall erkennt die T4-Subpopulation des Patienten die prozessierten Fremdproteine und im letzteren Fall die T4-Subpopulation des Donors die patienteneigenen MHC I- und MHC II-Strukturen auf dem Patienten-Makrophagen (APCs) und reagiert in beiden Fällen mit der IL-2-Sekretion, wovon u. a. die tumor- bzw. virusspezifischen CTLs bzw. deren Präkursoren (pCTLs) profitieren.

(8) Bei dem gen-therapeutischen Approach wird erfindungsgemäß empfohlen, als Ziel(Target)-Zellen für die Gen-Therapie die Makrophagen, die dendritischen Zellen u. a. APCs vorzusehen, weil sie gegenüber den bisheriger angewandten Tumorzellen und/oder TIL-Zellen den großen Vorteil der gleichzeitigen MHC II-Expression (neben der MHC I-Expression) auf ihrer Zelloberfläche mit sich bringen. Hierbei soll sich der patentrechtliche Schutz auf alle bisher eingesetzten Gene (z. B. für Cytokine, LAPs/Adhesine/Integrine etc.) wie sie von der Transfektion/Traduktion von Tumorzellen, TIL-Zellen u. a. Targetzellen her bekannt sind, erstrecken.

Eine Modifikation sieht Hybridzellen zwischen Patienten- und Donor-APCs (bzw. B-Zellen) vor; andere empfiehlt die MHC II-Expression (neben anderen konventionell eingesetzten Genen z. B. für Cytokine und deren Rezeptoren) auf Tumor- und TIL-Zellen vor, erzielbar durch cDNA oder Fusion.

(9) Die in der Patentanmeldung PCT/EP 94/01992, Anmeldet: P. Leskovar ausgearbeitete HTT- Technologie, basierend (a) auf der Fusion von Tumorzellen des Patienten mit autologen und/oder allogenen, MHC II-positiven Zellen (Makrophagen, Monozyten, dendritischen Zellen, B-Zellen), und (b) auf der Fusion spezialisierter Immunzellen (Th1, Th2, Tc, Ts etc.) mit maligne transformierten Zellen/Zellinien (zwecks Immortalisierung der spezialisierten Immunzellen), soff nun durch weitere neue Erkenntnisse und wichtige Verbesserungen ergänzt werden. Zudem soll diese neue Technologie, die sich inzwischen als sehr erfolgreich in der Klinik erwiesen hat, mit all ihren Varianten auf weiteren Indikationsbereichen patentrechtlich geschützt werden.

Wegen des gemeinsamen Wirkungsprinzipes, d. h. der neuartigen in vivo Eliminierung der pathologisch dysregulierten Immunozyten-Subsets, kombiniert mit Reetablierung von krankheitsbekämpfenden Effektorzellen, soll der Indikationsbereich der HTT-Technologie samt deren Verfeinerungen wie z. B. der HTT-AIT-Technik neben der Behandlung von Tumoren (soliden Tumoren und allen Formen des Blutzellkrebses) nun auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Allergien, Infekten (bakteriellen und (retro)viralen Infekten incl. HIV-Infektion), Arteriosklerose, Abstoßungsreaktion bei Organtransplantaten sowie von GvHD und HvGR (Abstoßung) bei Knochenmark-, Stammzell- und Progenitorzelltransplantation umfassen.

Da beim alleinigen Einsatz von Hybridomen, bestehend z. B. aus Tumorzelle plus allogener APC (Makrophage, dendritische Zelle) die Nachrekrutierung neuer tumor-spezifischer Tc(Th1) nicht funktioniert, wird empfohlen, autologe APCs mit Tumorzellen, deren Lysaten oder, falls vorhanden, tumor-spezifischen Peptiden zu beladen und mit den Hybridomazellen in den Patienten i. v. oder s. c. zu injizieren.

Ein wichtiger weiterer Punkt ist der patentrechtliche Schutz einer Kombination aus der MIS/MIT- Behandlung und der HTT-Technologie, wobei neben der Basistherapie auch alle Modifikationen und Verfeinerungen beider Strategien (MIS/MIT- und HTT-Strategie) als Bestandteile dieser kombinierten Therapie anzusehen sind. Beide Basistherapien wurden bereits in der 1993-Anmeldung des gleichen Anmelders (P. Leskovar) im Detail behandelt, wobei der später eingeführte Begriff MIS/MIT für "zelltod-vorprogrammierte allogene Effektorzellen" und die ebenso nachträglich eingeführte Bezeichnung HTT-Technologie für "Hybridoma (Trioma, Quadroma)-Zellen" stehen.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist auch der patentrechtliche Schutz aller Kombinationen der MIS/MIT- und/oder HTT-Technologie mit anderen immuntherapeutischen Verfahren zur Behandlung von Krebs, bakteriellen und (retro)viralen Infekten, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arteriosklerose, sowie von GvH und HvG-Komplikationen bei Organ- und Knochenmark- bzw. Stammzell/Progenitorzell-Transplantationen.

