DE69209894T2

DE69209894T2 - Langhaltende antimikrobielle Wirkung durch verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxyd

Info

Publication number: DE69209894T2
Application number: DE69209894T
Authority: DE
Inventors: Haan Ben Rudolf De; Jong Sylvia Josefine De; Hong Sheng Tan
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1991-06-11
Filing date: 1992-06-11
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2012-06-12
Also published as: JPH06500700A; AU652279B2; IE921889A1; ATE136740T1; WO1992022221A1; CA2083275C; AU2275392A; CA2083275A1; EP0518445B1; EP0518445A1; DE69209894D1; IE74397B1; NZ243106A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbesserung bei der Verwendung eines antimikrobiellen Systems. Spezifischerweise bezieht sich die Erfindung auf die verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Das erzeugte Wasserstoffperoxid kann als solches verwendet oder mit geeigneten Reagenzien kombiniert werden, um Substanzen mit antimikrobieller Wirksamkeit, insbesondere Hypothiocyanat, zu erzeugen.

Hintergrund der Erfindung

Mikrobielle Verseuchung von Nahrungsmitteln und Futter kann zu schweren gesundheitlichen Schädigungen führen. Neuere Beispiele sind die verschiedenen Ausbrüche der Listeriose beim Menschen, von welchen in Kanada (Schlech et al. 1983, N.Engl.J.Med. 308, 203-206), in den Vereinigten Staaten (Fleming et al. 1985, N.Engl.J.Med. 312, 404-407 und Linnan et al. 1988. N.Engl.J.Med. 3.19, 823-828) und in der Schweiz (Food Chem. News, 7.12.19.87) berichtet worden ist.
Die mikrobielle Verseuchung kann sich auch nachteilig auf Produkte auswirken, welche Proteine oder andere mikrobiell abbaubare Komponenten enthalten.
Es sind zur Vorbeugung der mikrobiellen Verseuchung von anfälligen Produkten verschiedene Methoden bekannt, so unter anderem chemische Methoden (Zusatz von Verbindungen wie ein Sulfit, ein Nitrit, die Benzoesäure, die Sorbinsäure) und die Verwendung von Bakteriziden. Wegen der vermuteten und nachgewiesenen Nebenwirkungen der in den chemischen Methoden verwendeten chemischen Produkte wird die Akzeptanz solcher Methode mehr und mehr zweifelhaft. Ferner ist die Anwendbarkeit der Bakterizide wegen der verhältnismässig hohen Spezifität dieser Moleküle gegenüber spezifischen Mikroorganismen beschränkt. Dies würde die Verwendung von Gemischen zahlreicher unterschiedlicher Bakterizide notwendig machen, um Wirksamkeit gegenüber den Mikroorganismen zustande zu bringen.
Die Nachteile der oben erwähnten Methoden haben die Forschung nach besser annehmbaren Methoden angeregt. Zur Behebung der oben erwähnten Schwierigkeiten besteht eine Möglichkeit in der Verwendung von in der Natur vorkommenden antimikrobiellen Systemen. Wurde also die Aufmerksamkeit auf natürliche Mechanismen zum Vorbeugen des mikrobiellen Wachstums gerichtet, gelang die Identifizierung eines antimikrobiellen Systems in der Milch als das sogenannte Lactoperoxidase-System (LP-System). Die Verwendung dieses Lactoperoxidase-Systems nimmt steigende Bedeutung an, da es sich durch ein breites Spektrum der Anwendbarkeit auszeichnet.
Das Laactoperoxidase/Thiocyanat/Wasserstoffperoxid-System stellt ein antimikrobielles System dar, welches den wichtigeren Körperflüssigkeiten wie roher Milch, Tränen und Speichel angeboren ist.
Ueber die Eigenschaften dieses Systems sind Uebersichten durch Reiter und Harnulv (1984, J. Food Protect. 47, 724-732) und Pruitt und Reiter (1985, dans "The lactoperoxidase system chemistry and biological significance" Ed. Pruitt, K.M. und Tenovuo, D. Seiten 144-178 New York, Marcel Dekker, Inc.) veröffentlicht worden.
Das Lactoperoxidase-System kann schematisch durch ein Dreistufenverfahren dargestellt werden:
a) die Erzeugung von Wasserstoffperoxid; die Reaktion einer Oxidoreductase mit einem oxidierbaren Substrat unter gleichzeitiger Erzeugung von Wasserstoffperoxid,
b) die Lactoperoxidase-Reaktionsstufe; in dieser Stufe wird Thiocyanat durch Reaktion mit Wasserstoffperoxid in Hypothiocyanat umgewandelt, welche Reaktion durch die Lactoperoxidase katalysiert wird,
c) die antimikrobielle Reaktion; in dieser inaktiviert das Hypothiocyanat die Mikroorganismen.
In FR-A-2 237 589 wird die Immobilisierung von zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid geeigneten Enzymen wie der Glucose-oxidase auf einer Matrix beschrieben, durch welche die zu behandelnde Flüssigkeit (beispielsweise die Milch, ein Lactoperoxidase enthaltendes Produkt) hindurchfliessen kann.
Gemäss FR-A-2 153 443 (Beispiel 17) wird eine Kombination von Invertase und Glucose-oxidase immobilisiert und in einer zur Bildung von Wasserstoffperoxid führenden Reaktion verwendet. In diesem Beispiel wird die Immobilisierung mit Gelatine durchgeführt.
In dem in EP-A-0 397 228 beschriebenen Verfahren wird ein Glucoseoxidase-System als Teil einer antimikrobiellen Zubereitung zur Käsekonservierung, insbesondere gegen Verseuchung durch Listeria, verwendet; vorzugsweise wird das Glucoseoxidase-System von der übrigen Zubereitung isoliert gehalten.
Das Dokument EP-A-0 397 227 bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines antimikrobiellen Systems, welches mindestens eine Lactoperoxidase und gegebenenfalls eine Oxidoreductase enthält, welche an einen besonderen Vektor gebunden (verankert) sind, welcher Vektor einen Kern umfasst, der aus einem hydrophilen Polysaccharidpolymer, einer ersten an den Kern chemisch gebundenen Lipidschicht und einer zweiten Phospholipidschicht gebildet ist, wobei die Enzymmoleküle in der zweiten Phospholipidschicht und/oder in der ersten Lipidschicht eingefügt sind.
