DE19859110A1

DE19859110A1 - Bispezifische und trispezifische Antikörper, die spezifisch mit induzierbaren Oberflächenantigenen als operationelle Zielstrukturen reagieren

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Publication number: DE19859110A1
Application number: DE19859110A
Authority: DE
Inventors: Horst Lindhofer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2000-04-13
Also published as: DE59907958D1; DE19859115A1

Abstract

Erfindungsgemäß wird bereitgestellt ein intakter bispezifischer oder trispezifischer Antikörper, der zumindest die nachfolgenden Eigenschaften aufweist: DOLLAR A a) Binden an eine T-Zelle; DOLLAR A b) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Zielzelle; DOLLAR A c) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Antikörpern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifischen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen DOLLAR A und der hierdurch eine Immunantwort induziert und/oder die Zielzellen zerstört, wobei der Antikörper so ausgewählt ist, daß er an ein Oberflächenantigen als Zielantigen auf der Zielzelle bindet, welches induzierbar ist und im nicht induzierten Zustand (Normalzustand) auf der Zielzelle nicht vorkommt oder in einer derart geringen Zahl, daß die Anzahl für eine Zerstörung der Zielzelle nicht ausreicht. DOLLAR A Weiterhin beschrieben werden eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen Antikörper enthält sowie Verwendungen des Antikörpers.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bispezifische und tri spezifische Antikörper, Verfahren zur Herstellung dieser Anti körper sowie ihre Verwendung in der Immuntherapie.

Die Immuntherapie durch Antikörper, insbesondere durch bispezi fische oder trispezifische Antikörper, hat in den letzten Jah ren an Bedeutung stetig zugenommen. Ein wesentliches Problem bei der Verwendung derartiger Antikörper in der Immuntherapie ist die spezifische Erkennung der Zielzelle durch die Antikör per, d. h. eine möglichst genaue Differenzierung zu den Zellen, die durch die Antikörper nicht angegriffen werden sollen, d. h. den Zellen im normalen, physiologischen Zustand. Je spezifi scher die Erkennung von Zielstrukturen auf den Zielzellen durch die Antikörper ist, desto schonender verläuft eine Therapie mit derartigen Antikörpern für einen Patienten und desto geringer sind die Nebenwirkungen.

Die Lösung diese Problems wird umso wichtiger, je stärker die Effizienz von Immuntherapien mit der Möglichkeit starker Neben wirkungen zunimmt.

In der DE 196 49 223 und der DE 197 10 495 sind intakte bispe zifische und trispezifische Antikörper beschrieben, die zur Immuntherapie eingesetzt werden. Diese bispezfischen und tri spezifischen Antikörper sind befähigt, an eine T-Zelle, zumin dest ein Antigen auf einer Zielzelle und durch ihren Fc-Teil oder durch eine dritte Spezifität an Fc-Rezeptor positive Zellen (akzessorische Zellen) zu binden.

Während beispielsweise monoklonale Antikörper bei ihrer Anwen dung in der Immuntherapie nur bestimmte, klar umgrenzte Teilbe reiche des Immunsystems an einer Zielzelle aktivieren und des halb die bei einem Patienten auftretenden Nebenwirkungen eben falls begrenzt und deshalb relativ leicht zu kontrollieren sind, rufen intakte bispezifische und trispezifische Antikörper wesentlich stärkere Nebenwirkungen hervor, wenn die Spezifität des Bindungsarmes, der ein Antigen auf einer Zielzelle erkennt, gering ist. Der Grund liegt darin, daß intakte bispezifische und trispezifische Antikörper nicht nur T-Zellen aktivieren, sondern gleichzeitig auch akzessorische Zellen, beispielsweise Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen. Diese Nebenwir kungen könnten dadurch verringert werden, daß eine hochspezi fische Erkennung der Zielzelle durch den Antikörper ermöglicht wird.

Es ist somit eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, intakte bispezifische und trispezifische Antikörper bereitzu stellen, die hochspezifisch ein Antigen auf einer Zielzelle erkennen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch einen intakten bispe zifischen oder trispezifischen Antikörper gelöst, die zumindest die nachfolgenden Eigenschaften aufweisen:

a) Binden an eine T-Zelle;
b) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Zielzelle;
c) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Antikör pern) oder durch eine dritte Spezifität (bei trispezifi schen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen

und der hierdurch eine Immunantwort induziert und/oder die Zielzellen zerstört, wobei der Antikörper so ausgewählt ist, daß er an ein Oberflächenantigen als Zielantigen auf der Ziel zelle bindet, welches induzierbar ist und im nicht induzierten Zustand (Normalzustand) auf der Zielzelle nicht vorkommt oder in einer derart geringen Zahl, daß die Anzahl für eine Zerstö rung der Zielzelle nicht ausreicht.

Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß nach Induktion be reits eine relativ geringe Anzahl der Zielantigene auf der Zielzelle ausreichend ist, um die intakten bispezifischen und trispezifischen Antikörper zu binden und eine Zerstörung der Zielzelle und/oder eine Immunantwort einzuleiten. Unter "gerin ge Anzahl" wird erfindungsgemäß eine Anzahl von Zielantigenen auf der Zielzelle von mehr als 100 Zielantigenen pro Zielzelle, bevorzugt mehr als 300 und weiterhin bevorzugt mehr als 1000 Zielantigenen pro Zelle verstanden. Die induzierbaren Zielanti gene können auch in einer Menge von bis zu 500.000 pro Zielzel le vorliegen, wobei auch Mengen bis zu 400.000, bis zu 300.000, bis zu 200.000 oder bis zu 100.000 pro Zielzelle induzierbar sind. Ein weiterer bevorzugter Mengenbereich, in dem die Ziel antigene vorliegen können, ist von 50.000 bis 100.000 und von 5000 bis 50.000.

Beispiele für induzierbare Oberflächenantigene auf Zielzellen (Zielantigene), die für eine Immuntherapie durch intakte bispe zifische und trispezifische Antikörper einsetzbar sind, sind Hitzeschock-Proteine und "MHC-Klasse I-verwandte" MIC-Moleküle. Hitzeschock-Proteine (Hsp) werden von der Zelle als Antwort auf Zellstreß synthetisiert. Unter "Zellstreß" ist erfindungsgemäß beispielsweise eine Entartung der Zelle, das Einwirken von Strahlen, chemischen Substanzen und von erhöhter Temperatur auf die Zelle sowie die Infektion der Zelle durch Mikroorganismen zu subsumieren. Zur Zeit sind vier Familien von Hitzeschock- Proteinen bekannt, die aufgrund ihres unterschiedlichen Moleku largewichts differenziert werden. Diese Familien werden als Hsp25, Hsp60, Hsp70 und Hsp90 bezeichnet, wobei die Zahl das ungefähre Molekulargewicht der Streßproteine in Kilo-Dalton wiedergibt. Die Hitzeschock-Proteine zeichnen sich durch hoch konservierte Aminosäuresequenzen aus, wobei der Grad der Kon servierung bei über 35% Aminosäure-Identität, bevorzugt bei 35 -55%, weiterhin bevorzugt 55-75% und am bevorzugtesten zwi schen 75% bis 85% Amiriösäure-Identität liegt.

Auf folgende Übersichtsartikel wird verwiesen: Annu. Rev. Ge net. 27, 437-496 (1993); Biochimie 76, 737-747 (1994); Cell. Mol. Life Sci. 53, 80-129, 168-211 (1997); Experientia 48, 621- 656 (1992); Kabakov u. Gabai, Heat Shock Proteins and Cytopro tection, Berlin: Springer 1997.

Hitzeschock-Proteine werden im Normalfall auf gesundem Gewebe nicht exprimiert. Es gibt jedoch Untersuchungen, die zeigen, daß Hitzeschock-Proteine beispielsweise auf Tumorzellinien und auf Tumormaterial aus Patienten exprimiert werden können (Mel cher et al., Nature Medicine, 4: 581, 1998). Die Expression der Hitzeschock-Proteine auf den Tumorzellinien ist aber relativ schwach und deshalb für bisher bekannte immuntherapeutische Ansätze mit monoklonalen Antikörpern und unvollständigen (F(ab)₂) bispezifischen Antikörpern ungeeignet.

Beispiele für Hitzeschock-Proteine sind Hsp60 und Hsp70/72.