Die Zielsetzung der anfangs erwähnten Hybridoma- bzw. Triomabildung aus Patienten-Tumorzellen und autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen ist die Präsentation von Tumorantigenen an der Oberfläche der gemeinsamen Tumor: APC-Hybridzelle, was zur Durchbrechung der präexistierenden Toleranz gegenüber Tumorzellen führt. Nachdem klinische Studien die hohe Effizienz dieses 1993 vom gleichen Anmelder (P. Leskovar) patentrechtlich geschützten Prinzips klar bestätigten, soll dieses Prinzip in einer vervollständigten Form als die sogenannte HTT-AIT-Technologie nun auch bei anderen Indikationen wie Autoimmunerkrankungen, Allergie, Atherosklerose, ferner bei der Behandlung von bakteriellen und (retro)viralen Infekten, incl. HIV, sowie bei der Bekämpfung der GvHD und HvG-Komplikationen bei Organ- und Knochenmarktransplantationen geschützt werden, allerdings unter Berücksichtigung einiger Besonderheiten der einzelnen Krankheitsbilder. So soll z. B. bei Autoimmunerkrankungen durch die Fusion von autoantigen-spezifischen, d. h. autoaggressiven T- Zellen mit autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen der besondere Effekt des so entstandenen Zellkonstrukts (Hybridoma- bzw. Triomazellen) therapeutisch genutzt werden, der darin besteht, daß sich nach der subkutanen bzw. intradermalen Inokulation bzw. i. v. Injektion der erwähnten Hybridoma- bzw. Triomazellen eine starke antiidiotypische Abwehrreaktion aufbaut, die in hoch- selektiver klonotypischer Weise die autoaggressiven T-Zell-Subpopulationen des Patienten in vivo depletiert bzw. inaktiviert.

Auch bei der Behandlung von Allergien kann die Fusion der autologen und/oder allogenen MHC II- positiven Zellen (APC) mit allergen-spezifischen T-Zellen (meist des Th2-Subtyps) und/oder mit allergen-spezifischen Plasma (B)-Zellen zur hoch effizienten und hoch selektiven (klonotypischen) in vivo Eliminierung bzw. Inaktivierung der allergie-induzierenden und -aufrechterhaltenden Immunzellen führen. Ähnlich kann bei der Atherosklerose durch die Fusion von autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen mit T- und/oder B-Zellen mit Spezifität z. B. für OxLDL ein Zellkonstrukt gebildet werden, welcher zur selektiven in vivo Depletion der bei der Atherogenese aktiv beteiligten Immunozyten-Subklone führen kann.

Auch bei der Organ- und Knochenmarktransplantation kann das neue Prinzip, die HTT-AIT-Technik, Anwendung finden, indem die subkutane Vakzinierung bzw. i. v. Injektion der Hybridoma- bzw. Triomazellen, gebildet durch die Fusion von MHC II-positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen) autologen und/oder allogenen Ursprungs mit alloaggressiven T-Zellsubpopulationen, in der selektiven Inaktivierung der HvGR- bzw. GvHR-induzierenden T-Zell-Subklone resultiert. Bei allen jenen Krankheitsbildern, bei denen autoaggressive oder alloaggressive T-Zellen aktiv beteiligt sind (Autoimmunkrankheiten, Transplantatabstoßung und GvHD), wird erfindungsgemäß empfohlen, die in vivo Depletion dieser krankheit- bzw. komplikation-auslösender T-Zell-Subsets mit einem weiteren Schritt, nämlich der Stabilisierung des aggressionsfreien Zustandes, zu ergänzen. Hierzu eignen sich antigen-spezifische Ts (und Th2)-Zellen, die man im Falle der Autoimmunkrankheiten durch Koinkubation der Patienten-PBLs mit Autoantigen und immunsuppressiven Zusätzen (CsA, Rapamycin, FK506, Glucocorticoiden, Agonisten von Gs-gekoppelten Rezeptoren wie Adenosin, Adrenalin, PGE2, etc.) generieren kann und die im Falle von Transplantationskomplikationen mittels des one-way-MLC-Ansatzes (in An- bzw. Abwesenheit erwähnter immunsuppressiver Zusätze), mit angeschlossener Inaktivierung der alloreaktiven T-Zellsubpopulationen, sei es mit Bestrahlung (50-­ 100 gy) oder mit Mitomycin C (20-50 ug/10⁶ Zellen), in vitro vorgebildet werden.