Anstelle der in situ-Erzeugung des Wasserstoffperoxids kann das Wasserstoffperoxid auch der zu schützenden Mischung langsam zugegeben werden. Ferner ist es auch möglich, lösliche anorganische Peroxide zu verwenden, aus welchen Wasserstoffperoxid nach und nach freigesetzt wird. Aus praktischen Gründen ist es aber besser, Wasserstoffperoxid in situ zu erzeugen. Vorzugsweise wird Wasserstoffperoxid enzymatisch erzeugt. Die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffperoxid kann durch Verwendung einer Anzahl unterschiedlicher Kombinationen von Enzym und Substrat durchgeführt werden, beispielsweise einer Kombination einer Oxidoreductase mit einem oxidierbaren Substrat, beispielsweise:
Glucose/Glucose-oxidase
L-Aminosäure/L-Aminosäure-oxidase
Galactose/Galactose-oxidase
Lactose/β-Galactosidase/Glucose-oxidase
2-Desoxyglucose/Glucose-oxidase
Es können dem zu schützenden System sowohl das Substrat als auch/oder die Oxidoreductase zugegeben werden. Es ist auch möglich, ein Enzym zu verwenden, welches in der zu schützenden Substanz bereits vorkommt. Beispielsweise kann die in der Milch üblicherweise vorhandene Xanthin-oxidase zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid durch Zugabe von Hypoxanthin als Substrat verwendet werden. Diese Substratzugabe ist zur Aktivierung des Systems erforderlich.
Kombinationen verschiedener Substrate und Enzyme sind ebenso wirksam und können sogar bessere Ergebnisse erbringen. Beispielsweise kann die Kombination von Glucose-oxidase mit β-Galactosidase in Lactose enthaltenden Substanzen verwendet werden, wobei die Lactose durch β-Galactosidase unter Bildung von Galactose und Glucose aufgespalten und letzteres Kohlehydrat dann durch die Glucose-oxidase weiter oxidiert wird.
Die antimikrobielle Wirksamkeit dieses Systems
geht auf die Bildung von Hypothiocyanat in der folgenden Reaktion zurück: Lactoperoxidase Milchsäure-Bakterien/ Leukozyten
Die rohe Milch enthält alle für diese Reaktion wesentliche Komponten; das Thiocyanat und die Lactoperoxidase liegen als solche vor und das Wasserstoffperoxid wird durch die Milchsäurebakterien oder die Leukozyten erzeugt. Das Thiocyanat wird in Hypothiocyansäure (HOSCN) umgewandelt, welche beim pH der Milch hauptsächlich in der Form des Hypothiocyanations vorkommt.
Um die Wirksamkeit des LP-Systems zu verlängern, kann es angebracht sein, Wasserstoffperoxid und/oder allenfalls eine der anderen Systemkomponenten zuzugeben, wenn sie sich für die Reaktion begrenzend erweisen. Die Zugabe von Wasserstgffperoxid wiederum wird durch die Wirkungen dieses Moleküls auf die Aktivität der Lactoperoxidase und anderer Proteine begrenzt.
Das Hypothiocyanation reagiert spezifisch mit allen Sulfhydrylgruppen, wobei mehrere lebenswichtige metabolische Enzyme und Membranproteine inaktiviert werden.
Das Hypothiocyanat hat auf ein breites Spektrum von Mikroorganismen eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung. Es ist über die Wirksamkeit von Hypothiocyanat beispielsweise gegenüber Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Listeria, Yersinia, Campylobacter und Salmonella berichtet worden.
Die Milchkonservierung ist eine bedeutende Anwendung dieses Systems. Allgemeiner gesagt können Molkereiprodukte unter Verwendung dieses Systems konserviert werden.
Es sind andere Anwendungen dieses Systems in einer mehr oder weniger isolierten Form beschrieben worden. Das US-Patent 4,320,116 beschreibt die Verwendung dieses Systems im Tierfutter und ein Verfahren zur Behandlung bakterieller Infektionen im Gastrointestinaltrakt von Säugetieren. Die kanadische Patentanmeldung 1 167 381-A beschreibt die Verwendung dieses Systems in Zahnpasta.
Im allgemeinen weist dieses System den Vorteil auf, von Nahrungsqualität zu sein; es kann deshalb ein breites Spektrum von möglichen Anwendungen ins Auge gefasst werden.
Eines der Hauptprobleme bei der Verwendung dieses LP-Systems ist die kurze Dauer seiner Funktion. So berichtet die dieses System betreffende Literatur bis jetzt nur über eine Wirksamkeit von wenigen Stunden bis maximal wenigen Tagen.- Die für diese kurze Funktionsdauer verantwortlichen Hauptfaktoren sind:
a) die ungesteuerte (und hohe) Erzeugungsrate von Wasserstoffperoxid und
b) die hohe Reaktivität von Wasserstoffperoxid.
Infolge seiner kurzen Funktionsdauer bringt das LP-System nur einen vorübergehenden Schutz gegen mikrobielle Infektion zustande. Die geschützten Substanzen sind einer erneuten Verseuchung ausgesetzt und die Verwendung des LP-Systems war deshalb bisher auf einen kurzdauernden Schutz beschränkt.
Es besteht deshalb ein Bedürfnis nach einer langanhaltenden Schutzdauer für Nahrungsmittel und Futter durch ein natürlich vorkommendes antimikrobielles System. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches System zur Verfügung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren und Mittel zur Erhöhung der Funktionsdauer des Lactoperoxidase-Systems. Um diese erhöhte Funktionsdauer zu erreichen, beschreibt die Erfindung immobilisierte Komponenten des Lactoperoxidase-Systems, welche die verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid zustandebringen. Die verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid macht eine gleichbleibende und kontinuierliche Erzeugung von Hypothiocyanat möglich.
Die vorliegende Erfindung beschreibt immobihsierte Komponenten des LP-Systems. Es wird ein System offenbart, welches eine Wasserstoffperoxid-Erzeugung während mindestens 42 Tage ergibt.
Die Erfindung offenbart ferner die Anwendung der Komponenten des immobilisierten Lactoperoxidase- Systems bei Nahrungsmitteln und Futter.

