CN201473547U

CN201473547U - 检测番茄溃疡病菌的巢式nest-pcr的试剂盒

Info

Publication number: CN201473547U
Application number: CN2009201563380U
Authority: CN
Inventors: 刘箐
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Gansu Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Gansu Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2019-05-22

Abstract

本实用新型是一种番茄细菌性溃疡病菌的巢式NEST-PCR试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置PCR缓冲液9×-10×(3)，氯化镁25-20mmol/L(4)，dNTP 9-10mmol/L(5)，Taq酶2IU/μL(6)；引物CMM-A10-15pmol/μL(7)，CMM-a 10-15pmol/μL(8)，引物CMM-B10-15pmol/μL(9)，CMM-b10-15pmol/μL(10)，双蒸水99％～100％(11)，检测PCR管6个(12)，阳性对照PCR管3个(13)，阴性对照PCR管3个(14)，阳性对照1管(15)，阴性对照1管(16)。是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒。

Description

检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒

技术领域

本实用新型是一种番茄细菌性溃疡病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对番茄细菌性溃疡病菌Clavibactermichiganensis subsp，michiganensis(Cmm)的检测。适用于番茄细菌性溃疡病菌的田间预防及进出口植物检疫中Cmm快速检测。

背景技术

番茄细菌性溃疡病是番茄最重要、危害性最大的病害之一。该病害可引起植株萎蔫、溃疡和果实斑点，严重影响果实的产量和质量。该病菌能侵染多种茄科植物并引起蔬菜大量减产，给农业生产带来巨大的经济损失。因而，目前欧洲、美洲、亚洲的大多数国家都将其列为重要的检疫对象。我国自从1981年首次在北京发现以来，辽宁、山西、黑龙江、新疆等地已相继报道该病的发生。甘肃省河西地区外繁种子基地是全国最大的对外制种基地，其中番茄对外制种已经有20年历史，面积占总制种面积的10-20％，近年来，已经在田间屡次发现番茄细菌性溃疡病，因此所有的外国公司都将其列为禁止携带的病害，由于我国目前对该病的研究很少，快速检测技术尚未建立，每年都因为未能及时准确的对该病进行快速、准确地鉴定而造成种子退货，给农户和制种公司带来巨大的经济损失。

该病病原属密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp，michiganensis)。种子是其远距离传播的主要途径，一般种传率在1％-5％，病菌还可存活于土壤和植物病残体中，存活期可长达2-3年。由于种子带菌率很低，传统的生物学方法很难快速地分离到病原，且程序烦琐；即使比较灵敏的酶联免疫(ELISA)法检测，也会造成漏检，且检测成本过高，无法适应口岸检疫所要求的快速、准确、灵敏的要求。90年代初期，国外学者将分子生物学方法用于该病的检测，检测灵敏度得到了极大的提高，最低检测限达到了100个细菌/反应体系。即便如此，在检测周期上却没有大的提高，且传统的DNA抽提过程损失了太多的病原菌，因而不可避免地降低了PCR方法应有的灵敏度。

中国专利200410041287.9公开了一种番茄溃疡病的检测试剂盒，最低检测限达到了50个细菌/反应体系。

实用新型内容

本实用新型的目的在于避免现有技术的不足提供一种检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒。

本实用新型对番茄种子进行简单快速的病原菌抽提，去除种子杂质和影响PCR反应的成分，获得相对纯净的细菌做为PCR扩增摸板，用两对嵌套式引物对模板DNA进行扩增，可以在12小时内完成整个PCR检测，不但极大地提高了检测灵敏度，而且缩短了检测时间，且结果准确、可靠，是一种行之有效的植物病原细菌分子生物学检测方法。

为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案为：一种检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其主要特点是在容器孔中分别放置PCR缓冲液9×-10×(3)，氯化镁25-20mmol/L(4)，dNTP9-10mmol/L，(5)Taq酶2IU/μL(6)；引物CMM-A10-15pmol/μL(7)，CMM-a10-15pmol/μL(8)，引物CMM-B10-15pmol/μL(9)，CMM-b10-15pmol/μL(10)，双蒸水99％～100％(11)，检测PCR管6个(12)，阳性对照PCR管3个(13)，阴性对照PCR管3个(14)，阳性对照1管(15)，阴性对照1管(16)。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述的核苷酸序列为：

CMM-A为gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；

CMM-a为gtacggctaccttgttacgacttagt；

CMM-B为ccccgactctgggataactgcta；

CMM-b为cggttaggccactggcttcgggtgttaccga。

本实用新型的有益效果是：本实用新型番茄细菌性溃疡病菌的检测试剂盒，涉及一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在12小时内就可以完成检测。