Bei der oben erwähnten in vitro Anreicherung der antigen-spezifischen T-Zellklone, die man z. B. bei der Behandlung der Autoimmunerkrankungen, aber auch der Allergien mit der HTT-AIT-Technik als Fusionspartner benötigt, wird die Koinkubation der Patienten-PBLs mit dem Autoantigen bzw. Allergen sowie mit IL-2 empfohlen, wobei das niedrig zu dosierende IL-2 noch mit IFNgamma und/oder IL-12 kombiniert werden kann. Im speziellen Fall der Allergiebehandlung können Hybridoma- bzw. Triomzellen mit FcepsilonR-positiven B-, T- und/oder Mastzellen bzw. Basophilen vorgesehen werden, wobei diese nach der FACS- oder MACS-Vortrennung (in T- und B-Zellen) mit IgE- beladenen Zellaffinitätschromatographiesäulen angereichert werden können.

Eine weitere Variante der Allergiebehandlung mit der HTT-AIT-Technik sieht vor, daß die Fusion der MHC II-positiven Zellen mit IgE-beladenen, Fc epsilon R-positiven Zellen (B-Zellen, Mastzellen, Basophilen) erfolgt. Zu diesem Zwecke kann man Fc epsilon R-exprimierende Zellen (B-Zellen, Mastzellen, Basophile) in vitro mit IgR oder des Fc-Untereinheit beladen und anschließend mit autologen Zellen fusionieren. Auf diese Weise wird mittels der HTT-AIT-Technik gegen Allergie generell vakziniert. Wenn man allergen-selektiv therapieren will, so muß auf konventionelle Weise zuerst das patienten-spezifische Allergenspektrum festgestellt werden, um anschließend durch Inkubation der Patienten-PBLs in Anwesenheit von den betreffenden Allergenen und IL-2 die allergen- spezifische T- und/oder B-Zell-Anreicherung vorzunehmen. Die weiteren Schritte (Fusion und s. c. Vakzinierung bzw i. v. Injektion) sind gleich wie oben.

Die vervollständigte HTT-AIT-Technik bringt auch bei der Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien/Lymphomen zusätzliche Verbesserungen. Im speziellen Fall all jener Blutzellkrebsformen, die durch die Anwesenheit von bcr-abl-Fusionsprotein charakterisiert sind (z. B. CML), kann die Immunisierung (s. c., i. d. oder i. v.) mit Hybridoma/Trioma-Zellen, bestehend aus bcr-abl- exprimierenden malignen Zellen plus autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen) eine hoch effiziente und selektive in vivo Depletion von (Rest)tumorzellen induzieren.

Durch die Fusion von tumor-spezifischen Ts (und Th2)-Zellen des Patienten mit den MHC II-positiven autologen und/oder allogenen APCs (Makrophagen, dendritischen Zellen) kann die durch die MIS- Effektorzellen erzielte in vivo Eliminierung von tumor-protektiven Ts (und Th2)-Zellen auf zellulärer Ebene noch effizienter und selektiver gestaltet werden; zudem kombiniert der erstmalige Einsatz von 2- Typen fusionierter Zellen, nämlich der Tumor: APC-Hybridome ("HTT-Technik") und der Ts: APC- Hybridome ("HTT-AIT-Technik"). 2 wichtige Konzepte bei der Tumorbekämpfung, die in vivo Generierung neuer tumoriziden CTLs ("HTT-Technik") mit der konsequenten Eliminierung tumor- protektiver Ts ("HTT-AIT-Technik") Die zusätzliche Heranziehung der MIS/MIT-Strategie läßt weitere Effizienzsteigerung erwarten. Eine wichtige Verbesserung der MIS/MIT-Effektoren, die in der 1993-Patentanmeldung des gleichen Anmelders (P. Leskovar) als "zelltod-vorprogrammierte alloreaktive Donorzellen" bezeichnet wird, besteht erfindungsgemäß in deren Präallloimmunisierung. Hierzu werden Donor-T-Zellen bzw Donor-PBLs in einer Art one-way-MLC (Donor: responder, Rezipient: Stimulator) 3-5 Tage lang coinkubiert, danach z. B. mit Mitomycin C oder Einbau von 3-H- Thymidin (suicide Dosis) zelltod-vorprogrammiert und als MIS/MIT in vivo eingesetzt. Die Vorteile dieser Kombination aus der MIS/MIT-, HTT- und HTT-AIT-Behandlung seien noch einmal kurz dargestellt: (a) Mit MIS/MIT-Effektoren werden tumoe-protektive Ts (und Th2)-Zellen subset-, aber nicht tumor-spezifisch eliminiert. (b) Die HIT-AIT-Technik ermöglicht eine gewißermaßen tumor- spezifische Depletion protektiver T-zellen. (c) Mit MIT-Effektorzellen, die durch höherdosierte (20-­ 50 ug/1.10⁶ Zellen) Mitomycin C-Vorbehandlung an ihrer cytolytischen Aktivität gehindert, nicht aber an ihrer metabolischen Leistung beeinträchtigt sind, werden APCs (Makrophagen) von der Typ2(Th2) zur Typ1 (Th1)-Funktion umprogrammiert, wodurch auch naive, tumor-spezifische T-Zellen in Th1- Richtung vorprogrammiert werden, (d) Die HTT-Technik ermöglicht die in vivo Bildung der tumor- spezifischen Tc (Th1)-Zellen auf zweierlei Weisen, (a) durch Nachrekrutierung neuer, naiver Tc und/oder (b) durch Umprogrammierung präexistenter Ts- in Tc-Zellen. Die neue kombinierte Technik, die sich durch minimale Nebenwirkungen auszeichnet, wird erfindungsgemäß auch bei der Behandlung von LAS/ARC/AIDS empfohlen. Mit der MIS und der HTT-AIT-Technik werden HIV-spezifische, aber auch opportunistische Infekte schützende Ts(Th2) eliminiert; mit der MIT- und HTT-Technik werden APCs(Makrophagen) in Th1-Richtung umprogrammiert sowie Th1- und Tc- statt Th2- und Ts- Subsets induziert.

