CN108753775B - 靶向APOBEC3G基因的sgRNA及食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法 - Google Patents

靶向APOBEC3G基因的sgRNA及食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向APOBEC3G基因的sgRNA及食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法。本发明针对食蟹猴APOBEC3G基因的mRNA确立靶序列并合成相应的sgRNA，然后构建敲除载体，共转染食蟹猴胚胎成纤维细胞，获得APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞，或将sgRNA和Cas9 mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎。本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴细胞和食蟹猴胚胎上实现APOBEC3G基因的基因敲除，为建立艾滋病动物模型奠定了坚实基础。

Description

靶向APOBEC3G基因的sgRNA及食蟹猴APOBEC3G基因敲除的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向APOBEC3G基因的sgRNA及食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的疾病。病毒以人类CD4T淋巴细胞为攻击目标，造成感染者免疫功能丧失。动物疾病模型是研究疾病必不可少的工具，在艾滋病疾病模型上，虽然在其他动物上发现能感染不同种属动物的免疫缺陷病毒，但没有一种疾病模型能实现HIV-1型病毒感染并表现出AIDS病人临床表现。研究人员希望通过基因敲除技术制造食蟹猴感染HIV非人灵长类疾病模型能为人类AIDS的研究另辟蹊径。
脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editingenzyme catalytic polypeptide-like protein 3 protein G,APOBEC3G)属于固有免疫家族成员；具有胞嘧啶脱氨酶活性。在HIV-1复制过程中通过与HIV-1的Gag蛋白相互作用，选择性包装进入病毒毒粒参与反应。在HIV-1的逆转录反应过程中，APOBEC3G通过催化病毒负链cDNA中的dC胞嘧啶脱氨尿嘧啶为Du，从而在病毒基因组中引入引发基因组大量碱基的超突变，进而从而发挥抗病毒作用。除了胞嘧啶脱氨机制外，APOBEC3G还能通过某些非脱氨机制抑制HIV-1的活性，而HIV-1编码的VIF蛋白可经以通过泛素—-蛋白酶体的降解途径来拮抗APOBEC3G的抗病毒活性。由上可知，敲除APOBEC3G基因能降低动物的抗病毒能力，有可能实现食蟹猴感染HIV的非人灵长类疾病模型提供新的有效方法。
综上所述，制备APOBEC3G基因敲除的非人灵长类动物细胞模型，对于建立艾滋病动物模型具有重要意义。至今未发现由和本发明相同或类似的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种靶向APOBEC3G基因的sgRNA，其中，APOBEC3G基因来自食蟹猴。
本发明的另一目的在于提供一种食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，该方法包括食蟹猴APOBEC3G在食蟹猴胚胎成纤维细胞上的基因敲除以及食蟹猴胚胎上的基因敲除方法，为人类艾滋病模型提供思路。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种靶向APOBEC3G基因的sgRNA，为sgRNA1或sgRNA3，其核苷酸序列如下所示：
sgRNA1：5'-CAATAAACCTTGGGTCAG(TGG)-3'；
sgRNA3：5'-TCCCGCTGAACCAGCACA(GGG)-3'；
其中，括号内为PAM位点NGG，促进靶点识别；
所述的靶向APOBEC3G基因的sgRNA在APOBEC3G基因敲除领域中的应；
一种食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，包含如下步骤：
(1)根据上述靶向APOBEC3G基因的sgRNA，设计合成sgRNA引物oligo，退火处理后，与载体连接，得到敲除载体；
(2)将步骤(1)制得的敲除载体共转染食蟹猴胚胎成纤维细胞，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞；
或体外合成sgRNA，与Cas9mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎；
步骤(1)中所述的sgRNA引物oligo的核苷酸序列如下所示：
sgRNA1-Sense：5'-AAACACCG-CAATAAACCTTGGGTCAG-3'；
sgRNA1-Anti：5'-CTCTAAAAC-CTGACCCAAGGTTTATTG-3'；
sgRNA3-Sense：5'-AAACACCG-TCCCGCTGAACCAGCACA-3'；
sgRNA3-Anti：5'-CTCTAAAAC-TGTGCTGGTTCAGCGGGA-3'；
步骤(1)中所述的载体优选为pCAG-T7-Cas9；
