DE1901517A1 - Reagens zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolysierenden Endohydrolasen und Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen - Google Patents

Reagens zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolysierenden Endohydrolasen und Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen

Info

Publication number
DE1901517A1
DE1901517A1 DE19691901517 DE1901517A DE1901517A1 DE 1901517 A1 DE1901517 A1 DE 1901517A1 DE 19691901517 DE19691901517 DE 19691901517 DE 1901517 A DE1901517 A DE 1901517A DE 1901517 A1 DE1901517 A1 DE 1901517A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reagent
groups
determination
atoms
bridges
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19691901517
Other languages
English (en)
Other versions
DE1901517C2 (de
Inventor
Miroslav Ceska
Ingelmann Bjoern Gustav-Adolf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pfizer Health AB
Original Assignee
Pharmacia AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia AB filed Critical Pharmacia AB
Publication of DE1901517A1 publication Critical patent/DE1901517A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1901517C2 publication Critical patent/DE1901517C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/003—Crosslinking of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

RECHTSANWÄLTE
DR. JUR. DIPL-CHEM. WALTER BEIk
ALFRED HOEPPENER tf. Jan
DR. JUR. DIPL-CHEM. H.-J. WOLFP
DR. JUR. HANS CHR. BEIL
FRANKFURT AM MAIN-HÖCHST ADELONSTRASSt 58
Unsere Nr. 15328
Pharmacia AB·
Uppsala / Schweden
Reagens zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolysierenden Endohydrolasen und Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen.
Bs ist außerordentlich wichtig, die sogenannten Endo hydrolasen, die den Abbau der Polysaccharide bewirken, auf einfache und zuverlässige Weise bestimmen zu können. Ein beson ders wichtiges Beispiel in dieser Hinsicht ist die Bestimmung des Enzyms a-Amylase, das Stärke und Glykogen hydrolysiert. Die Bestimmungen der a-Amylase werden in großer Anzahl vorgenommen, z.B. in der Medizin bei Urin- und Serumuntersuchungen für diagnostische Zwecke.
Die Routineverfahren haben bisher wesentliche Nachteile aufgezeigt, und man kann nicht sagen, daß sie völlig zufrie denstellend sind. Die Bestimmung der a-Amylase ist auch in der Industrie von Bedeutung. In ähnlicher Weise ist es auch wesentlich, daß man andere Endohydrolasen, die andere Poly saccharide, z.B. Dextran, hydrolysieren, einfach und zuver lässig bestimmen kann.
009829/1669
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen, die .Polysaccharide in -wässrigen Proben abhauen, sowie Reagentien · zur Durchführung der Bestimmungen.
Der Ausdruck "Polysaccharide" bezieht sich in der vor liegenden Beschreibung und in den Ansprüchen sowohl auf na türliche als auch auf synthetische Polysaccharide, die die strukturellen Eigenschaften der natürlichen Polysaccharide aufweisen, wobei sie infolge dieser Eigenschaften durch die in Frage kommende Endohydrolase abgebaut werden können. Bei spiele für derartige Polysaccharide sind Stärken, wie Amylose oder Amylopektin oder deren Dextrine, Dextran, Levan, Mannan, Galaktan oder deren Derivate, usw.. Bei dem Hydrolysations Vorgang baut die Endohydrolase glykosidische Bindungen in dem Polysaccharid oder in dessen abbaubaren Derivaten ab.
Das Verfahren zur Bestimmung ist hauptsächlich dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem Reagens in Be rührung bringt, das aus einem wasserunlöslichen, jedoch hydrophilen, quellbaren, enzymatisch hydrolysierbaren, dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen des Polysaeöharids oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten besteht, wobei die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt sind, und in dem Netzwerk ferner bestimmbare Gruppen oder Atome vor handen sind, die durch k oval en te Bindungen aneinander gebunden sind, wobei das Enzym mit dem Reagens unter Freisetzung von wasserlöslichen Fragmenten des Reagens, die die bestimmbaren Gruppen oder Atome enthalten, reagiert, nach Einwirkung des· Enzyms auf das Reagens innerhalb eines bestimmten Zeitraums die nicht gelöste Substanz des Reagens von der Flüssigkeit, in der sioh die wasserlöslichen Fragmente des darin gelösten Reagens befinden, trennt und dann die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem nicht gelösten Re agens als MaJ der Enzymaktivität bestimmt.
009829/1669