本实用新型提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。

通过对番茄细菌性溃疡病菌的特异性检测，引物CMM-A，CMM-a，CMM-B，CMM-b优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了一段1297bp的PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种非目标菌，均无扩增产物。

通过灵敏度的检测，对番茄细菌性溃疡病菌纯菌液的直接PCR和Nest-PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为2600个细菌/ml，而Nested-PCR的最低检出量是13个细菌/ml。

通过对番茄检测，均可从带菌种子中准确稳定的检测到1297bp的PCR产物，和ELISA检测符合率为99％，且有1％的ELISA未检测到的带菌种子，该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。

对于番茄溃疡病，该试剂盒可以不经过DNA提取而以病原菌为模板直接进行一步法PCR检测，对纯菌液Direct-PCR最低检出限为2600个细菌/ml，而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml；对种子提取液，Direct-PCR不能检出，而Nested-PCR最低检出限可达到3×10⁵个细菌/ml。

附图说明

图1是本实用新型的立体示意图。

图2实用新型实施例3出口番茄Cmm检测；

其中：M：marker，1-11出口番茄种子CMM的Nest-PCR检测。

图3本实用新型实施例4田间样品的Cmm检测。

其中：M：marker，1-4进口番茄种子CMM的Nest-PCR检测。

具体实施方式

以下结合实施例对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。

实施例1：一种检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒，包括有盒体1，衬垫2，在衬垫2上设有数个容器孔，在容器孔中分别放置PCR缓冲液10×3，氯化镁25mmol/L4，dNTP 10mmol/L5，Taq酶2IU/μL6；引物CMM-A10-15pmol/μL7，CMM-a10-15pmol/μL8，引物CMM-B10-15pmol/μL9，CMM-b10-15pmol/μL10，双蒸水99％～100％11，检测PCR管6个12，阳性对照PCR管3个13，阴性对照PCR管3个14，阳性对照1管15，阴性对照1管16。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述的核苷酸序列为：

CMM-A为gtgatgtcagagcttgctctggcggatc；

CMM-a为gtacggctaccttgttacgacttagt；

CMM-B为ccccgactctgggataactgcta；

CMM-b为cggttaggccactggcttcgggtgttaccga。

实施例2：一种检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒，包括有盒体1，衬垫2，在衬垫2上设有数个容器孔，在容器孔中分别放置PCR缓冲液9×3，氯化镁20mmol/L4，dNTP 9mmol/L5，Taq酶2IU/μL6；引物CMM-A10-15pmol/μL7，CMM-a10-15pmol/μL8，引物CMM-B10-15pmol/μL9，CMM-b10-15pmol/μL10，双蒸水99％～100％11，检测PCR管6个12，阳性对照PCR管3个13，阴性对照PCR管3个14，阳性对照1管15，阴性对照1管16。

上述各种液体分别装在容器内，插入容器孔内。

所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)待检测材料的制备；按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。

抽提缓冲液配方为：Na₂SO₃ 0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0.5ml/L，pH为7.4；抽提缓冲液使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1∶2-10。

(2)第一对引物PCR扩增，PCR循环预变性增加到20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR反应条件为：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。

(3)第二对引物PCR扩增，以第一次扩增产物为模板；PCR反应条件为：预变性94℃1分钟，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。

(4)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(5)对条带进行分析得出结论。

实施例3：对出口的11批番茄种子进行验证检测：

随机抽取经过ELISA检测的出口番茄种子23批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物周1％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明，见图2，所检测的番茄种子均不携带Cmm，和ELISA检测结果完全符合。

实施例4：对进口的4批番茄种子进行验证检测：

随机抽取经过ELISA检测的进口番茄种子12批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环。使用菌液为模板时，变性时间延长至20分钟。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析。结果表明，见图3，所检测的番茄种子均不携带Cmm，和ELISA检测结果完全符合。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims

1.一种检测番茄溃疡病菌的巢式NEST-PCR的试剂盒，包括有盒体(1)，衬垫(2)，在衬垫(2)上设有数个容器孔，其特征是在容器孔中分别放置PCR缓冲液9-10×(3)，氯化镁25-20mmol/L(4)，dNTP 9-10mmol/L(5)，Taq酶2IU/μL(6)；引物CMM-A10-15pmol/μL(7)，CMM-a10-15pmol/μL(8)，引物CMM-B10-15pmol/μL(9)，CMM-b10-15pmol/μL(10)，双蒸水99％～100％(11)，检测PCR管6个(12)，阳性对照PCR管3个(13)，阴性对照PCR管3个(14)，阳性对照1管(15)，阴性对照1管(16)。