KR20040104461A

KR20040104461A - 생식 계열 키메라 동물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20040104461A
Application number: KR10-2004-7013331A
Authority: KR
Inventors: 야스미쯔 나가오; 히로시 이마이; 다꾸로 호리; 요시까즈 도쯔까
Original assignee: 야스미쯔 나가오; 히로시 이마이; 다꾸로 호리; 요시까즈 도쯔까
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-12-10
Also published as: EP1486116A4; US20070245424A1; AU2003211803A1; WO2003071869A1; JPWO2003071869A1; EP1486116A1; US20050216966A1; CA2477112A1; CN1649489A

Abstract

본 발명은 생식 계열 키메라 동물의 효율적인 제조 방법 및 헤테로 접합체 및 호모 접합체 동물의 간편한 제조 방법을 제공한다. 구체적으로는 유전적 요인에 의해 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아(배반포 배아)에 대하여 배성 간세포(ES 세포)를 주입함으로써, 생식 세포가 주입된 ES 세포에서 유래하는 키메라 동물을 제조한다. 얻어진 키메라 동물로부터 얻어지는 자웅의 헤테로 접합체를 교배함으로써 호모 접합체를 얻는다. 얻어진 키메라 동물은 유전자 기능의 해석 등을 행하는 데에 있어서 매우 유용하다.

Description

생식 계열 키메라 동물의 제조 방법 {Method of Constructing Germline Chimeric Animal}

발생 공학 기술의 진보에 의해 확립된 배성 간세포(ES 세포)를 수정 배아로 복귀시켜 개체로 발생시키는 수법(Evans MJ and Kaufman MK, Nature 292, 154-156(1981))과 상동 재조합을 ES 세포에 실시한다는 수법(Zijlstra M et al., Nature 342, 435-438(1989); Thompson S et al., Cell 56, 313-321(1989))을 조합하는 것이 마우스를 이용하여 최초로 행해져, 녹-아웃(knock-out) 마우스 등의 유전자 개변 마우스의 제조 기술이 확립되었다. 이 기술의 완성에 의해, 지금까지는 오로지 효모나 초파리에서밖에 행할 수 없었던 변이체를 만들어, 유전자의 기능을 탐색한다는 것이 포유 동물에서도 행할 수 있게 되어, 포스트 게놈 시대의 유전자기능 해석에 불가결한 중요한 기술 중 하나로서 주목받고 있다.

녹-아웃 마우스 등의 유전자 개변 동물을 효율적으로 제조하기 위해서는 크게 나누어 3가지의 포인트가 있다. 제1 포인트는 우량한 ES 세포를 수립하는 것이고, 제2 포인트는 ES 세포에서 유전자 개변을 효율적으로 행하는 것이며, 제3 포인트는 유전자 개변된 ES 세포에서 키메라 마우스를 형성하고, 얻어진 키메라 마우스에 있어서 ES 세포에서 행한 유전자 개변이 생식 계열로 전파되어 차세대로 전달되는 것에 있다.

지금까지 개발된 기술 중에서, 제1 포인트의 우량한 ES 세포의 수립은 마우스의 계통에 크게 의존하여 수립의 확률이 낮았을 뿐 아니라, 수립할 수 있었던 ES 세포는 계대를 거듭함에 따라서 생식 계열로의 전파능을 잃기 때문에, 막대한 노동력을 투입하여 수립한 ES 세포도 계대를 반복하여 사용하지 못하는 것이 현실이다. 특히, 근교계 마우스의 ES 세포를 이용하는 경우에는 그러한 경향이 현저하다.

제2 포인트는 상동 재조합 기술 및 이에 관련하는 기술의 개선이 반복되어, 실용 단계의 기술로서 빈번하게 이용되고 있다.

제3 포인트에는 문제점이 많다. 특히, 키메라 마우스를 제조할 수 있었지만 생식 계열로의 전파가 없다는 쓰라린 경험을 많은 연구자가 하였고, 녹-아웃 마우스의 제조에서는 이 제3 포인트가 큰 장벽으로 되어 있다. 이 때문에, 실제로는 생식 계열로의 전파 실적이 있고, 가능한 한 계대를 거듭하지 않는 ES 세포를 입수하여 사용하는 방법이 취해지고 있는 것이 현실이다.