Gleiches gilt für MIC-Moleküle. Auch diese Moleküle sind durch Zellstreß, wie oben näher definiert, induzierbar. MIC-Moleküle sind MHC I-verwandte Moleküle, die unter Kontrolle von Hitze schock-Promoter-Elementen stehen (Groh et al., PNAS 93: 12445, 1996). Beispiele für MIC-Moleküle sind MIC A und MIC B. Auch für MIC-Moleküle konnte gezeigt werden, daß sie auf Normalge webe nicht oder nur in so geringer Menge exprimiert werden, daß sie als Zielstruktur zur Erkennung durch einen Antikörper, um eine Zerstörung der Zielzelle zu erreichen, nicht geeignet sind, während sie auf beispielsweise epithelialen Tumoren in einer solchen Menge exprimiert werden, daß sie durch die erfin dungsgemäß bereitgestellten bispezifischen und trispezifischen Antikörper bei einer Immuntherapie als Zielantigene einsetzbar sind.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten intakten bispezifischen oder trispezifischen Antikörper werden so ausgewählt, daß sie gegen zumindest ein Zielantigen auf einer Zielzelle gerichtet sind, welches induzierbar ist und auf der Zielzelle im nicht induzierten Zustand nicht oder im wesentlichen nicht vorkommt. Diese Zahl liegt beispielsweise bei ca. 100 Zielantigenen/Zel le. Dies heißt jedoch nicht, daß derartige Zielantigene auf anderen Zellen, d. h. Nicht-Zielzellen, nicht vorkommen können. Beispielsweise kommen auf sich schnell regenerierendem Gewebe, z. B. den Schleimhautzellen des Magen-Darm-Traktes, auch im phy siologischen Zustand, konstitutiv exprimiert, Hitzeschockpro teine vor. Diese Hitzeschockproteine werden jedoch von der vor liegenden Erfindung nicht mit umfaßt, da sie nicht induzierbar sind, sondern bereits auf Normalgewebe vorkommen. Bei Verwen dung der erfindungsgemäßen Antikörper, die gegen Hitzeschock proteine gerichtet sind, können auch bestimmte Schleimhautzel len des Magen-Darm-Traktes zerstört werden, da diese, wie oben ausgeführt, konstitutiv Hitzeschockproteine auf ihrer Zellober fläche exprimieren. Die mögliche Zerstörung dieser Zellen ist für einen Patienten zwar mit gewissen Nachteilen verbunden, die jedoch im Vergleich zur erzielbaren Tumorzerstörung gering an zusetzen sind.

Das sich schnell regenerierende Gewebe ist somit nicht primäres Target der erfindungsgemäßen Antikörper, kann jedoch dann von den Antikörpern "getroffen" werden, wenn der erfindungsgemäße Antikörper nicht nur die induzierbaren Zielantigene auf der Zielzelle erkennt, sondern diese Antigene z. B. auch auf sich schnell regenerierendem Gewebe vorkommen. Da sich dieses Gewebe jedoch schnell teilt, kann nach Absetzen der Antikörper-Thera pie der ursprüngliche Zustand dieses Gewebes relativ rasch so wieder hergestellt werden, daß es seine physiologische Aufgabe wieder erfüllen kann. Die Erfindung ist also nicht darauf ge richtet, daß die erfindungsgemäßen bispezifischen und trispezi fischen Antikörper Antigene auf z. B. sich schnell regenerieren dem Gewebe erkennen, welche dort unter Umständen konstitutiv exprimiert werden, sondern die Erfindung umfaßt ausschließlich solche Antikörper, die gegen Zielantigene gerichtet sind, die auf der Zielzelle induzierbar sind und nach Induktion, bei spielsweise auch konstitutiv, exprimierbar sind.

Erfindungsgemäß werden unter "induzierbar" solche Zielantigene verstanden, die hier operationell tumorspezifisch sind und im physiologischen Zustand auf der Zelle nicht oder nur in einer solchen Anzahl vorkommen, daß eine Immunantwort gegen sie nicht induzierbar ist oder eine Zerstörung der Zielzellen aufgrund dieser geringen Anzahl nicht oder in einem nicht wesentlichen, therapeutisch nutzbaren Umfang stattfindet.

Als induzierbare Zielantigene auf einer Zielzelle sind nicht nur solche auf einer Tumorzelle zu verstehen, sondern auch An tigene, die induziert werden, wenn die Zielzelle beispielsweise durch einen Mikrooganismus infiziert wird. Unter "Mikroorganis mus" wird erfindungsgemäß jeder Organismus verstanden, der die Zielzelle so beeinflußt, daß auf seiner Oberfläche ein vom Mi kroorganismus induziertes Zielantigen im oben beschriebenen Umfang exprimiert wird. Unter Mikroorganismen werden erfin dungsgemäß beispielsweise Bakterien, Viren, Protozoen und Pilze verstanden. Zu den Bakterien gehören beispielsweise Gram-posi tive und und Gram-negative Bakterien, Mycoplasmen und Rickett sien. Von den Protozoen mitumfaßt werden insbesondere Plasmo dien. Von den Viren umfaßt werden beispielsweise Retroviren, Adenoviren, Herpesviren, Hepatitis-Viren, Togaviren, Pockenvi ren usw. Entscheidend ist, daß in Zellen, die von einem oder mehreren dieser Mikroorganismen infiziert wurden, auf der Zell oberfläche Antigene exprimiert werden, die durch die Mikroor ganismen-Infektion induziert werden. Dabei handelt es sich um Antigene, die von den Zielzellen als Antwort auf die Mikroorga nismen-Infektion produziert werden und auf der Zelloberfläche erscheinen (wirtseigene Antigene), nicht dagegen um Zielantige ne, die durch die Mikroorganismen selbst produziert werden. Die Infektion einer Zielzelle durch einen Mikroorganismus führt ebenfalls zu einer Zellstreß-Situation für die Zelle, die als Antwort hierauf die Expression bestimmter Proteine induziert, beispielsweise von Hitzeschock-Proteinen und von MIC-Proteinen.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten intakten bispezifischen und trispezifischen Antikörper führen nicht nur einen Typ von Immunzellen, sondern T-Zellen und akzessorische Zellen an die Zielzelle heran, und sie sind aus diesem Grund für die Erken nung induzierbarer Oberflächenantigene als operationelle Ziel strukturen besonders geeignet. Es konnte gezeigt werden, daß bereits wenige Zielantigene in einer Menge von 100 bis 5000 pro Zelle auf der Zielzelle ausreichend sind, um diese zu zerstö ren. Die hierzu durchgeführten in vitro-Experimente mit Stamm zellpräparaten (PBSZ) sind im nachfolgenden Beispiel 1 be schrieben. Somit ist die erfindungsgemäße Klasse intakter bi spezifischer und trispezifischer Antikörper befähigt, auch bei einer sehr geringen Expression der Zielantigene Tumorzellen oder Zielzellen zu zerstören oder nach deren Erkennung eine Immunantwort zu initiieren.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können, da sie gegen induzier bare Antigene gerichtet sind, dazu beitragen, das Problem feh lender zielzellspezifischer, für eine Immuntherapie notwendige Zielantigene auf Tumorzellen und auf durch Mikroorganismen in fizierten Zellen zu lösen. Da derartige induzierbare Antigene nicht nur auf Tumorzellen vorkommen, sondern generell in Streß situationen produziert werden, können auch Erkrankungen immun therapeutisch angegangen werden, die durch Infektion von bei spielsweise Viren, Einzellern, Bakterien oder Pilzen ausgelöst wurden. Hierbei handelt es sich um die oben bereits näher be schriebenen MIC-Moleküle und Hitzeschock-Proteine.

Die oben beschriebenen intakten bispezifischen oder trispezifi schen Antikörper werden zur Induktion einer Immunantwort und/ oder zur Zerstörung der Zielzelle therapeutisch eingesetzt. Die Antikörper werden in Form einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht, die übliche Träger und/oder Hilfsstoffe enthalten kann, um eine Stabilität und eine günstige Verabreichungsform verbunden mit hoher Verträglichkeit und Wirksamkeit zu ermögli chen. Durch die Applikation der Antikörper kann eine Prophylaxe und Behandlung von beispielsweise Tumorerkrankungen erreicht werden, so daß eine Immunität gegen den Erreger bzw. gegen den Tumor, bevorzugt eine Langzeit-Immunität, erreicht wird.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper können in einer relativ geringen Menge eingesetzt werden, d. h. sie sind bereits in einer Menge von 5 µg bis 10 mg pro Patient wirksam, um die erfindungsgemäße Immunität, beispielsweise Tumorimmunität, oder die erfindungsgemäß erreichbare Zerstörung der Zielzelle zu bewirken. Bevorzugt liegt die Applikationsmenge im Bereich von 10 µg bis 100 µg pro Patient, sie kann jedoch auch, falls not wendig, darüber liegen, also im Bereich von 100 µg bis 5 mg pro Patient.

Bei einem Tumorpatienten sollte, da die Induktion einer Tumor immunität eine gewisse Zeit benötigt, bei Beginn der Therapie eine Minimal Residual Disease (MRD) Situation mit wenigen ver bliebenen Tumorzellen vorliegen. Unter MRD versteht man den Zeitraum nach der Reduktion von größeren Tumormengen mit geeig neten Methoden, wie beispielsweise der Entfernung des Primärtu mors durch chirurgische Maßnahmen, indem noch residuelle Tumor zellen existieren, die zwar u. U. nicht nachweisbar sind, aber nach einer gewissen Zeit zum Rezidiv führen. Der Beginn der Therapie kann aber bereits vor Entfernung des Tumors liegen, um sicherzustellen, daß genügend Tumorzellen durch die bispezifi schen oder trispezifischen Antikörper gebunden und dem Immunsy stem präsentiert werden.

Bei den erfindungsgemäß verwendbaren geringen Mengen von ver abreichten intakten bispezifischen oder trispezifischen Anti körpern ist die Gefahr schwerwiegender Nebenwirkungen wesent lich verringert. Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß eine humorale Immunantwort mit komplement-fixierenden Antikörpern (bei Menschen die Isotypen IgG1 und IgG3), die in der Lage sind, Tumorzellen zu zerstören, induziert wird.

Durch die Bindung des Antikörpers an die Fc-Rezeptor positive Zelle wird diese aktiviert, wodurch die Expression von Zytoki nen und/oder von co-stimulatorischen Antigenen initiiert oder erhöht wird.

