CN117210485A - 一种提高植物基因编辑效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高植物基因编辑效率的方法，包括，选择目标基因，使用CRISPR设计工具设计单指导RNA序列；根据单指导RNA序列构建CRISPR‑Cas9表达载体；利用植物转化方法进行植物转化和筛选；根据筛选结果进行分子分析和验证；根据编辑结果进行功能验证和优化改进。本发明能够更快速地实现基因编辑，节省时间和劳动力成本，够实现更精确的基因编辑，避免无意的突变或非特异性编辑，从而提高编辑的准确性和可重复性，并且通过提高植物的抗病性，有助于降低病原菌对农作物的影响，从而提高农作物的产量和品质。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，特别是一种提高植物基因编辑效率的方法。
背景技术
目前，传统的植物基因编辑方法通常涉及多个步骤，包括杂交、筛选和验证等，需要长时间来完成，传统方法中常常难以实现精确的基因编辑，它们会导致无意的突变或影响到目标基因周围的其他区域，可能受到目标植物物种的基因多样性和繁殖特性的限制，无法实现复杂的基因编辑，而且涉及的多个步骤和耗材导致成本较高，植物基因工程可以在非生物和/或生物胁迫条件下创造出具有更多优良性状的作物，最大限度地减少作物生产对环境的不利影响。CRISPR/Cas9系统是如今广泛应用的基因编辑工具，由于其操作简单、高效和通用性，目前在植物基因工程中的地位已经取代了上一代的锌指核酸酶基因编辑技术和转录激活因子样效应物核酸酶基因编辑技术。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有的提高植物基因编辑效率的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明所要解决的问题在于如何提供一种提高植物基因编辑效率的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明实施例提供了一种提高植物基因编辑效率的方法，其包括，选择目标基因，使用CRISPR设计工具设计单指导RNA序列；根据单指导RNA序列构建CRISPR-Cas9表达载体；利用植物转化方法进行植物转化和筛选；根据筛选结果进行分子分析和验证；根据编辑结果进行功能验证和优化改进。
作为本发明所述提高植物基因编辑效率的方法的一种优选方案，其中：所述目标基因为拟南芥的免疫基因PAD4，CRISPR设计工具为CHOPCHOP。
作为本发明所述提高植物基因编辑效率的方法的一种优选方案，其中：所述所述构建CRISPR-Cas9表达载体具体步骤如下：选择拟南芥的叶绿体，通过限制性内切酶切割和连接将Cas9基因插入叶绿体中，将单指导RNA序列插入Cas9蛋白质能够在叶绿体内进行正确的翻译和表达的位置。
作为本发明所述提高植物基因编辑效率的方法的一种优选方案，其中：所述利用植物转化方法进行植物转化和筛选具体包括，使用农杆菌介导法将构建好的CRISPR-Cas9载体导入拟南芥中，在培养基中添加抗性筛选剂，根据叶绿体中是否包含抗性标记基因进行筛选。
作为本发明所述提高植物基因编辑效率的方法的一种优选方案，其中：所述分子分析和验证具体包括，从转基因拟南芥中提取基因组DNA，设计引物扩增目标基因的特定区域，使用PCR检测编辑区域是否发生了变化，对PCR产物进行测序，确认是否发生了预期的编辑。
作为本发明所述提高植物基因编辑效率的方法的一种优选方案，其中：所述功能验证和优化改进具体包括，对编辑后的植株进行表型分析，检查编辑是否导致期望的生理和形态特征的变化，进行与野生型植物的杂交，以评估编辑的遗传传递性；根据初步结果，调整实验条件，考虑同时编辑多个基因以实现复杂特征的改良。
本发明有益效果为：本发明提供一种提高植物基因编辑效率的方法，能够更快速地实现基因编辑，节省时间和劳动力成本，够实现更精确的基因编辑，避免无意的突变或非特异性编辑，从而提高编辑的准确性和可重复性，并且通过提高植物的抗病性，有助于降低病原菌对农作物的影响，从而提高农作物的产量和品质，改善植物的抗病性以减少农业生产中对农药的需求，有助于降低环境污染、保护生态平衡，并降低生产成本，使农民在水、肥料和其他资源的使用方面更加高效，从而减少资源浪费。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为提高植物基因编辑效率的方法流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
实施例1
参照图1，为本发明第一个实施例，该实施例提供了一种低提高植物基因编辑效率的方法，包括：
S1：选择目标基因，使用CRISPR设计工具设计单指导RNA序列。
优选的，目标基因为拟南芥的免疫基因PAD4，CRISPR设计工具为CHOPCHOP。