한편, ES 세포는 수태 산물을 구성하는 모든 세포 계보에서 정상적인 발달을이루는 능력을 갖지만, 개체 발생의 과정에 있어서 주입하는 ES 세포가 주입되는 수정 배아(일반적으로 배반포)에 비해 태반 등의 배아 밖의 세포 계보에 기여하는 능력이 낮다고 생각되고 있다(Beddington R S & Robertson E J, Development 105, 733-737(1989); Nagy A et al., Development 110, 815-821(1990)). 따라서, ES 세포와 발생 분화의 방향이 주로 배아 밖의 태반으로 편중된 배아를 조합함으로써, ES 세포를 배아로의 발생 분화의 방향으로 유도하여, 생식 조직을 포함하는 모든 조직이 ES 세포에서 유래하는 마우스를 얻는 수법이 제안되어 있다. 이 경우에는, 마우스의 ES 세포와 마우스의 4배체 배아의 조합이 가장 적합하다고 생각되고 있다. 즉, 4배체 배아 단독에서는 착상 후까지 발생하는 경우가 적어, 임신 중기에 이르는 것은 거의 없다(Kaufman M H & Webb S, Development 110, 1121-1132(1990)). 4배체 배아와 정상 배아(2배체)의 키메라에서는, 4배체 세포는 배아 자체에는 거의 기여하지 않는 반면, 배아 밖의 막 조직에는 상당히 광범위하게 기여하는 것이 보고되어 있다(Tarkowski A K, J. Embryol. Exp. Morph. 41, 47-64(1977)). 따라서, 마우스 ES 세포와 마우스 4배체 배아를 조합함으로써 상호 보충하여 회합(會合)체 키메라를 제조하는 방법이 제안되어 있다. 이 경우에는, 태아(胎仔)는 ES 세포에서 유래하는 데 반하여, 대부분의 배아 밖 조직은 4배체 세포에서 유래하는 극성이 있는 키메라가 제조되는 것으로 보고되었다(Nagy A et al., Development 110, 815-821(1990)). 그러나, 이 수법에 의해, 근교계 마우스의 ES 세포로부터 키메라 개체를 얻을 수 있었던 예는 극히 드물고, 얻어진 경우에도 키메라 마우스는 호흡 장해나 기형 등의 장해를 발증하여 길게는 생존할 수 없어(Eggan K et al., PNAS 98, 6209-6214(2001)), 생식 계열 키메라의 실용적인 제조 방법으로 하는 것은 곤란하다.

이 때문에, 유전자 개변된 키메라 개체를 형성하고, 얻어진 키메라 개체에서의 ES 세포에서 유래하는 유전자 개변이 생식 계열로 전파된 차세대의 개체를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 갈망되고 있다.

본 발명은 유전적으로 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아(일반적으로 배반포(胚盤胞))와 전능성 세포를 이용함으로써 생식 세포가 형성된 키메라 동물의 제조 방법, 및 얻어지는 개체의 생식 세포가 전능성 세포에서 유래하는 키메라 동물에 관한 것이다. 여기서 말하는 전능성 세포란 생식 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포이다. 또한, 상기 키메라 동물로부터 얻어지는 헤테로 접합체 동물 및 호모 접합체 동물에 관한 것이다.

본 발명자들은 상술한 상황을 감안하여, 생식 계열 키메라의 제조 방법에 대하여 예의 연구하였다. 즉, 본 발명이 해결하여야 할 과제와 목적은, 유전자 개변을 실시한 ES 세포 등의 전능성 세포를 이용하여 녹-아웃 마우스 등의 유전자 개변 동물을 효율적으로 제조하는 것이다. 특히, 생식 계열 키메라 마우스의 효율적인 제조 방법을 구축하는 것이다. 즉, 녹-아웃 마우스 등의 유전자 개변 마우스의 제조에서는, 유전자 개변한 ES 세포를 이용한 키메라 마우스를 제조할 수는 있지만, 얻어진 키메라 마우스에는 유전자 개변된 ES 세포를 생식 계열로 전파할 수 없어, 유전자 개변이 차세대로 전달되지 않는다는 문제를 지금까지의 연구자는 경험하여 왔다. 개변 유전자를 갖는 자손을 제공할 수 있는 키메라 마우스의 제조가 요구되고, 이것을 해결할 필요로 인해 박차가 가해졌다. 본 발명은 이러한 개변 유전자가 차세대로 전달되지 않는다는 문제를 해결하기 위해서 이루어진 것이다.

이 때문에 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아와 전능성 세포를 이용하여, 이 전능성 세포에서 유래하는 생식 계열 키메라 동물을 제조할 수 있는 것에 착안하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 여기서 말하는 전능성 세포란, 생식세포로 분화할 수 있는 다능성 세포, 즉 ES 세포ㆍEG 세포 등의 간세포나, 원시 생식 세포, 내부 세포 덩어리, 핵 이식 배아 등의 재구축 배아를 포함한다.