Die erfindungsgemäßen Antikörper übertragen durch die co-sti mulatorischen Antigene auf der akzessorischen Zelle an die T- Zelle zumindest ein zweites Aktivierungssignal, welches für eine physiologische Aktivierung der T-Zelle benötigt wird, wo bei sich diese Aktivierung in der Hochregulation von Aktivie rungsmarkern, der Zerstörung der Zielzelle und/oder in einer Proliferation der T-Zelle zeigt. Nach Verabreichung des Anti körpers an den Patienten wird hierdurch eine Tumorimmunität, bevorzugt eine Langzeit-Tumorimmunität, initiiert.

Die erfindungsgemäß erreichbare Immunantwort ist dadurch cha rakterisiert, daß in einem Organismus das körpereigene Immunsy stem derart aktiviert wird, daß es zu einer dauerhaften Zerstö rung und/oder Kontrolle des Tumors oder der Infektionserkran kung kommt. Weiterhin vorteilhaft ist bei Verwendung der hier beschriebenen Antikörper die Reduktion von Nebenwirkungen, die üblicherweise eingesetzte Antikörper, beispielsweise monoklona le Antikörper, besitzen. Zielstruktur für die erfindungsgemäßen Antikörper sind induzierbare Oberflächenantigene gemäß der De finition der vorliegenden Erfindung, d. h. also solche, die auf der Zielzelle nicht vorkommen oder in einer vernachlässigbaren Menge, so daß eine direkte Zerstörung der Zielzelle oder eine Immunantwort, insbesondere eine lang andauernde Immunantwort bzw. Immunität nicht induziert oder zumindest nicht in einem therapeutisch vernünftigen Ausmaß induziert wird.

Erfindungsgemäß ist jede Art von Tumoren behandelbar, die unter die oben angegebene Definition fällt. Insbesondere therapierbar sind epitheliale Tumore, Adenokarzinome, Kolonkarzinome, Mamma karzinome, Ovarialkarzinome, Lungenkarzinome und Hals-, Nasen- und/oder Ohrentumore. Weiterhin behandelbar sind nicht-epithe liale Tumoren wie Leukämien und Lymphome. Weiterhin therapier bar sind virusinduzierte Tumoren, beispielsweise Lebertumore oder Cervixkarzinome.

Durch die Anwendung der erfindungsgemäß bereitgestellten Anti körper sind auch durch Mikroorganismen infizierte Zielzellen und die hierdurch induzierten Erkrankungen therapierbar. Hierzu gehören beispielsweise Infektionen durch CMV und HIV.

Unter "Zielzelle" sind erfindungsgemäß alle Zellen zu verste hen, die in Form einer Tumorzelle entartet sind oder die durch einen Mikroorganismus infiziert wurden und die als Antwort auf die Zell-Entartung oder die Mikroorganismus-Infektion ein Anti gen exprimieren, welches in der Zielzelle im Normalzustand, d. h. ohne Entartung bzw. ohne Infektion, nicht produziert wird oder in einem so geringen Maße, daß hierdurch eine Immunthera pie nicht induzierbar ist oder eine immuntherapeutische Zerstö rung der Zielzelle nicht möglich ist.

Erfindungsgemäß sind nicht beliebige Antikörper verwendbar, sondern diese müssen intakt sein, d. h. sie müssen einen funk tionellen Fc-Teil besitzen, und sie sind bevorzugt heterologer Natur sein, d. h. die Antikörper sind dann aus schweren Immung lobulinketten unterschiedlicher Subklassen(-Kombinationen, auch Fragmente bzw. einzelne ausgetauschte Aminosäuren) und/ oder Herkunft (Spezies) zusammengesetzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden bispezifische und/oder trispezifische Antikörper einge setzt, die in der Lage sind, die Fc-Rezeptor-positive Zelle zu aktivieren. Hierdurch wird die Expression von Cytokinen und/ oder co-stimulatorischen Antigenen initiiert oder erhöht.

Bei den trispezifischen Antikörpern erfolgt die Bindung an die Fc-Rezeptor positiven Zellen bevorzugt beispielsweise über den Fc-Rezeptor von Fc-Rezeptor positiven Zellen oder auch über andere Antigene auf Fc-Rezeptor positiven Zellen (Antigen-prä sentierenden Zellen), wie z. B. den Mannose-Rezeptor.

Die erfindungsgemäß verwendbaren heterologen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper sind zum Teil an sich be kannt, zum Teil werden sie aber auch in der vorstehenden Anmel dung zum ersten Mal beschrieben.

Nachfolgend wird die Erfindung insbesondere anhand von bispezi fischen Antikörpern beschrieben. Die bispezifischen Antikörper stellen jedoch nur eine Ausführungsform der Erfindung dar. Es ist auch möglich, trispezifische Antikörper mit den oben ange gebenen Eigenschaften einzusetzen. Weiterhin wird die Erfindung insbesondere am Beispiel der Induktion einer Tumorimmunität dargestellt. Dies ist jedoch ebenfalls nur eine mögliche Aus führungsform der Erfindung, die ganz allgemein für immunthera peutische Zwecke einsetzbar ist. Beispielsweise ist es auch möglich, durch die Anwendung der erfindungsgemäß bereitgestell ten Antikörper eine Immunität gegen Mikroorganismen zu errei chen, die auf den infizierten Zielzellen u. a. die hier be schriebenen Zielantigene induzieren.

Bezugnehmend auf das Merkmal (a) wird das 1. Signal beispiels weise über den T-Zell-Rezeptor-Komplex der T-Zelle übertragen und kann damit, für sich allein betrachtet, zu einer unphysio logischen Aktivierung der T-Zelle führen. Die Zelle wird hier durch anergisiert und kann auf T-Zell-Rezeptor vermittelte Sti muli nicht mehr angemessen reagieren. Durch die erfindungsgemä ßen bispezifischen oder trispezifischen Antikörper wird zusätz lich gleichzeitig durch die kostimulatorischen Antigene auf der Fc-Rezeptor positiven Zelle an die T-Zelle zumindest ein 2. Aktivierungssignal übertragen, das zu einer physiologischen Aktivierung der T-Zelle und in der Folge entweder zu einer Zer störung der Zielzelle und/oder einer Proliferation der T-Zelle führt. Als weiteres Kriterium für die Aktivierung der T-Zelle kann die Hochregulation von Oberflächenantigenen wie z. B. CD2, CD25 und/oder CD28 und/oder die Sekretion von Cytokinen wie z. B. IL-2 oder INF-γ herangezogen werden.

Mit den erfindungsgemäß verwendeten bsAk werden also T-Zellen aktiviert und gegen die Zielzellen redirigiert. Unspezifische Aktivierungen von T-Zellen ohne Redirektion hatten in der Im muntherapie generell wenig Erfolg.

Auf der Zielzelle erfolgt eine Hochregulation von MHC 1, sowie eine Aktivierung der intrazellulären Prozessierungsmaschinerie (Proteasom-Komplex) aufgrund der Freisetzung von Zytokinen (wie z. B. INF-γ und TNF-α) in unmittelbarer Nachbarschaft der Ziel zelle. Die Zytokine werden aufgrund bispezifischer Antikörper vermittelter Aktivierung von T-Zellen und akzessorischen Zellen freigesetzt (siehe Abb. 1 und 3). D. h. durch den intakten bsAk werden nicht nur Zielzellen zerstört oder phagozytiert, sondern indirekt auch deren Immunität, beispielsweise gegen den Tumor, erhöht.

Die Aktivierung der Fc-Rezeptor positiven Zelle durch den bsAk ist von der Subklasse bzw. der Subklassenkombination des bsAk abhängig. Wie in in vitro-Versuchen nachgewiesen werden konnte, sind beispielsweise bsAk der Subklassenkombination Maus-IgG2a/ Ratte-IgG2b in der Lage, an Fc-Rezeptor positive Zellen zu bin den und diese gleichzeitig zu aktivieren, was zur Hochregula tion bzw. Neuausbildung (Expression) von kostimulatorischen Antigenen, wie z. B. CD40, CD80 oder CD86, auf der Zelloberflä che dieser Zellen führt. Dagegen sind bsAk der Subklassenkom bination Maus-IgG1/IgG2b zwar in der Lage an Fc-Rezeptor posi tive Zellen zu binden (1), können diese aber offenbar nicht in vergleichbarem Maße aktivieren (2).

Während der intakte bsAk die T-Zelle mit einem Bindungsarm (z. B. an CD3 oder CD2) bindet und gleichzeitig aktiviert, kön nen kostimulatorische Signale von der, an den Fc-Teil des bsAk gebundenen Fc-Rezeptor positiven Zelle, an die T-Zelle übermit telt werden. D. h. erst die Kombination von Aktivierung der T- Zelle über einen Bindungsarm des bsAk und der gleichzeitigen Übertragung von kostimulatorischen Signalen von der Fc-Rezeptor positiven Zelle auf die T-Zelle, führt zu einer effizienten T- Zellaktivierung. Zielzellspezifische T-Zellen, die an der Zielzelle ungenügend aktiviert wurden und anergisch sind, kön nen nach einer ex vivo-Langzeit-Inkubationsbehandlung ebenfalls reaktiviert werden.

Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Induktion einer Zielzell immunität ist die mögliche Phagozytose, Prozessierung und Prä sentation von Zielzellbestandteilen durch die vom bsAk herange führten und aktivierten akzessorischen Zellen (Monozyten/Makro phagen, dendritische Zellen und NK-"Natural Killer"-Zellen). Durch diesen klassischen Mechanismus der Präsentation von Anti genen können sowohl zielzellspezifische CD4- wie auch CD8-posi tive Zellen generiert werden. Zielzellspezifische CD4-Zellen spielen darüberhinaus eine wichtige Rolle für die Induktion einer humoralen Immunantwort im Zusammenhang mit der T-B-Zell Kooperation.

Bispezifische und trispezifische Antikörper können mit einem Bindungsarm an den T-Zellrezeptor-Komplex der T-Zelle, mit dem zweiten Bindungsarm an zielzellassoziierte Antigene auf der Zielzelle binden. Sie aktivieren dabei T-Zellen, die durch Freisetzung von Zytokinen oder Apoptose-vermittelnde Mechanis men die Zielzellen zerstören. Darüber hinaus besteht offenbar die Möglichkeit, daß T-Zellen im Rahmen der Aktivierung mit bispezifischen Antikörpern tumorspezifische Antigene über ihren Rezeptor erkennen und dadurch eine dauerhafte Immunisierung eingeleitet wird. Von besonderer Bedeutung ist dabei der intak te Fc-Teil des bispezifischen oder trispezifischen Antikörpers, der die Bindung an akzessorische Zellen wie z. B. Monozyten/Ma krophagen und dendritische Zellen vermittelt und diese veran laßt selbst zytotoxisch zu werden und/oder gleichzeitig wichti ge kostimulatorische Signale an die T-Zelle weiterzugeben (Abb. 1). Auf diese Weise kann offensichtlich eine T-Zellantwort u. U. auch gegen bislang unbekannte, zielspezifische Peptide indu ziert werden.

Durch Redirektion von u. U. anergisierten, zielspezifischen T- Zellen an Zielzellen mittels bispezifischer und/oder trispezi fischer Antikörper bei gleichzeitiger Kostimulation derartiger T-Zellen durch akzessorische Zellen, welche an den Fc-Teil des bispezifischen oder trispezifische Antikörpers binden, könnte die Anergie von zytotoxischen T-Zellen (CTLs) aufgehoben wer den. D. h. eine im Patienten gegen die Zielzelle existierende T- Zell-Toleranz kann mittels intakter heterologer bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper gebrochen und damit eine dauerhafte Immunität, z. B. eine Tumorimmunität, induziert wer den.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper sind bevorzugt zur Reaktivierung von in Anergie befindlichen, zielspezifischen T- Zellen befähigt. Weiterhin sind sie zur Induktion von tumorre aktiven Komplement-bindenden Antikörpern und damit zur Induk tion einer humoralen Immunantwort in der Lage.

Die Hindung erfolgt bevorzugt über CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 und/oder CD44 an die T-Zelle. Die Fc-Rezeptor positi ven Zellen weisen zumindest einen Fcγ-Rezeptor I, II oder III auf.

Erfindungsgemäß einsetzbare Antikörper sind zur Bindung an Mo nozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, "Natural Killer"- Zellen (NK-Zellen) und/oder aktivierte neutrophile Zellen als Fcγ-Rezeptor 1 positive Zellen befähigt.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper bewirken, daß die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als ko stimulatorische Antigene oder/und die Sekretion von Zytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird. Die Zytokine sind bevorzugt IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 8, IL-12 und/oder TNF-α.

Die Bindung an die T-Zelle erfolgt bevorzugt über den T-Zell- Rezeptor-Komplex der T-Zelle.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren bispezifischen Antikörper sind bevorzugt:

- ein anti-CD3 × anti-operationell-induzierbares Zielzell assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 × anti-operatio nell-induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-asso ziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder an ti-CD8 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-assozi iertes Antigen- und/oder anti-CD2 × anti-operationell-in duzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti- CD28 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-assoziier tes Antigen- und/oder anti-CD44 × anti-operationell-indu zierbares Zielzell-assoziiertes Antigen-Antikörper ist.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren trispezifischen Antikörper sind bevorzugt:

- ein anti-CD3 × anti-operationell-induzierbares Zielzell assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 × anti-operatio nell-induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-asso ziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder an ti-CD5 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-assozi iertes Antigen- und/oder anti-CD2 × anti-operationell-in duzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti- CD28 × anti-operationell-induzierbares Zielzell-assoziier tes Antigen- und/oder anti-CD44 × anti-operationell-indu zierbares Zielzell-assoziiertes Antigen-Antikörper.

Bevorzugt einsetzbare Spezifitäten der erfindungsgemäßen Anti körper, die mit den unten genannten Isotyp-Kombinationen kom binierbar sind, sind beispielsweise:
Anti-CD3 × Anti-Hsp70
Anti-CD2 × Anti-Hsp70
Anti-CD28 × Anti-Hsp70
Anti-CD5 × Anti-Hsp70
Anti-CD3 × Anti-MICA
Anti-CD2 × Anti-MICA
Anti-CD28 × Anti-MICA
Anti-CD5 × Anti-MICA
Anti-CD3 × Anti-MICB
Anti-CD2 × Anti-MICB
Anti-CD28 × Anti-MICB
Anti-CD5 × Anti-MICB

Die erfindungsgemäß einsetzbaren trispezfischen Antikörper wei sen zumindest eine T-Zell-Bindungsarm, einen Zielzell-Bin dungsarm und einen an Fc-Rezeptor positive Zellen bindenden Bindungsarm auf. Dieser zuletzt genannte Bindungsarm kann ein anti-Fc-Rezeptor-Bindungsarm oder ein Mannose-Rezeptor-Bin dungsarm sein.

Der bispezifische Antikörper ist bevorzugt ein heterologer in takter Ratte/Maus bispezifischer Antikörper.

Mit den erfindungsgemäß einsetzbaren bispezifischen und trispe zifischen Antikörpern werden T-Zellen aktiviert und gegen die Zielzellen redirigiert. Bevorzugt einsetzbare heterologe intak te bispezifische Antikörper werden aus einer oder mehreren der nachfolgenden Isotyp-Kombinationen ausgewählt:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3[orientaler Allotyp G3m(st) = Bin dung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3[kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgOl-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human- IgG4-[Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human- IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Hu man-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2 : < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL] - Human-IgG4-[Hinge]-Human-IgG4-[CH2]-Human-IgG3*-[CH3]
HumanlgG1/Ratte[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1 [Hinge]-Human- IgG4-[CH2]-HumanIgG3*[CH3]
HumanlgGl/Maus[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1 [Hinge]-Human-IgG4- [CH2]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG4/Human[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4-[CH2]-HumanIgG3*-[CH3].

Die oben genannten Antikörper sind beispielhaft genannt. Diese und andere erfindungsgemäß einsetzbaren Antikörper können vom Fachmann anhand von speziellen Techniken hergestellt werden. Beispielhaft hierfür ist die DE 195 31 346 genannt.

Insbesondere Greenwood et. al. beschreiben die Möglichkeit, einzelne Immunglobulin-Domänen (z. B. CH2) durch geeignete Klo nierungstechniken auszutauschen. Dadurch wird die Technik be reitgestellt, um neue Antikörperkombinationen herzustellen, z. B.: human-(VH-CH1, VL-CL)-human IgG4-(hinge)-human IgG4 (N- terminale Region von CH2)-human IgG3* (C-terminale Region von CH2 : < Aminosäureposition 251)-human IgG3* (CH3).

Die Kombination mit einem Antikörper: human IgG4 zur Herstel lung des bispezifischen Antikörpers: human IgG4/human-(VH-CH1, VL-CL)-human IgG4-(hinge)-human IgG4 (N-terminale Region von CH2)-human IgG3* (C-terminale Region von CH2 : < Aminosäureposi tion 251)- human IgG3* (CH3) wird durch einfache Zellfusion, wie in Lindhofer et al. (3. Immunol. 155: 219, 1995) beschrie ben, herbeigeführt.

Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale, chimäre, rekombinante, syn thetische, halbsynthetische oder chemisch modifizierte intakte Antikörper mit beispielsweise Fv-, Fab-, scFv- oder F(ab)₂- Fragmenten.

Bevorzugt werden Antikörper oder Derivate oder Fragmente vom Menschen verwendet oder solche, die derart verändert sind, daß sie sich für die Anwendung beim Menschen eignen (sogenannte "humanized antibodies") (siehe z. B. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1992), 217; Mocikat et al., Transplantation 57 (1994), 405).

Die Herstellung der verschiedenen oben genannten Antikörperty pen und -fragmente ist dem Fachmann geläufig. Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die ihren Ursprung vorzugsweise in Säugetieren, z. B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen oder Ziege, haben, kann mittels herkömmlicher Methoden erfolgen, wie sie z. B. in Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), in Harlow und Lane (Antibodies, A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor) oder in Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschrie ben sind.

Ferner ist es möglich, die beschriebenen Antikörper mittels rekombinanter DNA-Technologie nach dem Fachmann geläufigen Techniken herzustellen (siehe Kurucz et al., J. Immunol. 154 (1995), 4576; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90 (1993), 6444).

