CN110878302A - 利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法和应用 - Google Patents

利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法及应用，设计了特异性靶向甘蓝型油菜Bna.TT8基因的sgRNA并制成Oligo二聚体，与Cas9载体连接，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，剪切目标序列，每条sgRNA都能通过CRISPRcas9系统介导A和C基因组上Bna.TT8基因的剪切，达到基因敲除的目的。经过表型鉴定，发现纯合突变株系的抗旱性显著增强，同时含油量也明显提高，为油菜性状改良提供了新方法。

Description

利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两种特异性靶向甘蓝型油菜Bna.TT8基因的sgRNA以及利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，可用于培育抗旱、高油的油菜品种。
背景技术
油菜是我国重要的油料作物，现在全国种植面积达1亿亩，长江流域是我国油菜的主产区。在三大栽培种中，甘蓝型油菜(Brassica napusL.)是产量最高，种植最广泛的油菜品种。目前我国油菜产业发展战略是以消费者需求和产业发展需求为导向，以高产、高油、多抗、双低油菜的全部产业链开发为主线，以理论、技术和产品创新促进油菜的多元发展。因此，提高抗逆性和含油量是油菜育种的重要目标。传统的杂交育种是提高我国油菜产量和品质的重要育种途径，但是杂交育种也存在着很多制约因素，比如制种效率不高，劳动强度大，育种耗时长，遗传背景复杂以及易受环境影响等问题。而利用新的基因工程技术如CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术则可以创建无转基因成分的可用于油菜性状改良的新的油菜种质资源，为解决这些问题提供更多的选择。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌应对外源病毒入侵的防御系统，现在已广泛用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、植物如油菜、水稻、拟南芥等的基因改造。它由sgRNA和Cas9核酸酶两种元件组成，特殊设计的引导序列sgRNA可以通过碱基互补配对来识别基因组中相对应的序列，从而来引导Cas9核酸酶对其DNA双链进行切割，造成双链断裂(DSB)，当DNA双链通过同源重组(HR)或非同源重组(NHEJ)进行DNA修复，在修复的过程中会导致DNA序列的定点突变。虽然通过CRISPR/Cas9技术可以对基因进行编辑以改良农作物，但如在油菜这种异源多倍体作物中，基因在A基因组和C基因组中都有拷贝。只有这些同源拷贝一起突变，才能获得基因敲除突变体。在同源保守区域设计sgRNA并且在同一区域设计两个sgRNA，不仅可以提高编辑效率，还可以降低脱靶效应。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法及其应用，通过设计Oligo DNA序列和CRISPR/Cas9载体，能够快速构建Bna.TT8基因敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化，筛选获得的Bna.TT8基因敲除的突变株可用于油菜性状改良。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)根据Bna.TT8基因两个拷贝的保守区域设计了两个sgRNA的DNA序列，两个sgRNA分别位于Bna.TT8基因外显子以及其中的bHLH保守结构域，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；
(2)根据sgRNA序列和CRISPR/Cas9载体要求，设计合成两对单链Oligo DNA序列，其序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
(3)将两对单链Oligo DNA退火形成双链，制成Oligo二聚体；
(4)将制备好的Oligo二聚体与CRISPR/Cas9载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，获得植物表达载体；
(5)使用农杆菌介导的方式将表达载体转化到甘蓝型油菜(Westar)中，在转基因后代中筛选Bna.TT8蛋白功能缺失突变的植株；
分别用于检测Bna.TT8基因在A和C染色体组上的两个拷贝的突变方式：A染色体拷贝的鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，C染色体拷贝的鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
