CN113151573B - 芝麻籽粒圆度主效qtl位点、与qtl位点紧密连锁的分子标记、分子标记引物、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及芝麻籽粒圆度主效QTL位点、与QTL位点紧密连锁的分子标记、分子标记引物、应用。本发明籽粒形状存在显著差异的芝麻品种豫芝4号和孟加拉小籽杂交，并以豫芝4号为父本进行回交，获得BC1群体在LG06连锁群定位了一个控制芝麻籽粒圆度的主效QTL位点，在不同环境中可解释表型变异的25.37%−39.36%，命名为qSR_ LG06。并开发出与qSR_LG06紧密连锁的SSR分子标记及其引物，可以有效预测芝麻遗传分离材料籽粒为卵圆或长卵圆形，通过分子标记辅助选择，可以在低世代对育种材料籽粒形状进行快速、准确、高效地筛选。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及芝麻籽粒圆度主效QTL位点、与QTL位点紧密连锁的分子标记、分子标记引物、应用。
背景技术
芝麻是我国重要的特色优质油料作物，常年种植面积约53万公顷，年产量约60~80万吨。芝麻种子含油量约55%，油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸含量高达85%，是优质食用油的重要来源。此外，芝麻还富含特殊的天然抗氧化物质—木酚素类，在人类营养保健、医疗及抗衰老等方面受到广泛地关注（Namiki et al. Crit Rev Food Sci, 2007, 47:651-673）。近年来，随着国内人民生活水平的不断提高，现有芝麻产量难以满足日益增长的市场需求；稳定和发展芝麻生产的关键在于提高产量和品质，从而增加比较效益。
种子是大部分农作物营养和遗传物质的储存器官，籽粒大小（seed size）和籽粒形状（seed shape）与作物产量、品质、商品价格密切相关，均为重要的育种目标性状（KaraRes Crop, 2011, 12:680-685；Wood et al. J Agri Sci, 2012, 4:244-252）。籽粒大小可以从空间或质量维度上分为粒长、粒宽、粒厚、粒重等组分。而籽粒形状则根据种子轮廓与已知几何图形相似的程度，分为圆形、卵圆形、椭圆形、心形、肾形等类型，籽粒形状度量指标有长宽比（Length/width ratio）、圆度（roundness）、J指数等（Cervantes et al.Scientifica, 2016, http://dx.doi.org/10.1155/2016/5691825）。籽粒大小和籽粒形状均为受多基因控制的数量性状，遗传调控机制非常复杂。随着分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点（quantitative trait loci，QTL），像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前拟南芥、水稻、玉米、大豆、小麦中已经定位或克隆了大量控制籽粒大小和籽粒形状的主效QTL或基因，主要涉及植物激素、MAPK 信号、泛素-蛋白酶体通路、表观修饰和G-蛋白信号等分子路径（Li, et al. Annu Rev Plant Biol, 2019, 70:435-463）。与模式植物和主要农作物相比，芝麻中对籽粒大小QTL定位的研究为数不多（Wu et al. BMC PlantBiol, 2014, 14:274; Zhou et al. Int J Mol Sci, 2018, 19:2794；Du et al. BMCPlant Biol, 2019, 19:588; Teboul et al. Genes, 2020, 11:1221）；除Du等（2019）利用F2群体在两个环境中各定位一个控制籽粒长宽比的QTL外（Du et al. BMC Plant Biol,2019, 19:588），对籽粒形状的研究未见更多的报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供芝麻籽粒圆度主效QTL位点，qSR_LG06，该位点可解释表型变异的23.21%~37.95%。
本发明的目的之二在于提供与芝麻籽粒圆度主效QTL紧密连锁的分子标记，HSRC3298，该分子标记与主效QTL的遗传距离0.8cM，为共显性分子标记，通过检测HSRC3298在育种材料中的扩增产物，可以确定材料中主效QTL位点的等位基因状态，进行育种选育，提高育种效率。
本发明的目的之三在于提供芝麻籽粒圆度育种筛选用分子标记引物，用于特异性扩增与籽粒圆度主效QTL紧密连锁的分子标记HSRC3298。
本发明的目的之四在于提供本发明分子引物在芝麻育种选育方面的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
芝麻籽粒圆度主效QTL位点，所述QTL位点位于芝麻基因组LG06连锁群，命名为qSR_LG06。
上述控制芝麻籽粒圆度的主效QTL位点qSR_LG06的获得，包括以下步骤：
（1）利用籽粒形状存在显著差异的芝麻品种豫芝4号和孟加拉小籽杂交获得F1种子，并以豫芝4号为父本进行回交，获得BC1群体，而后自交获得BC1F2家系；
