JPWO2003071869A1 - 生殖系列キメラ動物の作製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生殖系列キメラ動物の効率的な作製方法およびヘテロ接合体ならびにホモ接合体動物の簡便な作製方法を提供する。具体的には、遺伝的要因により生殖細胞細胞を形成できない初期胚(胚盤胞胚)に対して胚性幹細胞(ES細胞)を注入することにより、生殖細胞が注入したES細胞に由来するキメラ動物を作製する。得られたキメラ動物から得られる雌雄のヘテロ接合体を交配することでホモ接合体を得る。得られたキメラ動物は遺伝子機能の解析などを行う上で極めて有用である。
Description
[技術分野]
本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成できない初期胚(一般に胚盤胞)と全能性細胞を用いることにより、生殖細胞が形成されたキメラ動物の作製方法、および得られる個体の生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物に関する。ここで言う全能性細胞とは生殖細胞に分化しうる多能性細胞である。更に、該キメラ動物から得られるヘテロ接合体動物およびホモ接合体動物に関する。
[背景技術]
発生工学技術の進歩により確立された胚性幹細胞(ES細胞)を受精胚に戻して個体に発生させる手法(Evans MJ & Kaufman MK,Nature 292,154−156(1981))と相同組換えをES細胞に施すという手法(Zijlstra M et al.,Nature 342,435−438(1989);Thompson S et al.,Cell 56,313−321(1989))を組み合わせることがマウスを用いて最初に行われ、ノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスの作製技術が確立された。この技術の完成により、これまでは専ら酵母やショウジョウバエでしか行えなかった変異体を作り、遺伝子の機能を探るということが哺乳動物でも行うことができるようになり、ポストゲノム時代の遺伝子機能解析に不可欠な重要な技術の1つとして注目されている。
ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を効率よく作製するには大きく分けて3つのポイントがある。第1点は優良なES細胞を樹立すること。第2点はES細胞において遺伝子改変を効率よく行うこと。第3点は遺伝子改変されたES細胞がキメラマウスを形成し、得られたキメラマウスにおいてES細胞で行った遺伝子改変が生殖系列に伝播され次世代に伝達されることにある。
これまでの技術開発のなかで、第1点の優良なES細胞の樹立はマウスの系統に大きく依存し、樹立の確率が低いことに加え、樹立できたES細胞は継代を重ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、莫大な労力をつぎ込んで樹立したES細胞も、出来る限り、継代を繰り返さずに使用しているのが現状である。特に、近交系マウスのES細胞を用いる場合はその傾向が著しい。
第2点は相同組換え技術およびそれに関連する技術の改善が繰り返され、実用段階の技術として頻繁に利用されている。
第3点には問題点が多い。特に、キメラマウスは作製できたが生殖系列への伝播がないという苦い経験を多くの研究者がしており、ノックアウトマウスの作製においてはこの第3点が大きな壁となっている。このため、実際には、生殖系列への伝播実績があり、出来る限り継代を重ねていないES細胞を入手して使用する方法が取られているのが現状である。
一方、ES細胞は受胎産物を構成する全ての細胞系譜において正常な発達を遂げる能力を有するが、個体発生の過程において、注入するES細胞が注入される受精胚(一般に胚盤胞)に比べて胎盤などの胚外の細胞系譜に寄与する能力が低いと考えられている(Beddington R S & Robertson E J,Development 105,733−737(1989);Nagy A et al.,Development 110,815−821(1990))。そこで、ES細胞と発生分化の方向が主に胚外の胎盤へ偏りがある胚とを組み合わせることで、ES細胞を胚への発生分化の方向に導き、生殖組織を含む全ての組織がES細胞に由来するマウスを得る手法が提案されている。この場合には、マウスのES細胞とマウスの4倍体胚との組み合わせが最も適すると考えられている。すなわち、4倍体胚単独では着床後まで発生することは少なく、妊娠中期に至るものはほとんどない(Kaufman M H & Webb S,Development 110,1121−1132(1990))。4倍体胚と正常な胚(2倍体)とのキメラでは、4倍体細胞は胚自体にはほとんど寄与しない反面、胚外の膜組織へはかなり広範に寄与することが報告されている(Tarkowski A K,J.Embryol.Exp.Morph.41,47−64(1977))。そこで、マウスES細胞とマウス4倍体胚を組み合わせることで互いに補足し合って会合体キメラを作製する方法が提案されている。この場合には、胎仔はES細胞に由来するのに対し、大部分の胚外組織は4倍体細胞に由来する極性のあるキメラが作製されることが報告された(Nagy A et al.,Development 110,815−821(1990))。しかし、この手法により、近交系マウスのES細胞よりキメラ個体を取得できた例は極めて稀であり、得られた場合もキメラマウスは呼吸障害や奇形などの障害を発症して長くは生存できず(Eggan K et al.,PNAS 98,6209−6214(2001))、生殖系列キメラの実用的な作製方法とすることは困難である。
このため、遺伝子改変されたキメラ個体を形成し、得られたキメラ個体におけるES細胞に由来する遺伝子改変が生殖系列に伝播された次世代の個体を効率よく作製する技術の開発が切望されている。
[発明の開示]
本発明者らは、上述の状況を鑑み、生殖系列キメラの作製方法について鋭意研究を行った。すなわち、本発明が解決すべき課題と目的は、遺伝子改変を施したES細胞等の全能性細胞を用いてノックアウトマウス等の遺伝子改変動物を効率よく作製することにある。とりわけ生殖系列キメラマウスの効率的な作製方法を構築することにある。すなわち、ノックアウトマウス等の遺伝子改変マウスの作製においては、遺伝子改変したES細胞を用いたキメラマウスを作製することはできるが、得られたキメラマウスには、遺伝子改変されたES細胞を生殖系列に伝播できず、遺伝子改変が次世代に伝達されないという問題をこれまでの研究者は経験してきた。改変遺伝子を持った子孫が出来るキメラマウスの作製が望まれ、これを解決する必要に迫られていた。本発明は、このような改変遺伝子が次世代に伝達されないという問題を解決するためになされたものである。
このため生殖細胞を形成することができない初期胚と全能性細胞を用い、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物を作製すればよいことに想到し、本発明の完成に到ったものである。ここでいう全能性細胞とは、生殖細胞に分化しうる多能性細胞、すなわちES細胞・EG細胞などの幹細胞や、始原生殖細胞、内部細胞塊、核移植胚などの再構築胚を含む。
本発明は生殖細胞を形成することができない初期胚にES細胞などの全能性細胞を導入し、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法及びES細胞などに施した遺伝子改変が子孫に伝達される動物を提供することを課題とする。