采用上述方法在甘蓝型油菜中特异性敲除Bna.TT8基因，获得Bna.TT8蛋白功能缺失突变的植株，在此基础上进一步筛选无筛选标记的单株，经表型鉴定与性状考察表明不含转基因成分的基因敲除纯合株系Bna.TT8-sgRNA比野生型更加耐旱，干旱处理后存活率比野生型高，失水也比野生型慢；另外，我们还发现Bna.TT8-sgRNA突变转化株的含油量，尤其是亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)的摩尔百分比显著增加。该方法可用于油菜抗旱性和含油量的性状改良。
附图说明
图1：Bna.TT8-sgRNA1靶标位点。
图2：Bna.TT8-sgRNA2靶标位点。
图3：CRISPR/Cas9载体pREGB32示意图。
图4：转化植株T1代突变单株A09-sgRNA1位点核苷酸。
图5：T1代突变单株A09-sgRNA1位点测序峰图。
图6：T1代突变单株C09-sgRNA1位点核苷酸序列。
图7：T1代突变单株C09-sgRNA1位点测序峰图。
图8：T1代突变单株A09-sgRNA2位点核苷酸序列。
图9：T1代突变单株A09-sgRNA2位点测序峰图。
图10：T1代突变单株C09-sgRNA2位点核苷酸序列。
图11：T1代突变单株C09-sgRNA2位点测序峰图。
图12：T2代无转基因成分纯合突变Bna.TT8-sgRNA转化株系抗旱性结果，A为突变体株系经干旱处理后的表型，B为干旱处理后的存活率，C为叶片离体的失水率。
图13：无转基因成分纯合突变Bna.TT8-sgRNA转化株系的含油量分析结果，A为转化株系种子颜色，B为转化株系的含油量，C为转化株系脂肪酸摩尔质量。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细说明，但不用来限制本发明范围。在不背离本发明构思的前提下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明保护范围。
下述实验例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明均为现有技术中常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实验例中所涉及试验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规试验方法、检测方法等。
实验例1：甘蓝型油菜Bna.TT8基因CRISPR/Cas9的sgRNA设计与农杆菌转化载体构建
1.sgRNA序列确定
甘蓝型油菜为四倍体作物，具有A和C两套基因组，Bna.TT8基因在这两套基因组中各有一个拷贝。将这两个拷贝进行序列比对，在保守区域寻找PAM(proto adjacent motif)基序(NGG)，在PAM位置5’端20bp的一段序列即为sgRNA序列。本发明设计了两条sgRNA，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，靶标位点如图1、2所示
2.Oligo DNA单链的合成
本发明的两对Oligo DNA单链序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，交由武汉擎科生物科技有限公司合成。
3.制备Oligo二聚体
将合成的Oligo DNA加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，使用PCR仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒的速度缓慢降至20℃。
Figure BDA0002292247020000041
4.将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas9载体pREGB32
Oilgo二聚体按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时。
Figure BDA0002292247020000042
5.转化大肠杆菌
(1)将反应体系取5μl反应液加到100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；
(2)冰浴静置30分钟，期间避免晃动，严格保持静置；
(3)轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；
(4)加入600μl LB液体培养基，37℃200rpm复苏培养1小时；
(5)取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
6.阳性克隆鉴定与质粒提取
挑取反应长出来的单克隆，接种于LB液体+Kan的培养基，37℃，200rpm培养过夜后，取一半送至武汉擎科生物技术有限公司，使用引物Cas9-F：5’-ACGAGCGCCATCCGATC-3’进行测序鉴定。将测序鉴定正确的菌液提取质粒，获得目标载体。
实验例2：目标载体转化农杆菌GV3101