Beschreibung der Figuren

Die Figuren 1 bis 15 zeigen die Wirkung des LP-Systems auffolgende Mikroorganismen: Escherichia coli ATCC 11229; Salmonella typhimurium ATCC 13311, Bacillus cereus IAM 1229, Staphylococcus aureus ATCC 6538 und Listeria monocytogenes RIVM 3 bei den angegebenen pH-Werten.
Die Figur 16 zeigt die Wirkung des Lactoperoxidase-Systems auf durch Listeria verseuchten Camembert- Käse.
Die Figur 17 zeigt die Erzeugung von d-Gluconsäure im Lauf der Zeit aus freier Glucose und aus immobilisierter Maisstärke.
Die Figur 18 zeigt die Erzeugung der Gluconsäure im Lauf der Zeit unter Verwendung von immobilisierter Maisstärke.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zubereitung zur Verwendung für die verzögerte Erzeugung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung, welche eine Oxidoreductase und/oder ein entsprechendes Substrat in immobilisierter Form umfasst.
In ihrer allgemeineren Form stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, durch welches unter Verwendung der Zubereitung eine verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid erreicht wird. Das Wasserstoffperoxid wird langsam freigesetzt und kann als solches für seine antimikrobielle Aktivität verwendet werden. Um seine antimikrobielle Aktivität zu entfalten, muss das Wasserstoffperoxid in verhältnismässig grossen Mengen vorliegen. Das Hypothiocyanat ist ein weit wirksameres antimikrobielles Mittel als Wasserstoffperoxid. Für das Wasserstoffperoxid ist antimikrobielle Aktivität bei einer Konzentration von 5 mM berichtet worden, während zur Aktivierung des LP-Systems eine Konzentration an Wasserstoffperoxid von 0,02 mM berichtet worden ist. Deshalb wird das Wasserstoff, peroxid vorzugsweise zur Umwandlung von Thiocyanat in Hypothiocyanat unter Verwendung von Lactoperoxidase oder einer anderen Peroxidase verwendet.
Es kann im Prinzip jedes Thiocyanatsalz verwendet werden. Ueblicherweise werden Alkalimetallsalze wie das Natrium- oder Kaliumthiocyanat verwendet.
Das Verfahren zur Erzielung einer langsamen Freisetzung von Wasserstoffperoxid durch Reaktion von mindestens einer Oxidoreductase mit ihrem entsprechenden Substrat ist dadurch gekennzeichnet, dass mindestens die Oxidoreductase immobilisiert wird und das Substrat (Glucose, Galactose oder ein anderes Substrat) zusammen mit der Oxidoreductase immobilisiert und/oder durch enzymatische oder chemische Reaktion erzeugt wird, damit es in brauchbarer Form zugänglich gemacht wird.
Die Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann jedwelche Oxidoreductase enthalten. Vorzugsweise wird die Oxidoreductase aus der Gruppe ausgewählt, welche aus der Glucose-oxidase, der L-Aminosäure-oxidase, der Galactose-oxidase, der β-Galactosidase/Glucose-oxidase und der Xanthin-oxidase besteht. Kombinationen von Oxidoreductasen können vorteilhafterweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung wird das Wasserstoffperoxid kontinuierlich und vorzugsweise bei gleichbleibendem, zur Aktivierung des Lactoperoxidase-Systems ausreichend hohem Spiegel zugänglich gemacht. Um dies zu erreichen, kann das Substrat beispielsweise in einer langsam löslichen Form oder in der Form eines Polymeren vorliegen, in welchem Fall das Substratmolekül erst nach einer enzymatischen oder chemischen Reaktion in brauchbarer Form zugänglich wird.
Auch kann die obige Stufe der Wasserstoffperoxid-Erzeugung mit einer anderen Reaktionsstufe gekoppelt werden, in welcher das Substrat erzeugt wird, wodurch die Erzeugungsrate von Wasserstoffperoxid indirekt durch Steuerung der Substratsfreisetzungs- oder -erzeugungsrate gesteuert wird. Ein Beispiel davon ist die Glucose, welche aus Cellulose durch Reaktion mit Cellulase erhalten wird. Ein weiteres Beispiel ist der Abbau der Lactose unter Verwendung der Kombination von Glucose-oxidase mit β-Galactosidase. Noch ein anderes Beispiel ist die Verwendung der Stärke als Substrat, was die vorhergehende Freisetzung von Glucose benötigt. Nach Freisetzung des Substrates erzeugt die Oxidoreductase-Reaktion Wasserstoffperoxid. Es wurde gefunden, dass die Immobilisierung der Komponenten eine verlängerte Freisetzungsrate der Glucose zur Folge hat.
Das derart erhaltene Wasserstoffperoxid wird vorzugsweise zur Steigerung der effektiven Funktions dauer des Lactoperoxidase-Systems verwendet. Wir richten uns bei dieser Besprechung auf das Lactoperoxidase- System, weil dieses System das System der Wahl für Anwendungen auf Nahrungsmittel ist. Allerdings wird festgehalten, dass andere Enzyme, beispielsweise die Meerrettich-Peroxidase und die Chlorperoxidase, zur Wasserstoffperoxid-Erzeugung gemäss vorliegender Erfindung ebenso gut verwendet werden können.
Das System der vorliegenden Erfindung kann schematisch folgendermassen dargelegt werden: gegebundes Substrat (Cellulose, Stärke....) (1) - Enzym, chemische Reaktion Substrat (Glucose, Galactose.. (2) - Oxidoreductase Wasserstoffperoxid (3) - Peroxidase - Thiocyanat Hypothiocyanat
Eingerahmt ist jener Teil des Systems, in welchem mindestens eine der Komponenten immobilisiert ist.
Soviel wir wissen, ist es bisher nicht versucht worden, das LP-System zur Erzielung eines verlängerten antimikrobiellen Schutzes zu verwenden. Eine verlängerte antimikrobielle Aktivität löst gleichzeitig das Problem einer möglichen erneuten Verseuchung.
Zur Zeit wird das LP-System im allgemeinen zur einmaligen Behandlung der Substanz verwendet und eine nachfolgende erneute Verseuchung wird durch physikalische Trennung der "geschützten" Substanz von den Verseuchungsherden verhindert.
Die vorliegende Erfindung macht die natürliche Entwicklung von erneut verseuchenden Mikroorganismen während einer langen Zeitdauer unmöglich.
Wenn das für die enzymatische Reaktion verwendete Substrat auch ein Substrat für einen der in den zu schützenden Zubereitungen vorhandenen Mikroorganismen ist oder wenn das Substrat ein Substrat für andere verseuchende Mikroorganismen ist, wird die Zugabe des Substrats in einer nicht metabolisierbaren Form bevorzugt. Verschiedene Möglichkeiten der Verwendung eines nicht metabolisierbaren Substrates ergeben sich von selbst:
1) das Substrat kann immobilisiert werden, beispielsweise in der Form von Cellulose oder Stärke. Indem die Glucose in situ mit einer der Speicherung vorbeugenden Reaktionsgeschwindigkeit erzeugt und nachfolgend oxidiert wird, kann dem Wachstum von Mikroorganismen vorgebeugt werden,
2) wahlweise kann ein nicht metabolisierbares Substrat als solches verwendet werden; die 2-Desoxyglucose ist ein Beispiel.
Das erfindungsgemässe System kann gegen ein breites Spektrum von Organismen verwendet werden. Wie oben erwähnt wurde, ist das in der Lactoperoxidase-Reaktionsstufe erzeugte Hypothiocyanat gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen, einschliesslich sowohl der Gram-positiven als auch der Gram-negativen Bakterien und Pilze, wirksam gefunden worden.
Von Hypothiocyanat ist Aktivität beispielsweise gegen Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Listeria, Yersinia, Campylobacter, Salmonella, Streptococcus, Lactobacillus, Bacteroides, Flavobacterium und Fusobacterium berichtet worden.
Das Aktivitätsspektrum des vorliegenden Systems kann durch Kombination des Systems mit anderen antimikrobiellen Mitteln erhöht werden. Wenn nebst dem allgemeinen Schutz, Schutz gegen einen spezifischen Mikroorganismus verlangt wird, kann die Zugabe eines Bakterizids für das beschriebene System wertvoll sein. Diese Zugabe kann entweder vor oder nach der Immobilisierung vorgenommen werden. Geeignete Bakterizide sind bekannt und schliessen Antibiotika wie Nisin ein.
Die vorliegende Erfindung veranschaulicht die Verwendung des LP-Systems sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien. Spezifischerweise wird gezeigt dass das erfindungsgemässe System gegen folgende Mikroorganismen wirksam ist: Escherichia coli ATCC 11229, Salmonella typhimunum ATCC 13311, Bacillus cereus IAM 1229, Staphlococcus aureus ATCC 6538 und Listeria monocytogenes RIVM 3. Mit diesen Mikroorganismen sind Teste bei verschiedenen pH-Werten zwischen 5 und 7 durchgeführt worden. Das System funktioniert bei allen Werten gut, der bevorzugte pH-Wert war 6,3.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Stufe (2), die zweite Stufe des oben beschriebenen dreistufigen Verfahrens, das heisst, die Erzeugungsstufe von Wasserstoffperoxid. Um einen konstanten Spiegel an Wasserstoffperoxid zu gewährleisten, soll die erzeugte Menge konstant gehalten werden. Um einen konstanten Spiegel der Wasserstoffperoxid-Erzeugung zu erreichen, kann das Substrat für die Bildungsreaktion des Peroxids auf gesteuerte Weise zugegeben werden. Wahlweise kann eine begrenzende Enzymmenge mit einem Substratüberschuss verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur kontrollierbaren und langsamen Erzeugung von Wasserstoffperoxid zur Verfügung, was durch Immobilisierung der Enzyme und gegebenenfalls der Substrate zustande gebracht wird. Immobilisierungsmethoden sind bekannt. Bekannte Methoden machen beispielsweise von Calciumalginat, Gelatine oder Carrageen Gebrauch. Wenn nötig kann das immobilisierte Material durch Vernetzungsmittel verstärkt werden.
In der vorliegenden Erfindung werden einige der möglichen Zubereitungen veranschaulicht. Aviceltm (Cellulose) wird zusammen mit Cellulase und Glucose-oxidase in Gelatine immobilisiert, welche nachträglich mit Glutardialdehyd vernetzt wird. In diesem System wird Wasserstoffperoxid während mindestens 48 Stunden erzeugt.
In einem anderen Beispiel wird Maisstärke zusammen mit α-Amylase, Amyloglucosidase und Glucose-oxidase in einer Mischung von Gelatine und Alginat immobilisiert und danach mit Glutardialdehyd vernetzt. Es zeigt sich, dass dieses System die Freisetzung von Wasserstoffperoxid während mindestens 42 Tage zu bewerkstelligen vermag.
Es ist verständlich, dass die Mengen der Komponenten und die Zubereitung selbst in dem Systen gemäss der spezifischen Anwendung variieren sollen. Die Vereinigung der veranschaulichten Systeme mit Lactoperoxidase/ Thiocyanat soll die Wirksamkeit der antimikrobiellen Zubereitung erhöhen.
In flüssiger Form sind die Mindestmengen der LP-Komponenten folgende:
Glucose-oxidase (Gist-brocades) 0,8 mg/l
Lactoperoxidase (Biopole) 1 mg/l
Wasserstoffperoxid 0,02 mM
SCN&supmin; 0,02 mM
Im allgemeinen ist das molare Verhältnis zwischen dem Peroxid und dem Thiocyanat kleiner als 4 und es beträgt vorzugsweise 1 bis 2. Die Lactoperoxidase liegt in Mengen von 1 bis 200 mg/l vor. Die Aktivität der Enzyme sieht wie folgt aus:
Glucose-oxidase, 36 000 Einheiten/g (pH 6, Temperatur 14ºC), wobei eine Einheit 1 µMol Waserstoffperoxid/Min.,
Lactoperoxidase, 481 000 ABTS-Einheiten/g (pH 6, Temperatur 25ºC) ("ABTS" method", Childs et al. Biochem.J. (1975) 145 93-103).
Schliesslich offenbart die vorliegende Erfindung ein Nahrungsmittelprodukt, welches zu keiner Proliferation des verseuchenden Mikroorganismus führt, wenn es zwischen dem zweiten und dem zehnten Tag nach seiner Herstellung mit 10²-10&sup5; mikrobiellen Zellen behandelt und danach unter für diesen Mikroorganismus normalen Wachstumsbedingungen gehalten worden ist, und wobei der Schutz auf die verzögerte Wasserstoffperoxid-Erzeugung zurückgeht. Spezifischerweise wird auch gezeigt, dass das LP-System gegen Listeria wirksam ist, wenn es auf Käse (Camembert) angewendet wird.
Selbstverständlich können die spezifischen Zellmengen und Wachstumsbedingungen nach der Natur des Produktes und des verwendeten Mikroorganismus variieren.
Bei der Ausführung der Erfindung wird die zu schützende Substanz mit solchen Mengen der Reagenzien vermischt, dass das Wasserstoffperoxid in einer Menge per Zeiteinheit erzeugt wird, welche eine konstante Konzentration gewährleistet.
Das beschriebene System gewährt seinen antimikrobiellen Schutz während mindestens 10 Tage, vorzugsweise während mindestens 20 Tage und noch bevorzugter während bis zu 50 Tage.