Eine weitere Effizienzsteigerung wird von der medikamentösen in vivo Beeinflussung der immunkompetenten Zellen des Patienten z. B. durch Präparate, die das cAMP/cGMP-Verhältnis in den Immunzellen und/oder den Ca-Influx in die Ts(Th2)-Zellen aktiv modulieren, erwartet. Deshalb wird erfindungsgemäß die Kombination mit diesen Präparaten, die in allen Details in der oben erwähnten 1993-Anmeldung des gleichen Anmelders (P. Leskovar) empfohlen. Hierbei sind Kombinationen dieses pharmakologisch/medikamentösen Therapiekonzepts mit der MIS/MIT- und/oder HTT- bzw. HTT-AIT-Technologie erfindungsgemäß zu empfehlen, da eine additive bzw. synergistische therapeutische Wirkung zu erwarten ist. Dieses pharmakologisch/medikamentöse Therapiekonzept zeigte in der Klinik 80-85%-ige Tumorregression sowie ein vollständiges Verschwinden von Metastasen.

Ein wichtiger weiterer Punkt muß angesprochen werden. Da die Fusion mit autologen MHC II- positiven Zellen (APC wie Makrophagen und dendritische Zellen) eine, inzwischen auch klinisch bestätigte außergewönlich effiziente Präsentierung der Oberflächenantigene der Fusionspartnerzelle (z. B. Tumorzelle) ermöglicht, die bei Co-Fusion (Triomabildung) mit allogenen APCs bzw. bei Kombination der Hybridomazellen, basierend auf autologen APCs, mit Hybridomazellen, beruhend auf allogenen APCs, einen weiteren positiven Effekt, nämlich die Th1-Programmierung des neuen Zellkonstrukts einführt, wird erfindungsgemäß empfohlen, alle konventionellen Immunisierungen mit diesartigen Fusionskonstrukten zu verstärken.

Hierbei denkt man in erster Linie an alle Formen von Vakzinen, d. h. jene, die gegen Infekte (bakterielle oder (retro)virale) gerichtet sind, aber auch an alle Ausführungen von Tumorvakzinen. Die Vakzinen können dabei entweder subkutan/intradermal oder i. v. appliziert werden. Bei der HTT-AIT- Verfeinerung kann die vorzeitige Schwächung des Immunisierungsprozesses, eingeleitet durch gegenregulierende pathogen- bzw. tumor-spezifische Suppressorzellen (Ts, Th2), durch den Einsatz von Hybridomen/Triomen, bestehend aus autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen, plus pathogen- bzw. tumor-spezifischen Ts (Th2), verhindert oder mindestens aufgehalten werden.

(10) Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind auch 2 wichtige Verbesserungen der Knochenmark- bzw. Stammzell/Progenitorzell-Transplantation. Die erste betrifft den Vorschlag, anders als bei konventionellen Transplantationen, zuerst nur reife, zelltod-vorprogrammierte Donor-T-Zellen (bzw. PBLs/PBMs) bzw. deren Kombination mit reifen Rezipienten-T-Zellen (bzw. PBLs), die im Falle der malignen Erkrankungen des Rezipienten ähnlich wie die Donor-Zellen vorzubehandeln sind, einzusetzen; erst nach 7-14 Tagen sollen nach diesem Protokoll die unreifen Knochenmark- oder Stamm/Progenitorzellen postinfundiert werden. Hierdurch wird die partielle Immunkompetenz des Patienten auch in der kritischen Phase nach der Konditionierung erhalten, was die Infektanfälligkeit und die Gefahr der Reinduktion der tumor-spezifischen Toleranz wesentlich hierabsetzt. Zudem kann die partielle Schädigung der unreifen Immunozyten, speziell der HLA-DR/DQ-positiven, durch reife alloreaktive T-Zellen verhindert werden.