Ein Reagens zur Durchführung der Bestimmung ist haupt sächlich dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem wasserun löslichen, jedoch hydrophilen, quellbaren, enzymatisch hydrolysierbaren dreidimensionalen Netzwerk von Molekülen des Polysaccharide oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Deriva ten besteht, wobei die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt sind, wobei in dem Netz gleichfalls be stimmbare Gruppen oder Atome vorhanden sind, welche durch ko valente Bindungen aneinander gebunden sind.
Unter dem Ausdruck "bestimmbare Gruppen oder Atome" werden in der nachfolgenden Beschreibung und in den Ansprüchen !farbstoff produzierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen oder radioaktive Isotope oder Gruppen verstanden, die radioaktive Isotope enthalten. Vorzugsweise werden jedoch aus praktischen Gründen die Farbstoff produzierenden Gruppen ausgewählt, da
es verhältnismäßig einfach ist, Farbmessungen selbst in her kömmlichen (routine) Laboratorien vorzunehmen. Wird jedoch ein besonders hoher Empfindlichkeitsgrad gefordert, kann es ratsam sein, fluoreszierende Gruppen oder vorzugsweise radioaktive Isotope oder Gruppen, die radioaktive Isotope enthalten, zu verwenden.
Das zur Bestimmung verwendete Reagens kann nach ver schiedenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise ist es möglich, mit Hilfe von bifunktionellen Brückenbildnern Moleküle des Polysaccharide oder dessen Derivate, die durch die in Frage kommende Endohydrolase hydrolysiert werden können, mittels kovalenter Bindungen zu einem dreidimensionalen Netz zu vernetzen, woraufhin die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalente Bindungen an das Netzwerk gebunden werden. Es ist auch möglich, zuerst die bestimmbaren Gruppen oder Atome durch kovalente Bindungen mit den Molekülen des Poly saccharide oder dessen enzymatisch hydrolysierbaren Derivaten zu verknüpfen und dann die Vernetzung mit Hilfe von bifunktionellen Brückenbildnern zu bewirken. Es ist ferner möglich,
009829/1569
die Vernetzung und Einführung der bestimmbaren Gruppen in der gleichen Stufe, z.B. durch Verwendung von bifunktionellen Brückenbildnern, die auch die bestimmbaren G-ruppen oder Atome, z.B. bifunktioneile reaktionsfähige, Farbstoff produzierende Substanzen, enthalten.
Es gibt natürlich viele Arten von bifunktionellen Substanzen, die als bifunktioneile Brückenbildner verwendet werden können. Beispiele für solche Brückenbildner sind Diepoxyde und die entsprechenden Halohydrine und Diisocyanate (z.B. Hexamethylendiisocyanat) und Dithioisocyanate. Solche Brückenbildner können beispielsweise mit Hydroxyl- oder Aminogruppen in dem Polysaccharid oder in dessen Derivaten, die durch die Endohydrolase hydrolysiert werden können, reagieren, worauf hin die Moleküle durch Brücken mit kovalenten Bindungen ver netzt werden.
Beispiele für solche bifunktionellen Epoxyde und Halohydrine sind Dichiοrhydrin, Epichlorhydrin, Epibromhydrin, 1,2-Äthandioldiglycidyläther, 1,4-Butandioldiglycidyläther, Glycerin-diglyvidyläther, Bis-/" 2,3-epoxypropyl_7-äther und 1,2-3,4-Diepoxybutan. Diese Verbindungen setzen sich beispielsweise mit Hydroxylgruppen und Aminogruppen in Gegen wart einer alkalischen Substanz um. Wenn beispielsweise die Umsetzung mit Hydroxylgruppen im Polysaccharid stattfindet, dann handelt es eich um eine Brücke vom Typ - 0 - A - 0 - , bei der A eine Hydroxylgruppen enthaltende Alkylenbrücke bedeutet, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoff atome unterbrochen sein kann. Das vernetzte Polymere ist Un löslich, aber in Wasser quellbar. Beispiele für A in der vorstehenden Brücke sind:
. OH(OH). OH2- oder
OH(OH). OH2.0.0H2. OH(OH). OH2- oder -OHg.OH( OH).OH2.0.0H2.0H2.0.OH2.OH(OH).CH2- oder
009829/1669
-CH2.GH(OH).CH2.0.(CH2)4.O.CH2-GH(OH).CH2- oder -CH2.CH(OH).CH2.0.CH2.GH2.0.CH2.CH2.0.CH2.CH(OH).CH2- oder -CH2.CH(OH).CH2.0.CH2.CH(OH).CH2.0.CH2.CH(OH).CH2- oder -CH2-CH(OH)-CH(OH)-Ch2- oder
-CH2.OH(OH).CH2.0.0H2.CH(0H).CH2.0.(CH2J2.0.CH2.CH(OH).OH2.0.0H2.
-CH(OH)-CH2- oder
-CH2.CH(OH).CH2.0.CH2.CH(OH).CH2.0.(CHg)4.0.CH2.CH(OH).CH2.0.OH2.
.CH(OH)-GH2-.
Aus der vorstehenden Beschreibung geht hervor, daß es verschiedene Arten von Brücken zwischen den Molekülen des Polysaccharids in dem Reagens gibt, das ausgewählt werden kann. Bei einer besonderen Ausführungsform sind die Moleküle des Polysaccharids mittels aliphatischer Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt, wobei in den Brücken die Anzahl der Kohlenstoffatome zwischen 2 und 20 (beispielsweise zwischen 3 und 20), vorzugsweise 3 und 15, z.B. zwischen 3 und 10, liegt. Es ist besonders zweckmäßig, Brücken auszuwählen, die Hydroxylgruppen enthaltende Alkylengruppen mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, wie z.B. 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, enthalten, wobei die Gruppen gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unter brochen sein können. Solche Hydroxylgruppen enthaltende Brücken machen das Netzwerk hydrophiler, bewirken ein besseres Quellen in Wasser und verbessern die Eigenschaften des Netzwerkes.