Die Brauchbarkeit der Erfindung

Das System kann zur Konservierung von Nahrungsmitteln und Futter angewendet werden. Bezüglich dieser Anwendung kann es in einer Flüssigkeit, beispielsweise in (Käse-)Milch, verwendet werden, es erweist sich aber gleich wirksam bei Anwendung auf der Oberfläche von beispielsweise Käse. Das System kann auch als Langzeit-Reinigungsmittel in spezifischen Anwendungen angewendet werden. Es ist klar, dass die Komponentenmengen im System je nach spezifischer Anwendung variieren werden.
Ins Auge gefasst werden kann die Verwendung dieses Systems in der Entseuchung von Kadavern (Rindvieh, Fisch, Garnelen), der Oberflächenbehandlung von Nahrungsmitteln (Käse, Butter), der Behandlung von frischem Gemüse, bei Kosmetika, bei der Wundbehandlung, bei Zahnpasta, bei der Entseuchung von Maschinen (Eismaschinen, Milchschüttelmaschinen) oder mehr allgemein bei der in der Nahrungsmittelverarbeitung verwendeten Ausrüstung, bei Anlagen oder Räumen, in welchen Nahrungsmittelprodukte in grossen Mengen (Spitäler, Gaststätten usw.) hergestellt werden, bei der Entseuchung von Eutern, Silofutter und im Futter.

Experimentelles

Wasserstoffperoxid-Analyse

Die Bestimmung der Wasserstoffperoxidmenge wurde nach einer Abänderung der durch Mottola et al., Anal. Chem. 42, 410-411 (1970) beschriebenen Methode durchgeführt.
Kurz gefasst, wurden in einer 1 cm-Schale die folgenden Lösungen vermischt:
50 µl von die Probe enthaltendem Wasserstoffperoxid (0,2-1 mM)
200 µl einer Lösung von Leukokristallviolett (LCV) (0,5-1 mg/ml in 0,5% HCL)
1,6 ml Natriumacetatpuffer (0,5 mM, pH 4,5)
100 µl Lactoperoxidase (2 mg/ml) oder MRP (Meerrettich-Peroxidase)
In Gegenwart von Thiocyanat kann die Lactoperoxidase in diesem Versuch nicht zur Erzielung genauer Messungen verwendet werden. Unter diesen Bedingungen allerdings wirkt die Meerrettich-Peroxidase gut.
Die Farbentwicklung wurde bei 596 nm verfolgt.

