CN101899508A

CN101899508A - 西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用

Info

Publication number: CN101899508A
Application number: CN 201010207022
Authority: CN
Inventors: 邱思鑫; 陈新凯
Original assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-08-21
Filing date: 2010-08-21
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2030-08-21
Also published as: CN101899508B

Abstract

本发明提供一种西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用，该特异引物：上游引物AIT1F：5‘-GCTGGATCACCTCCTTTCTG-3’；下游引物AIT2R：5‘-TGACGCAATCAAATTTTTGTCA-3’；经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在西瓜细菌性果斑病菌纯DNA、带菌的发病植株组织和种子中扩增出片段长度为462bp的特异扩增产物，对西瓜细菌性果斑病菌进行快速检测；本发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中带菌西瓜种子和西瓜细菌性果斑病菌感染的植物组织中西瓜细菌性果斑病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为西瓜细菌性果斑病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用。

背景技术

西瓜细菌性果斑病是由燕麦食酸菌西瓜亚种( Acidovorax avenae subsp. citrulli，简称 A.a.c) 侵染引起的一种病害，可以严重为害西瓜的叶片和果实，造成大量减产。最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州发现，没有对病原菌进行鉴定，他们只是描述了病害的症状。 1988年Wall和Santos在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发生情况，并首次将病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenessubsp.citrulli)。1992年Wilems等人根据西瓜果斑病病原菌的rRNA-DNA和DNA-DNA分子杂交的研究结果，将其更名为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli)。从1987年开始，该病在国内的发生和为害情况，就不断有人发现和报道(张老章等，1992)。1998年张荣意等对海南省乐东和东方两县采集的3个菌株进行了鉴定，将病原菌鉴定为(Acidovorax avenae subsp. citrulli)。目前该病害在我国的分布有台湾、福建、香港、海南、山西、陕西、河北、吉林、沈阳、内蒙古、新疆等（林伟丽等，2006）。2002年底至2003年早春，在海南、山东、江苏、北京等地，该病菌造成了大量的嫁接幼苗死亡，仅海南与山东嫁接幼苗就损失800多万棵，经济损失在500万元以上。蔡学清等(2006)通过生理生化的测定，确认2004年在福建省霞浦县和南平市等地发生了西瓜细菌性果斑病。2006年西瓜细菌性果斑病菌被农业部列入我国对内和对外的重要植物检疫性有害生物，2007年被国家质检总局列入我国对内和对外的重要植物检疫性有害生物。

自从发现西瓜细菌性果斑病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究，传统的检测方法是对病原菌进行分离培养和纯化，之后进行致病性测定，选择有致病性的菌株再进行各种生理生化的测定。但是存在着敏感性不高、测试项目多、费时费力等问题。回文广等（2007）人的研究表明，哈密瓜细菌性果斑病菌在的显色培养（ASCM固体培养基）可以形成蓝绿色的菌落。利用显色培养基检测微生物也是国内外研究的热点（杨继勇等，2003；吴多荣等2003；吴清平等2005；肖辉川等2006；陈茂义等2008）。显色培养的原理是根据微生物胞内酶的种类和反应条件，将微生物特异性酶的底物加入到分离培养基中，添加的底物由发色基团和微生物可代谢物质组成，通常为无色，但在微生物产生的特异性酶的作用下会显示出一定的颜色，观察菌落的颜色即可以对微生物作出初步的判断（张淑红等，2006）。

目前分子生物学技术已经开始应用于果斑病菌的检测（任毓忠等，2004；王政等2005；闻慧等，2007）。根据16S rDNA设计的引物，冯建军等(2006)使用TaqMan 探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌株不同梯度菌悬液以及病组织浸泡液，结果表明，其灵敏度达10^3~4 CFU/mL。冯建军等(2006)以西瓜细菌性果斑病菌菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10⁶ CFU/mL，这种方法投入成本低、操作简易，但是特异性中等，灵敏度较低。

