CN109797223B - Obr基因及用作溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关遗传标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种OBR基因及作用溆浦鹅肝脏脂肪沉积相关遗传标记的方法，利用瘦蛋白受体基因OBR及其作为溆浦鹅肥肝性状的遗传标记，通过测定溆浦鹅肥肝大小，并筛选溆浦鹅OBR基因多态性，然后将OBR基因多态性与肥肝性状关联分析，其OBR分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示。在SEQ ID NO:1的573bp处存在一个G/A碱基突变，GG基因型溆浦鹅肝脏大小显著高于GA基因型个体。本发明为溆浦鹅肥肝性状的标记辅助选择提供了分子标记。
Description
技术领域
本发明属于家禽分子生物技术及育种领域，主要是测定溆浦鹅肥肝性状相关的遗传标记，具体地说是，是测定OBR基因中的多态性，即与溆浦鹅肥肝性状相关的瘦蛋白受体基因的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，缩写为SNP)的存在。
技术背景
溆浦鹅是我国肥肝性能最优，体型大，生长快，抗病性强，优势特别明显的国家级地方品种遗传资源，2014年进入国家级畜禽遗传资源保护名录。鹅肥肝是世界级高档美味健康食品中三大珍品之一，其所富含的不饱和脂肪酸、亚油酸、卵磷脂等对软化血管、降低血脂、预防心脑血管疾病的发生具有重要保健作用。由于溆浦鹅缺乏科学系统选育，导致填肥后肝脏大小个体差异大，严重制约了鹅产业化生产效率、产品品质和经济效益。常规选育较慢，随着生物分子技术的发展，使得我们能够从DNA水平寻找与溆浦鹅肥肝性状相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，一提高选育进程，获得更大的经济效应。
瘦蛋白受体(Leptin receptor,OBR)是一种跨膜蛋白，属于I类细胞因子超家族受体，有5种异构体，即OBRa、OBRb、OBRe、OBRd和OBRf。它们具有相同的胞外区，而胞内结构域则具有长度和序列上的差异。OBR主要生理功能是与瘦素结合，使瘦素发挥调节体内能量平衡、脂肪贮存等生理作用。有关家禽OBR基因的研究很少，Guy等首次克隆了鸡OBR cDNA序列，与哺乳动物的同源性平均为60％。Dunn等将鸡的OBR基因定位在8号染色体上。顾志良等在OBR基因外显子9上检测到了1个碱基突变，并推测等位基因A可能与沉积较多腹脂有关。王颖等在鸡OBR基因内含子8上检测到了T—C、G—A 2个基因突变，产生的不同基因型在腹脂重和腹脂率上差异显著，BB型个体腹脂重和腹脂率显著高于AB型个体，极显著高于AA型个体。初步推断OBR基因可能是影响鸡脂肪性状的主效基因或与主效基因紧密连锁
目前，关于OBR基因多态性与肥肝性能的关联分析相对较少。溆浦鹅DNA遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关的遗传标记尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，提供一种OBR基因及其作为溆浦鹅肥肝性状遗传标记的用途；同时筛选与溆浦鹅肥肝性状相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在溆浦鹅标记辅助选择中的应用。
本发明实施例是这样实现的，一种OBR基因，所述基因为与表示溆浦鹅肥肝性状相关的基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所述。序列表SEQ ID NO:1的573bp处有1个G/A的碱基突变，导致多态性存在。所用引物如下：
正向引物：5’—TTTGCCGTTAGTACCAGG—3’
反向引物：5’—GCACAGACAAACAGGAGC—3’
本发明实施例的另一目的在于提供一种用OBR基因作为溆浦鹅溆浦鹅肥肝性状相关遗传标记的方法，包括如下步骤：
(1)根据GenBank中鹅OBR基因的序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列；
(2)以溆浦鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；
(3)在扩增的591bp序列中(如序列表SEQ ID NO:1所示)，第573bp处存在1个突变位点。并证实该位点是在OBR基因第16内含子碱基位置258bp处。
进一步，所述方法选择溆浦鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选溆浦鹅肥肝性状相关基因，其步骤如下：
(1)选择相同批次80日龄健康溆浦鹅60只进行饲养试验；
(2)根据OBR基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；
(3)筛选与肥肝性状相关的SNP。
关于溆浦鹅肝脏脂肪沉积相关基因SNP筛选方法。
选择相同日龄的健康溆浦鹅50～80只进行填饲试验。一般在28天后进行屠宰，分别称取所有溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本中(大肝和小肝)分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鹅OBR基因序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列，引物序列为：5’-TTTGCCGTTAGTACCAGG-3’(正向)，5’-GCACAGACAAACAGGAGC-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组DNA进行扩增。
PCR：20μl反应体系：2×Master mix 12μl，上下游引物(10μmol/L))各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。
取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1246bp。
取PCR扩增产物3 0μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是OBR基因，序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。
上述实验结果表明，从溆浦鹅肝脏中提取相关基因为OBR基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的SNP，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。
关于与溆浦鹅肝脏脂肪沉积有关的SNP在生产实践中的验证试验。
选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅10～20只进行试验。一般在28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，分别称量肝脏重量。
用提取的溆浦鹅肝脏组织样基因组DNA，并利用引物扩增，并检测其SNP。
1、PCR
PCR反应体系如下表所示：
表1 PCR反应体系
PCR循环参数如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。
2、OBR基因SNP位点基因型频率分析
通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中(P>0.05)。
表2 SNP位点基因型和基因频率
3、OBR基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析
分析不同SNP基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同SNP基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中GG基因型溆浦鹅肝重高GA型个体110.8％，差异达到显著水平(P<0.05)。
表3不同基因型溆浦鹅肝重比较
注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(P＜0.05)。
本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出OBR基因为溆浦鹅肥肝性状的相关基因，继而从溆浦鹅OBR基因上筛选到与性状相关的SNP，并且通过生产实践验证确定OBR基因为肥肝脂肪沉积相关基因，筛选的SNP为与之相关的SNP。本发明筛选的溆浦鹅OBR基因的SNP可作为溆浦鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出肝脏脂肪沉积沉积更多，肝脏更大的溆浦鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。
附图说明：图1是突变位点和测序峰图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1溆浦鹅肝脏脂肪沉积相关基因SNP筛选
选择相同日龄的健康溆浦鹅60只进行填饲试验。28天后进行屠宰，称量溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本中(大肝和小肝)分别提取其基因组DNA。
根据GenBank中鹅OBR基因序列，用Primer 5.0设计引物，覆盖该基因全部外显子14到外显子16序列，引物序列为：5’-TTTGCCGTTAGTACCAGG-3’(正向)，5’-GCACAGACAAACAGGAGC-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组DNA进行扩增。