进一步的，选择具有较高特异性的单指导RNA序列，以减少非特异性编辑的风险，选择单制动RNA序列与目标基因PAD4的靶向区域相匹配，并尽量避免与其他基因或重要序列的交叉，考虑单指导RNA序列的GC含量，适度的GC含量有助于提高稳定性和特异性。
S2：根据单指导RNA序列构建CRISPR-Cas9表达载体。
优选的，选择拟南芥的叶绿体，通过限制性内切酶切割和连接将Cas9基因插入叶绿体中，将单指导RNA序列插入Cas9蛋白质能够在叶绿体内进行正确的翻译和表达的位置。
进一步的，使用生物信息学工具，分析拟南芥叶绿体基因组，选择自身复制起始点和转录因子结合位点位置，避免影响叶绿体自身复制和转录，利用限制性内切酶在叶绿体基因组中创建切割位点，构建一个包含Cas9基因以及限制性内切酶切割位点，从拟南芥叶绿体中提取DNA，使用所选的限制性内切酶对叶绿体DNA进行切割，创建Cas9插入位点，将Cas9基因插入到构建好的载体中，确保Cas9基因在合适的方向和位置，使用DNA连接酶将构建好的Cas9插入载体连接到已经切割的叶绿体DNA上，将构建好的Cas9插入载体转化到拟南芥叶绿体中，筛选获得含有Cas9插入的转基因植株，使用生物信息学工具设计单指导RNA序列，确保其能够特异性地靶向到目标基因，将设计好的单指导RNA序列插入到适当的单指导RNA表达载体中，确保其在叶绿体中能够进行正确的转录和翻译，将包含单指导RNA序列的载体转化到已经含有Cas9插入的转基因拟南芥叶绿体中，对转基因植株进行筛选，确保单指导RNA能够在叶绿体内正确翻译和表达。使用PCR、测序等方法验证Cas9和单指导RNA的存在和表达。
S3：利用植物转化方法进行植物转化和筛选。
优选的，利使用农杆菌介导法将构建好的CRISPR-Cas9载体导入拟南芥中，在培养基中添加抗性筛选剂，根据叶绿体中是否包含抗性标记基因进行筛选。
进一步的，设计和构建含有Cas9基因和目标单指导RNA序列的CRISPR-Cas9表达载体，确保载体包含适当的启动子、终止子和选择标记基因，将构建好的CRISPR-Cas9载体转化到培养好的农杆菌中，使用农杆菌介导法，将CRISPR-Cas9载体导入拟南芥叶片、花序或离体胚胎，将转化后的拟南芥组织在含有适当抗性筛选剂的选择培养基上培养，抗性筛选剂的浓度应使得只有转化后包含抗性标记基因的组织能够存活和生长，在培养基上生长一段时间后，观察是否有转化后的植株存活并生长，提取DNA并使用PCR或其他分子生物学方法验证是否成功将Cas9和单指导RNA导入到植株基因组中，对筛选出的转基因植株进行进一步验证，确保Cas9和单指导RNA在叶绿体中能够正确翻译和表达。
S4：根据筛选结果进行分子分析和验证。
优选的，从转基因拟南芥中提取基因组DNA，设计引物扩增目标基因的特定区域，使用PCR检测编辑区域是否发生了变化，对PCR产物进行测序，确认是否发生了预期的编辑。
进一步的，从转基因拟南芥植株中提取基因组DNA，根据编辑目标，设计一对引物，以扩增目标基因特定区域，该区域应包含您预期编辑的位点，引物应选择在目标基因区域内的保守序列上，确保引物特异性，并避免与其他基因区域相互干扰，设置PCR反应体系，包括基因组DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和核苷酸，根据PCR引物设计和反应体系的特点，调整反应条件，进行PCR扩增反应，使目标基因特定区域在PCR产物中扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将PCR产物与DNA分子量标准一同加载到琼脂糖凝胶中，以检查是否成功扩增了目标区域，在UV灯下观察琼脂糖凝胶图像，检查是否有预期大小的PCR产物，如果在凝胶电泳中检测到目标PCR产物，可以使用商用基因片段纯化试剂盒等方法，纯化PCR产物，以去除杂质，将纯化的PCR产物发送至基因测序服务机构，进行Sanger测序，获取测序结果后，使用测序分析软件检查PCR产物的测序数据，验证编辑区域是否发生了预期的变化，对比测序结果与目标编辑序列，确认是否存在单点突变、插入或缺失等编辑变化，对编辑区域的测序数据进行进一步分析，确认编辑的类型和频率，如果编辑结果与预期不符，考虑克隆和测序多个独立的PCR产物，以确定编辑的一致性。
S5：根据编辑结果进行功能验证和优化改进。
优选的，对编辑后的植株进行表型分析，检查编辑是否导致期望的生理和形态特征的变化，进行与野生型植物的杂交，以评估编辑的遗传传递性；
进一步的，根据初步结果，改变单指导RNA浓度，以提高编辑效率。
进一步的，设定单指导RNA浓度为10ng/μL，设计和构建含有Cas9基因和目标单指导RNA序列的CRISPR-Cas9表达载体，确保载体包含适当的启动子、终止子和选择标记基因，将构建好的CRISPR-Cas9载体转化到培养好的农杆菌中，使用农杆菌介导法，将CRISPR-Cas9载体导入拟南芥叶片、花序或离体胚胎，将转化后的拟南芥组织在含有适当抗性筛选剂的选择培养基上培养，抗性筛选剂的浓度应使得只有转化后包含抗性标记基因的组织能够存活和生长，在培养基上生长一段时间后，观察是否有转化后的植株存活并生长，提取DNA并使用PCR或其他分子生物学方法验证是否成功将Cas9和单指导RNA导入到植株基因组中，对筛选出的转基因植株进行进一步验证，确保Cas9和单指导RNA在叶绿体中能够正确翻译和表达。