步骤(1)中所述的共转染的具体操作优选为：
①将食蟹猴胚胎成纤维细胞(CMDF细胞)培养至汇合度80～90％；
②将0.75μL Lipo3,000和25μL Opti-men混匀，得到混合物1；将1μL P3000、25μLOpti-men和500ng DNA混匀，得到混合物2；将混合物1和混合物2分别静置后加入步骤(1)培养的细胞中进行共转染，共转染后换含有终浓度为0.5ng/μL puro的培养基进行筛选；
③对步骤②筛选后的细胞进行T7E1酶切验证，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞；
步骤②中所述的静止时间优选为5min；
步骤②中所述的共转染的时间优选为24h；
步骤②中所述的筛选的时间优选为3～5d；
步骤③中所述的T7E1酶切验证的具体操作优选为：
对步骤②筛选后的细胞进行DNA提取并进行PCR扩增目的片段，进行T7E1酶切验证；
所述的PCR扩增的引物优选为：
gRNA-F：5'-CAGCGATCTCCCAGTGAGC-3'；
gRNA-R：5'-GGAGAGTCACTGAAGCCAAAGT-3'；
步骤(1)中所述的共转染的试剂优选37℃水浴加热；
所述的体外合成sgRNA的具体操作优选为：
①根据上述靶向APOBEC3G基因的sgRNA，设计合成引物，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
②将步骤①制得的转录DNA模板转录，得到sgRNA；
所述的引物的核苷酸序列如下所示：
T7-gRNA-F：TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；
gRNA-PCR-R：AGCACCGACTCGGTGCCACTT；
其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为gRNA序列，不带PAM序列；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对食蟹猴APOBEC3G基因提供了2个高效的敲除靶点。
(2)本发明经敲除效果检测鉴定，能有效在食蟹猴细胞和食蟹猴胚胎上实现APOBEC3G基因的基因敲除，为建立艾滋病动物模型奠定了坚实基础。
附图说明
图1是sgRNA体外靶位点活性检测酶切结果图；其中，a：sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，b：sgRNA5、sgRNA6、sgRNA7和sgRNA8；NC-1、NC-2：野生型，。
图2是pCAG-T7-Cas9质粒的图谱图。
图3是敲除载体转染进食蟹猴胚胎成纤维细胞及细胞筛选的结果分析图；其中，a：用lopi3000转染质粒载体第一天白光视野(5X)，b：相同视野的绿色荧光；c：用6μL puro筛选第一天白光视野，d：筛选第二天视野，e：筛选第三天视野，f：筛选第四天视野。
图4是食蟹猴胚胎成纤维细胞共转染筛选后T7E1酶切鉴定电泳图。
图5是细胞转染sgRNA1后与野生型序列对比结果分析图。
图6是细胞转染sgRNA3后与野生型序列对比结果分析图。
图7是注射sgRNA与Cas9mRNA后胚胎发育图，其中，a：四细胞胚胎，b：8细胞胚胎，c：囊胚期，d：致密化期胚胎。
图8是胚胎目的基因PCR鉴定和T7E1酶切鉴定电泳图，其中，a：PCR鉴定，b：酶切鉴定，箭头所指为酶切后出现的另外一条较短的带。
图9是突变型胚胎测序与野生型序列对比结果分析图；其中，(A)：胚胎1；(B)：胚胎2。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 APOBEC3G基因靶点效率检测
(1)设计靶点
针对食蟹猴APOBEC3G基因(基因ID为NC_022281.1)的mRNA确立靶序列；根据食蟹猴APOBEC3G基因的mRNA序列(cagcgatct cccagtgagc cccagaaggg gtcagaggggcaggtgtgga ggctccagca agtgagcggg agccccttct gacaggtgct aagggatgtg gggagcaaggggaaggaggg tggggtgaaa gggaggaagc gtggagaggg agggggaggc agggcagacc acgacgagggctcttactcc tctgggcttt ttcccccgct gtccacagac atttgatgga tccaggcacg ttcacttccaactttaacaa taaaccttgg gtcagtggac agcatgagac ttacctgtgt tacaaggtgg agcgcctgcacaatgacacc tgggtcccgc tgaaccagca caggggcttt ctacgcaacc aggtgaccaa cccagccacccacatccagg cagggctctc ccaatccagg gacacgcatg ggcagaaggt tctgggcggt acctgtggtgtcccgcagag tgtctgtcac ctgtgcttcc tgcagctgct gctgcttggc cctggggttg gggggggaaactttggcttc agtgactctc)，设计15个靶序列，其中3个靶序列的核苷酸序列如下所示：
sgRNA1：5'-CAATAAACCTTGGGTCAG(TGG)-3'；
sgRNA2：5'-AGCGCCTGCACAATGACACCTGG(AGG)-3'；