Die Herstellung von Antikörpern mit zwei verschiedenen Spezi fitäten, den sogenannten bispezifischen Antikörpern, ist zum einen durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologie möglich, aber auch durch die sogenannte Hybrid-Hybridoma-Fusionstechnik (siehe z. B. Milstein et al., Nature 305 (1983), 537). Hierbei werden Hybridomazellinien, die Antikörper mit jeweils einer der gewünschten Spezifitäten produzieren, fusioniert und rekombi nante Zellinien identifiziert und isoliert, die Antikörper mit beiden Spezifitäten produzieren.

Das der Erfindung zugrunde liegende Problem kann sowohl durch bispezifische als auch trispezifische Antikörper gelöst werden, sofern sie die im Anspruch 1 gekennzeichneten Eigenschaften und Wirkungen aufweisen. Nachfolgend wird die Herstellung von Anti körpern mit Zwei- und Dreispezifitäten näher beschrieben. Die Bereitstellung derartiger bispezifischer und trispezifischer Antikörper gehört zum Stand der Technik, und auf die derartige Herstellungstechniken beschreibende Literatur wird hier voll inhaltlich Bezug genommen.

Die Herstellung von Antikörpern mit drei Spezifitäten, soge nannten trispezifischen Antikörpern, durch die das der Erfin dung zugrundeliegende Problem ebenfalls lösbar ist, kann bei spielsweise derart erfolgen, daß an eine der schweren Ig-Ketten eines bispezifischen Antikörpers eine dritte Antigenbindungs stelle mit einer weiteren Spezifität, z. B. in Form eines "sing le chain variable fragments" (scFv), angekoppelt wird. Das scFv kann beispielsweise über einen

-S-S(G₄S)_nD-I-Linker

an eine der schweren Ketten gebunden sein (S = Serin, G = Gly cin, D = Aspartat, I = Isoleucin).

Analog dazu können trispezifische F(ab)₂-Konstrukte hergestellt werden, indem die CH2-CH3-Regionen der schweren Kette einer Spezifität eines bispezifischen Antikörpers ersetzt werden durch ein scFv mit einer dritten Spezifität, während die CH2- CH3-Regionen der schweren Kette der anderen Spezifität bei spielsweise durch Einbau eines Stopcodons (am Ende der "Hinge"- Region) in das codierende Gen, z. B. mittels homologer Rekombi nation, entfernt werden (siehe Abb. 2).

Möglich ist auch die Herstellung trispezifischer scFv-Kon strukte. Hierbei werden drei VH-VL-Regionen, die drei ver schiedene Spezifitäten repräsentieren, hintereinander in Reihe angeordnet (Abb. 3).

Erfindungsgemäß werden z. B. intakte bispezifische Antikörper verwendet. Intakte bispezifische Antikörper sind aus zwei Anti körper-Halbmolekülen (je eine H- und L-Immunglobulinkette), die jeweils eine Spezifität repräsentieren, zusammengesetzt, und besitzen darüber hinaus, wie normale Antikörper auch, einen Fc- Teil mit den bekannten Effektorfunktionen. Sie werden bevorzugt durch die Quadrom-Technologie hergestellt. Dieses Herstellungs verfahren ist beispielhaft in der DE-A-44 19 399 beschrieben. Auf diese Druckschrift, auch bzgl. einer Definition der bispe zifischen Antikörper, wird zur vollständigen Offenbarung voll inhaltlich Bezug genommen. Selbstverständlich sind auch andere Herstellungsverfahren einsetzbar, solange sie zu den erfin dungsgemäß notwendigen intakten bispezifischen Antikörpern der obigen Definition führen.

Die Erfindung wurde vorstehend und wird nachstehend insbesonde re anhand von bispezifischen Antikörpern beschrieben. An die Stelle der bispezifischen Antikörper sind selbstverständlich aber auch trispezifische Antikörper einsetzbar, solange sie die gestellten Bedingungen erfüllen.

Die Erfindung wurde und wird anhand der beiliegenden Abbildun gen näher beschrieben. Die Abbildungen zeigen:

Abb. 1: Darstellung der Antikörper der Erfindung und ihres Wirkprinzips;

Abb. 2: Trispezifische F(ab)₂-Antikörper

Abb. 3: Trispezifischer scFv-Antikörper

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Antikörper eingesetzt, um durch ein ex-vivo-Immunisierungsverfahren eine Prophylaxe und Thera pie von Tumorerkrankungen und von durch Mikroorganismen hervor gerufenen Erkrankungen zu erreichen, insbesondere um eine Immu nität gegen einen Tumor oder gegen eine Infektion durch Mi kroorganismen zu induzieren. Dieses ex-vivo-Immunisierungsver fahren unter Verwendung der erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper umfaßt die nachfolgenden Schritte:

a) Isolierung autologer Zielzellen;
b) Behandeln der Zielzellen, um ihr Überleben nach Reinfusion zu verhindern;
c) 30 Minuten bis 4 Stunden, bevorzugt 30 Minuten bis 2 Stun den, vor Reinfusion der inaktivierten Zielzellen erfolgt eine Infusion der erfindungsgemäßen intakten bispezifi schen und/oder trispezifischen Antikörper in den Patien ten;
d) Reinfundierung der behandelten Zielzellen in den Patien ten.

Unter Zielzellen werden erfindungsgemäß sowohl Tumorzellen ver standen als auch Zellen, die durch Mikroorganismen, beispiels weise durch Bakterien, Viren oder Pilze, infiziert wurden. Nachfolgend wird die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung anhand der Behandlung autologer Tumorzellen dargestellt. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt, sondern kann auch auf solche Zielzellen angewandt werden, die durch Mikroor ganismen infiziert wurden und auf denen wirtseigene Antigene induziert wurden. Zur Induktion von Antigenen und ihrer Bedeu tung für die vorliegende Erfindung wird auf die obigen Ausfüh rungen verwiesen.

In der nunmehr beschriebenen Ausführungsform der Erfindung wer den heterologe intakte bispezifische und/oder trispezifische Antikörper verwendet. Um ein Überleben der Tumorzellen nach Reinfusion zu verhindern, wurden die Tumorzellen in an sich bekannter Weise behandelt, beispielsweise durch Bestrahlung oder Hitzebehandlung. Die Tumorzellen werden nach Bestrahlung mit den intakten heterologen bispezifischen und/oder trispezi fischen Antikörpern in Kontakt gebracht. Erfindungsgemäß sind nicht beliebige Antikörper verwendbar, sondern diese müssen intakt sein, d. h. sie müssen einen funktionellen Fc-Teil besit zen, und sie müssen heterologer Natur sein, d. h. die Antikörper sind dann aus schweren Immunglobulinketten unterschiedlicher Subklassen(-Kombinationen, auch Fragmente) und/oder Herkunft (Spezies) zusammengesetzt.

Durch dieses Verfahren und den Einsatz der hier beschriebenen Antikörper ist gewährleistet, daß nach Infusion der Antikörper in den Patienten, aus dem die Tumorzellen zuvor entnommen wur den, eine Tumorimmunität aufgebaut wird. Die Reinfusion der behandelten Tumorzellen erfolgt bevorzugt in einen Patienten nach der Behandlung des Primärtumors, bevorzugt bei Patienten in einer minimal residual disease (MRD)-Situation. Bei Pa tienten mit wenig verbliebenen Tumorzellen, bei denen aller dings die Gefahr eines Rezidivs hoch sein kann, wird das erfin dungsgemäß bereitgestellte Verfahren besonders erfolgreich an wendbar sein.

Erfindungsgemäß werden zwei Verfahrens-Varianten unterschieden:

1. Kurzzeitinkubation, und
2. Langzeitinkubation

Bei der Kurzzeitinkubation werden die autologen Tumorzellen nach ihrer Gewinnung zunächst inaktiviert. 30 Minuten bis 4 Stunden, bevorzugt 30 Minuten bis 2 Stunden, vor Reinfusion der behandelten Zielzellen werden die erfindungsgemäßen intakten bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörpern in den Pa tieten infundiert. Die behandelten Tumorzellen werden dann zur Reinfusion vorbereitet und infundiert.

Bei der Langzeitinkubation werden die autologen Tumorzellen ebenfalls zunächst durch beispielsweise Bestrahlung oder Tempe raturerhöhung inaktiviert. Anschließend werden hierzu Blutzel len des Patienten, bevorzugt mononukleäre Zellen aus dem peri pheren Blut (PBMC = peripheral blood mononucleated cells) sowie die erfindungsgemäßen bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper zugegeben, und diese Mischung wird dann über einen längeren Zeitraum, beispielsweise 1 bis 14 Tage lang, bevorzugt 3 bis 10 Tage und weiterhin bevorzugt 6 bis 10 Tage, inkubiert.

Hierdurch wird eine Vielzahl von Immunzellen bereits ex vivo gegen den Tumor "geprimt". Anschließend werden diese in den Patienten reinfundiert. Durch die Langzeitinkubation wird auch eine Internalisierung der Antikörper und ihr Abbau erreicht.

Erste in vitro-Ergebnisse zeigen, daß durch derartig vorbehan delte Immunzellen Tumorzellen ohne weitere Zugabe von bispezi fischen und/oder trispezifischen Antikörpern zerstört werden können.