将5μl目标载体DNA加入到100μl的GV3101农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴5分钟，液氮冷冻1分钟后，37℃水浴5分钟，加入700μl液体LB培养基，28℃，200rpm摇床复苏培养4小时。培养结束后，取适量菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体平皿上；28℃培养2天，挑取单克隆，接种于含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基，28℃200rpm培养过夜，然后用Cas9-F引物和相应后引物进行PCR鉴定。
鉴定正确的农杆菌菌液与50％甘油混合，-80℃保存。
实验例3：农杆菌转化甘蓝型油菜下胚轴
1.外植体准备
以甘蓝型春油菜Westar(实验室收集的春油菜品系)种子为材料进行种子表面消毒
(1)将种子加入到洁净的50ml离心管中，用75％酒精浸泡种子5分钟；
(2)倒掉酒精，加入10ml 1.5％升汞，浸泡种子15分钟，期间隔几分钟摇动使液体与种子充分接触；
(3)倒掉升汞，用灭菌单蒸水清洗种子4次左右；
(4)用移液枪将剩余的水吸干，用事先灼烧灭菌的镊子将种子摆入M0培养基中，每瓶50粒种子，每个转化各设6瓶种子；
(5)暗培养，24℃，5-6天。
2.农杆菌侵染及共培养
(1)将-80℃保存的农杆菌菌液取10μl，加入到1ml含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养进行活化；
(2)将暗培养好的苗子取出，放在灭菌的大皿中，用灼烧灭菌好的手术刀切取下胚轴，每段长0.8厘米左右，切时在大皿中倒入少量DM培养基保湿；
(3)将活化好的菌液接到20ml含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃200rpm培养至OD600值到0.4-0.8；用离心机2000rpm收集菌体，然后加入20ml含有100μM AS的DM培养基，重悬，28℃摇床摇30分钟；
(4)将DM培养基培养了30分钟后的农杆菌菌液加入到切好的下胚轴中，侵染30分钟，期间每隔五分钟左右摇动一次；
(5)将外植体转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，铺开，用小滤纸将菌液吸干；
(6)将外植体转到M1培养基中，24℃暗培养两天。
3.筛选及分化
将共培养两天的外植体转入含有5mg/L潮霉素的M2培养基，光照培养3周左右，此时可以看到外植体染色变深，并开始膨胀变成愈伤组织，之后将外植体转入含有8mg/L潮霉素的M3培养基，光照培养箱培养，光照长度16h/d，每两周继代一次以保证营养充分，至能看到分化出小苗子。
4.生根
将长出小苗子的愈伤转入已灭菌的空皿中，用镊子和手术刀将苗子从愈伤上切下，转入M4培养基光照培养箱，光照长度16h/d。
5.驯化移栽
将生根良好的瓶苗打开封口，拿出光照培养箱，置于温室中3-4天，之后移栽到基质中，并套上干净塑料膜保持湿度。3天后逐渐开孔防风，使植株适应外界环境。
本实验用到的培养基配方如下所示：
M0：MS 2.2g/L+琼脂粉7.5g/L，pH＝6.0
DM：MS 4.4g/L+蔗糖30g/L，使用前加入100μM AS，pH＝6.0
M1：MS 4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-D 1mg/L+KT 0.3mg/L+琼脂粉7g/L，使用前加入100μM AS，pH＝6.0
M2：MS 4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-D 1mg/L+KT 0.3mg/L+琼脂粉7g/L，使用时加入潮霉素至5mg/L、TMT至300mg/L、1.5/1000体积的STS，pH＝6.0
M3：MS 4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES 0.6g/L+琼脂粉7g/L，使用时加入潮霉素至5mg/L、TMT至300mg/L、Zeatin至2mg/L，pH＝6.0
M4：B5 3.21g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，pH＝6.0。
实验例4：转基因植株突变检测
1.转化植株筛选与检测
利用CTAB法提取获得的具有潮霉素抗性的转基因T0代植株基因组DNA，编号后PCR扩增检测转化植株，所用引物为：Hyg-F：5’-ACTCACCGCGACGTCTG-3’，Hyg-R：5’-CGATTGCGTCGCATCGAG-3’，检测T0代转化植株是否含有潮霉素筛选标记。
2.Bna.TT8-sgRNA转化株系突变检测
由于Bna.TT8基因的两个拷贝分别在A亚基因组第九染色体和C亚基因组第九染色体上，因此设计两对引物(如SEQ ID NO.7、8和SEQ ID NO.9、10所示)，从具有潮霉素抗性和有潮霉素筛选标记的T0代Bna.TT8-sgRNA转化植株基因组DNA扩增BnaA09.TT8和BnaC09.TT8靶位点附近的基因片段，PCR产物回收后连接T载体，送出测序转化植株Bna.TT8基因两拷贝的序列。测序结果显示L14、L17、L21、L18、L24、L30转化植株中在A09和C09染色体的两个Bna.TT8基因同源拷贝的靶位点均有插入或者缺失突变，导致蛋白质序列提前终止，其A09、C09位点核苷酸序列图4、图6、图8、图10所示，测序峰图如图5、图7、图9、图11所示。其中L14、L17、L21株系中BnaA09.TT8还保留的部分蛋白保守区域，L18、L24、L30株系为基因敲除突变体。