目前针对A.a.c.的检测所设计的引物大多为细菌性果斑病菌的16Sr RNA基因，以及根据16S及23S 核糖体DNA设计的引物来扩增转录间隔 (Internal Transcribed Spacer，ITS)。Walcott等(2000)根据16S rDNA序列设计了检测燕麦食酸菌西瓜亚种的引物(WFB1:5'-GAC CAG CCA CAC TGG GAC-3', WFB2: 5'- CTG CCG TAC TCC AGC GAT-3')。但是由于燕麦食酸菌卡特莱兰亚种和燕麦食酸菌西瓜亚种16S rDNA的同源性高达99%，因此基于16S rRNA设计的引物常会因燕麦食酸菌卡特莱兰亚种而影响检测结果。Schaad等(1999)根据ITS序列设计了检测燕麦食酸菌西瓜亚种的引物（SEQID4：5-GTC ATT ACT GAA TTT CAA CA-3; SEQID5:5-CCT CCA CCA ACC AAT ACG CT-3）并申报了美国发明专利。回文广等(2007)人根据ITS序列设计引物(Prime(+):5'-GTT GGA AGA ATT CGG TGC TA CC-3'; Primer(-):5'-ATT CGT CAT TAC TGA ATT TCA ACA AG-3')，初步建立了哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的方法，结果发现菌液PCR的检测初始浓度最低为 3×10⁵CFU/mL。为了给生产应用提供更加可靠检测方法，本发明根据细菌的ITS序列设计引物建立了西瓜细菌性果斑菌PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物及其应用，针对现有技术中西瓜细菌性果斑病菌的生物学检测方法所需周期长、目前西瓜细菌性果斑病菌分子检测测方法特异性差，假阳性率高，灵敏度低的问题，提供一种西瓜细菌性果斑病菌的特异分子检测引物。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．根据西瓜细菌性果斑病16S-23S rDNA的ITS序列特异性，设计了对西瓜细菌性果斑病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物AIT1F：5‘-GCT GGA TCA CCT CCT TTC TG -3’

下游引物AIT2R：5‘-TGA CGC AAT CAA ATT TTT GTC A-3’，

2．西瓜细菌性果斑病菌特异分子检测体系的建立

（1）从西瓜发病植株或西瓜种子中提取DNA；

（2）PCR扩增：PCR反应体系为25μL，所述PCR反应体系为2.5 μL10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg2+，100~400 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10~100 ng模板DNA, d.d.H2O补足25 μL；PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35s，59~70℃退火35s，循环30次，72 ℃延伸 5 min；

（3）然后将3~8 μl PCR产物用重量浓度1.2%琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。

（4）如果能特异性地扩增出462bp产物时，即可判断所述的样品中存在西瓜细菌性果斑病菌；否则所述的植株组织或土壤样品中未存在西瓜细菌性果斑病菌。

其中，步骤（1）所述西瓜种子中提取DNA的具体方法如下：取西瓜种子20-100粒，放入灭菌的研钵，加入无菌水10-30 mL进行研磨，研磨液静置10 min取上清用双层擦镜纸过滤，滤液于1，2000 g离心30 s，沉淀加入1 mL无菌水重悬并用45μm细菌过滤器过滤，取下滤膜用1 mL无菌水冲洗，洗液12000 g离心30 s，沉淀加20μl的TE缓冲液，沸水浴10 min，1, 2000 g离心2 min，取上清1 ml作为PCR扩增的模板；或将西瓜种子研磨后取2 mL研磨液加入到20 mL的LB液体培养基中，28℃，180 rpm，振荡培养24 h；用双层擦镜纸过滤培养液，之后将过滤后的培养液煮沸10 min，1, 2000 g离心2 min，取上清1 ml作为PCR扩增的模板。

所述发病植株中提取DNA采用DNA快速提取法获得发病组织中的西瓜果斑病菌的DNA，具体方法为取200 mg病叶片或果组织，加2 mL 0. 5 mol/LNaOH研磨；取5μl研磨液加入到495μl浓度为0. 1 mol/L的Tris-HCl，pH为8. 0缓冲液中，12, 000 rpm离心3 min，取上清液即可用于PCR反应。