Sowohl bei der Kurzzeitinkubation als auch bei der Langzeitin kubation werden T-Zellen an die Tumorzellen mittels der an den Tumorzellen immobilisierten intakten bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörper redirigiert; gleichzeitig findet eine Hindung von Fc-Rezeptor positiven Zellen an den Fc-Teil des bispezifischen und/oder trispezifischen Antikörpers nach Reinfusion statt. Dabei werden die Fc-Rezeptor positiven Zellen durch Bindung an die Fc-Teile von (an der T-Zelle bzw. Tumor zelle)immobilisierten intakten bispezifischen Antikörpern akti viert.

Zur Verbesserung des Immunisierungserfolges können die entweder nach dem Kurzzeit-Inkubationsverfahren oder nach dem Langzeit- Inkubationsverfahren mit den Antikörpern behandelten Tumorzel len nicht nur einmal an den Patienten appliziert, sondern wahl weise auch mehrfach verabreicht werden.

Auf der Tumorzelle erfolgt eine Hochregulation von MHC 1, sowie eine Aktivierung der intrazellulären Prozessierungsmaschinerie (Proteasom-Komplex) aufgrund der Freisetzung von Zytokinen (wie z. B. INF-γ und TNF-α) in unmittelbarer Nachbarschaft der Tumor zelle. Die Zytokine werden aufgrund bispezifischer Antikörper vermittelter Aktivierung von T-Zellen und akzessorischen Zellen freigesetzt (siehe Abb. 1 und 3). D. h. durch den intakten bsAk werden nicht nur Tumorzellen zerstört oder phagozytiert, son dern indirekt auch deren Tumorimmunität erhöht.

Während der intakte bsAk die T-Zelle mit einem Bindungsarm (z. B. an CD3 oder CD2) bindet und gleichzeitig aktiviert, kön nen kostimulatorische Signale von der, an den Fc-Teil des bsAk gebundenen Fc-Rezeptor positiven Zelle, an die T-Zelle übermit telt werden. D. h. erst die Kombination von Aktivierung der T- Zelle über einen Bindungsarm des bsAk und der gleichzeitigen Übertragung von kostimulatorischen Signalen von der Fc-Rezeptor positiven Zelle auf die T-Zelle, führt zu einer effizienten T- Zellaktivierung. Tumorspezifische T-Zellen, die an der Tumor zelle ungenügend aktiviert wurden und anergisch sind, können nach der erfindungsgemäßen ex vivo-Vorbehandlung ebenfalls re aktiviert werden.

Ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Induktion einer Tumorim munität ist die mögliche Phagozytose, Prozessierung und Präsen tation von Tumorbestandteilen durch die vom bsAk herangeführten und aktivierten akzessorischen Zellen (Monozyten/Makrophagen, dendritische Zellen und NK-"Natural Killer"-Zellen). Durch die sen klassischen Mechanismus der Präsentation von Antigenen kön nen sowohl tumorspezifische CD4- wie auch CD8-positive Zellen generiert werden. Tumorspezifische CD4-Zellen spielen darüber hinaus eine wichtige Rolle für die Induktion einer humoralen Immunantwort im Zusammenhang mit der T-B-Zell-Kooperation.

Es gibt erste in vivo-Daten aus Mausversuchen, die auf eine derartige dauerhafte Tumorimmuntät nach Behandlung mit einem syngenen Tumor und intakten bsAk hinweisen. In diesen Versuchen überlebten insgesamt 14 von 14 Tieren, die nach einer ersten Tumorinjektion erfolgreich mit bsAk behandelt werden konnten, eine weitere Tumorinjektion 144 Tage nach der ersten Tumorin jektion - ohne eine erneute Gabe von bsAk.

Weitere Vorteile bei der ex vivo-Immunisierung mittels bispezi fischer und/oder trispezifischer Antikörper sind (i) die Mini mierung von möglichen Nebenwirkungen, (ii) die kontrollierte Bindung des Tumorbindungsarms an die Tumorzelle außerhalb des Körpers, (iii) ein möglichst geringer Verbrauch von bispezifi schen und trispezifischen Antikörpern, (iv) und die Reprodu zierbarkeit bzw. Steuerung des Immunisierungserfolges durch Verabreichung einer definierten Anzahl von Tumorzellen. Dabei sind grundsätzlich zwei Vorgehensweisen möglich, die unten im einzelnen erläutert werden. Ein wichtiger Aspekt bei der Lang zeitinkubation ist, daß der eingesetzte bispezifische oder tri spezifische Antikörper innerhalb der projektierten Inkubations zeit verbraucht und abgebaut wird. Damit würde für eine derar tige Immunisierung die langwierige Arzneimittelanmeldung ent fallen.

Beim Langzeit-Inkubationsverfahren werden die mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut mit den inaktivierten, autologen Tumorzellen vermischt und zusammen mit den Antikörpern für ei nen Zeitraum von 1-14 Tagen, bevorzugter 3 bis 10 Tagen, wei terhin bevorzugt 6 bis 10 Tagen, inkubiert. Diese Inkubation erfolgt bevorzugt bei 37°C unter sterilen Bedingungen und unter GMP-Bedingungen (Good Manufacturing Production = GMP) in einem Brutschrank.

Die obengenannten Inkubationsbedingungen sind nur beispielhaft zu verstehen. In Abhängigkeit von den Tumorzellen und den ver wendeten Antikörpern können auch andere Zeiträume, Temperatur bedingungen etc., allgemein andere Inkubationsbedingungen, ge wählt werden. Der Fachmann kann durch einfache Versuche diese Bedingungen festlegen.

Bei der Ex-vivo-Immunisierung werden die Tumorzellen bevorzugt in einer Menge von 10⁷ bis 10⁹ Zellen, weiterhin bevorzugt in einer Menge von ca. 10⁸ Zellen, verwendet. Die mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut werden in einer Menge von ca. 10⁸ bis 10¹⁰ Zellen zugegeben. Selbstverständlich ist es für den Fachmann auch möglich, andere Inkubationsbedingungen zu wählen, die durch Laborversuche ermittelt werden können (bspw. Änderun gen in der Zellzahl und Inkubationsdauer).

Die eingesetzten autologen Tumorzellen werden, um nach Reinfu sion ein weiteres Überleben der Tumorzellen zu verhindern, bspw. bestrahlt. Beispielsweise werden γ-Strahlen verwendet, die bspw. in einer Dosisstärke von 20 bis 200 Gy eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper sind bevorzugt zur Reaktivierung von in Anergie befindlichen, tumorspezifischen T- Zellen befähigt. Weiterhin sind sie zur Induktion von tumorre aktiven Komplement-bindenden Antikörpern und damit zur Induk tion einer humoralen Immunantwort in der Lage.

IMMUNISIERUNGSPROTOKOLLE Ex vivo-Immunisierung (Kurzzeitinkubation)

1. Herstellung einer Einzelzellsuspension (10⁷-10⁹ Zellen) aus autologem Tumormaterial (oder allogenen Tumorzellen des selben Tumortyps) mit anschließender γ-Bestrahlung (20-100 Gy) oder Hitzebehandlung (zunächst ca. 42°C für 30 min; anschließend ca. 60°C für 1 Stunde);
2. Infusion der bispezifischen und/oder trispezifischen Anti körper (5-100 µg) 2 bis 4 Stunden vor Reinfusion des Zell gemisches in den Patienten;
3. Reinfusion des Zellgemisches (i.v.).

Ex vivo-Immunisierung (Langzeitinkubation)

1. Herstellung einer Einzelzellsuspension (10⁷-10⁹ Zellen) aus autologem Tumormaterial (oder allogenen Tumorzellen des selben Tumortyps) mit anschließender γ-Bestrahlung (50-100 Gy) bzw. Hitzebehandlung;
2. Zugabe von bispezifischen und/oder trispezifischen Anti körpern (5-50 µg), und Zugabe von PBMC (10⁸-10¹⁰), [alternativ: 1 × 10⁹ Zellen aus T-Zellapherese]
3. nach 5 bis 7 Tagen Kontrolle der T-Zell-Reaktivität durch Transfer von Aliquots auf z. B. allogene Brustkrebszelli nien (MCF-7, MX-1)
4. Reinfusion (i.v.) der kultivierten PBMC am Tag 4 bis 14 in den Patienten (bei T-Zellapherese Kryokonservierung).
Abkürzungen: PBMC, peripheral blood mononucleated cells = mono nukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; i.v., intravenös.

Ein ähnlicher aber auf den Zusatz von Zytokinen angewiesener und mit konventionellen bsAk (keine Aktivierung von akzessori schen Zellen durch bsAk der Subklassenkombination Ratte IgG2B × Ratte IgCl) durchgeführter Ansatz zeigte die prinzipielle Wirk samkeit einer derartigen ex vivo-Immunisierung im Tiermodell (5).

Im Gegensatz dazu liegt der Vorteil des hier offengelegten Ver fahrens in der "Selbstversorgung" mit den für die Hochregula tion von z. B. MHC 1 auf der Tumorzelle benötigten Zytokinen (wie INF-γ oder TNF-α) durch die gleichzeitige Aktivierung von T-Zellen und akzessorischen Zellen (Monozyten/Makrophagen, Abbildung) an der Tumorzelle. Dies wird durch die eingangs erwähnte besondere Subklassenkombination des hier verwendeten intakten bsAk erreicht. Bei der Kurzzeitinkubation finden diese Vorgänge im Patienten statt. Weitere Vorteile bei der Kurzzeitinkubation sind (i) Umgehung der sonst notwendigen Kultivierung der Zell suspension mit serumhaltigen Medium. (ii) Damit entfällt auch die kostenintensive Kultivierung unter GMP-Richtlinien.