そこで本発明者らは、本課題を解決するためにES細胞(胚性幹細胞)などの全能性細胞による、生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法を検討した。
なお、本発明において生殖系列キメラとは、キメラ動物の生殖細胞が導入した全能性細胞に由来していることを意味する。一般にES細胞を用いた生殖系列キメラマウスは、ES細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統との間でキメラマウスを作製し、得られたキメラマウスとES細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統のマウスを交配して、その産仔を得て、ES細胞の由来となった系統の毛色を確認するまでは生殖系列キメラマウスであるかどうかを確認することができない。また、特に雄性の場合、ES細胞から生殖細胞が形成されていたとしても、生殖細胞に占めるES細胞の寄与率が低い場合にはES細胞の遺伝子を有する産仔を得ることは困難である。また、ES細胞由来の精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には受精に至らず次世代の産仔を得ることはできない。更に、遺伝子改変をミトコンドリアに施す場合には、ミトコンドリアが卵子由来であるため、雌性のES細胞を使用して雌性の生殖系列キメラマウスを作製しなければならない。
精巣内又は卵巣内に、ES細胞に由来する生殖細胞だけを有するキメラマウスを得ることができれば、次世代の産仔は確実にES細胞に由来した染色体を持つことができ、生殖系列キメラマウスを効率よく作製することができる。仮に、雄性のキメラマウスが得られたが、得られたキメラマウスの精子の数が少ない場合や、精子の活性が低い場合であっても、顕微受精(ICSI)などの技術を用いて容易に次世代産仔を得ることができる。
尚、雌性のキメラマウスの場合には、自然交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精により次世代産仔を取得することができる。
本発明は以上の検討に基づいてなされたもので、生殖系列キメラ動物の作製方法に関する。また、該方法により得られるキメラ動物及び該キメラ動物から得られる遺伝子改変動物に関する。すなわち、本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚(一般に胚盤胞)と、全能性細胞とを用いることで、生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物を作製する方法およびそれにより得られる生殖系列キメラ動物である。本発明における遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚は、異種交雑種第1代が生殖細胞を欠失するという遺伝的要因を利用することで作製することができる。この生殖細胞の欠失が雌雄生殖細胞のいずれに現れるかは動物種により異なる。例えば、マウスでは雄性生殖細胞が欠失する。即ち、実験用マウスのC57BL/6と異種マウスのMus spretusとの正逆の交配、或は体外授精により得られる交雑種胚は雄性不稔となる(Matsuda Y et al.,PNAS 88,4850−4854(1991))。また、c−kit変異マウスの、例えばWv/+マウスとW/+マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚(Wv/W又はW/Wv)は、雌雄両性で生殖細胞を形成することができない(不稔/不妊)ので、この遺伝的要因を利用することで雌雄それぞれの生殖細胞を欠いたマウスを作製することができる(Kussell ES,Adv Genet 20,357−459(1979))。特に、Wv/W又はW/Wv受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。また、核移植胚またはトランスジェニック胚としても作製することができる。
本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てES細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精して、ES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。得られた雌雄のヘテロ接合体を交配してホモ接合体を容易に得ることができる。
更に、雌性の遺伝子改変を施したES細胞から作製した雌性のキメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。
本発明は以下のような方法とその方法によって作製されるキメラ動物を提供するものである。
(1)生殖細胞を形成することができない初期胚と、全能性細胞を用いることを特徴とする、生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
(2)生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受精胚、核移植胚、またはトランスジェニック胚である前記(1)の作製方法。
(3)全能性細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である前記(1)又は(2)の作製方法。
(4)全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である前記(1)又は(2)の作製方法。
(5)動物がマウスである前記(1)乃至(4)のいずれかの作製方法。
(6)生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マウス(Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にあるMus spretusのマウスとの正逆の交配或は体外授精で得られる受精胚である前記(5)の作製方法。
(7)生殖細胞を形成することができない初期胚がc−kit変異によりなされる受精胚である前記(1)乃至(5)のいずれかの作製方法。
(8)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
(9)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
(10)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
(11)動物がマウスである前記(8)乃至(10)のいずれかのキメラ動物。
(12)生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、所望する系統の雌性動物とを交配するか、又は、前記雄性キメラ動物から得られた精子を、所望する系統の卵子に体外授精または顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
(13)生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、所望する系統の雄性動物とを交配するか、又は、前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
(14)前記(9)および(10)により得られるキメラ動物の雌雄を交配、人工授精、体外授精、或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
(15)動物がマウスである前記(12)乃至(14)のいずれかの作製方法。
