CN116121261B - 一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法。该方法是利用基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18‑6A、BnPUB18‑5C、BnPUB19‑1A或BnPUB19‑1C基因中的至少一种；BnPUB18‑6A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；BnPUB18‑5C的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；BnPUB19‑1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；BnPUB19‑1C的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。通过本发明提供的方法获得的基因编辑后代，与野生型相比，能够显著提高油菜的抗旱性，本发明为快速创制农作物抗旱种质资源开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法。
背景技术
油菜作为一种重要的油用经济作物，是排名仅次于水稻、小麦、玉米、大豆的第五大作物，然而油菜在种植过程中容易遭受干旱、低温、盐、水渍、高温等非生物胁迫和虫害、病害等生物胁迫，不仅使油菜的生长发育遭受很大的威胁，而且严重影响油菜的产量和品质。同时，随着全球气候的变暖，越来越多的极端环境也极大的威胁着的油菜生产以及产业发展，因此，解析油菜的抗逆机理，深度挖掘抗逆关键基因，利用生物技术新手段快速创制抗逆的油菜种质对我国油料作物产业的健康发展具有重要意义。
传统的育种已经发展到了平台期，需要新的技术打破传统的育种周期和提高育种质量。基因编辑技术作为生命科学领域的新技术，已在多个领域被广泛应用，在农业领域，基因编辑技术有助于靶向敲除目的基因，实现目标基因的精准编辑，从而快速、精准改良作物的某一不良缺陷性状，缩短作物的育种进程。
植物为了应对干旱胁迫，从分子以及生理水平上进化出一系列调控机制来抵抗逆境，常见的机制有抗旱性、耐旱性以及避旱性。对油菜耐旱性分子机理及其产量的研究有助于更好的了解其抗旱机制，一方面可以通过分子标记筛选抗旱性更强、产量更高的品系，另一方面也可以通过转基因技术获取耐旱性更强、产量更高的株系用于农业生产，从而提高油菜的产量。
发明内容
本发明为了提高油菜的耐旱性，提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18-6A、BnPUB18-5C、BnPUB19-1A或BnPUB19-1C基因中的至少一种；
其中，所述BnPUB18-6A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述BnPUB18-5C的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述BnPUB19-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述BnPUB19-1C的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明第二方面，提供一种所述BnPUB18-6A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
本发明第三方面，提供一种所述BnPUB18-5C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
本发明第四方面，提供一种所述BnPUB19-1A基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
本发明第五方面，提供一种所述BnPUB19-1C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途。
本发明第六方面，提供一种耐旱性改良的甘蓝型油菜的培育方法，包括以下步骤：
S1、sgRNA靶位点选择：根据序列特点分别找到BnPUB18-6A和BnPUB18-5C的共有序列及BnPUB19-1A和BnPUB19-1C的共有序列，设计sgRNA序列；
S2、引物合成：利用S1中sgRNA合成引物；
S3、构建CRISPR/Cas9载体：以pCBC-DT1T2质粒为模板，用所述引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后，用Bsa I分别酶切pHSE401载体和纯化后的扩增产物，用T4连接酶连接纯化后的酶切产物，转化至大肠杆菌感受态，得到包含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9表达载体；
S3、获得耐旱性改良植株：将所述CRISPR/Cas9表达载体转化至甘蓝型油菜，获得耐旱性改良的甘蓝型油菜植株。