（2）分别在河南平舆、南阳、漯河种植BC1F2家系群体，利用SC-G自动考种分析仪测定各芝麻样本籽粒圆度，获得表现型数据；
（3）提取豫芝4号、孟加拉小籽及BC1群体叶片基因组总DNA；
（4）利用二代测序技术对豫芝4号和孟加拉小籽进行基因组重测序，比对到芝麻参照基因组，在全基因组范围内筛选多态性分子标记；
（5）根据筛选的多态性分子标记自主设计开发SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带大小进行判断，筛选亲本间有多态性的SSR标记引物；
（6）利用筛选到的多态性SSR标记引物分别对BC1群体DNA进行PCR扩增，获得BC1群体基因型数据；
（7）将BC1群体基因型数据输入IciMapping软件，进行遗传连锁图构建；（8）将BC1群体基因型、遗传连锁图、籽粒圆度表现型数据输入IciMapping软件进行QTL定位；其中在LG06连锁群定位了一个稳定的主效QTL，在上述河南平舆、南阳、漯河3个环境中均能检测到，分别解释表型变异的25.03%、37.95%、23.21%，命名为qSR_LG06。
基于上述确定的芝麻籽粒圆度主效QTL位点，确定与芝麻籽粒圆度主效QTL位点紧密连锁的分子标记，该分子标记与上述QTL位点的遗传遗传距离0.8cM，命名为HSRC3298。其确定方法包括参照豫芝4号和孟加拉小籽基因组重测序信息，在qSR_LG06位点附近大量合成多态性标记引物，对上述qSR_LG06进行精细定位，获得与其紧密连锁（遗传距离0.8 cM）的分子标记HSRC3298。
以上述HSRC3298作为共显性SSR分子标记，合成针对该分子标记的引物，其中正向引物序列：HSRC3298F: 5'–GGATTGAAAGTTGCCCTG–3'，SEQ ID NO：1所示；反向引物序列：HSRC3298R: 5'–CAAAAGCGAACACACGG–3'，SEQ ID NO：2所示。采用该分子标记引物在长卵圆形品种豫芝4号中只能扩增出455 bp产物，在卵圆形品种孟加拉小籽中扩只能增出467 bp产物，在杂合基因型中则能扩增出455bp和467 bp两种产物。
因此，在本发明的一些实施例中，应用上述分子标记HSRC3298引物对芝麻籽粒形状进行标记辅助选择和预测，具体方法包括用HSRC3298F和HSRC3298R引物扩增芝麻育种后代材料叶片或其他组织总DNA，若只获得455bp的扩增片段，表明在上述qSR_LG06位点上只存在与豫芝4号相同的等位基因，材料粒形较长，标记为长卵圆形；若只获得467bp的扩增片段，表明在上述qSR_LG06位点上只存在与孟加拉小籽相同的等位基因，材料粒形较圆，标记为卵圆形；若获得455bp和467bp两种扩增片段，则表明在上述qSR_LG06位点上同时存在两种杂合等位基因，粒形的长度和圆度处于长卵圆形和卵圆形之间，标记为中间形态，仍需进一步自交和选择。其中长卵圆形、卵圆形和中间形态的差异主要体现在籽粒的长度和圆度，其中长度方面长卵圆形＞中间形态＞卵圆形，圆度方面卵圆形＞中间形态＞长卵圆形。
本发明的优点在于：
（1）本发明首次在芝麻中定位了一个控制籽粒圆度的主效QTL位点qSR_LG06，可解释表型变异的23.21%~37.95%，又通过亲本基因组重测序和QTL精细定位，开发获得了与qSR_LG06紧密连锁的分子标记，并利用F2群体进行了验证获得了与qSR_LG06紧密连锁（遗传距离0.8 cM）的SSR分子标记HSRC3298，在芝麻中尚未见报道；
（2）芝麻籽粒形状是复杂的数量性状，受环境因素影响很大，传统育种中通过表型选择困难，本发明中SSR标记HSRC3298与控制芝麻籽粒圆度的主效QTL qSS_LG06紧密连锁，且为共显性分子标记，通过检测HSRC3298在育种材料中的扩增产物，可以确定材料中qSS_ LG06位点的等位基因状态；利用该标记在早期世代即可对芝麻育种材料籽粒形状进行准确预测和标记辅助选择，不受环境影响，显著提高育种效率。
附图说明
图1芝麻籽粒圆度的主效QTL qSR_LG06在芝麻基因组中的位置示意图；
图2分子标记HSRC3298的引物在BC1群体（豫芝4号×孟加拉小籽）中扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明以籽粒圆度存在显著差异的芝麻品种豫芝4号和孟加拉小籽作为研究材料，为芝麻籽粒形状选择提供新的方法。豫芝4号是河南省驻马店市农业科学研究所上世纪80年代培育的优良芝麻品种，过去30年中在我国黄淮芝麻产区得到广泛种植，籽粒长卵圆形。孟加拉小籽是从孟加拉国进口的商品芝麻中系统选择而成，蒴粒数多，籽粒较小，籽粒较圆。上述材料均保存在河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库。
实施例1 芝麻籽粒圆度分离群体的构建及性状测定：
（1）BC1群体构建：以豫芝4号为母本，孟加拉小籽为父本杂交获得F1种子，并以豫芝4号父本进行回交，获得BC1群体，而后自交获得BC1F2家系；
（2）籽粒圆度表型鉴定：分别在河南平舆、南阳、漯河种植BC1F2家系群体，随机区组排列，单行区，2重复；每小区中间5株混合收获，利用SC-G自动考种分析及千粒重仪（杭州万深检测科技有限公司）测定籽粒圆度，获得表现型数据；圆度计算公式
，其中S为侧面面积，a为外接椭圆长轴半径。
实施例2 引物的开发和合成：
（1）DNA提取：采用CTAB法，提取豫芝4号、孟加拉小籽及BC1群体叶片DNA：具体步骤为：液氮研磨叶片0.5 g，粉末加入2 ml的离心管中，加入1 ml的提取缓冲液，冰上放置10min，12000 rpm离心5 min，弃上清液；加入裂解缓冲液600μl，混匀，65 ℃水浴30~60 min；加入1 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，V/V/V）混匀30次，静置5 min，12000 rpm离心5 min，吸取上清液；加入等体积异丙醇，混匀后放置10 min，12000 rpm离心5 min，弃上清液；75%的乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入1×TE溶解（500μl），加入两倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，V/V/V），混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸上清液，加入等体积氯仿混匀50次，静置5 min，12000 rpm离心5 min；吸取上清液，加入十分之一体积3 M NaAc（PH5.2），加入等体积异丙醇，混匀，12000 rpm离心5 min，弃上清液，75 %乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入适量含有RNase的TE（50μl）溶解沉淀，37 ℃水浴30 min，消化RNA。Nanodrop分析仪检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，保存于-20 ℃备用；
（2）利用基因组重测序进行SSR分子标记和引物的开发：利用超声波将豫芝4号和孟加拉小籽DNA打断，构建测序文库并在Illumina HiSeq 2000平台测序（在北京百迈克生物科技有限公司完成）。利用BWA软件将双端Reads比对到中芝13号基因组（Wang et al.2014），分别利用GATK3.7和MISA进行InDel和SSR扫描，筛选豫芝4号和孟加拉小籽间存在InDel的SSR区域作为多态性候选SSR分子标记。选择均匀分布在全基因组的SSR分子标记，用Primer5.0软件设计引物，初次设计合成了1024对SSR引物。
实施例3 SSR引物多态性的筛选
利用合成的1024对SSR引物扩增豫芝4号和孟加拉小籽DNA，共筛选到多态性SSR引物315对，利用筛选到的多态性SSR标记引物分别对BC1群体DNA进行PCR扩增，获得BC1群体基因型数据。
PCR反应体系为10μL，包含1μL的模板DNA（25-50ng/μL），0.1μL的Taq酶(5U/μL)，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的dNTPs (10mM/μL)，0.2μL的正向引物（10μM/μL），0.2μL的反向引物（10μM/μL），7.3μL的ddH2O；扩增程序为：预变性94℃ 1min；变性94℃ 30s，退火57℃30s，延伸72℃ 30s，35个循环，延伸72℃ 10min；将扩增产物采用9%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，观察带型。
实施例4 芝麻籽粒圆度主效QTL位点定位：
遗传连锁图构建及QTL定位：将BC1群体基因型数据输入IciMapping软件，构建遗传图谱；将BC1群体基因型、遗传连锁图和籽粒圆度表现型数据输入IciMapping软件进行QTL定位；其中LG06连锁群上的一个主效QTL能在上述河南平舆、南阳、漯河3个环境中检测到，如图1所示，分别解释表型变异的25.03%、37.95%、23.21%，命名为qSR_LG06。
实施例5 确定与主效QTLqSR_LG06紧密连锁的分子标记
参照豫芝4号和孟加拉小籽基因组重测序信息，在qSR_LG06位点附近新合成SSR分子标记引物20对，重复实施例3和实施例4的过程对上述qSR_LG06进行精细定位，获得与其紧密连锁（遗传距离0.8 cm）的分子标记HSRC3298。
实施例6 确定与主效QTLqSR_LG06紧密连锁的分子标记引物
根据实施例5确定的分子标记HSRC3298，设计合成其引物，其中正向引物序列为HSRC3298F: 5'–GGATTGAAAGTTGCCCTG–3'，SEQ ID NO：1所示；反向引物序列为：HSRC3298R:5'–CAAAAGCGAACACACGG–3'，SEQ ID NO：2所示。
实施例7 与主效QTLqSR_LG06紧密连锁的分子标记引物在芝麻育种筛选方面的应用
利用实施例确定的与主效QTLqSR_LG06紧密连锁的分子标记引物扩增相应的芝麻育种后代材料叶片或其他组织总DNA，在长卵圆形品种豫芝4号中只能扩增出455 bp产物，其序列如SEQ ID NO：3所示；在卵圆形品种孟加拉小籽中只能扩增出467 bp产物，其序列如SEQ ID NO：4所示；在杂合基因型中则能扩增出455 bp和467 bp两种产物，如图2所示。
实施例2利用F2群体验证本发明分子标记HSRC3298对芝麻选育的辅助选择效果
（1）F2群体构建：以豫芝4号为母本，孟加拉小籽为父本杂交获得F1种子，并自交获得F2群体；
（2）DNA提取：在海南三亚种植F2群体，提取单株DNA，方法同实施例2；
（3）F2群体基因型鉴定：利用本发明实施例6确定的HSRC3298引物HSRC3298F: 5'–GGATTGAAAGTTGCCCTG–3'：HSRC3298R: 5'–CAAAAGCGAACACACGG–3'扩增F2单株DNA，鉴定F2群体基因型，PCR反应体系、凝胶及产物观察方法同实施例3。在138个F2单株中，28个单株只扩增出455 bp产物（豫芝4号等位基因），34个单株只增出467 bp产物（孟加拉小籽等位基因），76个单株同时扩增出455 bp和467 bp两种产物，符合1:2:1的分离比例；
（4）分子标记HSRC3298的辅助选择效果：利用SC-G自动考种分析及千粒重仪测定F2单株籽粒圆度，获得138个单株表现型数据。28个只扩增出455 bp产物的单株平均籽粒圆度为0.58，74个同时扩增出455 bp和467 bp两种产物的单株平均籽粒圆度为0.60，而34个单株只扩增出467 bp产物的单株平均籽粒圆度则为0.62，差异达极显著水平（P <0.01）。说明利用分子标记HSRC3298进行芝麻籽粒圆度辅助选择具有较好的效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 芝麻籽粒圆度主效QTL位点、与QTL位点紧密连锁的分子标记、分子标记引物、应用
<160> 4
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggattgaaag ttgccctg 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caaaagcgaa cacacgg 17
<210> 3
<211> 455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<212> DNA
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ccacctccat tgctccacat ttgatctact cctttttatt gccagcctgt ttcattttcc 420
tttttaaaaa ttaattatta ttatttaatt ccgtgtgttc gcttttg 467
Claims (5)
1.与芝麻籽粒圆度主效QTL位点紧密连锁的分子标记，其特征在于：所述分子标记与所述的QTL位点的遗传距离0.8cM，命名为HSRC3298；
所述芝麻籽粒圆度主效QTL位点位于芝麻基因组LG06连锁群，命名为qSR_LG06；
所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
2.芝麻籽粒圆度育种筛选用分子标记引物，其特征在于，特异性结合如权利要求1所述的分子标记HSRC3298区域序列。
3.如权利要求2所述的芝麻籽粒圆度育种筛选用分子标记引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为5'–GGATTGAAAGTTGCCCTG–3'，如SEQ ID NO：1所示；所述反向引物序列为5'–CAAAAGCGAACACACGG–3'，SEQ ID NO：2所示。
4.芝麻籽粒圆度育种筛选用分子标记引物在芝麻选育方面的应用，其特征在于，包括用如权利要求2或3所述引物扩增芝麻育种后代材料DNA，通过扩增片段的长度预测籽粒圆度。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，用如权利要求3所述引物扩增芝麻育种后代材料DNA，检测扩增片段长度，若只获得455bp的扩增片段，可预测该材料籽粒为长卵圆形；若只获得467bp的扩增片段，则可预测该材料籽粒为卵圆形；获得455bp和467bp两种扩增片段，则可预测该材料籽粒为长卵圆形与卵圆形的中间形态。
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-
2021
- 2021-06-04 CN CN202110621742.6A patent/CN113151573B/zh active Active
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| A high-density genetic map constructed using specific length amplified fragment (SLAF) sequencing and QTL mapping of seed-related traits in sesame ( Sesamum indicum L.);Hua Du et al.;《BMC Plant Biology》;20191227;第19卷;第1-20页 * |
| 白芝麻籽粒油脂、蛋白质及芝麻素含量QTL定位分析;吴坤等;《作物学报》;20171231;第43卷(第07期);第1003-1011页 * |
| 芝麻蒴果大小相关性状的QTL定位分析;杨梅等;《中国油料作物学报》;20171231;第39卷(第06期);第785-793页 * |
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