RU2810549C1 - гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 - Google Patents
гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810549C1 RU2810549C1 RU2023101720A RU2023101720A RU2810549C1 RU 2810549 C1 RU2810549 C1 RU 2810549C1 RU 2023101720 A RU2023101720 A RU 2023101720A RU 2023101720 A RU2023101720 A RU 2023101720A RU 2810549 C1 RU2810549 C1 RU 2810549C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- grna
- bola
- leukemia virus
- bovine leukemia
- exon
- Prior art date
Links
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 title claims abstract 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108010063590 BoLA-DRB3 antigen Proteins 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 241000202252 Cerberus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150034979 DRB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001663879 Deltaretrovirus Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101100278514 Oryza sativa subsp. japonica DRB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рибонуклеопротеиновому комплексу для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3, включающему белок CAS 9 и гРнк, характеризующаяся 5´- GACCGAGCGGGUGCGGUACCUGG -3. Изобретение эффективно для геномного редактирования для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. 2 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано для создания генетической конструкции с целью геномного редактирования предимплантационных эмбрионов для получения высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к лейкозу.
Изобретение обеспечивает эффективное встраивание генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ДНК эмбриональной культуры клеток крупного рогатого скота при трансфекции.
Лейкоз крупного рогатого скота – вирусное заболевание, которое характеризуется злокачественным разрастанием лимфатической ткани. Возбудителем этого заболевания является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, BLV), который относится к семейству РНК-содержащих вирусов семейства Retroviridae, рода Deltaretrovirus. В настоящее время лейкоз крупного рогатого скота остается одним из самых распространенных карантинных заболеваний. По состоянию на март 2022 года 65 субъектов Российской Федерации являются неблагополучными по лейкозу крупного рогатого скота, что подтверждается официальной информацией Россельхознадзора (https://cerberus.vetrf.ru/cerberus/regionalization/pub), в т.ч. и Кемеровская область-Кузбасс.
Учитывая распространенность заболевания и отсутствия лечения, а также генетическую предрасположенность высокопродуктивных животных, необходим поиск принципиально новых методов профилактики данного заболевания, в т.ч. и с применением методов генной инженерии, что позволяет получать наиболее ценные по хозяйственным признакам животных, устойчивых к заражению ВЛКРС.
Патент РФ №2621146 «Способ профилактики постнатального заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота молодняка крупного рогатого скота», патент РФ № 2631607 «Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения», описывают фармакологические методы профилактики заражения животных ВЛКРС. Недостатком методов является возможность заражения вирусом при отмене препаратов.
Ближайшим аналогом выбран патент РФ 2741092 «Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота», описывающим генетическую конструкцию на основе плазмидного вектора, кодирующего последовательность направляющей РНК, а также ряд регуляторных последовательностей: промоторы CMV и U6, энхансеры, ген-репортер – GFP, вставку hSpCas9 (5400 п.н.), селективный ген (обеспечивающий резистентность к тем или иным антибиотикам), ген эндонуклеазы Cas9, сайты узнавания для различных рестриктаз. Несмотря на удобство применения плазмидного вектора с целью геномного редактирования эукариотических клеток, у данного метода имеется недостаток – несовпадение во времени деления эукариотических клеток редактируемого организма с транскрипцией гРНК и трансляцией Cas9, что приводит к получению химерного организма.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение генетической конструкции, способной встраиваться в ДНК эмбриональной культуры клеток крупного рогатого скота, что обеспечивает модификацию генома с целью последующего получения генетически полноценных животных, устойчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.
Технический результат достигается тем, что готовый рибонуклеопротеиновый комплекс: смесь белка CAS9 и гРНК позволяет о проводить редактирование 2 экзона гена BoLA-DRB3 крупного рогатого скота за счет низкой неспецифической активности и редактирования сразу после встраивания в клетку.
Пример выполнения.
Для выявления генов, проводится сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей крупного рогатого скота (представитель рода Bos Taurus), депонированных в генетическую базу данных (GenBank), в результате которого выявляется главный комплекс гистосовместимости крупного рогатого скота BoLA-DRB3, содержащий участок – экзон 2 гена BoLA-DRB3, содержащий нуклеотидную последовательность «GGAGTATTCTACGAGCGAGTGTCATTTCTTCAACGGGACCGAGCGGGTGCGGTACCTGGACAGATACTTCCATAATGGAGAAGAGTTCGTGCGCTTCGACAGCGACTGGGGCGAGTACCGGGCGGTGACCGAGCTAGGGCGGCGGTCCGCCGAGCAGTTGAACGGCCAGAAGGACACCCTGGAGCGGGAGCGGGCCTATGTGGACACGTACTGCAGACACAACTACGGGGTCGTTGA», кодирующих аминокислотную последовательность Val-Asp-Thr-Tir (VDTY) (фиг. 1), которая, ассоциирована с восприимчивостью к лейкозу, поскольку идентична участку аминокислотной цепи обратной транскриптазы вируса лейкоза.