본 발명은 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아에 ES 세포 등의 전능성 세포를 도입함으로써, 이 전능성 세포에서 유래하는 생식 계열 키메라 동물을 제조하는 방법 및 ES 세포 등에 실시한 유전자 개변이 자손에게 전달되는 동물을 제공하는 것을 과제로 한다.

따라서, 본 발명자들은 본 과제를 해결하기 위해 ES 세포(배성 간세포) 등의 전능성 세포에 의한, 생식 계열 키메라 마우스를 효율적으로 제조하는 방법을 연구하였다.

또한, 본 발명에서 생식 계열 키메라란, 키메라 동물의 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 것을 의미한다. 일반적으로 ES 세포를 이용한 생식 계열 키메라 마우스는, ES 세포의 유래가 되었던 계통과 털색이 다른 계통 사이에서 키메라 마우스를 제조하고, 얻어진 키메라 마우스와 ES 세포의 유래가 되었던 계통과 털색이 다른 계통의 마우스를 교배하여, 그의 산자(産仔)를 얻고, ES 세포의 유래가 되었던 계통의 털색을 확인할 때까지는 생식 계열 키메라 마우스인지 어떤지를 확인할 수 없다. 또한, 특히 수컷성의 경우, ES 세포로부터 생식 세포가 형성되었다고 해도, 생식 세포에서 차지하는 ES 세포의 기여율이 낮은 경우에는 ES 세포의 유전자를 갖는 산자를 얻는 것은 곤란하다. 또한, ES 세포 유래의 정자수가 적은 경우나 정자의 활성이 낮은 경우에는 수정에 이르지 않아 차세대의 산자를 얻을 수 없다. 또한, 유전자 개변을 미토콘드리아에 실시하는 경우에는, 미토콘드리아가 난자 유래이기 때문에, 암컷성의 ES 세포를 사용하여 암컷성의 생식 계열 키메라 마우스를 제조해야만 한다.

정소 내 또는 난소 내에 ES 세포에서 유래하는 생식 세포만을 갖는 키메라 마우스를 얻을 수 있다면, 차세대의 산자는 확실하게 ES 세포에서 유래한 염색체를 가질 수 있고, 생식 계열 키메라 마우스를 효율적으로 제조할 수 있다. 만일 수컷성의 키메라 마우스가 얻어졌지만 얻어진 키메라 마우스의 정자의 수가 적은 경우나 정자의 활성이 낮은 경우에도, 현미 수정(ICSI) 등의 기술을 이용하여 쉽게 차세대 산자를 얻을 수 있다.

또한, 암컷성의 키메라 마우스의 경우에는 자연 교배, 인공 수정, 체외 수정 또는 현미 수정에 의해 차세대 산자를 얻을 수 있다.

본 발명은 이상의 연구에 기초하여 이루어진 것으로서, 생식 계열 키메라 동물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법에 의해 얻어지는 키메라 동물 및 상기 키메라 동물로부터 얻어지는 유전자 개변 동물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 유전적으로 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아(일반적으로 배반포)와 전능성 세포를 이용함으로써, 생식 세포가 전능성 세포에서 유래하는 키메라 동물을 제조하는 방법 및 이에 의해 얻어지는 생식 계열 키메라 동물이다. 본 발명에 있어서 유전적으로 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아는, 이종 교잡종 제1대가 생식 세포를 결실한다는 유전적 요인을 이용함으로써 제조할 수 있다. 이 생식 세포의 결실이 자웅 생식 세포 중 어디에 나타나는 가는 동물종에 따라 다르다. 예를 들면, 마우스에서는 수컷성 생식 세포가 결실한다. 즉, 실험용 마우스인 C57BL/6과 이종 마우스인 무스 스프레투스(Mus spretus)의 정역(正逆)의 교배 또는 체외 수정에 의해 얻어지는 교잡종 배아는 웅성 불임(不稔)이 된다(Matsuda Y et al., PNAS 88, 4850-4854(1991)). 또한, c-키트(c-kit) 변이 마우스의, 예를 들면 Wv/+ 마우스와 W/+ 마우스의 정역의 교배 또는 체외 수정에 의해 얻어지는 수정 배아(Wv/W 또는 W/Wv)는, 자웅 양성으로 생식 세포를 형성할 수 없기(불임/불임(不姙)) 때문에, 이 유전적 요인을 이용함으로써 자웅 각각의 생식 세포를 결실한 마우스를 제조할 수 있다(Kussell ES, Adv Genet 20, 357-459(1979)). 특히 Wv/W 또는 W/Wv 수정 배아를 이용하는 경우에는 암컷성의 ES 세포를 이용하여 암컷성의 생식 계열 키메라를 제조할 수 있다. 또한, 핵 이식 배아 또는 트랜스제닉(transgenic) 배아로서도 제조할 수 있다.

