CN116445536A - 小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1基因编辑载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1基因编辑载体及其应用，属于作物分子生物学领域，本发明设计引物从扬麦18幼穗cDNA中克隆TaROS1的编码区序列，TaROS1基因编码区序列在A、B、D同源染色体中的序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明使用CRISPR/Cas9载体构建包含TaROS1两个靶位点的基因编辑载体并转化扬麦18，通过敲除TaROS1基因，降低TaROS1基因的表达的水平，从而获得小麦籽粒糊粉层细胞增厚的小麦新种质。本发明利用基因工程技术改良小麦，对提高小麦营养品质具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于作物分子生物学领域，涉及小麦TaROS1基因的克隆、基因编辑CRISPR/Cas9-TaROS1载体构建及其TaROS1基因在调控小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用。
背景技术
小麦糊粉层亦称外胚乳，是小麦籽粒种皮最内层细胞，位于小麦籽粒种皮和胚乳之间。小麦糊粉层为单细胞层结构，只占麦粒总质量的7％～9％，但其营养成分含量却占小麦总营养的60％～70％，高营养价值的生理活性成分(膳食纤维、矿物质、有益脂类、维生素、酚酸类和木酚素等)均集中在糊粉层中。因此，小麦糊粉层极富高营养价值的生理活性成分，被称为小麦中的软黄金。小麦糊粉层丰富的营养构成使其成为极具潜力的新型食品及原料，应用前景十分广泛。作为主食，我国年消耗小麦约1亿吨左右用于生产面粉，大约年产麸皮近3千万吨，如果把麸皮中的糊粉层提取分离出30％用于食用，每年可增加粮食近千万吨。同时糊粉层制品添加到面粉中，以改善面粉营养结构，可提高粮食的利用率和营养品质。目前，小麦糊粉层分离技术已经成熟，并产业化。因此，创制糊粉层增厚的小麦新种质对提高小麦营养和和经济价值具有突破性意义。培育糊粉层增厚的小麦品种可进一步提升小麦糊粉层市场前景和产品盈利空间，实现小麦生产的提质增效。
禾谷类作物糊粉层是由胚乳表层细胞停止分裂后转化成而来，约占胚乳部分的5％～10％。除大麦含有3细胞层及水稻小部分区域为可变糊粉层外，禾谷类作物糊粉层主要为单细胞层结构。目前为止，小麦中ROS1基因的研究很少，尤其是ROS1在小麦中的功能研究和生产应用。因此，有必要在小麦中敲除ROS1，深入研究ROS1在小麦籽粒糊粉层发育中的作用，创制糊粉层细胞增厚的小麦新材料，为小麦高营养品质育种提供基因资源。
发明内容
本发明目的是提供小麦TaROS1基因及其应用。
在六倍体小麦扬麦18幼穗的cDNA中扩增TaROS1基因，得到在A、B、D同源染色体上的基因序列，分别如SEQ ID NO.1-3所示，该基因命名为TaROS1，该基因定位于第5染色体同源群上。
具体地，本发明所述的小麦TaROS1基因位于小麦第5同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。分别命名为TaROS1-5A、TaROS1-5B和TaROS1-5D。其对应的中国春基因组序列(RefSeq v1.1)全长分别为12423、13427和12210个碱基，3个基因均由18个外显子和17个内含子组成。根据这些基因信息，我们利用同源克隆的方法，在扬麦18幼穗的cDNA中克隆获得TaROS1-5A、TaROS1-5B和TaROS1-5D基因。3个基因分别含5928、5949和5946个碱基的开放阅读框，分别编码1975、1982和1981个氨基酸残基的多肽链。这三个部分同源基因之间，除了第一个外显子外，其他的外显子相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaROS1基因提供了理论依据。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平ROS1基因的沉默。
本发明提供了小麦TaROS1基因在植物种质资源改良中的应用。
所述植物包括但不限于小麦。
本发明提供了用于克隆小麦TaROS1基因的引物组合ROS1-F和ROS1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。
相应地，本发明提供了小麦TaROS1基因的克隆方法，利用SEQ ID NO.8-9所示的特异性引物组合，以小麦穗子cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaROS1基因。
本发明提供了一种提高小麦种子中糊粉层细胞数量的方法，包括如下步骤：对TaROS1基因进行基因编辑
以上任一所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。
本发明提供了构建TaROS1 CRISPR/Cas9载体的靶位点及其应用。
本发明提供了小麦TaROS1 CRISPR/Cas9载体的靶位点序列为sgRNA1和sgRNA2，靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