Zusammensetzung der Medien

Das Minimalmedium enthält je Liter die folgenden Substanzen:
14 g K&sub2;HPO&sub4;;, 6,0 g KH&sub2;PO&sub4;; 2 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 1 g Trinatriumcitrat. 2H&sub2;O; 0,2 mg MGSO&sub4;. 7 H&sub2;0; 5 g MNSO&sub4;. 2H&sub2;O;
2 g L-Glutaminsäure; 0,8 g NaOH; 50 ml 10%ige Casaminsäurelösung (Difco), 20 ml 50%ige Glucoselösung und 10 ml Vitaminlösung.
Die Vitaminlösung enthielt je Liter:
2 mg Biotin; 2 mg Folsäure; 20 mg Pyridoxin.HCL (B6);
5 mg Thiamin.HCL (B1); 5 mg Riboflavin (B2); 5 mg Nicotinsäure; 0,1 mg Vitamin B12; 5 mg p-Aminobenzoesäure;
5 mg DL-Calciumpantothenat.
Das Käsemilch-Medium (KM-Medium) enthielt je Liter 15 g Caseinhydrolysat, 3 g Trinatriumcitrat, 3 g Lactose;
3,5 g Lactat, 5 g Tryptose und 50 mM Phosphatpuffer (pH 5, 6 oder 7).
Nach der Sterilisierung wurde Glucose zugegeben.

BEISPIELE

Beispiel 1

Wirksamkeit des Lactoperoxidase-Systems gegen spezifische Mikroorganismen

Die Wirksamkeit des Lactoperoxidase-Systems gegen fünf verschiedene Mikroorganismen wurde unter Verwendung von Glucose-oxidase/Glucose zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid geprüft.
Die verwendeten Mikroorganismen waren folgende:
Gram-negativ: Escherichia coli ATCC 11229 Salmonella, typhimurium ATCC 13311
Gram-positiv: Bacillus cereus IAM 1229 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Listeria monocytogenes RIVM 3
E.coli, S.typhimurium, B.cereus und S.aureus wurden bei dem gewünschten pH-Wert im Minimalmedium inkubieren gelassen.
L.monocytogenes wurde im Käsemilch-Medium inkubieren gelassen. Nach Züchtung über Nacht wurden Zellen zur Einimpfung der Hauptkultur mit einer Dichte von 10³ 10&sup5;-Zellen/ml verwendet. Die Inkubationstemperatur war 37ºC. Der pH-Wert war 5,2, 6,3 oder 7,2 (für L.monocytogenes,: 5,0, 6,0 und 7,0). Diesen Kulturen sind die erwähnten Substanzen bis zur angegebenen Endkonzentration zugegeben worden:
- SCN&supmin; 100 mg/l (Natriumsalz, Merck);
- Lactoperoxidase 20 mg/l (Biopole);
- Glucose-oxidase 1,5 mg/l (Gist-brocades);
- Glucose 10 g/l (BDH).
Die Vergleichskulturen enthielten die gleichen Substanzen, ohne Glucose-oxidase.
Die Anzahl lebende Zellen wurde im Laufe der Zeit verfolgt und durch Aufstreichen mehrerer Verdünnungen auf BHI-Platten bestimmt.
Während dieser Versuche wurde die Wasserstoffperoxidkonzentration unter Verwendung der in "Experimentelles" beschriebenen Methode überwacht. Es konnte daraus geschlossen werden, dass Wasserstoffperoxid bei Verwendung der oben erwähnten Konzentrationen nie in einer solchen Menge vorlag, dass es als solches jegliche mikrobielle Wirkung hätte. Infolgedessen konnten die beschriebenen antimikrobiellen Wirkungen vollends dem Hypothiocyanat zugeschrieben werden.
Die Ergebnisse werden in den Figuren 1 bis 15 gezeigt.
E.coli (Fig. 1-3)
pH 7,2, - Zellen zwischen 8 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach einer Verzögerungsphase von 4 Stunden weiter
pH 6,3 - Zellen nach 4 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 4 Stunden weiter
pH 5,2 - Zellen nach 2 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 6 Stunden weiter
S.typhimurium (Fig. 4-6)
pH 7,2 - Zellen zwischen 6 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 4 Stunden weiter
pH 6,3 - Zellen nach 2 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 6 Stunden weiter
pH 5,2 - Zellen nach 4 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 4 Stunden weiter
S.aureus (Fig. 7-9)
pH 7,2 - Zellen nicht vollständig getötet
- Vergleiche wachsen nach 8 bis 24 Stunden weiter
pH 6,3 - Zellen innert 4 Stunden getötet
- Vergleiche, siehe unter pH 7,2
pH 5,2 - Zellen innert 6 Stunden getötet
- Vergleiche, siehe unter pH 7,2
B.cereus (Fig. 10-12)
pH 7,2 - Zellen innert 2 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 2 Stunden weiter
pH 6,3 - Zellen wie bei pH 7,2 getötet
- Vergleiche wachsen nach 4 Stunden weiter
pH 5,2 - Zellen zwischen 6 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 6 Stunden weiter
L.monocytogenes (Fig. 13-15)
pH 7,0 - Zellen zwischen 5 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 5 Stunden weiter
pH 6,0 - Zellen zwischen 3 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen nach 2 Stunden weiter
pH 5,0 - Zellen zwischen 3 und 24 Stunden getötet
- Vergleiche wachsen bei diesem pH nicht.
Es kann der Schluss gezogen werden, dass sämtliche geprüfte Mikroorganismen unter den angegebenen experimentellen Bedingungen hinreichend getötet wurden, mit der Ausnahme von S.aureus bei pH 7,2.
Der optimale pH-Wert liegt überall bei 6,3.