sgRNA3：5'-TCCCGCTGAACCAGCACA(GGG)-3'；
sgRNA5：5'-GGAGGCAGGGCAGACCACG(AGG)-3'；
sgRNA6：5'-CGAGGGCTCTTACTCCTCTG(CGG)-3'；
sgRNA7：5'-CCCAATCCAGGGACACGCAT(GGG)-3'；
sgRNA8：5'-GTGGTGTCCCGCAGAGTGT(AGG)-3'；
(2)提取野生型食蟹猴胚胎成纤维细胞(已在专利申请号为“201510670510.4”，申请名称为“一种食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的方法”中公开)的DNA作为模板，设计合成针对上述靶点所在基因片段的引物，进行PCR扩增，纯化，得到用于酶切的DNA片段；其中，扩增引物的序列如下所示：
gRNA-F：5'-CAGCGATCTCCCAGTGAGC-3'；
gRNA-R：5'-GGAGAGTCACTGAAGCCAAAGT-3'；
(3)体外转录合成sgRNA
根据上述靶点设计合成扩增引物，以px459载体(淼灵质粒平台addgene)为模板，进行PCR扩增(扩增体系见表1)，纯化，得到转录DNA模板，进一步通过转录(转录体系见表2)、纯化，得到gRNA，其中，扩增引物的核苷酸序列如下所示，同时扩增、转录，得到标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)(Cas9-gRNA靶点效率检测试剂盒(Catalog.VK007，北京维尚立德))；
T7-gRNA-F：
5'-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；
gRNA-PCR-R：5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3'；
其中，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN为gRNA靶点；
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0001650738000000051
表2 sgRNA体外转录体系
Figure BDA0001650738000000061
(4)靶点体外活性检测
按照表3的体外靶位点活性检测体系，除gRNA外，混合好酶反应溶液，分成5等份，将步骤(3)合成的gRNA的浓度进行倍减(100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng)，分别加入到5管cas9酶切溶液中，反应30min，65℃煮5min，采用质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，部分结果如图1所示，sgRNA5、sgRNA6、sgRNA7和sgRNA8只有一条带，其活性为0。进一步分析gRNA活性，结果见表4。经比较分析，所设计15个靶点中，靶点sgRNA1和sgRNA3活性最高，故选用这两个靶点进行敲除。
表3体外靶位点活性检测体系
Figure BDA0001650738000000062
表4酶切条带灰度换算
Figure BDA0001650738000000063
注：标准gRNA1(g1)和标准gRNA2(g2)经过SSA luciferase检测过活性，其SSA活性分别为：标准gRNA1(g1)＝3，标准gRNA2(g2)＝10，NC为野生型，若样品gRNA的酶切效率<g1,表明样品靶点活性差，敲除的可能性较小；40％>若样品gRNA的酶切活性>g1，表明该靶点的活性及格；若g2>样品靶位点活性>50％，表明样品靶位点活性良好；若样品gRNA的酶切活性>g2，表明样品gRNA靶点活性非常高。
实施例2 APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞
(1)构建敲除质粒载体
经过靶点体外活性检测，本发明根据靶向APOBEC3G基因的sgRNA1和sgRNA3(均位于APOBEC3G基因的第六外显子)，设计合成sgRNA引物oligo，其中，sgRNA引物oligo的序列如下所示：
sgRNA1-Sense：5'-AAACACCG-CAATAAACCTTGGGTCAG；
sgRNA1-Anti：5'-CTCTAAAAC-CTGACCCAAGGTTTATTG；
sgRNA3-Sense：5'-AAACACCG-TCCCGCTGAACCAGCACA；
sgRNA3-Anti：5'-CTCTAAAAC-TGTGCTGGTTCAGCGGGA；
将上述sgRNA引物oligo进行退火处理，使之形成oligo二聚体，与载体骨架pCAG-T7-Cas9(淼灵质粒平台addgene)(图2)连接，25℃静置5min，使oligo二聚体插入到载体中，得到敲除载体；
(6)共转染食蟹猴胚胎成纤维细胞
采用英潍捷基lip3,000来转染CMDF细胞，在转染前所用试剂都应在37℃水浴加热，具体操作如下：
①将野生型食蟹猴胚胎成纤维细胞(CMDF细胞，已在专利申请号为“201510670510.4”，申请名称为“一种食蟹猴TRIM5alpha基因敲低的方法”中公开)培养至汇合度80～90％；