본 발명에 의해 제조되는 키메라 동물의 생식 세포는 전부 ES 세포에서 유래하기 때문에, 수컷성 키메라 동물을 교배, 인공 수정, 체외 수정 또는 현미 수정하여 ES 세포의 염색체쌍의 한쪽을 갖는 자웅의 헤테로 접합체를 얻을 수 있다. 얻어진 자웅의 헤테로 접합체를 교배하여 호모 접합체를 쉽게 얻을 수 있다.

또한, 암컷성의 유전자 개변을 실시한 ES 세포로부터 제조한 암컷성의 키메라 동물을 교배, 인공 수정, 체외 수정 또는 현미 수정하여 ES 세포의 염색체쌍의 한쪽을 갖는 자웅의 헤테로 접합체를 얻을 수 있다.

본 발명은 이하와 같은 방법과 이 방법에 의해 제조되는 키메라 동물을 제공하는 것이다.

(1) 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아와 전능성 세포를 이용하는 것을특징으로 하는, 생식 세포가 전능성 세포에서 유래하는 생식 계열 키메라 동물의 제조 방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 이종간 교잡에 의해 얻어지는 수정 배아, 핵 이식 배아 또는 트랜스제닉 배아인 제조 방법.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 전능성 세포가 배성 간세포(ES 세포) 또는 배아성 생식 세포(EG 세포)인 제조 방법.

(4) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 전능성 세포가 핵 이식 배아 또는 핵 이식 배아 유래의 배성 간세포(ES 세포) 또는 배아성 생식 세포(EG 세포)인 제조 방법.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 제조 방법.

(6) 상기 (5)에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 실험용 마우스(무스 무스쿨루스 도메스티쿠스(Mus musculus domesticus))와 그의 동포(同胞) 이종 관계에 있는 무스 스프레투스 마우스와의 정역의 교배 또는 체외 수정으로 얻어지는 수정 배아인 제조 방법

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 c-키트 변이에 의해 이루어지는 수정 배아인 제조 방법.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 키메라 동물.

(9) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 수컷성 키메라 동물.

(10) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 암컷성 키메라 동물.

(11) 상기 (8) 내지 (10) 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 키메라 동물.

(12) 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 수컷성 키메라 동물과, 원하는 계통의 암컷성 동물을 교배하거나, 또는 상기 수컷성 키메라 동물로부터 얻어진 정자를 원하는 계통의 난자에 체외 수정이나 현미 수정함으로써 얻어지는 수정 배아를 가부모에게 이식함으로써 개체를 발생시키는 것을 특징으로 하는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 제조 방법.

(13) 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 암컷성 키메라 동물과, 원하는 계통의 수컷성 동물을 교배하거나, 또는 상기 암컷성 키메라 동물로부터 얻어진 난자를 원하는 계통의 정자에 체외 수정이나 현미 수정함으로써 얻어지는 수정 배아를 가부모에게 이식함으로써 개체를 발생시키는 것을 특징으로 하는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 제조 방법.

(14) 상기 (9) 또는 (10)에 의해 얻어지는 키메라 동물의 자웅을 교배, 인공 수정, 체외 수정 또는 현미 수정함으로써 얻어지는 호모 접합체 동물의 제조 방법.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 제조 방법.

(16) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조할 수 있는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물.

(17) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조할 수 있는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 자웅을 교배함으로써 얻어지는 호모 접합체 동물.

(18) 상기 (16) 또는 (17)에 있어서, 동물이 마우스인 동물.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명의 키메라 동물은, 유전적으로 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아에 대하여 ES 세포와 같은 전능성 세포를 주입함으로써 제조한다. 얻어진 키메라 동물의 모든 생식 세포는 주입한 전능성 세포, 예를 들면 ES 세포를 이용한 경우에는 ES 세포에서 유래한다. 이하의 설명에서는, 전능성 세포의 일례로서 ES 세포를 예시하여 설명하지만, 전능성 세포를 ES 세포로 한정한 것은 아니다. 얻어진 키메라 동물의 정자 또는 난자는 전부 ES 세포에서 유래하고, 차세대의 산자에는 반드시 ES 세포에서 유래한 염색체가 전파하여, 유전자쌍의 한쪽은 ES 세포가 유전자인 헤테로 접합체가 된다.