优选地，sgRNA序列有两个，第一个sgRNA位于BnPUB18-5C和BnPUB18-6A外显子的共有序列上，第二个sgRNA位于BnPUB19-1A和BnPUB19-1C外显子的共有序列上。
优选地，第一个sgRNA的序列为5’-TGCAAATCAATCTCCGTAAC-3’，第二个sgRNA的序列为5’-CCGGGTCGGGTTAATACCAG-3’。
优选地，所述引物为BnPUB18-T1-BsF、BnPUB18-T1F、BnPUB19-T2-BsR及BnPUB19-T2R；
所述BnPUB18-T1-BsF的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述BnPUB18-T1F的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述BnPUB19-T2-BsR的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述BnPUB19-T2R的序列如SEQ ID NO.8所示。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明利用CRISPR/Cas9技术对BnPUB18/BnPUB19基因进行编辑，通过农杆菌介导法将携带BnPUB18/BnPUB19的基因编辑载体转入到油菜受体材料K407中，对靶向基因BnPUB18/BnPUB19进行了精准编辑，获得了大量的基因编辑植株，通过对后代株系检测，获得了4个基因BnPUB18-5C、BnPUB18-6A、BnPUB19-1A和BnPUB19-1C均被编辑的植株GE3和GE5。
2、本发明对基因编辑突变体植株GE3和GE5进行自然干旱法处理，基因编辑株系在自然干旱21天后表现出极强的耐旱性，与基因编辑株系相比，野生型株系表现为叶片萎蔫、干枯、脱水皱缩等现象，复水后植株存活率仅为30％，而基因编辑突变体植株尽管干旱处理后虽然叶片萎蔫，但不严重，经复水后，植株存活率75％和68％，显著高于对照，且植株很快恢复了正常生长状态。
3、本发明对基因编辑突变体植株GE3和GE5进行自然干旱法处理，通过对干旱过程中植株的电导率、MDA含量、T-AOC活性三个生理指标进行检测发现，GE3和GE5基因编辑株系的电导率和MDA含量显著低于对照，而T-AOC活性显著高于对照，呈现出强的抗旱特性。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9敲除BnPUB18和BnPUB19的靶位点设计和基因结构示意图；
图2为验证编辑株系的编辑位点检测测序峰图；
图3为干旱处理基因编辑株系和对照的表型图；A为处理前正常生长的植株表型图，B为干旱处理后的植株表型图，C为复水后的表型图，从左往右依次是K407(对照)、GE3、GE5株系；
图4为经干旱处理的基因编辑株系和对照植株复水7天后的存活率；
图5是基因编辑株系和对照植株干旱过程中植株的电导率；
图6是基因编辑株系和对照植株干旱过程中植株的MDA含量及T-AOC活性；A、MDA含量，B、T-AOC活性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明根据BnPUB18和BnPUB19的序列特点，分别找到共有序列，然后设计sgRNA序列，其中一个sgRNA序列设计在BnPUB18基因上，一个设计在BnPUB19基因上，构建包含双靶点的CRISPR/Cas9载体，最终通过靶向敲除BnPUB18和BnPUB19提高油菜耐旱性，该方法不仅丰富了抗旱油菜的种质资源，而且为研究BnPUB18和BnPUB19的基因功能和抗旱分子设计育种提供了理论基础。
实施例1
含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9表达载体的构建及BnPUB18和BnPUB19敲除株系的获得
1、含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9表达载体的构建
在甘蓝型油菜“中双11号”基因组中，BnPUB18和BnPUB19各有两个拷贝，分别命名为BnPUB18-6A、BnPUB18-5C、BnPUB19-1A、BnPUB19-1C，利用DNAman分别比对BnPUB18的两个拷贝之间及BnPUB19两个拷贝之间的同源性，利用CRISPR RGEN tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/？tdsourcetag＝s_pcqq_aiomsg)在BnPUB18两个拷贝外显子的共有序列处设计第一个sgRNA序列为5’-TGCAAATCAATCTCCGTAAC-3’(如SEQ IDNO.15所示)，在BnPUB19两个拷贝外显子的共有序列处设计第二个合适的sgRNA，为5’-CCGGGTCGGGTTAATACCAG-3’(如SEQ ID NO.16所示)，见图1。由杨凌天润奥科生物科技有限公司分别合成接头引物用于构建CRISPR/Cas9载体，引物序列见表1。
表1接头引物序列