进一步的，设定单指导RNA浓度为30ng/μL，设计和构建含有Cas9基因和目标单指导RNA序列的CRISPR-Cas9表达载体，确保载体包含适当的启动子、终止子和选择标记基因，将构建好的CRISPR-Cas9载体转化到培养好的农杆菌中，使用农杆菌介导法，将CRISPR-Cas9载体导入拟南芥叶片、花序或离体胚胎，将转化后的拟南芥组织在含有适当抗性筛选剂的选择培养基上培养，抗性筛选剂的浓度应使得只有转化后包含抗性标记基因的组织能够存活和生长，在培养基上生长一段时间后，观察是否有转化后的植株存活并生长，提取DNA并使用PCR或其他分子生物学方法验证是否成功将Cas9和单指导RNA导入到植株基因组中，对筛选出的转基因植株进行进一步验证，确保Cas9和单指导RNA在叶绿体中能够正确翻译和表达。
进一步的，设定单指导RNA浓度为50ng/μL，设计和构建含有Cas9基因和目标单指导RNA序列的CRISPR-Cas9表达载体，确保载体包含适当的启动子、终止子和选择标记基因，将构建好的CRISPR-Cas9载体转化到培养好的农杆菌中，使用农杆菌介导法，将CRISPR-Cas9载体导入拟南芥叶片、花序或离体胚胎，将转化后的拟南芥组织在含有适当抗性筛选剂的选择培养基上培养，抗性筛选剂的浓度应使得只有转化后包含抗性标记基因的组织能够存活和生长，在培养基上生长一段时间后，观察是否有转化后的植株存活并生长，提取DNA并使用PCR或其他分子生物学方法验证是否成功将Cas9和单指导RNA导入到植株基因组中，对筛选出的转基因植株进行进一步验证，确保Cas9和单指导RNA在叶绿体中能够正确翻译和表达。
实施例2
表1本发明和传统方法植物抗病性对比
通过表1对比发现，设置相同的实验环境、控制相同的实验条件，本发明在不的植物上基因编辑效率都要比传统的方法高的多，在抗病性上本发明的效果显著，而传统方法效果差，说明本发明可以大大满足提交植物基因编辑效率的需求。
实施例3
表2本发明与传统方法优点对比
通过表2对比发现，本发明能够更快速地实现基因编辑，节省时间和劳动力成本，够实现更精确的基因编辑，避免无意的突变或非特异性编辑，从而提高编辑的准确性和可重复性，并且通过提高植物的抗病性，有助于降低病原菌对农作物的影响，从而提高农作物的产量和品质。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：包括，
选择目标基因，使用CRISPR设计工具设计单指导RNA序列；
根据单指导RNA序列构建CRISPR-Cas9表达载体；
利用植物转化方法进行植物转化和筛选；
根据筛选结果进行分子分析和验证；
根据编辑结果进行功能验证和优化改进。
2.如权利要求1所述的提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：所述目标基因为拟南芥的免疫基因PAD4，CRISPR设计工具为CHOPCHOP。
3.如权利要求1所述的提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：所述构建CRISPR-Cas9表达载体具体步骤如下：
选择拟南芥的叶绿体，通过限制性内切酶切割和连接将Cas9基因插入叶绿体中，将单指导RNA序列插入Cas9蛋白质能够在叶绿体内进行正确的翻译和表达的位置。
4.如权利要求1所述的提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：所述利用植物转化方法进行植物转化和筛选具体包括，
使用农杆菌介导法将构建好的CRISPR-Cas9载体导入拟南芥中，在培养基中添加抗性筛选剂，根据叶绿体中是否包含抗性标记基因进行筛选。
5.如权利要求1所述的提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：所述分子分析和验证具体包括，
从转基因拟南芥中提取基因组DNA，设计引物扩增目标基因的特定区域，使用PCR检测编辑区域是否发生了变化，对PCR产物进行测序，确认是否发生了预期的编辑。
6.如权利要求1所述的提高植物基因编辑效率的方法，其特征在于：所述功能验证和优化改进具体包括，
对编辑后的植株进行表型分析，检查编辑是否导致期望的生理和形态特征的变化，进行与野生型植物的杂交，以评估编辑的遗传传递性；
根据初步结果，调整实验条件，考虑同时编辑多个基因以实现复杂特征的改良。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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