含有上述靶位点序列的CRISPR/Cas9载体属于本发明的保护范围。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA1的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA2的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
本发明还保护特异sgRNA。所述特异sgRNA为sgRNA1或sgRNA2。
本发明还保护特异重组质粒。所述特异重组质粒为pLGYE-3-sgROS1。
sgRNA1的靶标序列如下：GCCAGAGCAAAGCAAATTGG(SEQ ID NO.4)。
sgRNA2的靶标序列如下：GAAGTTCCTGCTGACAGATC(SEQ ID NO.5)。
pLGYE-3-sgROS1含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA1和sgRNA2的编码基因。
本发明提供了TaROS1基因CRISPR/Cas9转基因植株，其具有小麦籽粒糊粉层显著增厚表型。
本发明还保护所述特异sgRNA或所述特异重组质粒在小麦育种中的应用。
有益效果：
本发明提供了小麦TaROS1基因的克隆方法以及小麦TaROS1基因在调控籽粒糊粉层厚度的生物学功能，本发明实验发现小麦TaROS1基因被定点敲除后，小麦籽粒糊粉层细胞层数均明显增加。本发明的小麦TaROS1基因对于小麦遗传育种和种质资源改良具有重要的应用价值。
附图说明
图1 TaROS1基因第3外显子双靶标sgRNA1和sgRNA2位置。
图2重组基因编辑载体质粒pLGYE-3-sgROS1 PCR鉴定图：c1-c6为重组质粒pLGYE-3-sgROS1；p为空载体pLGYE-3；M为DL2000 Marker。
图3靶向TaROS1基因CRISPR/Cas9重组载体pLGYE-3-sgROS1测序结果。斜体字母为OsU3终止子序列；加黑区为TaU6启动子序列；斜体大写字母加下划线为sgRNA；下划线为PCR鉴定引物pLGYE-F和pLGYE-R序列。
图4 TaROS1 CRISPR/Cas9转化扬麦18T0代植株Cas9基因PCR鉴定。M是Marker，-为野生型扬麦18作为阴性对照，+为pLGYE-3-sgROS1质粒作为阳性对照，r1-r9为TaROS1CRISPR/Cas9 T0代转基因植株，所用模板为三叶期幼苗的DNA。图中430bp的条带代表阳性。
图5 TaROS1在野生型扬麦18和基因编辑植株的部分测序结果。
图6 TaROS1在野生型扬麦18和基因编辑植株农艺表型。
图7 TaROS1基因编辑植株籽粒糊粉层细胞染色表型及厚度检测，bar＝50μm。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。BsaI内切酶、DNA片段连接所需的T4连接酶购自NEB生物公司；PCR扩增所需的高保真酶2x phanthaMax Master Mix、PCR产物回收试剂盒、酶切片段凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒、大肠杆菌E.coli DH5α、农杆菌EHA105感受态细胞均购自擎科南京生物公司。培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。LB、SOB培养基购置公司。DNAMarker DL2000等试剂购自Takara公司；所使用的引物由擎科南京生物技术有限公司合成，序列如下：
表1本研究中使用的引物
小麦品种扬麦18是江苏里下河地区农业科学研究所自主培育的具有良好组织培养能力的小麦种质，公众可从江苏里下河地区农业科学研究获得。
植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pLGYE-3，含有小麦TaU3启动子，用以启动sgRNA。pLGYE-3和中间载体pTagRNA4(Zhang Z,K,et al.Development of anAgrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for wheat genome editing.PlantBiotechnol.J,17,1623–1635,2019)由山东省农业科学研究院李根英课题组提供。
实验例1.双靶标CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建。
1.靶向ROS1的sgRNA的设计。
在小麦品种扬麦18幼穗中扩增ROS1基因的序列，其扩增序列与NCBI数据库中的小麦的该基因序列100％相似。该基因CDS全长1982个碱基，通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在ROS1基因的第3个外显子寻找2个适合的打靶位点，在PAM结构前找到20bp序列片段设定为靶序列，sgRNA1序列选定为GCCAGAGCAAAGCAAATTGG，sgRNA1序列选定为GAAGTTCCTGCTGACAGATC，两个靶标之间间隔181bp(如图1)。
2.合成扩增包含双靶标的sgRNA表达框引物，引物由擎科南京生物技术有限公司合成，2条引物为gROS1-TaU6-F和gROS1-TaU6-R(表1)。
3.以中间载体pTagRNA4为模板，用[0039]所设计的引物gROS1-TaU6-F和gROS1-TaU6-R进行PCR扩增，PCR体系：gROS1-TaU6-F(10μM):1μL,gROS1-TaU6-R(10μM):1μL，2×phantha Mix:25μL，ddH2O补足50μL。PCR程序：94℃,3min、94℃,10S、72℃,30S、循环35次，72℃,8min。