| SEQ ID NO.5 | BnPUB18-T1-BsF | ATATATGGTCTCTATTGGTTACGGAGATTGATTTGCAGTT |
| SEQ ID NO.6 | BnPUB18-T1F | GGTTACGGAGATTGATTTGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC |
| SEQ ID NO.7 | BnPUB19-T2-BsR | ATTATTGGTCTCTAAACCTGGTATTAACCCGACCCGGCAA |
| SEQ ID NO.8 | BnPUB19-T2R | CCTGGTATTAACCCGACCCGGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC |
以稀释20倍的pCBC-DT1T2质粒为模板，使用高保真酶进行四接头引物(表1)PCR扩增，得到的PCR片段进行琼脂糖电泳后切胶纯化，回收PCR产物，然后用Bsa I分别酶切PCR产物和pHSE401载体，再用T4连接酶连接纯化后的酶切产物，得到连接产物，酶切-连接体系如表2～4所示。
表2酶切PCR产物反应体系
表3酶切pHSE401质粒反应体系
表4连接反应体系
| 反应物 | 体积 |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| T4 DNA Ligase Buffer | 2μL |
| pHSE401质粒片段 | 1.5μL |
| PCR片段 | 3.5μL |
| 加ddH2O补齐至 | 20μL |
将上述连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板进行筛选(含卡那霉素在LB培养基中的浓度为50ug/mL)，将阳性菌落送至杨凌天润奥科生物科技有限公司测序验证。将测序正确的单克隆接种于50mL LB中大摇后提取质粒，为构建成功的包含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9载体，质粒保存于-80℃冰箱备用。
2、遗传转化
吸取2μL质粒用电转法转入农杆菌感受态细胞GV3101中，28℃倒置固体培养2天后，挑取PCR检测的3个阳性克隆分别转接到同时含有壮观霉素、利福平和卡那霉素三种抗生素的LB液体培养基(LB液体培养基中壮观霉素、利福平及卡那霉素的浓度均为50ug/mL)中，放置于28℃、220rpm摇床振荡培养2天，离心，收集菌液，用于接下来的遗传转化。
将CRISPR/Cas9表达载体通过农杆菌介导法转入油菜下胚轴。通过潮霉素抗性筛选，获得甘蓝型油菜阳性植株。
实施例2
阳性油菜植株DNA的提取与阳性植株检测
取0.1g阳性植株的幼嫩叶片用CTAB法提取DNA，以稀释后的DNA为模板，以靶序列的侧翼序列设计引物(表5)，利用高保真酶进行PCR扩增，反应体系如表6所示，扩增程序如表7所示，PCR产物纯化后送样测序；同时将PCR产物构建至TA克隆载体，转化后用阳性单菌落再次测序，分析测序结果，验证阳性植株GE3和GE5的BnPUB18和BnPUB19的编辑事件(表5中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11用于验证BnPUB18-6A，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10用于鉴定BnPUB18-5C，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13用于验证BnPUB19-1A，SEQ ID NO.12和SEQID NO.14用于验证BnPUB19-1C)。
表5鉴定引物列表
| SEQ ID NO.9 | BnPUB18AC-yz-F | GTTGACACACTTGCCAACTGA |
| SEQ ID NO.10 | BnPUB18C-yz-R | CGAACAGAGCAAGGACTCC |
| SEQ ID NO.11 | BnPUB18A-yz-R | CGAGAAGGCGGTTGAGTG |
| SEQ ID NO.12 | BnPUB19AC-yz-F | CTGCATATCACGTGGCAGAT |
| SEQ ID NO.13 | BnPUB19A-yz-R | GTTGGTATACATAATAACCCTCTG |
| SEQ ID NO.14 | BnPUB19C-yz-R | GAATCGTCGGATCTCCAGGA |
表6高保真酶扩增转基因株系DNA反应体系
| 试剂 | 使用量 |
| PrimeSTAR Max Premix(2X) | 10μL |
| F引物 | 1μL |
| R引物 | 1μL |
| DNA | 1μL |
| ddH2O | 7μL |
表7 PCR扩增程序
测序结果表明，GE3和GE5的所有BnPUB18和BnPUB19基因(包括BnPUB18-5C、BnPUB18-6A、BnPUB19-1A和BnPUB19-1C)都被敲除，编辑类型如图2所示。
实施例3