Следующий этап работы заключается в разработке гРНК, с применением одного из веб-инструментов CHOP-CHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) для выбора целевых сайтов CRISPR/Cas9. Подбор включал в себя следующие этапы:
1. Введение нуклеотидной последовательности, полученной в результате анализа молекулярно-биологических программ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) в веб-инструмент CHOP-CHOP;
2. Выбор видовой принадлежности редактируемого организма из предложенного списка. В нашем случае выбранным организмом является Bos Taurus;
3. Указание системы, с помощью которой планируется проводить редактирование. Свой выбор мы остановили на системе CRISPR/Cas9.
Для внесения двухцепочечного разрыва в геном крупного рогатого скота с применением системы редактирования CRISPR-Cas9 подбирается последовательность направляющей РНК с учетом следующих правил:
1. Оптимальным участком для внесения двуцепочечного разрыва ДНК с целью нокаутирования гена является участок экзонной области ДНК, расположенный на расстоянии около 150-300 п.н. после сарт-кодона.
2. Первым нуклеотидом, расположенным на 5′-конце гРНК (с которого будет начинаться синтез молекулы РНК), должен быть гуанин. Поэтому необходимо подбирать последовательности ДНК вида G(N)19 NGG.
3. Необходимо чтобы 17-м нуклеотидом протоспейсера, непосредственно прилегающего к месту разрыва, и наибольшим образом влияющий на исход репарации, являлся тимин или аденин. В этом случае с большей вероятностью произойдет инсерция-делеция со сдвигом рамки считывания.
4. Необходимо обеспечить исключение возникновения нецелевых мутаций при эффективном подборе целевых.
С учетом вышеуказанных требований была подобрана следующая гРНК: (5´- GACCGAGCGGGUGCGGUACCUGG -3´).
Для введения в клетки системы CAS применяется готовый рибонуклеопротеиновый комплекс: смесь белка CAS9 и гРНК с выбранной нуклеотидной последовательностью (5´- GACCGAGCGGGUGCGGUACCUGG -3´). Доставка системы CRISPR/CAS9 в виде готового рибонуклеопротеинового комплекса имеет ряд преимуществ, среди которых: высокая эффективность редактирования; низкая неспецифическая активность; редактирование сразу после встраивания в клетку; возможность быстрого скрининга эффективности направляющих РНК в пробирке.
Для исследования способности гРНК вносить двухцепочечный разрыв в выбранный участок редактируемого гена BoLA-DRB3 была проведена липофекция 9 эмбриональных клеточных культур крупного рогатого скота.
Полученные клеточные культуры культивировали при температуре 37 оС, в 5% СО2 в течение 40-48 часов. Через три дня культивирования из эмбриональных клеточных культур выделяют плазмидную ДНК, путем проведения денатурации и медленного отжига ПЦР-продуктов. При проведении отжига ампликоны фрагментов ds-DNA, расщепляли рестриктазой EarI. При исследовании ПЦР-продуктов на 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия и фиксируют системой гель-документации, имеющие различную длину нуклеотидные последовательности в агарозном геле появляются различными размерами фрагментов (табл. 1).
Таблица 1 – Генотипирование эмбрионых культур клеток крупного рогатого скота на наличие целевой модификации
| № | Наличие целевой модификации |
| 1 | + (159 п.н.; 78 п.н.) |
| 2 | - 159 п.н. |
| 3 | + (159 п.н.; 78 п.н.) |
| 4 | - (120 п.н.; 78 п.н.) |
| 5 | - (500 п.н.; 159 п.н.) |
| 6 | - 159 п.н. |
| 7 | + (159 п.н.; 78 п.н.) |
| 8 | - (120 п.н.; 78 п.н.) |
| 9 | - |
Визуализация менее ярких полос в 3 образцах, содержащих фрагменты рестрикции с меньшей молекулярной массой (159 п.н. и 78 п.н.) свидетельствует о наличии встроенной генетической конструкции (Фиг. 2).