Die 2. Verbesserung betrifft die Einführung der allogenen, d. h. Donor-LAK-Zellen sowohl in die Tumortherapie als auch in die. Knochenmark- bzw. Stammzell/Progenitorzell-Transplantation. Diese allogenen LAK-Zellen müssen jedoch zuvor mit Anti-panT(CD3)-Antikörpern und/oder Anti-CD8- Antikörpern von den ca. 10% nicht-MHC-restringierten T-Zellen befreit werden. Alternativ hierzu können die allogenen LAK-Zellen zelltodvorprogrammiert werden, ähnlich wie für MIS/MIT- Effektorzellen in der oben erwähnten Patentanmeldung 1993 (Anmelder: P. Leskovar) im Detail beschrieben.

(11) Ein weiterer Punkt betrifft neue Erkenntnisse des Anmelders hinsichtlich der Regulation von Th1-, Th2-, Tc/CTL- und Ts-Subsets der T-Lymphozyten. Nach diesen neuesten Erkenntnissen weisen Th1-, aber auch Tc-Subsets im Vergleich zu Th2- und Ts-Zellen ein erhöhtes intrazelluläres bzw. mitochondriales ROI/RNI-Verhältnis auf. Hieraus leitet sich der angestrebte patentrechtliche Schutz für alle pharmakologisch/medikamentöse Eingriffe und Manipulationen ab, die direkt oder indirekt das Th1/Th2- bzw. Tc/Ts- bzw. T4/T8-Verhältnis in vitro und/oder in vivo verändern können. Beispiele sind verschiedene Hemmer der RNI-erhöhenden NO-Synthetasen (iNOS, cNOS), die z. B. zur Erhöhung der Th1-Cytokin- und Reduzierung der Th2-Cytokin-Produktion führen, ferner alle ROI- und RNI-generierende bzw. sezernierende Systeme sowie alle ROI- und RNI-scavengers, enzymatischer oder chemischer Natur.

Zudem fand der Erfinder heraus, daß die Tc/CTL- und die Ts-Zelle die gleiche, CD8⁺-Zelle darstellen, die sich in 2 "eingefrorenen" funktionellen Zuständen, dem Tc- bzw. Ts-Zustand, befindet. Ein erhöhter intrazellulärer NO-Spiegel in der Ts-Zelle verhindert die Ca_i-abhängige Translokalisation der vorgebildeten Perforin- und CD95L (Apo-1L/FasL)-Moleküle zur Zelloberfläche, wodurch die cytolytische Wirkung von Tc verhindert wird. Mehr noch, der innige Kontakt zwischen der Tc- bzw. Ts-Zelle und der MHC I-positiven Zielzelle ermöglicht zugleich die Penetrierung des membrangängigen überschüssigen NO'-Radikals von der Ts- in die Zielzelle, wodurch das cytosolische H₂O-Radikal Molekül chemisch "neutralisiert" wird, was mit einer immunsuppressiven Einwirkung auf die Zielzelle einhergeht. Es sollen nun auch alle pharmakologisch/medikamentöse Eingriffe zur in vitro oder in vivo Umwandlung von Ts- in Tc-Zellen (z. B. bei Toleranzinduktion, oder bei Autoimmunerkrankungen) patentrechtlich geschützt werden.

Da auch die APCs (Makrophagen/Monozyten) durch Änderung des intrazellulären Quotienten von der sogenannten "Suppressor-Monozyten"-Funktion in die tumorizide/viruzide/bakterizide Effektorfunktion umgeschaltet werden und zudem einen großen Einfluß auf die Th1- vs. Th2- Vorprogrammierung der antigen-spezifischen naiven (non-primed) T-Zellen nehmen können, soll auch die pharmakologisch/medikamentöse APC-Beeinflussung via Änderung des ROI/RNI-Quotienten patentrechtlich geschützt werden.

(12) Es seien noch einige weitere technische Verbesserungen der HTT- und HTT-AIT-Technik patentrechtlich geschützt.