②将lipo3,000(0.75μL Lipo3,000和25μL Opti-men)和P3,000(1μL P3,000，25μL Opti-men和500ng DNA)分别置于不同的EP管中，混匀后静置5分钟；然后加入步骤(1)培养的细胞中进行共转染，共转染24h后换含有终浓度为0.5ng/μL puro的培养基进行筛选，因为载体中具有筛选基因puro，所以选用puro(0.5ng/μL)进行筛选，野生型中因不具有抗性基因会被杀死从而筛选出已转染的细胞，筛选的时间为4d，不能超过5d，当野生型基本被筛选尽后筛选终止，并且换正常的培养基进行培养即可，如图3。
③待筛选后的细胞正常培养至分裂足够多后，对细胞进行DNA的提取并扩增(gRNA-F：5'-CAGCGATCTCCCAGTGAGC-3'，gRNA-R：5'-GGAGAGTCA CTGAAGCCAAAGT-3')，得到目的基因组片段(突变体DNA PCR产物)，另以野生型食蟹猴胚胎成纤维细胞DNA PCR产物作为对照(实施例2步骤(2))。
(7)T7E1酶切验证
表5酶切反应体系
Figure BDA0001650738000000081
将按照表5配制酶切反应体系，并将含有酶切反应体系的EP管放浮板上，放置在1L的烧杯中加入500mL沸腾的水等待它冷却至室温(此过程大约需要1h～1.5h)。
将上述反应体系加0.5μL T7E1酶，37℃反应30min后，立刻加2μL DNA LoadingBuffer放于65℃煮10min，质量分数为2％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，结果见图4。
将样品送测序后与野生型进行比对更加直观地证明在食蟹猴胚胎成纤维细胞上质粒载体起到敲除的作用(图5、图6)。
实施例3
(1)体外转录合成sgRNA
①根据实施例1靶点sgRNA1和sgRNA3设计合成引物，其中，引物的核苷酸序列如下所示：
T7-gRNA-F：5'-TAATACGACTCACTATAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；
gRNA-PCR-R：5'-AGCACCGACTCGGTGCCACTT-3'；
以px459载体为模板，T7-gRNA-F和gRNA-PCR-R作为扩增引物，进行PCR扩增，得到转录DNA模板，其中，PCR扩增体系同表1；
(2)步骤(1)制得的转录DNA模板通过转录(北京维尚立德T7转录试剂盒)、纯化后，得到sgRNA，其中，转录体系同表2；
(3)注射载体后胚胎的发育情况
用胚胎显微操作技术将sgRNA3：50ng/μL(混合后终浓度)和Cas9mRNA(市购)80ng/μL(混合后终浓度)混合注射进17枚食蟹猴胚胎(制备方法参照Functional disruption ofthe dystrophin gene in rhesus monkey using CRISPR/Cas9，其中食蟹猴购自蓝岛生物公司)中，观察注射后胚胎发育情况(图7)。
(4)验证胚胎靶位点敲除情况
抽取了其中发育到八细胞以后的胚胎的七枚胚胎的DNA进行验证sgRNA敲除情况。从T7E1酶切的条带和测序情况的对比中都可明确的直到sgRNA在胚胎中工作，使目的基因发生敲除(图8、图9)，图9为其中两个胚胎目的基因敲除情况。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
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gtgagcggga gccccttctg acaggtgcta agggatgtgg ggagcaaggg gaaggagggt 120
ggggtgaaag ggaggaagcg tggagaggga gggggaggca gggcagacca cgacgagggc 180
tcttactcct ctgggctttt tcccccgctg tccacagaca tttgatggat ccaggcacgt 240
tcacttccaa ctttaacaat aaaccttggg tcagtggaca gcatgagact tacctgtgtt 300
acaaggtgga gcgcctgcac aatgacacct gggtcccgct gaaccagcac aggggctttc 360
tacgcaacca ggtgaccaac ccagccaccc acatccaggc agggctctcc caatccaggg 420
acacgcatgg gcagaaggtt ctgggcggta cctgtggtgt cccgcagagt gtctgtcacc 480
tgtgcttcct gcagctgctg ctgcttggcc ctggggttgg ggggggaaac tttggcttca 540
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物T7-gRNA-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(38)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 11
taatacgact cactatagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnn 38
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物gRNA-PCR-R
<400> 12
agcaccgact cggtgccact t 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物sgRNA1-Sense