本发明的关键性技术是西瓜细菌性果斑病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了获得西瓜细菌性果斑病菌的特异引物序列，本发明以我国福建、浙江、北京等省市以及新西兰的30株西瓜细菌性果斑病菌和多个食酸菌近缘种以及常见的几种病原细菌为供试材料，采用CTAB-SDS法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取供试菌株培养液1.5 mL加入到1.5 mL Eppendorf管中，12，000 rpm，离心2 min; 倒去上清液，加入500 mL 1×TE（配制为10 mmol/LTris-HCL，0.1 mmol/LEDTA，pH8.0），用枪头反复吹打混匀；加入5 mL蛋白酶K，30 mL 重量浓度10%SDS，轻轻混匀，37℃水浴锅放置1 h；待菌液变透明后，加入100 mL 5 mol/L NaCl混匀，加入80 mL CTAB 提取液（配制为重量浓度10% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA, pH8.0；0.7 mol/L NaCl），轻缓地颠倒离心管数次使样品充分混匀，65℃水浴放置10 min；冷却后加715 mL加入酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，轻柔颠倒数次，12，000 rpm离心5 min；小心吸取上清至另一新的1.5 mL Eppendorf管，加入与吸取上清液等体积的上述酚、氯仿和异戊醇混合溶液，颠倒混匀；12，000rpm离心5 min，小心吸取上清至另一新的1.5 mL Eppendorf管；加入与吸取上清液等体积的异丙醇，轻柔颠倒数次混匀， -20 ℃放置30 min，12，000rpm离心5min，弃上清，加入1 mL 70％乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台中晾干沉淀，无酒精味后加入100 μL 1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50 ng/μL保存于-20℃备用；在获得西瓜细菌性果斑病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物特异引物序列，经对供试菌株和30株西瓜细菌性果斑病菌的特异性进行PCR验证，PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，150 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4min，94 ℃变性35s，59~70℃退火35s，72℃ 延伸30s(此步骤也可不做)，循环30次，72 ℃延伸 5 min。所述特异引物在西瓜细菌性果斑病菌上特异性地扩增出462bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织和种子中西瓜细菌性果斑病菌快速可靠的检测和鉴定。

本发明的方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于带菌的植株和种子高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间西瓜细菌性果斑病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，此技术对于西瓜细菌性果斑病菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明有益效果：本发明针对现有技术中存在的缺陷，通过测定西瓜细菌性果斑病菌及其它食酸菌属细菌的16S-23S ITS序列，经多重比对分析，针对西瓜细菌性果斑病菌的 ITS序列的特异性设计出了一对引物，用于带西瓜细菌性果斑病菌的病残体、植株和种子的高灵敏度快速分子检测，建立西瓜细菌性果斑病菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系。此技术可应用于西瓜细菌性果斑病菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供科学依据。

本发明方法适用于病残体、植株组织和西瓜种子中西瓜细菌性果斑病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中西瓜细菌性果斑病菌引起的病害的防治具有重要的实用价值；本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强：本发明检测方法是利用西瓜细菌性果斑病菌的rDNA具有保守性和ITS序列多变性的特点，根据多变性ITS特异序列设计引物进行检测。已经对源于我国福建、北京、浙江、海南和新西兰等不同地区的西瓜细菌性果斑病菌和其它细菌菌株的验证，结果具有很强的特异性；

2、实用性好：本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带西瓜细菌性果斑病菌的病残体、植株组织和种子的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对发病植物组织中存在的西瓜细菌性果斑病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

3、操作简便快速：应用本发明方法，对带西瓜细菌性果斑病菌的植物组织进行病菌DNA的快速提取、二步法PCR扩增（省略延伸步骤）和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在4~6小时内完成。

附图说明：

图1 为本发明所要检测的西瓜细菌性果斑病菌的特异PCR扩增图；其中：泳道1-6为西瓜细菌性果斑病菌，泳道7 为燕麦食酸菌卡特莱兰亚种，泳道8为燕麦食酸菌燕麦亚种，泳道9为魔芋食酸菌，泳道10为丁香假单胞菌丁香致病变，泳道11为茄青枯菌，泳道12为大肠杆菌，泳道13为红条假单胞菌，泳道14为燕麦食酸菌卡特莱兰亚种，泳道15为燕麦食酸菌燕麦亚种，泳道16为魔芋食酸菌，泳道17-19为芽孢杆菌，泳道20为阴性对照，泳道M为DL 2000 bp DNA 分子量标准；

图2为本发明西瓜细菌性果斑病菌的灵敏性检测扩增结果图；其中：泳道M为DL 2000 bp DNA 分子量标准，泳道1为10⁸ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道2为10⁷ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道3为10⁶ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道4为10⁵ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道5为10⁴ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道6为10³ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道7为10² CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道8为10¹ CFU/mL的西瓜细菌性果斑病菌，泳道9为阴性对照；