Визуализация полос с данной молекулярной массой – является подтверждением эффективной интеграции целевой последовательности в геноме эмбриональных клеток.
На основании вышеизложенного, можно сделать вывод, что созданный рибонуклеопротеиновый комплекс: смесь белка CAS9 и гРНК 5´- GACCGAGCGGGUGCGGUACCUGG -3´ позволяет более эффективно проводить редактирование 2 экзона гена BoLA-DRB3 крупного рогатого скота за счет низкой неспецифической активности и редактирования сразу после встраивания в клетку. Определение эффективности встраивания геномной конструкции не требует высокоценного технологичного оборудования.
Claims (1)
- Рибонуклеопротеиновый комплекс для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3, включающий белок CAS 9 и гРнк, характеризующаяся 5´- GACCGAGCGGGUGCGGUACCUGG -3.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810549C1 true RU2810549C1 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741092C1 (ru) * | 2020-07-23 | 2021-01-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2741092C1 (ru) * | 2020-07-23 | 2021-01-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALEXEY V. DEYKIN et al., Using CRISPR/Cas9 for generation the cd209 knockout is a way to get cattle breeds resistant to the Bovine leukemia virus (BLV), E3S Web of Conferences, 2020, 176, 01007. JULIARENA M. A. et al, Association of BLV infection profiles with alleles of the BoLADRB3.2 gene, Animal Genetics, 2008, 39(4), 432-438. CHIEH-WEN LO et al., BoLA-DRB3 Polymorphism is Associated with Differential Susceptibility to Bovine Leukemia Virus-Induced Lymphoma and Proviral Load, Viruses 2020, 12, 352; doi:10.3390/v12030352. * |
| МЕТЛЕВА А.С. И др., Отбор Grna для геномного редактирования чувствительных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей экзона 2 гена Bola-DRB3 с помощью CRISPR/Cas9, Материалы IV Международной научно-практической конференции "Современная научно-техническая техника и проблемы сельского хозяйства". Кемерово (Россия), 25 июня 2020 г., стр. 148-157. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210207207A1 (en) | Methods for next generation genome walking and related compositions and kits | |
| Nakayama et al. | Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis | |
| CN105647969B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| Yuan et al. | Effects of DGAT1 gene on meat and carcass fatness quality in Chinese commercial cattle | |
| CN107988268A (zh) | 一种基因敲除选育tcf25基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN107475412B (zh) | 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用 | |
| CN108048486A (zh) | 一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| US20220136041A1 (en) | Off-Target Single Nucleotide Variants Caused by Single-Base Editing and High-Specificity Off-Target-Free Single-Base Gene Editing Tool | |
| Lee et al. | Allele-specific quantitative PCR for accurate, rapid, and cost-effective genotyping | |
| CN109280666A (zh) | 一种基因敲除选育bai2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN109280709B (zh) | 一种与猪生长及繁殖性状相关的分子标记及应用 | |
| CN112195253A (zh) | 一种提高鸡肉脂肪酸c14:0含量的snp位点及其选育优质鸡品系的方法 | |
| CN113265471B (zh) | 一种检测绵羊fasn基因单核苷酸多态性的方法及其在肉质性状早期筛选中的应用 | |
| CN110894510A (zh) | 一种基因敲除选育Lgr6基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| CN110066805A (zh) | 基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| RU2810549C1 (ru) | гРНК для геномного редактирования восприимчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота аллелей 2 экзона гена BOLA-DRB3 | |
| CN109652457A (zh) | 一种基因敲除选育alpk2基因缺失型斑马鱼的方法 | |
| US20120264124A1 (en) | Microsatellite marker combination and method for identifying lanyu pig breed | |
| CN110894511A (zh) | 一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法 | |
| US20220056502A1 (en) | Compositions and methods of labeling mitochondrial nucleic acids and sequencing and analysis thereof | |
| CN112094923B (zh) | 一种与猪生长速度关联的sine转座子多态分子标记及其检测方法和应用 | |
| CN109295236B (zh) | 牛serpina3基因遗传标记辅助检测牛生长和胴体性状的方法及其应用 | |
| RU2741092C1 (ru) | Генетическая конструкция для получения устойчивых к вирусу лейкоза эмбрионов крупного рогатого скота | |
| CN111560420A (zh) | 一种abo基因单倍体分型方法及试剂 | |
| CN110438159A (zh) | 一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法 |