생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아, 예를 들면 수정 배아는 유전적 요인에 의해 발생하는 생식 세포의 형성 부전을 이용함으로써 제조한다. 이 때문에, 2종의 방법을 제안할 수 있다. 즉, 마우스에서는 이종 교잡종 제1대의 수컷은 불임을 나타내기 때문에, 실험용 마우스(무스 무스쿨루스 도메스티쿠스)와 그의 동포 이종 관계에 있는 마우스를 자연 교배하여 이종 교잡 수정 배아를 얻는다. 이 때 번식 능력이 우수한 실험용 마우스의 암컷으로부터 난자를 얻는 것이 바람직하다. 즉, 실험용 마우스(무스 무스쿨루스 도메스티쿠스)의 암컷과 그의 동포 이종 관계에 있는 수컷을 자연 교배하여 이종 교잡 수정 배아를 얻는 것이 바람직하다. 특히, 3주령 내지 4주령의 약령기(若齡期) 실험용 암컷 마우스를 호르몬 처리하여 과잉 배란을 유도한 후에 교배함으로써 많은 수정 배아를 얻을 수 있다.

또한, 과잉 배란을 유도한 약령기의 실험용 암컷 마우스로부터 채취한 난자와 이종 마우스의 정자를 체외 수정하여 얻은 이종 교잡종 배아를 효율적으로 대량으로 얻을 수 있다. 실험용 마우스는 C57BL/6 등을 사용할 수 있다.

한편, 교배 상대인 이종 마우스는 무스 스프레투스나 무스 카롤리(Mus caroli), 무스 파하리(Mus pahari) 등을 사용할 수 있지만, 체외 수정에 관한 정보가 비교적 집적되어 있는 무스 스프레투스가 바람직하고, 이종 교잡종 배아를 안정적으로 얻을 수 있는 C57BL/6 암컷성 마우스와 무스 스프레투스 수컷성 마우스의 조합이 바람직하다.

또한, 제2의 방법으로서, c-키트 변이 마우스, 예를 들면 Wv/+ 마우스와 W/+ 마우스의 정역의 교배 또는 체외 수정에 의해 얻어지는 수정 배아(Wv/W 또는 W/Wv)는 생식 세포의 형성 부전이 일어난다는 것을 이용하여 제조할 수 있다. 특히, Wv/W 또는 W/Wv 수정 배아를 이용하는 경우에는 암컷성의 ES 세포를 이용하여 암컷성의 생식 계열 키메라를 제조할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 수정 배아는 전부 유전적으로 생식 세포를 형성하지 않는 수정 배아이다. 그 결과, 이 배아에 ES 세포를 주입하여 얻어진 키메라 마우스의 생식 세포에서는, 모두 ES 세포에서 유래하는 정자 또는 난자가 형성된다.

이렇게 하여 얻어진 수컷성의 키메라 마우스의 정자(생식 세포)는 ES 세포에서 유래하고, 이 키메라 마우스와 실험용 암컷 마우스를 교배하여 얻어진 산자는 ES 세포의 염색체쌍의 한쪽을 갖는 헤테로 접합체가 된다. 이와 같이 얻어지는 상기 키메라 마우스는 ES 세포 유래의 생식 계열 키메라 마우스가 된다. 또한, 얻어지는 상기 키메라 마우스의 정자수가 적은 경우나 정자의 활성이 낮은 경우에는 자연 교배에서는 수정에 이르지 않지만, 그 경우에도 정자를 채취하여 현미 수정(ICSI) 등의 기술을 이용하여 차세대 산자를 얻을 수 있다. 한편, Wv/W 수정 배아를 이용하는 경우에는 암컷성의 ES 세포를 이용하여 암컷성의 생식 계열 키메라 동물을 제조할 수 있다. 이 경우, 미토콘드리아 개변 등을 행한 유전자 개변 동물을 제조하는 경우가 유리하다.

이상 서술한 바와 같이, 본 발명은 생식 계열 키메라 동물을 효율적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 적응에 의해, 이제까지 거의 성공하지 못하였던 근교계 마우스 유래 ES 세포로부터의 녹-아웃 마우스 등의 유전자 개변 마우스를 제조할 수 있다고 예측된다. 또한, 지금까지 생식 계열 키메라를 얻을 수 없었던 ES 세포로부터도, 유전자 개변 마우스가 생길 수 있는 가능성이 있다. 또한, ES 세포로 한정되지 않고 전능성 세포라면 응용이 가능하다고 생각된다.