图3为本发明对发病组织的检测结果图；其中：泳道1为DL 2000 bp DNA 分子量标准，泳道2为阴性对照，泳道3为健康西瓜果组织，4为发病西瓜果组织，5，6，7为发病的西瓜叶组织，泳道8为健康西瓜叶组织；

图4为本发明对带菌种子的检测结果图；其中：泳道1为DL 2000 bp DNA 分子量标准，泳道2为阳性对照，泳道3，4，5为种子样品。

具体实施方式：

本发明的技术内容包括西瓜细菌性果斑病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为：

上游引物AIT1F：5‘-GCT GGA TCA CCT CCT TTC TG -3’

下游引物AIT2R：5‘-TGA CGC AAT CAA ATT TTT GTC A-3’

利用该引物可从西瓜细菌性果斑病菌上特异扩增出462bp的产物。

以下结合实施例具体阐述本发明

实施例1：引物对西瓜细菌性果斑病菌的特异性扩增

1．西瓜细菌性果斑病菌的特异检测

各菌株的DNA提取方法按上述SDS-CTAB法进行，PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，150 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，65℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。

2．检测结果

检测的特异性：除了西瓜细菌性果斑病菌可特异地扩增出462 bp的产物外，检测了细菌的其它6株食酸菌以及青枯菌、红条假单胞菌、丁香假单胞菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等菌株DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性（图1）。

实施例2：引物对西瓜细菌性果斑病菌的灵敏性检测

1．检测细菌的浓度稀释与裂解：西瓜细菌性果斑病菌培养液经梯度稀释成10¹、10²、10²、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸CFU/mL，然后经沸水裂解后，直接吸取上清进行PCR检测。

2．西瓜细菌性果斑病菌的灵敏性检测

PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，150 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和1 μL细菌裂解液做模板DNA, d.d.H₂O补足25 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，65℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。

3．检测结果：10⁵CFU/mL浓度可看到条带，也就是在25 μL反应体系中，有约100个西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA可获得明显扩增条带（图2）。

实施例3：发病植物组织中西瓜细菌性果斑病菌的检测

1．样品采集：发病西瓜植物组织样品采自福建省闽清蔬菜基地。

2．DNA提取及检测

发病植物组织采用DNA快速提取法获得病组织中的西瓜果斑病菌的NDA，具体方法为取200 mg病叶片或果组织，加2 mL 0. 5 mol/LNaOH研磨；取5 --l研磨液加入到495 --l浓度为0. 1 mol/L的Tris-HCl(pH为8. 0)缓冲液中，12, 000 rpm离心3 min，取上清液即可用于PCR反应。按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，150 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，65℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。电泳检测扩增产物。

3．检测结果

结果见图3，各种病组织均见到一条清晰的分子量为462 bp的特异条带，因而判断发病组织感染西瓜细菌性果斑病菌。

实施例4：种子中西瓜细菌性果斑病菌的检测

1．样品：种子为市售大红西瓜种子。

2．DNA提取及检测

取西瓜种子100粒，放入灭菌的研钵，加入无菌水15 mL进行研磨，种子研磨后取2 mL研磨液加入到20 mL的LB液体培养基中，28℃，180 rpm，振荡培养24 h。用双层擦镜纸过滤培养液，之后将过滤后的培养液煮沸10 min，1, 2000 g离心2 min，取上清1 ml作为PCR扩增的模板。按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，150 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，65℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。电泳检测扩增产物。

3．检测结果

结果见图4，有2个种子样品中扩增出一条清晰的分子量为462 bp的特异条带，因而判断种子带有西瓜细菌性果斑病菌。

Claims

1.一种西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的序列为：

AIT1F：5‘-GCT GGA TCA CCT CCT TTC TG -3’

AIT2R：5‘-TGA CGC AAT CAA ATT TTT GTC A-3’。

2.根据权利要求1所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物AIT1F/ AIT2R对西瓜细菌性果斑病菌特异性扩增出462 bp的产物。