Dazu gehört die Abwandlung beider, auf Zell:Zell-Fusion basierender Technologien, bei der an die Stelle der Zell:Zell-Fusion die Zellkern:Zell- und die Zellkern:Zellkenr-Fusion tritt. Dies gilt für Zweier(Hybridomazellen)-, Dreier(Triomazellen)- und Vierer(Quadromazellen)-Kombinationen. Bei allen Fusionstechniken, den "konventionellen" Zell:Zell- und den modifizierten Zellkern:Zell- bzw. Zellkern:Zellkern-Fusionstechniken kommt es zur Fusion der Zellkerne und der Chromosome sowie zu der Oberflächen-Koexpression der Gene beider Fusionspartner. Hierbei werden, wie bei viralem Zellbefall und bei der (malignen) Zelltransformation Genprodukte (Peptide/Polypeptide/Proteine) beider Fusionspartner im Kontext mit dem MHC I-Komplex an der Zelloberfläche exprimiert. Die Gewinnung der benötigten Zellkerne erfolgt mit klassischen Enukleisierungsverfahren (z. B. mit LyseS, mit verschiedenen Tensiden und deren Kombinationen unter Zuhilfenahme von NH₄Cl oder Saponin etc.).

Eine interessante Anwendung kombinierter Zellkerne:Zell-Fusionsverfahren ist erfindungsgemäß das Einschleusen von Fremdzellgenen (z. B. der fehlenden Gene von profizienten bzw. Wildtypfremdzellen in defiziente autologe Zeilen), ohne die Gefahr der Abstoßung fremder Zellen aufgrund von MRC I- und/oder MHC II-Mismatch. Ein besonders aktueller Sonderfall ist die Fusion des Donorzellkerns mit Rezipiententhymuszelle, was nach Homing der autologen Thymuszelle im Rezipiententhymus zur gleichzeitigen Rezipient- und Donor-spezifischen thymalen Schulung der heranreifenden T-Zellen führt. Die resultierenden immunkompetenten T-Zellen sind ähnlich wie bei (AxB)F1-Hybriden, doppelt d. h. Rezipient- und Donor-MHC-restringiert. In dieser Weise kann auf elegante Weise eine Donor-spezifische Toleranz erzielt werden.

Ein anderer interessanter Spezialfall ist die Fusion des Donorzellkerns mit der Rezipientenstammzelle, wobei der Donorzellkern einer Donorstammzelle oder somatischer (haematopoietischer) Zelle entnommen werden kann. Auch hier wird durch das gleiche Prinzip des "trojanischen Pferdes" die frühzeitige Abstoßung der fremden (Donor) Zelle verhindert.

Bei allen HTT-AIT-Techniken samt deren Modifikationen kann die Fusion erfindungsgemäß entweder chemisch (z. B. PEG oder PEG/DMSO oder PVP oder PEG/PVP), durch Hochfrenquenzstrom (Elektrofusion/Elektroporation) oder viral (z. B. SV40) erfolgen.

(13) Eine weitere wesentliche Verbesserung aller, auf Fusion basierender Technologien kann erfindungsgemäß durch gezielte, hochselektive Vorannäherung der zu fusionierenden Partnerzellen durch bifunktionelle Antikörper, die an typische Oberflächenstrukturen der zu fusionierenden Zellen binden, erzielt werden. Statt der bifunktionellen Antikörper können auch andere, bi-, tri- oder tetravalente Antikörperkonstrukte eingesetzt werden, wodurch Hybridoma-, Trioma- oder Quadroma­ zellen gewünschter Komposition entstehen können. Hierbei muß die Konzentration der chemischen Fusogene relativ niedrig gehalten werden (bei PEG z. B. bei 35-40%) bzw. die Bedingungen bei der Elektrofusion so gewählt werden, daß die Fusion der vorangenäherten Partnerzellen selektiv, vor der Fusion anderer, nicht vorangenäherten Partnerzellen, erfolgen kann.

Bei der Fusion von Patiententumorzellen mit den autologen und/oder allogenen MHC II-positiven Zellen (Makrophagen, dendritische Zellen) müssen bivalente Antikörper eingesetzt werden, die einerseits TSTA/TSA/TAA-spezifisch sind und andererseits Strukturen auf Makrophagen (z. B. CD16/CD32/CD64, d. h. Fc gamma RI/II/III) bzw. auf dendritischen Zellen (z. B. CD83 oder T6) erkennen.

Bei den Hybridomen, bestehend aus dysregulierenden Immunozyten plus autologen oder allogenen APCs (MHC II-exprimierenden Zellen), können bispezifische Mabs bzw. Antikörperkonstrukte mit doppelter Spezifität eingesetzt werden, die einerseits typische Oberflächenstrukturen (z. B. Differenzierungsantigene) auf den pathologischen (dysregulierten) Immunzellen und andererseits die erwähnten Membranstrukturen auf den APCs erkennen.

Will man gegen dysregulierte Th2- oder Th1-Zellen immunisieren, so muß in vitro - wie bei der Th1- und Th2-FACS-Analyse - zuerst die Saponinperforierung der Th2-Zellmembran erfolgen und anschliessend ein bifunktioneller MAB oder Antikörperkonstrukt eingesetzt werden, der die Th2- bzw. Th1-Zellen an die aurologen oder allogenen APCs annähert bzw. bindet. Mit niedrigdosiertem PEG wird dann die selektive Fusion durchgeführt, womit die Basis für eine hoch-selektive in vivo Immunisierung gegen den Th2- bzw. Th1-Subset gegeben ist.