Die bestimmbaren (indicatable) Gruppen oder Atome können nach verschiedenen Verfahren eingeführt werden. Wenn es beispielsweise erwünscht ist, gefärbte Gruppen einzuführen, dann ist es verhältnismäßig einfach, eine Umsetzung mit reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen zu bewirken, die sich beispielsweise mit Hydroxylgruppen oder Aminogruppen in dem Polysaooharid oder dessen Derivat umsetzen, z.B. Farbstoff
009829/1569
bildende Substanzen, die sich mit Baumwolle oder Wolle um -. 'setzen, wobei die Substanzen an das Polysaccharid oder das Polysaccharidderivat durch kovalente Bindungen gebunden werden. In Abhängigkeit von der Verwendung wird als zweck mäßigste Farbe beispielsweise ein Blau oder Rot ausgewählt. Beispiele für solche reaktionsfähigen, Farbstoff produzierenden Substanzen sind Cibacronscharlach 2 G- (Procion Scarlet H3GS), Cibacronblau 3 G (Procion Blue HBS). Die Struktur formein dieser Substanzen werden in einem Artikel von J. Panchartek et. al. in Coll. Czech. Chem. Gommun., Band 25 (19.60), Seiten 2783 -2799 beschrieben. Die Einführung von fluoreszierenden Gruppen kann beispielsweise mit Fluores ceinderivaten, z.B. Fluoresceinisothiocyanat, bewirkt wer den. Es gibt ferner eine Anzahl von Möglichkeiten, bei denen radioaktive G-ruppen oder Gruppen, die radioaktive Iso tope enthalten, verwendet werden können. Ein Beispiel be steht in der Einführung einer ein radioaktives Jodisotop, z.B. ^I, enthaltenden Gruppe. Es ist ferner möglich, zuerst eine Gruppe ohne Isotope und dann in die Gruppe ein radioaktives Isotop einzuführen. Dies kann beispielsweise dadurch erzielt werden, daß man zuerst eine Allylgruppe, z.B. mit Hilfe von Allylbromid, einführt und dann ein radioaktives Jodisotop an die Doppelbindung anlagert.
Der G-rad der Substitution mit Bezug auf die bestimm baren Gruppen oder Atome und vernetzenden Brücken in den Polysaccharidmolekülen wird so reguliert, daß die Menge der vorhandenen, bestimmbaren Gruppen und Atome für das Be stimmungsverfahren ausreicht, und daß das dreidimensionale-Netzwerk in ausreichender Weise zusammenhält. Der Grad der Substitution wird jedoch nicht so gewählt, daß der Abbau der Polysaccharidmoleküle in dem Netzwerk durch die in Frage kommende Endohydrolase hier und dort verhindert wird. Ein geeigneter Substitutionsgrad mit Bezug auf die bestimmbaren Gruppen und vernetzenden Brüoken für das jeweilige Polyeaocharid und die in Frage kommende Endohydrolase kann durch Ver -
009829/1569
suche vom Fachmann verhältnismäßig einfach bestimmt werden.
Palis das Reagens die Form von Teilchen haben soll, kann das bei der vorstehend beschriebenen Synthese des Reagens erhaltene G-elprodukt zu der entsprechenden Korngröße gemahlen werden. Die Synthese des gelförmigen Reagens kann auch als Perlpolymerisationsverfahren duroh Emulgieren des Reak tionsgemischs in einer inerten Flüssigkeit, mit der das Reaktionsgemisch nicht mischbar ist, bewirkt werden, wobei unmittelbar kleine kugelförmige Teilchen erhalten werden. Das erhaltene granuläre Material kann in geeigneter Weise gesiebt und die Fraktionen mit der entsprechenden Größe können dann isoliert werden.
Eine wesentliche Bedingung der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß die Polysaccharidmoleküle, die mit den kovalent gebundenen* bestimmbaren Gruppen oder Atomen (z.B. Farbstoff bildenden Gruppen) verknüpft sind, durch Brücken mit kovalenten Bindungen verbunden sind. Auf diese Weise ist es für die bestimmbaren Gruppen oder Atome unmöglich, den Abbau in anderer Weise vorzunehmen als durch die Hydrolyse der entsprechenden Bindungen in den Polysaocharidmolekülen des Netzwerkes, nämlich durch die Endohydrolases. Es ist ferner von Bedeutung, daß das zwar in Wasser unlösliche Reagens leicht duroh die in Frage kommende Endohydrolase gebunden werden kann. Diese Bedingung kann dadurch erfüllt werden, daß dad Reagens aus einem hydrophilen, in Wasser quellbartn, dreidimensionalen lockeren Netzwerk besteht, das duroh Brücken alt kovalenten Bindungen verbunden ist. Die bestimmbaren Gruppen oder Atome, 2.B. die leicht meßbaren, Farbstoff erzeugenden Gruppen, maohen die Bestimmung verhältnismäßig leicht, ferner macht die Kombination der vorstehend beschriebenen Kennzeichen ein besondere empfind lichee und zuverlässiges Bestimmungsverfahren möglich, das einfach durchgeführt werden kann und für Routinearbeiten
009829/1568
außerordentlich geeignet ist.