3.根据权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的特异引物序列获得方法为：以西瓜细菌性果斑病菌、多个燕麦食酸菌其他亚种的菌株、食酸菌属内的近缘种以及常见的几种病原细菌为供试材料，采用CTAB—SDS法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取供试菌株细菌培养液1.5 mL加入到1.5 ml Eppendorf管中，12，000 rpm，离心2 min；倒去上清液，加入500 ml 1×TE，用枪头反复吹打混匀；加入5 ml蛋白酶K，30ml 重量浓度10% SDS，轻轻混匀，37℃水浴锅放置1 h；待菌液变透明后，加入100 ml 5 mol/L NaCl混匀，加入80 mlCTAB提取液，轻缓地颠倒离心管数次使样品充分混匀，65℃水浴放置10 min；冷却后加715 ml酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻柔颠倒数次，12，000 rpm离心5 min；小心吸取上清至另一新的1.5 ml Eppendorf管，加入吸取上清液等体积的上述酚、氯仿和异戊醇混合溶液，颠倒混匀；12，000 rpm离心5 min，小心吸取上清至另一新的1.5 ml Eppendorf管，加入与吸取上清液等体积的异丙醇，轻柔颠倒数次混匀，-20 ℃放置30 min，12，000 rpm离心5发min，弃上清，加入1 ml 70％乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台中晾干沉淀，无酒精味后加入100 ml 1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50 ng/μl，保存于-20℃备用；PCR在获得西瓜细菌性果斑病菌和其他细菌ITS序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物特异引物序列，经对供试菌株和30株西瓜细菌性果斑病菌的特异性进行PCR验证，所述特异引物在西瓜细菌性果斑病菌上特异性地扩增出462 bp的产物。

4.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述CTAB提取液的配制为重量浓度10% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA， pH8.0；0.7 mol/L NaCl。

5.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述1×TE溶液配制为10 mmol/LTris-HCL，0.1 mmol/LEDTA，pH8.0。

6.根据权利要求3所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物，其特征在于：所述对供试菌株和30株西瓜细菌性果斑病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25 μl，包括2.5 μl 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，100~400 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和20 ng模板DNA, d.d.H₂O补足25 μl，PCR反应条件为：94℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，59~70℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min。

7.一种如权利要求1、2、3、4、5和6所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的应用，其特征在于：所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物应用于西瓜细菌性果斑病菌的快速分子检测诊断，按照以下步骤检测：

(1) 从西瓜发病植株或西瓜种子中提取DNA；

(2) 以该DNA为模板用所述的一对引物AIT1F和AIT2R通过聚合酶链式反应PCR扩增；PCR反应体系25 μl，所述PCR反应体系为2.5 μl 10×PCR反应缓冲液，2.0 mmol/L Mg²⁺，100~400 μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物AIT1F和AIT2R各0.2 μmol/L和10~100 ng模板DNA，d.d.H₂O补足25 μl；PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性35 s，59~70℃退火35 s，循环30次，72 ℃延伸 5 min；

（3）然后取步骤（2）的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出462 bp的产物，即可判断所述的样品中存在西瓜细菌性果斑病菌。

8.根据权利要求7所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的应用，其特征在于：步骤（1）所述西瓜种子中提取DNA的具体方法如下：取西瓜种子20-100粒，放入灭菌的研钵，加入无菌水10-30ml进行研磨，研磨液静置10min取上清用双层擦镜纸过滤，滤液于1，2000g离心30s，沉淀加入1 ml无菌水重悬并用45μm细菌过滤器过滤，取下滤膜用1 ml无菌水冲洗，洗液12000g离心30s，沉淀加20μl的TE缓冲液，沸水浴10 min，1, 2000 g离心2 min，取上清1 ml作为PCR扩增的模板；或将西瓜种子研磨后取2 mL研磨液加入到20 ml的LB液体培养基中，28℃，180 rpm，振荡培养24 h；用双层擦镜纸过滤培养液，之后将过滤后的培养液煮沸10 min，1, 2000 g离心2 min，取上清1 ml作为PCR扩增的模板。

9.根据权利要求7所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的应用，其特征在于：步骤（1）所述发病植株中提取DNA采用DNA快速提取法获得发病组织中的西瓜果斑病菌的DNA，具体方法为取200 mg病叶片或果组织，加2 ml 0.5 mol/LNaOH研磨；取5μl研磨液加入到495 μl浓度为0.1 mol/L的Tris-HCl，pH为8. 0缓冲液中，12, 000 rpm离心3 min，取上清液即可用于PCR反应。

10.根据权利要求7所述的西瓜细菌性果斑病菌分子检测引物的应用，其特征在于：所述步骤（3）为取3~8μl PCR扩增产物用重量浓度1.2%琼脂糖电泳分离。