4.PCR产物回收试剂盒回收[0040]PCR扩增获得的808bp目标条带。
5.pLGYE-3载体的线性化。
用BsaI内切酶酶切pLGYE-3载体3h，凝胶电泳后回收线性载体片段。
6.将[0041]PCR产物克隆至基因编辑骨架载体pLGYE-3([0043]Bsa1单酶切回收的载体)。连接反应在PCR仪进行，具体反应程序为：37℃ 5min，16℃ 10min，共40个循环；然后16℃ 1h。连接反应体系为：pLGYE-3线性化载体3μL(60ng)，PCR回收产物6μL(300ng)，BsaI1uL，BSA 2ul，10×T4 ligase buffer 2uL，T4 ligase 0.5μL，ddH2O补足20μL。
7.重组质粒转化验证。
将连接产物转化大肠杆菌到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pLGYE-F和pLGYE-R(表1)。PCR鉴定阳性克隆目标条带为1331bp(如c1-c6)，而pLGYE-3空载体(p)扩增条带为1773bp(如图2)。进一步测序结果(如图3)检测到了双靶标的sgRNA序列(sgRNA2测序结果为反向互补序列)，同时在靶序列sgRNA2上游都检测到了TaU6启动子序列，测序结果说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pLGYE-3双元表达载体，证明了TaROS1的双靶标CRISPR/Cas9基因编辑载体pLGYE-3-sgROS1构建成功。
编辑载体pLGYE-3-sgROS1转化农杆菌感受态细胞EHA105，之后于LB(Kan+Rif)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆继续在SOB(Kan+Rif)培养液中培养备用。
实验例2.基因编辑载体的普通小麦转化。
1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,Sprin gScience+Businedd Media New York 2015
2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28℃培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1mL菌液于1.5mL离心管中，加入1.4uL乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23℃暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25℃。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25℃培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基上。用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有米黄色球状结构。
糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。
封好培养皿，放到25℃培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。
3.转基因苗的突变体检测
3.1 T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选。
由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中cas9基因的表达框PCR检测快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，质粒pLGYE-3-sgROS1为阳性对照，PCR引物Cas9-F/Cas9-R(表1)，PCR反应体系为：Cas9-F(10μM):0.5μL,Cas9-R:0.5μL，2×phantha Mix:10μL，ddH2O补足20μL。PCR运行程序为：94℃,3min、94℃,10S、72℃,30S、循环33次、72℃，8min。筛选阳性转基因苗结果(如图4)所示：样品r1-r9为T0代再生苗，+为阳性对照，-为扬麦18受体阴性对照，其中样品r1-r9出现Cas9基因的430bp目标条带，与+阳性质粒对照结果一致为阳性苗。
3.2编辑位点的测序检测。
目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用浙江水稻研究所的Hi-TOM基因编辑位点检测平台。该平台通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物aPrimer-F和aPrimer-R(表1)对TaROS1进行扩增，扩增产物建库后测序。
Hi-TOM具体过程：第一轮PCR反应体系：以TaROS1基因编辑的小麦植株叶片DNA为模板1μL，2×phanthta Mix 10μL，Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的2×phthta TaqMix 15μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，2×phthta Taq Mix 15μL，加测序接头引物aPrimer-F和aPrimer-R(表1)，Nuclease-free Water补足体积至30μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