Wenn die Endohydrolase auf das Reagens einwirkt, werden die Polysaceharidketten abgebaut und wasserlösliche Frag mente des Reagens mit daran angeordneten bestimmbaren Gruppen oder Atomen freigesetzt. Diese Fragmente werden gelöst und können leicht von dem nicht gelösten Reagens» z.B. durch einfaches Abfiltrieren oder Zentrifugieren getrennt werden. Die Bestimmung wird zweckmäßigerweise dadurch bewirkt, daß man die die in Frage kommende Hydrolase enthaltende wässrige Probe mit einer entsprechenden Menge des Reagens in Berührung bringt und die Probe bei einer für das in Frage kommende Enzym geeigneten Temperatur eine vorbestimmte Zeitspanne, unter Rühren auf das Reagens einwirken läßt. Natürlich wird die Hydrolyse durch das Enzym bei einem pH-Wert, der für das in Frage kommende Enzym geeignet ist, und in einer entsprechenden salzhaltigen Umgebung bewirkt. Nachdem das Enzym während des bestimmten Zeitraums auf das Reagens eingewirkt hat, wird die weitere enzymatische Hydrolyse auf herkömmliche Weise unterbrochen. Beispielsweise ist es möglich, die weitere Hydrolyse des Reagens durch z.B. Erhitzen oder Kühlen des Systems, Änderung des pH-Werts oder durch Zusatz eines geeigneten Inhibitors zu verhindern. Es ist auch möglich, das Reagens einfach von der Probelösung zu trennen, falls die dazu benötigte Zeit im Vergleich zu der Reaktionszeit kurz ist. Nach der Abtrennung des Reagens aus der Probelösung werden die bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem ungelösten Reagens als Maß der Enzymaktivität er mittelt. In dieser Hinsicht ist es am einfachsten, wenn die bestimmbaren Gruppen Farbstoff produzierende Gruppen sind und der Farbstoff in der Flüssigkeit als Maß der Enzymaktivität bestimmt wird.
Das Reagens wird vorzugsweise in feinteiliger Form ver wendet, wobei die kleinen Teilchen so ausgewählt werden, daß
005829/1569
eine große Kontaktoberfläche erzielt wird, obgleich die Teilchen nicht zu klein sein sollten, da dadurch die Trennung der nicht gelösten Substanz und der Flüssigkeit schwierig wird. Durch Suspentieren der Teilchen unter Rühren in einer geeigneten flüssigkeit ist es möglich, die Teströhrchen so zu füllen, daß sie das gleiche Volumen der erzielten Suspension aufweisen, so daß das Reagens in jedes Reagensglas in der gleichen Menge mit ausreichender Genauigkeit, eingefüllt werden kann. Fehler, die. durch Veränderungen der in die Test röhrchen eingeführten Substanzmenge entstehen, können da durch reduziert werden, daß man für das Enzym eine über schüssige Menge des Substrates verwendet.
Das Reagens, das beispielsweise in feinteiliger Form vorliegt, kann mit einem inerten Material, beispielsweise in Form einer Trägersubstanz, gemischt werden. Es kann beispielsweise mit einer Papiermasse gemischt werden, so daß ein Papier erhalten wird, das aus einer Mischung mit dem Reagens besteht, wobei das Papier in für die Analyse geeignete Probestücke geschnitten werden kann.
Das Verfahren ist besonders von Bedeutung zur Bestimmung von Endohydrolasen, die Stärken und Glykogen abbauen, z.B. wenn eine große Anzahl von oc-Amylase-Bestimmungen für medizinische Routineuntersuchungen und für industrielle Zwecke vorgenommen werden. Die derzeitigen Routineverfahren aur Bestimmung der oc-Amylase sind nioht völlig zufrieden stellend, und daher entspricht das erfindungsgemäße Verfahren einem besondere wichtigen Erfordernis. Das Verfahren kann auch zur Bestimmung von anderen Sndohydrolasen, z.B. für Endo -hydrolasen, die Dextran abbauen, angewendet werden.
BIe Menge der bestimmbaren Gruppen oder Atome in den wasserlöslichen fragments, die freigesetzt und gelöst werden, ist abhängig von der Knzymaktivität in der Prob« und vom Zeitraum, innerhalb welchem das Bnsym auf das Reagens einwirkt,
009829/HB9
-sowie von anderen Faktoren, die für enzymatisehe Verfahren von Bedeutung sind, z.B. Temperatur und pH-Wert, und in be-' stimmten Fällen, z.B. im Fall der a-Amylase, vom Salzgehalt der Probe. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bestimmung bei einer Temperatur und einem pH-Wert vorgenommen, die für das in Frage kommende Enzym geeig net sind, wobei nach Möglichkeit auch eine geeignete salz haltige'Umgebung vorhanden sein soll.
Eine geeignete Reaktionszeit der vorzunehmenden Be Stimmung kann so eingestellt werden, daß die Menge der bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Lösung nur eine Funk tion der Enzymaktivität der Probe darstellt. Natürlich ist es auch möglich, die Menge der bestimmbaren Gruppen oder Atome in der Lösung bei unterschiedlichen Zeiträumen zu messen, z.B. wenn eine bestimmte Substanzmenge in der Lösung erhalten wird. Gewünschtenfalls können Vergleichstabellen oder Darstellungen verwendet werden, um die erhaltenen Werte in andere Einheiten für die in Frage kommende Enzymaktivität umzuwandeln.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel It