Im speziellen Fall von Allergien kann durch den Einsatz von bifunktionellen Mabs bzw. Antikörperkonstrukten mit Spezifität für IgE oder Fc epsilon R einerseits und für CD16 (auf Makrophagen) bzw. CD83 oder T6 (auf dendritischen Zellen) die selektive Bildung von Hybridom- bzw. Triomkonstrukten erzielt werden, welche eine hoch-selektive Immunisierung gegen IgE-tragende B- und T-Zellen bzw. Mastzellen/Basophilen ermöglicht.

Die Effizienz der beschriebenen Allergiebehandlung kann erfindungsgemäß noch weiterhin gesteigert werden, wenn (a) mit Fc epsilon -Untereinheiten von IgE und/oder (b) mit löslichen IgE-Rezeptoren (sFc epsilon R) und/oder (c) mit IgEs ohne Allergenspezifität und/oder (d) mit IgEs, deren Ag- bindende Domäne z. B. durch Einsatz eines oder mehrerer Aminosäureste gestört ist, die allergen- spezifischen IgEs von der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen verdrängt werden. Mit allergen- spezifischen Antikörpern anderer, nicht IgE-Subklasse, z. B. der IgG, IgM und/oder IgA-Subklasse lassen sich erfindungsgemäß die zirkulierenden und (Mastzell) gebundenen so verschieben, daß die Dichte der (Mastzell)gebundenen IgE-Moleküle abnimmt, was gleichfalls zur Schwächung der Allergiesymptome führt.

Im speziellen. Falle der Allergie wird erfindungsgemäß empfohlen, mit den bispezifischen und/oder hybriden Antikörpern, die einerseits das IgE oder den Fc epsilon R-Rezeptor erkennen und andererseits MHC II-positive Zellen (APCs) binden, via Vorannäherung der Partnerzellen eine hohe Selektivität bei der Hybridoma/Triomabildung anzustreben.

Detaillierte Laboruntersuchungen des Anmelders haben noch ein weiteres Phänomen, nämlich die starke Immunstimulierung durch niedrige, subfusogene Konzentrationen an chemischen Fusogenen (PEG, PVP und deren Kombinationen) aufgezeigt. Das Prinzip dürfte die intensivierte Interaktion beteiligter immunkompetenter Zellen in Anwesenheit von fusogenen Polymeren in subfusogenen Konzentrationen sein.

Zudem wurde beobachtet, daß die gleichen fusogenen Polymere (PEG, PVP und Kombinationen) bessere kryobiologische Eigenschaften als das allgemein zur Einfrierung von zellen empfohlene, aber toxische DMSO zeigen.

Beide Eigenschafen, die Immunstimulation und die Zellprotektion beim Einfrieren der Zellen sind bei hoch molekularen Polymeren (PEG, PVP) ausgeprägter als bei niedrigmolekularen Vertretern.

Der Einsatz erwähnter Polymere (PEG, PVP und Kombinationen) (a) zur Immunstimulation und (b) zur Kryoprotektion ist Gegenstand vorliegender Anmeldung.

Weitere Verbesserungen der HTT- bzw HTT-AIT-Technik betreffen den Einsatz von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern mit Spezifität einerseits für Cytokeratin, andererseits für Differenzierungsantigene und weitere Oberflächenstrukturen, typisch für MHC II-positive Zellen (APCs wie dendritische Zellen, Makrophagen/Monozyten und/oder B Zellen). Da Cytokeratin auf allen soliden Tumoren, aber nicht auf Leukozyten (z .B. APCs) exprimiert wird, ermöglichen diesartige Antikörper eine innige Annäherung der gewünschten Fusionspartnerzellen und hiermit eine hoch selektive Hybridoma/Trioma/Quadromabildung bei suboptimalen Konzentrationen von Fusogenen (z. B. PEG, PVP, PEG/PVP-Kombinationen).

Anmerkung

Obwohl nicht extra erwähnt, haben alle Textstellen, die die chemische Fusion betreffen, volle Geltung auch für die physikalische Fusion (Elektrofusion/Elektroporation).

Statt oder neben Cytokeratin-erkennenden Antikörpern können Tumorantigen-spezifische Antikörper mit den APC-erkennenden Antikörpern in Form von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern zum Einsatz kommen.