(16)前記(12)乃至(14)のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物。
(17)前記(12)乃至(14)のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得られるホモ接合体動物。
(18)動物がマウスである前記(16)又は(17)の動物。
[発明を実施するための最良の形態]
本発明のキメラ動物は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚に対してES細胞のような全能性細胞を注入することで作製する。得られたキメラ動物の全ての生殖細胞は注入した全能性細胞、例えばES細胞を用いた場合には、ES細胞に由来する。以下の説明においては、全能性細胞の一例としてES細胞を例示して説明するが、全能性細胞をES細胞に限ったものではない。得られたキメラ動物の精子、又は卵子は全てES細胞に由来し、次世代の産仔には必ずES細胞に由来した染色体が伝播し、遺伝子対の一方はES細胞の遺伝子であるヘテロ接合体となる。
生殖細胞を形成することができない初期胚、例えば受精胚は遺伝的要因により起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製する。このためには、2種の方法を提案することができる。すなわち、マウスでは異種交雑種第1代の雄は不稔を示すことから、実験用マウス(Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にあるマウスを自然交配して異種交雑受精胚を得る。このとき繁殖能力に優れた実験用マウスの雌から卵子を得る方が好ましい。すなわち、実験用マウス(Mus musculus domesticus)の雌とその同胞異種関係にある雄を自然交配して異種交雑受精胚を得ることが望ましい。特に、3週齢から4週齢の若齢期実験用雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配することで多くの受精胚を得ることができる。
更に、過剰排卵を誘起した若齢期の実験用雌マウスから採取した卵子と異種マウスの精子を体外授精して得た異種交雑種胚を効率よく大量に得ることができる。実験用マウスはC57BL/6などが使用できる。
一方、交配相手である異種マウスはMus spretusやMus caroli、Mus pahari等が使用できるが、体外授精に関する情報が比較的集積されてきているMus spretusが好ましく、異種交雑種胚を安定して得ることができるC57BL/6雌性マウスとMus spretus雄性マウスの組み合わせが好ましい。
更に、第2の方法として、c−kit変異マウス、例えば、Wv/+マウスとW/+マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚(Wv/W又はW/Wv)は生殖細胞の形成不全が起こるということを利用して作製することができる。特に、Wv/W又はW/Wv受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。
このようにして得られた受精胚はすべて遺伝的に生殖細胞を形成しない受精胚である。その結果、この胚にES細胞を注入して得られたキメラマウスの生殖細胞では、全てES細胞に由来する精子又は卵子が形成される。
かくして得られた雄性のキメラマウスの精子(生殖細胞)はES細胞に由来し、このキメラマウスと実験用雌マウスを交配して得られた産仔はES細胞の染色体対の一方を持つヘテロ接合体となる。このように得られる該キメラマウスはES細胞由来の生殖系列キメラマウスとなる。更に、得られる該キメラマウスの精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には自然交配では受精に至らないが、その場合にも、精子を採取して顕微受精(ICSI)などの技術を用いて次世代産仔を得ることができる。一方、Wv/W受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラ動物を作製することができる。この場合、ミトコンドリア改変等を行った遺伝子改変動物を作製する場合は有利である。
以上述べたとおり、本発明は生殖系列キメラ動物を効率よく作製することができる。本発明の適応によって、これまでほとんど成功していない近交系マウス由来ES細胞からのノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスが作製できると予測される。また、これまで生殖系列キメラを得ることができなかったES細胞からも、遺伝子改変マウスができる可能性がある。またES細胞に限らず全能性細胞ならば応用が可能であると考えられる。
上記はマウスによって例示したがこの操作はすべての哺乳動物に応用することができる。例えば家畜などにおいては、体細胞、或は遺伝子を改変した体細胞から核移植によりクローン胚を作製し、本発明の方法を適用することによって効率的に生殖系列キメラ動物を作製することが可能となる。また鳥類や爬虫類、両生類、魚類などの実験動物にも応用することができる。この場合異数体胚を不妊胚として用いることも可能である。さらに、野生動物にも応用することもできる。
さらに、本発明により得られる全ての生殖細胞がES細胞に由来するキメラ動物の次世代産仔からは、染色体対の一方がES細胞に由来する雌雄のヘテロ接合体動物を得ることができ、得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することでホモ接合体動物(ホモ型遺伝子改変動物)を作製することができる。
[実施例]
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例1
キメラ作製に用いる受精胚の調製
(1)雄性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
3.5週齢のMus spretus型ミトコンドリアを持つC57BL/6雌マウス(B6−mtSPE:戻し交配により細胞質内のミトコンドリアを野生種由来近交系Mus spretusのそれに置換したC57BL/6マウス)の腹腔に妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)を5IU/0.05ml/匹の割合で投与し、その48時間後に絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を5IU/0.05ml/匹の割合で投与して過剰排卵誘起処理を施した。次に過剰排卵誘起処理を施した雌マウスと、性成熟した(6週齢以上)雄の野生種由来近交系Mus spretusと同居させて自然交配させた。交配確認後3.5日目の雌マウスの子宮を摘出して、M2培地(94.7mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,4.00mM NaHCO3,21.0mM HEPES,23.3mM乳酸ナトリウム,0.33mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)で還流して採取した胚を同培地で洗浄して同胞異種胚(胚盤胞期胚)を調製した。