50 g Stärke (löslich, pro analysi) wurden in 200 ecm Wasser gelöst. Bei 200C wurden 10 ecm einer 10 m NaOH-Lösung zugesetzt und dann wurde unter Rühren langsam tropfenweise mit 4 oom 1,4-Butandiol-diglyoidyläther versetzt. Bas Reaktionsgemisch wurde dann ohne Rühren 2 Tage bei 20 C aufbewahrt. Das erhaltene Gel wurde dann zu kleinen Teilchen gemahlen und mit Wasser gewaschen.
10 g Cibacronblau 3 G-A wurden in 200 ecm Wasser gelöst und dann in der Farbstoff lösung die Gelteilchen sus -
009829/1681
pendiert. 15 g NaCl wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden -wurde bei 20°0 unter Rühren mit 10 ecm 10 m NaOH-Lösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann ohne Rühren 20 Stunden bei 2O0C aufbewahrt. Anschließend wurden die Teilchen gründlich mit "Wasser gewaschen, dann getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu einer durchschnittlichen Teilchengröße von etwa 40 Mikron gemahlen. Die Teilchen sind in Wasser unlös lieh, aber quellbar.
Beispiel 2:
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 3 ecm 1,4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispiel 3 :
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 5 ecm 1,4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispi el
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G-A verwendet.
Beispiel
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G anstelle von Cibaoronblau 3 φ-Α verwendet.
009829/1569
Beispiel
50 g Stärke (löslich, p.a.) wurden in 200 ecm Wasser gelöst und bei 200C mit 10 g Cibacronblau 3 G-A und 15 g NaGl versetzt. Nachdem sich der Farbstoff gelöst hatte, wurden 10 ecm m NaOH in das System eingerührt. Das Reaktionsge misch wurde anschließend 20 Stunden bei 2O0C aufbewahrt und dann tropfenweise unter Rühren mit 5 ecm 1,4-Butandioldiglycidyläther versetzt. Das erhaltene Gel wurde dann gemahlen und gründlich mit Wasser gewaschen. Die Teilchen wurden nun getrocknet und weiter in einer Kugelmühle bis zu einer durchschnittlichen Teilchengröße von 40 Mikron ge mahlen.
Beispiel
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde ange wandt, jedoch wurden 8 g Cibacronblau 3 G-A und 4 ecm 1,4-Butandiol-diglycidyläther verwendet.
Beispiel 8:
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde ange wandt, jedoch wurden 10 g Cibacronscharlach 2 G anstelle von Cibacronblau 3 G-A verwendet.
Beispiel 9:
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 ange wandt, jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem Molekulargewicht (Mw ) von 460.000 anstelle von stärke verwendet.
!Off. ■ " ORIGINAL INSPECTED
•£f*-~ ■■■»'. -.1V ■ · ■'· ■
Beispiel. 10;
Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 angewandt, jedoch wurde dieses Mal Dextran mit einem Molekulargewicht von Mn = 460.000 anstelle von Stärke verwendet.
Be i |,ρ; j. e 1 11?
Die Reagentien der Beispiele 1 bis 8 wurden mit einer cL -Amyläse untersucht, die aus der Bauchspeicheldrüse, dem Blutplasma, Urin, Speichel, Malz und Bacillus subtilus stammte. In diesen Fällen wurde die Freisetzung des Farbstoffs in geeigneter Weise bei 620 nm für die blaue Farbe und 510 nm für die rote Farbe gemessen. Ein geeigneter Puffer für die Verwendung bei den Bestimmungen ist ein 0,02 m Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7*0, der gleichfalls NaCl (z.B. 0,01 M) enthält. 0,02 % NaN-, können gleichfalls dem Puffer zugesetzt werden, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Die Bestimmung wurde vorzugsweise so vorgenommen, daß die gewünschte Quantität des Reagens in einem Reagensglas mit einem geeigneten Volumen der Pufferlösung versetzt wurde, woraufhin die wässrige Probe, die die ^. -Amylase enthielt, zugesetzt wurde. Das Reagensglas und sein Inhalt wurden bei einer geeigneten Temperatur während des beabsichtigten Zeitraums in einem Thermostaten geschüttelt, woraufhin eine Weitere enzymatische Hydrolyse, beispielsweise durch Erhitzen oder Kühlen des Systems oder Verändern des pH-Werts oder durch Zusatz von geeigneten Enzyminhibitoren auf bekannte Weise oder durch Abtrennen der Teilchen von der Flüssigkeit verhindert wurde.
Die Farbmessung wurde zweckmäßigerweise bei der Flüssigkeit vorgenommen, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren von den TeHohen getrennt wurde.
009829/1569
Die Freisetzung des Farbstoffs "bei den Reagentien der Beispiele 1 bis 8 unter dem Einfluß der vorstehend angeführten oc-Amylasen wurde bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise 20° bis 6O0O, bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen als Punktion von Zeit und Quantität des Enzyms untersucht. Es wurden auch Tests mit unterschiedlichen Reagensmengen vorgenommen.