Vorteil bei der Langzeitinkubation ist, daß der bsAk sich in vitro nach einiger Zeit selber verbraucht (und somit auch diese Methode nicht als Medikament, sondern als "medical device" eta bliert werden kann).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Antikörper eingesetzt, um die An zahl kontaminierender Zielzellen in Stammzelltransplantaten ex vivo zu vermindern. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeich net, daß die erfindungsgemäß bereitgestellten intakten bispezi fischen und trispezifischen Antikörper für einen ausreichend langen Zeitraum mit Stammzelltransplantaten, die kontaminieren de Zielzellen enthalten können, in Kontakt gebracht werden, um die Anzahl von kontaminierenden Zielzellen im Stammzelltrans plantat zumindest zu verringern. Z. B. werden hier Stammzell transplantate aus Patientinnen mit einem Mammakarzinom oder Ovarialkarzinom oder aus Patienten mit Leukämien, Lymphom, Ho denkarzinom oder anderen Chemotherapie sensitiven Karzinomen, behandelt. Erfindungsgemäß können aber auch Stammzelltransplan tate aus Patienten behandelt werden, die durch Mikroorganismen, beispielsweise durch Viren, infiziert sind. Beispiele für mit Viren infizierte Stammzelltransplantate sind solche, die durch CMV oder HIV infiziert wurden. Die erfindungsgemäß verwendbaren bispezifischen und trispezifischen Antikörper wurden bereits vorstehend beschrieben.

Das Stammzelltransplantat wird mit den bispezifischen Antikör pern für einen Zeitraum von 4 bis 72 Stunden, bevorzugt für einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden, inkubiert, wobei bei spielsweise eine Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C, vor zugsweise Raumtemperatur, gewählt wird. Die Zellen im Stamm zelltransplantat liegen beispielsweise in einer Dichte von 30.000 bis 75.000 Zellen pro µl vor.

Nach erfolgter ex-vivo Behandlung werden die Stammzelltrans plantate in den Patienten, möglicherweise auch nach weiterer Aufreinigung, reinfundiert. Vollinhaltlich wird hier auf die DE 196 49 223.8 hingewiesen, deren Offenbarungsgehalt in die vor stehende Anmeldung voll mit integriert wird.

In dieser Ausführungsform der Erfindung mit dem erfindungsgemä ßen Verfahren werden kontaminierende Tumorzellen in Stammzell präparaten (Leukaphereseprodukten) mittels bispezifischer oder trispezifischer Antikörper in vitro eliminiert. Diese Antikör per weisen die im Anspruch 1 spezifizierten Merkmale auf, ins besondere werden diese Antikörper so ausgewählt, daß sie an ein Oberflächenantigen als Zielantigen auf der Zielzelle binden, welches induzierbar ist und im nicht-induzierten Zustand (Nor malzustand) nicht vorkommt oder in einer derart geringen Zahl, daß die Anzahl für eine Zerstörung der Zielzelle oder die In duktion einer Immunantwort durch den Antikörper nicht aus reicht.

Beispiele für die verwendbaren, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Antikörper wurden gegeben. Diese weisen ins besondere die bereits oben dargestellen Spezifitäten auf und können bevorzugt mit den dargestellten Isotyp-Kombinationen verknüpft werden.

Das Inkontaktbringen der bispezifischen Antikörper und der Stammzellen mit den kontaminierenden Zielzellen erfolgt unter solchen Bedingungen, die sowohl eine Hindung der bispezifischen oder trispezifischen Antikörper an die Zielzellen und die T- Zellen als auch eine Beibehaltung der Lebensfähigkeit der Stammzellen gestatten. Die Einhaltung dieser Parameter ist für die Erhaltung und die Vitalität der Stammzellen wie auch der Lymphozyten notwendig. Beispielsweise wird das Stammzelltrans plantat (Leukaphereseprodukt) etwa 4-72 Stunden, bevorzugt 24-48 Stunden, mit bispezifischen Antikörpern bei Raumtemperatur und einer Zelldichte von 30.000-75.000 Zellen/µl, bevorzugt 30.000-50.000 Zellen/µl, unter leichtem Schwenken inkubiert. Bei einer Gesamtzellzahl von ca. 10 × 10⁹ Zellen/Stammzell transplantat ist eine bsAk-Menge von 5-50, 50-100, 100-500 µg für die Tumorzellzerstörung ausreichend. Ein weiterer wichtiger Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Ver wendung von sogenannten intakten bispezifischen oder trispezi fischen Antikörpern. Diese sind nicht nur in der Lage (aufgrund der hier verwendeten Spezifitäten) T-Zellen an die Tumorzellen zu führen, sondern sie sind aufgrund der Effektorfunktionen des Fc-Teils darüber hinaus geeignet, mittels Komplement vermittel ter Lyse oder durch Hindung von Fc-Rezeptor positiven Zellen, wie z. B. Makrophagen, Monozyten oder aktivierten neutrophilen Granulozyten, Tumorzellen zu zerstören. Es können somit durch intakte bsAk mehrere tumorzell-zerstörende Mechanismen gleich zeitig aktiviert werden.

Nachfolgend wird anhand eines Beispiels gezeigt, daß die erfin dungsgemäß bereitgestellten Antikörper befähigt sind, induzier bare Oberflächenantigene auf Zielzellen zu erkennen und an sie zu binden und eine Immunantwort einzuleiten bzw. die Zielzelle zu zerstören, auch wenn die Zielstrukturen in einer äußerst geringen Menge auf der Zielzelle vorliegen, beispielsweise in einer Menge von 100 bis 10.000 pro Zelle. Die Zielstrukturen können auch in höherer Anzahl vorliegen, beispielsweise bis zu 500.000 (weitere bevorzugte Bereiche sind oben dargestellt). Die erfindungsgemäßen Antikörper wirken jedoch überraschender weise auch dann, wenn die Zielstrukturen auf der Zielzelle in einer Anzahl von ca. 100 vorliegen, wobei erstaunlicherweise, selbst bei dieser geringen Anzahl von Zielstrukturen auch nur geringste Mengen des Antikörpers notwendig sind, um eine Wirk same therapeutische Behandlung durchzuführen, d. h. Mengen von ca. 5 µg können zur Behandlung ausreichend sein.

Zur Verbesserung des Immunisierungserfolges wird die Kombina tion aus Antikörper und Tumorzellen bevorzugt mehrfach an den Patienten verabreicht, wobei die Zahl der Infusionen vom zu behandelnden Tumor und vom Patienten und eventuell weiteren Faktoren abhängt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Immuno genität der Tumorzellen dadurch erhöht, daß sie vor Verabrei chung einer Hitzevorbehandlung unterzogen werden. Eine bevor zugte Hitzevorbehandlung wird über einen Zeitraum von bei spielsweise 1-6 Stunden, bevorzugt ca. 3 Stunden, über einen Temperaturbereich von 41-42°C, bevorzugt bei einer Temperatur von ca. 41,8°C, durchgeführt. Sowohl die Behandlungsdauer als auch die Behandlungstemperatur hängen vom zu behandelnden Tu mortyp ab. Dien einzusetzende Temperatur und der Hitzevorbe handlungszeitraum können vom Fachmann durch Versuche ermittelt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbei spiels dargestellt. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses spezielle Bespiel beschränkt, sondern kann im Rahmen der vor liegenden Beschreibung und der anliegenden Ansprüche abgewan delt werden.

BEISPIEL 1

Nachdem in präklinischen Tiermodellen die herausrangende Wirk samkeit von intakten bsAk nicht nur in vitro, sondern auch in vivo belegt werden konnte (Lindhofer et al., Blood, 88: 4651, 1996), wurde die Reinigung von Stammzellpräparaten von kontami nierenden Tumorzellen als weitere Anwendungsmöglichkeit entwic kelt (Lindhofer et al., Exp. Hematol. 25: 879, 1997).

Auf diesen Versuchen aufbauend, konnte in Folgeversuchen mit kompletten Stammzellpräparaten (ca. 2 × 10e10 Zellen), insbe sondere die Wirksamkeit im untergesättigten Bereich der Zielan tigene nachgewiesen werden. D. h. es wurde, in Titrationsversu chen, so wenig intakter bsAk verabreicht, daß in einem PBSZ (Periphere Blut-Stammzellen)-Präparat mit ca. 6,5 × 10e9 T-Zel len, bei einer Gabe von 5 µg Antiköper/Präparat, lediglich 3000 CD3 Moleküle von ca. 30.000 CD3 Molekülen/T-Zelle mit dem bsAk gebunden vorlagen (siehe Berechnung). Trotzdem waren die intak ten bsAk in der Lage, auch unter diesen Bedingungen, die Ziel zellen (hier Tumorzelle: HCT-8) zu zerstören.

Die Versuche waren so aufgebaut, daß von derartig behandelten PBSZ-Präparaten Aliquots entnommen und mit einer definierten Menge von Tumorzellen kontaminiert wurden. Es konnte gezeigt werden, daß die Tumorzellen selbst bei dieser geringen Konzen tration von intakten bsAk, bei der nur ein Teil der Zielanti gene besetzt vorliegen, zerstört werden.