Beispiel 2

Verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid

Es wurden 5 g Aviceltm (aus Cellulose bestehendes kristallinisches Polymere, Serva) in 45 ml wässriger Gelatinelösung bei 30ºC suspendiert. Danach wurden 20 mg Cellulase (Gist-brocades, Maxazymtm CL 2000) und 25 mg Glucose-oxidase (Gist-brocades) zugegeben. Diese Gelatinepolymer-enzym-Suspension wurde zu 100 ml einer unter Rühren gehaltenen Maisöllösung (Brocacef) bei 30ºC zugegeben. Die Wasser-in-Oel-Suspension wurde auf 10ºC gekühlt. Die Partikeln wurden durch langsame Zugabe (in 60 Minuten) von 1,03 g Glutardialdehyd (Merck) in 8,25 ml Wasser vernetzt.
Es wurde 0,05 g Tween 80 in 5 ml Wasser zugegeben und während 5 Minuten weiter gerührt.
Danach wurden die Partikeln durch Zugabe von 1000 ml Wasser von der Oelphase abgetrennt und die Partikeln wurden zweimal mit derselben Menge Wasser gewaschen. Die Partikeln waren beständig und in Wasser unlöslich.
Die Wasserstoffperoxid-Freisetzung im Laufe der Zeit wurde unter Verwendung der im experimentellen Teil beschriebenen Methode verfolgt. Der Versuch wurde durch Inkubierenlassen von 5 g Partikeln in 50 ml Puffer (pH 5,0) in einem unter Rühren gehaltenen Reaktionsgefäss bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 dargelegt. Es kann daraus geschlossen werden, dass die Wasserstoffperoxid-Erzeugung verlängert und konstant ist. Tabelle 1 Wasserstoffperoxide-Erzeugung Zeit Partikeln

Beispiel 3

Wirkung des Lactoperoxidase-Systems auf durch Listeria monocytogenes verseuchten Camembert-Käse
Einen Tag nach seiner Herstellung wurde Camembert-Käse gefroren und dann in gefrorenem Zustand bei -50ºC gehalten. Das Einfrieren und das Auftauen hatten auf die Käseflora keine sichtbaren Wirkungen. Der Käse wurde in Kühlschrankschachteln mit einem Volumen von 1 Liter gelegt und die relative Feuchtigkeit wurde unter Verwendung eines Glycerin/Wasser-Gemisches bei 95% gehalten.
Die Schachteln wurden bei 14ºC inkubieren gelassen. Nach 5 Tagen wurde der Käse mit Listeria monocytogenes DSM 20600 bei 100 Zellen/g Käse (in 0,5 ml) behandelt. Nach 4 Stunden wurde der Käse auf der einen Seite mit 0,6 ml LPS-Lösung [100 mM Glucose (BDH), 20 mM NaSCN (Merck), 200 mg/l Lactoperoxidase (Biopole) und 50 mg/l Glucose-oxidase (Gist-brocades)] behandelt. Der Vergleichskäse wurde mit Milli-Q-Wasser behandelt.
Die Anzahl Listeria wurde bei Zeit 0 und nach 1, 2 und 5 Tagen in Doppel gezählt. Die Zählung wurde durch zweimalige Verdünnung von 17 g Käse in 2%igem Trinatriumcitrat durchgeführt. Nach Homogenisierung in einem Stomacher-Apparat wurde die Suspension in physiologischer Salzlösung verdünnt.
Von den verschiedenen Verdünnungen wurde 0,1 ml auf Palcam-Platten (Merck) gebracht. Die Platten wurden während eines Tages bei 30ºC gezüchtet und die Kolonien wurden gezählt.
Das Ergebnis wird in Figur 16 gezeigt und es kann daraus geschlossen werden, dass das LPS-System unter den Anwendungsbedingungen gut funktioniert.

Beispiel 4

Verwendung von immobilisierter Maisstärke als Glucosequelle I

Hergestellt wurde eine Suspension aus 10% (Gewicht/Gewicht) Maisstärke in 8% (Gewicht/Gewicht) Gelatine und 1% (Gewicht/Gewicht) Alginat und das Gemisch wurde bei 30ºC gehalten und es wurden 0,05%ige α-Amylase (Gist-brocades, Maxamyltm, 6300 TAU/g), 0,05%ige Amyloglucosidase (Gist-brocades, Amigasetm TS, 25000 AGI/ml) und 0,05%ige Glucose-oxidase (Gist-brocades), alle auf Gewicht/Gewicht-Basis, zugegeben.
Danach wurde die Suspension in zwei Volumina Maisöl gegossen, welche 1%iges (Gewicht/Gewicht) Span 80 enthielten. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Turbinrotors energisch gerührt. Nach 5 Minuten wurde die Temperatur auf 15ºC gesenkt und nach Koagulation wurden 8,25 ml Vernetzungsgemisch per 50 g Zubereitung zugegeben. Das Vernetzungsgemisch bestand aus 88,5% CaCl&sub2;.2H&sub2;O in Ethanol (40 g per 100 ml Ethanol) und 11,4%iges Glutardialdehyd (25% Gewicht/Gewicht).
Nach 60 Minuten wurde die Emulsion von immobilisiertem Produkt und Oel während 5 Minuten in einem Wasserüberschuss gerührt und das Oel wurde dekantiert. Hierauf wurde das immobilisierte Produkt zweimal mit einem Wasserüberschuss gewaschen und schliesslich durch fraktioniertes Sieben isoliert.
Um die Erzeugungsrage von Wasserstoffperoxid zu verfolgen, wurde die Gluconsäure bestimmt. Das Gluconat ist ein Produkt der Bildungsreaktion von Wasserstoffperoxid: Glucose + O&sub2; T H&sub2;O&sub2; + Gluconat
Um die Erzeugung der D-Gluconsäure zu verfolgen, wurden zwei offene, unter Rühren gehaltene Reaktionsgefässe von 100 ml verwendet. Das erste Gefäss enthielt 2,5 g immobilisiertes Produkt in 25 ml 0,1 M-Natriumacetatpuffer von pH 5.
Das zweite Gefäss enthielt 0,277 g Glucose und 1,38 Glucose-oxidase in 25 ml 0,1 M-Natriumacetatpuffer von pH 5. Die D-Gluconsäure wurde unter Verwendung eines Enzymprüfungssatzes von Boehringer Mannheim (Kat. Nr. 428.191) bestimmt.
Die Ergebnisse werden in Figur 17 dargelegt und es kann daraus ersehen werden, dass ohne Immobilisierung und bei Verwendung von freier Glucose die Erzeugung der D-Gluconsäure nach etwa 50 Stunden aufhört, während die D-Gluconsäureerzeugung und somit die Wasserstoffperoxiderzeugung während mehr als 200 Stunden fortgesetzt werden, wenn als Glucosequelle immobilisierte Stärke verwendet wird.
Die Maximalmenge an Gluconsäure, welche in diesem Versuch von der verwendeten Menge Stärke erhalten werden kann, ist 60 mM.