Ein wichtiger weiterer Punkt ist die erfindungsgemäße Vereinfachung der klassischen Mab-Gewinnung nach Köhler und Milstein, die das zeit- und kostenaufwendige Klonieren in selektiven Medien wie HAT, HT usw. überflüßig macht, das neue Prinzip besteht in einer gezielten innigen Vorannäherung beider Fusionspartner, der Antigen-spezifischen B-Zellen mit immortalisierenden transformierten Standardzellinien. Hierbei können z. B. mit FACS- oder MACS-Technik die B-Zellen des mit dem speziellen Antigen immunisierten Tieres vorselektioniert und mit einem bifunktionellen und/oder hybriden Antikörper, der B-Zell-Differenzierungsantigene und spezifische Strukturen auf der Oberfläche der erwähnten immortalisierenden Zellinien erkennt, vorbehandelt werden. Die so vorangenäherten Partnerzellen können nun selektiv fusioniert werden. Eine höhere Selektivität wird durch den Ersatz der B-Zell-spezifischen Antikörper durch solche, die nur die aktivierten B-Zellen erkennen, erzielt werden. In diesem Falle und im Falle einer noch selektiveren, klonotypischen Hybridombildung, bei der die Antigen-spezifischen B-Zellklone erkannt werden, müssen die Splenozyten des immunisierten tieres zuerst in vitro in Anwesenheit des spezifischen Antigens präaktiviert werden.

Bei dieser klonotypischen Fusion müssen die 96-er Mikrotitrationsplatten zuerst mit dem spezifischen Antigen direkt oder indirekt (via Poly-L-Lysin-Behandlung) vorbeschichtet werden. Alternativ hierzu können alle anderen, bei der konventionellen Mab-Gewinnung praktizierten Selektionsverfahren eingesetzt werden.

Wenn nun die Antigen-spezifischen B-Zellen grob oder fein vorangereichert sind, wird durch den Einsatz von bifunktionellen und/oder hybriden Antikörpern, die einerseits B-Zell-typische Differenzierungsantigene bzw. aktivierte B-Zellen erkennende Antigene binden und andererseits mit APC-Oberflächenstrukturen interagieren, ist die Voraussetzung für eine selektive Fusionierung der Fusionspartner erfüllt.

(14) Ein weiterer Punkt ist die Immunzytenstimulierung durch Fusogene in sub-fusogenen Konzentrationen, wobei auch hier eine Selektivität durch Vorannäherung der interagierenden immunkompetenten Zellen erfindungsgemäß durch bifunktionelle und/oder hybride Antikörper erzielbar ist.

(15) Noch einige weitere Punkte sollen Erwähnung finden:

• a) Bei Knochenmarktransplantationen (BMT, SCT, PCT) kann durch das Heranziehen von Spendern (einem oder mehreren) die Resistenz gegenüber viralen und/oder bakteriellen Infektionen gezielt auf den Empfänger mitübertragen werden, was klinisch mehrfach gelang.
• b) Als eine neuartige Klasse von Immunmodulatoren (BRMs) wird erfindungsgemäß der Einsatz von (b1)zelltod-vorprogrammierten allogenen, MHC II-positiven Zellen und/oder (b2) von zelltod- vorprogrammierten Hybridoma/Triomazellen, bestehend aus autologen plus allogenen, MHC II- positiven Zellen (Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Zellen) empfohlen.
• c) Die Th1/Tc vs. Th2/Ts-Vorprogrammierung läßt sich durch Vor- oder Nachbehandlung der Hybridoma/Triomazellen, bestehend aus Tumorzellen, autologer APC und/oder allogener APC, im Sinne des Typ-1- vs. Typ-2-Profils (z. B. via Modulation des intrazellulären cAMP-Spiegels oder via Cytokinmodulierung) erzielen.

Claims (9)

1. Mittel zur Behandlung von Krebs enthaltend eine zur Depletierung bzw. Co­ depletierung von Th2-Zellen geeignete Substanz.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Depletierung von Th2-Zellen geeignete Substanz ein Antikörperpräparat ist mit Antikörpern, die CD5, CD6 und/ oder CD7 erkennen, oder aktiven Teilen davon.

3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Depletierung von Th2-Zellen geeignete Substanz mit komplementbindenden Antikörpern kombiniert ist.

4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper OKT6, OKT9, OKT10 oder eine Mischung davon vorhanden ist.

5. Mittel zur Behandlung von Allergien umfassend Fusionszellen aus autologen und/oder allogenen MHCII-positiven Zellen mit allergenspezifischen T-Zellen und/oder mit allergenspezifischem Plasma-(B)-Zellen.

6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als MHCII positive Zellen APC eingesetzt werden.

7. Mittel nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als allergenspezifische T-Zellen solche des Th2-Subtyps enthalten sind.

8. Mittel nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als APC Makrophagen oder dentritische Zellen vorhanden sind.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fusionszellen Hybridoma-, Trioma- oder Quadromazellen sind.