상기는 마우스에 의해 예시하였지만 이 조작은 모든 포유 동물로 응용할 수 있다. 예를 들면 가축 등에서는 체세포, 또는 유전자를 개변한 체세포로부터 핵 이식에 의해 클론 배아를 제조하여, 본 발명의 방법을 적용함으로써 효율적으로 생식 계열 키메라 동물을 제조하는 것이 가능해진다. 또한, 조류나 파충류, 양서류, 어류 등의 실험 동물에도 응용할 수 있다. 이 경우, 이수(異數)체 배아를 불임 배아로서 이용하는 것도 가능하다. 또한, 야생 동물에도 응용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 얻어지는 모든 생식 세포가 ES 세포에서 유래하는 키메라 동물의 차세대 산자로부터는, 염색체쌍의 한쪽이 ES 세포에서 유래하는 자웅의 헤테로 접합체 동물을 얻을 수 있고, 얻어진 자웅의 헤테로 접합체를 교배함으로써 호모 접합체 동물(호모형 유전자 개변 동물)을 제조할 수 있다.

이하의 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들은 단순히 예시일 뿐이고, 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되지 않는다.

<실시예 1>

키메라 제조에 이용하는 수정 배아의 제조

(1) 웅성의 생식 세포를 형성할 수 없는 수정 배아의 취득

3.5 주령의 무스 스프레투스형 미토콘드리아를 갖는 C57BL/6 암컷 마우스(B6-mtSPE: 복귀 교배에 의해 세포질 내의 미토콘드리아를 야생종 유래 근교계 무스 스프레투스의 그것으로 치환한 C57BL/6 마우스)의 복강에 임마 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 5 IU/0.05 ㎖/마리의 비율로 투여하고, 그의 48 시간 후에 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)을 5 IU/0.05 ㎖/마리의 비율로 투여하여 과잉 배란 유도 처리를 실시하였다. 다음으로, 과잉 배란 유도 처리를 실시한 암컷 마우스를, 성적으로 성숙한(6 주령 이상) 수컷의 야생종 유래 근교계 무스 스프레투스와 동거시켜 자연 교배시켰다. 교배 확인 후 3.5일째의 암컷 마우스의 자궁을 적출하여 M2 배지(94.7 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.71 mM CaCl₂, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgS0₄, 4.00 mM NaHCO₃, 21.0 mM HEPES, 23.3 mM 락트산 나트륨, 0.33 mM 피루브산 나트륨, 1 g/L 글루코오스, 4 g/L BSA, 100 IU/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신)에서 환류시키고, 채취한 배아를 동일한 배지로 세정하여 동포 이종 배아(배반포기 배아)를 제조하였다.

한편, 체외 수정에 의해 동포 이종 배아를 제조하는 경우에는, 상술한 방법으로 과잉 배란 유도 처리를 실시한 C57BL/6 암컷 마우스(hCG 투여 후 16 시간 후)를 경추 탈구로 안락사시켜 난관을 적출하고, 미네랄 오일로 덮은 mTYH 배지(199.37 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.71 mM CaCl₂, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgSO₄, 25.07 mM NaHCO₃, 1.00 mM 피루브산 나트륨, 4 g/L BSA, 100 IU/mK 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신) 액적의 미네랄 오일 부위에 채취한 난관을 붙였다. 다음으로, 실체 현미경 하에서 2개의 27G 주사 바늘을 이용하여 난관을 깨뜨리고, 난자를 포함하는 난구(卵丘) 세포군을 mTYH 배지 액적 내에 도입하였다. 또한, 혈액이나 조직의 혼입을 막기 위해서, 난관은 배지 내로 들어갈 수 없도록 주의하였다. 정자는 전배양을 행하기 위해서, 무스 스프레투스 수컷 마우스를 경추 탈구에 의해 안락사시켜 정소상 체미(體尾)부를 적출하고, 정소상 체미부에 부착되어 있는 혈액을 킴와이프(Kimwipe)로 닦아낸 후, 손가락으로 유지하여 가장 굵은 정관을 목표하여 23G 주사 바늘로 틈을 내어, 나온 정자 덩어리를 주사 바늘로 떠내고, 미네랄 오일로 덮은 0.3 ㎖의 mTYH 배지액 또는 mTYH 배지(199.37 mM NaCl, 4.78 mM KCl,1.71 mM CaCl₂, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgSO₄, 25.07 mM NaHCO₃, 1.00 mM 피루브산 나트륨, 1 g/L 글루코오스, 4 g/L BSA, 100 IU/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신)에 도입하여 CO₂인큐베이터 내에서 2 내지 8 시간 배양하여 전배양을 행하였다. 전배양을 끝낸 정자를 앞서 제조한 난자를 포함하는 수정용 배지(mTYH 배지)에 최종 정자 농도가 1 내지 5×10⁵개/mL가 되도록 매정(媒精)하였다. 매정한 난자를 CO₂인큐베이터 내에서 8 내지 10 시간 배양하였다. 다음으로, 난자를 발생용의 0.1 mM EDTA 첨가 M16 배지(94.59 mM NaCl, 4.78 mM KCl, 1.71 mM CaCl₂, 1.19 mM KH₂PO₄, 1.19 mM MgSO₄, 25.07 mM NaHCO₃, 23.28 mM 락트산 나트륨, 0.33 mM 피루브산 나트륨, 1 g/L 글루코오스, 4 g/L BSA, 100 IU/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신)로 세정한 후에 동일한 배지로 옮겨 실체 현미경으로 수정란을 확인한 후, CO₂인큐베이터 내에서 96 시간 배양하여 배반포기 배아를 제조하였다.