Beispiel 5

Verwendung von immobilisierter Maisstärke als Glucose- Quelle II

Es wurden 50 g Maisstärke in 200 ml Wasser suspendiert und auf 85ºC erhitzt. Der Brei wurde während 15 Minuten unter fortgesetztem Rühren bei dieser Temperatur gehalten. Es wurde eine Lösung von 50 g Gelatine in 200 ml zugegeben. Nach Kühlung der Suspension auf etwa 40ºC wurden 125 mg Amyloglucosidase (Amigasetm TS), 250 mg Glucose-oxidase und 1250 mg Lactoperoxidase zugegeben. Hierauf wurden 6 ml Glutardialdehyd (25%, Gewicht/Gewicht) unter fortgesetztem Rühren zugegeben. Das Gel wurde mit einem Mischer homogenisiert. Nach der Homogenisierung wurden 2 Liter einer 0,7% Glutardialde hyd enthaltenden 0,2 M-Natriumacetatlösung zugegeben. Das Gemisch wurde während 15 Minuten bei 15ºC gerührt. Das Produkt wurde gesiebt und zweimal mit dem zehnfachen Volumen Wasser gewaschen. Das Produkt wurde danach in einem Fliessbett-Trockner bei 39ºC bis auf ein Trockengewicht von 94% (Gewicht/Gewicht) getrocknet. Schliesslich wurden die getrockneten Partikeln in einer Hochgewchwindigkeits-Hammermühle auf eine Partikelgrösse von ungefähr 20 Mikron gemahlen.
150 mg getrocknete Partikeln (20 Mikron) wurden in 149 ml 0,1 M-Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 suspendiert, welche 4,5% (Gewicht/Volumen) NaCl und 0,1 ml 400 mM NaSCN enthielten.
Die Inkubation wurde bei 7ºC in einem Schüttelwasserbad von solcher Geschwindigkeit durchgeführt, dass die Partikeln in steter Bewegung gehalten wurden und dass die Lüftung gewährleistet wurde. Die Gluconsäureerzeugung im Lauf der Zeit wurde unter Verwendung des zuvor erwähnten Prüfungssatzes von Boehringer verfolgt.
Die Figur 18 zeigt die Ergebnisse. Unter den angegebenen Bedingungen kann Wasserstoffperoxid während mindestens 42 Tage bei konstanter Geschwindigkeit erzeugt werden.
Die Maximalmenge an Gluconsäure, welche aus der in diesem Versuch verwendeten Menge Stärke erhalten werden konnte, war 3 mM.

Claims

1. Verfahren zur Erzielung einer verzögerten Freisetzung von Wasserstoffperoxid durch Reaktion von mindestens einer Oxidoreductase mit ihrem entsprechenden Substrat, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens die Oxidoreductase immobilisiert wird und das Substrat zusammen mit der Oxidoreductase immobilisiert und/oder durch enzymatische oder chemische Reaktion erzeugt wird, damit es in brauchbarer Form zugänglich gemacht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung mit Gelatine, einem Alginat oder Carrageen durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Oxidoreductase aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus der Glukose-oxidase, der L-Aminosäure-oxidase, der Galactose-oxidase, der β-Galactosidase/Glukose-oxidase und der Xanthin-oxidase besteht.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem eine Kombination von mindestens zwei Oxidoreductasen verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem das Wasserstoffperoxid zur Umwandlung von Thiocyanat in Hypothiocyanat in Gegenwart einer Peroxidase verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in welchem die Peroxidase die Lactoperoxidase ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Hypothiocyanat zur Konservierung von Nahrung oder Futter verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Hypothiocyanat zur Konservierung von Käse verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Hypothiocyanat gegen Gram-positive oder Gram-negative Bakterien oder Pilze verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Hypothiocyanat gegen die folgenden Mikroorganismen verwendet wird: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus oder Listeria monocytogenes.

11. Zubereitung die fähig ist, Wasserstoffperoxid herzustellen, enthaltend eine Oxidoreductase in immobilisierter Form und ein entsprechendes Substrat in immobilisierter Form, welche die Freisetzung oder die Erzeugung des Substrates reguliert, um eine verzögerte Freisetzung von Wasserstoffperoxid zu gewährleisten.

12. Zubereitung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidoreductase aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus der Glukose-oxidase, der L-Aminosäure-oxidase, der Galactose-oxidase, der β-Galactosidase/Glukose-oxidase und der Xanthin-oxidase besteht.

13. Zubereitung nach Anspruch 11, welche Stärke, Amyloglucosidase, α-Amylase und eine Oxidoreductase, alle in immobilisierter Form, enthält.

14. Zubereitung nach Anspruch 13, in welcher die Komponente in einem Alginat, in Gelatine oder in Carrageen immobilisiert sind.

15. Nahrungsmittel, enthaltend eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 14.

16. Nahrungsmittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Käse ist.