一方、体外授精により同胞異種胚を調製する場合は、前述の方法で過剰排卵誘起処理を施したC57BL/6雌マウス(hCG投与後16時間後)を頚椎脱臼で安楽死させて卵管を摘出し、ミネラルオイルで覆ったmTYH培地(199.37mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,1.00mMピルビン酸ナトリウム,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)液滴のミネラルオイル部位に採取した卵管をつけた。次に、実体顕微鏡下で2本の27G注射針を用いて卵管を破り、卵子を含む卵丘細胞群をmTYH培地液滴内に導入した。尚、血液や組織の混入を防ぐため、卵管は培地内に入れないように注意した。精子は前培養を行うため、Mus spretus雄マウスを頚椎脱臼により安楽死させて精巣上体尾部を摘出し、精巣上体尾部に付着している血液をキムワイプでふき取った後、指で保持して最も太い精管をめがけて23G注射針で切れ目を入れ、出てきた精子塊を注射針ですくい取り、ミネラルオイルで覆った0.3mlのmTYH培地液またはmTYH培地(199.37mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,1.00mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)に導入してCO2インキュベーター内で2〜8時間培養して前培養を行った。前培養を終えた精子を先に調製した卵子を含む受精用培地(mTYH培地)に最終精子濃度が1〜5×105個/mLになるように媒精した。媒精した卵子をCO2インキュベーター内で8〜10時間培養した。次に、卵子を発生用の0.1mM EDTA添加M16培地(94.59mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,23.28mM乳酸ナトリウム,0.33mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)で洗浄後に同培地に移し、実体顕微鏡で受精卵を確認した後、CO2インキュベーター内で96時間培養し、胚盤胞期胚を調製した。
(2)雌雄両性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
生殖細胞形成に関与するc−kitの変異を持つW系統ヘテロ接合体の雌雄マウスの交配又は体外授精によってWv/W或はW/Wvホモ接合体の受精胚の作製を(1)に記載した方法に準じて胚盤胞期胚を調製した。
実施例2
キメラマウスの作製
実施例1に記載したMus spretus型ミトコンドリアDNAを持つ近交系C57BL/6雌マウス(B6−mtSPE)の卵子と野生種由来近交系Mus spretus精子の体外授精法で調製した胚盤胞期胚(ミトコンドリアDNAはMus spretus型)に対して常法に従い近交系C57BL/6由来のES細胞(ミトコンドリアDNAはMus musculus domesticus型)を注入した。48個の胚盤胞期胚を使用して、1個の胚に対して5個のES細胞を注入し、48個の注入胚を得た。8週齢の精管結紮雄マウスと交配することで得た交配2日目の3匹の6週齢の仮親用CD−1雌マウス子宮に16個の注入胚を移植し、3匹のキメラ産仔を得た。
実施例3
キメラマウス生殖細胞の系譜
実施例2で得た雄性キメラマウスを飼育して性成熟させた。毛色で低モザイク、中モザイク及び黒色の3種を選抜し、精巣上体尾部より精子を採取した。得られた精子のミトコンドリアDNAをPCR解析することで、生殖細胞の系譜を調べた。精子がES細胞に由来する場合はMus musculus domesticus型のミトコンドリアDNAが、受精卵に由来する場合はMus spretus型のミトコンドリアDNAが検出される。Nested−PCR法(Kaneda H et al.,PNAS 92,4542−4546(1995))の解析の結果、いずれのマウスにおいても得られた精子はES細胞に由来した。尚、C57BL/6マウス(B6−mtSPE)の卵子とMus spretus精子の体外授精で得られた異種交雑種F1雄性マウスにおいて精子を確認することは出来ず、また、C57BL/6マウスとの交配でも産仔を得ることができなかったことから、異種交雑種F1雄性マウスが生殖細胞を形成できないことを確認した。
[産業上の利用の可能性]
本発明により得られるキメラ動物の作る生殖細胞は注入したES細胞に由来するため、該キメラ動物と所望する系統の動物との交配により、或は、該キメラ動物から得られた精子と所望する系統の卵子で体外授精して得られた受精卵を仮親に移植することにより産仔を得ることで、染色体対の一方がES細胞に由来するヘテロ接合体の雌雄動物を得ることができる。こうして得られたヘテロ接合体の雌雄を交配することでホモ接合体動物を作製することができる。通常、ここで使用するES細胞は、予め相同組換えなどにより所望する遺伝子改変を施したES細胞を使用することができるため、遺伝子改変がなされたホモ接合体動物を容易に得ることができる。更に、Wv/+マウスとW/+マウスの正逆の交配或は体外授精により得られるWv/W又はW/Wv受精胚などのc−kit変異マウスの受精胚を用いた場合、雄性のみらならず雌性の生殖細胞も形成することができない。このためES細胞は雄性のみならず雌性であっても、得られたキメラマウスの全ての生殖細胞に注入したES細胞が寄与するため、雄性のES細胞に限定されることなく、雌雄いずれのES細胞でも生殖系列キメラ動物を作製することができる。
また本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てES細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配或は体外授精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体は、相互に交配してホモ接合体を容易に得ることができるため、遺伝子機能解析に極めて有用である。更に、遺伝子改変を施した雌性ES細胞を樹立して作製した雌性のキメラ動物を交配或は人工授精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することで同様にホモ接合体を容易に得ることができる。また、キメラ動物の雌雄を交配することでホモ接合体を得ることもできると考えられる。以上の方法で得られる遺伝子改変動物は、遺伝子機能解析に極めて有用である。
そしてこのような操作を簡便に行うことが可能となり、従来非効率的であった生殖系列キメラ動物の作製を効率的に行うことが可能となる。
本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成できない初期胚(一般に胚盤胞)と全能性細胞を用いることにより、生殖細胞が形成されたキメラ動物の作製方法、および得られる個体の生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物に関する。ここで言う全能性細胞とは生殖細胞に分化しうる多能性細胞である。更に、該キメラ動物から得られるヘテロ接合体動物およびホモ接合体動物に関する。
[背景技術]
発生工学技術の進歩により確立された胚性幹細胞(ES細胞)を受精胚に戻して個体に発生させる手法(Evans MJ & Kaufman MK,Nature 292,154−156(1981))と相同組換えをES細胞に施すという手法(Zijlstra M et al.,Nature 342,435−438(1989);Thompson S et al.,Cell 56,313−321(1989))を組み合わせることがマウスを用いて最初に行われ、ノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスの作製技術が確立された。この技術の完成により、これまでは専ら酵母やショウジョウバエでしか行えなかった変異体を作り、遺伝子の機能を探るということが哺乳動物でも行うことができるようになり、ポストゲノム時代の遺伝子機能解析に不可欠な重要な技術の1つとして注目されている。
ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を効率よく作製するには大きく分けて3つのポイントがある。第1点は優良なES細胞を樹立すること。第2点はES細胞において遺伝子改変を効率よく行うこと。第3点は遺伝子改変されたES細胞がキメラマウスを形成し、得られたキメラマウスにおいてES細胞で行った遺伝子改変が生殖系列に伝播され次世代に伝達されることにある。
これまでの技術開発のなかで、第1点の優良なES細胞の樹立はマウスの系統に大きく依存し、樹立の確率が低いことに加え、樹立できたES細胞は継代を重ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、莫大な労力をつぎ込んで樹立したES細胞も、出来る限り、継代を繰り返さずに使用しているのが現状である。特に、近交系マウスのES細胞を用いる場合はその傾向が著しい。
第2点は相同組換え技術およびそれに関連する技術の改善が繰り返され、実用段階の技術として頻繁に利用されている。
第3点には問題点が多い。特に、キメラマウスは作製できたが生殖系列への伝播がないという苦い経験を多くの研究者がしており、ノックアウトマウスの作製においてはこの第3点が大きな壁となっている。このため、実際には、生殖系列への伝播実績があり、出来る限り継代を重ねていないES細胞を入手して使用する方法が取られているのが現状である。
一方、ES細胞は受胎産物を構成する全ての細胞系譜において正常な発達を遂げる能力を有するが、個体発生の過程において、注入するES細胞が注入される受精胚(一般に胚盤胞)に比べて胎盤などの胚外の細胞系譜に寄与する能力が低いと考えられている(Beddington R S & Robertson E J,Development 105,733−737(1989);Nagy A et al.,Development 110,815−821(1990))。そこで、ES細胞と発生分化の方向が主に胚外の胎盤へ偏りがある胚とを組み合わせることで、ES細胞を胚への発生分化の方向に導き、生殖組織を含む全ての組織がES細胞に由来するマウスを得る手法が提案されている。この場合には、マウスのES細胞とマウスの4倍体胚との組み合わせが最も適すると考えられている。すなわち、4倍体胚単独では着床後まで発生することは少なく、妊娠中期に至るものはほとんどない(Kaufman M H & Webb S,Development 110,1121−1132(1990))。4倍体胚と正常な胚(2倍体)とのキメラでは、4倍体細胞は胚自体にはほとんど寄与しない反面、胚外の膜組織へはかなり広範に寄与することが報告されている(Tarkowski A K,J.Embryol.Exp.Morph.41,47−64(1977))。そこで、マウスES細胞とマウス4倍体胚を組み合わせることで互いに補足し合って会合体キメラを作製する方法が提案されている。この場合には、胎仔はES細胞に由来するのに対し、大部分の胚外組織は4倍体細胞に由来する極性のあるキメラが作製されることが報告された(Nagy A et al.,Development 110,815−821(1990))。しかし、この手法により、近交系マウスのES細胞よりキメラ個体を取得できた例は極めて稀であり、得られた場合もキメラマウスは呼吸障害や奇形などの障害を発症して長くは生存できず(Eggan K et al.,PNAS 98,6209−6214(2001))、生殖系列キメラの実用的な作製方法とすることは困難である。
このため、遺伝子改変されたキメラ個体を形成し、得られたキメラ個体におけるES細胞に由来する遺伝子改変が生殖系列に伝播された次世代の個体を効率よく作製する技術の開発が切望されている。
[発明の開示]
本発明者らは、上述の状況を鑑み、生殖系列キメラの作製方法について鋭意研究を行った。すなわち、本発明が解決すべき課題と目的は、遺伝子改変を施したES細胞等の全能性細胞を用いてノックアウトマウス等の遺伝子改変動物を効率よく作製することにある。とりわけ生殖系列キメラマウスの効率的な作製方法を構築することにある。すなわち、ノックアウトマウス等の遺伝子改変マウスの作製においては、遺伝子改変したES細胞を用いたキメラマウスを作製することはできるが、得られたキメラマウスには、遺伝子改変されたES細胞を生殖系列に伝播できず、遺伝子改変が次世代に伝達されないという問題をこれまでの研究者は経験してきた。改変遺伝子を持った子孫が出来るキメラマウスの作製が望まれ、これを解決する必要に迫られていた。本発明は、このような改変遺伝子が次世代に伝達されないという問題を解決するためになされたものである。
このため生殖細胞を形成することができない初期胚と全能性細胞を用い、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物を作製すればよいことに想到し、本発明の完成に到ったものである。ここでいう全能性細胞とは、生殖細胞に分化しうる多能性細胞、すなわちES細胞・EG細胞などの幹細胞や、始原生殖細胞、内部細胞塊、核移植胚などの再構築胚を含む。
本発明は生殖細胞を形成することができない初期胚にES細胞などの全能性細胞を導入し、この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法及びES細胞などに施した遺伝子改変が子孫に伝達される動物を提供することを課題とする。
そこで本発明者らは、本課題を解決するためにES細胞(胚性幹細胞)などの全能性細胞による、生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法を検討した。
なお、本発明において生殖系列キメラとは、キメラ動物の生殖細胞が導入した全能性細胞に由来していることを意味する。一般にES細胞を用いた生殖系列キメラマウスは、ES細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統との間でキメラマウスを作製し、得られたキメラマウスとES細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統のマウスを交配して、その産仔を得て、ES細胞の由来となった系統の毛色を確認するまでは生殖系列キメラマウスであるかどうかを確認することができない。また、特に雄性の場合、ES細胞から生殖細胞が形成されていたとしても、生殖細胞に占めるES細胞の寄与率が低い場合にはES細胞の遺伝子を有する産仔を得ることは困難である。また、ES細胞由来の精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には受精に至らず次世代の産仔を得ることはできない。更に、遺伝子改変をミトコンドリアに施す場合には、ミトコンドリアが卵子由来であるため、雌性のES細胞を使用して雌性の生殖系列キメラマウスを作製しなければならない。
精巣内又は卵巣内に、ES細胞に由来する生殖細胞だけを有するキメラマウスを得ることができれば、次世代の産仔は確実にES細胞に由来した染色体を持つことができ、生殖系列キメラマウスを効率よく作製することができる。仮に、雄性のキメラマウスが得られたが、得られたキメラマウスの精子の数が少ない場合や、精子の活性が低い場合であっても、顕微受精(ICSI)などの技術を用いて容易に次世代産仔を得ることができる。
尚、雌性のキメラマウスの場合には、自然交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精により次世代産仔を取得することができる。