Als Ergebnis wurde eimittelt, daß die Bestimmungen zweckmäßigerweise in dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 , bei beispielsweise 37°C (obgleich höhere Temperaturen bis zu 47°C in einigen Fällen gewählt werden können) vorgenommen werden. Gewünschtenfalls können die Bestimmungen
ο .
jedoch auch bei Raumtemperatur (20 C) oder darunter durchgeführt werden, obgleich eine lange Reaktionszeit dann natürlich erforderlich ist. Aus praktischen Gründen wurde gefunden, daß im Fall von normalen Routinebestimmungen der oc-Amylase die Bedingungen zweckmäßigerweise so gewählt sein soll ten, daß die Menge des Reagens bei 5 bis 10 mg und das VoIu men des vorstehend genannten Puffers bei 1 bis 2 ecm liegt , wobei das Volumen der Inzymprobe bei 0,01 bis 0,1 ecm liegen soll, obgleich natürlich auch andere Mengen gewählt werden können.
Bei den Untersuchungen wurde ermittelt, daß die Freisetzung des Farbstoffs in den anfänglichen Stufen im wesentlichen eine rektilineare Funktion der Zeit ist. Es wurde ferner gefunden, daß die Freisetzung des Farbstoffs eine Funktion der Enzymaktivität der Probe ist, wobei ein höherer Grad der Farbstoff-Freisetzung nach einem bestimmten Zeitraum natürlich einem höheren Grad der Enzymaktivität der Probe entspricht und zuverlässige Kurven oder Tabellen für das Verhältnis «wischen dem freigesetzten Farbstoff und der Enzymaktivi- tät können für das in Frage kommende Reagens leicht aufge -stellt werden·
009829/1569
Zur Erläuterung der Empfindlichkeit des Verfahrens wird darauf hingewiesen, daß 0,04-yttg kristalline α-Amylase des Bacillus subtilis aus 1 mg des nach Beispiel 6 verwendeten Reagens nach 10 Minuten "bei 470G eine Farbstoffmenge freisetzten, die ausreichte, um das Meßverfahren zu "bewirken. (ODgpO etwa gleich 1 "bei den in Frage kommenden Testbedingungen) .
Reine ß-Amylase, ein Exoenzym, sollte aus diesem Reagens keinen Farbstoff freisetzen. Bei der Untersuchung mit reiner ß-Amylase des Bacillus subtilis fand keine Frei setzung des Farbstoffs statt.
Tests, die mit dem vorstehend beschriebenen Reagens und einer Anzahl von anderen Reagentien, die mit verschiedenen Mengen der reaktionsfähigen Farbstoff bildenden Substanzen und 1,4-Butandiol-diglycidyläther und anderen Brückenbildnern, wie z.B. 1,2-Äthandiol-diglycidyläther und Epichlorhydrin unter verschiedenen Bedingungen hergestellt worden waren, zeigten die Nützlichkeit der Reagentien bei der Bestimmung der α-Amylase. Beispielsweise wurde gefunden, daß die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Reagentien sehr vorteilhaft waren in Bezug auf. den Substitutionsgrad der Farbstoff bildenden G-ruppen und vernetzenden Brücken und sich besonders für die Bestimmungen der α-Amylase eignen.
Beispiel 12:
Um die Freisetzung von wasserlöslichen Fragmente, die Farbstoff bildende Gruppen enthalten, als eine Funktion der Reaktionszeit weiter zu erläutern, wurden in der nachfolgenden Tabelle 1 die angewendeten Reaktionszeiten und ent sprechenden ODg2Q nm""^er'fce angeführt. Bei dem Test wurden a-Amylaee von B. subtilis (0,08/^g /ecm) und das Reagens des Beispiele 6 (5 mg/ecm) verwendet. Die Temperatur betrug
009829/1589
60 C Die Pufferlösung war die in Beispiel 11 beschriebene Lösung mit einem pH-Wert von 7,0.
Tabelle 1: 0D620 nm
Reaktionszeit, Min. 1,16
2,82
4,22
6,22
2
5
7
10
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt die Menge des Farbstoffs in der Lösung mit der Reaktionszeit zu.
Beispiel 13 :
In der nachfolgenden Tabelle 2 wurden die eines Tests mit oc-Amylase von B. subtilis angegeben. Die Enzymmenge schwankt zwischen 0,04 und 0,40 ztg/ccm. Die Menge des Reagens (nach Beispiel 6) betrug 7 mg/ccm. Die Temperatur betrug 47°C und die Reaktionszeit 10 Minuten. Bei der Pufferlösung handelte es sich um die Lösung nach Beispiel 11 mit einem pH-Wert von 7,0.
Tabelle 2 : 0D620 nm
Enzym, μ g/ccm 2,27
6,80
10,00
0,04
0,16
0,40
009829/1569
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, steigt die Menge des Farbstoffs in der Lösung bei konstanter Reaktionszeit mit zunehmenden Mengen des Enzyms.
Beispiel 14:
Die Reagentien der Beispiele 9 und 10 sowie andere Reagentien mit unterschiedlichen Mengen an Brückenbildnern und reaktionsfähigen, Farbstoff bildenden Substanzen im Verhältnis zu den Dextranpolymeren wurden mi~b Endodextranase von verschiedenen Mikroorganismen nach dem für die a-Amylase in den Beispielen 11, 12 und 13 beschriebenen Verfahren untersucht. Auch in diesem lall wurde eine Freisetzung von gefärbten Fragmenten in gleicher Weise erhalten wie bei der Einwirkung von a-Amylase auf das vorstehend beschriebene Reagens für die a-Amylase.
Ο0982Θ/1589