靶向敲除BnPUB18和BnPUB19基因，获得了耐旱性甘蓝型油菜新种质
为了验证BnPUB18和BnPUB19敲除株系是否提高了油菜的耐旱性，我们分别取长势一致的幼苗对其进行了干旱处理。
结果发现，对照K407(基因编辑受体材料)自然干旱21天，植株严重失水，叶片严重萎蔫，经复水7天后存活率仅为30％(图3)，且存活植株恢复生长缓慢；而两个GE3和GE5基因编辑株系自然干旱21天，失水较轻，复水7天后存活率分别为75％和68.3％(图4)，显著高于对照，且恢复植株很快恢复了正常生长状态。
此外，通过对其干旱过程中植株的电导率、MDA含量、T-AOC活性三个生理指标进行检测发现(图5～6)，GE3和GE5基因编辑株系的电导率和MDA含量显著低于对照K407，而T-AOC活性显著高于对照K407，呈现出强的抗旱特性。
以上表明，基因编辑BnPUB18和BnPUB19可提高油菜的耐旱性，通过基因编辑手段，靶向敲除BnPUB18和BnPUB19，可快速获得相对耐旱的甘蓝型油菜，不仅丰富油菜的种质资源，加快耐旱油菜的育种，也为进一步研究BnPUB18和BnPUB19的分子机制奠定了基础。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种提高甘蓝型油菜耐旱性的方法，其特征在于，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除甘蓝型油菜BnPUB18-6A、BnPUB18-5C、BnPUB19-1A和BnPUB19-1C基因；
其中，所述BnPUB18-6A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述BnPUB18-5C的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述BnPUB19-1A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述BnPUB19-1C的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种权利要求1所述BnPUB18-6A基因、所述BnPUB18-5C、所述BnPUB19-1A基因及所述BnPUB19-1C基因在耐旱甘蓝型油菜选育中的用途，其特征在于，耐旱甘蓝型油菜选育是通过敲除甘蓝型油菜BnPUB18-6A、BnPUB18-5C、BnPUB19-1A和BnPUB19-1C基因来实现。
3.一种耐旱性改良的甘蓝型油菜的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、sgRNA靶位点选择：根据序列特点分别找到权利要求1中BnPUB18-6A和BnPUB18-5C的共有序列及BnPUB19-1A和BnPUB19-1C的共有序列，设计sgRNA序列；
S2、引物合成：利用S1中sgRNA合成引物；
S3、构建CRISPR/Cas9载体：以pCBC-DT1T2质粒为模板，用所述引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后，用Bsa I分别酶切pHSE401载体和扩增产物，用T4连接酶连接纯化后的酶切产物，转化至大肠杆菌感受态，得到包含BnPUB18和BnPUB19双靶点的CRISPR/Cas9表达载体；
S4、获得耐旱性改良植株：将所述CRISPR/Cas9表达载体转化至甘蓝型油菜，获得耐旱性改良的甘蓝型油菜植株。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，sgRNA序列有两个，第一个sgRNA位于BnPUB18-5C和BnPUB18-6A外显子的共有序列上，第二个sgRNA位于BnPUB19-1A和BnPUB19- 1C外显子的共有序列上。
5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，第一个sgRNA的序列为5’-TGCAAATCAATCTCCGTAAC-3’，第二个sgRNA的序列为5’- CCGGGTCGGGTTAATACCAG-3’。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述引物为BnPUB18-T1-BsF、BnPUB18-T1F、BnPUB19-T2-BsR及BnPUB19-T2R；
所述BnPUB18-T1-BsF的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述BnPUB18-T1F的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述BnPUB19-T2-BsR的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述BnPUB19-T2R的序列如SEQ ID NO.8所示。
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