KR102382458B1 - 생식력 있는 xy 암컷 마우스의 생산을 위한 다능성 세포의 선택 - Google Patents
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Abstract
F0 생식력 있는 XY 암컷 동물을 생성하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 F0 세대에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포, 시험관내 세포 배양물, 또는 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생산할 수 있는 배아를 만드는 것을 포함한다. 이러한 세포, 배아 및 동물은 Y 염색체의 영역을 침묵화시킴으로써 만들어질 수 있다. 임의로, 세포는 또한 암컷화 배지, 예컨대 저 삼투질농도 배지에서 배양되고/되거나, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 유지시킴으로써 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포, 또는 시험관내 세포 배양물, 배아, 또는 이들로부터 유래한 동물에서의 Y 염색체의 영역을 침묵화시키기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포의 집단을 유지시키고, F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생산하는 역량이 증가한 세포 또는 클론을 선택하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 암컷화 활성을 가지는 화합물에 대해 스크리닝하거나 암컷화 배지에서 농도를 최적화하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2015년 9월 17일에 출원된 미국 출원 제62/219,927호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
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표적화된 돌연변이를 보유하는 유전적으로 변형된 마우스의 생성은 보통 수컷 배아로부터 유래한 XY ES 세포주에 의해 성취된다. 수컷 또는 암컷일 수 있는 포배기 배아로의 ES 세포의 주사, 이어서 대리모로의 자궁 전달은 숙주 배아 및 ES 세포 둘 다로부터의 유전적 기여를 가지는 키메라 F0 세대 새끼의 출생을 발생시킨다. 이 타입의 실험의 성공의 특징은 XX 암컷 배아의 발생하는 생식 융기의 XY ES 세포에 의한 콜로니화 및 수컷 상태로의 전환의 결과로서 수컷을 선호하는 F0 마우스의 성별비의 왜곡이다. 강한 ES 세포 유래 코트 색상 기여를 가지는 수컷 키메라는 표적화된 돌연변이를 보유하는 정자를 생성할 것이고, 따라서 자손으로 ES 세포 게놈을 전달하기 위한 양호한 후보로 생각된다. 암컷 키메라가 불량한 효율로 생식선 전달을 거의 달성할 수 없으므로, 이들은 불량한 ES 세포 기여를 가지는 것으로 예상되고, 돌연변이체 마우스 라인을 확립하도록 보통 교배되지 않는다.
유전적으로 변형된 마우스의 생성을 촉진하도록, 본 발명자들은 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 방법을 개발하였고, 여기서 8-세포기 배아로 주사된 ES 세포는 완전한 ES 세포 유래 F0 세대 마우스로 전환된다(Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotech. 25(1):91-99). 벨로시마우스(등록상표) 방법이 키메라를 제거하면서, 모든 벨로시마이스(VELOCIMICE)(등록상표)는 이것이 유래한 ES 세포의 유전자형을 공유한다. XY ES 세포는 배타적으로 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 것으로 예상된다. XY 마우스에서 성 전환이 보고되었지만, 이러한 마우스는 대개 생식력 없거나 매우 낮은 생식력을 가진다.
대부분의 유전적 변형은 2개 중 1개의 기존의 대립유전자의 변형을 생성하도록 XY ES 세포를 표적화함으로써 수행되고, 생성된 공여자 마우스 ES 세포는 유전적 변형에 이형접합성이다. 그러나, 유전적 변형에 동형접합성인 마우스를 얻는 것이 대개 바람직하다. 본질적으로 완전한 ES 세포 유래 암컷 마우스가 변형을 포함하는 F0 세대에서 태어나지 않으므로, F0 수컷은 통상적으로 암컷(예를 들어, 매칭된 동계교배된 암컷)에 동계교배되어 적어도 하나의 암컷(F1 암컷)이 유전적 변형에 이형접합성인 한배 새끼를 생성한다. 이후, 이형접합성 F1 암컷은 F1 이형접합성 수컷과 상호교잡되어 동형접합성 자손이 얻어진다. 이러한 교배 요건은 비싸고 시간 소모적인 단계를 나타낸다.
생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 생산할 수 있는 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만들기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 일 양태에서, 본 발명은 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 암컷화 활성에 대해 표적 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지하기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계(여기서, 제1 집단은 표적 화합물의 존재 하에 배양되고, 제2 집단은 표적 화합물의 부재 하에 배양됨); 및 (b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 제1 및 제2 집단의 각각에서 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 평가하는(assaying) 단계(이로써, 암컷화 활성은, 제2 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포와 비교하여, 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 감소에 의해 확인됨)를 포함한다. 임의로, 이러한 방법은 (c) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 기초하여, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산하기 위한, 제1 집단으로부터의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 선택하는 단계(여기서, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류의 비율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성과 역으로 관련됨)를 추가로 포함한다. 임의로, 이러한 방법은 (d) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (e) 단계 (d)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (f) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있거나, 생식력 있고 가임성임)를 추가로 포함한다.
몇몇 이러한 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다. 몇몇 이러한 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 단백질 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다.
몇몇 방법에서, 암컷화 활성은 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 결여에 의해 단계 (b)에서 확인된다. 몇몇 방법에서, 암컷화 활성은, 제2 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포와 비교하여, 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성의 감소에 의해 단계 (b)에서 확인된다. 몇몇 방법에서, 암컷화 활성은 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성의 결여에 의해 단계 (b)에서 확인된다.
몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 제2 집단으로부터의 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (b)는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 집단에서의 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 적어도 2개를 평가하는 단계를 포함하고, 단계 (c)는 다른 평가된 세포에 비해 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 단계 (b)에서의 평가된 세포를 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로서 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성의 발현 및/또는 활성이 결여된다.
몇몇 방법에서, 제1 집단은 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양된다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 배아 줄기(embryonic stem: ES) 세포이다. 임의로, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 표적 화합물의 부재 하에 단계 (a)에서의 배지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는다.
몇몇 방법에서, 표적 화합물의 부재 하에 단계 (a)에서의 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가지는 저 삼투질농도 배지이다. 임의로, 저 삼투질농도 배지는 하기 특성 중 하나 이상을 가진다: (I) 저 삼투질농도 배지는 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (II) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (III) 저 삼투질농도 배지는 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도를 가짐; (IV) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함함; (V) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 염화나트륨을 포함함; (VI) 기본 배지는 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함함; (VII) 기본 배지는 약 13mM 내지 약 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함; (VIII) 기본 배지는 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도를 가짐; (IX) 기본 배지는 87 ± 5mM의 농도의 염화나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (X) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; 및 (XI) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 기본 배지는 50mM 내지 110mM의 농도의 염화나트륨 및 13mM 내지 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함. 임의로, 기본 배지는 약 18mM 내지 약 44mM의 농도의 탄산염을 포함한다. 임의로, 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함한다. 임의로, 탄산염은 중탄산나트륨이고, 알칼리 금속 및 할라이드의 염은 염화나트륨이고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다. 임의로, 기본 배지는 약 3㎎/㎖의 농도의 염화나트륨 및 약 2.2㎎/㎖d의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류이다. 임의로, 설치류는 랫트 또는 마우스이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 C57BL/6 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 129 균주 유래이다. 임의로, Y 염색체는 BALB/c 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 마우스는 129 균주를 포함하지 않는다. 몇몇 방법에서, Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하는 마우스이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃(knockout), 넉인(knockin), 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법은 (g) F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 교배하여 자손을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두는 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, XY 자손 중 어느 것도 표현형으로 암컷이 아니다. 임의로, 모든 XY 자손은 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, 교배 단계는 F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 코호트 F0 XY 수컷 비인간 포유류와 교잡하는 단계(여기서, F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류 및 F0 XY 수컷 비인간 포유류는 각각 유전적 변형에 이형접합성임), 및 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손 비인간 포유류를 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 방법에서, 숙주 배아는 상실기전 배아이고, 단계 (d)는 숙주 배아를 포배기로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양된다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 임의로, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 생식력 있다. 임의로, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 집단을 배양하는 단계(여기서, 저 삼투질농도 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가짐); (b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 집단에서 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 평가하는 단계; 및 (c) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 기초하여, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산하기 위한, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 선택하는 단계(여기서, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류의 비율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성과 역으로 관련됨)를 포함한다.
몇몇 이러한 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다. 몇몇 이러한 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 단백질 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성에 기초하여 선택된다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (b)는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 집단에서의 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 적어도 2개를 평가하는 단계를 포함하고, 단계 (c)는 다른 평가된 세포에 비해 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 단계 (b)에서의 평가된 세포를 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로서 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지에서 배양된다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다. 임의로, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 저 삼투질농도 배지는 하기 특성 중 하나 이상을 가진다: (I) 저 삼투질농도 배지는 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (II) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (III) 저 삼투질농도 배지는 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도를 가짐; (IV) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함함; (V) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 염화나트륨을 포함함; (VI) 기본 배지는 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함함; (VII) 기본 배지는 약 13mM 내지 약 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함; (VIII) 기본 배지는 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도를 가짐; (IX) 기본 배지는 87 ± 5mM의 농도의 염화나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (X) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; 및 (XI) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 기본 배지는 50mM 내지 110mM의 농도의 염화나트륨 및 13mM 내지 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함. 임의로, 기본 배지는 약 18mM 내지 약 44mM의 농도의 탄산염을 포함한다. 임의로, 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함한다. 임의로, 탄산염은 중탄산나트륨이고, 알칼리 금속 및 할라이드의 염은 염화나트륨이고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다. 임의로, 기본 배지는 약 3㎎/㎖의 농도의 염화나트륨 및 약 2.2㎎/㎖의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류이다. 임의로, 설치류는 랫트 또는 마우스이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 C57BL/6 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 129 균주 유래이다. 임의로, Y 염색체는 BALB/c 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 마우스는 129 균주를 포함하지 않는다. 몇몇 방법에서, Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하는 마우스이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서의 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법은 (d) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (e) 단계 (d)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (f) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있거나, 생식력 있고 가임성임)를 추가로 포함한다. 몇몇 방법은 (g) F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 교배하여 자손을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두는 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, XY 자손 중 어느 것도 표현형으로 암컷이 아니다. 임의로, 모든 XY 자손은 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, 교배 단계는 F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 코호트 F0 XY 수컷 비인간 포유류와 교잡하는 단계(여기서, F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류 및 F0 XY 수컷 비인간 포유류는 각각 유전적 변형에 이형접합성임), 및 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손 비인간 포유류를 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 방법에서, 숙주 배아는 상실기전 배아이고, 단계 (d)는 숙주 배아를 포배기로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지에서 배양된다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 임의로, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 생식력 있다. 임의로, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성 수준을 검출하기 위한 검출 시약; 및 (b) 검출 시약을 사용하고, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산하기 위한 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 예측된 성향과 검출을 상관시키기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 임의로, 검출 시약은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트 및/또는 하나 이상의 프로브를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암컷화 배지에서 표적 배지 성분의 농도를 최적화하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계(여기서, 제1 집단은 표적 배지 성분의 제1 농도의 존재 하에 배양되고, 제2 집단은 제1 농도와 다른 표적 배지 성분의 제2 농도의 존재 하에 배양됨); (b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 제1 및 제2 집단의 각각에서 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 평가하는 단계; 및 (c) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 제2 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포와 비교하여, 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 감소하는 경우 제1 농도를 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 이러한 방법은 (d) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 기초하여 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산하기 위한, 제1 집단으로부터의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 선택하는 단계(여기서, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류의 비율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성과 역으로 관련됨)를 추가로 포함한다. 몇몇 이러한 방법은 (e) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (f) 단계 (e)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (g) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻은 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있거나, 생식력 있고 가임성임)를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다. 몇몇 방법에서, 단계 (b)에서의 평가하는 단계는 단백질 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출한다.
몇몇 방법에서, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되는 경우 단계 (c)에서 선택된다. 몇몇 방법에서, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 제2 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포와 비교하여 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 경우 단계 (c)에서 선택된다. 몇몇 방법에서, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여되는 경우 단계 (c)에서 선택된다.
몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (c)에서의 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 제2 집단으로부터의 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는, 대조군 비인간 포유류 XY 다능성 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 단계 (b)는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 제1 집단에서의 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 적어도 2개를 평가하는 단계를 포함하고, 단계 (d)는 다른 평가된 세포에 비해 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 단계 (b)로부터의 평가된 세포를 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로서 선택하는 단계를 포함한다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다.
몇몇 방법에서, 제1 및 제2 집단은 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 배지 성분의 존재 하에 배양된다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다. 임의로, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 단계 (a)에서의 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가지는 저 삼투질농도 배지이다. 임의로, 저 삼투질농도 배지는 하기 특성 중 하나 이상을 가진다: (I) 저 삼투질농도 배지는 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (II) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (III) 저 삼투질농도 배지는 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도를 가짐; (IV) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함함; (V) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 염화나트륨을 포함함; (VI) 기본 배지는 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함함; (VII) 기본 배지는 약 13mM 내지 약 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함; (VIII) 기본 배지는 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도를 가짐; (IX) 기본 배지는 87 ± 5mM의 농도의 염화나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; (X) 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; 및 (XI) 저 삼투질농도 배지는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 기본 배지는 50mM 내지 110mM의 농도의 염화나트륨 및 13mM 내지 25mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함함. 임의로, 기본 배지는 약 18mM 내지 약 44mM의 농도의 탄산염을 포함한다. 임의로, 기본 배지는 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염을 포함한다. 임의로, 탄산염은 중탄산나트륨이고, 알칼리 금속 및 할라이드의 염은 염화나트륨이고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다. 임의로, 기본 배지는 약 3㎎/㎖의 농도의 염화나트륨 및 약 2.2㎎/㎖의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, 저 삼투질농도 배지는 약 216mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류이다. 임의로, 설치류는 랫트 또는 마우스이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 C57BL/6 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 129 균주 유래이다. 임의로, Y 염색체는 BALB/c 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 마우스는 129 균주를 포함하지 않는다. 몇몇 방법에서, Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하는 마우스이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법은 (h) F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 교배하여 자손을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두는 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, XY 자손 중 어느 것도 표현형으로 암컷이 아니다. 임의로, 모든 XY 자손은 표현형으로 수컷이고 생식력 있다. 임의로, 교배 단계는 F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류를 코호트 F0 XY 수컷 비인간 포유류와 교잡하는 단계(여기서, F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류 및 F0 XY 수컷 비인간 포유류는 각각 유전적 변형에 이형접합성임), 및 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손 비인간 포유류를 얻는 단계를 포함한다.
몇몇 방법에서, 숙주 배아는 상실기전 배아이고, 단계 (e)는 숙주 배아를 포배기로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 배지 성분의 존재 하에 배양된다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 임의로, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 생식력 있다. 임의로, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
일 양태에서, 본 발명은 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 Y 염색체의 영역을 침묵화시키고 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 생산하도록 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 변형시키는 단계(여기서, 침묵화는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키는 것 이외의 수단에 의해 달성되고, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 생산할 수 있음)를 포함한다. 임의로, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다.
몇몇 방법에서, 영역은 Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 하나 이상의 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry를 배제한다. 몇몇 방법에서, 영역은 마우스 Y 염색체의 Sxra 영역 및/또는 Sxrb 영역에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 마우스 Y 염색체 상의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 마우스 Y 염색체 상의 결실 간격 2에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 Kdm5d의 텔로머 또는 Usp9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머이다. 몇몇 방법에서, 영역은 Zfy2 유전자의 텔로머이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 Y 염색체의 작은 아암의 영역에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 몇몇 방법에서, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소한다. 임의로, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거된다. 몇몇 방법에서, 하나 이상의 Sry 및 Zfy2의 수준 및/또는 활성은 감소한다. 임의로, 하나 이상의 Sry 및 Zfy2의 수준 및/또는 활성은 제거된다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 영구적이다. 몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 중 하나 이상에 의해 달성된다: (1) 표적화된 유전적 변형; (2) 영역의 결실 또는 파괴; (3) 영역 내의 하나 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 안티센스 저해 또는 RNA 간섭; (4) 영역 내의 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 지시된 분해; (5) 이질염색질 매개된 침묵화; (6) Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가; 및 (7) 영역 내의 하나 이상의 유전자의 전사의 감소. 임의로, 영역은 표적화된 뉴클레아제 내에 결실되거나 파괴된다. 임의로, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease: TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 '주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR) 연관된 (Cas) 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA: gRNA)이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 시간 중 적어도 하나 동안 발생한다: (1) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 숙주 배아로 도입된 후; (2) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 포함하는 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입한 후; (3) 수컷 성 결정 프로그램이 관여할 때 배아 발생 동안에; (4) 마우스에서 E11-E12에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (5) 마우스에서 E17-E19에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (6) 배아 발생에 걸쳐; (7) 난자형성의 기간에 걸쳐; (8) 난모세포 발생에서의 감수분열 전기 동안에; (9) 난모세포가 수정된 후 처음의 2개 세포 분열 동안에; 및 (10) 난모세포 배란 후에 걸쳐 처음의 2개 세포 분열 수정 후에. 몇몇 방법에서, 성 전환은 F1 자손으로 전달될 수 있다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 배양되지 않는다. 다른 방법은 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지임)를 추가로 포함한다. 몇몇 방법에서, 영역은 하나 이상의 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry를 포함하고, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 배양되고, 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지이다. 임의로, 저 삼투질농도 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함한다: (1) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도; (2) 218mOsm/㎏의 삼투질농도; (3) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (4) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (5) 약 50mM 내지 약 110mM의 염화나트륨 농도; (6) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; (7) 약 13mM 내지 약 25mM의 중탄산나트륨 농도; (8) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도; (9) 87 ± 5mM의 염화나트륨 농도 및 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도; (10) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염, 및 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도; 및 (11) 218mOsm/㎏의 삼투질농도, 50mM 내지 110mM의 염화나트륨 농도, 및 13mM 내지 25mM의 중탄산나트륨 농도. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류이다. 임의로, 설치류는 랫트 또는 마우스이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 C57BL/6 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 129 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 마우스는 129 균주를 포함하지 않는다. 몇몇 방법에서, Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법에서, 영역은 Zfy2를 포함하고, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함한다. 임의로, 비인간 포유류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이거나, 비인간 포유류는 129 균주를 포함하지 않는 마우스이거나, 비인간 포유류는 Y 염색체가 C57BL/6 균주 유래인 마우스이거나, 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래가 아닌 마우스이다. 임의로, 이러한 방법은 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지임)를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만들기 위한 임의의 상기 방법에 의해 생산된 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 포함하는 시험관내 배양물을 제공한다.
본 발명은 또한 배아를 생성시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 임의의 상기 방법에 의해 생산된 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계(여기서, 숙주 배아는 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산할 수 있음)를 포함한다.
본 발명은 또한 배아를 생성하기 위한 상기 방법에 의해 생산된 변형된 비인간 포유류 배아를 제공한다. 본 발명은 또한 이의 게놈에서 Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형을 가지는 세포를 포함하는 변형된 비인간 포유류 배아를 제공한다.
본 발명은 또한 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만들기 위한 임의의 상기 방법에 의해 생산된 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (c) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다. 대안적으로, 상기 방법은 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만들기 위해 제공되고, (a) 변형된 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 배아를 수태시키는 단계(여기서, 배아는 상기 방법에 의해 생산됨); 및 (b) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 생식력 있다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만들기 위한 임의의 상기 방법에 의해 생산된 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 제공한다.
본 발명은 또한 F1 세대에서 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 형질전환 비인간 포유류를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 상기 방법에 의해 생산된 F0 XY 생식력 있는 암컷을 F0 XY 수컷 비인간 포유류와 교배하는 단계(여기서, F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 포유류 및 F0 XY 수컷 비인간 포유류는 각각 표적화된 유전적 변형에 이형접합성임); 및 (b) 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손 비인간 포유류를 얻는 단계를 포함한다. 임의로, F0 XY 수컷은 F0 XY 생식력 있는 암컷과 동일한 다능성 세포 클론으로부터 유래한 코호트 클론성 형제자매이다.
본 발명은 또한 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 변형시킴으로써 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 생성하는 단계(여기서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함함); (b) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (c) 단계 (b)의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (d) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다. 임의로, 다능성 세포는 배아 줄기 세포이다.
몇몇 방법에서, 영역은 Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부를 포함하거나; 하나 이상의 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry를 배제하거나; 마우스 Y 염색체의 Sxra 영역 및/또는 Sxrb 영역에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; 마우스 Y 염색체 상의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; Kdm5d의 텔로머 또는 Usp9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함하거나; Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 영역에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 임의로, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거되거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거된다. 몇몇 방법에서, 침묵화는 영구적이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 중 하나 이상에 의해 달성된다: (1) 표적화된 유전적 변형; (2) 영역의 결실 또는 파괴; (3) 영역 내의 하나 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 안티센스 저해 또는 RNA 간섭; (4) 영역 내의 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 지시된 분해; (5) 이질염색질 매개된 침묵화; (6) Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가; 및 (7) 영역 내의 하나 이상의 유전자의 전사의 감소. 임의로, 영역은 표적화된 뉴클레아제 내에 결실되거나 파괴된다. 임의로, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 '주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR) 연관된 (Cas) 단백질 및 가이드 RNA(gRNA)이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 시간 중 적어도 하나 동안 발생한다: (1) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 숙주 배아로 도입된 후; (2) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 포함하는 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입한 후; (3) 수컷 성 결정 프로그램이 관여할 때 배아 발생 동안에; (4) 마우스에서 E11-E12에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (5) 마우스에서 E17-E19에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (6) 배아 발생에 걸쳐; (7) 난자형성의 기간에 걸쳐; (8) 난모세포 발생에서의 감수분열 전기 동안에; (9) 난모세포가 수정된 후 처음의 2개 세포 분열 동안에; 및 (10) 난모세포 배란 후에 걸쳐 처음의 2개 세포 분열 수정 후에. 몇몇 방법에서, 성 전환은 F1 자손으로 전달될 수 있다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 배양되지 않는다. 다른 방법은 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지임)를 추가로 포함한다. 임의로, 저 삼투질농도 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함한다: (1) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도; (2) 218mOsm/㎏의 삼투질농도; (3) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (4) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (5) 약 50mM 내지 약 110mM의 염화나트륨 농도; (6) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; (7) 약 13mM 내지 약 25mM의 중탄산나트륨 농도; (8) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도; (9) 87 ± 5mM의 염화나트륨 농도 및 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도; (10) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염, 및 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도; 및 (11) 218mOsm/㎏의 삼투질농도, 50mM 내지 110mM의 염화나트륨 농도, 및 13mM 내지 25mM의 중탄산나트륨 농도. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류, 랫트 또는 마우스이다. 임의로, 마우스는 C57BL/6 균주를 포함하거나; 마우스는 129 균주를 포함하거나; 마우스는 129 균주를 포함하지 않거나; 마우스는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 C57BL/6 균주 유래인 마우스이거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래인 마우스이거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래가 아닌 마우스이거나; 비인간 포유류는 마우스이고, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법에서, 영역은 Zfy2를 포함한다. 임의로, 비인간 포유류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이거나, 비인간 포유류는 129 균주를 포함하지 않는 마우스이거나, 비인간 포유류는 Y 염색체가 C57BL/6 균주 유래인 마우스이거나, 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래가 아닌 마우스이다. 임의로, 이러한 방법은 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 배양하는 단계(여기서, 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지임)를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 임의로, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류인 F0 XY 자손의 백분율은 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류의 백분율보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 생식력 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기보다 크다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 한배 새끼의 평균 수는 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 한배 새끼의 평균 수보다 많다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수보다 많다.
본 발명은 또한 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 변형시킴으로써 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 생성하는 단계(여기서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 저 삼투질농도 배지 중에 유지되지만, 침묵화는 저 삼투질농도 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키는 것 이외의 또는 이것에 부가한 수단에 의해 달성되고, 저 삼투질농도 배지는 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하고, 기본 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함함); (b) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계; (c) 단계 (b)의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (d) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다. 임의로, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다.
몇몇 방법에서, 영역은 Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부를 포함하거나; 하나 이상의 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry를 배제하거나; 마우스 Y 염색체의 Sxra 영역 및/또는 Sxrb 영역에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; 마우스 Y 염색체 상의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; Kdm5d의 텔로머 또는 Usp9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함하거나; Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 영역에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 임의로, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거되거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거된다. 몇몇 방법에서, 침묵화는 영구적이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 중 하나 이상에 의해 달성된다: (1) 표적화된 유전적 변형; (2) 영역의 결실 또는 파괴; (3) 영역 내의 하나 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 안티센스 저해 또는 RNA 간섭; (4) 영역 내의 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 지시된 분해; (5) 이질염색질 매개된 침묵화; (6) Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가; 및 (7) 영역 내의 하나 이상의 유전자의 전사의 감소. 임의로, 영역은 표적화된 뉴클레아제 내에 결실되거나 파괴된다. 임의로, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 '주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR) 연관된 (Cas) 단백질 및 가이드 RNA(gRNA)이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 하기 시간 중 적어도 하나 동안 발생한다: (1) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포가 숙주 배아로 도입된 후; (2) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 포함하는 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입한 후; (3) 수컷 성 결정 프로그램이 관여할 때 배아 발생 동안에; (4) 마우스에서 E11-E12에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (5) 마우스에서 E17-E19에 상응하는 적어도 발생 단계까지 배아 발생 동안에; (6) 배아 발생에 걸쳐; (7) 난자형성의 기간에 걸쳐; (8) 난모세포 발생에서의 감수분열 전기 동안에; (9) 난모세포가 수정된 후 처음의 2개 세포 분열 동안에; 및 (10) 난모세포 배란 후에 걸쳐 처음의 2개 세포 분열 수정 후에. 몇몇 방법에서, 성 전환은 F1 자손으로 전달될 수 있다.
몇몇 방법에서, 저 삼투질농도 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함한다: (1) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도; (2) 218mOsm/㎏의 삼투질농도; (3) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (4) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (5) 약 50mM 내지 약 110mM의 염화나트륨 농도; (6) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; (7) 약 13mM 내지 약 25mM의 중탄산나트륨 농도; (8) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도; (9) 87 ± 5mM의 염화나트륨 농도 및 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도; (10) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염, 및 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도; 및 (11) 218mOsm/㎏의 삼투질농도, 50mM 내지 110mM의 염화나트륨 농도, 및 13mM 내지 25mM의 중탄산나트륨 농도. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류, 랫트 또는 마우스이다. 임의로, 마우스는 C57BL/6 균주를 포함하거나; 마우스는 129 균주를 포함하거나; 마우스는 129 균주를 포함하지 않거나; 마우스는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 C57BL/6 균주 유래인 마우스이거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래인 마우스이거나; 비인간 포유류는 Y 염색체가 129 균주 유래가 아닌 마우스이거나; 비인간 포유류는 마우스이고, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 방법에서, 영역은 Zfy2를 포함하고, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 임의로, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류인 F0 XY 자손의 백분율은 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류의 백분율보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 생식력 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기보다 크다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 한배 새끼의 평균 수는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 한배 새끼의 평균 수보다 많다. 임의로, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하지 않는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수보다 많다.
본 발명은 또한 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 다능성의 유지에 의해 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 성장시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키는 단계(여기서, 기본 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함함); 및 (b) 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 평가하여 Y 염색체의 영역의 침묵화를 확인하는 단계를 포함한다. 임의로, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다.
몇몇 방법에서, 저 삼투질농도 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함한다: (1) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도; (2) 218mOsm/㎏의 삼투질농도; (3) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (4) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (5) 약 50mM 내지 약 110mM의 염화나트륨 농도; (6) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; (7) 약 13mM 내지 약 25mM의 중탄산나트륨 농도; (8) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도; (9) 87 ± 5mM의 염화나트륨 농도 및 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도; (10) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염, 및 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도; 및 (11) 218mOsm/㎏의 삼투질농도, 50mM 내지 110mM의 염화나트륨 농도, 및 13mM 내지 25mM의 중탄산나트륨 농도. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 평가 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, 영역은 Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부를 포함하거나; 하나 이상의 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry를 배제하거나; 마우스 Y 염색체의 Sxra 영역 및/또는 Sxrb 영역에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; 마우스 Y 염색체 상의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3에 상응하는 Y 염색체의 섹션의 전부 또는 일부를 포함하거나; Kdm5d의 텔로머 또는 Usp9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함하거나; Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머이다.
몇몇 방법에서, 침묵화는 영역에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킨다. 임의로, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거되거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 감소하거나; Sry 및 Zfy2 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 제거된다.
몇몇 이러한 방법은 (b) 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계 및 (c) 단계 (b)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계를 추가로 포함한다. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 배지에서 유지된다.
본 발명은 또한 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 배양물 중에 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 집단을 유지시키는 단계(여기서, 기본 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함함); (b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 하나 이상의 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 평가하는 단계; 및 (c) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 선택하는 단계(여기서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산할 수 있음)를 포함한다. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다. 임의로, 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포이다.
몇몇 방법에서, 저 삼투질농도 배지는 하기 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함한다: (1) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도; (2) 218mOsm/㎏의 삼투질농도; (3) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (4) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (5) 약 50mM 내지 약 110mM의 염화나트륨 농도; (6) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; (7) 약 13mM 내지 약 25mM의 중탄산나트륨 농도; (8) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도; (9) 87 ± 5mM의 염화나트륨 농도 및 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도; (10) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염, 및 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도; 및 (11) 218mOsm/㎏의 삼투질농도, 50mM 내지 110mM의 염화나트륨 농도, 및 13mM 내지 25mM의 중탄산나트륨 농도. 임의로, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 평가 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가진다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류는 설치류이다. 임의로, 설치류는 랫트 또는 마우스이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 C57BL/6 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 설치류는 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, Y 염색체는 129 균주 유래이다. 몇몇 방법에서, 마우스는 129 균주를 포함하지 않는다. 몇몇 방법에서, Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다. 몇몇 방법에서, 설치류는 C57BL/6 균주 및 129 균주를 포함하는 마우스이다. 임의로, 다능성 세포는 VGF1 마우스 ES 세포이다.
몇몇 방법에서, 다능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함한다. 임의로, 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃, 넉인, 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 배아를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만들기 위한 상기 방법에 의해 생산된 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아 공여자로 도입하는 단계(여기서, 숙주 배아는 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산할 수 있음)를 포함한다.
본 발명은 또한 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만드는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (a) 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 만들기 위한 상기 방법에 의해 생산된 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포를 숙주 배아 공여자로 도입하는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (c) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다. 대안적으로, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 만들기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 배아를 수혜자 암컷 비인간 포유류로 도입하고 배아를 수태시키는 단계(여기서, 배아는 상기 방법에 의해 생산되고, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 세포를 포함함); 및 (b) 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 포함하는 F0 XY 비인간 포유류 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 비인간 포유류는 생식력 있음)를 포함한다. 임의로, 숙주 배아는 상실기전 배아이다. 임의로, 상기 방법은 숙주 배아를 포배기로 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 방법에서, 비인간 포유류 XY 다능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 저 삼투질농도 배지 중에 유지된다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류이다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 생식력 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 자손보다 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 새끼를 가지는 한배 새끼를 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 공여자 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 이의 생애에 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼를 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 비인간 포유류 XY 다능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
본 발명은 또한 (a) 비인간 포유류 XY 다능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성 수준을 검출하기 위한 검출 시약; 및 (b) 검출 시약을 사용하고, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 포유류를 생산하기 위한 비인간 포유류 XY 다능성 세포의 예측된 성향과 검출을 상관시키기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
도 1A는 결실 간격 1-7, Sxra 및 Sxrb 영역, 및 Sxrb 결실에 맵핑된 유전자를 포함하는 마우스 Y 염색체의 도식을 제공한다.
도 1B는 마우스 Y 염색체의 짧은 아암(Yp)의 도식을 제공한다.
도 2는 1823CE6 및 1823CF11 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 13 내지 25 꼬리 체질(tail somites; ts)의 범위였다. 20 ts에서의 CD1 XY 배아는 양성 대조군으로서 사용되고, 20 ts에서의 CD1 XX 배아는 음성 대조군으로서 사용되었다. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sry 발현을 보여준다. Hprt가 정규화 기준 유전자로서 사용될 때 동일한 결과를 얻었다. 정규화된 발현 값은 1823CF11 ts 14 샘플 중 하나에 대해 작도되고, 이의 값은 임의로 1로 설정된다.
도 3은 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 상대 Ddx3y 발현 수준을 보여준다.
도 4는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 상대 Eif2s3y 발현 수준을 보여준다.
도 5a-5d는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 수컷 성 결정 유전자 Sox9(도 5a), Fgf9(도 5b), mDhh(도 5c) 및 Amh(도 5d)의 상대 발현 수준을 보여준다.
도 6A 및 도 6B는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 암컷 성 결정 유전자 Foxl2(도 6A) 및 Rspo1(도 6B)의 상대 발현 수준을 보여준다.
도 7은 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 11 내지 34 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sry 발현을 보여준다.
도 8a-c는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Eif2s37(도 8a), Uty(도 8b) 및 Ddx3y(도 8c)의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 16 내지 22 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 9는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry, Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 상대 발현 수준을 보여준다. 정규화된 발현 수준은 17 내지 20 꼬리 체질(ts)의 범위의 배아 발생 단계에 걸쳐 평균이 되었다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 10A-D는 KO-DMEM에서 배양된 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 마우스에서의 출생 후 1주에 다양한 조직에서의 Ddx3y(도 10A), Uty(도 10B), Eif2s3y(도 10C) 및 Kdm5d(도 10D)의 상대 발현 수준을 보여준다. 2개의 대조군을 사용하였다: 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 조직 타입을 보여주고, y축은 Gapdh 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 11A-B는 수컷 생식선 발생의 초기 단계 동안 중심인 유전자의 성 결정의 단계 동안의 상대 발현 수준을 보여준다. 도 11A는 Sox9의 상대 발현 수준을 보여주고, 도 11B는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Fgf9의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 4개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 12A-B는 수컷 생식선 발생의 마커의 성 결정의 단계 동안 상대 발현 수준을 보여준다. 도 11A는 Dhh의 상대 발현 수준을 보여주고, 도 11B는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Amh의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 4개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 13은 암컷 생식선 발생의 마커의 성 결정의 단계 동안 상대 발현 수준을 보여준다. 도 13은 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Foxl2의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 2개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 및 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 14a-e는 XY 수컷 및 XY 암컷 마우스 둘 다를 생산하는 3개의 모 F1H4 XY 배아 줄기 세포 클론(모 클론 979 AC7(도 14a), 4048 BC4(도 14b) 및 15069 CD1(도 14c)) 및 오직 수컷 마우스를 생산하는 2개의 모 F1H4 XY 배아 줄기 세포 클론(985 AA8(도 14d) 및 1823 C11 (도 14e))으로부터의 배아 줄기 세포 서브클론에서의 RT-PCR에 의한 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 상대 발현 수준을 보여준다. 발현은 B2m에 대한 것이다. Drosha를 대조군으로서 사용하였다.
도 15는 마우스에서의 성 결정 신호전달 경로의 개관을 보여준다. 마우스 배아생성 동안, 쌍전위 생식선은 교미 후(dpc) 10.5일에 생식 융기로부터 생긴다. XY 생식 융기의 체세포에서, Sry(염색체 Y 상의 성 결정 영역) 발현은 10.5 dpc에서 시작하고, 11.5 dpc에서 피크에 도달하고, 12.5 dpc 만큼 약해진다. Sox9(SRY 박스 함유 유전자 9) 발현은 세르톨리 세포의 분화를 유도하도록 차후 몇 시간에 상향조절된다. Sox9 발현은 11.5-12.5 dpc에서 피크이고, 출생 후 계속해서 발현되고, 몇몇 포지티브 피드백 루프(FGF9(섬유아세포 성장 인자 9) 포함)에 의해 지원되고, SOX9는 후속하여 Amh(항뮬러관 호르몬)을 포함하는 많은 수컷 특이적 유전자를 활성화한다. 12.5 dpc에서, 고환삭이 형성되고, 고환과 난소 사이의 형태학적 차이가 명확하다. SRY의 부재 하에, 폴리스타틴 및 많은 다른 난소 특이적 유전자의 발현에 의해 입증된 바대로, Wnt4(무익기형 MMTV 통합 부위 패밀리, 구성원 4), Rspo1(R-spondin 1) 및 Foxl2(포크헤드 박스 L2)와 같은 유전자는 암컷 특이적 방식으로 발현되고, 난소 발생을 유도한다.
도 1B는 마우스 Y 염색체의 짧은 아암(Yp)의 도식을 제공한다.
도 2는 1823CE6 및 1823CF11 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 13 내지 25 꼬리 체질(tail somites; ts)의 범위였다. 20 ts에서의 CD1 XY 배아는 양성 대조군으로서 사용되고, 20 ts에서의 CD1 XX 배아는 음성 대조군으로서 사용되었다. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sry 발현을 보여준다. Hprt가 정규화 기준 유전자로서 사용될 때 동일한 결과를 얻었다. 정규화된 발현 값은 1823CF11 ts 14 샘플 중 하나에 대해 작도되고, 이의 값은 임의로 1로 설정된다.
도 3은 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 상대 Ddx3y 발현 수준을 보여준다.
도 4는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 상대 Eif2s3y 발현 수준을 보여준다.
도 5a-5d는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 수컷 성 결정 유전자 Sox9(도 5a), Fgf9(도 5b), mDhh(도 5c) 및 Amh(도 5d)의 상대 발현 수준을 보여준다.
도 6A 및 도 6B는 동일한 방식으로 정규화되고 작도된 도 2에서의 Sry 발현에 대해 보여진 동일한 생식 융기 샘플에서의 암컷 성 결정 유전자 Foxl2(도 6A) 및 Rspo1(도 6B)의 상대 발현 수준을 보여준다.
도 7은 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 11 내지 34 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sry 발현을 보여준다.
도 8a-c는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Eif2s37(도 8a), Uty(도 8b) 및 Ddx3y(도 8c)의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 16 내지 22 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 9는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Sry, Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 상대 발현 수준을 보여준다. 정규화된 발현 수준은 17 내지 20 꼬리 체질(ts)의 범위의 배아 발생 단계에 걸쳐 평균이 되었다. 3개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 10A-D는 KO-DMEM에서 배양된 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 마우스에서의 출생 후 1주에 다양한 조직에서의 Ddx3y(도 10A), Uty(도 10B), Eif2s3y(도 10C) 및 Kdm5d(도 10D)의 상대 발현 수준을 보여준다. 2개의 대조군을 사용하였다: 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 조직 타입을 보여주고, y축은 Gapdh 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 발현을 보여준다.
도 11A-B는 수컷 생식선 발생의 초기 단계 동안 중심인 유전자의 성 결정의 단계 동안의 상대 발현 수준을 보여준다. 도 11A는 Sox9의 상대 발현 수준을 보여주고, 도 11B는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Fgf9의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 4개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 12A-B는 수컷 생식선 발생의 마커의 성 결정의 단계 동안 상대 발현 수준을 보여준다. 도 11A는 Dhh의 상대 발현 수준을 보여주고, 도 11B는 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Amh의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 4개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아; 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 KO-DMEM에서 성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 13은 암컷 생식선 발생의 마커의 성 결정의 단계 동안 상대 발현 수준을 보여준다. 도 13은 KO-DMEM에서 배양된 2개의 성 전환 XY ES 세포 클론으로부터 유래한 배아로부터 절개된 생식 융기에서의 Foxl2의 상대 발현 수준을 보여준다. 분석된 배아의 발생 단계는 12 내지 25 꼬리 체질(ts)의 범위였다. 2개의 대조군을 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 및 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아. x축은 ts 단계를 보여주고, y축은 Sf1 기준 유전자의 것으로 정규화된 mRNA의 TAQMAN(등록상표) 역전사 커플링된 정량적 중합효소 사슬 반응(RT-qPCR)에 의해 측정된 Sox9 발현을 보여준다.
도 14a-e는 XY 수컷 및 XY 암컷 마우스 둘 다를 생산하는 3개의 모 F1H4 XY 배아 줄기 세포 클론(모 클론 979 AC7(도 14a), 4048 BC4(도 14b) 및 15069 CD1(도 14c)) 및 오직 수컷 마우스를 생산하는 2개의 모 F1H4 XY 배아 줄기 세포 클론(985 AA8(도 14d) 및 1823 C11 (도 14e))으로부터의 배아 줄기 세포 서브클론에서의 RT-PCR에 의한 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 상대 발현 수준을 보여준다. 발현은 B2m에 대한 것이다. Drosha를 대조군으로서 사용하였다.
도 15는 마우스에서의 성 결정 신호전달 경로의 개관을 보여준다. 마우스 배아생성 동안, 쌍전위 생식선은 교미 후(dpc) 10.5일에 생식 융기로부터 생긴다. XY 생식 융기의 체세포에서, Sry(염색체 Y 상의 성 결정 영역) 발현은 10.5 dpc에서 시작하고, 11.5 dpc에서 피크에 도달하고, 12.5 dpc 만큼 약해진다. Sox9(SRY 박스 함유 유전자 9) 발현은 세르톨리 세포의 분화를 유도하도록 차후 몇 시간에 상향조절된다. Sox9 발현은 11.5-12.5 dpc에서 피크이고, 출생 후 계속해서 발현되고, 몇몇 포지티브 피드백 루프(FGF9(섬유아세포 성장 인자 9) 포함)에 의해 지원되고, SOX9는 후속하여 Amh(항뮬러관 호르몬)을 포함하는 많은 수컷 특이적 유전자를 활성화한다. 12.5 dpc에서, 고환삭이 형성되고, 고환과 난소 사이의 형태학적 차이가 명확하다. SRY의 부재 하에, 폴리스타틴 및 많은 다른 난소 특이적 유전자의 발현에 의해 입증된 바대로, Wnt4(무익기형 MMTV 통합 부위 패밀리, 구성원 4), Rspo1(R-spondin 1) 및 Foxl2(포크헤드 박스 L2)와 같은 유전자는 암컷 특이적 방식으로 발현되고, 난소 발생을 유도한다.
정의
본 명세서에서 상호교환되어 사용되는 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 코딩된 및 비코딩된 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함하는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 골격을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 상호교환되어 사용되는 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 이것은 단일, 이중 및 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비천연, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
용어 "유전자"는 생성물(예를 들어, RNA 생성물 및/또는 폴리펩타이드 생성물)을 코딩하는 염색체에서의 DNA 서열을 의미하고, 비코딩 인트론에 의해 차단된 코딩 영역 및 5' 및 3' 말단 둘 다에서 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열을 포함하여서, 유전자는 전장 mRNA(5' 및 3' 비번역된 서열 포함)에 상응한다. 용어 "유전자"는 또한 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 증강인자 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위, 침묵인자, 절연 서열 및 기질 부착 영역을 포함하는 다른 비코딩 서열을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 가깝거나(예를 들어, 10kb 내), 원위 부위에 있을 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "야생형"은 (돌연변이체, 이환된, 변경된 또는 기타 등등에 의해 반대되는) 정상 상태 또는 상황에서 발견되는 구조 및/또는 활성을 가지는 집합체를 의미한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 대개 다수의 상이한 형태(예를 들어, 대립유전자)로 존재한다.
"생식력" 및 "생식력 있는"은 교배하고 임신하고 살아서 태어난 자손을 분만하는 암컷 동물의 능력을 의미한다. 동물은 생식력 있다고 생각되는 1마리의 살아서 태어난 자손을 오직 생산할 필요가 있다.
"가임능력" 및 "가임성"은 생식력의 품질을 의미한다. 가임능력은 정량적 측정치, 예컨대 동물의 수명에 또는 한정된 실험 시간 프레임에서 살아서 태어난 자손의 총 수일 수 있다. 한배 새끼의 수 및 빈도 및 한배 새끼당 자손의 수는 또한 가임능력의 측정치이다. 동물은 생식력 있지만, 매우 가임성이 아닐 수 있다(예를 들어, 오직 1마리 또는 아주 적은 작은 한배 새끼).
하나 이상의 기재된 구성요소를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 기재되지 않은 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물은 단독의 또는 다른 성분과 조합된 단백질을 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 범위 내의 또는 범위를 한정하는 모든 정수, 및 범위 내의 정수에 의해 한정된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않은 한, 용어 "약"은 기재된 값의 측정 오차(예를 들어, SEM)의 표준 마진 내의 값을 포함한다.
관사 "일", "하나" 및 "이"의 단수 형태는, 문맥이 명확히 표시하지 않는 한, 복수 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "Cas 단백질" 또는 "적어도 하나의 Cas 단백질"은 복수의 Cas 단백질, 예컨대 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
통계학적 유의성은 p ≤ 0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개관
F0 생식력 있는 XY 암컷 동물을 생성하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 F0 세대에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포, 시험관내 세포 배양물, 또는 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생산할 수 있는 배아를 만드는 것을 포함한다. 이러한 세포(및 배아 및 이들로부터 유래한 동물)는 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배양하고 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성을 평가함으로써 이루어질 수 있다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향은 이들 클론에서의 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 또는 활성과 역으로 상관된다. 대안적으로, 이러한 세포(및 배아 및 이들로부터 유래한 동물)는 Y 염색체의 영역을 침묵화함으로써 이루어질 수 있다. 임의로, 세포는 또한 암컷화 배지에서 배양되고/되거나 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다. 암컷화 배지, 예컨대 저 삼투질농도 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 유지시킴으로써 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포(또는 시험관내 세포 배양물, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물)에서 Y 염색체의 영역을 침묵화하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포의 집단을 유지시키고, F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생산하는 역량의 증가를 가지는 세포 또는 클론을 선택하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 암컷화 활성을 가지는 화합물에 대해 스크리닝하거나, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 평가를 통해 암컷화 배지에서의 성분의 농도를 최적화하기 위한 방법 및 조성물(XY 다능성 또는 전능성 세포에서의 이의 발현 및/또는 활성은 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향과 역으로 상관됨)이 또한 제공된다.
비인간 포유류(예를 들어, 마우스)를 만들기 위한 대부분의 ES 세포주는 수컷 XY 유전자형을 가진다. 포유류 성 결정에서 Y 염색체의 우성 때문에, XY ES 세포가 숙주 배아로 도입되고 수태될 때, 거의 항상 제1 세대(F0)를 생성시키는 것은, 수컷 공여자 ES 세포(XY)로부터 유래한 세포 및 수컷(XY) 또는 암컷(XX)일 수 있는 숙주 배아로부터 유래한 세포를 함유하는 키메라인, 표현형으로 수컷인 동물이다. F0 세대에서 표현형 암컷이 관찰되는 정도로, 이것은 통상적으로, ES 세포 기여가 배아 생식 융기를 남성화시키기에 불충분한 키메라를 생성시키는, 암컷 XX 배아로의 XY ES 세포의 도입으로부터 생긴다. 대부분의 경우에, 이러한 암컷 키메라는 XY ES 세포로부터 유래한 난모세포를 생산하지 않고, 따라서, ES 세포 게놈을 다음 세대로 전달할 수 없다.
벨로시마우스(등록상표) 방법(예를 들어, 미국 특허 제7,659,442호; 제7,576,259호; 및 제7,294,754호; 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotech. 25(1):91-99](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨) 참조)을 이용하여, 완전히 공여자 ES 세포로부터 유래한 F0 세대 마우스를 얻을 수 있다. 정상 상황 및 표준 실험 조건 하에, XY 공여자 ES 세포는 오직 표현형으로 수컷인 완전한 ES 세포 유래 마우스를 생산하는 한편, XX 또는 XO인 ES 세포(Y 염색체를 소실한 XY ES 세포)는 오직 표현형으로 암컷인 완전한 ES 세포 유래 마우스를 생산한다. 수컷 및 암컷 완전한 ES 세포 유래 마우스로부터 동형접합성 표적화된 돌연변이를 가지는 마우스를 생산하는 것은, 상호교잡 때 F2 세대에서 동형접합성 자손을 생산하는 가능성을 가지는, F1 세대 이형접합성 수컷 및 암컷을 처음에 생산하기 위해 교배의 2개의 후속하는 세대를 요한다.
XY 유전자형을 가지는 표현형으로 암컷인 마우스는 특이적 돌연변이의 결과로서 발생할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lovell-Badge et al. (1990) Development 109:635-646]을 참조하고; 또한 문헌[Colvin et al. (2001) Cell 104(6):875-889]을 참조한다. 그러나, 이러한 XY 암컷 마우스는 대개 불임이거나, 매우 제한된 생식력을 가진다.
WO 제2011/156723호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)은, 숙주 배아로의 XY 공여자 세포의 도입 및 적합한 숙주에서의 수태 후, 생식력 있는 XY 암컷 동물이 F0 집단에서 생산될 수 있도록, 배양물 중에 XY 공여자 세포를 유지시키기 위한 암컷화 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 저 삼투질농도 배지 또는 저염 배지)를 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 표적 게놈 유전좌위에서 소정의 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손을 만드는 데 있어서 용도가 발견된다.
본원은 XY 공여자 세포(예를 들어, 표현형으로 수컷인 마우스로부터 유래한 XY 공여자 세포) 및 적합한 숙주 배아로부터 표현형으로 암컷인 생식력 있는 XY 비인간 포유류(예를 들어, 마우스)를 만드는 방법을 제공한다. 상기 방법은 F0 세대에서 이러한 비인간 포유류를 만드는 것을 포함하고, 이것은 F0 세대에서 교배 쌍(수컷 F0 및 암컷 F0)의 형성을 허용한다. 공여자 세포가 이형접합성 유전적 변형을 포함할 때 이는 특히 유용하고, 유전적 변형에 동형접합성인 비인간 포유류가 요망된다. 본 개시내용이 공여자 마우스 XY ES 세포로부터 표현형으로 암컷인 생식력 있는 XY 마우스를 만드는 것의 맥락에서 본 발명을 예시하지만, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 임의의 적합한 비인간 포유류 세포(예를 들어, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포, ES 세포 또는 다능성 세포) 및 임의의 적합한 비인간 포유류 배아로부터 표현형 암컷 XY 생식력 있는 비인간 포유류를 만들도록 적용될 수 있다.
본원은 해부학적으로 정상이고, 생식력 있고, 가임성인, XY F0 암컷의 생산을 촉진하도록 Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형을 가지는 XY 공여자 세포를 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법 및 조성물은 F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY 비인간 동물을 만드는 것을 허용한다. 상기 방법 및 조성물은 조합으로 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형 및/또는 F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY 자손의 백분율을 유의미하게 증가시키도록 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배양 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서의 배양과 조합되어 추가로 이용될 수 있다. 이 표현형으로 암컷인 생식력 있는 XY 비인간 포유류는, 동물에서 배란에 의해 생성된 난자의 수정 시, 달이 찰 때까지 배아를 수태시키고 살아서 태어난 동물을 출생시키는 것을 포함하여, 배란시키고 배아를 수태시키는 충분한 표현형으로 암컷인 특징을 나타내는 비인간 포유류를 포함한다.
효율적인 수컷 대 암컷 성 전환을 위한 방법은 가축 동물 산업에 귀중하다. 예를 들어, 암컷 송아지는 수컷보다 젖소 산업에 훨씬 더 귀중하다. 가금류에도 역시 사실이다. 교배 목적을 위해, 이것이 소 또는 말 또는 양이든지, 많은 암컷을 오직 아주 적은 황소, 수퇘지 또는 숫양과 교배하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 제공된 다양한 방법은 다양한 상업적으로 중요한 교배 산업에서 용도가 발견된다.
II. F0 세대에서 생식력 있는 XY 동물을 만들기 위한 방법 및 조성물
A. F0 세대에서 생식력 있는
XY
암컷을 생산할 수 있는
XY
다능성
또는
전능성
세포를 만드는 방법
XY 유전자형을 가지는 표현형으로 암컷인 동물(예를 들어, 마우스)은 특이적 돌연변이의 결과로서 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Lovell-Badge et al. (1990) Development 109:635-646]을 참조하고; 또한 문헌[Colvin et al. (2001) Cell 104(6):875-889]을 참조한다. 그러나, 이러한 XY 암컷 동물은 대개 불임이거나, 생식력 있는 경우, 매우 불량한 가임능력을 가진다. 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 동물을 생성하는 것의 맥락에서 가장 유용하도록, 성 전환 및 생식력 둘 다는 XY 암컷에서 달성될 필요가 있다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 통해, F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY를 생산할 수 있는, XY 다능성 또는 전능성 동물 세포 또는 배아가 만들어질 수 있다. 이러한 세포(및 시험관내 세포 배양물, 배아 및 이들로부터 유래한 동물)는 Y 염색체의 영역을 침묵화시킴으로써 만들어질 수 있다. 임의로, 세포는 또한 암컷화 배지에서 배양되고/되거나 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형될 수 있다.
i. Y 염색체의 영역의
침묵화
Y 염색체의 영역을 침묵화시켜서, 생식력 있는 암컷 동물을 발생시키는 능력을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로 세포의 몇몇은 전환시키기 위한, XY 동물 세포(예를 들어, XY 다능성 또는 전능성 세포 예컨대 XY ES 세포)를 변형시키기 위한 방법 및 조성물이 제공되고, 그래서 세포는 수혜자 배아로 이식되고, 생식력 있는 암컷 자손을 생성할 수 있다. 따라서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포는 생식력 있는 표현형으로 암컷인 동물을 포함하는 F0 XY 자손을 생산할 수 있다.
침묵화된 영역은 Y 염색체의 임의의 일부, 예컨대 Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부를 포함하는 영역 또는 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지에 의해 처리함으로써 침묵화된 영역일 수 있다. 침묵화는 또한 Y 염색체의 다른 부분(예를 들어, 긴 아암(Yq)), 특히 수컷 생식력 및 정자발생에 필요한 유전자를 보유하는 부분에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 영역은 Sxra 영역의 전부 또는 일부(예를 들어, Sry 유전자를 함유하는 부분)를 포함할 수 있고/있거나, 영역은 마우스 Y 염색체의 Sxrb 영역의 전부 또는 일부(예를 들어, Zfy2 유전자를 함유하는 부분)(도 1A 참조) 또는 다른 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역(예를 들어, 인간 Y 염색체의 AZFa, AZFb 또는 AZFc 영역)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Sxra 및 Sxrb 영역 둘 다의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. Sxrb 영역의 경계는 예를 들어 Zfy1 및 Zfy2이다(도 1A 및 문헌[Mazeyrat et al. (1998) Human Molecular Genetics 7(11):1713-1724](모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨) 참조). 다른 동물 종으로부터의 상응하는 영역은 마우스 Y 염색체 상의 영역에서의 유전자에 이종상동성 또는 상동성인 하나 이상의 유전자를 가지는 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 영역의 AZFa 영역은, 각각의 영역이 Uty, Dby(Ddx3y) 및 Dffry(Usp9y)를 함유한다는 점에서, 마우스 Y 염색체의 Sxrb 영역에 상응한다. 예를 들어, 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol. Med., Jan. 3; 2001: 1-16; Mazeyrat et al. (1998) Human Molecular Genetics 7(11);1713-1724; 및 Sargent et al. (1999) J. Med . Genet. 36:370-377](이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 영역은 또한 Smy 영역 또는 Spy 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(도 1A 및 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol. Med., Jan. 3; 2001: 1-16] 참조). 마찬가지로, 영역은 마우스 Y 염색체의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2, 결실 간격 3, 결실 간격 4, 결실 간격 5, 결실 간격 6 및 결실 간격 7 또는 다른 동물 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1A 및 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol. Med., Jan. 3; 2001: 1-16] 참조). 예를 들어, 영역은 마우스 Y 염색체의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3 또는 다른 동물 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1A 참조). 일 예에서, 영역은 결실 간격 2 및 결실 간격 3, 또는 결실 간격 2의 일부 및 결실 간격 3의 일부를 포함할 수 있다.
영역은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1(표 A 참조). 영역은 Rbmy 클러스터에 대한 텔로머일 수 있거나, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1에 대한 동원체 또는 텔로머일 수 있다. 예를 들어, 영역은 Kdm5d의 텔로머 또는 Uspy9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있거나, 영역은 Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머일 수 있다. 영역은 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 마찬가지로, 영역은 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상의 외부의 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상의 외부의 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있다.
침묵화는 Y 염색체에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질의 수준 및/또는 활성은 감소할 수 있다. 대안적으로, 침묵화는 Y 염색체에 위치한 유전자의 발현을 제거할 수 있다(즉, 유전자는 발현되지 않거나, 세포는 유전자의 검출 가능한 발현이 결여됨). 몇몇 방법에서, 예를 들어 하나 이상의 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상은 침묵화시 발현되지 않는다. 몇몇 방법에서, Ddx3y, Eif2s3y, Uty, Zfy2 및 Sry에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질의 수준 및/또는 활성은 감소하거나, Ddx3y, Eif2s3y, Uty, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상은 발현되지 않는다.
영역의 침묵화는 예를 들어 게놈으로부터의 영역의 제거, 영역 내의 하나 이상의 유전자의 발현의 감소 또는 영역 내의 유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질 또는 RNA의 활성의 감소를 포함할 수 있다. 대상체 세포에서의 발현 또는 활성의 감소는, 적절한 대조군 세포와 비교할 때, 발현 또는 활성 수준의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 발현 또는 활성이 Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 적절한 대조군 세포에서의 발현 또는 활성보다 통계학적으로 더 낮은 경우 발현 또는 활성은 감소한다. 이러한 감소는 Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과의 감소를 포함한다. 통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다. 발현 또는 활성의 감소는 임의의 단계에서의 임의의 기전을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 발현의 감소는 영역에 직접적으로 또는 간접적으로 만들어진 변형을 통해 또는 전사 동안에, 전사 후에, 번역 동안에 또는 번역 후에 발생하는 사건 또는 조절을 통해 발생할 수 있다.
몇몇 경우에, 침묵화된 영역 내에 유전자는 발현되지 않을 수 있다(예를 들어, 발현은 제거되거나, 세포는 유전자의 검출 가능한 발현이 결여됨). 유전자의 전사가 수행되지 않을 때 또는 당해 분야에 공지된 흔한 기법에 의해 유전자의 생성물(예를 들어, mRNA 또는 단백질)의 검출 가능한 수준이 없을 때, 유전자는 발현되지 않는다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, FACS 분석, ELISA), 또는 간접적으로, 예를 들어 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 감소한 발현 및/또는 활성은 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
"대상체 세포"는 유전적 변경, 예컨대 본 명세서에 개시된 유전적 변형이 실행되는 것이거나, 이렇게 변경된 세포로부터 유래하거나 변경을 포함하는 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 감소한 수준 또는 활성을 발생시키는 유전적 변형 또는 돌연변이가 결여된다는 것을 제외하고는, 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 가지는 세포와 가능한 한 가깝게 일치할 수 있다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주로부터 기원할 수 있음). 다른 경우에, 대조군 세포는 예를 들어 (a) 야생형 세포(즉, 대상체 세포를 발생시키는 유전적 변경에 대해 출발 물질과 동일한 유전자형의 것); (b) 무효 작제물(즉, 관심 있는 특질에 미지의 효과를 가지는 작제물, 예컨대 마커 유전자를 함유하는 작제물)에 의해 유전적으로 변형된 출발 물질과 동일한 유전자형의 세포; (c) 대상체 세포(즉, 동일한 세포주로부터 기원한 대조군 세포 및 대상체 세포)의 유전적으로 비변형된 자손인 세포; (d) 대상체 세포와 유전적으로 동일하지만 단백질 수준 및/또는 활성 수준을 변경하는 조건 또는 자극에 노출되지 않은 세포; 또는 (e) 유전적 변형이 단백질 수준 및/또는 활성 수준의 발현을 변경하지 않는 조건 하의 대상체 세포 자체를 포함할 수 있다.
침묵화는 영구적인 유전적 변경 또는 일시적일 수 있다. 영구적인 유전적 변경은 (예를 들어, 추가 변형을 통해) 이것을 역전시키도록 취해지는 예를 들어 추가 단계 없이 있는 변경일 수 있는 한편, 일시적인 변경은, 이것을 역전시키도록 추가 단계가 취해지지 않더라도(예를 들어, 암컷화 배지에서 배양함으로써 달성된 침묵화), 오직 소정의 시간 동안 지속하는 변경일 수 있다. 몇몇 방법에서, 침묵화는 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배지(예를 들어, 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지)에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키는 것 이외의 수단에 의해 달성된다. 다른 방법에서, 침묵화는 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배지(예를 들어, 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가지는 저 삼투질농도 배지 또는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가지는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지)에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배양함으로써 달성된다. 예를 들어, 침묵화는 하기 중 하나 이상에 의해 달성될 수 있다: (1) 표적화된 유전적 변형, 예컨대 영역의 결실 또는 파괴; (2) 영역 내의 하나 이상의 유전자로부터 전사된 mRNA의 안티센스 저해 또는 RNA 간섭; (3) 영역 내의 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 지시된 분해 또는 저해; (4) 이질염색질 매개된 침묵화 또는 Y 염색체 상의 하나 이상의 위치에서의 이질염색질 형성의 변경; (5) Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가; 또는 (6) 영역 내의 하나 이상의 유전자의 전사의 감소. 표적화된 유전적 변형 및 이를 제조하는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다. 침묵화는 저해 핵산, 예컨대 짧은 간섭 핵산(예를 들어, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)) 또는 유전자 전사체에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 또한 달성될 수 있다. 침묵화는 영역 내의 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 저해제의 사용 또는 예를 들어 인산화, 유비퀴틴화 및 수모화를 통해 번역 후 변형에 의한 이의 상류 조절을 통해 또한 달성될 수 있다. Y 염색체 상의 이질염색질 형성의 변경은 또한 침묵화를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 제1 Y 염색체의 영역의 결실은 제2 영역이 동원체의 이질염색질 도메인에 더 가깝게 놓고, 제2 영역의 침묵화를 발생시킬 수 있다. Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 또한 발생시킬 수 있다. 인산화 히스톤 γH2AX는 전사와 연관되는 것으로 공지되어 있고, 감수분열 전기 동안 XY 성 육체에서의 X 및 Y 염색체의 전사 억제와 연관된다. 예를 들어, 문헌[Alton et al. (2008) Reproduction 135:241-252]을 참조한다. 영역 내의 하나 이상의 유전자의 전사의 감소는 Y 염색체의 영역의 침묵화를 또한 발생시킬 수 있다. 하나 이상의 유전자의 전사의 억제는 예를 들어 전사 억제인자 도메인 또는 후성적 변형 도메인에 융합된 DNA 결합 단백질을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, WO 제2014/089290호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨) 참조).
단백질의 감소한 수준 및/또는 활성은 단백질을 코딩하는 유전자 또는 단백질의 수준 또는 활성에 영향을 미치거나 이를 조절하는 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 의해 달성될 수 있다. 이러한 표적화된 변형은 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉아웃, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉인, 이종성 핵산 서열에 의한 외인성 핵산 서열의 대체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드는 표적화된 게놈 변형을 형성하도록 변할 수 있다. 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형을 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 또한, 본 명세서에 기재된 다양한 방법은 단백질을 코딩하는 유전자 또는 다른 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형을 도입하도록 사용될 수 있다.
단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 표적화된 유전적 변형을 만들기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있고, 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
단백질을 코딩하는 유전자 또는 임의의 다른 표적 게놈 유전좌위의 표적화된 유전적 변형이 발생할 수 있는 한편, 세포(예를 들어, ES 세포)는 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배양 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)(예를 들어, XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진하는 배지)에서 유지된다. 반대로, 세포는 본 명세서에 개시된 암컷화 배지가 아닌(예를 들어, 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 저 삼투질농도 배지가 아닌) 배지에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 유전자 또는 다른 표적 게놈 유전좌위의 표적화된 유전적 변형이 발생할 수 있는 한편, 세포는 상이한 배양 배지에서 유지되고, 후속하여 본 명세서에 개시된 암컷화 배양 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)로 전달된다.
단백질의 활성 및/또는 수준은 또한 단백질의 수준 또는 활성을 저해하는 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입함으로써 또한 감소하거나 제거될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 직접적으로 Sry 메신저 RNA의 번역을 방지함으로써 또는 간접적으로 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 저해하는 폴리펩타이드를 코딩함으로써 단백질의 발현을 저해할 수 있다. 대안적으로, 단백질의 활성은 단백질의 활성을 저해하는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 세포로 도입함으로써 감소하거나 제거된다.
단백질의 수준 및/또는 활성은 단백질의 활성 및/또는 수준을 감소시키는 조건 대립유전자의 사용을 통해 또한 조절될 수 있다. 조건 대립유전자는 원하는 발생 시간에 및/또는 관심 있는 원하는 조직 내에 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 가지도록 설계된 단백질을 코딩하는 변형된 유전자를 포함한다. 감소한 수준 및/또는 활성은 조건 대립유전자를 생성시키는 변형이 결여된 대조군 세포와, 또는 이전의 및/또는 이후의 시간에 의한 원하는 발생 시간에 감소한 활성의 경우에, 또는 원하는 조직의 경우에, 모든 조직의 평균 활성과 비교될 수 있다. 예를 들어, 조건 대립유전자는 원하는 발생 시점에서 및/또는 특정한 조직에서 스위칭 오프될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자의 조건 눌 대립유전자를 포함할 수 있다. 이러한 조건 대립유전자는 임의의 유전자 표적화된 클론으로부터 유래한 생식력 있는 XY 암컷을 생성하도록 사용될 수 있다. 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로, 이러한 방법은 F1 세대에서 원하는 동형접합성 유전적 변형의 생성이 가능하게 한다. 이러한 방법은, F2 세대로 교배하지 않으면서, 표현형에 대해 빠르게 살펴보는 것을 제공한다.
조건 대립유전자는 또한 US 제2011/0104799호(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 다기능성 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 이러한 조건 대립유전자는 (i) 액츄에이팅 서열 및 DSC가 결여되고, (ii) 센스 배향의 NSI 및 안티센스 배향의 COIN을 함유하는, 조건 대립유전자를 형성하기 위해, (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 배향의 액츄에이팅 서열, 및 센스 또는 안티센스 배향의 약물 선택 카세트(DSC); (b) 안티센스 배향의 관심 있는 뉴클레오타이드 서열(NSI) 및 조건적 반전 모듈(conditional by inversion module: COIN)(엑손 스플리팅 인트론 및 반전 가능한 유전자포촉 유사 모듈을 사용함)(예를 들어, US 제2011/0104799호(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨) 참조); 및 (c) 제1 재조합효소에 대한 노출 시 재조합하는 재조합 가능한 단위를 포함할 수 있다.
단백질을 코딩하는 유전자의 조건 대립유전자는 임의의 세포형으로 생성될 수 있고, XY 다능성 또는 전능성 세포로 제한되지 않는다. Y 염색체 상의 게놈 유전좌위를 표적화하기 위한 비제한적인 방법과 함께 이러한 세포형은 본 명세서에서 그 외 더 자세히 기재되어 있다.
XY 다능성 또는 전능성 세포가 배양될 때에, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포가 숙주 배아로 도입된 후에 또는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 숙주 배아가 수혜자 암컷 동물로 도입된 후에 침묵화가 발생할 수 있다. 배아 발생의 상이한 단계 동안에 또는 배아 발생에 걸쳐 침묵화가 또한 발생할 수 있다. 몇몇 경우에, 침묵화는 출현 후에 계속된다. 예를 들어, 난모세포가 수정된 후, 처음의 2개 세포 분열에 걸쳐 약간의 침묵화가 유지될 수 있다. 침묵화에 의해 생긴 성 전환은 또한 F1 자손으로 전달될 수 있다. 침묵화가 발생하는 기간의 몇몇 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: (1) 수컷 성 결정 프로그램이 관여할 때 배아 발생 동안에; (2) 마우스에서 E11-E12에 상응하는 적어도 발생 단계(예를 들어, 성 결정 또는 성 전환에 중요한 발생 단계)까지 배아 발생 동안에; (3) 마우스에서 E17-E19에 상응하는 적어도 발생 단계(예를 들어, 배아 난모세포에서의 생식력에 중요한 발생 단계)까지 배아 발생 동안에; (4) 난자형성의 기간에 걸쳐; (5) 출현 직전에 배아에서 시작하는, 난모세포 발생에서의 감수분열 전기 동안에; (6) 난모세포가 수정된 후(예를 들어, 처음의 2개 세포 분열 동안에); 또는 (7) 난모세포 배란 후에 걸쳐 처음의 2개 세포 분열 수정 후에.
ii. 암컷화 배지에서의 배양 및 유지
F0 세대에서 XY 생식력 있는 암컷을 촉진하기 위한 다양한 방법 및 조성물에서 사용된 배양 배지는 이것이 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포, iPS 세포, XY ES 세포, XY iPS 세포 등)를 유지시키게 하는 것이다. 용어 "유지시킨다", "유지시키는" 및 "유지"는 본 명세서에 기재된 다능성 또는 전능성 세포(ES 세포 또는 iPS 세포 포함)의 특징 또는 표현형 중 적어도 하나 이상의 안정한 보존을 의미한다. 이러한 표현형은 다능성 또는 전능성, 세포 형태, 유전자 발현 프로필, 및 세포의 다른 기능 특징을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 용어 "유지시킨다", "유지시키는" 및 "유지"는 또한 배양되는 세포의 증식 또는 세포의 수의 증가를 포함할 수 있다. 상기 용어는 추가로 세포가 다능성이게 하는 배양 조건을 고려하는 한편, 세포는 계속해서 분열하고 수가 증가하거나 그렇지 않을 수 있다. 세포는 다양한 농도의 이산화탄소 중에 배양될 수 있다. 일 예에서, 세포는 5%의 이산화탄소 중에 배양된다.
Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포는 배양물 중에 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포, iPS 세포, XY ES 세포, XY iPS 세포 등)를 성장시키고 유지시키는 데 있어서의 (첨가된 보충제에 의한) 용도에 적합한 당해 분야에 공지된 임의의 기본 배지(예를 들어, DMEM)를 배양함으로써 유지될 수 있다. 이러한 배양된 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포)는 Y 염색체의 영역의 침묵화로 인해 생식력 있는 암컷 동물로 발생한 가능성을 가지고 다능성 또는 전능성을 보유하여서, 세포는 수혜자 배아로 이식되고 생식력 있는 암컷 자손을 생성시킬 수 있다.
1. 암컷화 배지
Y 염색체의 영역의 침묵화는 하기 추가로 정의된 바대로 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배양하거나 유지시킴으로써 달성될 수 있다. 마찬가지로, Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 추가의 변형을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포는 하기 추가로 정의된 바대로 암컷화 배지에서 배양함으로써 또한 유지될 수 있다. 세포를 배지에서 충분한 시간 동안 배양함으로써, 세포는 생식력 있는 암컷 동물로 발생할 가능성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포로 전환될 수 있어서, 세포는 수혜자 배아로 이식되고 생식력 있는 암컷 자손을 생성할 수 있다. WO 제2011/156723호 및 문헌[Kuno et al. (2015) Transgenic Res. 24(1):19-29](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)은, 숙주 배아로의 XY 공여자 세포의 도입 및 적합한 숙주에서의 수태 후, F0 집단에서 생식력 있는 XY 암컷 동물이 생산될 수 있도록, 배양물 중에 XY 공여자 세포를 유지시키기 위한 이러한 암컷화 배양 배지(예를 들어, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 저 삼투질농도 배지 또는 저염 배지)를 사용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 몇몇 이러한 방법에서, 생식력 있는 XY 암컷 동물을 생산하기 위한 특정한 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향은 0% 내지 60%일 수 있고, 이 암컷화 효과는 대조군 비암컷화 배지에서 클론을 재성장시킴으로써 반전될 수 없다. 이러한 F0 XY 암컷은 정상 암컷 외부 및 내부 해부구조를 가질 수 있고, 숙주 배아 기여 없이 및 키메라화 없이 완전히 공여자-세포 유래일 수 있고, 성 장기를 포함하는 모든 조직에서 하나의 X 및 하나의 Y 염색체를 가질 수 있고, 가시적인 염색체 비정상 없이 정상 XY 수컷 핵형을 가질 수 있다. 암컷화 배지에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷은 XX 암컷과 필적하는 생식력 및 가임능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 이러한 방법에서, F0 XY 암컷은 F1 XX 암컷 대조군에 대한 대략 90%와 비교하여 60% 내지 70%의 생식력을 가진다. 몇몇 이러한 방법에서, 9개월 교배 시험에서 F0 XY 암컷과 F1 XX 암컷 사이의 가임능력의 차이가 없다.
암컷화 배지에서의 배양은 Y 염색체 유전자의 억제 또는 침묵화를 발생시킬 수 있다(실시예 1 참조). 예를 들어, Y 염색체의 영역, 예컨대 Y 염색체의 짧은 아암의 전부 또는 일부는 침묵화될 수 있다. 기전의 이해는 실행에서 필요하지 않지만, Y 염색체의 짧은 아암의 침묵화는 Sry 유전자인 수컷 성 결정 경로의 중요한 조절인자로 연장될 수 있고, 이것은 마우스 배아 발생 동안 E11-E12로부터 정확한 시간에 충분히 발현하지 못해서, 양능성 생식 융기에서 암컷 성 결정 프로그램의 발현을 발생시킨다(실시예 1 및 도 2a-d 참조). 다른 유전자, 예컨대 Ddx3y 및 Eif2s3y는 또한 발현할 수 없다(실시예 1 및 도 3 및 도 4 참조). 그때부터, 성 전환된 배아는 암컷으로 분만되고(F0 세대), 이후 이의 XY 유전자형에도 불구하고 정상인 생식력 있는 암컷 마우스로 성장할 수 있다. 몇몇 방법에서, 암컷화 배지 유도된 Y 염색체 침묵화는 영구적인 유전적 변화가 아니고, F1 세대로 계속되지 않는다(즉, F0 XY 암컷의 F1 자손 중에 XY 암컷이 발견되지 않음).
기전의 이해는 실행에서 필요하지 않지만, Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가 및/또는 염색질의 변경은 침묵화에 기여할 수 있다. 인산화 히스톤 γH2AX는 전사 억제와 연관되는 것으로 공지되어 있고, 감수분열 전기 동안 XY 성 육체에서 X 및 Y 염색체의 전사 억제와 연관된다. 예를 들어, 문헌[Alton et al. (2008) Reproduction 135:241-252]을 참조한다.
몇몇 경우에, XY 다능성 또는 전능성 세포에서의 Y 염색체의 초기 암컷화 배지 유도된 침묵화는 클론의 모든 세포에 걸쳐 완전하지 않고, 그래서 클론으로부터 세포에 의해 주사된 몇몇 배아는 정상 수컷으로 발생할 것이다. 이 F0 수컷은 이의 유전적으로 동일한 성 전환된 암컷 클론성 형제자매와 교배되어서 제1 (F1) 세대에서 동형접합성인 유전적으로 변형된 마우스를 생산할 수 있고, 이로써 동형접합성 마우스를 생산하는 데 보통 필요한 교배의 추가의 세대(F2)의 비용 및 시간을 제거한다.
암컷화 배지는 XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진할 수 있다. 따라서, 이러한 배지에서의 배양은, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 세포와 비교할 때, 또는 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고 XY 암컷 마우스를 생산하는 역량이 결여되거나 역량이 감소한 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론과 비교할 때, (예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율, 또는 한배 새끼의 보통 수를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율, 한배 새끼의 크기, 및 생애 새끼를 증가시킬 수 있다.
XY 다능성 또는 전능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 추가 표적 게놈 유전좌위를 변형시키는 것을 포함하는 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 전체 표적화 과정, 예를 들어 전기천공, 약물 내성 콜로니의 선택, 표적화된 돌연변이에 대한 스크리닝, 증식 및 냉동보존에 대해 또는 전체 표적화 과정의 오직 하나 이상의 일부에 대해 암컷화 배지에서 배양될 수 있다. 마찬가지로, 세포는 표적화 과정 전에 및/또는 동안에 및/또는 후에 암컷화 배지에서 배양될 수 있다.
"기본 배지" 또는 "기본 배지들"은 배양물 중에 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포, iPS 세포, XY ES 세포, XY iPS 세포 등)를 성장시키고 유지시키는 데 있어서의 (첨가된 보충제에 의한) 용도에 적합한 예를 들어 당해 분야에 공지된 기본 배지(예를 들어, DMEM)를 포함한다. 생식력 있는 XY 암컷을 만드는 것을 촉진하는 기본 배지(즉, "암컷화 배지"(예를 들어, "저염 배지" 또는 "저 삼투질농도 배지"))는 배양물 중에 ES 세포를 유지시키기 위해 통상적으로 사용되는 기본 배지와 다르다. 일반적으로 기본 배지를 설명할 목적을 위해, 생식력 있는 XY 암컷을 만드는 것을 촉진하지 않는 기본 배지는 이 부문에 및 "DMEM"(예를 들어, 통상적인 DMEM 배지)로서 표 1에 기재되어 있다. 생식력 있는 XY 암컷을 만드는 것을 촉진하는 기본 배지를 설명할 목적을 위해, 구절 "암컷화 배지"(예를 들어, "저염 배지", "저염 DMEM", "저 삼투질농도 배지" 또는 "저 삼투질농도 DMEM")를 사용한다. 배양물(예를 들어, DMEM) 중에 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키기 위해 통상적으로 사용된 기본 배지와 생식력 있는 XY 암컷을 만드는 것을 촉진하는 기본 배지(예를 들어, "암컷화 배지", 예컨대 "저염 DMEM") 사이의 차이는 본 명세서에 설명되어 있다. 구절 "저염 배지"는 편의를 위해 사용되고, 생식력 있는 XY 암컷을 만들기에 적합한 DMEM은 "저염"으로 제한되지 않는 특징을 나타내지만, 본 명세서에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 표 1에 기재된 DMEM은, 표 1에 기재된 DMEM과 비교하여, 상이한 삼투질농도 및 상이한 전도도를 또한 생성시키는, 본 명세서에 제공된 바와 같은 염화나트륨 및/또는 중탄산나트륨 농도를 변경함으로써 생식력 있는 XY 암컷을 만들기에 적합하게 만들어질 수 있다. 기본 배지의 예는 다양한 형태의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(예를 들어, 인비트로젠(Invitrogen) DMEM, 카탈로그 번호 1 1971 -025; 표 1)이다. 적합한 저염 DMEM은 KO-DMEM(상표명)(인비트로젠 카탈로그 번호 10829-018)으로서 상업적으로 구입 가능하다. 기본 배지는 공여자 세포로서 사용하기 위해 배양물 중에 세포를 유지시키기 위해 사용될 때 당해 분야에 공지된 다수의 보충제가 통상적으로 보충된다. 이러한 보충제는 본 개시내용에서 "보충제" 또는 "+ 보충제"로서 표시된다.
"보충제" 또는 구절 "+ 보충제"는 (예를 들어, 배양물 중에 공여자 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기 위한) 배양물 중에 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포 또는 XY iPS 세포)를 성장시키거나 유지시키기 위한 기본 배지에 첨가된 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 배양물 중에 다능성 또는 전능성 세포를 성장시키거나 유지시키기에 적합한 배지 보충제는 소 태아 혈청(FBS), 글루타민, 항생제(들), 페니실린 및 스트렙토마이신(예를 들어, 펜스트렙(penstrep)), 피루베이트 염(예를 들어, 나트륨 피루베이트), 비필수 아미노산(예를 들어, MEM NEAA), 2-머캅토에탄올, 및 백혈병 저해 인자(Leukemia Inhibitory Factor: LIF)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 방법에서, 기본 배지는, 예를 들어 배아로의 주사 및 대리모 마우스로의 자궁내 전달 후 수컷 성 결정 발생 프로그램에 기여하는 감소한 역량을 가지는 XY ES 세포 또는 XY iPS 세포를 포함하는, 다능성 또는 전능성 세포를 배양물 중에 유지시키기에 적합한, 하나 이상의 보충제를 포함한다. 몇몇 세포주에 대해, 배지는 Wnt 순화 배지, 예를 들어 Wnt-3a 순화 배지이다.
예를 들어, 기본 배지는 하기 보충제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: FBS(90㎖의 FBS/0.5ℓ의 기본 배지), 글루타민(2.4mmole/0.5ℓ의 기본 배지), 나트륨 피루베이트(0.6mmole/0.5ℓ의 기본 배지), 비필수 아미노산(0.1mmol/0.5ℓ 미만의 기본 배지), 2-머캅토에탄올, LIF 및 하나 이상의 항생제. 예를 들어 배아로의 주사 및 대리모 마우스로의 자궁내 전달 후 수컷 성 결정 발생 프로그램에 기여하는 감소한 역량을 가지는 XY ES 세포 또는 XY iPS 세포를 포함하는, 다능성 또는 전능성 세포를 배양물 중에 유지시키기 위한 배지의 일 예는 하기 보충제가 첨가된 약 500㎖의 기본 배지를 포함한다: 약 90㎖의 FBS(예를 들어, Hyclone FBS 카탈로그 번호 SH30070.03), 약 2.4밀리몰의 글루타민(예를 들어, 약 12㎖의 200mM 글루타민 용액, 예를 들어 인비트로젠 카탈로그 번호 25030-081, 페니실린:스트렙토마이신(예를 들어, 60,000단위의 페니실린 G 나트륨 및 60㎎의 황산 스트렙토마이신과 함께 약 51㎎의 NaCl; 예를 들어, 약 6㎖의 인비트로젠 pennstrep, 카탈로그 번호 15140-122), 약 0.6밀리몰의 나트륨 피루베이트(예를 들어, 6㎖의 100mM 나트륨 피루베이트, 인비트로젠 카탈로그 번호 1 1360-070), 약 0.06밀리몰의 비필수 아미노산(예를 들어, 약 6㎖의 MEM NEAA, 예를 들어 인비트로젠 카탈로그 번호 1 1 140-050으로부터의 MEM NEAA), 약 1.2㎖의 2-머캅토에탄올 및 약 1.2마이크로그램의 LIF(예를 들어, LIF 제제 1㎖당 106단위의 약 120마이크로리터; 예를 들어, 약 120마이크로리터의 밀리포어(Millipore) ESGRO(상표명)-LIF, 카탈로그 번호 ESG1 107). 생식력 있는 XY 암컷을 만들기 위해 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 또는 XY iPS 세포)를 유지시키기 위한 기본 배지를 구성할 때, 통상적으로 거의 동일한 양의 동일한 보충제를 사용하지만, 기본 배지의 조성은 (DMEM, 예를 들어 표 1에 기재된 배지와) 다를 것이고, 그 차이(는)는 본 명세서에 교시된 차이(는)에 상응한다.
삼투질농도, 전도도, 염 농도, 알칼리 금속 및 할라이드의 염의 농도, 탄산염의 농도, 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도, 및 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 몰 비를 포함하는 암컷화 배지의 다른 특징은 변경될 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 저염 배지(예를 들어, 85 내지 130mM(약 5.0 내지 7.6㎎/㎖)의 NaCl 농도를 가지는 저염 DMEM), 저 삼투질농도 배지(예를 들어, 250 내지 310mOsm/㎏ 또는 218 내지 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지는 저 삼투질농도 DMEM) 또는 저전도도 배지(예를 들어, 11 내지 13mS/㎝의 전도도를 가지는 저전도도 DMEM)일 수 있다.
기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지의 삼투질농도는 예를 들어 약 320 이하, 310, 300, 290, 280, 275, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 또는 200mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지의 삼투질농도는 예를 들어 약 340mOsm/㎏ 또는 330mOsm/㎏ 이하일 수 있다. 임의로, 기본 배지는 약 340 이하, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 275, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 또는 200mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 삼투질농도는 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 보충제의 기본 배지에 대한 첨가 시 1% 초과, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%로 변하지 않는다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 200 내지 329, 218 내지 322, 240 내지 320, 250 내지 310, 275 내지 295, 또는 260 내지 300mOsm/㎏의 삼투질농도를 포함할 수 있다. 임의로, 기본 배지는 약 200 내지 329, 218 내지 322, 240 내지 320, 250 내지 310, 275 내지 295, 또는 260 내지 300mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 삼투질농도는 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 보충제의 기본 배지에 대한 첨가 시 1% 초과, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%로 변하지 않는다. 대안적으로, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 214, 약 216, 약 200 내지 322, 약 200 내지 340, 약 200 내지 292, 약 214 내지 322, 약 216 내지 322, 약 218 내지 322, 약 214 내지 332, 약 216 내지 332, 또는 약 218 내지 332mOsm/㎏의 삼투질농도를 포함할 수 있다. 임의로, 기본 배지는 약 214, 약 216, 약 200 내지 322, 약 200 내지 340, 약 200 내지 292, 약 214 내지 322, 약 216 내지 322, 약 218 내지 322, 약 214 내지 332, 약 216 내지 332, 또는 약 218 내지 332mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 삼투질농도는 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 보충제의 기본 배지에 대한 첨가 시 1% 초과, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%로 변하지 않는다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 270mOsm/㎏ 또는 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 포함할 수 있다. 대안적으로, 삼투질농도는 218 ± 22mOsm/㎏, 261 ± 26mOsm/㎏, 294 ± 29mOsm/㎏, 또는 322 ± 32mOsm/㎏일 수 있다. 대안적으로, 삼투질농도는 약 216 또는 214mOsm/㎏ 또는 216 ± 22mOsm/㎏ 또는 214 ± 22mOsm/㎏일 수 있다. 임의로, 기본 배지는 약 270mOsm/㎏, 약 218mOsm/㎏, 216mOsm/㎏, 214mOsm/㎏, 218 ± 22mOsm/㎏, 261 ± 26mOsm/㎏, 294 ± 29mOsm/㎏, 322 ± 32mOsm/㎏, 216 ± 22mOsm/㎏, 또는 214 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도를 가지고, 삼투질농도는 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 보충제의 기본 배지에 대한 첨가 시 1% 초과, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25%로 변하지 않는다.
기본 배지의 전도도 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 예를 들어 약 10.0 이하, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 또는 14.0mS/㎝일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 10-14mS/㎝ 이하, 약 11 내지 13mS/㎝, 또는 약 12 내지 13mS/㎝의 전도도를 나타낼 수 있다.
기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지의 pH는 예를 들어 약 6.9 내지 약 7.5, 약 6.98 내지 약 7.41, 약 7.0 내지 약 7.4, 약 7.05 내지 약 7.35, 약 7.1 내지 약 7.3, 약 7.15 내지 약 7.25, 약 7.18 내지 약 7.22, 약 7.19 내지 약 7.23, 또는 약 7.2 내지 약 7.22일 수 있거나, pH는 약 7.21, 약 7.17, 약 7.38, 약 6.99, 약 6.98, 약 7.40, 약 7.41, 약 7.34, 또는 약 7.37일 수 있다.
몇몇 배지는 알칼리 금속 및 할라이드의 염, 예컨대 NaCl의 농도를 나타낸다. 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 알칼리 금속 및 할라이드의 염의 농도는 예를 들어 약 100 이하, 90, 80, 70, 60, 또는 50mM일 수 있다. 예를 들어, NaCl에 대해, 기본 배지 또는 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 농도는 예를 들어 약 5.8 이하, 5.3, 4.7, 4.1, 3.5, 또는 2.9㎎/㎖일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 50 내지 110, 60 내지 105, 70 내지 95, 80 내지 90, 90, 또는 85mM의 알칼리 금속 및 할라이드의 염의 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, NaCl에 대해, 기본 배지 또는 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 농도는 예를 들어 약 2.9 내지 6.4, 3.5 내지 6.1, 4.1 내지 5.6, 4.7 내지 5.3, 5.3, 또는 5.0㎎/㎖일 수 있다. 대안적으로, 알칼리 금속 및 할라이드의 염의 농도는 50 ± 5mM, 87 ± 5mM, 110 ± 5mM, 약 3㎎/㎖, 약 5.1㎎/㎖, 또는 약 6.4㎎/㎖일 수 있다.
몇몇 배지는 탄산의 염(탄산염), 예컨대 나트륨염(예를 들어, 중탄산나트륨)의 농도를 나타낸다. 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 탄산의 염의 농도는 예를 들어 45 이하, 40, 35, 30, 25, 또는 20mM일 수 있다. 예를 들어, 중탄산나트륨에 대해, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 농도는 예를 들어 3.8 이하, 3.4, 2.9, 2.5, 2.1, 또는 1.7㎎/㎖일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 10 내지 40, 18 내지 44, 17 내지 30, 18 내지 26, 13 내지 25, 20 내지 30, 25 내지 26, 18, 또는 26mM의 기본 배지 중의 탄산염의 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중탄산나트륨에 대해, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 농도는 예를 들어 약 0.8 내지 3.4, 1.5 내지 3.7, 1.4 내지 2.5, 1.5 내지 2.2, 1.1 내지 2.1, 1.7 내지 2.5, 2.1 내지 2.2, 1.5, 또는 2.2㎎/㎖일 수 있다. 대안적으로, 탄산염의 농도는 18 ± 5mM, 26 ± 5mM, 약 1.5㎎/㎖, 또는 약 2.2㎎/㎖일 수 있다.
기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 농도의 합은 예를 들어 140 이하, 130, 120, 110, 100, 90, 또는 80mM일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 80 내지 140, 85 내지 130, 90 내지 120, 95 내지 120, 100 내지 120, 또는 115mM의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 농도 합을 포함할 수 있다.
기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지 중의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 몰 비는 예를 들어 2.5 초과일 수 있다. 예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 2.6 내지 4.0, 2.8 내지 3.8, 3.0 내지 3.6, 3.2 내지 3.4, 3.3 내지 3.5, 또는 3.4의 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 몰 비를 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 일 예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다: (a) 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도; (b) 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도; (c) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (d) 약 17mM 내지 약 30mM의 탄산염 농도; 및 (e) 약 85mM 내지 약 130mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도 또는 약 11mS/㎝ 내지 약 13mS/㎝의 전도도를 가지르 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다: (a) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염; (b) 약 17mM 내지 약 30mM의 농도의 탄산염; 및 (c) 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도. 예를 들어, 기본 배지는 약 2.9 내지 6.4㎎/㎖의 농도의 NaCl을 포함할 수 있고/있거나, 약 1.4 내지 2.5㎎/㎖의 농도의 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다: (a) 약 50mM 내지 약 110mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드의 염(예를 들어, NaCl); (b) 약 18mM 내지 약 44mM 또는 약 18mM 내지 약 26mM의 농도의 탄산염(예를 들어, NaHCO3); 및 (c) 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도. 예를 들어, 기본 배지는 약 2.9 내지 6.4㎎/㎖의 농도의 NaCl을 포함할 수 있고/있거나, 약 1.5 내지 3.7㎎/㎖ 또는 1.5 내지 2.2㎎/㎖의 농도의 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218mOsm/㎏ 내지 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 하기 특징 중 하나 이상을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다: (a) 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도; (b) 약 11 내지 13mS/㎝의 전도도; (c) 약 60 내지 105mM의 농도의 알칼리 금속 및 할라이드 염; (d) 약 20 내지 30mM의 탄산염 농도; 및 (e) 약 85 내지 130mM 이하의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 12 내지 13mS/㎝의 전도도 및 약 260 내지 300mOsm/㎏의 삼투질농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 12 내지 13mS/㎝의 전도도 및 약 260 내지 300mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 약 70 내지 95mM(즉, 약 4.1 내지 5.6㎎/㎖)의 농도의 염화나트륨 또는 약 90mM의 NaCl(즉, 약 5.3㎎/㎖)을 추가로 포함한다. 임의로, 기본 배지는 약 35mM 미만(즉, 약 2.9㎎/㎖) 또는 약 20 내지 30mM(즉, 약 1.7 내지 2.5㎎/㎖)의 농도의 중탄산나트륨을 추가로 포함한다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도 및 약 60 내지 105mM의 알칼리 금속 및 할라이드의 염의 농도를 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 3.5 내지 6.1㎎/㎖ NaCl을 포함할 수 있거나, 기본 배지는 약 3.5 내지 6.1㎎/㎖ NaCl을 포함할 수 있고, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 250 내지 310mOsm/㎏의 삼투질농도를 가진다. 임의로, 기본 배지는 약 20 내지 30mM의 탄산의 염의 농도를 포함한다. 예를 들어, 기본 배지는 약 1.7 내지 2.5㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 임의로, 알칼리 금속 및 할라이드의 염 및 탄산의 염의 농도의 합은 약 80 내지 140mM이다. 임의로, 기본 배지의 전도도는 약 12 내지 13mS/㎝이다. 대안적으로, 기본 배지의 전도도 및 보충제를 포함하는 배지는 약 12 내지 13mS/㎝이다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 50 ± 5mM NaCl 및 약 26 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 2.6 내지 3.2㎎/㎖ NaCl 및 약 1.8 내지 2.6㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 218mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 87 ± 5mM NaCl 및 약 18 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 4.8 내지 5.4㎎/㎖ NaCl 및 약 1.1-1.9㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 261 ± 26mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 261mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 1.5㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 261mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 294 ± 29mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 110 ± 5mM NaCl 및 약 18 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 294 ± 29mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 6.1 내지 6.7㎎/㎖ NaCl 및 약 1.1-1.9㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 294 ± 29mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 294mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 6.4㎎/㎖ NaCl 및 약 1.5㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 294mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 270 ± 27mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 87 ± 5mM NaCl 및 약 26 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 270 ± 27mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 4.8 내지 5.4㎎/㎖ NaCl 및 약 1.8 내지 2.6㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 270 ± 27mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 270mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 270mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 기본 배지는 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 275mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 기본 배지는 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 268mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 기본 배지는 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 280mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 322 ± 32mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 87 ± 5mM NaCl, 약 26 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨) 및 약 86 ± 5mM 글루코스를 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 322 ± 32mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 4.8 내지 5.4㎎/㎖ NaCl 및 약 1.8 내지 2.6㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 322 ± 32mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 5.1㎎/㎖ NaCl, 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨 및 약 15.5㎎/㎖ 글루코스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 322mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도로 50 ± 5mM NaCl 및 26 ± 5mM 탄산염을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 2.6 내지 3.2㎎/㎖ NaCl 및 약 1.8 내지 2.6㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 218 ± 22mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 218mOsm/㎏의 삼투질농도로 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있다. 대안적으로, 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 대안적으로, 기본 배지는 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 216mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 대안적으로, 기본 배지는 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 2.2㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 214mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 50 ± 5mM NaCl 및 약 44 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 238 ± 24mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 2.6 내지 3.2㎎/㎖ NaCl 및 약 3.3 내지 4.1㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 238 ± 24mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 3.7㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 238mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 87 ± 5mM NaCl 및 약 44 ± 5mM 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 288 ± 29mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 배지는 약 4.8 내지 5.4㎎/㎖ NaCl 및 약 3.3 내지 4.1㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 288 ± 29mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 예를 들어, 기본 배지는 약 5.1㎎/㎖ NaCl 및 약 3.7㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함할 수 있고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 288mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 임의로, 기본 배지는 4.5㎎/㎖ 글루코스를 추가로 포함할 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 3㎎/㎖ NaCl 및 약 1.5㎎/㎖ 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 203mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 44mM 중탄산나트륨(즉, 약 3.7㎎/㎖)을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 290mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 26mM(즉, 약 2.2㎎/㎖) 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 264mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 18mM (즉, 약 1.5㎎/㎖) 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 292mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다. 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 또 다른 예는 약 18mM (즉, 약 1.5㎎/㎖) 중탄산나트륨을 포함하는 기본 배지를 포함하는 배지이고, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 251mOsm/㎏의 삼투질농도를 가질 수 있다.
사용될 수 있는 다른 배지는 본 명세서에 개시된 바와 같은 NaHCO3 농도(예를 들어, 약 44mM, 26mM 또는 18mM)를 가지고, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 나트륨 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올, 2mM L-글루타민, 50㎍/㎖의 각각의 페니실린 및 스트렙토마이신(LifeTech), 15% FBS(Hyclone) 및 2000U/㎖ LIF(밀리포어)에 의해 보충된 고 글루코스 DMEM 배지(LifeTech)를 포함한다.
암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)의 다른 예는 WO 2011/156723, US 2011/0307968, 및 US 2015/0067901(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 암컷화 배지의 또 다른 예는 문헌[Kuno et al. (2015) Transgenic Res. 24(1):19-29](모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
2. 생식력 있는
XY
암컷 동물을 생산하는 증대된 역량을 가지는
XY
다능성
또는 전능성 세포 또는 클론의 선택
F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론의 성향을 결정하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향은 이들 클론에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 또는 활성과 역으로 상관된다. 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서의 이들 유전자 중 하나 이상의 발현의 소실은 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰되는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 침묵화가 더 많을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 마찬가지로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서의 이들 유전자 중 하나 이상의 활성의 소실 또는 발현 및/또는 활성의 감소는 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰되는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현이 더 낮을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 즉, 이들 유전자 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 XY 암컷 생산을 예측하기 위한 대리 마커일 수 있다.
이 정보는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 높은 성향을 가지는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포)의 집단이 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 유지될 때, 이러한 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 하나 이상의 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 평가하는 단계 및 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있고, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 이러한 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 Ddx3y, Uty, Eif2s3y, Ddx3y 및 Uty, Ddx3y 및 Eif2s3y, Uty 및 Eif2s3y, 또는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현 및/또는 활성을 가질 수 있다.
공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 이후 숙주 배아로 도입될 수 있고, 숙주 배아는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 숙주 배아는 상실기전 배아일 수 있고, 숙주 배아는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 도입 시 포배기로 배양될 수 있다. 동물, 배아, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배아로 도입하는 방법 및 F0 동물을 생산하는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
암컷화 배지(예를 들어, 배양물 중에 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제, 여기서 기본 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 포함함) 및 이러한 배지에서 세포를 유지시키는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 전에 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 다양한 시간 동안 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 이하 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 몇몇 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 배아로의 세포의 주사까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다. 다른 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포가 주사된 배아는 대리모로 전달될 때까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다.
평가 단계는 클론 자체를 평가하는 단계 및 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 또는 활성의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 예를 들어 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 이의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 서브클론의 백분율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 서브클론 중에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 필적하는 발현 및/또는 활성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있다. 대안적으로, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 예를 들어, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 검출 가능한 발현의 결여가 존재할 수 있다.
발현은 단백질 수준 또는 mRNA 수준에서 평가될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, FACS 분석, ELISA), 또는 간접적으로, 예를 들어 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 감소한 발현 및/또는 활성은 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(Next Generation Sequencing: NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현은 RT-PCR, RNA-seq, 디지털 PCR, 또는 mRNA 수준을 측정하기 위한 임의의 다른 적합한 방법에 의해 mRNA 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 예로서, RNA 수준은 대조군 유전자, 예컨대 B2m에 대해 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 경우에, 예를 들어 대조군 유전자(예를 들어, B2m)와 표적 유전자 사이의 ΔCt는 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 또는 적어도 8일 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 경우에, 30회, 31회, 32회, 33회, 34회, 35회, 36회, 37회, 38회, 39회 또는 40회 사이클 후 표적 유전자에 대한 검출 가능한 RNA가 없을 것이다.
임의로, mRNA 또는 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정할 때, Y 염색체의 존재를 확인하도록 대조군 실험을 수행할 수 있다. 예를 들어, Y 염색체 상의 상이한 게놈 서열에 프로브를 사용함으로써 Y 염색체의 하나의 카피의 존재를 확인하도록 TAQMAN(등록상표) 카피 수 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 게놈 내의 카피 수 변이를 측정하도록 설계된다.
유전자 또는 이것이 대상체 세포, 배아 또는 동물에서 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성의 감소는, 적절한 대조군 세포, 배아 또는 동물, 또는 대조군 세포, 배아 또는 동물의 집단과 비교할 때, 발현 또는 활성 수준의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 발현 또는 활성이 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 적절한 대조군 세포, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물(예를 들어, 동물 XY 다능성 세포)(암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고 역사적으로 전부 수컷 마우스를 생산하는 동물 XY 다능성 세포)에서의 발현 또는 활성보다 통계학적으로 더 낮은 경우 발현 또는 활성은 감소한다. 이러한 감소는 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과의 감소를 포함한다. 통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다. 발현 또는 활성의 감소는 임의의 단계에서의 임의의 기전을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 발현의 감소는 전사 동안에, 전사 후에, 번역 동안에 또는 번역 후에 발생하는 사건 또는 조절을 통해 발생한다.
"대상체 세포"는 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양된 것이거나, 암컷화 배지에서 배양된 세포로부터 유래한 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 암컷화 배지에서 배양되지 않거나, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, XY 암컷 마우스를 생산하는 역량이 결여되거나 역량의 감소를 가진다는 것을 제외하고는, 바람직하게는 대상체 세포와 가능한 한 가깝게 일치한다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원할 수 있거나, 동일한 유전자형을 가질 수 있음). 예를 들어, 대조군 세포는 (a) 대상체 세포와 동일한 유전자형의 세포, 또는 대상체 세포와 동일한 세포주 또는 클론으로부터 기원하지만 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 것(예를 들어, DMEM, 또는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 역량을 이것에 제공함으로써 세포를 변경하지 않는 또 다른 유형의 배지); (b) 대상체 세포와 유전적으로 동일하거나, 동일한 세포주 또는 클론으로부터 유래하지만 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생성시키는 가능성을 이것에 제공하는 조건 또는 자극에 노출되거나 유전적으로 변경되지 않은, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포; 및 (c) 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양되지만, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, 역사적으로 전부 수컷 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 및 전능성 세포를 포함할 수 있다.
몇몇 실험에서, 집단 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포) 또는 클론은 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 유지되고, 2개 이상의 세포 또는 클론은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 평가된다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 세포 또는 클론은 이후 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론인 것으로 선택될 수 있고, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다.
Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 것은 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 더 높은 백분율, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 생애 한배 새끼의 더 높은 평균 수 및 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 더 높은 평균 한배 새끼 크기를 발생시킬 수 있다. 이러한 F0 자손은 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 숙주 배아로의 세포의 도입 및 숙주 배아의 수태 후에 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 생산될 수 있다.
증가는 적절한 대조군과 비교할 때 임의의 통계학적으로 유의미한 증가일 수 있다. 예를 들어, 증가는 적절한 대조군과 비교할 때 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배일 수 있다.
예를 들어, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
(예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론의 성향을 결정하기 위한 키트가 또한 제공된다. 이러한 키트는 예를 들어 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상에 대한 검출 시약을 포함할 수 있다. 검출 시약은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성 수준을 측정할 수 있다. 예를 들어, 검출 시약은 동물 다능성 또는 전능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상으로부터의 mRNA 또는 단백질 발현의 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검출 시약은 동물 다능성 또는 전능성 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 세트 및/또는 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다.
이러한 키트는 또한 라벨을 포함할 수 있다. 키트는 통상적으로 키트의 사용을 위한 지시를 제공하는 라벨링을 함유한다. 라벨링은 일반적으로 이의 제조, 수송, 판매 또는 사용 동안의 임의의 시간에 키트에 부착되거나 달리 키트를 동반하는 임의의 서면 또는 기록 자료를 의미한다. 예를 들어, 용어 라벨링은 광고 리플렛 및 브로셔, 포장 자료, 설명서, 오디오 또는 비디오 카세트, 컴퓨터 디스크, 및 키트에 직접 인쇄된 서면을 포함한다.
이러한 키트는 검출 시약을 사용하고, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론의 예측된 성향과 검출을 상관시키기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
iii. Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형
Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포는, 세포가 수혜자 배아로 이식되고 생식력 있는 암컷 자손을 생성시킬 수 있도록, 생식력 있는 암컷 동물을 발생시킬 가능성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포로 몇몇 세포를 전환하도록 Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 발생시키는 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 세포는 Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 발생시키는 유전적 변형을 포함할 수 있거나, Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 발생시키는 유전적 변형을 포함하지 않을 수 있도록 있다. "성 결정 영역 Y" 단백질 또는 "Sry" 단백질은 DNA 결합 단백질의 고 이동 기(high mobility group: HMG)-박스 패밀리의 구성원인 전사 인자이다. Sry는 수컷 성 결정을 개시시키는 고환 결정 인자이다. 마우스(수탁 번호 Q05738); 랫트(유전자은행: CAA61882.1) 인간(수탁 번호 Q05066); 고양이(수탁 번호 Q67C50) 및 말(수탁 번호 P36389)(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)로부터의 것을 포함하는 유기체의 변종으로부터의 Sry 단백질의 서열이 공지되어 있다.
Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 XY 다능성 또는 전능성 세포를 변형시키는 것을 통해 F0 세대에서 표현형 암컷 XY 동물을 만드는 방법은 WO 제2015/200805호 및 US 제2015/0376651호(이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 몇몇 유전적 배경(예를 들어, C57BL/6 균주로부터의 Y 염색체를 가지는 VGB6 마우스 ES 세포주를 사용하는 것)에서, Sry의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 ES 세포를 변형시키는 것 및 F0 마우스를 생산하도록 이러한 세포를 사용하는 것은 표현형으로 암컷인 F0 XY 마우스를 발생시키지만, 모든 마우스는 생식력 없거나 불임이다. 이 불임 또는 매우 제한된 생식력은 또한 다른 것에 의해 보고되었다. 예를 들어, 문헌[Kato et al. (2013) Scientific Reports 3:3136 및 Vernet et al. (2014) Development 141:855-866]을 참조한다. 그러나, 다른 유전적 배경(예를 들어, 129 균주로부터의 Y 염색체를 가지는 VGF1 마우스 ES 세포주를 사용하는 것)에서, Sry의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 ES 세포를 변형시키는 것 및 F0 마우스를 생산하도록 이러한 세포를 사용하는 것은 대부분 생식력 있는 표현형으로 암컷인 F0 XY 마우스를 발생시킨다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 암컷화 배지에서 이 VGF1 세포를 추가로 배양함으로써, 표현형으로 암컷인 F0 XY 마우스의 훨씬 더 높은 백분율은 생식력 있을 수 있다. WO 제2015/200805호 및 US 제2015/0376651호(이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
Sry의 감소한 수준 및/또는 활성을 발생시키는 유전적 변형뿐만 아니라 Y 염색체의 추가 영역의 침묵화를 포함하도록 XY 다능성 또는 전능성 세포를 변형시키는 것은 (예를 들어, XY F0 암컷 생산을 증가시킴으로써 및/또는 XY F0 암컷의 생식력 및/또는 가임능력을 추가로 증가시킴으로써) XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진할 수 있다. 이러한 변형의 조합은, Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 발생시키는 유전적 변형이 없는 XY 다능성 또는 전능성 세포와 비교할 때, (예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율, 또는 한배 새끼의 보통 수 및 한배 새끼의 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율을 증가시킬 수 있다.
일반적으로, Sry 단백질의 단백질 수준 및/또는 활성 수준이 Sry 단백질의 발현 및/또는 활성을 저해하도록 유전적으로 변형되거나 돌연변이되지 않은 적절한 대조군 세포에서의 Sry의 단백질 수준보다 통계학적으로 낮은 경우, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성은 감소한다. 예를 들어, Sry 단백질의 농도 및/또는 활성은 Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 가지도록 변형되지 않은 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과로 감소한다.
"대상체 세포"는 유전적 변경, 예컨대 본 명세서에 개시된 유전적 변형이 실행되는 것이거나, 이렇게 변경된 세포로부터 유래하거나 변경을 포함하는 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 감소한 활성을 발생시키는 유전적 변형 또는 돌연변이가 결여된다는 것을 제외하고는, 감소한 Sry 활성을 가지는 세포와 가능한 한 가깝게 일치할 수 있다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주로부터 기원할 수 있음). 다른 경우에, 대조군 세포는 예를 들어 (a) 야생형 세포(즉, 대상체 세포를 발생시키는 유전적 변경에 대해 출발 물질과 동일한 유전자형의 것); (b) 무효 작제물(즉, 관심 있는 특질에 미지의 효과를 가지는 작제물, 예컨대 마커 유전자를 함유하는 작제물)에 의해 유전적으로 변형된 출발 물질과 동일한 유전자형의 세포; (c) 대상체 세포(즉, 동일한 세포주로부터 기원한 대조군 세포 및 대상체 세포)의 유전적으로 비변형된 자손인 세포; (d) 대상체 세포와 유전적으로 동일하지만 Sry 단백질 수준 및/또는 활성 수준을 변경하는 조건 또는 자극에 노출되지 않은 세포; 또는 (e) 유전적 변형이 Sry 단백질 수준 및/또는 활성 수준의 발현을 변경하지 않는 조건 하의 대상체 세포 자체를 포함할 수 있다.
Sry 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 Sry 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써, 또는 간접적으로, 예를 들어 Sry 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. Sry 단백질의 활성을 결정하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
다른 경우에, Sry 폴리펩타이드의 활성 및/또는 수준을 감소시키는 표적화된 유전적 변형을 가지는 세포는 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 선택될 수 있다.
Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성은 Sry 단백질의 수준 또는 활성에 영향을 미치거나 이를 조절하는 Sry 유전자 또는 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 의해 달성될 수 있다. 이러한 표적화된 변형은 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉아웃, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉인, 이종성 핵산 서열에 의한 외인성 핵산 서열의 대체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드는 표적화된 게놈 변형을 형성하도록 변할 수 있다. 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형을 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 또한, 본 명세서에 기재된 다양한 방법은 Sry 유전자 또는 다른 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형을 도입하도록 사용될 수 있다.
Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 표적화된 유전적 변형을 만들기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있고, 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
Sry 유전자 또는 임의의 다른 표적 게놈 유전좌위의 표적화된 유전적 변형이 발생할 수 있는 한편, 세포(예를 들어, ES 세포)는 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배양 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)(예를 들어, XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진하는 배지)에서 유지된다. 대안적으로, Sry 유전자 또는 다른 표적 게놈 유전좌위의 표적화된 유전적 변형이 발생할 수 있는 한편, 세포는 상이한 배양 배지에서 유지되고, 임의로 후속하여 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배양 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)(예를 들어, XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진하는 배지)로 전달된다.
Sry 폴리펩타이드의 활성 및/또는 수준은 또한 Sry 폴리펩타이드의 수준 또는 활성을 저해하는 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입함으로써 또한 감소하거나 제거될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 직접적으로 Sry 메신저 RNA의 번역을 방지함으로써 또는 간접적으로 Sry 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 저해하는 폴리펩타이드를 코딩함으로써 Sry 폴리펩타이드의 발현을 저해할 수 있다. 대안적으로, Sry 폴리펩타이드의 활성은 Sry 폴리펩타이드의 활성을 저해하는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 세포로 도입함으로써 감소하거나 제거된다.
Sry 단백질의 수준 및/또는 활성은 Sry 단백질의 활성 및/또는 수준을 감소시키는 조건 Sry 대립유전자의 사용을 통해 또한 조절될 수 있다. "조건 Sry 대립유전자"는 원하는 발생 시간에 및/또는 관심 있는 원하는 조직 내에 Sry 단백질의 감소한 수준 및/또는 활성을 가지도록 설계된 변형된 Sry 유전자를 포함한다. 감소한 수준 및/또는 활성은 조건 대립유전자를 생성시키는 변형이 결여된 대조군 세포와, 또는 이전의 및/또는 이후의 시간에 의한 원하는 발생 시간에 감소한 활성의 경우에, 또는 원하는 조직의 경우에, 모든 조직의 평균 활성과 비교될 수 있다. 예를 들어, 조건 Sry 대립유전자는 원하는 발생 시점에서 및/또는 특정한 조직에서 스위칭 오프될 수 있는 Sry의 조건 눌 대립유전자를 포함할 수 있다. 이러한 조건 대립유전자는 임의의 유전자 표적화된 클론으로부터 유래한 생식력 있는 XY 암컷을 생성하도록 사용될 수 있다. 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로, 이러한 방법은 F1 세대에서 원하는 동형접합성 유전적 변형의 생성이 가능하게 한다. 이러한 방법은, F2 세대로 교배하지 않으면서, 표현형에 대해 빠르게 살펴보는 것을 제공한다.
조건 Sry 대립유전자는 또한 US 제2011/0104799호(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 다기능성 대립유전자일 수 있다. 예를 들어, 이러한 조건 대립유전자는 (i) 액츄에이팅 서열 및 DSC가 결여되고, (ii) 센스 배향의 NSI 및 안티센스 배향의 COIN을 함유하는, 조건 대립유전자를 형성하기 위해, (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 배향의 액츄에이팅 서열, 및 센스 또는 안티센스 배향의 약물 선택 카세트(DSC); (b) 안티센스 배향의 관심 있는 뉴클레오타이드 서열(NSI) 및 조건적 반전 모듈(conditional by inversion module: COIN)(엑손 스플리팅 인트론 및 반전 가능한 유전자포촉 유사 모듈을 사용함)(예를 들어, US 제2011/0104799호(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨) 참조); 및 (c) 제1 재조합효소에 대한 노출 시 재조합하는 재조합 가능한 단위를 포함할 수 있다.
Sry 유전자의 조건 대립유전자는 임의의 세포형으로 생성될 수 있고, XY 다능성 또는 전능성 세포로 제한되지 않는다. Y 염색체 상의 게놈 유전좌위를 표적화하기 위한 비제한적인 방법과 함께 이러한 세포형은 본 명세서에서 그 외 더 자세히 기재되어 있다.
iv. 조합
Y 염색체의 영역을 침묵화시키기 위해 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 변형시키기 위해 제공된 방법 및 조성물은 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법 및/또는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법과 조합될 수 있다. 마찬가지로, 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법은 Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 변형시키기 위해 제공된 방법 및 조성물 및/또는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법과 조합될 수 있다. XY 다능성 또는 전능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
XY 다능성 또는 전능성 세포가 암컷화 배지에서 배양되는 방법에서, 세포는 전체 침묵화 과정에 대해 또는 전체 침묵화 과정의 오직 하나 이상의 부분에 대해 암컷화 배지에서 배양될 수 있다. 즉, XY 다능성 또는 전능성 세포가 암컷화 배지에서 배양되고, Y 염색체의 영역이 또 다른 침묵화 과정에 의해 침묵화되는 방법에서, 세포는 전체 침묵화 과정에 대해 또는 전체 침묵화 과정의 오직 하나 이상의 부분에 대해 암컷화 배지에서 배양될 수 있다. 마찬가지로, 세포는 침묵화 과정 전에 및/또는 동안에 및/또는 후에 암컷화 배지에서 배양될 수 있다. 암컷화 배지에서 세포를 유지시키는 것 및 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 것의 둘 다를 추가로 포함하는 방법에서, 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 전체 과정에 대해 또는 상기 과정의 오직 하나 이상의 부분에 대해 암컷화 배지에서 배양될 수 있다. 마찬가지로, 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 과정 전에 및/또는 동안에 및/또는 후에 암컷화 배지에서 배양될 수 있다.
암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법과의 몇몇 이러한 조합에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 유지될 수 있지만, Y 염색체의 영역의 침묵화는 암컷화 배지에서 세포를 유지시키는 것 이외의 또는 이에 부가한 수단에 의해 달성된다. Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 XY 다능성 또는 전능성 세포를 변형시키는 것을 포함하는 방법과의 몇몇 이러한 조합에서, Y 염색체의 영역의 침묵화는 Sry 유전자 외부의 Y 염색체의 부분을 포함하는 영역의 침묵화일 수 있다.
일 예에서, Sry 유전자는 Y 염색체 상의 하나 이상의 추가 유전자에 부가하여 침묵화된다. 기전의 이해는 실행에서 필요하지 않지만, Sry의 침묵화는 (예를 들어, 약 11.0 dpc에서의 생식선 체세포에서의 침묵화로 인해) 이러한 XY 배아에서 성 전환을 증대시킬 수 있고, Y 염색체 상의 하나 이상의 다른 유전자의 침묵화는 (예를 들어, 약 18.5 dpc 이상의 난모세포에서의 침묵화로 인해) 성 전환된 XY 배아로부터 생산된 XY 암컷의 생식력 및/또는 가임능력을 증대시킬 수 있다. 예를 들어, Zfy2 및 Sry 유전자 둘 다는 (예를 들어, C57BL 균주, C57BL/6 균주 또는 129 이외의 균주로부터의 마우스 XY ES 세포에서, 또는 C57BL 균주, C57BL/6 균주 또는 129 이외의 균주로부터의 Y 염색체에 의해) 침묵화될 수 있고, XY 다능성 또는 전능성 동물 세포는 본 명세서에 개시된 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 임의로 배양된다. 몇몇 방법에서, Sry의 침묵화는 (예를 들어, 약 11.0 dpc에서의 생식선 체세포에서의 침묵화로 인해) XY 배아에서 성 전환을 증대시킬 수 있고, Zfy2의 침묵화는 (예를 들어, 약 18.5 dpc 이상의 난모세포에서의 침묵화로 인해) XY 암컷의 생식력 및/또는 가임능력을 증대시킬 수 있다.
이러한 조합은 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 더 높은 백분율, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 수명 한배 새끼의 더 높은 평균 수 및 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 더 높은 평균 한배 새끼 크기를 발생시킬 수 있다. 이러한 F0 자손은 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 숙주 배아로의 세포의 도입 및 숙주 배아의 수태 후에 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 생산될 수 있다.
증가는 적절한 대조군과 비교할 때 임의의 통계학적으로 유의미한 증가일 수 있다. 예를 들어, 증가는 적절한 대조군과 비교할 때 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 또는 5배일 수 있다.
예를 들어, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
(예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 본 명세서에 개시된 조합을 이용함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키도록 추가로 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, 적절한 조절 배지(예를 들어, DMEM에 기초한 것)에서 배양된 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되지 않은 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형되고 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
B.
시험관내
세포 배양물 및 배양물 중에
다능성
또는
전능성
세포를 배양하고 유지시키는 방법
Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 시험관내 세포 배양물이 추가로 제공된다. 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지에서 배양된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 시험관내 세포 배양물이 또한 제공된다. 이러한 세포를 유지시키거나 배양하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함할 수 있다. 마찬가지로, XY 다능성 또는 전능성 세포는 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
시험관내 배양물에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키거나 배양하는 방법이 제공되고, 여기서 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 암컷화 배지의 존재 하에 시험관내 배양물 중에 유지된다. 마찬가지로, 시험관내 배양물에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키거나 배양하는 방법이 제공되고, 여기서 세포는 Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형을 포함하고, 세포는 본 명세서에 기재된 조건 하에 시험관내 배양물 중에 유지된다. 시험관내 배양물에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키거나 배양하는 이러한 방법은 예컨대 숙주 배아로의 비인간 동물 XY ES 세포의 도입 및 숙주 배아의 이후의 수태시 XY F0 생식력 있는 암컷 동물의 수의 증가를 촉진하는 것이다.
본 명세서에 개시된 임의의 배지가 이러한 유지 또는 배야 방법에 사용될 수 있지만, 하나의 비제한적인 예는 배양물에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키거나 배양하기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 배지는 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지(예를 들어, 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지가 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 나타내는 저 삼투질농도 배지)를 포함할 수 있다.
XY 다능성 또는 전능성 세포가 암컷화 배지에서 유지되는 시간 기간은 변할 수 있다. 예를 들어, XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 약 또는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 13일, 또는 2주, 3주 또는 4주의 기간 동안 배지에서 유지될 수 있다(예를 들어, 숙주 배아로의 도입 전에 약 또는 적어도 3일, 약 또는 적어도 1주, 또는 약 또는 적어도 2주 내지 4주 동안 배지에서 유지됨). 마찬가지로, XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 13일, 또는 2주, 3주 또는 4주 이하의 기간 동안 배지에서 유지될 수 있다. 대안적으로, XY 다능성 또는 전능성 세포는 (예를 들어, XY 생식력 있는 F0 암컷을 촉진하는) 암컷화 배지에서 유지(예를 들어, 냉동)될 수 있고, 이후 해동되고 XY 다능성 또는 전능성 세포를 숙주 배아로 도입하기 전 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 이것 초과 동안 (예를 들어, XY 생식력 있는 F0 암컷을 촉진하는) 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 마찬가지로, XY 다능성 또는 전능성 세포는 (예를 들어, XY 생식력 있는 F0 암컷을 촉진하는) 암컷화 배지에서 유지(예를 들어, 냉동)될 수 있고, 이후 해동되고 XY 다능성 또는 전능성 세포를 숙주 배아로 도입하기 전 1일 이하, 2일, 3일, 4일, 또는 이것 초과 동안 (예를 들어, XY 생식력 있는 F0 암컷을 촉진하는) 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, XY 다능성 또는 전능성 세포는 암컷화 배지에서 적어도 한번 계대배양될 수 있고, 이후에 세포는 암컷화 배지에서 냉동되고, 이후에 세포는 암컷화 배지에서 해동되고 숙주 배아로의 도입 전에 약 또는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 13일, 또는 2주, 3주 또는 4주 동안 성장한다. 대안적으로, XY 다능성 또는 전능성 세포는 암컷화 배지에서 적어도 한번 계대배양될 수 있고, 이후에 세포는 암컷화 배지에서 해동되고 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 또는 13일, 또는 2주, 3주 또는 4주 이하 동안 성장한다.
몇몇 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 배아로의 세포의 주사까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다. 다른 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포가 주사되는 배아는 대리모로 전달될 때까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다.
C. F0 세대에서 생식력 있는
XY
암컷을 생산할 수 있는 배아
Y 염색체의 영역을 침묵화시키도록 변형된 적어도 하나의 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포를 가지는 내부 세포 덩어리를 포함하는 F0 배아가 추가로 제공된다. 마찬가지로, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지에서 배양되거나 유지되는 적어도 하나의 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포를 가지는 내부 세포 덩어리를 포함하는 F0 배아가 추가로 제공된다. 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포는 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함할 수 있다. 마찬가지로, 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포는 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 배아는 숙주 배아로 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 도입함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 배아는 상실기전 배아일 수 있고, 배아는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포의 도입 시 포배기로 배양될 수 있다. 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포가 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양되는 방법에서, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아로 도입되기 전의 임의의 시간 기간 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 이하 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다.
몇몇 F0 배아에서, 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포 및/또는 숙주 배아는 하기 중 하나 이상의 유래가 아니다: 아코돈 종(Akodon spp .), 미오푸스 종(Myopus spp .), 마이크로투스 종(Microtus spp .) 및 탈파 종(Talpa spp .). 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 XY 세포 및/또는 숙주 배아는 정상 야생형 특징이 XY 암컷 생식력인 임의의 종의 유래가 아니다. 이종성 공여자 다능성 또는 전능성 세포 및/또는 숙주 배아가 추가 유전적 변형을 포함하는 몇몇 방법에서, 유전적 변형은 XYY 또는 XXY, Tdy-음성(즉, Sry-음성) 성 전환, Tdy-양성 성 전환, X0 변형, 이수성, Fgf9 -/- 유전자형 또는 Sox9 변형이 아니다.
D. F0 생식력 있는
XY
암컷 및 F1 자손을 생성하는 방법
Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하는 변형을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포를 사용하기 위한 다양한 방법 및 조성물은 표적 게놈 유전좌위에 대한 추가 표적화된 유전적 변형을 임의로 포함하는 생식력 있는 F0 XY 암컷 동물을 생성하도록 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지에서 배양되거나 유지되는 XY 다능성 또는 전능성 세포를 사용하기 위한 다양한 방법 및 조성물은 표적 게놈 유전좌위에 대한 추가 표적화된 유전적 변형을 임의로 포함하는 생식력 있는 F0 XY 암컷 동물을 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 F0 XY 암컷 동물은 F1 세대를 생성하도록 야생형 동물에 교잡될 때 생식력 있을 수 있다.
i. F0 세대에서 생식력 있는 암컷
XY
동물을 만드는 방법
F0 세대에서 생식력 있는 암컷 XY 동물을 만드는 방법 및 조성물이 제공된다. 이러한 방법에 의해 생산되는 생성된 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물이 또한 제공된다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 만드는 방법은 (a) 본 명세서에서 그 외 개시된 임의의 변형된 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포(즉, F0 세대에서 생식력 있는 XY 암컷을 생산할 수 있는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포)를 숙주 배아로 도입하는 단계; (b) 단계 (a)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 동물로 도입하고 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및 (c) 표현형 암컷 XY 동물을 포함하는 F0 XY 동물 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 동물은 생식력 있음)를 포함할 수 있다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 만드는 다른 방법은 (a) 본 명세서에서 그 외 개시된 임의의 변형된 배아를 수혜자 암컷 동물로 도입하고 배아를 수태시키는 단계; 및 (b) 표현형 암컷 XY 동물을 포함하는 F0 XY 동물 자손을 얻는 단계(여기서, 성적 성숙을 획득 시 F0 표현형 암컷 XY 동물은 생식력 있음)를 포함할 수 있다.
배아로 이식된 세포는 "공여자 세포"라 칭해질 수 있고, 세포를 받는 배아는 "숙주 배아"라 칭해질 수 있다. 몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 숙주 배아는 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 사용된 XY 다능성 또는 전능성 세포는 (1) Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형 및 (2) 하나 이상의 표적 게놈 유전좌위에 대한 하나 이상의 추가 표적화된 유전적 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본 명세서에서 그 외 자세히 개시되어 있다. 본 명세서에서 그 외 기재된 바대로, XY 다능성 또는 전능성 세포에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 추가 표적화된 유전적 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 상황에서, F0 생식력 있는 암컷 XY 동물은 이들 추가 표적화된 유전적 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 유전적으로 변형된 게놈 유전좌위를 보유하는 동물은 본 명세서에 기재된 바대로 대립유전자의 변형(MOA) 검정을 통해 확인될 수 있다.
공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포는 숙주 배아와 동일한 균주 유래일 수 있거나, 숙주 배아와 상이한 균주 유래일 수 있다. 마찬가지로, 대리모는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포 및/또는 숙주 배아와 동일한 균주 유래일 수 있거나, 대리모는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포 및/또는 숙주 배아의 균주와 다른 균주 유래일 수 있다.
XY 다능성 또는 전능성 세포의 유전자형은 숙주 배아의 유전자형과 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, XY 공여자 세포는 XX 숙주 배아로 이식될 수 있다.
다양한 숙주 배아를 사용할 수 있다. XY 공여자 세포는 예를 들어 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 16-세포기, 32-세포기, 또는 64-세포기 숙주 배아로 이식될 수 있다. 예를 들어, XY 다능성 또는 전능성 세포는 상응하는 유기체로부터 상실기전 배아(예를 들어, 8-세포기 배아)로 도입될 수 있다. 예를 들어, US 제7,576,259호; US 제7,659,442호; US 제7,294,754호; 및 US 제2008-0078000호 A1(이들은 각각 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 마찬가지로, 숙주 배아는 예를 들어 배반포, 배반포전 배아, 상실기전, 상실기, 비치밀화 상실기 또는 치밀화 상실기일 수 있다. 대안적으로, 숙주 배아는 응집되는 상실기 숙주 배아일 수 있다. 마우스의 경우에, 숙주 배아 단계는 예를 들어 타일러 단계(Theiler Stage) 1(TS1), TS2, TS3, TS4, TS5, 또는 TS6 배아(예를 들어, TS1, TS2, TS3 및 TS4로부터 선택됨)일 수 있고, 타일러 단계에 대한 언급은 문헌[Theiler (1989) "The House Mouse: Atlas of Mouse Development," Springer-Verlag, New York]에 기재되어 있다. 숙주 배아가 투명대를 포함하는 방법에서, 공여자 세포(예를 들어, 및 XY ES 세포)는 투명대에서의 홀을 통해 숙주 배아로 도입될 수 있다. 홀이 적은 배아를 또한 사용할 수 있다.
몇몇 방법에서, 공여자 다능성 또는 전능성 세포 및/또는 숙주 배아는 하기 중 하나 이상의 유래가 아니다: 아코돈 종, 미오푸스 종, 마이크로투스 종 및 탈파 종. 마찬가지로, 몇몇 방법에서, 공여자 세포 및/또는 숙주 배아는 정상 야생형 특징이 XY 암컷 생식력인 임의의 종의 유래가 아니다. 공여자 세포 및/또는 숙주 배아가 추가 유전적 변형을 포함하는 몇몇 방법에서, 유전적 변형은 XYY 또는 XXY, Tdy-음성(즉, Sry-음성) 성 전환, Tdy-양성 성 전환, X0 변형, 이수성, Fgf9 -/- 유전자형 또는 Sox9 변형이 아니다.
핵 전달 기법은 동물을 생성하도록 또한 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 핵 전달을 위한 방법은 (1) 난모세포를 제핵시키는 단계; (2) 제핵된 난모세포와 조합되는 공여자 세포 또는 핵을 단리하는 단계; (3) 세포 또는 핵을 제핵된 난모세포로 삽입하여 재구성된 세포를 형성하는 단계; (4) 재구성된 세포를 동물의 자국으로 이식하여 배아를 형성하는 단계; 및 (5) 배아가 발생하게 허용하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 난모세포는 일반적으로 죽은 동물로부터 찾아지지만, 이들은 살아 있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터 또한 단리될 수 있다. 난모세포는 제핵 전에 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 제핵은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 다수의 방식에 의해 수행될 수 있다. 세포 또는 핵을 제핵된 난모세포로 삽입하여 재구성된 세포를 형성하는 단계는 보통 융합 전에 투명대 하의 공여자 세포의 미량주사에 의한다. 융합은 접촉/융합 면에 걸친 DC 전기 펄스의 인가(전기융합), 융합 촉진 화학물질, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜에 대한 세포의 노출에 의해, 또는 불활화 바이러스, 예컨대 센다이(Sendai) 바이러스에 의해 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 통상적으로 핵 공여자 및 수혜자 난모세포의 융합 전에, 동안에 및/또는 후에 전기 및/또는 비전기 수단에 의해 활성화된다. 활성화 방법은 전기 펄스, 펄스, 화학적 유도된 쇼크, 정자에 의한 침투, 난모세포에서의 이가 양이온의 수준의 증가 및 난모세포에서의 (키나제 저해제에 의한) 세포 단백질의 인산화의 감소를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포 또는 배아는 통상적으로 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 배지에서 배양되고, 이후 동물의 자궁으로 전달된다. 예를 들어, US 제2008/0092249호; WO 제1999/005266호 A2; US 제2004/0177390호; WO 제2008/017234호 A1; 및 US 특허 제7,612,250호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)를 참조한다.
공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 숙주 배아는 F0 동물을 생산하도록 포배기까지 배양되고 이후 대리모로 삽입될 수 있다. 이후, 숙주 배아는 대리모에서 수태될 수 있다.
몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 숙주 배아는 적합한 숙주에서 이식 전에 1일, 2일, 3일 또는 4일 또는 이것 초과 일 동안 XY 생식력 있는 암컷 ES 세포의 발생을 촉진하도록 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지 또는 저염 기본 배지)에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 숙주 배아는 적합한 숙주에서 이식 전에 적어도 1일, 2일, 3일 또는 4일 또는 이것 초과 일 동안 또는 1일 이하, 2일, 3일 또는 4일 또는 이것 초과 일 동안 XY 생식력 있는 암컷 ES 세포의 발생을 촉진하도록 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지 또는 저염 기본 배지)에서 유지될 수 있다. 이러한 방법은 F0 생식력 있는 암컷 동물의 생성을 촉진할 수 있다.
몇몇 방법에서, 숙주 배아로의 공여자 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포 또는 XY iPS 세포)의 도입 및 숙주 배아의 수태 시, F0 자손 또는 F0 XY 자손의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 표현형 암컷 XY 동물이다.
이들 방법에 의해 생산된 F0 XY 암컷 동물의 생식력 및 가임능력은 야생형 XX 암컷 동물에 필적할 수 있다. 몇몇 방법에서, 숙주 배아로의 공여자 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포 또는 XY iPS 세포)의 도입 및 숙주 배아의 수태 시, F0 자손의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물이다.
몇몇 방법에서, F0 XY 자손의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 성적 성숙을 획득 시 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물이다.
몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 XY 유전자형을 가진다.
몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 생식력 있다.
몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 야생형 XX 암컷 마우스에 필적하는 다수의 한배 새끼 및/또는 한배 새끼마다 다수의 새끼 및/또는 다수의 생애 자손을 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 생식력 있는 XY 암컷 비인간 동물은 이의 수명 동안 1마리, 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼(예를 들어, 2 내지 6마리의 한배 새끼)를 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 이의 생애에 1마리, 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 한배 새끼(예를 들어, 2 내지 6마리의 한배 새끼)를 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 생식력 있는 XY 암컷 비인간 동물은 한배 새끼마다 적어도 1마리, 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 자손(즉, 새끼)(예를 들어, 한배 새끼마다 4 내지 6마리의 자손)을 생산할 수 있다. 몇몇 방법에서, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 F0 암컷의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 한배 새끼마다 적어도 1마리, 2마리, 3마리, 4마리, 5마리, 6마리, 7마리, 8마리, 9마리 또는 10마리의 자손(즉, 새끼)(예를 들어, 한배 새끼마다 4 내지 6마리의 자손)을 생산할 수 있다. 예를 들어, F0 생식력 있는 XY 암컷 비인간 동물은 2 내지 6마리의 한배 새끼를 생산할 수 있고, 각각의 한배 새끼는 적어도 2마리, 3마리, 4마리, 5마리 또는 6마리의 자손을 가진다. 몇몇 방법에서, 자손의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 XY 생식력 있는 암컷 자손(예를 들어, 자손의 15% 내지 25%는 XY 생식력 있는 암컷 자손임)이다.
다른 실시형태에서, 이러한 방법으로부터 생산된 F0 자손은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 약 3%, 약 10% 또는 이것 초과, 또는 약 63% 또는 이것 초과 유래한다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은, F1 자손에 유전적 변형을 전달하도록, F0 동물의 적어도 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 이것 초과가 표적화된 유전적 변형(예를 들어, Y 염색체의 영역의 침묵화를 발생시키는 표적화된 유전적 변형 및/또는 또 다른 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형)을 가지도록 허용한다.
몇몇 방법에서, 하나 이상의 F0 세대 암컷 XY 비인간 동물(예를 들어, F0의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 모두는 암컷 XY 비인간 동물을 생성시킴)은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 또는 99.8% 유래한다. 예를 들어, 하나 이상의 F0 암컷 XY 비인간 동물은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 100% 유래한 코트 색상을 가질 수 있다. F0 세대에서의 비인간 암컷 XY 동물에 대한 숙주 배아 세포의 기여는 예를 들어 2,000개 중 1개 세포를 검출할 수 있는(0.05%) 정량적 검정에 의해 검출될 수 있고, 암컷 XY 동물의 조직은 숙주 배아 세포 기여에 양성이 아니다.
ii. 생식력 있는 암컷
XY
F0 세대를 교배하는 방법
몇몇 방법에서, Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 유전적 변형을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 세포(즉, XY ES 세포 또는 XY iPS 세포)로부터 유래한 생성된 생식력 있는 XY 암컷 F0 세대를 동물과 교잡하여 F1 세대 자손을 얻는다. F0 세대 암컷 XY 비인간 동물은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)로부터 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 완전히 유래할 수 있다.
마찬가지로, (예를 들어, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 저 삼투질농도 배지 또는 다른 암컷화 배지의 사용을 통해) 본 명세서에 개시된 임의의 다른 방법으로부터 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 유래한 생성된 생식력 있는 XY 암컷 F0 세대를 동물과 교잡하여 F1 세대 자손을 얻을 수 있다. F0 세대 암컷 XY 비인간 동물은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)로부터 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 완전히 유래할 수 있다. 자손(예를 들어, F1 자손 및/또는 자손의 임의의 또는 모든 다른 세대)는 XY 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두가 정상 수컷 표현형을 가지거나 정상 수컷 표현형을 가지고 생식력 있게 하는 것일 수 있다. 몇몇 경우에, XY 자손(예를 들어, F1 자손 및/또는 자손의 임의의 또는 모든 다른 세대) 중 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만은 표현형으로 암컷이거나 암컷이 아니다. 몇몇 경우에, 모든 XY 자손(예를 들어, F1 자손 및/또는 자손의 임의의 또는 모든 다른 세대)는 정상 수컷 표현형을 가지거나, 정상 수컷 표현형을 가지고 생식력 있다. 몇몇 경우에, 자손의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 모두는 유전자형 (즉, XY 또는 XX)에 기초한 예상된 성 표현형(즉, 수컷 또는 암컷)을 가진다.
F0 세대 암컷 XY 비인간 동물이 교배될 수 있는 비인간 동물은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)로부터 또한 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 완전히 유래한 수컷 XY 비인간 동물일 수 있다. 예를 들어, F0 암컷 XY 비인간 동물 및/또는 수컷 XY 비인간 동물은 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포로부터 100% 유래한 색상 코트를 가질 수 있다. F1 세대 자손을 얻기 위해 사용된 교배 쌍은 각각 동일한 F0 세대에서 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, ES 세포 또는 iPS 세포)로부터 완전히 유래할 수 있다. 예를 들어, F0 XY 수컷은 F0 XY 생식력 있는 암컷과 동일한 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포) 클론으로부터 유래한 코호트 클론성 형제자매일 수 있다. 이후, F1 세대 자손은 공여자 ES 세포로부터 완전히 유래한 게놈을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 완전한 ES 세포 유래 마우스를 생성시키는 F0 세대 수컷 및 F0 세대 암컷 마우스의 교잡의 빈도는 100%이다.
F1 자손은 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하는 표적화된 유전적 변형이 존재하는지를 결정하기 위해 특이적 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여 유전자형분석될 수 있다. 추가 표적화된 유전적 변형(예를 들어, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형 또는 표적 게놈 유전좌위에 대한 하나 이상의 추가 표적화된 유전적 변형)이 F0 세대에 존재하는 경우, F1 자손은 이러한 변형이 존재하는지를 결정하기 위해 특이적 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여 유전자형분석될 수 있다. 이후, 원하는 사용에 적절한 F1 자손은 확인될 수 있다. 예를 들어, Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하는 유전적 변형이 결여된 F1 자손이 선택될 수 있거나, Y의 영역의 침묵화를 포함하지만 표적 게놈 유전좌위에 대한 적어도 하나의 추가 표적화된 유전적 변형을 포함하는 유전적 변형이 결여된 F1 자손이 선택될 수 있다. 특이적 프라이머 및/또는 프로브에 의한 유전자형분석 후, 표적 게놈 유전좌위에 대한 추가 표적화된 유전적 변형에 이형접합성이고 Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하는 유전적 변형이 결여된 F1 동물은 서로에 교잡될 수 있다. 이러한 교잡은 관심 있는 유전적으로 변형된 게놈 유전좌위에 동형접합성이고 Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 유전적 변형을 포함하지 않는 F2 자손을 생산한다.
F1 세대에서 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 형질전환 비인간 동물을 생산하는 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 (a) Y 염색체의 영역의 침묵화를 포함하는 변형을 가지는 F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 동물을 F0 XY 수컷 비인간 동물과 교잡하는 단계(여기서, F0 XY 생식력 있는 암컷 비인간 동물 및 F0 XY 수컷 비인간 동물은 각각 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 이형접합성임), 및 (b) 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 동형접합성인 F1 자손을 얻는 단계를 포함한다. 몇몇 방법에서, F0 XY 수컷은 F0 XY 생식력 있는 암컷과 동일한 다능성 또는 전능성 세포 클론으로부터 유래한 코호트 클론성 형제자매이다. 예를 들어, F1 자손은 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 동형접합성이지만, Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형이 결여되도록 선택될 수 있다. F0 XY 생식력 있는 암컷이 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형을 추가로 포함하는 경우, F1 자손은 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 동형접합성이지만, Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 변형 및 Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형이 결여되도록 선택될 수 있다.
E.
표적화된
유전적 변형을 만드는 방법
(예를 들어, Y 염색체의 영역을 침묵화시키거나, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키거나, 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같이 임의의 추가 표적 게놈 유전좌위를 변형시키는) 표적화된 유전적 변형을 만들기 위한 다양한 방법 및 조성물을 사용할 수 있다. 표적화된 유전적 변형을 만드는 하나의 수단은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전적 정보의 임의의 교환 과정을 포함하는 재조합을 통해서이다. 이중 가닥 파괴(DSB)에 반응한 재조합은 원칙적으로 2개의 보존된 DNA 보수 경로를 통해 발생한다: 비상동성 말단 부착(NHEJ) 및 상동성 재조합(HR). 문헌[Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev . Biol . 22:886-897](모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨). NHEJ는, 상동성 주형에 대한 필요 없이, 서로에 대한 파괴 말단의 직접 결찰에 의해 핵산에서의 이중 가닥 파괴의 보수를 포함한다. NHEJ에 의한 비인접한 서열의 결찰은 이중 가닥 파괴의 부위 근처에서 결실, 삽입 또는 전위를 대개 발생시킬 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어 기능 유전적 변형의 표적화된 소실을 발생시키는 것에 용도가 발견된다.
재조합은 상동성 지시된 보수(HDR) 또는 상동성 재조합(HR)을 통해 또한 발생할 수 있다. HDR 또는 HR은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 요할 수 있는 핵산 보수의 형태를 포함하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 것)의 주형 보수에 "공여자" 분자를 사용하고, 공여자로부터의 유전적 정보를 표적으로 전달한다. 임의의 특정한 이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 이러한 전달은 파괴된 표적과 공여자 사이를 형성하는 이종듀플렉스 DNA의 미스매치 보정, 및/또는 합성 의존적 가닥 어닐링(여기서, 공여자는 표적의 일부가 되는 유전적 정보를 재합성하도록 사용됨), 및/또는 관련 과정을 수반할 수 있다. 몇몇 경우에, 공여자 폴리뉴클레오타이드, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 부분, 공여자 폴리뉴클레오타이드의 카피 또는 공여자 폴리뉴클레오타이드의 카피의 부분은 표적 DNA로 통합한다. 이러한 표적화된 유전적 변형을 생성하기 위한 비제한적인 방법은 예를 들어 표적화 플라스미드, 작은 표적화 벡터(작은 TVEC) 또는 큰 표적화 벡터의 사용을 포함하여 본 명세서에서 그 외 자세히 기재되어 있다. 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 또한 참조한다.
표적화된 유전적 변형을 만드는 방법은 예를 들어 단독의 또는 본 명세서에서 그 외 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제와 조합된 표적화 벡터(예를 들어, 작은 TVEC 또는 LTVEC)의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, US 제2015/0159175호, US 제2015/0159174호, US 제2014/0310828호, US 제2014/0309487호 및 US 제2013-0309670호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)를 참조한다. 마찬가지로, 표적화된 유전적 변형을 만드는 방법은 단독의 또는 표적화 벡터와 조합된 하나 이상의 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다.
예를 들어, 세포에서 (예를 들어, Y 염색체 상의) 표적 게놈 유전좌위를 변형시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 표적 게놈 유전좌위에서 또는 그 근처에서 인식 부위에서 하나 이상의 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하는 하나 이상의 뉴클레아제 물질을 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전좌위에서 게놈 변형을 포함하는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
세포에서 표적 게놈 유전좌위를 변형시키는 다른 방법은 (a) 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된 삽입체 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (b) 표적 게놈 유전좌위에서 통합된 삽입체 폴리뉴클레오타이드를 이의 게놈에서 포함하는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
세포에서 표적 게놈 유전좌위를 변형시키는 다른 방법은 (a) (i) 뉴클레아제 물질(여기서, 뉴클레아제 물질은 표적 게놈 유전좌위 내의 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도함); 및 (ii) 인식 부위에 충분히 근접하게 위치한 5' 및 3' 표적 부위에 상응하는 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 플랭킹된 삽입체 핵산을 포함하는 표적화 벡터를 세포로 도입하는 단계; 및 (c) 표적 게놈 유전좌위에서 변형(예를 들어, 삽입체 핵산의 통합)을 포함하는 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 표적화된 유전적 변형 및 임의의 다른 표적화된 유전적 변형(예를 들어, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형 또는 임의의 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형)이 발생할 수 있는 한편, 다능성 또는 전능성 XY 세포는 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)(예를 들어, XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진하는 배지)에서 유지된다. 대안적으로, Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 표적화된 유전적 변형 및/또는 임의의 다른 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형이 발생할 수 있는 한편, 다능성 또는 전능성 XY 세포는 상이한 배양 배지에서 유지된다. 임의로, 세포는 후속하여 본 명세서에서 그 외 개시된 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)(예를 들어, XY F0 생식력 있는 암컷의 발생을 촉진하는 배지)로 전달될 수 있다.
Y 염색체의 영역을 침묵화시키는 표적화된 유전적 변형 및 임의의 다른 표적화된 유전적 변형(예를 들어, Sry 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시키는 변형 또는 임의의 다른 표적 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형)은 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다.
i. 뉴클레아제 물질
원하는 인식 부위로 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하는 임의의 뉴클레아제 물질은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 천연 발생 또는 네이티브 뉴클레아제 물질을 사용할 수 있거나, 변형된 또는 조작된 뉴클레아제 물질(예를 들어, 특이적으로 인식하고 원하는 인식 부위에서 닉 또는 이중 가닥 파괴를 유도하도록 네이티브 형태로부터 조작된(변형된 또는 유래한) 뉴클레아제)를 사용할 수 있다.
뉴클레아제 물질의 하나의 유형은 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 네이티브 또는 조작된 전사 활성인자 유사(TAL) 이펙터, 또는 이의 기능적 부분을 FokI과 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 융합함으로써 생성된다. 예를 들어, WO 제2010/079430호; 문헌[Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; 및 Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 적합한 TAL 뉴클레아제의 예 및 적합한 TAL 뉴클레아제를 제조하는 방법은 예를 들어 US 제2011/0239315 A1, US 제2011/0269234호 A1, US 제2011/0145940호 A1, US 제2003/0232410호 A1, US 제2005/0208489호 A1, US 제2005/0026157호 A1, US 제2005/0064474호 A1, US 제2006/0188987호 A1 및 US 제2006/0063231호 A1(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
뉴클레아제 물질의 또 다른 유형은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. 몇몇 ZFN에서, ZFN의 각각의 단량체는 3개 이상의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하고, 각각의 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인은 3bp 하위부위에 결합한다. 다른 ZFN에서, ZFN은 독립적인 뉴클레아제 예컨대 FokI 엔도뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된 아연 핑거 기반 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메라 단백질이다. 예를 들어, 뉴클레아제 물질은 제1 ZFN 및 제2 ZFN을 포함할 수 있고, 제1 ZFN 및 제2 ZFN의 각각은 FokI 뉴클레아제 아단위에 작동 가능하게 연결되고, 제1 및 제2 ZFN은 약 5-7bp 스페이서에 의해 분리된 표적 DNA 서열의 각각의 가닥에서 2개의 인접한 표적 DNA 서열을 인식하고, FokI 뉴클레아제 아단위는 이합체화하여 이중 가닥 파괴를 만드는 활성 뉴클레아제를 생성한다. 예를 들어, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; WO/2011/017293A2; 및 문헌[Gaj et al. (2013) Trends in Biotechnology, 31(7):397-405](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
뉴클레아제 물질의 또 다른 유형은 메가뉴클레아제이다. 메가뉴클레아제는 보존된 서열 모티프에 기초한 4개의 패밀리로 분류되고, 패밀리는 LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H 및 His-Cys 박스 패밀리이다. 이들 모티프는 금속 이온의 배위 및 포스포다이에스터 결합의 가수분해에 참여한다. 메가뉴클레아제는 이의 긴 인식 부위에 및 이의 DNA 기질에서 몇몇 서열 다형을 용인하는 데 중요하다. 메가뉴클레아제 도메인, 구조 및 기능은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Guhan and Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; 및 Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9:764]을 참조한다.
뉴클레아제 물질은 I형, II형, III형 및 IV형 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다. I형 및 III형 제한 엔조뉴클레아제는 특정한 인식 부위를 인식하지만, 통상적으로 절단 부위(인식 부위)로부터 먼 수백 개의 염기쌍일 수 있는 뉴클레아제 결합 부위로부터의 가변 위치에서 절단한다. II형 시스템에서, 제한 활성은 임의의 메틸화효소 활성에 독립적이고, 절단은 통상적으로 결합 부위 내 또는 이것에 근접한 특정한 부위에서 발생한다. 대부분의 II형 효소는 회문성 서열을 절단하지만, IIa형 효소는 비회문성 인식 부위를 인식하고, 인식 부위의 밖에서 절단하고, IIb형 효소는 인식 부위의 밖의 부위 둘 다에 의해 2회 서열을 절단하고, IIs형 효소는 비대칭 인식 부위를 인식하고 인식 부위로부터 약 1개 내지 20개의 뉴클레오타이드의 한정된 거리에서 일 측에서 절단한다. IV형 제한 효소는 메틸화된 DNA를 표적화한다. 제한 효소는 예를 들어 REBASE 데이터베이스에서 추가로 기재되어 있고 분류된다(rebase.neb.com에서의 웹페이지; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20); Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12; 및 Belfort et al., (2002) in Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC)(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨).
뉴클레아제 물질은 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(CRISPR)/CRISPR 연관된(Cas) 시스템 또는 이러한 시스템의 성분을 추가로 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 유전요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은 핵산의 부위 지시된 절단을 위해 CRISPR 복합체(Cas 단백질과 복합체화된 가이드 RNA(gRNA) 포함)를 사용한다. 예를 들어, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, WO/2013142578A1, WO 2014/131833A1, US 2015/0159175, US 2015/0159174, US 2014/0310828 및 US 2014/0309487(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
Cas 단백질, 예컨대 Cas9는 일반적으로 가이드 RNA(gRNA)와 상호작용하는 적어도 하나의 RNA 인식 또는 결합 도메인 및 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. Cas 단백질은 또한 예를 들어 유전자의 전사 또는 발현을 조절하기 위한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인에 융합될 수 있다. WO 제2014/089290호(모든 목적을 위해 본 명세서에서 참고로 포함됨)를 참조한다. Cas9 패밀리 구성원의 예는 WO 제2014/131833호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
"가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 Cas 단백질에 결합하고 표적 DNA 내의 특정한 위치로 Cas 단백질을 표적화하는 RNA 분자를 포함한다. 가이드 RNA는 2개의 분절: "DNA 표적화 분절" 및 "단백질 결합 분절"을 포함할 수 있다. 몇몇 gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자를 포함한다: (1) "활성인자-RNA"("트랜스-작용 CRISPR RNA" 또는 "tracrRNA" 또는 "스캐폴드"); 및 (2) "타겟터-RNA"("CRISPR RNA" 또는 "타겟터-RNA" 또는 "crRNA" 또는 "crRNA 반복"). crRNA는 gRNA의 DNA 표적화 분절(단일 가닥) 및 gRNA의 단백질 결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 하나의 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 스트레치 둘 다를 포함한다. 상응하는 tracrRNA(활성인자-RNA)는 gRNA의 단백질 결합 분절의 dsRNA 듀플렉스의 다른 절반을 형성하는 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함한다. crRNA의 뉴클레오타이드의 스트레치는 gRNA의 단백질 결합 도메인의 dsRNA 듀플렉스를 형성하도록 tracrRNA의 뉴클레오타이드의 스트레치에 상보성이고 이것과 하이브리드화한다. 그러므로, 각각의 crRNA는 상응하는 tracrRNA를 가진다고 말해질 수 있다.
다른 gRNA는 "단일 분자 gRNA", "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"라 또한 칭해질 수 있는 단일 RNA 분자(단일 RNA 폴리뉴클레오타이드)이다. 예를 들어, WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2, WO/2014/099750A2, WO/2013142578A1 및 WO 2014/131833A1(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 용어 "가이드 RNA" 및 "gRNA"는 이중-분자 gRNA 및 단일 분자 gRNA 둘 다를 포함한다.
crRNA 및 상응하는 tracrRNA는 gRNA를 형성하도록 하이브리드화한다. crRNA는 표적 DNA에서 CRISPR RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 단일 가닥 DNA 표적화 분절을 추가로 제공한다. 예를 들어, 문헌[Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol . 31:233-239; 및 Cong et al. (2013) Science 339:819-823](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. Cas9에 의한 표적 DNA의 부위 특이적 절단은 표적 DNA에서 (i) gRNA와 표적 DNA 사이의 염기쌍 지음 상보성 및 (ii) 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)라 불리는 짧은 모티프 둘 다에 의해 결정된 위치에서 발생할 수 있다. PAM은 CRISPR RNA 인식 서열을 플랭킹할 수 있다.
ii. 표적화 벡터
표적화 벡터는 게놈 표적 유전좌위로 핵산 삽입체를 도입하도록 사용될 수 있고, 핵산 삽입체 및 핵산 삽입체를 플랭킹하는 상동성 아암을 포함할 수 있다. 표적화 벡터는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 언급의 용이를 위해, 상동성 아암은 본 명세서에서 (즉, 상류 및 하류) 상동성 아암 5' 및 3'라 칭해진다. 이 전문용어는 표적화 벡터 내의 핵산 삽입체에 대한 상동성 아암의 상대 위치를 의미한다. 5' 및 3' 상동성 아암은 표적화된 유전좌위 내의 영역에 상응하고, 이것은 본 명세서에서 각각 "5' 표적 서열" 및 "3' 표적 서열"이라 칭해진다.
핵산 삽입체는 게놈 표적 유전좌위에서 통합되는 DNA의 분절을 포함한다. 표적 유전좌위에서의 핵산 삽입체의 통합은 표적 유전좌위에 대한 관심 있는 핵산 서열의 부가, 표적 유전좌위에서의 관심 있는 핵산 서열의 결실, 및/또는 표적 유전좌위에서의 관심 있는 핵산 서열의 대체를 발생시킬 수 있다. 더구나, 대체되는 표적 유전좌위에서의 핵산 삽입체 또는 상응하는 핵산은 임의의 원하는 길이, 예를 들어 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 500kb의 길이 또는 이것 초과일 수 있다.
핵산 삽입체는 선택 마커, 리포터 유전자, 또는 하나 이상의 발현 카세트 또는 결실 카세트를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 소정의 카세트는 발현에 영향을 미치는 다양한 조절 성분과 함께 관심 있는 뉴클레오타이드 서열, 선택 마커를 코딩하는 핵산, 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.
삽입체 핵산은 부위 특이적 재조합 표적 서열(예를 들어, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox)에 의해 플랭킹된 핵산을 포함할 수 있다. 전체 삽입체 핵산은 이러한 부위 특이적 재조합 표적 서열에 의해 플랭킹될 수 있거나, 삽입체 핵산 내의 관심 있는 임의의 영역 또는 개별 폴리뉴클레오타이드는 이러한 부위에 의해 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 재조합 부위는 삽입체 핵산 내에 함유된 선택 마커 및/또는 리포터 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 플랭킹할 수 있다. 표적화된 유전좌위에서의 삽입체 핵산의 통합 후, 부위 특이적 재조합 부위 사이의 서열은 제거될 수 있다.
2개의 영역이 상동성 재조합 반응에 대한 기질로서 작용하도록 서로에 충분한 수준의 서열 동일성을 공유할 때, 상동성 아암 및 표적 서열은 서로에 "상응한다" 또는 "상응하다". 용어 "상동성"은 상응하는 서열에 동일하거나 서열 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 표적화 벡터에서 발견되는 소정의 표적 서열과 상응하는 상동성 아암 사이의 서열 동일성은 상동성 재조합이 발생하도록 허용하는 임의의 정도의 서열 동일성일 수 있다. 더구나, 상동성 아암과 상응하는 표적 서열 사이의 상동성의 상응하는 영역은 절단된 인식 부위에서 상동성 재조합을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 소정의 상동성 아암 및/또는 상응하는 표적 서열이 예를 들어 약 5kb 내지 약 300kb 길이 또는 이것 이상인 상동성의 상응하는 영역을 포함할 수 있어서, 상동성 아암은 세포의 게놈 내에 상응하는 표적 서열과 상동성 재조합을 겪도록 충분한 상동성을 가진다.
뉴클레아제 물질(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 표적 유전좌위의 변형을 돕도록 표적화 벡터와 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레아제 물질은 표적화 벡터와 표적 유전좌위 사이의 상동성 재조합을 촉진할 수 있다. 뉴클레아제 물질이 표적화 벡터와 조합되어 사용될 때, 표적화 벡터는, 뉴클레아제 절단 부위에서의 닉 또는 이중 가닥 파괴 시, 표적 서열과 상동성 아암 사이의 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진하도록, 뉴클레아제 절단 부위에 충분히 근접하게 위치한 5' 및 3' 표적 서열에 상응하는 5' 및 3' 상동성 아암을 포함할 수 있다. 표적화 벡터의 5' 및 3' 상동성 아암에 상응하는 표적화된 유전좌위 내의 표적 서열은, 거리가 인식 부위에서의 닉 또는 이중 가닥 파괴 시, 예컨대 5' 및 3' 표적 서열 및 상동성 아암 사이의 상동성 재조합 사건의 발생을 촉진하는 경우, 뉴클레아제 절단 부위에 "충분히 근접하게 위치한다".
뉴클레아제 물질과의 표적화 벡터(예를 들어, 큰 표적화 벡터 (LTVEC) 또는 작은 표적화 벡터(작은 TVEC) 포함)의 조합된 사용은 표적화 벡터 단독의 사용과 비교하여 증가한 표적화 효율을 발생시킬 수 있다.
1. 작은
표적화
벡터(작은 TVEC)
몇몇 방법은 작은 표적화 벡터 또는 작은 TVEC를 사용한다. Y 염색체에 표적화된 유전적 변형을 만들기 위해 작은 TVEC를 사용하는 것의 예는 예를 들어 WO 제2015/200805호 및 US 제2015/0376651호(이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. "작은 TVEC"는 짧은 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 작은 TVEC에서의 상동성 아암의 길이는 예를 들어 약 400bp 내지 약 1000bp일 수 있다. 작은 TVEC의 상동성 아암은 예를 들어 약 400 bp 내지 약 500bp, 약 500bp 내지 약 600bp, 약 600bp 내지 약 700bp, 약 700bp 내지 약 800bp, 약 800bp 내지 약 900bp, 또는 약 900 bp 내지 약 1000 bp를 포함하는 상응하는 표적 부위를 가지는 상동성 재조합 사건을 촉진하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 작은 TVEC에서의 상동성 아암의 바람직한 길이는 약 700bp 내지 약 800bp이다. 작은 TVEC의 5' 및 3' 상동성 아암의 총 합은 예를 들어 약 0.5kb 내지 약 10kb일 수 있다. 이러한 방법에서, 상동성 아암의 짧은 길이는, 더 긴 상동성 아암을 가지는 표적화 벡터와 비교하여, 표적화 효율을 증가시킬 수 있다. 매우 반복적인 서열을 가지는 Y 염색체의 성질로 인해, 작은 TVEC의 짧은 아암은 Y 염색체에서 매우 특이적인 표적화를 허용할 수 있다.
2. 큰 표적화 벡터(LTVEC)
몇몇 표적화 벡터는 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"이고, 이것은 세포에서 상동성 재조합을 수행하기 위해 의도되는 다른 접근법에 의해 통상적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열에 상응하고 이로부터 유래한 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. LTVEC를 사용하여 표적화된 유전적 변형을 생성하는 것의 예는 예를 들어 WO 제2015/088643호, US 제2015/0159175호, US 제2015/0159174호, US 제2014/0310828호, US 제2014/0309487호 및 US 제2013-0309670호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. LTVEC는 또한 세포에서 상동성 재조합을 수행하기 위해 의도되는 다른 접근법에 의해 통상적으로 사용되는 것보다 큰 핵산 서열을 가지는 핵산 삽입체를 포함하는 표적화 벡터를 포함한다. 예를 들어, LTVEC는 이의 크기 제한 때문에 전통적인 플라스미드 기반 표적화 벡터에 의해 수용될 수 없는 큰 유전좌위의 변형이 가능하게 한다. 예를 들어, 표적화된 유전좌위는 종래의 방법을 사용하여 표적화될 수 없거나, 뉴클레아제 물질(예를 들어, Cas 단백질)에 의해 유도된 닉 또는 이중 가닥 파괴의 부재 하에 오직 부정확하게 또는 오직 상당히 낮은 효율에 의해 표적화될 수 있는, 세포의 유전좌위일 수 있다(즉, 5' 및 3' 상동성 아암은 이것에 상응할 수 있다).
LTVEC의 예는 박테리아 인공 염색체(BAC), 인간 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체(YAC)로부터 유래한 벡터를 포함한다. LTVEC의 비제한적인 예 및 이를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,586,251호; 미국 특허 제6,596,541호; 미국 특허 제7,105,348호; 및 WO 2002/036789호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. LTVEC는 선형 형태 또는 원형 형태일 수 있다.
LTVEC는 예를 들어 적어도 10kb 또는 약 50kb 내지 약 400kb 또는 이것 초과를 포함하는 임의의 길이일 수 있다. LTVEC의 크기는 종래의 검정, 예를 들어 사우던 블로팅 및 긴 범위(예를 들어, 1kb 내지 5kb) PCR에 의해 표적화 사건의 스크리닝이 가능하게 하도록 너무 클 수 있다. 5' 상동성 아암 및 3' 상동성 아암의 총 합계는 예를 들어 적어도 10kb일 수 있다(각각의 상동성 아암은 예를 들어 약 5kb 내지 약 200kb의 범위일 수 있음). LTVEC 및 핵산 삽입체는 약 5kb 내지 약 3Mb(예를 들어, 약 500kb 또는 이것 초과)와 같은 길이의 표적 유전좌위에서 결실을 허용하도록 설계될 수 있다. 마찬가지로, LTVEC 및 핵산 삽입체는 약 5kb 내지 약 400kb 또는 이것 초과의 범위와 같은 길이의 외인성 핵산 서열의 표적 유전좌위로의 삽입을 허용하도록 설계될 수 있다.
iii. 세포로의 성분의 도입
세포로의 핵산의 도입을 허용하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 경우에, 핵산을 도입하기 위해 사용된 시스템은 특정한 게놈 유전좌위에서 표적화된 통합을 허용한다. 이러한 시스템은 다양한 성분을 사용하고, 언급의 용이함을 위해, 용어 "표적화된 게놈 통합 시스템"은 총칭적으로 통합 사건에 필요한 성분 모두(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레아제 물질, 뉴클레아제 절단 부위, 인서트 DNA 폴리뉴클레오타이드, 표적화 벡터, 표적 게놈 유전좌위 및 관심 있는 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다.
본 명세서에 제공된 방법은 표적화된 게놈 통합 시스템의 하나 이상의 성분을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 작제물을 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. "도입"은 서열이 세포의 내부로의 접근에 이르는 방식으로 서열 (폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)을 세포에 제시하는 것을 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법은 세포로 핵산 또는 단백질을 도입하기 위한 특정한 방법에 따라 달라지지 않고, 오직 그 핵산 또는 단백질이 적어도 하나의 세포의 내부로의 접근에 이른다. 다양한 세포형으로 핵산 및 단백질을 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 안정한 형질감염 방법, 일시적 형질감염 방법, 및 바이러스 매개 방법을 포함한다.
형질감염 프로토콜, 및 세포로 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위한 프로토콜은 변할 수 있다. 비제한적인 형질감염 방법은 리포솜; 나노입자; 인산칼슘(Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 양이온성 중합체, 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민을 사용한 화학 기반 형질감염 방법을 포함한다. 비화학 방법은 전기천공, 초음파천공법(Sono-poration) 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자 기반 형질감염은 유전자 총 또는 자석 보조 형질감염의 사용을 포함한다(Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 형질감염에 바이러스 방법을 또한 이용할 수 있다.
몇몇 경우에, 세포로의 핵산 또는 단백질의 도입은 전기천공, 세포질내 주사, 바이러스 감염, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 형질감염, 지질 매개 형질감염 또는 뉴클레오펙션(Nucleofection)(상표명)에 의해 매개된다.
세포로의 핵산 또는 단백질의 도입은 시간 기간에 걸쳐 1회 또는 수회 수행될 수 있다. 예를 들어, 도입은 시간 기간에 걸쳐 적어도 2회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 3회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 4회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 5회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 6회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 7회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 8회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 9회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 10회, 적어도 11회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 12회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 13회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 14회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 15회, 적어도 16회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 17회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 18회, 시간 기간에 걸쳐 적어도 19회 또는 시간 기간에 걸쳐 적어도 20회 수행될 수 있다.
뉴클레아제 물질 및 표적화 벡터(예를 들어, LTVEC) 둘 다가 세포로 도입될 때, 이들은 동시에 도입될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제 물질은 표적화 벡터와 별개로 도입될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 물질은 표적화 벡터의 도입 전에 도입될 수 있거나, 표적화 벡터의 도입 후에 도입될 수 있다.
iv. 변형의 유형
(예를 들어, Y 염색체의 영역의 결실 또는 파괴를 통해) Y 염색체의 영역을 침묵화시키기 위해 표적화된 유전적 변형의 다양한 유형을 이용할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 수준 및/또는 활성의 감소는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 단백질의 수준 또는 활성에 영향을 미치거나 이를 조절하는 게놈 유전좌위에 대한 표적화된 유전적 변형에 의해 달성될 수 있다. 이러한 표적화된 변형은 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 점 돌연변이, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉아웃, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부의 넉인, 이종성, 외인성 또는 이종상동성 핵산 서열에 의한 내인성 핵산 서열의 대체, 도메인 스왑(swap), 엔손 스왑, 인트론 스왑, 조절 서열 스왑, 유전자 스왑 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드는 표적화된 게놈 변형을 형성하도록 변할 수 있다. 결실, 삽입 또는 대체는 본 명세서에서 그 외 개시된 바대로 임의의 크기일 수 있다. 다양한 방법은 표적화된 유전적 변형을 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; 및 Wang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532](이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
Y 염색체에서의 결실은 임의의 핵산 서열, 예컨대 생식력/불임 또는 성적 발달과 연관된 유전자의 결실일 수 있다. Y 염색체에서의 결실은 다수의 유전자의 결실을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 유전자가 결실될 수 있다. 2개의 뉴클레아제 물질을 사용할 때, 이들의 상응하는 인식 부위 사이의 서열이 결실될 수 있다. 결실은 예를 들어 약 5kb 내지 약 10kb, 약 10kb 내지 약 20kb, 약 20kb 내지 약 40kb, 약 40kb 내지 약 60kb, 약 60kb 내지 약 80kb, 약 80kb 내지 약 100kb, 약 100kb 내지 약 150kb, 약 150kb 내지 약 200kb, 약 200kb 내지 약 300kb, 약 300kb 내지 약 400kb, 약 400kb 내지 약 500kb, 약 500kb 내지 약 600kb, 약 600kb 내지 약 700kb, 약 700kb 내지 약 800kb, 약 800kb 내지 약 900kb, 약 900kb 내지 약 1Mb, 약 500kb 내지 약 1Mb, 약 1Mb 내지 약 1.5Mb, 약 1.5Mb 내지 약 2Mb, 약 2Mb 내지 약 2.5Mb, 또는 약 2.5Mb 내지 약 3Mb의 범위일 수 있다. 예를 들어, 결실은 500kb 초과, 약 500kb 내지 약 600kb, 또는 약 500kb일 수 있다.
마찬가지로, Y 염색체의 파괴는 임의의 핵산 서열, 예컨대 생식력/불임 또는 성적 발달과 연관된 유전자의 파괴일 수 있다. Y 염색체의 파괴는 다수의 유전자의 파괴를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 이것 초과의 유전자가 파괴될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제에 의해 생성된 이중 가닥 파괴가 비상동성 말단 부착(NHEJ) 매개된 DNA 보수에 의해 보수될 때(핵산 서열의 삽입 또는 결실을 포함하는 돌연변이체 대립유전자를 생성시키고, 이로써 그 게놈 유전좌위의 파괴를 발생시킴), 내인성 핵산 서열의 파괴는 발생할 수 있다. 파괴의 예는 조절 유전인자(예를 들어, 프로모터 또는 증강인자)의 변경, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임 쉬프트 돌연변이, 절두 돌연변이, 눌 돌연변이, 또는 적은 수의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실(예를 들어, 프레임 쉬프트 돌연변이를 발생시킴)을 포함한다. 파괴는 불활화(즉, 기능의 소실) 또는 대립유전자의 소실을 발생시킬 수 있다.
v. 표적화된 변형을 가지는 세포의 확인
표적화된 변형, 예컨대 결실 또는 삽입을 가지는 세포를 확인하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은 표적 유전좌위에서(예를 들어, 제1 및 제2 CRISPR RNA 인식 서열 사이에) 표적화된 변형을 가지는 하나의 세포를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 스크리닝은 변형된 게놈 유전좌위를 가지는 이러한 세포를 확인하기 위해 수행될 수 있다.
스크리닝 단계는 모 염색체의 대립유전자의 변형(MOA)을 평가하기 위한 정량적 검정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 정량적 검정은 정량적 PCR, 예컨대 실시간 PCR(qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 실시간 PCR은 표적 유전좌위를 인식하는 제1 프라이머 세트 및 비표적화된 기준 유전좌위를 인식하는 제2 프라이머 세트를 사용할 수 있다. 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인식하는 형광성 프로브를 포함할 수 있다.
적합한 정량적 검정의 다른 예는 형광 매개 인시츄 하이브리드화(FISH), 비교 게놈 하이브리드화, 등온 DNA 증폭, 부동화된 프로브(들)에 대한 정량적 하이브리드화, Invader 프로브(등록상표), MMP 검정, TAQMAN(등록상표) 분자 Beacon 또는 Eclipse(상표명) 프로브 기법(예를 들어, US 제2005/0144655호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨) 참조)을 포함한다.
F. 세포 및 동물
상기 방법 및 조성물에서의 동물(예를 들어, 세포, 배아)은 포유류, 어류 및 조류를 포함하는 임의의 동물을 포함할 수 있다. 포유류는 예를 들어 인간, 비인간 포유류, 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 마모셋, 붉은털원숭이 및 유인원), 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그), 가축 또는 농업용 포유류(예를 들어, 염소, 황소, 사슴, 들소, 말 종, 예컨대 말, 소 종, 예컨대 소 및 거세소, 양 종, 예컨대 양, 및 돼지 종, 예컨대 돼지 및 수컷돼지), 및 가축화 포유류(예를 들어, 고양이, 개, 토끼 및 흰담비)를 포함한다. 조류는 예를 들어 닭, 칠면조, 타조, 거위 및 오리를 포함한다. 비인간 동물은 인간 이외의 임의의 동물일 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 비인간 포유류, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 농업용 포유류, 가축 포유류, 어류 또는 조류일 수 있다.
상기 방법 및 조성물에서의 다능성 세포는 하나 초과의 분화 세포형으로 발생하는 능력을 보유하는 임의의 미분화 세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법 및 조성물에서의 다능성 세포는 배아 줄기(ES) 세포 또는 유도 다능성 줄기(iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아로의 도입 시 발생하는 배아의 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아 유래 전능성 또는 다능성 세포를 포함한다. 대안적으로, 이들은 성체 줄기 세포, 또는 발생상 제한된 전구 세포일 수 있다. 다능성 세포는 임의의 동물 유래일 수 있다. 예를 들어, 다능성 세포는 인간 ES 세포, 비인간 ES 세포, 포유류 ES 세포, 비인간 포유류 ES 세포, 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 랫트 ES 세포 또는 햄스터 ES 세포일 수 있다.
적합한 유전적으로 변형 가능한 다능성 세포가 용이하게 이용 가능하지 않는 이들 포유류에 대해, 예컨대 Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LIN28 및 Glis1(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 다능성 유도 인자의 조합의 체세포(예를 들어, 섬유아세포)로 도입함으로써, 다능성 세포로 체세포를 리프로그래밍하기 위해 다른 방법을 이용한다.
마우스 다능성 세포, 전능성 세포 또는 숙주 배아는 예를 들어 동계교배된 균주, 하이브리드 균주 및 이계교배된 균주를 포함하는 마우스의 임의의 균주 유래일 수 있다. 마우스 균주의 예는 129 균주, C57BL 균주(예를 들어, C57BL/6 균주), 129 및 C57BL/6의 혼합(예를 들어, 50% 129 및 50% C57BL/6), BALB/c 균주, 및 스위스 웹스터(Swiss Webster) 균주를 포함한다. 129 균주의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 12951/SV, 12951/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 12959/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1 및 129T2를 포함한다(예를 들어, 문헌[Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836]을 참조한다). C57BL 균주의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/01a를 포함한다. 마우스는 상기 언급된 129 균주의 혼합(예를 들어, 129S6(129/SvEvTac) 균주) 및 상기 언급된 C57BL/6 균주, 하나 이상의 상기 언급된 129 균주의 혼합 또는 하나 이상의 상기 언급된 C57BL 균주의 혼합일 수 있다. 마우스는 또한 129 균주를 배제한 균주 유래일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법에서 사용되는 마우스 또는 마우스 세포는 129 및 C57BL/6 균주의 혼합, BALB/c 및 C57BL/6 균주의 혼합, 129 및 BALB/c 균주의 혼합 또는 BALB/c, C57BL/6 및 129 균주의 혼합일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법에서 사용되는 마우스 또는 마우스 세포는 적어도 부분적으로 BALB/c 균주 유래일 수 있다(예를 들어, BALB/c 균주로부터 유래한 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 BALB/c 균주로부터 유래한 약 25%, 약 50%, 약 75% 또는 약 100%). 일 예에서, 마우스 또는 마우스 세포는 50% BALB/c, 25% C57BL/6 및 25% 129를 포함하는 균주를 가질 수 있다. 대안적으로, 마우스 또는 마우스 세포는 BALB/c를 배제한 균주 또는 균주 조합을 포함할 수 있다.
마우스 XY 다능성 세포에서의 Y 염색체는 임의의 균주 유래일 수 있다. 예를 들어, 마우스 XY 다능성 세포(예를 들어, 마우스 XY ES 세포)에서의 Y 염색체는 129 균주 또는 C57BL 균주(예를 들어, C57BL/6 균주) 유래일 수 있다. 대안적으로, Y 염색체는 BALB/c 균주 유래일 수 있다. 129 균주로부터의 Y 염색체를 가지는 마우스 XY ES 세포의 예는 VGF1 마우스 ES 세포이다. VGF1(F1H4로도 공지됨) 마우스 ES 세포는 암컷 C57BL/6NTac 마우스를 수컷 129S6/SvEvTac 마우스에 교잡함으로써 생산된 하이브리드 배아로부터 유래한다. 따라서, VGF1 ES 세포는 129S6/SvEvTac 마우스로부터의 Y 염색체를 함유한다. 예를 들어, 문헌[Auerbach, W. et al. (2000) Biotechniques 29, 1024-1028, 1030, 1032](모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 대안적으로, 마우스 XY 다능성 세포에서의 Y 염색체는 129 균주 유래가 아니다(예를 들어, C57BL/6 균주 유래이다). VGB6 ES 세포주는 C57BL/6NTac 균주의 수컷 및 암컷 마우스의 짝짓기로부터 생산된 단일 수컷(XY) 배반포 배아로부터 유래한다.
랫트 다능성 세포, 전능성 세포 또는 숙주 배아는 예를 들어 동계교배된 균주, 하이브리드 균주 및 이계교배된 균주를 포함하는 임의의 랫트 균주 유래일 수 있다. 랫트 균주의 예는 ACI 랫트 균주, 다크 아고우티(Dark Agouti:DA) 랫트 균주, 위스타르(Wistar) 랫트 균주, LEA 랫트 균주, 스프라그 다울리(Sprague Dawley: SD) 랫트 균주 또는 피쳐(Fischer) 랫트 균주, 예컨대 피셔(Fisher) F344 또는 피셔 F6을 포함한다. 랫트 다능성 세포, 전능성 세포 또는 숙주 배아는 또한 상기 기재된 2개 이상의 균주의 혼합으로부터 유래한 균주로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 랫트 다능성 세포, 전능성 세포 또는 숙주 배아는 DA 균주 및 ACI 균주로부터 선택된 균주로부터 유래할 수 있다. ACI 랫트 균주는 흰색 배 및 발 및 RT1 av1 단상형을 가지는 블랙 아고우티를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 균주는 할란 레보러토리즈(Harlan Laboratories)를 포함하는 다양한 소스로부터 이용 가능하다. ACI 랫트로부터의 랫트 ES 세포주의 예는 ACI.G1 랫트 ES 세포이다. 다크 아고우티(DA) 랫트 균주는 아고우티 코트 및 RT1 av1 단상형을 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 랫트는 챨스 리버(Charles River) 및 할란 레보러토리즈를 포함하는 다양한 소스로부터 이용 가능하다. DA 랫트로부터의 랫트 ES 세포주의 예는 DA.2B 랫트 ES 세포주 또는 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 랫트 균주의 다른 예는 예를 들어 US 제2014/0235933호, US 제2014/0310828호 및 US 제2014/0309487호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)호에 제공된다.
몇몇 방법 및 조성물에서, 동물은 하기 중 하나 이상의 유래가 아니다: 아코돈 종, 미오푸스 종, 마이크로투스 종 및 탈파 종. 마찬가지로, 몇몇 방법 및 조성물에서, 동물은 정상 야생형 특징 XY 암컷 생식력인 임의의 종 유래가 아니다.
III. 화합물을 스크리닝하는 방법
세포 또는 클론이 화합물의 존재 하에 배양될 때 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론에 대한 암컷화 활성을 가지는(즉, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하기 위한 세포 또는 클론의 성향을 증가시키는), 화합물을 스크리닝하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향은 이 클론에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 또는 활성과 역으로 상관된다. 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서의 이들 유전자 중 하나 이상의 발현의 소실은 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰된 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 침묵화가 더 많을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 마찬가지로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서 이들 유전자 중 하나 이상의 활성의 소실 또는 발현 및/또는 활성의 감소는 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰되는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현이 더 낮을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 즉, 이들 유전자 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 XY 암컷 생산을 예측하기 위한 대리 마커일 수 있다.
이 정보는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 높은 성향을 가지는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 생산하는 화합물을 스크리닝하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계(여기서, 제1 집단은 표적 화합물의 존재 하에 배양되고, 제2 집단은 표적 화합물의 부재 하에 배양됨)를 포함할 수 있다. 이후, 상기 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 및 제2 집단의 각각에서 하나 이상의 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이로써 암컷화 활성은, 제2 집단으로부터의 하나 이상의 세포와 비교하여, 제1 집단으로부터의 하나 이상의 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 감소에 의해 확인된다. 즉, 상기 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 및 제2 집단의 각각에서 하나 이상의 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 평가하는 단계 및 이후 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 제2 집단으로부터의 하나 이상의 세포와 비교하여 제1 집단으로부터의 하나 이상의 세포에서 감소하는 경우 표적 화합물을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 발현 및/또는 활성의 감소는 Ddx3y, Uty, Eif2s3y, Ddx3y 및 Uty, Ddx3y 및 Eif2s3y, Uty 및 Eif2s3y, 또는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y일 수 있다.
스크리닝될 수 있는 화합물의 예는 항체, 항원 결합 단백질, 부위 특이적 DNA 결합 단백질(예를 들어, CRISPR-Cas 복합체, CRISPRi 라이브러리, CRISPRa 라이브러리), 폴리펩타이드, 베타-턴 모방체, 폴리사카라이드, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머 N-치환된 글라이신 및 올리고카바메이트를 포함한다. 화합물의 큰 조합 라이브러리는 WO 제1995/012608호, WO 제1993/006121호, WO 제1994/008051호, WO 제1995/035503호 및 WO 제1995/030642호(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 코딩된 합성 라이브러리(ESL) 방법에 의해 구성될 수 있다. 펩타이드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법에 의해 또한 생성될 수 있다. 예를 들어, US 제5,432,018호(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)를 참조한다. 상이한 유전자에 CRISPR-Cas 시스템을 표적화하기 위한 가이드 RNA의 라이브러리의 사용은 예를 들어 WO 제2014/204727호, WO 제2014/093701호, WO 제2015/065964호, WO 제2016/011080호, Shalem et al. (2014) 343(6166):84-87(게놈 스케일 CRISPR-Cas9 넉아웃(GeCKO) 라이브러리) 및 Konermann et al. (2015) 517(7536):583-588 (CRISPR/Cas9 상승작용 활성화 매개인자(Synergistic Activation Mediator: SAM) 혼주된 라이브러리)(이들은 각각 모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
세포의 제1 집단은 임의의 시간 길이 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양될 수 있다. 예로서, 세포의 제1 집단은 평가 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양될 수 있다.
배지는 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않으면서 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분한 배지일 수 있다. 대안적으로, 배지는 암컷화 배지일 수 있다. 암컷화 배지(예를 들어, 배양물에서 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제, 여기서 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가짐) 및 이러한 배지에서 세포를 유지시키는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
표적 화합물의 암컷화 활성은 다수의 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 암컷화 활성은 제1 집단으로부터의 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성의 결여에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 암컷화 활성은 제2 집단으로부터의 세포와 비교하여 제1 집단으로부터의 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 모두의 발현 및/또는 활성의 감소에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 암컷화 활성은 제1 집단으로부터의 세포에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 모두의 발현 및/또는 활성의 결여에 의해 확인될 수 있다. 발현 및/또는 활성을 평가하는 방법은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
몇몇 스크리닝 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 기초하여 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 동물을 생산하기 위한 제1 집단으로부터의 공여자 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 단계(여기서, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 동물의 비율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성과 역으로 관련됨)를 추가로 포함할 수 있다.
공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 이후 숙주 배아로 도입될 수 있고, 숙주 배아는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 숙주 배아는 상실기전 배아일 수 있고, 숙주 배아는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 도입 시 포배기로 배양될 수 있다. 동물, 배아, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배아로 도입하는 방법 및 F0 동물을 생산하는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 전에 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 다양한 시간 동안 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 이하 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 몇몇 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 배아로의 세포의 주사까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다. 다른 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포가 주사된 배아는 대리모로 전달될 때까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다.
공여자 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 집단으로부터의 하나 이상의 세포를 평가한 후 선택될 수 있다. 평가 단계는 세포 또는 클론 자체를 평가하는 단계 및 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 또는 활성의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 예를 들어 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 이의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 서브클론의 백분율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 서브클론 중에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 필적하는 발현 및/또는 활성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있다. 대안적으로, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 예를 들어, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 검출 가능한 발현의 결여가 존재할 수 있다.
발현은 단백질 수준 또는 mRNA 수준에서 평가될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, FACS 분석, ELISA), 또는 간접적으로, 예를 들어 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 감소한 발현 및/또는 활성은 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현은 RT-PCR, RNA-seq, 디지털 PCR, 또는 mRNA 수준을 측정하기 위한 임의의 다른 적합한 방법에 의해 mRNA 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 예로서, RNA 수준은 대조군 유전자, 예컨대 B2m에 대해 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 경우에, 예를 들어 대조군 유전자(예를 들어, B2m)와 표적 유전자 사이의 ΔCt는 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 또는 적어도 8일 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 경우에, 30회, 31회, 32회, 33회, 34회, 35회, 36회, 37회, 38회, 39회 또는 40회 사이클 후 표적 유전자에 대한 검출 가능한 RNA가 없을 것이다.
임의로, mRNA 또는 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정할 때, Y 염색체의 존재를 확인하도록 대조군 실험을 수행할 수 있다. 예를 들어, Y 염색체 상의 상이한 게놈 서열에 프로브를 사용함으로써 Y 염색체의 하나의 카피의 존재를 확인하도록 TAQMAN(등록상표) 카피 수 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 게놈 내의 카피 수 변이를 측정하도록 설계된다.
유전자 또는 이것이 대상체 세포, 배아 또는 동물에서 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성의 감소는, 적절한 대조군 세포, 배아 또는 동물, 또는 대조군 세포, 배아 또는 동물의 집단과 비교할 때, 발현 또는 활성 수준의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 발현 또는 활성이 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 적절한 대조군 세포, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물(예를 들어, 동물 XY 다능성 세포)(암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고 역사적으로 전부 수컷 마우스를 생산하는 동물 XY 다능성 세포)에서의 발현 또는 활성보다 통계학적으로 더 낮은 경우 발현 또는 활성은 감소한다. 이러한 감소는 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과의 감소를 포함한다. 통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다. 발현 또는 활성의 감소는 임의의 단계에서의 임의의 기전을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 발현의 감소는 전사 동안에, 전사 후에, 번역 동안에 또는 번역 후에 발생하는 사건 또는 조절을 통해 발생한다.
"대상체 세포"는 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양된 것이거나, 암컷화 배지에서 배양된 세포로부터 유래한 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 암컷화 배지에서 배양되지 않거나, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, XY 암컷 마우스를 생산하는 역량이 결여되거나 역량의 감소를 가진다는 것을 제외하고는, 바람직하게는 대상체 세포와 가능한 한 가깝게 일치한다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원할 수 있거나, 동일한 유전자형을 가질 수 있음). 예를 들어, 대조군 세포는 (a) 대상체 세포와 동일한 유전자형의 세포, 또는 대상체 세포와 동일한 세포주 또는 클론으로부터 기원하지만 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 것(예를 들어, DMEM, 또는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 역량을 이것에 제공함으로써 세포를 변경하지 않는 또 다른 유형의 배지); (b) 대상체 세포와 유전적으로 동일하거나, 동일한 세포주 또는 클론으로부터 유래하지만 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생성시키는 가능성을 이것에 제공하는 조건 또는 자극에 노출되거나 유전적으로 변경되지 않은, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포; 및 (c) 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양되지만, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, 역사적으로 전부 수컷 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 및 전능성 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대조군 세포는 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포일 수 있다. 임의로, 발현 및/또는 활성의 감소는 제2 집단으로부터의 대조군 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포에 대해서일 수 있다.
몇몇 실험에서, 제1 집단에서의 2개 이상의 세포 또는 클론은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 평가된다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 세포 또는 클론은 이후 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론인 것으로 선택될 수 있고, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다.
Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 것은 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 더 높은 백분율, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 생애 한배 새끼의 더 높은 평균 수 및 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 더 높은 평균 한배 새끼 크기를 발생시킬 수 있다. 이러한 F0 자손은 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 숙주 배아로의 세포의 도입 및 숙주 배아의 수태 후에 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 생산될 수 있다.
증가는 적절한 대조군과 비교할 때 임의의 통계학적으로 유의미한 증가일 수 있다. 예를 들어, 증가는 적절한 대조군과 비교할 때 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배일 수 있다.
예를 들어, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
(예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
V. 암컷화 배지에서 성분의 농도를 최적화하는 방법
동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론에서 증가한 암컷화 활성(즉, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 세포 또는 클론의 증가한 성향)에 대해 암컷화 배지에서 성분의 농도를 최적화하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 클론의 성향은 이들 클론에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 또는 활성과 역으로 상관된다. 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서의 이들 유전자 중 하나 이상의 발현의 소실은 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰된 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 침묵화가 더 많을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 마찬가지로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포(예를 들어, XY ES 세포)에서 이들 유전자 중 하나 이상의 활성의 소실 또는 발현 및/또는 활성의 감소는 어떤 세포 클론이 F0 세대에서 XY 암컷 동물을 생산할 것인지를 예측할 수 있고, 관찰되는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현이 더 낮을수록, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 XY ES 세포 클론의 성향이 더 높다(예를 들어, 실시예 3 참조). 즉, 이들 유전자 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 XY 암컷 생산을 예측하기 위한 대리 마커일 수 있다.
이 정보는 증가한 암컷화 효과를 가지고 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산하는 높은 성향을 가지는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 생산하는 배지 성분의 최적 농도를 스크리닝하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계(여기서, 제1 집단은 표적 배지 성분의 제1 농도의 존재 하에 배양되고, 제2 집단은 제1 농도와 다른 표적 배지 성분의 제2 농도의 부재 하에 배양됨)를 포함할 수 있다. 제1 농도는 제2 농도보다 높거나 낮을 수 있다. 이후, 상기 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 및 제2 집단의 각각에서 하나 이상의 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 제2 집단으로부터의 하나 이상의 세포와 비교하여 제1 집단으로부터의 하나 이상의 세포에서 감소하는 경우 이후 제1 농도를 선택할 수 있다. 발현 및/또는 활성의 감소는 Ddx3y, Uty, Eif2s3y, Ddx3y 및 Uty, Ddx3y 및 Eif2s3y, Uty 및 Eif2s3y, 또는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y일 수 있다.
농도가 변경될 수 있는 배지 성분의 예는 알칼리 금속 및 할라이드의 염(예를 들어, 염화나트륨), 탄산염(예를 들어, 중탄산나트륨), 글루코스, 소 태아 혈청 (FBS), 글루타민, 항생제(들), 페니실린 및 스트렙토마이신(예를 들어, 펜스트렙), 피루베이트 염(예를 들어, 나트륨 피루베이트), 비필수 아미노산(예를 들어, MEM NEAA), 2-머캅토에탄올, 및 백혈병 저해 인자(LIF)를 포함한다. 농도가 변경될 수 있는 다른 배지 성분은 표 1에 기재되어 있다. 통상적인 배지 성분은 본 명세서에서 그 외 더 자세히 기재되어 있다.
세포의 제1 집단은 임의의 시간 길이 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양될 수 있다. 예로서, 세포의 제1 집단은 평가 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 표적 화합물의 존재 하에 배양될 수 있다.
배지는 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않으면서 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분한 배지일 수 있다. 대안적으로, 배지는 암컷화 배지일 수 있다. 암컷화 배지(예를 들어, 배양물에서 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제, 여기서 기본 배지 또는 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지는 약 200mOsm/㎏ 내지 약 329mOsm/㎏ 미만의 삼투질농도를 가짐) 및 이러한 배지에서 세포를 유지시키는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
배지 성분의 제1 농도의 암컷화 활성은 다수의 방식으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 세포가 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되는 경우 선택될 수 있다. 대안적으로, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 세포가 제2 집단으로부터의 세포와 비교하여 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 모두의 발현 및/또는 활성의 감소를 가지는 경우 선택될 수 있다. 대안적으로, 제1 농도는 제1 집단으로부터의 세포가 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 모두의 발현 및/또는 활성이 결여되는 경우 선택될 수 있다. 발현 및/또는 활성을 평가하는 방법은 하기 더 자세히 기재되어 있다.
몇몇 스크리닝 방법은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 기초하여 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 동물을 생산하기 위한 제1 집단으로부터의 공여자 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 단계(여기서, F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 비인간 동물의 비율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성과 역으로 관련됨)를 추가로 포함할 수 있다.
공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 이후 숙주 배아로 도입될 수 있고, 숙주 배아는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 숙주 배아는 상실기전 배아일 수 있고, 숙주 배아는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 도입 시 포배기로 배양될 수 있다. 동물, 배아, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배아로 도입하는 방법 및 F0 동물을 생산하는 방법은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 전에 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 다양한 시간 동안 배지에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 평가 단계 및/또는 숙주 배아로의 도입 전에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 이하 동안 암컷화 배지에서 유지될 수 있다. 몇몇 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포는 배아로의 세포의 주사까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다. 다른 방법에서, XY 다능성 또는 전능성 세포가 주사된 배아는 대리모로 전달될 때까지 암컷화 배지에서 배양되거나 유지된다.
공여자 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 제1 집단으로부터의 하나 이상의 세포를 평가한 후 선택될 수 있다. 평가 단계는 세포 또는 클론 자체를 평가하는 단계 및 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 또는 활성의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 예를 들어 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 이의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 서브클론의 백분율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 평가 단계는 클론으로부터 유래한 몇몇 서브클론을 평가하는 단계 및 서브클론 중에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 필적하는 발현 및/또는 활성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성은 감소할 수 있다. 대안적으로, 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성이 결여되거나, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현 및/또는 활성이 결여된다. 예를 들어, 모든 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 검출 가능한 발현의 결여가 존재할 수 있다.
발현은 단백질 수준 또는 mRNA 수준에서 평가될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, FACS 분석, ELISA), 또는 간접적으로, 예를 들어 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 감소한 발현 및/또는 활성은 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자의 발현은 RT-PCR, RNA-seq, 디지털 PCR, 또는 mRNA 수준을 측정하기 위한 임의의 다른 적합한 방법에 의해 mRNA 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 예로서, RNA 수준은 대조군 유전자, 예컨대 B2m에 대해 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 경우에, 예를 들어 대조군 유전자(예를 들어, B2m)와 표적 유전자 사이의 ΔCt는 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 또는 적어도 8일 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 경우에, 30회, 31회, 32회, 33회, 34회, 35회, 36회, 37회, 38회, 39회 또는 40회 사이클 후 표적 유전자에 대한 검출 가능한 RNA가 없을 것이다.
임의로, mRNA 또는 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정할 때, Y 염색체의 존재를 확인하도록 대조군 실험을 수행할 수 있다. 예를 들어, Y 염색체 상의 상이한 게놈 서열에 프로브를 사용함으로써 Y 염색체의 하나의 카피의 존재를 확인하도록 TAQMAN(등록상표) 카피 수 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 널리 공지되어 있고, 게놈 내의 카피 수 변이를 측정하도록 설계된다.
유전자 또는 이것이 대상체 세포, 배아 또는 동물에서 코딩하는 단백질의 발현 또는 활성의 감소는, 적절한 대조군 세포, 배아 또는 동물, 또는 대조군 세포, 배아 또는 동물의 집단과 비교할 때, 발현 또는 활성 수준의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 발현 또는 활성이 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 적절한 대조군 세포, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물(예를 들어, 동물 XY 다능성 세포)(암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고 역사적으로 전부 수컷 마우스를 생산하는 동물 XY 다능성 세포)에서의 발현 또는 활성보다 통계학적으로 더 낮은 경우 발현 또는 활성은 감소한다. 이러한 감소는 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과의 감소를 포함한다. 통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다. 발현 또는 활성의 감소는 임의의 단계에서의 임의의 기전을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 발현의 감소는 전사 동안에, 전사 후에, 번역 동안에 또는 번역 후에 발생하는 사건 또는 조절을 통해 발생한다.
"대상체 세포"는 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양된 것이거나, 암컷화 배지에서 배양된 세포로부터 유래한 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 암컷화 배지에서 배양되지 않거나, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, XY 암컷 마우스를 생산하는 역량이 결여되거나 역량의 감소를 가진다는 것을 제외하고는, 바람직하게는 대상체 세포와 가능한 한 가깝게 일치한다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원할 수 있거나, 동일한 유전자형을 가질 수 있음). 예를 들어, 대조군 세포는 (a) 대상체 세포와 동일한 유전자형의 세포, 또는 대상체 세포와 동일한 세포주 또는 클론으로부터 기원하지만 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 것(예를 들어, DMEM, 또는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 역량을 이것에 제공함으로써 세포를 변경하지 않는 또 다른 유형의 배지); (b) 대상체 세포와 유전적으로 동일하거나, 동일한 세포주 또는 클론으로부터 유래하지만 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생성시키는 가능성을 이것에 제공하는 조건 또는 자극에 노출되거나 유전적으로 변경되지 않은, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포; 및 (c) 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양되지만, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, 역사적으로 전부 수컷 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 및 전능성 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대조군 세포는 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포일 수 있다. 임의로, 발현 및/또는 활성의 감소는 제2 집단으로부터의 대조군 비인간 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포에 대해서일 수 있다.
몇몇 실험에서, 제1 집단에서의 2개 이상의 세포 또는 클론은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현 및/또는 활성에 대해 평가되고, 이후 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현 및/또는 활성을 가지는 세포 또는 클론은 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포 또는 클론인 것으로 선택될 수 있고, 여기서 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포는 F0 세대에서 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물을 생산할 수 있다.
Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택하는 것은 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 XY 자손의 더 높은 백분율, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 더 높은 백분율, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 생애 한배 새끼의 더 높은 평균 수 및 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대한 더 높은 평균 한배 새끼 크기를 발생시킬 수 있다. 이러한 F0 자손은 본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 숙주 배아로의 세포의 도입 및 숙주 배아의 수태 후에 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 생산될 수 있다.
증가는 적절한 대조군과 비교할 때 임의의 통계학적으로 유의미한 증가일 수 있다. 예를 들어, 증가는 적절한 대조군과 비교할 때 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배 또는 5배일 수 있다.
예를 들어, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 표현형 암컷 XY 동물인 F0 자손 또는 F0 XY 자손의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 자손에 대해 더 높다.
생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 생식력 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
(예를 들어, 야생형 암컷 동물과 비교하여) 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, 한배 새끼의 보통 수 및/또는 보통 한배 새끼 크기를 생산할 수 있는 F0 XY 암컷의 백분율은, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 자손에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 평균 한배 새끼 크기는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 한배 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포를 선택함으로써 또한 증가할 수 있다. 몇몇 방법에서, F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 의해 생산된 생애 새끼의 평균 수는, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 더 높은 발현 및/또는 활성을 가지는 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷과 비교할 때, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현 및/또는 활성을 가지는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포로부터 유래한 F0 XY 암컷 또는 생식력 있는 F0 XY 암컷에 대해 더 높다.
V. 다른 용도
본 명세서에서 그 외 개시된 바와 같은 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포를 유지시키고, Y 염색체의 영역의 침묵화를 확인하기 위해 XY 다능성 또는 전능성 세포를 평가함으로써 XY 다능성 또는 전능성 동물 세포(또는 시험관내 세포 배양물, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물)에서 Y 염색체의 영역을 침묵화하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 이러한 방법은 예를 들어 표적화된 변형이 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 사용되는 상황(예를 들어, 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성을 저해하기 위한 넉아웃)에서 용도가 발견될 수 있다. 암컷화 배지와의 배양을 통한 침묵화는 특이적인 표적화된 변형을 생성하는 것보다 훨씬 시간을 덜 필요로 하고, 이에 따라 침묵화를 달성하기 위한 더 효율적인 수단이다.
암컷화 배지의 예 및 이의 성분 및 특징은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다. 마찬가지로, 암컷화 배지에서 XY 다능성 또는 전능성 세포를 배양하기 위한 시기 및 시간 길이의 예는 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다.
암컷화 배지에서의 배양은 Y 염색체 유전자의 억제 또는 침묵화를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, Y 염색체의 영역, 예컨대 Y 염색체의 짧은 아암의 전부 또는 일부는 침묵화될 수 있다. Y 염색체의 짧은 아암의 침묵화는 Sry 유전자인 수컷 성 결정 경로의 중요한 조절인자로 연장될 수 있고, 이것은 마우스 배아 발생 동안 E11-E12로부터 정확한 시간에 충분히 발현하지 못해서, 양능성 생식 융기에서 암컷 성 결정 프로그램의 발현을 발생시킨다(실시예 1 및 도 2a-d 참조). 다른 유전자, 예컨대 Ddx3y 및 Eif2s3y는 또한 발현할 수 없다(실시예 1 및 도 3 및 도 4 참조). 그때부터, 성 전환된 배아는 암컷으로 분만되고(F0 세대), 이후 이의 XY 유전자형에도 불구하고 정상인 생식력 있는 암컷 마우스로 성장할 수 있다. 몇몇 방법에서, 암컷화 배지 유도된 Y 염색체 침묵화는 영구적인 유전적 변화가 아니고, F1 세대로 계속되지 않는다(즉, F0 XY 암컷의 F1 자손 중에 XY 암컷이 발견되지 않음).
Y 염색체의 작은 아암의 전부 또는 일부 이외에, 이들 내에, 또는 이들을 포함하여 암컷화 배지에 의해 침묵화될 수 있는 다른 Y 염색체의 영역은 본 명세서에서 그 외 개시되어 있다. 침묵화된 영역은 긴 아암(Yq), 특히 정자발생에 필요한 Y 염색체 상의 다른 유전자를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Sxra 영역의 전부 또는 일부(예를 들어, Sry 유전자를 함유하는 부분)를 포함할 수 있고/있거나, 영역은 마우스 Y 염색체의 Sxrb 영역의 전부 또는 일부(예를 들어, Zfy2 유전자를 함유하는 부분)(도 1A 참조) 또는 다른 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역(예를 들어, 인간 Y 염색체의 AZFa, AZFb 또는 AZFc 영역)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Sxra 및 Sxrb 영역 둘 다의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. Sxrb 영역의 경계는 예를 들어 Zfy1 및 Zfy2이다(도 1A 및 문헌[Mazeyrat et al. (1998) Human Molecular Genetics 7(11):1713-1724](모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨) 참조). 다른 동물 종으로부터의 상응하는 영역은 마우스 Y 염색체 상의 영역에서의 유전자에 이종상동성 또는 상동성인 하나 이상의 유전자를 가지는 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 영역의 AZFa 영역은, 각각의 영역이 Uty, Dby(Ddx3y) 및 Dffry(Usp9y)를 함유한다는 점에서, 마우스 Y 염색체의 Sxrb 영역에 상응한다. 예를 들어, 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol. Med., Jan. 3; 2001: 1-16; Mazeyrat et al. (1998) Human Molecular Genetics 7(11);1713-1724; 및 Sargent et al. (1999) J. Med . Genet. 36:370-377](이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다. 영역은 또한 Smy 영역 또는 Spy 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(도 1A 및 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol. Med., Jan. 3; 2001: 1-16] 참조). 마찬가지로, 영역은 마우스 Y 염색체의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2, 결실 간격 3, 결실 간격 4, 결실 간격 5, 결실 간격 6 및 결실 간격 7 또는 다른 동물 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1A 및 문헌[Affara (2001) Expert Rev. Mol . Med ., Jan. 3; 2001: 1-16] 참조). 예를 들어, 영역은 마우스 Y 염색체의 하나 이상의 결실 간격 1, 결실 간격 2 및 결실 간격 3 또는 다른 동물 종으로부터의 상응하는 Y 염색체의 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다(예를 들어, 도 1A 참조). 일 예에서, 영역은 결실 간격 2 및 결실 간격 3, 또는 결실 간격 2의 일부 및 결실 간격 3의 일부를 포함할 수 있다.
영역은 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 영역은 Rbmy 클러스터에 대한 텔로머일 수 있거나, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1에 대한 동원체 또는 텔로머일 수 있다. 예를 들어, 영역은 Kdm5d의 텔로머 또는 Uspy9y의 동원체인 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있거나, 영역은 Zfy2, Sry 또는 Rbmy 클러스터의 텔로머일 수 있다. 영역은 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상을 배제할 수 있다. 마찬가지로, 영역은 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상의 외부의 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 영역은 Rbmy 클러스터, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상의 외부의 Y 염색체의 부분을 포함할 수 있다.
침묵화는 Y 염색체에 위치한 유전자에 의해 코딩된 단백질의 수준 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질의 수준 및/또는 활성은 감소할 수 있다. 대안적으로, 침묵화는 Y 염색체에 위치한 유전자의 발현을 제거할 수 있다(즉, 유전자는 발현되지 않음). 몇몇 방법에서, 예를 들어 하나 이상의 Rbmy 클러스터, H2al2y, Sry, Zfy2, Usp9y, Ddx3y, Uty, Tspy -ps, Eif2s3y, Kdm5d, Uba1y 또는 Zfy1 중 하나 이상은 침묵화시 발현되지 않는다. 몇몇 방법에서, Ddx3y, Eif2s3y, Zfy2 및 Sry 에 의해 코딩된 하나 이상의 단백질의 수준 및/또는 활성은 감소하거나, Ddx3y, Eif2s3y, Zfy2 및 Sry 중 하나 이상은 발현되지 않는다.
대상체 세포, 배아 또는 동물에서의 발현 또는 활성의 감소는, 적절한 대조군 세포, 배아 또는 동물과 비교할 때, 발현 또는 활성 수준의 임의의 통계학적으로 유의미한 감소를 포함할 수 있다. 일반적으로, 발현 또는 활성이 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 적절한 대조군 세포, 배아 또는 이들로부터 유래한 동물(예를 들어, 동물 XY 다능성 세포)(암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고 역사적으로 전부 수컷 마우스를 생산하는 동물 XY 다능성 세포)에서의 발현 또는 활성보다 통계학적으로 더 낮은 경우 발현 또는 활성은 감소한다. 이러한 감소는 대조군 세포에 비해 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 이것 초과의 감소를 포함한다. 통계학적 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
"대상체 세포"는 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양된 것이거나, 암컷화 배지에서 배양된 세포로부터 유래한 세포이다. "대조군" 또는 "대조군 세포"는 대상체 세포의 표현형의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공한다. 대조군 세포는, 이것이 암컷화 배지에서 배양되지 않거나, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, XY 암컷 마우스를 생산하는 역량이 결여되거나 역량의 감소를 가진다는 것을 제외하고는, 바람직하게는 대상체 세포와 가능한 한 가깝게 일치한다(예를 들어, 각각의 세포는 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원할 수 있거나, 동일한 유전자형을 가질 수 있음). 예를 들어, 대조군 세포는 (a) 대상체 세포와 동일한 유전자형의 세포, 또는 대상체 세포와 동일한 세포주 또는 클론으로부터 기원하지만 암컷화 배지가 아닌 적절한 조절 배지에서 배양된 것(예를 들어, DMEM, 또는 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포의 다능성 또는 전능성을 유지시키기에 충분하지만 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 역량을 이것에 제공함으로써 세포를 변경하지 않는 또 다른 유형의 배지); (b) 대상체 세포와 유전적으로 동일하거나, 동일한 세포주 또는 클론으로부터 유래하지만 생식력 있는 암컷 XY 동물을 생성시키는 가능성을 이것에 제공하는 조건 또는 자극에 노출되거나 유전적으로 변경되지 않은, 동물 XY 다능성 또는 전능성 세포; 및 (c) 암컷화 배지(예를 들어, 저 삼투질농도 배지)에서 배양되지만, 암컷화 배지에서 이것이 배양됨에도 불구하고, 역사적으로 전부 수컷 동물을 생산하는 동물 XY 다능성 및 전능성 세포를 포함할 수 있다.
발현 또는 활성의 감소는 임의의 단계에서 임의의 기전을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 발현의 감소는 영역에 직접적으로 또는 간접적으로 만들어진 변형을 통해 또는 전사 동안에, 전사 후에, 번역 동안에 또는 번역 후에 발생하는 사건 또는 조절을 통해 발생할 수 있다.
기전의 이해는 실행에서 필요하지 않지만, Y 염색체 상의 히스톤 변이체 γH2AX의 인산화 형태의 수준의 증가 및/또는 염색질의 변경은 침묵화에 기여할 수 있다. 인산화 히스톤 γH2AX는 전사 억제와 연관되는 것으로 공지되어 있고, 감수분열 전기 동안 XY 성 육체에서 X 및 Y 염색체의 전사 억제와 연관된다. 예를 들어, 문헌[Alton et al. (2008) Reproduction 135:241-252]을 참조한다.
XY 다능성 또는 전능성 세포가 배양될 때에, 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포가 숙주 배아로 도입된 후에 또는 공여자 XY 다능성 또는 전능성 세포를 포함하는 숙주 배아가 수혜자 암컷 동물로 도입된 후에 침묵화가 발생할 수 있다. 배아 발생의 상이한 단계 동안에 또는 배아 발생에 걸쳐 침묵화가 또한 발생할 수 있다. 몇몇 경우에, 침묵화는 출현 후에 계속된다. 예를 들어, 난모세포가 수정된 후, 처음의 2개 세포 분열에 걸쳐 약간의 침묵화가 유지될 수 있다. 침묵화에 의해 생긴 성 전환은 또한 F1 자손으로 전달될 수 있다. 침묵화가 발생하는 기간 중 몇몇 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다: (1) 수컷 성 결정 프로그램이 관여할 때 배아 발생 동안에; (2) 마우스에서 E11-E12에 상응하는 적어도 발생 단계(예를 들어, 성 결정 또는 성 전환에 중요한 발생 단계)까지 배아 발생 동안에; (3) 마우스에서 E17-E19에 상응하는 적어도 발생 단계(예를 들어, 배아 난모세포에서의 생식력에 중요한 발생 단계)까지 배아 발생 동안에; (4) 난자형성의 기간에 걸쳐; (5) 출현 직전에 배아를 개시시키는, 난모세포 발생에서의 감수분열 전기 동안에; (6) 난모세포가 수정된 후(예를 들어, 처음의 2개 세포 분열 동안에); 또는 (7) 난모세포 배란 후에 걸쳐 처음의 2개 세포 분열 수정 후에.
Y 염색체의 영역의 침묵화에 대해 세포를 평가하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 침묵화된 영역 내에 유전자는 발현되지 않을 수 있다(예를 들어, 발현은 제거되거나, 세포는 유전자의 검출 가능한 발현이 결여됨). 유전자의 전사가 수행되지 않을 때 또는 당해 분야에 공지된 흔한 기법에 의해 유전자의 생성물(예를 들어, mRNA 또는 단백질)의 검출 가능한 수준이 없을 때, 유전자는 발현되지 않는다. 폴리펩타이드의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어 세포 또는 유기체에서의 폴리펩타이드의 수준에 대해 평가함으로써(예를 들어, 웨스턴 블롯 분석, FACS 분석, ELISA), 또는 간접적으로, 예를 들어 폴리펩타이드의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다른 경우에, 유전자의 감소한 발현 및/또는 활성은 예를 들어 싸우던 블롯 분석, DNA 서열분석, PCR 분석, 노던 블롯 분석, 정량적 RT-PCR 분석, 차세대 서열분석(NGS), 마이크로어레이 분석 또는 표현형 분석을 포함하는 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 평가는 Y 염색체 상의 어떤 영역, 하위영역 또는 유전자가 침묵화되는지를 확인하는 것을 또한 포함할 수 있다.
상기 및 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 수탁 번호 등은, 각각의 개별 항목이 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함된다. 서열의 상이한 버전이 다른 시간에 수탁 번호와 연관되는 경우, 본원의 유효 출원일에 수탁 번호와 연관된 버전이 의도된다. 유효 출원일은, 적용 가능한 경우, 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일 중 더 이른 것을 의미한다. 마찬가지로, 공보, 웹사이트 등의 상이한 버전이 다른 시간에 공개된 경우, 다르게 표시되지 않은 한, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전이 의도된다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 구성요소, 실시형태 또는 양태는, 구체적으로 다르게 표시되지 않은 한, 임의의 다른 것과 조합될 수 있다. 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예로서 약간 자세히 기재되어 있지만, 첨부된 청구항의 범위 내에 소정의 변경 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 명확할 것이다.
서열의 간단한 설명
동반된 서열 목록에 기재된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 철자 축약 및 아미노산에 대해 3철자 코드를 사용하여 표시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 말단에서 시작하여 3' 말단으로 앞으로 향하는(즉, 각각의 선에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로) 표준 관례를 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 유일한 하나의 가닥이 표시되어 있지만, 상보성 가닥은 표시된 가닥을 임의로 참조하여 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카복시 말단으로 앞으로 향하는(즉, 각각의 선에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로) 표준 관례를 따른다.
실시예
실시예
1.
XY
ES
세포로부터의 생식력 있는
가임성
F0
XY
암컷 마우스의 생성.
재료 및 방법
ES 세포 배양물 . 여기에 기재된 모든 결과는 본 발명자들의 C57BL6NTac/129S6SvEv F1 하이브리드 XY ES 세포주인 VGF1에 의해 수행된 실험으로부터의 것이다(Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:91-99; Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol . 21:652-659). ES 세포를 이전에 기재된 바대로 배양하였다(Matise et al. (2000) Production of targeted embryonic stem cell clones. In: Joyner AL (ed) Gene targeting: a practical approach. Oxford University press, New York, pp 101-132). 표 3에 표시된 NaHCO3 농도를 가지는 맞춤 제조된 고 글루코스 DMEM 배지(LifeTech)를 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 나트륨 피루베이트, 0.1mM 2-머캅토에탄올, 4mM L-글루타민, 100U/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(라이프 테크롤로지스(Life Technologies)), 15% FBS(Hyclone) 및 2,000U/㎖ 백혈병 저해 인자(LIF, 밀리포어)에 의해 보충하였다. 배지의 삼투질농도를 단일 샘플 Osmometer(Advanced Instruments, Inc. 모델 3250)에 의해 측정하였다. 전기천공을 위해, 본 발명자들은 120㎕의 전기천공 완충제(밀리포어) 중에 용해된 1.5㎍의 표적화 벡터 DNA를 7.5x106개의 ES 세포와 혼합하고, BTX 다중웰 전기천공 플레이트(Harvard Apparatus)로 옮겼다. 전기천공 후, 세포를 2개의 15㎝ 젤라틴화 접시에서 플레이팅하기 전에 10분 동안 얼음에서 항온처리하였다. 선택 배지를 전기천공 후 48시간에 첨가하고, 이후 매일 바꿨다. 콜로니를 전기천공 후 10일에 선별하고, 트립신을 함유하는 96웰 플레이트의 개별 웰로 옮기고, 이후 세포를 젤라틴화 96웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 3일 후, 세포를 다시 트립신 처리하고, 각각의 웰의 함량의 ⅔를 냉동시키고, 남은 ⅓을 DNA 추출을 위해 새로운 플레이트로 옮겼다.
ES 세포 스크리닝, 마우스 유전자형분석 , 및 X 및 Y 염색체 카운팅 . 본 발명자들은 표적화된 ES 세포 클론을 정확히 확인하고 마우스 대립유전자 유전자형을 결정하기 위해 대립유전자 소실 방법(Frendewey et al. (2000) Methods Enzymol . 476:295-307)을 이용하였다. 본 발명자들은 하기 TAQMAN(등록상표) 정량적 PCR(qPCR) 검정(Biosearch Technologies)에 의해 X 및 Y 염색체 수를 결정하였다: X에 대해, 프라이머 (5'-3') GGAGGGTAGCACGGGAAGAAG(서열 번호 45) 및 GCTGGCTACCCACTTGATTGG(서열 번호 46) 및 프로브 TCAAGCAGTCTCTCCCAGCTAACCTCCCT(서열 번호 47); 및 Y에 대해, 프라이머 GATCAGCAAGCAGCTGGGAT(서열 번호 48) 및 CTCCTGGAAAAAGGGCCTTT(서열 번호 49) 및 프로브 CAGGTGGAAAAGCCTTACAGAAGCCGA(서열 번호 50). 스위스 웹스터 균주가 보유하고 VGF1 ES 세포 게놈에 존재하지 않는 티로시나제 유전자에서의 알비노 돌연변이에 대한 qPCR 검정은 숙주 배아 기여를 정량화하였다. 이 검정의 검출의 한계는 2,000개의 반수체 게놈 등가물에서의 대략 1개의 알비노 대립유전자이다(Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol . 25:91-99). 절개한 비장을 스펙트럼 핵형분석(spectral karyotyping: SKY)을 위해 Van Andel Institute(미시간주 그랜드 래피즈)로 보냈다.
미량주사. 주사 일에, ES 세포를 트립신 처리하고, LIF가 없는 ES 세포 배지 중에 재현탁시켰다. 냉동된 8-세포 스위스 웹스터 배아(챨스 리버 레버로토리즈)를 해동하고, 미량주사 전 90분 동안 7.5% CO2에서 37℃에서 KSOM 배지(밀리포어)에서 항온처리하였다. 8-세포 배아로의 ES 세포의 주사를 이전에 기재된 바대로 수행하였다(Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol . 25:91-99). 주사 후, 배아를 밤새 배양하고, 교미 후 2.5일에 상상임신 수혜자 암컷 마우스로 전달하였다.
결과
교배 및 표형형분석 연구 둘 다에 대한 벨로시마이스(등록상표)의 수율을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 유전자 표적화 실험 동안 및 8-세포 배아 주사 전에 다양한 ES 세포 배양 배지를 시험하였다. 본 발명자들이 평가한 하나의 성분은 넉아웃 TM DMEM(KO-DMEM, 라이프 테크롤로지스)으로 공지된 기본 배지이다. 초기에, 본 발명자들이 더 적은 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 얻었다는 점에서, 표준 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)에 의해 만들어진 배지에서 유지된 세포와 비교하여, KO-DMEM에 의해 제조된 배지에서 성장한 ES 세포가 불량하게 수행되는 것으로 보였다. 그러나, 본 발명자들은 또한 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 큰 증가를 관찰하였다: 34개의 상이한 유전자에 대한 표적화 실험으로부터 유래한 78개의 클론의 주사로부터 생산된 벨로시마이스(등록상표)의 31%는 암컷이었다(표 3, KO-DMEM). 종래의 DMEM 배지에서 성장한 500개 초과의 표적화된 ES 세포 클론의 주사에 대한 본 발명자들의 마우스 생산 데이터베이스에 기록된 결과의 후향적 비교는 모든 벨로시마이스(등록상표)의 오직 1%가 암컷으로서 확인되었다는 것을 밝혀냈다(표 3, DMEM). 희귀한 암컷 벨로시마이스(등록상표)는 교배되지 않았고, 추가로 조사되지 않았다. KO-DMEM 배지에서 성장한 XY ES 세포 클론으로부터의 암컷의 높은 발생률에도 불구하고, 이 실험으로부터의 수컷 및 암컷인 벨로시마이스(등록상표)의 18%의 총 수율은 DMEM 배지에서 유래한 클론에서의 본 발명자들의 역사적 경험과 동일하였다(표 3, KO-DMEM 및 DMEM).
KO-DMEM에서 성장한 ES 세포 클론은 0 내지 60%의 범위인 비율로 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다. 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 성향은 각각의 클론에 특이적이었다. 암컷을 생산하지 않는 클론을 반복 미량주사에서 이 특질에서 유지시키는 한편, 암컷을 생성시키는 클론은 반복 미량주사 실험에서 대략 동일한 비율의 암컷을 생성하는 경향이 있었다. 본 발명자들이 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 클론의 능력을 변경할 수 있는지를 보기 위해, 본 발명자들은 배지 변경 실험을 수행하였다. 전체 표적화 과정(전기천공, 약물 내성 콜로니의 선택, 표적화된 돌연변이에 대한 스크리닝, 증시 및 냉동보존)에 DMEM 기반 또는 KO-DMEM 기반 배지에서 ES 세포가 성장하거나 유지되는 유전자 표적화 실험으로부터의 ES 세포 클론을 해동하고, 8-세포 배아로의 미량주사를 위한 준비에서 3일 동안 반대의 배지에서 성장시켰다. 배아가 배반포로 분화하게 하는 KSOM에서의 밤샘 항온처리 후, 이것을 대리모로 전달하였다. 본 발명자들은 살아서 태어난 벨로시마이스(등록상표) 중에서 생산된 XY 암컷의 비율을 점수 매겼다.
KO-DMEM로의 DMEM의 스위칭을 위해, 본 발명자들은 DMEM 배지에서 수행된 5개의 상이한 유전자 표적화 실험으로부터 11개의 클론을 선택하고 해동하고 대조군으로서 KO-DMEM 또는 DMEM 중 어느 하나에서 이들을 성장시켰다. DMEM으로부터 KO-DMEM으로 스위칭된 ES 세포로부터 전달된 대략 400개의 배아는 105마리의 살아서 태어난 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였고, 이들 중 불과 2마리(1.9%)는 암컷(표 4, DMEM에서의 표적화, KO-DMEM에서의 해동)이고, DMEM에서 유지된 ES 세포가 주사된 대조군 배아에 의해 생산된 암컷의 비율(2.4%)과 유사하다(표 4, DMEM에서의 표적화, DMEM에서의 해동). 상호 실험을 위해, 본 발명자들은 KO-DMEM에서 수행된 표적화 실험으로부터 3개의 클론을 선택하고 해동하고 대조군으로서 DMEM 또는 KO-DMEM 중 어느 하나에서 이들을 성장시켰다. KO-DMEM으로부터 DMEM으로 스위칭된 ES 세포로부터 전달된 300개의 배아는 41마리의 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였고, 이들 중 8마리(20%)는 암컷(표 4, KO-DMEM에서의 표적화, DMEM에서의 해동)이고, KO-DMEM에서 유지된 ES 세포가 주사된 대조군 배아에 의해 생산된 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 비율(18%)과 유사하다(표 4, KO-DMEM에서의 표적화, KO-DMEM에서의 해동).
이 결과는 DMEM 기반 배지에서 유래한 클론이 본 발명자들의 역사적인 경험과 유사하게 암컷 벨로시마이스(등록상표) 생산의 낮은 빈도를 유지한다(표 3, DMEM)는 것을 나타내고, 본 발명자들은 KO-DMEM에 대한 잠깐의 노출에 의해 이 빈도를 증가시킬 수 없었다. 유사하게, KO-DMEM 기반 배지에서 유래한 클론은 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 더 높은 빈도를 생성하였고, DMEM에 대한 잠깐의 노출은 암컷을 생산하는 XY 클론의 성향을 감소시키지 않았다. 실험의 아암 둘 다에서, DMEM 또는 KO-DMEM 중 어느 하나의 편차에도 불구하고, 해동 후 KO-DMEM에 노출된 클론은 DMEM 배지에서 해동된 것(10% 및 14%)과 비교하여 전체 벨로시마우스(등록상표) 생산의 더 높고 유사한 효율(27% 및 28%)을 가졌다.
XY ES 세포로부터 완전히 유래한 해부학적으로 정상인 암컷. 암컷 벨로시마우스(등록상표) 현상에 대한 설명으로서 키메라 현상을 제거하기 위해, 본 발명자들은 코트 색상 기여에 의해 명확히 완전히 ES 세포 유래인 모든 암컷이 꼬리 생검에 대한 qPCR 검정에 의해 진정한 벨로시마이스(등록상표)라는 것을 확인하였고, 이 생검은 ES 세포가 주사된 스위스 웹스터 8-세포 숙주 배아로부터의 유전적 기여를 나타내지 않았다(Poueymirou et al. (2007) Nat. Biotechnol . 25:91-99). 본 발명자들은 암컷 벨로시마이스(등록상표)가 배타적으로 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 XO ES 세포로부터 유래하지만, 이 가능성이 qPCR 염색체 계수 검정에 의해 제거된다는 것을 알았고, 이 검정은 암컷 벨로시마이스(등록상표)(이하 XY 암컷이라 칭함)가 X 및 Y의 각각의 하나의 카피를 가진다는 것을 확립하였다. XY qPCR 결과는 5마리의 XY 암컷으로부터 취한 비장 세포의 SKY에 의해 확인되었고, 이것은 또한 검출 가능한 전위 또는 결실이 없는 정상 상염색체를 밝혀냈다.
15마리의 XY 암컷의 복강의 조사는 정상 암컷 해부구조가 내부 장기로 연장된 외부 성기에서 모든 XY 암컷에 의해 나타냈다는 것을 확인시켜주었다. 모두 반음양, 난정소, 또는 불완전한 암컷 성 발생의 다른 표시를 나타내지 않는 정상 암컷 생식기를 나타냈다. 이들은 정상 난관 및 잘 혈관화된 자궁 뿔을 보유하고, 활성 배란 과정을 제시하는 출혈체를 가지는 기능성 난소를 가지는 것으로 보였다. 또한, 본 발명자들은 XY 암컷이 교배에 의해 유래한 야생형 암컷 마우스에서 보인 값의 범위 내인 체중 및 혈청 화학 프로필을 가진다는 것을 밝혀냈다.
암컷 성 장기에서 조직 특이적 숙주 배아 키메라 현상의 가능성을 제거하기 위해, 본 발명자들은 정상 해부구조에 대해 조사된 15마리의 XY 암컷으로부터 절개된 조직에서 X 및 Y 염색체 및 스위스 웹스터 숙주 배아 마커에 대한 qPCR 검정을 수행하였다. 모든 마우스에 대해, 본 발명자들은 무의 숙주 배아 기여 및 난소, 난관 및 자궁을 포함하는 모든 조직에서의 X 및 Y 염색체의 각각의 하나의 카피를 발견하였다. 본 발명자들은 XY 암컷이 정상 수컷 핵형을 가지고, 주사된 XY ES 세포로부터 완전히 유래하고, 숙주 배아로부터 검출 가능한 유전적 기여를 나타내지 않는다고 결론지었다. 이들은 정상 암컷 마우스로부터 구별 불가능한 외부 및 내부 해부구조를 제시한다.
성 전환된 XY 암컷은 생식력 있고 가임성이다 . XY 암컷의 생식력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 다수의 독립적인 XY 유전자 표적화된 ES 세포 클론으로부터 유래한 119마리의 암컷 F0 벨로시마이스(등록상표)(50% C57BL/6N: 50% 129SvEvS6)를 야생형 C57BL/6NTac 수컷과 교배하였다. 63퍼센트(75마리)의 XY 암컷은 적어도 한 마리의 한배 새끼를 생산하였다. 생식력의 이 수준은, 동일한 모 ES 세포주로부터 유래한 F1 세대(75% C57BL/6N: 25% 129SvEvS6) XX 암컷에 대한 생산 교배에서 본 발명자들이 관찰한 대략 90%의 생식력보다 낮지만, 암컷에 대한 수컷의 성 전환의 이전에 기재된 사례와 비교하여 대단히 높다. XY 암컷의 가임능력을 정상 교배에 의해 생성된 XX 암컷과 비교하기 위해, 본 발명자들은 C57BL/6NTac 수컷과 18마리의 XY 암컷 또는 14마리의 야생형 XX F1 암컷을 교배하였다. 9개월 기간에 걸쳐, 본 발명자들은, 암컷마다 생산된 새끼 및 한배 새끼, 및 한배 새끼 크기인, 가임능력의 3개의 측정치에 대해 XY 암컷 엄마와 XX 대조군 사이의 상당한 차이를 관찰하지 못했다(표 5).
암컷으로의 수컷의 성 전환 특징은 F1 세대로 전달되지 않는다. XY 암컷 특징의 유전성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 XY 암컷과 C57BL/6NTac 수컷 사이의 짝짓기로부터의 394개의 F1 자손에서의 X 및 Y 염색체 수를 정량화하였다. 본 발명자들은 표현형으로 암컷인 자손 중 어느 것도 XY 유전자형을 가지지 않고, 적어도 하나의 Y 염색체를 가지는 모든 마우스가 표현형으로 수컷이라는 것을 발견하였다. 그러나, 본 발명자들은 암컷(134)보다 2배 많은 수컷(260) 및 수컷 및 암컷 마우스 둘 다에서 비정상 성 염색체 수를 관찰하였다. 비정상 수컷 핵형(XXY 및 XYY)은 XY ES 세포의 배반포 주사에 의해 생산된 암컷 키메라의 교배로부터의 F1 자손에서 보고되었고(Bronson et al. (1995) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:3120-3123), 불임과 연관되었다. 본 발명자들은 또한 XY 암컷의 XXY 및 XYY 수컷 F1 자손이, 무정자이거나 극도로 낮은 정자 수를 가지는 매우 작은 고환을 가지며, 불임이라는 것을 발견하였다.
XY ES 세포로부터 XY 암컷의 생성을 촉진하는 배지 조건. KO-DMEM에 기초한 배지에서 성장한 ES 세포는 종래의 DMEM 배지에서 성장한 클론보다 8-세포 배아로의 주사 후 XY 암컷을 생산하는 훨씬 더 높은 성향을 가졌다(표 3). 공급자의 사양은 이들 기본 배지 사이에 삼투질농도의 차이를 나타낸다: DMEM에 대한 대략 340mOsm/㎏와 비교된 KO-DMEM에 대한 대략 275mOsm/㎏. 본 발명자들은 따라서 염 및 당 성분의 농도를 변경함으로써 감소한 측정된 삼투질농도를 가지는 DMEM의 변형된 버전(mDMEM)을 제조하고, 이후 변형된 배지에서 생성된 표적화된 ES 세포에 대한 벨로시마우스(등록상표) 생산을 평가하였다(표 3). 다른 실험에서, XY ES 세포 및 이들 ES 세포로부터 생산된 F0 마우스에 대해 효과에 대해 상이한 삼투질농도, 염 농도 및 탄산염 농도를 시험하였다. 생식력 있는 F0 XY 암컷은 3.0 내지 6.4㎎/㎖(약 51.3mM 내지 약 109.5mM)의 알칼리 금속 및 할라이드의 염(예를 들어, NaCl)의 농도 및 1.5 내지 3.7㎎/㎖(약 17.9mM 내지 약 44.0mM)의 탄산의 염(예를 들어, NaHCO3)의 농도에서 218 내지 322mOsm/㎏의 삼투질농도에서 성공적으로 생산되었다(표 6 및 7). 표 7에서의 2열(DMEM)에 대해, 기본 배지의 통상적인 삼투질농도는 337 내지 341 또는 340 내지 341mOsm/㎏이고, 완전한 배지(DMEM과 15% FBS, pen/strep, 비필수 아미노산, 나트륨 피루베이트, 베타-머캅토에탄올, L-글루타민 및 LIF)에 통상적인 삼투질농도는 329 내지 338mOsm/㎏이다. 표 7에서의 1열(KO-DMEM)에 대해, 기본 배지의 통상적인 삼투질농도는 271 내지 278mOsm/㎏이고, 완전한 배지(KO-DMEM 기본 배지와 15% FBS, pen/strep, 비필수 아미노산, 나트륨 피루베이트, 베타-머캅토에탄올, L-글루타민 및 LIF)에 통상적인 삼투질농도는 278 내지 280mOsm/㎏이다. 표 7에서의 4열(낮은 NaCl 기본 배지)에 대해, 기본 배지에 통상적인 삼투질농도는 200mOsm/㎏이고, 완전한 배지에 통상적인 삼투질농도는 약 216mOsm/㎏이다.
변동이 XY 암컷의 생산의 변화와 지속적으로 상관되는 유일한 성분은 다른 염의 농도, 측정된 삼투질농도 또는 pH와 무관하게 중탄산나트륨이었다. 본 발명자들이 시험한 4개의 변형된 배지를 비교할 때 중탄산나트륨 농도의 효과가 보였다. 유전자 표적화 실험에서 DMEM 배지의 것과 동일한 중탄산나트륨 농도(44mM)를 가지는 mDMEM-1에 기초한 배지(표 3)의 사용은, DMEM 배지와 비교하여 감소한 측정된 삼투질농도에도 불구하고, 낮은 비율(5.7%)의 XY 암컷을 생성시키는 ES 세포를 생산하였다. DMEM의 것보다 낮게 중탄산나트륨 농도를 감소시키는 것(mDMEM-2에 대해 26mM 및 mDMEM-3 및 -4에 대해 18mM)은 본 발명자들이 KO-DMEM에 의해 관찰한 비율과 유사하게 평균 30%의 XY 암컷을 생산하였다(표 3). mDMEM-4 배지는 가장 낮은 삼투질농도를 가지고, XY 암컷의 가장 높은 비율(34%) 및 총 벨로시마우스(등록상표) 생산의 가장 높은 효율(25%) 둘 다를 생성하였다. 그러나, 저 삼투질농도는 XY 암컷의 높은 빈도와 항상 상관되지 않았다. mDMEM-1 및 -3 배지는 거의 동일한 삼투질농도를 가지지만, XY 암컷의 매우 상이한 비율을 촉진하였다. 일반적으로, 본 발명자들은 XY 암컷을 생산하는 배지의 경향과 완전한 ES 세포 유래 F0 마우스의 수율 사이의 직접적인 상관관계를 관찰하였다.
동질유전자 XY 수컷 및 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 교배로부터 유래한 마우스의 표현형분석. 생식력 있는 가임성 XY 암컷의 가치를 예시하는 예로서, 본 발명자들은 이형접합성 동질유전자 XY 수컷 및 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 교배로부터 유래한 F1 세대 넉아웃 마우스의 표현형을, 카텝신 K를 코딩하는 Ctsk(골 항상성에 중요한 시스테인 프로테아제); 및 클라우딘-7을 코딩하는 Cldn7(밀착 연접의 주요 성분)인, 2개의 유전자에 대해, 종래의 교배로부터 유래한 F2 생성 넉아웃 마우스의 것과 비교하였다. 둘 다에 대해, 본 발명자들은 전체 코딩 영역을 시작 코돈과 인프레임으로 융합된 베타-갈락토시다제 리포터를 코딩하는 서열, 이어서 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 약물 선택 카세트에 의해 대체하였다. 본 발명자들은 F0 XY 암컷을 이의 클론성 형제자매 XY 수컷 벨로시마이스(등록상표)와 교배함으로써 야생형(+/+), 이형접합성(+/-) 및 동형접합성 넉아웃(-/-) 마우스의 F1 세대 연구 코호트를 생산하였다. Cldn7 넉아웃에 대해, 본 발명자들은 F1 이형접합성 마우스를 생성하도록 수컷 F0 벨로시마이스(등록상표)를 C57BL/6NTac 암컷과 교잡함으로써 추가 종래의 교배 대조군을 생산하고, 이후 이들 마우스를 상호교잡하여 F2 연구 코호트를 생산하였다.
Ctsk 넉아웃 마우스의 이전의 보고와 일치하게, 본 발명자들은 XY 암컷 교배에 의해 생산된 Ctsk-/- 마우스가 생존가능하고 생식력 있지만, 이들의 Ctsk+/+ 한배 새끼와 비교하여 이들이 암컷에서의 상당한 BMD 증가 및 대퇴골 섬유주의 보유의 증가를 포함하는 다수의 골 결함을 발현한다는 것을 발견하였다. 이전에 보고된 Cldn7 넉아웃으로부터 예상된 것처럼, 종래의 및 XY 암컷 교배 계획 둘 다로부터의 Cldn7-/- 마우스는 왜소하고 출생 후 수일에 죽었다. 살아서 태어난 마우스 중에서, 본 발명자들은 종래의 교배(Cldn7+/+, 32; Cldn7+/-, 74; Cldn7-/-, 13; P = 4.2 x 10-7, χ2 시험) 및 XY 암컷 교배(Cldn7+/+, 54; Cldn7+/-, 108; Cldn7-/-, 24; P = 9.2 x 10-4, χ2 시험) 둘 다에 의해 생산된 동형접합성 돌연변이체 마우스의 감소한 수를 관찰하였고, 이는 불완전하게 파고드는 배아 치사율을 나타낸다. 신장 결함과 일치하고 공개된 돌연변이체 마우스와 동일하게, 종래의 및 XY 암컷 교배 계획 둘 다로부터의 Cldn7-/- 신생아는 혈장 칼륨 이온을 적절히 조절할 수 없다. 일치된 성장 및 신장 기능 표현형 이외에, 본 발명자들은 XY 암컷 및 종래의 교배 그룹 둘 다로부터의 이형접합체의 주요 성인 장기에서 동일한 베타-갈락토시다제 전조직 표본 발현 패턴을 관찰하였다.
토의
모순된 유전적 배경(Eicher et al. (1982) Science 217:535-537; Taketo-Hosotani et al. (1989) Development 107:95-105)에 의해 또는 성 결정에 필요한 유전자에서의 돌연변이(Bagheri-Fam et al. (2008) Dev . Biol . 314:71-83; Barrionuevo et al. (2006) Biol . Reprod . 74:195-201; Bogani et al. (2009) PLoS Biol 7:e1000196; Chaboissier et al. (2004) Development 131:1891-1901; Colvin et al. (2001) Cell 104:875-889; Gierl et al. (2012) Dev. Cell 23:1032-1042; Hammes et al. (2001) Cell 106:319-329; Katoh-Fukui et al. (1998) Nature 393:688-692; Meeks et al. (2003) Nat. Genet. 34:32-33; Tevosian et al. (2002) Development 129:4627-4634; Warr et al. (2012) Dev . Cell 23:1020-1031)에 의해 야기되든, 마우스에서의 암컷으로의 수컷의 성 전환은 거의 항상 불임을 동반한다. Sry인 1차 수컷 성 결정 유전자에서의 돌연변이를 보유하는 몇몇 XY 암컷은 생식력 있지만, 작은 드문 한배 새끼 및 짧은 번식 수명을 가진다(Lovell-Badge and Robertson (1990) Development 109:635-646). 최근에, 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에 의한 지시된 표적화에 의해 생산된 Sry의 41개의 염기쌍(bp) 결실을 보유하는 XY 암컷 마우스에 대해 유사하게 낮은 생식력 및 가임능력이 보고되었다(Wang et al. (2013) Nat. Biotechnol . 31:530-532). TALEN 유도된 Sry 돌연변이의 또 다른 예에서, 2bp 결실을 보유하는 단일 XY 암컷 마우스는 불임인 것으로 밝혀졌다(Kato et al. (2013) Sci . Rep. 3:3136).
손상된 생식력의 이들 사례와의 현저한 비교로, 유전자 표적화된 ES 세포로부터 생산된 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)는 예상의 반대로 가는 것으로 보일 수 있는, 전례 없는 높은 수준의 생식력 및 정상 가임능력을 나타낸다. 정상 20X 배우자 이외에, XY 암컷은 비정상 20Y, 19O 및 21XY 난 유형을 생산할 수 있고, 후자의 2개는 XY 암컷의 F1 자손에서의 XXY, XYY 및 XO 성 염색체 핵형을 설명하는 감수분열 I에서의 비분리 사건으로부터 생긴다. 따라서, XY 암컷이 감소한 수의 생존 가능 및 기능적 난을 가질 수 있다. 사실, 다양한 F1 성 염색체 핵형의 비율은 3개의 비정상 배우자 유형으로부터 유래한 4개의 유형의 생존가능 암컷화 자손의 25-30%의 소실을 취하는 모델과 (χ2 분석에 의해) 최고로 일치한다. 이러한 소실은 모든 난 유형으로부터 불과 20%의 소실을 발생시킬 것이고, 이것은 본 발명자들의 9개월의 교배 시험에서 본 발명자들이 알아차린 가임능력 차이를 야기하지 않을 것이다.
본 명세서에 기재된 XY 암컷의 높은 생식력 및 가임능력은 암컷에 대한 수컷의 성 전환의 고유한 기전을 제안한다. XY 암컷 특질의 유전성의 결여는 성 전환이 유전자 표적화된 ES 세포 클론에서의 몇몇 세포가 후성적 마크 또는 이들이 XY 암컷의 생산을 선호하도록 예정 짓는 몇몇 다른 생리학적 변경을 획득하는 일시적인 사건이라는 것을 나타낸다. ES 세포가 어떤 마크 또는 변경을 획득하든, 이것이 고정되고 안정한 것으로 보인다. XY 암컷을 생산하는 성향은 각각의 유전자 표적화된 XY ES 세포 클론에 특유하다. 각각은 보통 반복 주사 실험에서 XY 암컷의 재현 가능한 비율을 생산하고, 개별 클론은 유전자 표적화 과정 후 이들을 상이한 배양 조건으로 스위칭함으로써 '암컷화' 또는 '수컷화'될 수 없다. XY 암컷 형상의 특징은 이것이 유전자 표적화의 전체 과정(해동, 성장, 계대배양, 전기천공, 항생제 선택, 증식 및 냉동)을 통해 암컷화 배지에서 유지된 ES 세포에 오직 영향을 미친다는 것이고, 이는 유전자 표적화 과정의 스트레스가 XY ES 세포에서 '암컷화' 특징을 부여하는 후성적 마크를 때때로 유도한다는 것을 제안한다.
본 발명자들은 본 발명자들이 고장성(300mOsmol/㎏ 초과)인 본 발명자들의 DMEM로부터의 기본 배지를 등장성(275 내지 295mOsmol/㎏) KO-DMEM으로 전환한 후에 상당한 수의 XY 암컷을 처음에 관찰하였다. 세포는 MAP 키나제 경로를 활성화함으로써 삼투성 스트레스에 반응하고, MAP 키나제 경로의 구성원인 Map3k4 및 Gadd45c, 또는 MAP 키나제를 통해 신호전달하는 인슐린 경로에서의 돌연변이는 Sry의 발현의 감소 및 무작용의 생식 융기의 고환 발생을 유도하는 것의 실패를 발생시킬 수 있다. 고장성 배지에서의 ES 세포의 배양은 MAP 키나제 경로를 자극하고, 세포가 발생하는 배아로 증식한 후 수컷 분화를 강화하는 생리학적 또는 후성적 환경을 촉진한다. 반대로, 등장성 또는 약간 저장성 배지에서의 ES 세포의 배양은 MAP 키나제 경로를 통한 신호전달을 연기시키고 이에 따라 성 전환 돌연변이의 효과를 모방할 수 있다.
성 결정을 이해하기 위한 이의 암시를 넘어, 본 발명자들이 여기서 기술한 암컷으로의 수컷의 성 전환 현상은 유전적으로 변형된 마우스의 생산에 대한 중요한 실제적 결과를 가진다. XY 암컷이 생식력 있으면서 가임성이므로, 본 발명자들은 F1 동형접합성 넉아웃 마우스(이의 표현형은 본 발명자들의 연구소에서의 자연 교배 계획에 의해 생성되거나 공개된 보고서에 기재된 것을 재현함)를 생산하기 위해 F0 형제자매 이종교배를 이용할 수 있었다. 비정상 성 염색체 핵형을 보유하는 마우스가 배제될 때에도, 연구 코호트의 어셈블리에 대해 충분한 정상 F1 XX 암컷 및 XY 수컷이 남아 있다. 본 발명자들의 배양 방법은 XO ES 세포 클론으로부터 생식력 있는 암컷을 생성하는 것보다 빠르고 쉬운데, 왜내하면 서브클로닝하고 Y 염색체의 드문 소실을 스크리닝할 필요가 없기 때문이다. 책임지는 성 전환 및 분자 기전을 촉진하는 조건의 추가의 연구는 임의의 표적화된 ES 세포 클론으로부터의 수컷 및 암컷 벨로시마이스(등록상표) 둘 다의 신뢰할만하고 예측 가능하고 효율적인 생산에 대한 개선된 방법의 발생이 가능하게 할 수 있다.
실시예
2.
Ddx3y
(
Dby
),
Eif2s3y
및
Sry
의
발현은 저
삼투질농도
배지에서 배양된
XY
ES
세포로부터 유래한 배아에서
침묵화되거나
감소한다.
교미 후(dpc) 11.5일의 발생 단계에서 배아를 절개하고, 이의 근사적인 단계는 타일러(Theiler) 스테이징을 사용하여 결정되었다. 잉태 연령이 한배 새끼 내에 넓게 변하므로, 개별 배아의 더 정확한 스테이징은 후측으로부터 뒷다리싹으로 꼬리의 끝으로 꼬리 체질(ts)의 수를 계수함으로써 달성되었다. 이 기법을 이용하여, 8 꼬리 체질인 배아는 10.5 dpc이고, 18 꼬리 체질인 배아는 11.5 dpc이고, 30 꼬리 체질인 배아는 12.5 dpc이다(문헌[Hacker, Capel, Goodfellow and Lovell-Badge, Devel 1995]으로부터).
B6 마우스에서, Sry는 대략 13 ts에서 검출 가능한 것으로 보고되고, 대략 17-18 ts에서 피크에 도달하고, 대략 27 ts에서 감소한다. Sry의 완전 시간 과정을 포착하도록 마우스로부터 12 내지 27 ts인 배아를 취했다. (생식선 및 인접한 중신(mesonephros)을 함유하는) 생식 융기를 이 단계에서 배아로부터 절개되고, 체벽 및 후신(신장 발생)으로부터 분리되고, RNA 정제를 위해 Trizol에서 보존되었다.
Y 염색체 상의 성 결정 유전자(Sry)는 포유류에서의 수컷 성 결정을 개시시키는 것을 책임진다. 이 유전자는 좁은 발생 창 동안에 생식선에서의 세포의 제한된 집단에서 발현된다(마우스에서 대략 11.5 dpc). 이 창 동안에, Sry는 생식선이 고환이 되고 유기체가 수컷 운명을 획득하는 데 필요한 모든 변화를 개시시킨다. 그러나, Sry 발현이 이 창 동안에 감소하거나 심지어 후에 몇 시간에 발현되면, XY 개체는 난소를 발생시키고 암컷이 되고 성 전환된 것으로 생각된다.
몇몇 XY 클론이 왜 성 전환된 마우스를 생산하는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 수컷 및 암컷 둘 다에서 초기 성 결정의 마커의 발현 수준을 결정하도록 RT-PCR을 사용하였다. 수컷 경로에서, 본 발명자들은 수컷 성 결정의 개시에 관여한 유전자를 검토하였다: Sry, Sox9(Sry의 직접적인 표적인 것으로 제안됨; 고환 발생의 개시 및 유지에 필요), 암컷 경로의 억제 양태에 관여한 유전자(Fgf9), 및 초기 고환 분화의 양호한 마커인 유전자(Dhh 및 Amh). 암컷 경로에서, 본 발명자들은 매우 초기 암컷 발생에서 활성인 유전자(Foxl2) 및 수컷 경로의 억제 양태에 관여한 유전자(Rspo1)를 검토하였다. 도 15를 참조한다.
RT-PCR에 대해 샘플을 준비하기 위해, 조직을 TRIzol에서 균질화하고, 클로로폼을 상 분리에 사용하였다. 제조사의 사양에 따라 마이크로어레이즈 토탈(Microarrays Total) RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지스에 의한 암비온(Ambion), 카탈로그 AM1839호)에 대해 MagMAX(상표명)-96을 사용하여 전체 RNA를 함유하는 수성 상을 정제하였다. 상기 기재된 MagMAX 키트로부터 MagMAX(상표명)Turbo(상표명) DNase 완충제 및 TURBO DNase(Ambion by 라이프 테크롤로지스, 카탈로그 AM1839호)를 사용하여 게놈 DNA를 제거하였다. SuperScript(등록상표) VILO(상표명) Master Mix(라이프 테크놀로지스에 의한 인비트로젠, 카탈로그 11755500호)를 사용하여 mRNA를 cDNA로 역전사시켰다. ABI 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems(어플라이드 바이오시스템즈))을 사용하여 TAQMAN(등록상표) 유전자 발현 Master Mix(라이프 테크놀로지스에 의한 어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 4370074호)에 의해 cDNA를 증폭시켰다. 사이클링 조건은 95℃에서의 10분, 3초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 40회 사이클로 이루어졌다. Hprt를 임의의 cDNA 유입 차이를 정규화하기 위한 내부 대조군 유전자로서 사용하였다. 기준 샘플은 모든 다른 샘플이 델타 델타 CT 비교용 분석 방법에서와 비교되는 #1이다. 모든 프로브를 리포터로서 6FAM으로서 및 켄쳐로서 BHQ1(quencher)로서 표지하였다. 서열은 표 8에 기재되어 있다.
RT-PCR 샘플을 정규화하기 위해, 본 발명자들은 일반적인 하우스키핑 유전자(Hprt), 및 생식 융기에 특이적이고 이들 단계에서 성별 둘 다에서 동일한 수준으로 발현된 유전자(Sf1 및 Gata4)를 사용하였다.
이전의 실험은 ES 세포에서 정상으로 발현된 Y 염색체 상의 2개의 유전자가 성 전환된 세포주(Ddx3y 및 Eif2s3y)로부터의 ES 세포에서 하향조절된다는 것을 나타낸다(도 1 참조). 이들 유전자는 Sxrb 영역에서 Y 염색체의 짧은 아암에 있다. 결실 연구를 통해, 이 영역은 정자발생에 중요하지만 성 결정에 관여하지 않는다고 공지되어 있다. 이들 유전자의 둘 다는 난소에서가 아니라 이 발생 기간 동안에 수컷 생식선에서 발현되었고(GUDMAP.org로부터의 affymetrix 데이터), 따라서 본 발명자들은 성 전환을 발생시키는 과정이 성 결정에 관여된 것을 이외에 Y 염색체 상의 다른 유전자의 발현을 가져오는지를 보여주도록 이들 유전자에 대해 프로브를 사용하였다.
이 실험에 2개의 클론을 사용하였다: 1823CF11은 역사적으로 F0 세대에 오직 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 한편, 1823CE6은 F0 세대에 (성 전환된) 88%의 암컷 XY 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다. 단리 및 KO-DMEM에 기초한 배지에서의 증식을 통해 동일한 조건 하에 클론 둘 다를 성장시켰다. 각각의 클론으로부터 벨로시마이스(등록상표)의 11마리의 한배 새끼가 생산되었다: 각각으로부터의 2마리의 한배 새끼는 달이 차게 허용하여서 성 전환의 정도를 입증하여서, 생식 융기 수집에 대해 각각의 클론으로부터 9마리의 한배 새끼가 남았다(표 9 참조). 자손이 유성일 수 있도록 달이 차게 허용된 각각의 클론의 한배 새끼로부터, 클론 CF11은 2마리의 수컷 키메라 및 1마리의 암컷 키메라와 함께 11마리의 XY 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하고 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하지 않았다. 클론 CE6은 3마리의 수컷 키메라 및 6마리의 암컷 키메라와 함께 2마리의 XY 수컷 벨로시마이스(등록상표) 및 6마리의 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다.
배반포 주사 및 절개가 각각의 클론에 대한 날짜의 동일한 시간에 대한 시간을 시작시키는 시기에도 불구하고, 성 전환된 CE6 클론에 대한 한배 새끼는 CF11과 비교하여 발생상 진화하였다(표 10 참조). 예를 들어, 8:30 AM 및 9:30 AM에 취한 CF11 한배 새끼는 12-13 ts에서 시작하는 체절 범위를 가지는 한편, 이 시간에 CE6 한배 새끼는 16-20 ts의 체절 범위를 가졌다. 전체적으로, 이것은 CF11에 비해 CE6의 대략 8시간 진전을 나타내고, Sry 발현의 가장 초기 단계가 이 실험에서 CE6 세포주에서 측정 가능하지 않다는 것을 의미한다. 그러나, 17-18 ts에서의 Sry 발현의 피크의 시간이 여전히 나타난다.
대조군에 대해, 본 발명자들은 또한 성 결정의 창 동안에(20ts) 이계교배된 균주 CD1로부터의 생식 융기를 수확하였다. 이 이계교배된 세포주로부터의 XY 샘플은 이 시간에 높은 수준의 Sry를 발현하고 강한 양성 대조군으로 작용해야 한다. XX 샘플은 Y 염색체를 가지지 않고, 이에 따라 Sry, Y 염색체 상의 유전자 및 수컷 경로의 다른 마커에 대한 음성 대조군이다.
배반포를 생성하는 벨로시마우스(등록상표) 방법은 전부 주사된 ES 세포로부터 유래한 마우스를 주로 생산하지만, 숙주 및 ES 세포 둘 다의 숙주 유래 배아 및 키메라의 적은 수가 여전히 생성된다. 고려로부터 이 샘플을 제거하기 위해, 본 발명자들은 숙주 배반포 균주 스위스 웹스터(TyrMut)에서 돌연변이되고 F1H4 ES 세포(TyrWt)에서 기능성인 코트 컬러 유전자인 타이로시나제의 상이한 대립유전자의 존재를 기대하도록 PCR을 이용하였다. 샘플이 0.5 이상의 TyrMut, 또는 1.5 이상의 TyrWt의 수준 및 TyrWt의 20% 초과의 TyrMut를 가지는 경우 이것을 제거하였다.
각각의 샘플에서의 생식선 조직의 양으로 RT-PCR 데이터를 정규화하기 위해, 본 발명자들은 Sf1 및 Gata4인 성별 둘 다의 생식선에서 특이적으로 발현된 2개의 유전자의 수준을 조사하였다. Sf1은 본 발명자들이 조사한 발생 단계에 걸쳐 하우스키핑 유전자 Hprt에 대해 생식선에서 비교적 일정한 발현을 가지고, 이에 따라 후속하는 샘플에서 정규화 유전자로서 사용된다. Gata4는 초기 단계에 증가한 수준을 가지는 것으로 보여서 정규화 유전자로서 사용되지 않았다.
도 2에 도시된 바대로, Sry 발현은 성 결정의 일반 창에서 CF11 세포주로부터의 생식선에서 검출 가능하다. 도 2에서의 Sry 발현은 이 단계에서 성별 둘 다의 생식 융기에서의 체세포에 대한 마커인 Sf1에 대해 도시되어 있다. Sry 발현이 Hprt 발현으로 정규화될 때 유사한 결과가 관찰되었다(데이터 비도시). 20 ts에서의 CD1 XY 및 XX 샘플을 대조군으로서 사용하였다(Sry 발현에 대한 양성 대조군으로서의 CD1 XY 및 음성 대조군으로서의 CD1 XX). 도 2에 도시된 바대로, Sry 발현은 대략 13 ts에서 시작하여 검출 가능해져서, 대략 16-17 ts에서 피크에 도달하고, 대략 25 ts만큼 감소한다. 그러나, 성 전환 CE6 클론으로부터 유래한 생식선에서, Sry 발현은 조사된 성 결정의 모든 단계 동안에 주로 검출 불가능하다(16-25 ts). CE6 클론으로부터의 대부분의 생식선은 40회 사이클 후에도 검출 가능한 CT 값을 가지지 않았다.
Y 염색체 유전자 Ddx3y 및 Eif2s3y는 이 단계에서 CF11 생식선에서 예상된 바대로 발현되지만, 도 3 및 도 4에 도시된 바대로 성 전환된 CE6 클론으로부터의 생식선에서 주로 검출 불가능하다. 도 3은 CE6 및 CF11에서 Sf1에 대한 Ddx3y 발현을 보여준다. 도 4는 CE6 및 CF11에서 Sf1에 대한 Eif2s3y 발현을 보여준다. XY CD1 및 XX CD1을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다(20 ts). Sry 발현에 대한 데이터와 함께, 이 데이터는 Y 염색체에서의 3개의 비관련된 유전자가 성 전환된 클론(CE6)에서 강하게 억제된다는 것을 나타내어서, Y 염색체의 큰 부분이 성 전환된 클론에서 침묵화될 수 있다는 것을 제안한다.
도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 Sry의 하류에서 수컷 성 결정 및 고환 발생의 마커가 성 비전환된 CF11 클론과 비교할 때 성 전환된 CE6 클론으로부터의 생식선에서 감소한다는 것을 보여준다. 도 5a는 Sf1에 대한 Sox9 발현을 보여주고, 도 5b는 Sf1에 대한 Fgf9 발현을 보여주고, 도 5c는 Sf1에 대한 mDhh 발현을 보여주고, 도 5d는 Sf1에 대한 Amh 발현을 보여준다. XY CD1 및 XX CD1을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다(20 ts).
도 6A 및 도 6B는 성 비전환된 CF11 클론과 비교하여 성 전환된 SE6 클론으로부터의 생식선에서 암컷 성 결정 및 난소 발생의 마커를 보여준다. 도 6A는 Sf1에 대한 Foxl2 발현을 보여주고, 도 6B는 Sf1에 대한 Rspo1 발현을 보여준다. XY CD1 및 XX CD1을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 사용하였다(20 ts). 암컷 성 결정 및 난소 발생의 마커는 일반적으로 이보다 약간 더 늦은 단계에서 개시되지만, 난소 발생의 가장 초기의 마커 중 하나(Foxl2)는 성 전환된 CE6 클론으로부터의 생식선에서 강하게 증가한다. 난소 마커 Rspo1은 또한 성 전환된 샘플에서 약간 위에 있다. 작은 차이는 단순히 대부분의 난소 특이적 발생을 검출하기에 너무 초기인 이 단계로 인할 수 있다.
클론 1823CE6이 일부 시점에서 이의 Y 염색체를 소실한다는 것이 차후에 입증되었으므로, 실험에서 모든 점에서 둘 다가 여전히 Y 염색체를 가진다는 것을 확실히 하기 위해, 1개의 보통의 성 전환하는 세포주 및 1개의 강하게 성 전환하는 세포주를 포함하는 추가 XY ES 세포 클론을 사용하여 상기한 바대로 발현 실험을 반복하였다. 단리 및 KO-DMEM에 기초한 배지에서의 증식을 통해 동일한 조건 하에 클론을 성장시켰다. 하기 더 자세히 설명된 것처럼, 이 실험은 Sry, Y 염색체 유전자 및 수컷 성 결정 유전자의 발현이 XY ES 세포 성 전환 세포주에서 감소하고, 덜 빈번한 성 전환을 생성시키는 세포주와 비교할 때 가장 높은 빈도의 성 전환을 생성하는 세포주에서 더 강하게 억제되는 경향이 있다는 것을 확인시켜 주었다. 또한, 이 실험은 마우스 발생 동안에 성 전환된 세포주에서 및 출생 후 시험된 모든 장기에서 Y 염색체 유전자가 지속적으로 억제되므로, 이것이 성 전환 현상에 보고하는 양호한 방식이라는 것을 입증한다. 또한, 결코 성 전환하지 않은 1개의 XY ES 세포주에서, 대단히 높은 수준의 대부분의 Y 염색체 유전자 및 수컷 성 결정 유전자가 관찰되었다.
도 7에서, 성 결정 동안에 생식선에서 Sry 발현을 측정하였다. 3개의 대조군 세포주를 사용하였다: 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아; 비표적화된 XY ES 세포로부터의 XY 마우스 배아; 및 성 전환하지 않는 XY ES 세포주(1823-CF11)로부터의 XY 마우스 배아. 이 대조군은 대략 14 ts의 개시, 17-18 ts에서 피크 및 26 ts만큼의 소실에 의해 Sry 발현의 일반 시간 과정을 보여준다. 2개의 성 전환 세포주는 이의 중요한 기간 동안 현저히 덜한 Sry 발현을 보여주었다. 라인 #1은 강하게 성 전환하는 세포주(평균 86% XY 암컷)이고, 라인 #2(15069-CD1; 45% XY 암컷)보다 이 시간 과정에 걸쳐 더 적은 Sry 발현을 가졌다. XX 마우스 배아는 (Y 염색체의 결여로 인해) 어떤 발현을 가지지 않고, 음성 대조군으로서 작용한다.
도 8a-c는 성 결정 동안 생식 융기에서의 Y 염색체 상의 3개의 유전자의 발현 수준을 보여준다: Eif2s3y(도 8a); Uty(도 8b); 및 Ddx3y(도 8c). 모든 3개는 성 비전환 XY ES 세포주로부터 생성된 마우스 배아에서 가장 강한 발현, 대조군(교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아 및 비표적화된 XY ES 세포로부터의 XY 마우스 배아)에서 중간 수준, 2개의 성 전환 XY ES 세포주로부터 생성된 XY 마우스 배아에서 가장 낮은 수준을 나타내어서, Y 염색체 상의 다수의 유전자가 바로 Sry 뒤의 이 과정에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 도 9는 동일한 데이터가 도 7 및 도 8a-c에서 오직 압축된다는 것을 보여주어서, 배아 생식 융기에서 평가된 모든 4개의 Y 염색체 유전자의 평균을 보여준다.
Y 염색체 유전자의 발현이 출생 후 성 전환 세포주로부터 생성된 마우스에서 여전히 억제되는지를 결정하기 위해, 비표적화된 XY ES 세포주, 성 비전환 XY ES 세포주 및 성 전환 세포주로부터 생성된 마우스에서의 출생 후 1주에 다수의 장기에서 Ddx3y(도 10A); Uty(도 10B); Eif2s3y(도 10C) 및 Kdm5d(도 10D)의 발현 수준을 결정하였다. 생식선, 신장, 심장, 간 및 발에서 발현 수준을 시험하였다. 도 10A-D는 Y 염색체 유전자가 출생 후 다수의 장기에서 성 전환 세포주로부터 생성된 마우스에서 여전히 억제되고, 이 유전자의 발현 수준이 비표적화된 XY ES 세포로부터의 마우스 및 성 전환하지 않는 XY ES 세포주로부터의 마우스에서의 수준보다 낮다는 것을 보여준다.
도 11A(Sox9) 및 도 11B(Fgf9)는 Sry의 하류에서 수컷 성 결정 및 고환 발생의 마커가, 성 비전환 XY ES 세포주, 비표적화된 대조군 XY ES 세포주 및 교배에 의해 생성된 XX 마우스 배아와 비교할 때, 성 전환 XY ES 세포주로부터 생성된 마우스 배아로부터의 생식선에서 감소한다는 것을 보여준다. 교배에 의해 생성된 XY 마우스 배아는 추가 대조군으로서 사용되었다. Sox9 및 Fgf9 둘 다는 수컷 경로에서 중요한 초기 유전자이고, 둘 다는 생식선에서의 Sry 발현의 피크 주위에(16-18 ts) 상향조절되고, 수컷 고환 발생에 필수적이다. Sox9 및 Fgf9 수준은 성 전환하지 않는 세포주로부터의 생식선에서 가장 높고, 대조군(교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아 및 비표적화된 XY ES 세포로부터의 마우스 배아)에서 중간이고, 교배를 통해 생성된 XX 마우스 배아에서 가장 낮았다. XX 마우스 배아는 이 기간 동안 Sox9 및 Fgf9에 대한 발현의 암컷 수준을 나타내도록 사용되었다. 2개의 성 전환 세포주로부터 생성된 마우스 배아에서의 발현 수준은 XX 대조군과 XY 대조군 사이에 해당하고, 더 강하게 전환하는 세포주 #1은 Sox9 유도의 기간 동안 #2보다 더 낮은 수준을 나타낸다.
Dhh 및 Amh는 고환 발생 동안 강하게 및 특이적으로 상향조절되는 고환 발생의 마커이고, 난소 발생 동안 존재하지 않는다. 도 15를 참조한다. 이들 유전자의 둘 다는 수컷 대조군으로부터의 생식선에서 가장 높게 발현되었다(성 전환하지 않는 세포주로부터의 XY 마우스 배아, 교배를 통해 생성된 XY 마우스 배아 및 비표적화된 ES 세포로부터의 XY 마우스 배아). 2개의 성 전환 세포주로부터 생성된 마우스는 XX와 XY 교배된 대조군 사이에 해당하는 발현 수준을 가졌고, 더 강하게 전환하는 세포주 #1은, 암컷에 더 가까운, #2보다 더 낮은 수준을 나타낸다(도 12A(Dhh) 및 도 12B(Amh)).
Foxl2는 암컷 발생의 가장 초기의 마커이고, 21 내지 23 ts에서 암컷 생식선에서 강하게 상향조절된다. 도 15를 참조한다. 도 13에 도시된 바대로, 2개의 성 전환 XY ES 세포주로부터 생성된 마우스에서의 이 유전자의 발현 수준은 XX와 XY 교배된 대조군 사이에 해당하였다.
실시예
3.
XY
ES
세포 클론에서의
Ddx3y
(
Dby
),
Eif2s3y
및
Uty
발현의 결여 또는 감소는 이의
XY
ES
세포 클론으로부터의 생식력 있는
XY
F0 암컷 마우스의 생산과 상관된다
표 11은 8-세포 배아로의 XY ES 세포 클론의 미량주사 후 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하기 위한 VGF1 ES 세포주에서의 유전자 표적화로부터의 XY ES 세포 클론의 성향을 보여준다. 모든 클론을 표적화 및 미량주사 과정에 걸쳐 KO-DMEM에 기초한 배지에서 유지시키고 배양하였다. 클론의 이 샘플로부터, XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 능력이 클론 특이적이고 0% 내지 60%의 범위라는 것이 명확하다. 이 결과는 다수의 미량주사 실험에서 재현가능하고, 암컷을 생산하지 않은 클론은 반복 미량주사에서 이 특질을 유지시키는 한편, 암컷을 생성시킨 클론은 반복 미량주사 실험에서 대략 동일한 비율의 암컷을 생성시키는 경향을 가졌다. DMEM 기반 배지에서 클론을 재성장시킴으로써 효과가 반전될 수 없었다. 전기천공, 약물 내성 콜로니의 선택, 표적화된 돌연변이에 대한 스크리닝, 증식 및 냉동보존의 전체 표적화 과정에 대해 DMEM 기반 또는 KO-DMEM 기반 배지에서 ES 세포를 성장시키고 유지시키는 유전자 표적화 실험으로부터의 ES 세포 클론을 8-세포 배아로의 미량주사의 준비에서 해동하고 3일 동안 반대 배지에서 성장시켰다. DMEM 기반 배지에서 유래한 클론은 낮은 빈도의 암컷 벨로시마이스(등록상표) 생산을 유지시켰고, 이것은 KO-DMEM에 대한 짧은 노출에 의해 성장할 수 없었다. 마찬가지로, KO-DMEM 기반 배지에서 유래한 클론은 더 높은 빈도의 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하고, DMEM에 대한 짧은 노출은 암컷을 생산하는 XY 클론의 성향을 감소시키지 않았다.
암컷화 및 비암컷화 유전자-표적화된 XY ES 세포 클론에서의 유전자 발현 프로필을 이후 비교하였다(표 12 참조). 4개의 ES 세포 클론을 사용하였고, 각각 정확히 동일하게 처리하였다. 모든 4개의 클론은 초기 해동, 표적화 벡터에 의한 전기천공, 약물 내성 클론에 대한 선택 및 동결을 포함하는 전체 공정에 걸쳐 동일한 KO-DMEM 기반 배지에서 성장한 VGF1 세포로부터 유래하였다. 2개의 클론은 다수의 미량주사에서 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하지 않았다; 2개의 클론은 반복 미량주사에서 50% 초과의 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다. Y 염색체 유전자 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y에 대한 발현 수준은 비암컷화 ES 세포와 비교하여 암컷화 ES 세포에서 10-20배 더 낮다. Y 염색체 이외의 염색체 상의 2개의 유전자(Col10a1 및 Tm4sf1)를 대조군으로서 사용하였다.
또 다른 실험에서, 서브클로닝 실험에 KO-DMEM 배지에서 동일하게 유래한 5개의 유전자-표적화된 ES 세포 클론을 선택하였다. 클론 985-AA8 및 1823-CF11이 3개의 별개의 미량주사 실험에서 오직 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산한 한편, 클론 15069-CD1, 4048-BC4 및 979-AC7은 반복 미량주사에서 30%와 50% 사이의 평균의 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다(표 13 참조). ES 세포 클론을 액체 질소 저장으로부터 해동하고, 2개의 복제 96웰 플레이트로 서브클로닝하고, 이들 중 1개를 -150℃에서 저장하는 한편, 다른 것은 DNA 및 RNA 준비를 위해 2개의 다른 플레이트로 성장시키고 계대배양하였다. Y 염색체의 소실을 스크리닝하기 위해 DNA 플레이트를 사용하는 한편, RT-qPCR에 의해 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 발현을 조사하기 위해 RNA 플레이트를 사용하였다. 표 13에 기재된 바대로, XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 클론의 성향은 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 발현을 갖지 않거나 이의 발현이 감소한 서브클론의 백분율에 직접적으로 비례하고, 이것은 서브클론에서의 Y 염색체 유전자 발현의 소실이 클론이 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산할 가능성을 예측할 수 있다는 것을 나타낸다: Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y의 발현에 대해 침묵화된 서브클론의 비율이 더 높을수록, XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하는 모 ES 세포 클론의 성향이 더 높다.
표 13의 상부 부분에서의 데이터를 생성하기 위해, 암컷 및 수컷 XY 마우스 둘 다를 생산하는 3개의 모 XY ES 세포주로부터의 서브클론을 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y 유전자 발현의 RNA 분석을 위해 제출하였다. 시험된 3개의 부분적으로 성 전환하는 클론은 979-AC7, 4048-BC4 및 15069-CD1을 포함하였다. 클론 979-AC7에 대한 서브클론 A1-A4, B1-B4, C1-C4, D1-D4, E1-E4, F1-F4, G1-G4 및 H1-H4, 클론 4048-BC4에 대한 서브클론 A5-A8, B5-B8, C5-C8, D5-D8, E5-E8, F5-F8, G5-G8 및 H5-H8, 및 클론 15069-CD1에 대한 서브클론 A9-A12, B9-B12, C9-C12, D9-D12, E9-E12, F9-F12, G9-G12 및 H9-H12를 포함하는, 32개의 서브클론을 각각에 대해 시험하였다. Drosha의 발현을 대조군으로서 사용하고, 각각의 유전자의 발현은 B2m 발현에 대해 결정되었다. 도 14a-c에서 ΔCt의 형태로 RT-PCR 결과를 나타냈다(관심 있는 유전자 - B2m). 음수의 ΔCt는 더 높은 상대 발현을 나타내고, 양수의 ΔCt는 더 낮은 상대 발현을 나타낸다. 도 14a에 도시된 바대로, 클론 979-AC7에 대한 32개 중 6개의 서브클론(18.8%)에서, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y에 대해 발현이 검출되지 않았다. 도 14b에 도시된 바대로, 클론 4048-BC4에 대한 32개 중 18개의 서브클론(56.2%)에서, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y에 대해 발현이 검출되지 않았다. 도 14c에 도시된 바대로, 클론 15069-CD1에 대한 32개 중 22개의 서브클론에서, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y에 대해 발현이 검출되지 않았다. 그러나, 32개의 서브클론의 후속하는 분석은 클론 D9인 32개의 서브클론 중 하나가 Y 염색체를 소실하였다는 것을 나타내고, 이것은 15069 CD1에 대한 32개 중 21개의 서브클론(65.6%)이 Y 염색체를 가지지만, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y의 검출 가능한 발현을 가지지 않는다는 것을 의미한다. Y 염색체의 존재의 평가는 Sry 및 Eif2s3y인 Y 염색체 상의 2개의 유전자에 대한 프로브에 의해 카피 수 검정을 하여 수행되었다. 클론 979-AC7에 대한 모든 32 서브클론, 클론 4048-BC4에 대한 모든 32 서브클론 및 클론 15069-CD1에 대한 31/32 서브클론은 Y 염색체의 1개의 카피를 가지는 것으로 카피 수 검정에 의해 확인되었다.
표 13의 하부 부분에서의 데이터를 생성하기 위해, 오직 수컷 XY 마우스를 생산하는 2개의 모 XY ES 세포주로부터의 서브클론을 Eif2s3y, Uty 및 Ddx3y 유전자 발현의 RNA 분석을 위해 제출하였다. 시험된 2개의 클론은 985-AA8 및 1823-CF11을 포함하였다. 클론 985-AA8에 대한 서브클론 A1-A6, B1-B6, C1-C6, D1-D6, E1-E6, F1-F6, G1-G6 및 H1-H6 및 클론 1823-CF11에 대한 서브클론 A7-A12, B7-B12, C7-C12, D7-D12, E7-E12, F7-F12, G7-G12 및 H7-H12를 포함하는, 48개의 서브클론을 각각에 대해 시험하였다. Drosha의 발현을 대조군으로서 사용하고, 각각의 유전자의 발현은 B2m 발현에 대해 결정되었다. 도 14d-e에서 ΔCt의 형태로 RT-PCR 결과를 나타냈다(관심 있는 유전자 - B2m). 음수의 ΔCt는 더 높은 상대 발현을 나타내고, 양수의 ΔCt는 더 낮은 상대 발현을 나타낸다. 도 14d에 도시된 바대로, 클론 985-AA8에 대한 48개 중 3개의 서브클론(6.25%; 클론 A4, F6 및 H3)에서, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y에 대해 발현이 검출되지 않았다. D1 및 F2인 2개의 다른 985-AA8 서브클론은 Y 염색체를 소실하는 것으로 나타났다. 도 14e에 도시된 바대로, 클론 1823-CF11에 대한 48개 중 2개의 서브클론(4.16%; 클론 A9 및 E8)에서, Eif2s3y, Uty 또는 Ddx3y에 대해 발현이 검출되지 않았다. C12인 하나의 다른 1823-CF11 서브클론은 Y 염색체를 소실하는 것으로 나타났다. Y 염색체의 존재의 평가는 Sry인 Y 염색체 상의 1개의 유전자에 대한 프로브에 의해 카피 수 검정을 하여 수행되었다. Y 염색체의 1개의 카피의 존재는 985 AA8에 대한 46/48 서브클론 및 1823 CF11에 대한 47/48 서브클론에서 카피 수 검정에 의해 확인되었다.
실시예
4. Y 염색체 유전자
Sry
에서의
TALEN
유도된 돌연변이를 가지는 F0 XY 암컷의 생식력의 증가.
Sry에 대한 lacZ 대체 대립유전자를 포함하는 표적화된 결실은, 38 및 37kb의 상동성 아암에 의해 플랭킹된 네오마이신 내성 유전자 및 Sry 시작 코돈과 인프레임으로 융합된 lacZ를 포함하는 삽입 카세트를 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)에 의해, 그리고 bMQ 라이브러리(129S7/SvEv Brd-Hprt b-m2)로부터의 BAC에 기초하여, 생성되었다. LTVEC((URL "velocigene.com/komp/detail/12778"에서 World Wide Web(www)에서 인터넷을 통해 이용 가능한) NIH KOMP 프로젝트 VG12778 LTVEC 참조)는 이의 상동성 아암에 Sry의 발현을 위한 모든 공지된 제어 유전요소를 포함한다. 이의 lacZ 코딩된 베타-갈락토시다제는 Sry 유전자의 조직 특이적 및 발생 단계 특이적 발현에 대한 리포터로서 작용한다. 표적화 벡터를 가지는 Sry 유전자의 정확한 표적화에 의해 생성된 대립유전자는 Sry 코딩 서열의 결실 및 삽입 카세트에 의한 대체를 포함한다. VGB6(B6A6으로 공지됨) C57BL/6 및 VGF1(F1H4로 공지됨) C57BL6/129 F1 하이브리드 ES 세포주 둘 다에서 Sry 유전자를 표적화하도록 표적화 벡터를 사용되었다. VGF1(F1H4) 마우스 ES 세포는 암컷 C57BL/6NTac 마우스를 수컷 129S6/SvEvTac 마우스에 교잡함으로써 생산된 하이브리드 배아로부터 유래하였다. 따라서, VGF1 ES 세포는 129S6/SvEvTac 마우스로부터의 Y 염색체를 함유한다. VGF1 세포주로부터 생산된 암컷 XY 마우스는 129S6/SvEvTac 마우스로부터 유래한 Y 염색체를 함유한다.
본 발명자들은 Sry 유전자에서 HMG 박스 DNA 결합 모티프 코딩 서열(상류 인식 서열: 5'-TCCCGTGGTGAGAGGCAC-3'(서열 번호 43); 하류 인식 서열: 5'-TATTTTGCATGCTGGGAT-3'(서열 번호 44))의 표적 파트에 설계된 TALEN을 얻었다. TALEN-1은 다수의 실험에서 Sry 유전좌위에서 NHEJ 돌연변이를 생성하는 데 있어서 활성이었다.
아마도 이중 가닥 DNA 파괴의 비상동성 말단 부착(NHEJ) 보수의 결과인, 결실 돌연변이는 TALEN의 작용에 의해 Sry 유전자에서 생성되었다. VGB6 및 VGF1 마우스 ES 세포 둘 다는 TALEN 유도된 돌연변이에 의해 생성되었다. 표 14는 모든 클론의 목록 및 이들이 보유하는 결실 돌연변이의 크기 및 이들이 Sry 유전좌위에서 lacZ -neo LTVEC 삽입 카세트를 가지는지를 함유한다. 표 14는 또한 8-세포 배아로의 Sry 돌연변이체 ES 세포 클론의 미량주사에 의해 생산된 F0 세대 벨로시마이스(등록상표)의 결과 및 Sry 유전자에서 돌연변이를 가지는 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)(성 전환된 암컷)의 교배 결과를 포함한다.
VGB6 ES 세포로부터 유래한 Sry 돌연변이를 가지는 모든 벨로시마이스(등록상표)는 Sry의 불활화에 예상된 것처럼 암컷이었다. 표 14에 기재된 것처럼, Sry 돌연변이체 암컷 B6 벨로시마이스(등록상표)는 시험 교배될 때 불임이었고, 이것은 Sry 돌연변이에 대한 문헌과 일치한다. 불임 때문에, LTVEC 표적화(즉, 정확하게 표적화된 Sry 결실 및 lacZ -neo 삽입을 가지는 클론)는 F1 자손에 대한 돌연변이체 대립유전자의 전달에 의해 공식적으로 확인되지 않았다. 그러나, 본 발명자들의 데이터는 VGF1 클론과 매우 상이한 결과를 입증하였다.
KO-DMEM 유사 낮은 삼투성 농도 배지에서 유지될 수 없고 마우스를 생산하는 능력을 보유하는 VGB6 ES 세포와 달리, VGF1 세포는 KO-DMEM 유사 낮은 삼투성 농도 배지에서 유지될 수 있다. 따라서, Sry에서의 돌연변이를 가지는 VGF1 XY ES 세포가 배지에 의해 암컷화될 수 있는지 결정하기 위해(즉, VGB6 Sry 돌연변이체 XY ES 세포와 달리, 이들이 몇몇 생식력 있는 XY Sry 돌연변이체 암컷을 생산할 수 있는지를 결정하기 위해) 실험을 수행하였다. 처음에, VGF1 ES 세포를 암컷화하는 본 발명자들의 KO-DMEM 유사 낮은 삼투성 농도 성장 배지에서 일상적으로 유지시켰다: 이 배지에서 성장한 미량주사된 XY 클론 중 몇몇은 돌연변이를 보유하지 않더라도 생식력 있는 XY 암컷을 생산할 것이다. 예를 들어, 클론 TH4(데이터 비도시)는 Sry 돌연변이를 가지지 않지만, 2마리의 암컷 및 6마리의 수컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였다.
5bp로부터 1kb 초과의 범위의 TALEN 유도된 작은 결실을 가지는 6개의 VGF1 ES 세포 클론을 미량주사하였다. KO-DMEM 유사 낮은 삼투성 농도 성장 배지에서 성장한 VGF1 ES 세포에서 LTVEC 표적화(즉, 정확하게 표적화된 Sry 결실 및 lacZ -neo 삽입을 가지는 클론)가 관찰되지 않았다. 모두는 암컷 벨로시마이스(등록상표)를 생산하였고, 이들 중 32마리를 교배하였다. 현저하게, 모든 Sry 돌연변이체 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)은 생식력 있었다: 각각은 적어도 한 마리의 한배 새끼를 생산하였다(표 14). 많은 Sry 돌연변이체 XY 암컷은 보통 한배 새끼 크기를 가지는 다수의 한배 새끼를 생산하는 한편, XY 암컷 중 몇몇은 오직 1마리 또는 2마리의 작은 한배 새끼를 생산하였다. 유전자형분석된 이 교배로부터의 299마리의 F1 마우스 중에서, 대략 절반(146, 49%)은 정상 XY 수컷 또는 정상 XX 암컷이었다. 174마리(58%)의 F1 마우스는 표현형 암컷인 한편, 125마리(42%)는 표현형 수컷이었다. 26마리의 암컷(암컷의 15%, 총 F1 세대의 8.6%)은 돌연변이체 Sry 대립유전자를 유전 받은 XY 암컷이었다. XY 난모세포와 연관된 감수분열 비분리 사건 때문에, Sry 돌연변이체 XY 암컷 벨로시마이스(등록상표)의 F1 자손에서 XXY, XYY, XO, XXYY인 다수의 비정상 유전자형(이들 중 몇몇은 돌연변이체 Sry 대립유전자를 포함하였음)이 관찰되었다.
표 14는 또한 Sry의 돌연변이를 가지는 종래의 DMEM 기반 배지에서 성장한 ES 세포로부터 유래한 XY 암컷의 생식력 결과를 보고한다. 예상치 못하게, KO-DMEM 기반 배지에서 성장한 ES 세포에 의한 유사한 실험에 대한 결과와 비교하여, DMEM 기반 배지에서의 LTVEC 표적화는 정확하게 표적화된 Sry 결실 및 lacZ -neo 삽입을 가지는 클론은 생산하였다(즉, TALEN 보조된 LTVEC 표적화된 결실-대체). 4개의 표적화된 클론으로부터 유래한 10마리 중 9마리의 XY Sry ( lacZ ) 암컷은 메이팅 시 살아서 태어난 새끼를 생산하였다 - 90% 생식률.
VGB6 XY ES 세포로부터 유래한 Sry 돌연변이를 가지는 벨로시마이스(등록상표)의 생식력을 구제하거나, 종래의 DMEM 기반 배지에서 성장한 VGF1 ES 세포로부터 유래한 Sry 돌연변이를 가지는 벨로시마이스(등록상표)의 생식력 또는 가임능력을 증가시키기 위해, XY ES 세포에서 추가 Y 염색체의 영역이 침묵화되었다. 이러한 추가 침묵화는 XY 암컷의 생산을 또한 증가시킬 수 있다. 일 예에서, Zfy2 유전자는 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, TALEN, 메가뉴클레아제 또는 CRISPR-Cas 뉴클레아제)에 의해 생성된 표적화된 유전적 변형 및/또는 Sry 유전자를 표적화하기 위해 상기 기재된 바와 같은 LTVEC와 같은 표적화 벡터에 의해 침묵화된다.
실시예
5.
ES
세포에서의 Y 염색체 유전자의 발현.
Y 염색체 유전자가 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서 발현되고 성 전환의 마커에 대한 후보인지를 결정하기 위해, F1H4 ES 세포에서 RNA-seq 분석을 수행하였다. 표 15에 기재된 바대로, Eif2s3y, Ddx3y, Erdr1, Kdm5d, Uty, Ube1y1, Zfy1, Zfy2, Rbmy1a1, Sly, Usp9y, LOC100041346은 F1H4 ES 세포에서 검출 가능한 발현 수준을 가진다. Sry는 F1H4 ES 세포에서 검출 가능한 발현 수준을 가지지 않았다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> SELECTION OF PLURIPOTENT CELLS FOR PRODUCTION
OF FERTILE XY FEMALE MICE
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<160> 50
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<223> mDdx3y Forward Primer
<400> 38
gtgtatggtg gtgctgatac tgt 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mDdx3y Reverse Primer
<400> 39
cgtcctggtg tggcaactaa c 21
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mEif2s3y Probe
<400> 40
agctggtaat gaatcttgtc ctcaacc 27
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mEif2s3y Forward Primer
<400> 41
tggatgcagc tcttctgttg a 21
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mEif2s3y Reverse Primer
<400> 42
tggcagccag gtgttcag 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Upstream Recognition Sequence for TALEN Targeting
Sry
<400> 43
tcccgtggtg agaggcac 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Downstream Recognition Sequence for TALEN
Targeting Sry
<400> 44
tattttgcat gctgggat 18
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X Chromosome Primer 1
<400> 45
ggagggtagc acgggaagaa g 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X Chromosome Primer 2
<400> 46
gctggctacc cacttgattg g 21
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> X Chromosome Probe
<400> 47
tcaagcagtc tctcccagct aacctccct 29
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Chromosome Primer 1
<400> 48
gatcagcaag cagctgggat 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Chromosome Primer 2
<400> 49
ctcctggaaa aagggccttt 20
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Y Chromosome Probe
<400> 50
caggtggaaa agccttacag aagccga 27
Claims (99)
- 설치류 XY 배아 줄기 (ES) 세포에서 암컷화 활성을 가지는 표적 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 상기 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 설치류 XY ES 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계이되, 상기 제1 집단은 상기 표적 화합물의 존재 하에 배양되고, 상기 제2 집단은 상기 표적 화합물의 부재 하에 배양되는, 상기 배양하는 단계; 및
(b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 대해 상기 설치류 XY ES 세포의 제1 및 제2 집단의 각각에서 상기 하나 이상의 설치류 XY ES 세포를 평가하는(assaying) 단계로서, 이로써 암컷화 활성은, 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포와 비교하여, 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현의 감소에 의해 확인되되, 상기 암컷화 활성은 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류를 생산하기 위한 증가한 성향을 가지는 설치류 XY ES 세포를 발생시키는, 상기 평가하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
(c) 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 기초하여, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류를 생산하기 위한, 상기 제1 집단으로부터의 공여자 설치류 XY ES 세포를 선택하는 단계이되, 상기 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류의 비율은 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현과 역으로 관련된, 상기 선택하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제2항에 있어서,
(d) 상기 공여자 설치류 XY ES 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 설치류로 도입하고 상기 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및
(f) 표현형 암컷 XY 설치류를 포함하는 F0 XY 설치류 자손을 얻는 단계이되, 성적 성숙을 획득 시 상기 F0 표현형 암컷 XY 설치류는 생식력 있고 가임성인, 상기 얻는 단계
를 추가로 포함하는, 방법 - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 화합물의 부재 하에 단계 (a)의 상기 배지는 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 적합하지만 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암컷화 활성은 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포와 비교하여, 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 상기 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현의 감소에 의해 단계 (b)에서 확인되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 평가는 mRNA 수준에서 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 암컷화 활성은 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 확인되는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 암컷화 활성은 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY Es 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 확인되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암컷화 활성은, 상기 암컷화 활성은 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현의 결여에 의해 단계 (b)에서 확인되는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 암컷화 활성은 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현의 결여에 의해 단계 (b)에서 확인되는, 방법.
- 암컷화 배지에서 표적 화합물의 농도를 최적화하는 방법으로서,
(a) 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 배지에서 설치류 XY 배아 줄기 (ES) 세포의 제1 집단 및 제2 집단을 배양하는 단계로서,
상기 제1 집단은 상기 표적 화합물의 제1 농도의 존재 하에 배양되고 상기 제2 집단은 상기 제1 농도와 다른 표적 화합물의 제2 농도의 존재 하에 배양되는, 상기 배양하는 단계;
(b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 대해 설치류 XY ES 세포의 제1 및 제2 집단의 각각에서 상기 하나 이상의 설치류 XY ES 세포를 평가하고, 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포와 비교하여 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서 감소한 경우, 상기 제1 농도를 선택하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제11항에 있어서,
(c) 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 기준으로, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류를 생산하기 위한, 상기 제1 집단으로부터의 공여자 설치류 XY ES 세포를 선택하는 단계로서, 상기 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류의 비율은 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현과 역으로 관련된, 상기 선택하는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서,
(d) 상기 공여자 설치류 XY ES 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 설치류로 도입하고 상기 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및
(f) 표현형 암컷 XY 설치류를 포함하는 F0 XY 설치류 자손을 얻는 단계이되, 성적 성숙을 획득 시 상기 F0 표현형 암컷 XY 설치류는 생식력 있고 가임성인, 상기 얻는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포가 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포와 비교하여 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현을 가지는 경우, 상기 제1 농도는 단계 (b)에서 선택되는, 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 평가는 mRNA 수준에서 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 농도는 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 선택되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 농도는 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 선택되는, 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포가 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현이 결여된 경우, 상기 제1 농도는 단계 (b)에서 선택되는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 설치류 XY ES 세포가 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현이 결여된 경우, 상기 제1 농도는 단계 (b)에서 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 집단은 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 상기 표적 화합물의 존재 하에 배양되는, 방법.
- 제2항, 제3항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
(I) 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 대조군 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현을 갖거나; 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 상기 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현을 갖거나; 또는
(II) 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 상기 제2 집단으로부터의 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현을 갖거나, 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 상기 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 감소한 발현을 갖는, 방법. - 제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 집단 및 제2 집단은 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원하거나 동일한 유전자형을 가지는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 기본 배지는 DMEM 또는 KO-DMEM인, 방법.
- 공여자 설치류 XY 배아 줄기 (ES) 세포를 만드는 방법으로서,
(a) 상기 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 적합한 기본 배지 및 보충제를 포함하는 저 삼투질농도 배지에서 설치류 XY ES 세포의 집단을 배양하는 단계로서, 상기 저 삼투질농도 배지는 218 mOsm/kg 내지 322 mOsm/kg 미만의 삼투질농도를 가지고, 상기 기본 배지는 50 mM 내지 110 mM의 농도의 염화나트륨 및 18 mM 내지 44 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하는, 상기 배양하는 단계;
(b) Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 대해 설치류 XY ES 세포의 집단에서 상기 하나 이상의 설치류 XY ES 세포를 평가하는 단계; 및
(c) 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 기초하여, F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류를 생산하기 위한, 공여자 설치류 XY ES 세포를 선택하는 단계로서, 상기 F0 세대에서의 생식력 있는 표현형 암컷 XY 설치류의 비율은 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현과 역으로 관련된, 상기 선택하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제24항에 있어서,
(d) 상기 공여자 설치류 XY ES 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계;
(e) 상기 단계 (d)로부터의 숙주 배아를 수혜자 암컷 설치류로 도입하고 상기 숙주 배아를 수태시키는 단계; 및
(f) 표현형 암컷 XY 설치류를 포함하는 F0 XY 설치류 자손을 얻는 단계이되, 성적 성숙을 획득 시 상기 F0 표현형 암컷 XY 설치류는 생식력 있고 가임성인, 상기 얻는 단계
를 추가로 포함하는, 방법. - 제24항 또는 제25항에 있어서, 설치류 XY ES 세포는 상기 평가 단계 (b) 전에 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주 또는 4주 동안 상기 저 삼투질농도 배지에서 배양되는, 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 대조군 설치류 XY ES 세포의 다능성을 유지시키기에 충분하지만, 생식력 있는 암컷 자손을 생성시키는 세포의 역량을 변경하지 않는 배지에서 배양된 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 감소한 발현을 갖거나, 단계 (c)에서의 상기 공여자 설치류 XY ES 세포는, 상기 대조군 설치류 XY ES 세포에 비해, Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 감소한 발현을 갖는, 방법.
- 제27항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 평가는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하고, 공여자 설치류 XY ES 세포는 공여자 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현이 대조군 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 단계 (c) 에서 선택되는, 방법.
- 제28항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 평가는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현을 검출하고, 공여자 설치류 XY ES 세포는 공여자 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 대조군 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 단계 (c)에서 선택되는, 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 기본 배지는 DMEM 또는 KO-DMEM인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 배지는 218 mOsm/kg 내지 322 mOsm/kg 미만의 삼투질농도를 가지는 저 삼투질농도 배지이고, 상기 기본 배지는 50 mM 내지 110 mM의 농도의 염화나트륨 및 18 mM 내지 44 mM의 농도의 중탄산나트륨을 포함하는, 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 저 삼투질농도 배지는
(I) 상기 저 삼투질농도 배지가 218mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐;
(II) 상기 저 삼투질농도 배지가 11mS/㎝ 내지 13mS/㎝의 전도도를 가짐;
(III) 상기 기본 배지가 85 mM 내지 130 mM의 총 알칼리 금속 할라이드 염 및 탄산염 농도를 가짐;
(IV) 상기 기본 배지가 87 ± 5 mM의 농도의 염화나트륨을 포함하고, 상기 저 삼투질농도 배지가 261 ± 26 mOsm/㎏의 삼투질농도를 가짐; 및
(V) 상기 기본 배지가 3 mg/mL의 농도의 염화나트륨 및 2.2 mg/mL의 농도의 중탄산나트륨을 포함하고, 상기 저 삼투질농도 배지가 216 mOsm/kg의 삼투질농도를 가짐
의 특성 중 하나 이상을 가지는, 방법. - 제1항 내지 제3항, 제11항 내지 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 평가는 단백질 수준에서 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현을 검출하는, 방법.
- 제2항, 제3항, 제12항, 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현에 대해 상기 제1 집단에서의 설치류 XY ES 세포의 적어도 2개를 평가하는 단계를 포함하고, 단계 (c)는 다른 평가된 세포에 비해 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 가장 낮은 발현을 가지는 단계 (b)에서의 평가된 세포를 상기 공여자 설치류 XY ES 세포로서 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제2항, 제3항, 제12항, 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 공여자 설치류 XY ES 세포는 상기 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y 중 하나 이상의 발현이 결여된, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 공여자 설치류 XY ES 세포는 Ddx3y, Uty 및 Eif2s3y의 발현이 결여된, 방법.
- 제1항 내지 제3항, 제11항 내지 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 랫트 또는 마우스인, 방법.
- 제1항 내지 제3항, 제11항 내지 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스인, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 ES 세포는 VGF1 마우스 ES 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제3항, 제11항 내지 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류는 C57BL/6 균주를 포함하는 마우스이거나, C57BL/6 균주, 129 균주, 또는 BALB/c 균주로부터의 Y 염색체를 포함하거나, 또는 C57BL/6 균주 및 129 균주의 혼합을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항, 제11항 내지 제13항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설치류 XY ES 세포는 표적 게놈 유전좌위에서 표적화된 유전적 변형을 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 표적화된 유전적 변형은 삽입, 결실, 넉아웃(knockout), 넉인(knockin), 점 돌연변이, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 설치류 XY ES 세포는 마우스 XY ES 세포이며,
상기 제1 집단 및 제2 집단은 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원하거나 동일한 유전자형을 가지고,
상기 단계 (b)에서의 평가는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현을 검출하고,
암컷화 활성은 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 마우스 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 마우스 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 확인되는, 방법. - 제11항에 있어서, 상기 설치류 XY ES 세포는 마우스 XY ES 세포이며,
상기 제1 집단 및 제2 집단은 동일한 세포주 또는 동일한 클론으로부터 기원하거나 동일한 유전자형을 가지고,
상기 단계 (b)에서의 평가는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현을 검출하고,
상기 제1 농도는 상기 제1 집단으로부터의 하나 이상의 마우스 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 상기 제2 집단으로부터의 하나 이상의 마우스 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 선택되는, 방법. - 제24항에 있어서, 상기 설치류 XY ES 세포는 마우스 XY ES 세포이며,
상기 단계 (b)에서의 평가는 mRNA 수준에서 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 발현을 검출하고,
상기 공여자 설치류 XY ES 세포는 공여자 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현이 대조군 설치류 XY ES 세포에서의 Ddx3y, Uty, 및 Eif2s3y의 mRNA 발현보다 적어도 90% 더 낮은 경우 단계 (c)에서 선택되는, 방법. - 삭제
- 삭제
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