Claims (13)

  1. Patentansprüche;
    Reagens zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolysierenden Endohydrolasen, dadurch gekennzeichnet, daß es
    aus einem wasserunlöslichen, aber hydrophilen, quellbaren,
    enzymatisch hydrolysierbaren, dreidimensionalen Netzwerk
    von Molekülen des Polysaccharide oder dessen enzymatisch
    hydrolysierbaren Derivaten, bei dem die Moleküle durch
    Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt sind und in dem
    Netz kovalent gebundene, bestimmbare Gruppen oder Atome vor- ^ handen sind, besteht.
  2. 2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    daß das Reagens in Teilchenform vorliegt.
  3. 3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Polysaccharid als Stärke, z.B. Amylose oder Amylopektin oder deren Dextrine vorliegt.
  4. 4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmbaren Gruppen Farbstoff bildende Gruppen sind.
  5. 5. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmbaren Gruppen fluoreszierende Gruppen sind,
  6. 6. Reagens nach einem der Anspruch· 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmbaren Gruppen oder Atome radio aktive Isotope oder Gruppen, die radioaktive Isotope enthalten, sind.
    009929/1619
  7. 7. Reagens nach, einem der Ansprüche 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharidmoleküle in dem Reagens durch aliphatisch^ Brücken mit kovalenten Bindungen vernetzt sind, wobei die Brücken 2 bis 20, vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoff atome, enthalten.
  8. 8. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharidmoleküle in dem Reagens durch Hydroxylgruppen enthaltende. Alkylenbrücken mit 3 bis 20, vorzugsweise 3 bis 15 Kohlenstoffatomen, vernetzt sind, wobei die Brücken gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochen sind.
  9. 9. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit Papiermasse unter Er-*- zielung von das Reagens enthaltendem Papier gemischt wird.
  10. 10. Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen, die Polysaccharide in wässrigen Proben hydrolysieren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem Reagens nach einem der Ansprüche 1-9 in Berührung bringt, so daß eine Umsetzung zwischen dem Enzym und dem Reagens unter Freisetzung von wasserlöslichen Fragmenten des Reagens, die die bestimmbaren Gruppen oder Atome enthalten, stattfindet, nach der Ein wirkung des Enzyms auf das Reagens innerhalb eines bestimm ten Zeitraums die ungelöste Substanz des Reagens von der die wasserlöslichen Fragmenten des Reagens enthaltenden Flüssigkeit abtrennt und dann die bestimmbaren G-ruppen oder Atome in der Flüssigkeit oder in dem ungelösten Reagens als Maß der Enzymaktivität bestimmt.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polysaccharid Stärke oder deren Dextrine oder deren enzymatisch hydrolysierbaren Derivate verwendet.
    009829/1569
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung in Gegenwart eines Puffers mit einem für das in Frage kommende Enzym zweckmäßigen pH-Wert vornimmt.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, da durch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung quantitativ vornimmt.
    Für Pharmacia AB
    Rechtsanwalt
    009829/1569
DE1901517A 1968-01-15 1969-01-14 Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen Expired DE1901517C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE00465/68A SE336915B (de) 1968-01-15 1968-01-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE1901517A1 true DE1901517A1 (de) 1970-07-16
DE1901517C2 DE1901517C2 (de) 1983-01-20