<400> 13
aaacaccgca ataaaccttg ggtcag 26
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物sgRNA1-Anti
<400> 14
ctctaaaacc tgacccaagg tttattg 27
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物sgRNA3-Sense
<400> 15
aaacaccgtc ccgctgaacc agcaca 26
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物sgRNA3-Anti
<400> 16
ctctaaaact gtgctggttc agcggga 27

Claims (10)

1.一种靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA，其特征在于：为sgRNA1或sgRNA3，其核苷酸序列如下所示：
sgRNA1：5'-CAATAAACCTTGGGTCAGTGG-3'；
sgRNA3：5'-TCCCGCTGAACCAGCACAGGG-3'。
2.权利要求1所述的靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA在APOBEC3G基因敲除领域中的应用。
3.一种食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于包含如下步骤：
方法（1）：根据权利要求1所述的靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA，设计合成sgRNA引物oligo，退火处理后，与载体连接，得到敲除载体；将制得的敲除载体共转染食蟹猴胚胎成纤维细胞，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞；
或方法（2）：体外合成权利要求1所述的靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA与Cas9 mRNA混合注射入食蟹猴胚胎，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎。
4.根据权利要求3所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
方法（1）中所述的sgRNA引物oligo的核苷酸序列如下所示：
sgRNA1-Sense：5'-AAACACCG-CAATAAACCTTGGGTCAG-3'；
sgRNA1-Anti：5'-CTCTAAAAC-CTGACCCAAGGTTTATTG-3'；
sgRNA3-Sense：5'-AAACACCG-TCCCGCTGAACCAGCACA-3'；
sgRNA3-Anti：5'-CTCTAAAAC-TGTGCTGGTTCAGCGGGA-3'。
5.根据权利要求3所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
方法（1）中所述的载体为pCAG-T7-Cas9。
6.根据权利要求3所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
方法（1）中所述的共转染的具体操作为：
①将食蟹猴胚胎成纤维细胞培养至汇合度80～90%；
②将0.75μL Lipo3,000和25μL Opti-men混匀，得到混合物1；将1μL P3000、25μLOpti-men和500ng DNA混匀，得到混合物2；将混合物1和混合物2分别静置后加入步骤（1）培养的细胞中进行共转染，共转染后换含有终浓度为0.5ng/μL puro的培养基进行筛选；
③对步骤②筛选后的细胞进行T7E1酶切验证，得到APOBEC3G基因敲除的食蟹猴胚胎成纤维细胞。
7.根据权利要求6所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
步骤②中所述的共转染的时间为24h。
8.根据权利要求6所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
步骤②中所述的筛选的时间为3～5d。
9.根据权利要求3所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
方法（2）中体外合成靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA的具体操作为：
①根据权利要求1所述的靶向敲除APOBEC3G基因的sgRNA，设计合成引物，然后以px459载体为模板，进行PCR扩增，得到转录DNA模板；
②将步骤①制得的转录DNA模板转录，得到sgRNA。
10.根据权利要求9所述的食蟹猴APOBEC3G基因敲除的方法，其特征在于：
所述的引物的核苷酸序列如下所示：
T7-gRNA1-F：TAATACGACTCACTATAG-CAATAAACCTTGGGTCAG；
T7-gRNA3-F：TAATACGACTCACTATAG-TCCCGCTGAACCAGCACA；
gRNA-PCR-R：AGCACCGACTCGGTGCCACTT。
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