Die Auswertung des oben beschriebenen Experiments führte zu folgenden Ergebnissen:

Berechnung

Ein intakter bsAk hat ein Molekulargewicht von 150 KDa. D. h. 1 Mol sind 150 kg und entsprechen definitionsgemäß 6 × 10²³ Molekü len. Damit entsprechen 5 µg ca. 2 × 10¹³ Molekülen.

Nachdem in einem Stammzellpräparat 6,5 × 10⁹ T-Zellen bestimmt wurden und eine T-Zelle ca. 30.000 CD3 Moleküle trägt, kommt man auf eine Gesamtzahl von 19,5 × 10¹³ CD3 Molekülen im Stamm zellpräparat.

Da jeder bsAk einen anti-CD3 Bindungsarm besitzt, kann gefol gert werden, daß theoretisch, setzt man die beiden oben berech neten Molekülmengen in Bezug, in diesem konkreten Beispiel nicht mehr als ca. 3000 CD3 Moleküle von den bsAk besetzt wer den können.

LITERATUR

1. Haagen et al., Interaction of human moncyte Fcγ receptors with rat IgG2b, J. Immunolog., 1995, 154: 1852-1860

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3. Tenny, C., Jacobs, S., Stoller, R., Earle, M., and Kirk wood, J. Adoptive cellualr immunotherapy with high-dose chemotherapy and autologous bone marrow rescue (ABMR) for recurrent breast cancer (meeting abstract). Proc. Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol; 11: A88, 1992 ISSN: 0736-7589. CO: PMAODO - 7589 CO, 1993.

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6. Lindhofer et al., Preferential species-restricted heavy light chain pairing in rat-mouse quadromas: Implications for a single step purification of bispecific antibodies, J. Immunology 1995, 155: 219

Claims

1. Intakter bispezifischer oder trispezifischer Antikörper, der zumindest die nachfolgenden Eigenschaften aufweist:

a) Binden an eine T-Zelle;
b) Binden an zumindest ein Antigen auf einer Zielzelle;
c) Binden durch ihren Fc-Teil (bei bispezifischen Anti körpern) oder durch eine dritte Spezifität (bei tri spezifischen Antikörpern) an Fc-Rezeptor positive Zellen

und der hierdurch eine Immunantwort induziert und/oder die Zielzellen zerstört, wobei der Antikörper so ausge wählt ist, daß er an ein Oberflächenantigen als Zielanti gen auf der Zielzelle bindet, welches induzierbar ist und im nicht induzierten Zustand (Normalzustand) auf der Ziel zelle nicht vorkommt oder in einer derart geringen Zahl, daß die Anzahl für eine Zerstörung der Zielzelle durch den Antikörper nicht ausreicht.

2. Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als induzierbare Antigene Hitze-Schock-Proteine oder MHC-Klasse-I verwandte MIC-Moleküle eingesetzt werden.

3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hitze-Schock-Proteine HSP25-, HSP60- oder HSP70- (HSP72-) oder HSP90-Proteine und als MIC-Moleküle MIC-A- und MIC-B-Moleküle eingesetzt werden.

4. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen solche Zielantigene gerichtet ist, die nach Induktion auf der Zielzelle in einer Anzahl von mindestens 100 und höchstens 500.000 pro Zielzelle vorliegen.

5. Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper weiterhin so ausgewählt wird, daß er zur Aktivierung Fc-Rezeptor positiver Zellen befähigt ist, wodurch die Expression von Cytokinen und/oder co-stimmu latorischen Antigenen initiiert oder erhöht wird.

6. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, daß die Antikörper so ausgewählt werden, daß sie zur Bin dung Fc-Rezeptor positiven Zellen befähigt sind, die einen Fcγ-Rezeptor I, II oder III aufweisen.

7. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper zur Bindung an Monozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, "Natural Killer"-Zellen (NK-Zellen) und/oder aktivierte neutrophile Zellen als Fcγ-Rezeptor I + III positive Zellen befähigt sind.

8. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper zur Induktion von zielzellreaktiven, insbesondere tumorreaktiven Komplement-bindenden Antikör pern und damit zur Induktion einer humoralen Immunantwort befähigt sind.

9. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper so ausgewählt werden, daß sie über CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28 und/oder CD44 an die T-Zel len binden.

10. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper so ausgewählt werden, daß nach ihrer Bindung an die Fc-Rezeptor positiven Zellen die Expression von CD40, CD80, CD86, ICAM-1 und/oder LFA-3 als kostimula torische Antigene und/oder die Sekretion von Zytokinen durch die Fc-Rezeptor positive Zelle initiiert oder erhöht wird.

11. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper so ausgewählt werden, daß die Sekretion von IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, INF-γ als Zytoki ne und/oder von TNF-α erhöht wird.

12. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper so ausgewählt wird, daß er ein anti-CD3 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 × anti operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD5 × anti-operationell induzierbares Ziel zell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 × anti-opera tionell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/ oder anti-CD8 × anti-operationell induzierbares Zielzell assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 × anti-operatio nell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD28 × anti-operationell induzierbares Zielzell-asso ziiertes Antigen- und/oder anti-CD44 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen-Antikörper ist.

13. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper aus einer oder mehreren der nachfolgenden Isotypkombinationen ausgewählt wird:
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2a,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG2b,
Ratte-IgG2b/Maus-IgG3,
Ratte-IgG2b/Human-IgG1,
Ratte-IgG2b/Human-IgG2,
Ratte-IgG2b/Human-IgG3[orientaler Allotyp G3m(st) = Bin dung an Protein A],
Ratte-IgG2b/Human-IgG4,
Ratte-IgG2b/Ratte-IgG2c,
Maus-IgG2a/Human-IgG3[kaukasische Allotypen G3m(b+g) = keine Bindung an Protein A, im folgenden mit * gekenn zeichnet]
Maus-IgG2a/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2a/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG1-[Hinge]-Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human- IgG4-[Hinge]-Human-IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human- IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Hu man-IgG3*[CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge-CH2-CH3]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG3-[Hinge-CH2-CH3, orientaler Allotyp]
Ratte-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge-CH2-CH3]
Human-IgG1/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]- Human-IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG2[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG1/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG1/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG2/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG2-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Human-IgG4/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4[N-terminale Region von CH2]-Human-IgG3*[C-terminale Region von CH2: < AS-Position 251]-Human-IgG3*[CH3]
Maus-IgG2b/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Human-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-IgG2b/Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1-[Hinge]-Human- IgG3*-[CH2-CH3]
Maus-[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4/Ratte-[VH-CH1,VL-CL]- Human-IgG4-[Hinge]-Human-IgG4-[CH2]-Human-IgG3*-[CH3]
HumanIgG1/Ratte[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1[Hinge]-Human- IgG4-[CH2]-HumanIgG3*[CH3]
HumanIgG1/Maus[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG1[Hinge]-Human-IgG4- [CH2]-Human-IgG3*[CH3]
Human-IgG4/Human[VH-CH1,VL-CL]-Human-IgG4-[Hinge]-Human- IgG4-[CH2]-HumanIgG3*-[CH3]

14. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der bispezifische Antikörper aus einem heterologen Ratte/Maus bispezifischen Antikörper ausgewählt wird.

15. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der trispezifische Antikörper einen T-Zell-Bindungs arm, einen Zielzell-Bindungsarm und eine dritte Spezifität zur Bindung an Fc-Rezeptor positive Zellen besitzt.

16. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der trispezifische Antikörper so ausgewählt wird, daß er ein anti-CD3 × anti-operationell induzierbares Ziel zell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD4 × anti-opera tionell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/- oder anti-CD5 × anti-operationell induzierbares Zielzell assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD6 × anti-operatio nell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder anti-CD8 × anti-operationell induzierbares Zielzell-asso ziiertes Antigen- und/oder anti-CD2 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen- und/oder an ti-CD28 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assozi iertes Antigen- und/oder anti-CD44 × anti-operationell induzierbares Zielzell-assoziiertes Antigen-Antikörper, bevorzugt mit einem zusätzlichen Anti-Fc-Rezeptor-Bin dungsarm, ist.

17. Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle eine Tumorzelle oder eine durch Mikroor ganismen infizierte Zelle ist.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen oder mehreren der Antikörper nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wahlweise zusammen mit einem oder mehreren üblichen pharmazeutischen Träger- und/oder Hilfsstoffen, in einer therapeutisch wirksamen Menge enthält.

19. Verwendung eines Antikörpers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Induktion einer Immunantwort und/oder zur Zerstörung der Zielzelle.

20. Verwendung eines Antikörpers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen und von Erkrankungen, die durch Infek tion mit Mikroorganismen induziert wurden.

21. Verwendung eines Antikörpers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Induktion einer Zielzellimmu nität, bevorzugt einer Langzeit-Zielzellimmunität.

22. Verwendung eines Antikörpers nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Verminderung der Anzahl kon taminierender Zielzellen in Stammzelltransplantaten ex vivo, wobei der Antikörper für einen ausreichend langen Zeitraum mit aus Transplantaten gewonnenen Stammzellen, die kontaminierende Zielzellen enthalten können, in Kon takt gebracht wird, um die Anzahl an kontaminierenden Zielzellen im Stammzelltransplantat zumindest zu verrin gern.

23. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Zielzelle eine Tumorzelle oder eine durch Mikroorganismen infizierte Zelle eingesetzt wird.