经测序比对分析，9个T1代再生株系基于靶序列ABD基因组的基因型、基于靶序列的突变类型如表2：
表2基于Hi-TOM的靶基因测序检测
注：I代表插入，1I代表插入1个核苷酸，依次类推；D代表缺失，1D代表缺失1个核苷酸，依次类推；WT代表野生型。4株再生植株的部分测序结果见图5。图5中：AGG(反向互补序列CCT)为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除，斜体加粗字母为碱基插入。
4.转基因植株的籽粒表型检测。
挑选T1代基因编辑株系，自交获得T2代植株，从中筛选基于靶序列的突变类型为“ABD基因组纯合突变型”材料，受体扬麦18作物阴性对照材料，一起进行温室种植。供试编辑植株和对照植株均设置10-20株生物学重复。基因编辑株系的株高、种子千粒重、种子长度和宽度与受体扬麦18比较没有显著差异(如图6)，图5中wt为扬麦18为未转基因对照，r为基因编辑株系。
5.转基因籽粒糊粉层厚度检测。
在小麦籽粒糊粉层发育稳定的花后25天，分别对基因编辑和对照材料取样，对材料籽粒进行染色、切片和显微镜扫描(参考文献：张文虎(等)，小麦糊粉层发育研究，广东农业科学，2012)，测量糊粉层细胞厚度，结果表明，在TaROS1基因ABD三个基因组均被定点敲除的r37、r65株系糊粉层细胞厚度平均值为51.75μm和46.58μm，对照扬麦18(wt)的种子糊粉层厚度平均值为24.72μm(图7)，T-test检验表明TaROS1基因编辑材料的糊粉层厚度显著的高于对照扬麦18材料(P-value)。
Claims (9)
1.小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1在调控小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用，其特征在于抑制TaROS1基因表达，能够提高小麦籽粒糊粉层细胞厚度；所述小麦TaROS1基因位于小麦第5同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于通过TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统实现抑制TaROS1基因表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统针对双靶标sgRNA，其序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统为含有权利要求3中所述的双靶标sgRNA的表达框的重组质粒载体pLGYE-3-sgROS1。
5.一种针对权利要求1中所述的小麦TaROS1基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，以pLGYE-3为出发载体，BsaI酶切位点插入针对TaROS1基因双靶标sgRNA的表达框，所述的TaROS1基因双靶标sgRNA序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
6.根据权利要求5所述的小麦TaROS1基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于所述的TaROS1基因双靶标sgRNA的表达框序列如SEQ ID NO.10所示。
7.权利要求5所述CRISPR/Cas9载体的构建方法，提特征在于包括如下步骤：
S1：在靶向TaROS1基因第3个外显子保守序列处设计靶标sgRNA1和sgRNA2；
S2：合成包含双靶标sgRNA的表达框PCR扩增引物，如SEQ ID NO.6所示的gROS1-TaU6-F和如SEQ ID NO.7所示的gROS1-TaU6-R；
S3：双靶标sgRNA表达框的PCR扩增，利用S2所述引物，以中间载体pTagRNA4为模版PCR扩增获得双靶标sgRNA表达框DNA序列；
S4：利用限制性内切酶BsaI酶切pLGYE-3载体，回收线性化的pLGYE-3载体，将pLGYE-3线性化载体片段和S3所述带有粘性末端的双靶标sgRNA表达框的PCR产物，通过BsaI酶切、T4连接酶体系同时进行酶切、连接反应，获得重组质粒载体pLGYE-3-sgROS1；
或者包含以下步骤：
S1:在靶向TaROS1基因第3个外显子保守序列处设计靶标sgRNA1和sgRNA2；
S2：合成SEQ ID NO.10所示的包含双靶标sgRNA表达框的基因片段；
S3：利用限制性内切酶BsaI酶切pLGYE-3载体，回收线性化的pLGYE-3载体，将pLGYE-3线性化载体片段和S2所述基因片段，通过BsaI酶切、T4连接酶体系同时进行酶切、连接反应，获得重组质粒载体pLGYE-3-sgROS1。
8.小麦TaROS1基因的表达抑制剂在提高小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用。
9.权利要求5或6所述的小麦TaROS1基因的CRISPR/Cas9载体在提高小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用。
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