本発明は以上の検討に基づいてなされたもので、生殖系列キメラ動物の作製方法に関する。また、該方法により得られるキメラ動物及び該キメラ動物から得られる遺伝子改変動物に関する。すなわち、本発明は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚(一般に胚盤胞)と、全能性細胞とを用いることで、生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物を作製する方法およびそれにより得られる生殖系列キメラ動物である。本発明における遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚は、異種交雑種第1代が生殖細胞を欠失するという遺伝的要因を利用することで作製することができる。この生殖細胞の欠失が雌雄生殖細胞のいずれに現れるかは動物種により異なる。例えば、マウスでは雄性生殖細胞が欠失する。即ち、実験用マウスのC57BL/6と異種マウスのMus spretusとの正逆の交配、或は体外授精により得られる交雑種胚は雄性不稔となる(Matsuda Y et al.,PNAS 88,4850−4854(1991))。また、c−kit変異マウスの、例えばWv/+マウスとW/+マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚(Wv/W又はW/Wv)は、雌雄両性で生殖細胞を形成することができない(不稔/不妊)ので、この遺伝的要因を利用することで雌雄それぞれの生殖細胞を欠いたマウスを作製することができる(Kussell ES,Adv Genet 20,357−459(1979))。特に、Wv/W又はW/Wv受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。また、核移植胚またはトランスジェニック胚としても作製することができる。
本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てES細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精して、ES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。得られた雌雄のヘテロ接合体を交配してホモ接合体を容易に得ることができる。
更に、雌性の遺伝子改変を施したES細胞から作製した雌性のキメラ動物を交配、人工授精、体外授精、或は顕微受精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。
本発明は以下のような方法とその方法によって作製されるキメラ動物を提供するものである。
(1)生殖細胞を形成することができない初期胚と、全能性細胞を用いることを特徴とする、生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
(2)生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受精胚、核移植胚、またはトランスジェニック胚である前記(1)の作製方法。
(3)全能性細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である前記(1)又は(2)の作製方法。
(4)全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である前記(1)又は(2)の作製方法。
(5)動物がマウスである前記(1)乃至(4)のいずれかの作製方法。
(6)生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マウス(Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にあるMus spretusのマウスとの正逆の交配或は体外授精で得られる受精胚である前記(5)の作製方法。
(7)生殖細胞を形成することができない初期胚がc−kit変異によりなされる受精胚である前記(1)乃至(5)のいずれかの作製方法。
(8)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
(9)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
(10)前記(1)乃至(7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
(11)動物がマウスである前記(8)乃至(10)のいずれかのキメラ動物。
(12)生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、所望する系統の雌性動物とを交配するか、又は、前記雄性キメラ動物から得られた精子を、所望する系統の卵子に体外授精または顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
(13)生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、所望する系統の雄性動物とを交配するか、又は、前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
(14)前記(9)および(10)により得られるキメラ動物の雌雄を交配、人工授精、体外授精、或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
(15)動物がマウスである前記(12)乃至(14)のいずれかの作製方法。
(16)前記(12)乃至(14)のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物。
(17)前記(12)乃至(14)のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得られるホモ接合体動物。
(18)動物がマウスである前記(16)又は(17)の動物。
[発明を実施するための最良の形態]
本発明のキメラ動物は、遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚に対してES細胞のような全能性細胞を注入することで作製する。得られたキメラ動物の全ての生殖細胞は注入した全能性細胞、例えばES細胞を用いた場合には、ES細胞に由来する。以下の説明においては、全能性細胞の一例としてES細胞を例示して説明するが、全能性細胞をES細胞に限ったものではない。得られたキメラ動物の精子、又は卵子は全てES細胞に由来し、次世代の産仔には必ずES細胞に由来した染色体が伝播し、遺伝子対の一方はES細胞の遺伝子であるヘテロ接合体となる。
生殖細胞を形成することができない初期胚、例えば受精胚は遺伝的要因により起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製する。このためには、2種の方法を提案することができる。すなわち、マウスでは異種交雑種第1代の雄は不稔を示すことから、実験用マウス(Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にあるマウスを自然交配して異種交雑受精胚を得る。このとき繁殖能力に優れた実験用マウスの雌から卵子を得る方が好ましい。すなわち、実験用マウス(Mus musculus domesticus)の雌とその同胞異種関係にある雄を自然交配して異種交雑受精胚を得ることが望ましい。特に、3週齢から4週齢の若齢期実験用雌マウスをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配することで多くの受精胚を得ることができる。