PCR：20μl反应体系：2×Master mix 12μl，上下游引物(10μmol/L))各0.8μl，DNA模板1μl，超纯水补至所需体积。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。
取PCR产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，PCR产物的长度为1246bp。
取PCR扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了PCR产物是OBR基因，序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。图1是突变位点和测序峰图。
上述实验结果表明，从溆浦鹅肝脏中提取相关基因为OBR基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的SNP，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。
实施例2与溆浦鹅肝脏脂肪沉积有关的SNP在生产实践中的验证
选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅14只进行试验。28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，称量肝脏重量。
用提取的14只溆浦鹅肝脏组织样基因组DNA，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其SNP。
1、PCR
PCR反应体系如下表所示：
表1 PCR反应体系
PCR循环参数如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。
2、OBR基因SNP位点基因型频率分析
通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于Hardy-Weinberg平衡中(P>0.05)。
表2 SNP位点基因型和基因频率
3、OBR基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析
分析不同SNP基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同SNP基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中GG基因型溆浦鹅肝重高GA型个体110.8％，差异达到显著水平(P<0.05)。
表3不同基因型溆浦鹅肝重比较
注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(P＜0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> OBR基因及用作溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关遗传标记的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> 鹅(goose)
<220>
<221> mutation
<222> (573)
<223> r=g或a
<400> 1
agttgccaac aagatcagct atgataaagg ttcagaaact ctgtgttgag tatgttgttc 60
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atgcagttgt gagagatatc aaaggtacgt gtgctttcag agcgtgctct gatgctcggt 180
ccggtttcag actcagatgt gacactgttc tttcaaaact gtaatcttgc agctccctta 240
caaggccctg agttttggag agttgttgtt gaagatccag ccaggaggca gaaaaatgtt 300
accctcctgt ggaaggtgag aacacttaga ttttggtctt tcactttgaa agatgcatga 360
cccaaaagca ttggtagaat taatgaaaat gataatgata agcacgtgcc tccctgccct 420
gagaggcaac ctagggtggt cactgtttac aggacttggt ttgcagcatg cttgcaggtt 480
tttgctgcca atttctgcta accgagttct ctgagcagaa tgtgccactg agtcctagac 540
agctgcctgt acaaacacct cggcaatggc acrtaaactg ggcaaagctg c 591
Claims (1)
1.一种用如序列SEQ ID NO:1所示的OBR基因作为溆浦鹅肥肝性状相关遗传标记的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)在GenBank下载鹅OBR基因序列，用Primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子14到外显子16序列；
(2)以溆浦鹅基因组DNA为模板，PCR扩增，产物纯化，测序，获得如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(3)鉴定序列表SEQ ID NO:1的第573bp处是否存在G-A突变，GG基因型溆浦鹅肝重高于GA型个体。
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| CN201811536713.4A Active CN109797223B (zh) | 2018-12-14 | 2018-12-14 | Obr基因及用作溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关遗传标记的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921771A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-12-22 | 曲湘勇 | Obr基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途 |
| CN101921770A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-12-22 | 曲湘勇 | PPAR α基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途 |
| CN102911942A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-02-06 | 湖南农业大学 | Ob基因用作为鹅脂肪性状遗传标记的用途 |
| CN103031307A (zh) * | 2012-08-27 | 2013-04-10 | 湖南农业大学 | PPAR α基因及用作为鹅脂肪沉积相关遗传标记的方法 |
| CN103146829A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-12 | 浙江省农业科学院 | 利用分子标记辅助选择鹅肌肉脂肪酸性状的方法 |
-
2018
- 2018-12-14 CN CN201811536713.4A patent/CN109797223B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921771A (zh) * | 2010-04-27 | 2010-12-22 | 曲湘勇 | Obr基因及其作为鹅脂肪性状遗传标记的用途 |
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Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Comparison of overfed Xupu and Landes geese in performance,fatty acid composition, enzymes and gene expression related to lipid metabolism;Xu Liu等;《AJAS》;20201231;第33卷(第12期);1957-1964 * |
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| 朗德鹅A-FABP基因内含子2多态性及其与产肝性能的关联分析;邵丹等;《中国畜牧杂志》;20131231;第49卷(第3期);9-11 * |
| 鹅FAS、OBR、THRSPa和Apo-AI基因多态性及FAS和Apo-B基因在填词鹅中表达模式的研究;弓彦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140115(第01期);D050-250 * |
| 鹅肥肝形成相关基因的研究进展;邵丹等;《中国畜牧兽医》;20121231;第39卷(第09期);42-46 * |
| 鹅脂肪性状候选基因的研究;曲湘勇;《中国博士学位论文全文数据库》;20080715(第07期);D050-5 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109797223A (zh) | 2019-05-24 |
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