实验例5：T2代无转基因成分株系筛选与无转基因成分植株表型观察、性状统计
将Bna.TT8-sgRNA株系(L14、L17、L21、L18、L24、L30)T1代纯合突变株系收种后，继续播种种植T2代。利用潮霉素筛选标记鉴定引物Hyg-F：5’-ACTCACCGCGACGTCTG3’，Hyg-R：5’-CGATTGCGTCGCATCGAG-3’，和Cas9基因鉴定引物Cas9-F：5’-ACGAGCGCCATCCGATC-3’，Cas9-R：5’-GTTCACCCTGAGGATGTCGCT-3’，对T2代纯合突变株系单株进行潮霉素筛选标记和Cas9基因鉴定，用于筛选没有转基因成分的纯合突变单株。
通过研究Bna.TT8-sgRNA基因敲除突变体对于干旱胁迫的反应，如图12，我们发现在干旱胁迫条件下，基因敲除突变体Bna.TT8-sgRNA-L18(T2代)的抗旱性比对照Westar的抗旱性更强，存活率提高了53.3±9.42％，Bna.TT8-sgRNA-L18突变体的失水也更慢，说明Bna.TT8基因功能缺失提高了甘蓝型油菜的抗旱性。另外，我们还对T2代Bna.TT8-sgRNA株系(L14、L17、L21、L18、L24、L30)进行了品质性状分析。如图13，突变转化株Bna.TT8-sgRNA的含油量升高了5.27±0.68％，其中的亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)的摩尔百分比显著增加，说明Bna.TT8基因的突变使甘蓝型油菜的含油量、亚油酸和亚麻酸的含量升高。这些结果显示本发明通过利用CRISPR/Cas9系统定点敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因获得功能缺失突变株，具有更强的抗旱性和更高的含油量，该方法可用于油菜性状改良。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggacatgatg aatctaatgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggtctcct tgtgaccaag agttttagag ctagaa 36
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcaaccct tcgcagtcat atgat 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtagcgcgga tcggacctag tata 24
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcattcccg tgcttgat 18
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggatgcgg agcaacc 17

Claims (5)

1.特异性靶向甘蓝型油菜Bna.TT8基因的sgRNA，其特征在于，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。
2.利用CRISPR-Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，包括如下步骤：
(1)以权利要求1所述的sgRNA为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火
形成双链，制成Oligo二聚体；
(2)将Oligo二聚体与Cas9载体连接，获得一个植物表达载体；
(3)通过农杆菌介导的方式将这个植物表达载体转化甘蓝型油菜，在转基因后代中筛选A09染色体和C09染色体上均发生突变的Bna.TT8蛋白功能缺失突变体植株。
3.根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，其特征在于，根据sgRNA-1设计的寡核苷酸序列如SEQ ID NO .3、4所示，根据sgRNA-2设计的寡核苷酸序列如SEQ ID NO .5、6所示。
4.根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，其特征在于，步骤(3)中用于检测A染色体中Bna.TT8基因突变的引物序列如SEQ IDNO.7、8所示，检测C染色体中Bna.TT8基因突变的引物序列如SEQ ID NO .9、10所示。
5.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的方法在改良油菜性状中的应用，其特征在于，包括提高抗旱性和含油量。
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