(2) 자웅 양성의 생식 세포를 형성할 수 없는 수정 배아의 취득

생식 세포 형성에 관여하는 c-키트의 변이를 갖는 W 계통 헤테로 접합체의 자웅 마우스의 교배 또는 체외 수정에 의해 Wv/W 또는 W/Wv 호모 접합체의 수정 배아의 제조를 (1)에 기재한 방법에 준하여 행하여 배반포기 배아를 제조하였다.

<실시예 2>

키메라 마우스의 제조

실시예 1에 기재한 무스 스프레투스형 미토콘드리아 DNA를 갖는 근교계C57BL/6 암컷 마우스(B6-mtSPE)의 난자와 야생종 유래 근교계 무스 스프레투스 정자의 체외 수정법으로 제조한 배반포기 배아(미토콘드리아 DNA는 무스 스프레투스형)에 대하여 통상법에 따라서 근교계 C57BL/6 유래의 ES 세포(미토콘드리아 DNA는 무스 무스쿨루스 도메스티쿠스형)를 주입하였다. 48개의 배반포기 배아를 사용하고, 1개의 배아에 대하여 5개의 ES 세포를 주입하여 48개의 주입 배아를 얻었다. 8 주령의 정관 결찰 수컷 마우스와 교배함으로써 얻은 교배 2 일째인 3 마리의 6 주령의 가부모용 CD-1암컷 마우스 자궁에 16개의 주입 배아를 이식하여 3 마리의 키메라 산자를 얻었다.

<실시예 3>

키메라 마우스 생식 세포의 계보

실시예 2에서 얻은 수컷성 키메라 마우스를 사육하여 성적으로 성숙시켰다. 털색으로 저(低)모자이크, 중(中)모자이크 및 흑색의 3종을 선발하여 정소상 체미부로부터 정자를 채취하였다. 얻어진 정자의 미토콘드리아 DNA를 PCR 해석함으로써 생식 세포의 계보를 조사하였다. 정자가 ES 세포에서 유래하는 경우에는 무스 무스쿨루스 도메스티쿠스형의 미토콘드리아 DNA가, 수정란에서 유래하는 경우에는 무스 스프레투스형의 미토콘드리아 DNA가 검출된다. 1차 및 2차 중합효소연쇄반응법(Nested-PCR법, Kaneda H et al., PNAS 92, 4542-4546(1995))의 해석 결과, 모든 마우스에서 얻어진 정자는 ES 세포에서 유래하였다. 또한, C57BL/6 마우스(B6-mtSPE)의 난자와 무스 스프레투스 정자의 체외 수정으로 얻어진 이종 교잡종 F1 웅성 마우스에서 정자를 확인할 수는 없고, 또한 C57BL/6 마우스와의 교배에서도 산자를 얻을 수 없었기 때문에 이종 교잡종 F1 웅성 마우스가 생식 세포를 형성할 수 없음을 확인하였다.