更に、過剰排卵を誘起した若齢期の実験用雌マウスから採取した卵子と異種マウスの精子を体外授精して得た異種交雑種胚を効率よく大量に得ることができる。実験用マウスはC57BL/6などが使用できる。
一方、交配相手である異種マウスはMus spretusやMus caroli、Mus pahari等が使用できるが、体外授精に関する情報が比較的集積されてきているMus spretusが好ましく、異種交雑種胚を安定して得ることができるC57BL/6雌性マウスとMus spretus雄性マウスの組み合わせが好ましい。
更に、第2の方法として、c−kit変異マウス、例えば、Wv/+マウスとW/+マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚(Wv/W又はW/Wv)は生殖細胞の形成不全が起こるということを利用して作製することができる。特に、Wv/W又はW/Wv受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを作製することができる。
このようにして得られた受精胚はすべて遺伝的に生殖細胞を形成しない受精胚である。その結果、この胚にES細胞を注入して得られたキメラマウスの生殖細胞では、全てES細胞に由来する精子又は卵子が形成される。
かくして得られた雄性のキメラマウスの精子(生殖細胞)はES細胞に由来し、このキメラマウスと実験用雌マウスを交配して得られた産仔はES細胞の染色体対の一方を持つヘテロ接合体となる。このように得られる該キメラマウスはES細胞由来の生殖系列キメラマウスとなる。更に、得られる該キメラマウスの精子数が少ない場合や精子の活性が低い場合には自然交配では受精に至らないが、その場合にも、精子を採取して顕微受精(ICSI)などの技術を用いて次世代産仔を得ることができる。一方、Wv/W受精胚を用いる場合は雌性のES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラ動物を作製することができる。この場合、ミトコンドリア改変等を行った遺伝子改変動物を作製する場合は有利である。
以上述べたとおり、本発明は生殖系列キメラ動物を効率よく作製することができる。本発明の適応によって、これまでほとんど成功していない近交系マウス由来ES細胞からのノックアウトマウスなどの遺伝子改変マウスが作製できると予測される。また、これまで生殖系列キメラを得ることができなかったES細胞からも、遺伝子改変マウスができる可能性がある。またES細胞に限らず全能性細胞ならば応用が可能であると考えられる。
上記はマウスによって例示したがこの操作はすべての哺乳動物に応用することができる。例えば家畜などにおいては、体細胞、或は遺伝子を改変した体細胞から核移植によりクローン胚を作製し、本発明の方法を適用することによって効率的に生殖系列キメラ動物を作製することが可能となる。また鳥類や爬虫類、両生類、魚類などの実験動物にも応用することができる。この場合異数体胚を不妊胚として用いることも可能である。さらに、野生動物にも応用することもできる。
さらに、本発明により得られる全ての生殖細胞がES細胞に由来するキメラ動物の次世代産仔からは、染色体対の一方がES細胞に由来する雌雄のヘテロ接合体動物を得ることができ、得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することでホモ接合体動物(ホモ型遺伝子改変動物)を作製することができる。
[実施例]
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例1
キメラ作製に用いる受精胚の調製
(1)雄性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
3.5週齢のMus spretus型ミトコンドリアを持つC57BL/6雌マウス(B6−mtSPE:戻し交配により細胞質内のミトコンドリアを野生種由来近交系Mus spretusのそれに置換したC57BL/6マウス)の腹腔に妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)を5IU/0.05ml/匹の割合で投与し、その48時間後に絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を5IU/0.05ml/匹の割合で投与して過剰排卵誘起処理を施した。次に過剰排卵誘起処理を施した雌マウスと、性成熟した(6週齢以上)雄の野生種由来近交系Mus spretusと同居させて自然交配させた。交配確認後3.5日目の雌マウスの子宮を摘出して、M2培地(94.7mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,4.00mM NaHCO3,21.0mM HEPES,23.3mM乳酸ナトリウム,0.33mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)で還流して採取した胚を同培地で洗浄して同胞異種胚(胚盤胞期胚)を調製した。
一方、体外授精により同胞異種胚を調製する場合は、前述の方法で過剰排卵誘起処理を施したC57BL/6雌マウス(hCG投与後16時間後)を頚椎脱臼で安楽死させて卵管を摘出し、ミネラルオイルで覆ったmTYH培地(199.37mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,1.00mMピルビン酸ナトリウム,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)液滴のミネラルオイル部位に採取した卵管をつけた。次に、実体顕微鏡下で2本の27G注射針を用いて卵管を破り、卵子を含む卵丘細胞群をmTYH培地液滴内に導入した。尚、血液や組織の混入を防ぐため、卵管は培地内に入れないように注意した。精子は前培養を行うため、Mus spretus雄マウスを頚椎脱臼により安楽死させて精巣上体尾部を摘出し、精巣上体尾部に付着している血液をキムワイプでふき取った後、指で保持して最も太い精管をめがけて23G注射針で切れ目を入れ、出てきた精子塊を注射針ですくい取り、ミネラルオイルで覆った0.3mlのmTYH培地液またはmTYH培地(199.37mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,1.00mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)に導入してCO2インキュベーター内で2〜8時間培養して前培養を行った。前培養を終えた精子を先に調製した卵子を含む受精用培地(mTYH培地)に最終精子濃度が1〜5×105個/mLになるように媒精した。媒精した卵子をCO2インキュベーター内で8〜10時間培養した。次に、卵子を発生用の0.1mM EDTA添加M16培地(94.59mM NaCl,4.78mM KCl,1.71mM CaC12,1.19mM KH2PO4,1.19mM MgSO4,25.07mM NaHCO3,23.28mM乳酸ナトリウム,0.33mMピルビン酸ナトリウム,1g/Lグルコース,4g/L BSA,100IU/mLペニシリン,50μg/mLストレプトマイシン)で洗浄後に同培地に移し、実体顕微鏡で受精卵を確認した後、CO2インキュベーター内で96時間培養し、胚盤胞期胚を調製した。
(2)雌雄両性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
生殖細胞形成に関与するc−kitの変異を持つW系統ヘテロ接合体の雌雄マウスの交配又は体外授精によってWv/W或はW/Wvホモ接合体の受精胚の作製を(1)に記載した方法に準じて胚盤胞期胚を調製した。
実施例2
キメラマウスの作製
