CN105219871A - 基于cytC基因检测番茄溃疡病菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了番茄溃疡病菌中<i>cyt</i>C基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，通过观察显色剂颜色变化，判断样品是否含有番茄溃疡病菌。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。

Description

基于cytC基因检测番茄溃疡病菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及植物病害的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测番茄溃疡病菌的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

番茄细菌性溃疡病（Bacterialcankeroftomato）是由密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis）引起的一种维管束病害，经种子和土壤传播。自1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，现已广泛分布于全球60多个国家和地区，在我国北京、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地均发生严重，近年来发病呈上升趋势，成为番茄生产上的一种毁灭性的病害，造成的产量损失高达80%以上。我国1995年将该病原菌列入《全国植物检疫对象名单》，2007年列入《中华人民共和国进境植物检疫有害生物名录》。

通过种子检疫和早期病害检测能对该病害起到较好的防控作用。目前对番茄细菌性溃疡病菌检测的方法主要有生理生化反应、ELISA、PCR、基因芯片和测序比对等。在上述方法中，PCR方法应用最为广泛，但基于PCR技术的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4h），难以实现现场快速检测，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的检测新技术。

LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。

目前虽有报道利用LAMP技术检测番茄细菌性溃疡病菌的检测方法和试剂盒，但采用的检测引物大多根据番茄溃疡病菌ITS序列进行设计的，且没有设计环引物。本发明以番茄溃疡病菌的特异性基因cytC为检测靶标对象，设计了2条内引物、2条外引物和1条环引物，能在60分钟内、63~65℃的反应条件下，通过显色反应对番茄溃疡病菌特异性检出。检测特异性更强、灵敏度更高、时间更短、方法更简单。在进出口检疫部门和基层植保部门，本发明具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的在于公开番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于公开番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测番茄溃疡病菌的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

根据番茄溃疡病菌的cytC基因的核苷酸序列，设计cytC基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQIDNO:1~5；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性进行验证。

番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：TATGCCGCCGGTGACG（SEQIDNO：1）；

外引物2：CCATCCGTGTGCCTGCA（SEQIDNO：2）；

内引物1：ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC（SEQIDNO：3）；

内引物2：ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC（SEQIDNO：4）；

环引物：TGCTCCACCCGCATCGA（SEQIDNO：5）。

番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的5条引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L、4~6μmol/L；

（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；

（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，40~100mmol/LMgSO₄，6~14mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。

优选的，所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物1、5μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1、40μmol/L内引物2、5μmol/L环引物。

优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。

优选的，所述的10×反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L和8mol/L。

利用以上所述的试剂盒检测番茄溃疡病菌的方法，包括如下步骤：

（1）提取番茄溃疡病菌基因组DNA：按细菌基因组DNA提取试剂盒提取番茄溃疡病菌基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；

（3）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（4）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。

通过实验证明，本发明提供的cytC基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点，能够快速准确鉴定番茄溃疡病菌。

附图说明

图1为实施例2中进行LAMP特异性检测的结果图，1为番茄溃疡病菌，2为番茄青枯假单胞菌，3为茄青枯假单胞菌、4为马铃薯环腐病菌、5为黄瓜角斑病菌、6为西瓜果斑病菌、7为马铃薯疮痂病菌、8为空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1试剂盒及其检测方法。

按下列配方制备番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测试剂盒，每个试剂盒的规格为100次反应：

（1）检测引物溶液：合成外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物，将引物干粉用灭菌去离子水或超纯水分别配成浓度为100μmol/L的母液，然后分别取5μL外引物1、5μL外引物2、40μL内引物1、40μL内引物2、5μL环引物，充分混匀，配成100μL的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：

外引物1：TATGCCGCCGGTGACG（SEQIDNO：1）；

外引物2：CCATCCGTGTGCCTGCA（SEQIDNO：2）；

内引物1：ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC（SEQIDNO：3）；

内引物2：ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC（SEQIDNO：4）；

环引物：TGCTCCACCCGCATCGA（SEQIDNO：5）；

（2）BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL，分装100μL放入一个新的1.5mL离心管中；

（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8)，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，80mmol/LMgSO₄，8mol/L甜菜碱，分装250μL放入一个新的1.5mL离心管中；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500μL放入一个新的1.5mL离心管中；

（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料，分装200μL放入一个新的棕色1.5mL离心管中。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

（1）提取番茄溃疡病菌基因组DNA：按细菌基因组DNA提取试剂盒提取番茄溃疡病菌基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；

（3）运行LAMP扩增反应：63℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（4）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。

实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。

对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品包括：番茄溃疡病菌、番茄青枯假单胞菌、茄青枯假单胞菌、马铃薯环腐病菌、黄瓜角斑病菌、西瓜果斑病菌、马铃薯疮痂病菌。

本实施例中，仅含番茄溃疡病菌的样品反应管显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对番茄溃疡病菌具有很好的特异性。

应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>吉林省蔬菜花卉科学研究院

<120>基于cytC基因检测番茄溃疡病菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

<130>

<160>5

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测外引物1

<400>1

tatgccgccggtgacg16

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测外引物2

<400>2

ccatccgtgtgcctgca17

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测内引物1

<400>3

atcgacggcgttggtccggggtggaatccgctcttcac38

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测内引物2

<400>4

atccacgtagccgaacgcatcggcccgaactggtcagacc40

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>番茄溃疡病菌cytC基因的LAMP检测环引物

<400>5

tgctccacccgcatcga17

Claims (6)

1.番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：TATGCCGCCGGTGACG（SEQIDNO：1）；

外引物2：CCATCCGTGTGCCTGCA（SEQIDNO：2）；

内引物1：ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC（SEQIDNO：3）；

内引物2：ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC（SEQIDNO：4）；

环引物：TGCTCCACCCGCATCGA（SEQIDNO：5）。

2.番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的5条引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、和环引物的浓度依次为4~6μmol/L、4~6μmol/L、32~48μmol/L、32~48μmol/L、4~6μmol/L；

（2）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；

（3）10×反应缓冲液：200mmol/LTris-HCl、pH8.8，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，40~100mmol/LMgSO₄，6~14mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）显色剂：1000×SYBRGREENI荧光染料。

3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物溶液中含有5μmol/L外引物1、5μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1、40μmol/L内引物2、5μmol/L环引物。

4.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，浓度为8U/μL。

5.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为80mmol/L、8mol/L。

6.利用权利要求2~5任一项所述的试剂盒检测番茄溃疡病菌的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL反应管内加入模板DNA2~5μL、检测引物溶液1μL、BstDNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液2~5μL，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25μL；

（3）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（4）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。