본 발명에 의해 얻어지는 키메라 동물이 만드는 생식 세포는 주입한 ES 세포에서 유래하기 때문에, 상기 키메라 동물과 원하는 계통의 동물과의 교배에 의해, 또는 상기 키메라 동물로부터 얻어진 정자와 원하는 계통의 난자로 체외 수정하여 얻어진 수정란을 가부모에게 이식함으로써 산자를 얻는 것으로, 염색체쌍의 한쪽이 ES 세포에서 유래하는 헤테로 접합체의 자웅 동물을 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 헤테로 접합체의 자웅을 교배함으로써 호모 접합체 동물을 제조할 수 있다. 통상, 여기서 사용하는 ES 세포는 미리 상동 재조합 등에 의해 원하는 유전자 개변을 실시한 ES 세포를 사용할 수 있기 때문에, 유전자 개변이 이루어진 호모 접합체 동물을 쉽게 얻을 수 있다. 또한, Wv/+ 마우스와 W/+ 마우스의 정역의 교배 또는 체외 수정에 의해 얻어지는 Wv/W 또는 W/Wv 수정 배아 등의 c-키트 변이 마우스의 수정 배아를 이용한 경우, 수컷성 뿐만 아니라 암컷성의 생식 세포도 형성할 수 없다. 이 때문에, ES 세포는 수컷성 뿐만 아니라 암컷성에서도, 얻어진 키메라 마우스의 모든 생식 세포에 주입한 ES 세포가 기여하기 때문에, 수컷성의 ES 세포로 한정되지 않고, 자웅 모든 ES 세포에서 생식 계열 키메라 동물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 제조되는 키메라 동물의 생식 세포는 모두 ES 세포에서 유래하기 때문에, 수컷성 키메라 동물을 교배 또는 체외 수정하여 ES 세포의 염색체쌍의 한쪽을 갖는 자웅의 헤테로 접합체를 얻을 수 있다. 이 얻어진 자웅의헤테로 접합체는 서로 교배하여 호모 접합체를 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 유전자 기능 해석에 매우 유용하다. 또한, 유전자 개변을 실시한 암컷성 ES 세포를 수립하여 제조한 암컷성의 키메라 동물을 교배 또는 인공 수정하여 ES 세포의 염색체쌍의 한쪽을 갖는 자웅의 헤테로 접합체를 얻을 수 있다. 이 얻어진 자웅의 헤테로 접합체를 교배함으로써 동일하게 호모 접합체를 쉽게 얻을 수 있다. 또한, 키메라 동물의 자웅을 교배함으로써 호모 접합체를 얻을 수 있다고 생각된다. 이상의 방법으로 얻어지는 유전자 개변 동물은 유전자 기능 해석에 매우 유용하다.

또한, 이러한 조작을 간편하게 행하는 것이 가능해지므로, 종래 비효율적이었던 생식 계열 키메라 동물의 제조를 효율적으로 행하는 것이 가능해진다.

Claims

생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아와 전능성 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는, 생식 세포가 전능성 세포에서 유래하는 생식 계열 키메라 동물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 이종간 교잡에 의해 얻어지는 수정 배아, 핵 이식 배아 또는 트랜스제닉 배아인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 전능성 세포가 배성 간세포(ES 세포) 또는 배아성 생식 세포(EG 세포)인 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 전능성 세포가 핵 이식 배아 또는 핵 이식 배아유래의 배성 간세포(ES 세포) 또는 배아성 생식 세포(EG 세포)인 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 제조 방법.
제5항에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 실험용 마우스(무스 무스쿨루스 도메스티쿠스(Mus musculus domesticus))와 그의 동포 이종 관계에 있는 무스 스프레투스(Mus spretus) 마우스와의 정역(正逆)의 교배 또는 체외 수정으로 얻어지는 수정 배아인 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생식 세포를 형성할 수 없는 초기 배아가 c-키트(c-kit) 변이에 의해 이루어지는 수정 배아인 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 키메라 동물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 수컷성 키메라 동물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 제조할 수 있는 생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 암컷성 키메라 동물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 키메라 동물.
생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 수컷성 키메라 동물과, 원하는 계통의 암컷성 동물을 교배하거나, 또는 상기 수컷성 키메라 동물로부터 얻어진 정자를 원하는 계통의 난자에 체외 수정이나 현미 수정함으로써 얻어지는 수정 배아를 가부모에게 이식함으로써 개체를 발생시키는 것을 특징으로 하는, 염색체쌍의한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 제조 방법.
생식 세포가 도입된 전능성 세포에서 유래하는 암컷성 키메라 동물과, 원하는 계통의 수컷성 동물을 교배하거나, 또는 상기 암컷성 키메라 동물로부터 얻어진 난자를 원하는 계통의 정자에 체외 수정이나 현미 수정함으로써 얻어지는 수정 배아를 가부모에게 이식함으로써 개체를 발생시키는 것을 특징으로 하는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 제조 방법.
제9항 또는 제10항에 의해 얻어지는 키메라 동물의 자웅을 교배, 인공 수정, 체외 수정 또는 현미 수정함으로써 얻어지는 호모 접합체 동물의 제조 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 제조 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조할 수 있는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조할 수 있는, 염색체쌍의 한쪽이 전능성 세포에서 유래하는 헤테로 접합체 동물의 자웅을 교배함으로써 얻어지는 호모 접합체 동물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 동물이 마우스인 동물.