実施例1に記載したMus spretus型ミトコンドリアDNAを持つ近交系C57BL/6雌マウス(B6−mtSPE)の卵子と野生種由来近交系Mus spretus精子の体外授精法で調製した胚盤胞期胚(ミトコンドリアDNAはMus spretus型)に対して常法に従い近交系C57BL/6由来のES細胞(ミトコンドリアDNAはMus musculus domesticus型)を注入した。48個の胚盤胞期胚を使用して、1個の胚に対して5個のES細胞を注入し、48個の注入胚を得た。8週齢の精管結紮雄マウスと交配することで得た交配2日目の3匹の6週齢の仮親用CD−1雌マウス子宮に16個の注入胚を移植し、3匹のキメラ産仔を得た。
実施例3
キメラマウス生殖細胞の系譜
実施例2で得た雄性キメラマウスを飼育して性成熟させた。毛色で低モザイク、中モザイク及び黒色の3種を選抜し、精巣上体尾部より精子を採取した。得られた精子のミトコンドリアDNAをPCR解析することで、生殖細胞の系譜を調べた。精子がES細胞に由来する場合はMus musculus domesticus型のミトコンドリアDNAが、受精卵に由来する場合はMus spretus型のミトコンドリアDNAが検出される。Nested−PCR法(Kaneda H et al.,PNAS 92,4542−4546(1995))の解析の結果、いずれのマウスにおいても得られた精子はES細胞に由来した。尚、C57BL/6マウス(B6−mtSPE)の卵子とMus spretus精子の体外授精で得られた異種交雑種F1雄性マウスにおいて精子を確認することは出来ず、また、C57BL/6マウスとの交配でも産仔を得ることができなかったことから、異種交雑種F1雄性マウスが生殖細胞を形成できないことを確認した。
[産業上の利用の可能性]
本発明により得られるキメラ動物の作る生殖細胞は注入したES細胞に由来するため、該キメラ動物と所望する系統の動物との交配により、或は、該キメラ動物から得られた精子と所望する系統の卵子で体外授精して得られた受精卵を仮親に移植することにより産仔を得ることで、染色体対の一方がES細胞に由来するヘテロ接合体の雌雄動物を得ることができる。こうして得られたヘテロ接合体の雌雄を交配することでホモ接合体動物を作製することができる。通常、ここで使用するES細胞は、予め相同組換えなどにより所望する遺伝子改変を施したES細胞を使用することができるため、遺伝子改変がなされたホモ接合体動物を容易に得ることができる。更に、Wv/+マウスとW/+マウスの正逆の交配或は体外授精により得られるWv/W又はW/Wv受精胚などのc−kit変異マウスの受精胚を用いた場合、雄性のみらならず雌性の生殖細胞も形成することができない。このためES細胞は雄性のみならず雌性であっても、得られたキメラマウスの全ての生殖細胞に注入したES細胞が寄与するため、雄性のES細胞に限定されることなく、雌雄いずれのES細胞でも生殖系列キメラ動物を作製することができる。
また本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全てES細胞に由来するため、雄性キメラ動物を交配或は体外授精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体は、相互に交配してホモ接合体を容易に得ることができるため、遺伝子機能解析に極めて有用である。更に、遺伝子改変を施した雌性ES細胞を樹立して作製した雌性のキメラ動物を交配或は人工授精してES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄のヘテロ接合体を得ることができる。この得られた雌雄のヘテロ接合体を交配することで同様にホモ接合体を容易に得ることができる。また、キメラ動物の雌雄を交配することでホモ接合体を得ることもできると考えられる。以上の方法で得られる遺伝子改変動物は、遺伝子機能解析に極めて有用である。
そしてこのような操作を簡便に行うことが可能となり、従来非効率的であった生殖系列キメラ動物の作製を効率的に行うことが可能となる。
Claims (18)
- 生殖細胞を形成することができない初期胚と、全能性細胞を用いることを特徴とする、生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
- 生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受精胚、核移植胚、またはトランスジェニック胚である請求項1に記載の作製方法。
- 全能性細胞が胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である請求項1又は請求項2に記載の作製方法。
- 全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞(ES細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)である請求項1又は2に記載の作製方法。
- 動物がマウスである請求項1〜4のいずれかに記載の作製方法。
- 生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マウス(Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にあるMus spretusのマウスとの正逆の交配或は体外授精で得られる受精胚である請求項5に記載の作製方法。
- 生殖細胞を形成することができない初期胚がc−kit変異によりなされる受精胚である請求項1〜5のいずれかに記載の作製方法。
- 請求項1〜7のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
- 請求項1〜7のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
- 請求項1〜7のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
- 動物がマウスである請求項8〜10のいずれかに記載のキメラ動物。
- 生殖細胞が、導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、所望する系統の雌性動物とを交配するか、又は、前記雄性キメラ動物から得られた精子を、所望する系統の卵子に体外授精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
- 生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、所望する系統の雄性動物とを交配するか、又は、前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の作製方法。
- 請求項9および10により得られるキメラ動物の雌雄を交配、人工授精、体外授精、或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
- 動物がマウスである請求項12〜14のいずれかに記載の作製方法。
- 請求項12〜14のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物。
- 請求項12〜14のいずれかの方法で作製することができる、染色体対の一方が全能性細胞に由来するヘテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得られるホモ接合体動物。
- 動物がマウスである請求項16又は17に記載の動物。
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