Family

ID=20256615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1901517A Expired DE1901517C2 (de) 1968-01-15 1969-01-14 Reagens und Verfahren zur Bestimmung von α-Amylasen oder Dextranasen

Country Status (11)

Country Link
US (1) US3676303A (de)
JP (2) JPS5134317B1 (de)
BE (1) BE726843A (de)
CH (1) CH499110A (de)
DE (1) DE1901517C2 (de)
DK (1) DK121822B (de)
FI (1) FI49883C (de)
FR (1) FR2000245A1 (de)
GB (1) GB1251433A (de)
NL (1) NL165218C (de)
SE (1) SE336915B (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1291077B (de) * 1966-06-08 1969-03-20 Demag Zug Gmbh Vorrichtung zur Verriegelung zweier Haengekatzfahrbahnen miteinander
DE2801455A1 (de) * 1977-01-14 1978-07-20 Eastman Kodak Co Mehrschichtiges analytisches element fuer die analyse einer fluessigkeit
EP0034692A2 (de) * 1980-01-19 1981-09-02 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Die Verwendung von Stärkederivaten für Indikatormittel
US4337310A (en) * 1978-05-02 1982-06-29 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the determination of α-amylase

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1320086A (en) * 1970-09-11 1973-06-13 Boehringer Mannheim Gmbh Agent and method for the determination of hydrolysing enzymes
NL179399C (nl) * 1976-07-13 1986-09-01 Du Pont Werkwijze voor de bepaling van het amylase-gehalte van een monster en reagens-proefpakket daarvoor.
US4403032A (en) * 1980-04-11 1983-09-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Continuous spectrophotometric assay of microbial cellulase
US4321364A (en) * 1980-04-17 1982-03-23 Minister For Public Works For The State Of New South Wales Preparation of soluble chromogenic substrates
EP0040728A1 (de) * 1980-05-19 1981-12-02 Pharmacia Diagnostics Ab Prüfverfahren, welche biospezifische Affinitätsreaktionen umfassen
US4859581A (en) * 1986-03-10 1989-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Endoglycosidase assay

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3089828A (en) * 1960-12-27 1963-05-14 Schwarz Biores Inc Evaluation of proteolytic enzyme activity
FR1508496A (fr) * 1966-01-20 1968-01-05 Warner Lambert Pharmaceutical Produit et procédé pour le dosage de l'amylase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3089828A (en) * 1960-12-27 1963-05-14 Schwarz Biores Inc Evaluation of proteolytic enzyme activity
FR1508496A (fr) * 1966-01-20 1968-01-05 Warner Lambert Pharmaceutical Produit et procédé pour le dosage de l'amylase

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1291077B (de) * 1966-06-08 1969-03-20 Demag Zug Gmbh Vorrichtung zur Verriegelung zweier Haengekatzfahrbahnen miteinander
DE2801455A1 (de) * 1977-01-14 1978-07-20 Eastman Kodak Co Mehrschichtiges analytisches element fuer die analyse einer fluessigkeit
US4337310A (en) * 1978-05-02 1982-06-29 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the determination of α-amylase
EP0034692A2 (de) * 1980-01-19 1981-09-02 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Die Verwendung von Stärkederivaten für Indikatormittel
EP0034692A3 (en) * 1980-01-19 1981-12-23 Behringwerke Aktiengesellschaft Polysaccharide derivatives, process for their preparation, their use and products containing them

Also Published As

Publication number Publication date
GB1251433A (de) 1971-10-27
JPS5134317B1 (de) 1976-09-25
NL165218C (nl) 1981-03-16
JPS5498700A (en) 1979-08-03
BE726843A (fr) 1969-06-16
DE1901517C2 (de) 1983-01-20
SE336915B (de) 1971-07-19
FR2000245A1 (de) 1969-09-05
FI49883C (fi) 1975-10-10
NL165218B (nl) 1980-10-15
CH499110A (fr) 1970-11-15
NL6900644A (de) 1969-07-17
DK121822B (da) 1971-12-06
US3676303A (en) 1972-07-11
FI49883B (de) 1975-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3001669C2 (de)
DE2646879A1 (de) Matrix aus einem in wasser unloeslichen beta-1,3-glucangel und verfahren zu ihrer herstellung
DE1901517A1 (de) Reagens zur Bestimmung von Polysaccharide hydrolysierenden Endohydrolasen und Verfahren zur Bestimmung von Endohydrolasen
DE3434104A1 (de) Wasserunloesliche zubereitung von hyaluronsaeure und verfahren dazu
DE1768512B2 (de) Verfahren zur herstellung von in wasser unloeslichen, chemisch oder biologisch wirksamen derivaten von biopolymeren
DE2317352A1 (de) Perlfoermige zusammensetzung auf der grundlage eines durch ein cyanhalogenid aktivierten, wasserunloeslichen polysaccharids oder polysaccharidderivates
Magnus Instability of the potency of tuberculin dilutions: a second report
DE2721267A1 (de) Polymermatrix auf der basis von acrylamid
EP0034692B1 (de) Die Verwendung von Stärkederivaten für Indikatormittel
DE2551576A1 (de) Traeger fuer immunochemische messungen
DE1940869A1 (de) Komplexverbindungen
CH636965A5 (de) Kuenstlicher stuhl.
EP0005148B1 (de) Alpha-Amylasesubstrat und Verfahren zu seiner Herstellung
DE1673015B1 (de) Verfahren zur radiochemischen bestimmung von vitamin b tief 12
EP1050544A1 (de) Radiolytisch modifizierte Heteropolysaccharide
DE3614432A1 (de) Verfahren zum antigennachweis
DE2054805A1 (de) Indirekter Hamagglutmationstest bei gleichzeitiger Adsorption heterologer Antikörper
EP0246469B1 (de) Verfahren zur Verkapselung von biologisch aktivem Material
EP0428137B1 (de) Verfahren zur Erhöhung der enzymatischen Reaktivität von Beta-Galactosidase
DE1943881C3 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Thrombinaktivität in Blutplasma und dessen Fraktionen
Robertson Studies on the fertilization of the eggs of a sea urchin Strongylocentrotus purpuratus by blood-sera, sperm, sperm extracts and other fertilizing agents
Bensley An examination of the methods for the microchemical detection of phosphorus compounds other than phosphates in the tissues of animals and plants
DE2524278A1 (de) Diagnostisches mittel, hilfsmittel zu dessen herstellung sowie diagnoseverfahren
DE2059792A1 (de) Indikatorzubereitung fuer eine Verwendung zur quantitativen Bestimmung von Amylase in Koerperfluessigkeiten
DE2138905A1 (de) Kornförmige substituierte Cellulose

Legal Events

Date Code Title Description
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee