CN111321232B - 一种快速检测肉牛eif4a2基因拷贝数变异的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法及其应用：基于实时定量PCR，以云岭牛基因组DNA为模板，利用一对引物扩增地方肉牛(例如，云岭牛)EIF4A2基因的拷贝数变异区域部分片段，同时利用另外一对引物扩增牛通用转录因子3基因部分片段作为内参，对定量结果进行计算，判定个体的拷贝数变异类型。本发明提供的方法建立在肉牛EIF4A2基因拷贝数变异与生长性状之间的关联基础之上，有利于加快肉牛分子标记辅助选择育种工作，该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种快速检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传学检测领域，具体涉及一种检测肉牛(例如，云岭牛)EIF4A2基因拷贝数变异的方法，该方法利用基因组DNA实时定量PCR，以BTF3基因为内参，根据2*2^(-ΔΔCt)值从而确定个体的拷贝数变异类型。

背景技术

真核翻译起始因子4A(EIF4A)属于DEAD－box RNA解旋酶家族，在EIF4F复合体中发挥RNA解旋酶活性。EIF4A与CCYR-NOT复合物结合能够抑制翻译，EIF4A参与Dpp/BMP信号通路的调控，在胚胎发育中有重要作用。哺乳动物中存在三种EIF4A：EIF4A1、EIF4A2和EIF4A3。其中EIF4A1和EIF4A2的表达是相互关联的，通过抑制EIF4AI可以抑制蛋白的表达，且显著提高EIF4A2表达。

所谓的拷贝数变异(CNV)指的是一个物种的个体之间的大于50bp的基因组序列的插入或缺失变异，是一种基因组结构变异类型。CNV可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。随着牛全基因组测序工作的完成，牛基因组CNVs研究也成为热点。研究表明，有些CNV位点位于功能基因内部，有些CNV位点则与牛的各种经济性状相关。

在检测已知CNV的各种方法中，实时定量PCR(qPCR)使用比较广泛。该方法操作简单、敏感性高，速度快。PCR中可选取单拷贝的基因，如参考Liu等验证发现的牛单拷贝基因BTF3基因，作为内参基因，然后利用2^-ΔΔCt的方法计算，从而判定个体的拷贝数变异类型以及相对拷贝数。

到目前为止，尚未见到关于EIF4A2基因与肉牛个体生长性状关联的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以肉牛血样基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增肉牛个体的EIF4A2基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因(牛通用转录因子3基因)的部分片段，然后根据定量结果鉴定肉牛个体EIF4A2基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-ACCAAGGCTATCTTGGTTTCTG-3’

下游引物R1：5’-GGTGAAAAAGGAAGAATTGACCC-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

优选的，所述的EIF4A2基因的拷贝数变异区域位于牛EIF4A2基因参考序列NC_007299.6的81347201位至81351200位。

优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2^(-ΔΔCt)将定量结果分为的三类：插入型，2*2^(-ΔΔCt)>2；缺失型，2*2^(-ΔΔCt)<1；正常型，1≤2*2^(-ΔΔCt)≤2。

优选的，所述的实时定量PCR所用的扩增体系为：50ng/μL模板DNA 1μL、ddH₂O 3μL、10μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及

Premix ExTaq^TMII 5μL。

优选的，所述的实时定量PCR所用的反应程序为：(1)95℃预变性1min；(2)95℃变性15s，60℃退火15s，共40个循环。

优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为156bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述的拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上显著优于具有正常型、缺失型拷贝数变异类型的个体。

优选的，所述的生长性状(例如，云岭牛个体)为胸深、胸宽、尻长。

本发明的有益效果体现在：

本发明公开的检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法，与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，快速简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型。依据本发明对肉牛EIF4A2基因(EIF4A2基因的拷贝数变异区域)的CNV类型进行的检测和类型频率统计，以及相应CNV位点与肉牛(例如，云岭牛)的生长性状关联分析结果，本发明的检测方法可以鉴定个体在DNA水平上与肉牛(例如，云岭牛)生长性状密切相关的CNV标记，可作为云岭牛等地方肉牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，快速建立遗传资源优良的肉牛(例如，云岭牛)种群，便于肉牛生长性状的标记辅助选择。

附图说明

图1为EIF4A2基因拷贝数变异检测的实时定量PCR Melt Peak图；图1中：左侧峰对应引物对P1；右侧峰对应引物对P2。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

在前期的地方牛基因组重测序研究当中，发现牛EIF4A2基因组序列的81347201位至81351200位(NC_007299.6)发生了拷贝数变异。本发明根据重测序得到的云岭牛EIF4A2基因组序列中发生拷贝数变异的区域设计特异性片段扩增引物，并以云岭牛基因组DNA为模板，进行qPCR扩增，根据定量结果(以BTF3基因为内参基因)计算并判定个体的拷贝数类型。具体实验过程和结果如下。

1.样品的采集及基因组DNA提取

(1)血样的采集

本发明中肉牛血样采集于云南省昆明市小哨乡草地动物科学研究院(2018年10月采集)，共计132个云岭牛个体，均为24月龄，血液的采集方法为颈静脉采血。并记录它们的生长性状数据，如体高、体长、胸宽、胸深、胸围、尻长、坐骨端宽、十字部高等，以用于后续的关联分析。

(2)血样基因组DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀消失、溶液澄清；尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀，继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复本步骤1次。

⑤加入氯仿500mL，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿、异戊醇混合液(24:1)500mL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA中加入80～100μL的TE，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪检测DNA纯度和浓度，-80℃保存。

2.目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计

根据NCBI所公布的牛EIF4A2基因序列(NC_007299.6)为参考序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，即EIF4A2基因(目的基因)组序列的81347201位至81351200位，利用Prime 5.0软件设计包含在此区域的引物，并在NCBI_BLAST中进行比对，引物序列如下(引物对P1，扩增片段大小为156bp)：

上游引物F1：5’-ACCAAGGCTATCTTGGTTTCTG-3’

下游引物R1：5’-GGTGAAAAAGGAAGAATTGACCC-3’

同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增内参基因(BTF3基因)中特定片段(166bp)的引物，其引物序列如下(引物对P2)：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’

3.实时定量PCR

qPCR反应体系如表1所示。

表1.qPCR的反应体系

qPCR反应程序为：

(1)95℃预变性1min；然后按照(2)进行扩增反应；

(2)95℃变性15s，60℃退火15s，共40个循环。

绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃/5s。

通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于QPCR分析。扩增曲线平滑，表明qPCR试剂质量好且扩增体系和条件合适；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好；峰单一表示引物特异性良好(图1)。

4.个体CNV类型判定

实验结果采用2^-△△Ct方法进行计算，具体的计算方法为：ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}

公式中，实验组即为待检测有无拷贝数变异的个体样本。参照组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照组云岭牛个体。

根据公式计算得出每个待测个体的-ΔΔCt，并根据判定标准：2*2^(-ΔΔCt)>2，插入型(Gain)；2*2^(-ΔΔCt)<1，缺失型(Loss)；1≤2*2^(-ΔΔCt)≤2，正常型(Median)，鉴定检测的云岭牛个体的拷贝数变异类型。Ct即Cyclethreshold，为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

5.数据处理

统计检测群体中各种类型(Gain、Median和Loss)的个体数，并统计各种类型的频率。

计算公式如下：

P_C＝N_C/N

其中，P_C代表某种拷贝数变异类型的频率；N_C代表群体中具有C这种CNV类型的个体数；N代表检测群体的个体总数量。

利用SPSS(18.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、性别、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中，Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的拷贝数类型；E_ijk为随机误差。

数据处理的结果如表2所示。

表2.云岭牛EIF4A2基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；^*P<0.05。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

结果表明(表2)，云岭牛EIF4A2基因的拷贝数变异位点与胸深、胸宽和尻长这三个生长性状具有显著的关联性。其中，Loss类型的个体频率最高，Gain类型的个体生长性状显著优于Median、Loss类型个体，Gain类型对云岭牛的胸深、胸宽和尻长有显著的正效应。因此，检测的EIF4A2基因拷贝数变异位点(NC_007299.6的81347201位至81351200位)的Gain类型可以作为云岭牛性状早期选择的分子标记(CNV标记)。

6.CNV标记在肉牛选育中的应用

本发明于利用qPCR技术，检测云岭牛EIF4A2基因的拷贝数变异情况，并将不同的拷贝数变异类型与生长性状进行关联分析，寻找到了具有优势生长性状的拷贝数类型，通过检测，可以为云岭牛的分子育种工作提供基础资料，根据相应的CNV标记不仅可以加快云岭牛的种质资源改良工作，而且有助于肉牛优良品系的快速选育。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种快速检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法及其应用

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工合成

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accaaggcta tcttggtttc tg 22

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggtgaaaaag gaagaattga ccc 23

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (4)

1.检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法在肉牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述检测肉牛EIF4A2基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

以肉牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时定量PCR扩增EIF4A2基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定肉牛EIF4A2基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’- ACCAAGGCTATCTTGGTTTCTG -3’

下游引物R1：5’- GGTGAAAAAGGAAGAATTGACCC -3’ ；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’ ；

所述的EIF4A2基因的拷贝数变异区域位于EIF4A2基因参考序列NC_007299.6的81347201位至81351200位；

所述肉牛为云岭牛；

所述的拷贝数变异类型是根据2*2^（-ΔΔCt）将定量结果分为的三类：插入型，2*2^（-ΔΔCt）>2；缺失型，2*2^（-ΔΔCt）<1；正常型，1≤2*2^（-ΔΔCt）≤2；

所述的拷贝数变异类型中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优；

所述的生长性状为胸深、胸宽或尻长。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的扩增体系包括50 ng/μL模板DNA 1 μL及10 μmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的实时定量PCR的反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，共40个循环。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为156bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166 bp。

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