WO2003071869A1 - Procede de construction d'animal chimere a lignee germinale - Google Patents

Procede de construction d'animal chimere a lignee germinale Download PDF

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Yasumitsu Nagao
Hiroshi Imai
Takuro Horii
Yoshikazu Totsuka
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Yasumitsu Nagao
Hiroshi Imai
Takuro Horii
Yoshikazu Totsuka
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    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine

Definitions

  • the present invention provides a method for producing a chimeric animal in which germ cells are formed by using an early embryo (generally a blastocyst) and a totipotent cell that cannot form a germ cell genetically,
  • the invention relates to chimeric animals derived from sex cells.
  • the totipotent cells mentioned here are pluripotent cells that can be divided into germ cells.
  • the present invention relates to a heterozygous animal and a homozygous animal obtained from the chimeric animal.
  • mice embryonic stem cells
  • the method of applying cells to cells can be performed using mice.
  • a technique for producing genetically modified mice such as knockout mice was established. With the completion of this technology, it has become possible to create mutants that could not be performed exclusively by yeast or Drosophila, and to use the functions of genes in mammals. It is attracting attention as one of the important technologies indispensable for functional analysis.
  • Efficient production of genetically modified animals such as knockout mice can be roughly divided into three points.
  • the first point is to establish excellent ES cells.
  • the second point is to efficiently modify genes in ES cells.
  • the third point is that the genetically modified ES cells form chimeric mice, and in the obtained chimeric mice, the genetic modification performed in the ES cells is transmitted to the germ line and transmitted to the next generation.
  • the first point is that the establishment of excellent ES cells largely depends on the strain of the mouse, and the probability of establishment is low.
  • the ES cells that have been established can be regenerated with successive passages. E was established with enormous effort to lose transmission ability to the series At present, s cells are used without repeating subculture as much as possible. This tendency is particularly remarkable when ES cells from inbred mice are used.
  • the second point is that the technology of homologous recombination and related technologies have been repeatedly improved, and are frequently used as a practical stage technology.
  • the third point has many problems. In particular, many researchers have been able to produce chimeric mice but have no transmission to the germ line, and many researchers have experienced this. The third point is a major obstacle in the production of knockout mice. For this reason, in practice, there is a track record of transmission to the germ line, and at present the method of obtaining and using ES cells that have not been repeated for as long as possible is used.
  • ES cells on the other hand, have the ability to achieve normal development in all cell lineages that make up the conceptus, but during the ontogeny process, the ES cells to be injected are injected into the fertilized embryo (generally blastocyst). In comparison, the ability to contribute to extra-embryonic cell lineages such as the placenta is considered to be low (Beddington RS & Robertson EJ, Development 105, 733-737 (1989); Nagy A et al., Development 110, 815- 821 (1990)).
  • ES cells are guided to the development and differentiation direction to embryos, and all tissues including reproductive tissues are ES cells
  • a method for obtaining a mouse derived from has been proposed.
  • a combination of mouse ES cells and mouse tetraploid embryos is considered to be most suitable. That is, tetraploid embryos alone rarely develop until after implantation, and few reach the second trimester (Kaufman MH & Webb S, Development 110, 1121-1132 (1990)).
  • tetraploid and normal embryo (diploid) chimeras In tetraploid and normal embryo (diploid) chimeras, tetraploid cells have been reported to contribute very little to the embryo itself, but to the extraembryonic membrane tissue. (Tarkowski AK, J. Embryol. Exp. Morph. 41, 47-64 (1977)). Therefore, a method has been proposed in which mouse ES cells and mouse tetraploid embryos are combined to complement each other to produce an aggregate chimera. In this case, it was reported that polar embryos derived from tetraploid cells were produced in most extraembryonic tissues, while fetuses were derived from ES cells (Nagy A et al., Development 110, 815-821 (1990)).
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing a germline chimera. That is, the problem and object to be solved by the present invention are to efficiently produce genetically modified animals such as knockout mice using totipotent cells such as genetically modified ES cells. In particular, it is to construct an efficient method for producing germ-line chimeric mice. That is, in the production of a genetically modified mouse such as a knockout mouse, a chimeric mouse using the genetically modified ES cells can be produced.
  • researchers have experienced the problem that genetic modifications cannot be transmitted to the next generation. It has been desired to create a chimeric mouse that can produce offspring having the modified gene, and it has been necessary to solve this.
  • the present invention has been made to solve the problem that such a modified gene is not transmitted to the next generation.
  • totipotent cells include pluripotent cells that can differentiate into germ cells, that is, stem cells such as ES cells and EG cells, and reconstructed embryos such as primordial germ cells, inner cell mass, and nuclear transfer embryos .
  • a totipotent cell such as an ES cell was introduced into an early embryo that could not form a germ cell, a method for producing a germ-line chimeric animal derived from this totipotent cell, and the method was applied to an ES cell and the like. It is an object to provide an animal in which the genetic modification is transmitted to offspring.
  • the present inventors studied a method for efficiently producing a germ-line chimeric mouse using totipotent cells such as ES cells (embryonic stem cells) in order to solve the present problem.
  • the germline chimera means that the germ cells of the chimeric animal are derived from the introduced totipotent cells.
  • germ-line chimeric mice using ES cells produce chimeric mice between the strains from which the ES cells were derived and the strains with different coat colors, and obtained chimeric mice and strains from which the ES cells were derived.
  • mice of different strains of different hair colors are bred and their offspring are obtained and the hair color of the strain from which the ES cells are derived is confirmed.
  • the number of sperm derived from ES cells is small or the activity of sperm is low, fertilization does not occur and the next generation of offspring cannot be obtained.
  • genetic modification is performed on mitochondria, female ES cells must be used to generate female germ-line chimeric mice, since mitochondria are derived from eggs.
  • a chimeric mouse having only ES cell-derived germ cells in the testis or ovary can be obtained, the next generation of offspring can surely have ES cell-derived chromosomes, and It can be manufactured efficiently.
  • male chimeric mice were obtained, even if the number of spermatozoa in the obtained chimeric mice is low or the activity of spermatozoa is low, it is easy to use techniques such as microinsemination (ICSI). The next generation of offspring can be obtained.
  • ICSI microinsemination
  • offspring of the next generation can be obtained by natural mating, artificial insemination, in vitro insemination, or microinsemination.
  • the present invention has been made based on the above studies, and relates to a method for producing a germ-line chimeric animal.
  • the present invention also relates to a chimeric animal obtained by the method and a genetically modified animal obtained from the chimeric animal. That is, the present invention uses a primary embryo (generally a blastocyst) that cannot genetically form germ cells and a totipotent cell to produce a chimeric animal whose germ cell is derived from a totipotent cell.
  • the early embryo that cannot genetically form germ cells according to the present invention can be produced by utilizing the genetic factor that the first generation of the hybrid hybrid lacks germ cells.
  • mice lack male germ cells. That is, hybrid embryos obtained by reverse mating of the experimental mouse C57BL / 6 with Mus spretus of the heterologous mouse or by in vitro insemination become male sterile (Matsuda Y et al., PNAS 88, 4850- 4854 (1991)).
  • fertilized embryos obtained from c-kit mutant mice, for example, by reciprocal crossing of Wv / + mice and W / + mice or by in vitro insemination, are reproductive in both sexes.
  • mice that lack both male and female germ cells (Kussell ES, Adv Genet 20, 357-459). (1979)).
  • female germline chimeras can be produced using female ES cells. It can also be produced as a nuclear transfer embryo or a transgenic embryo.
  • male chimeric animals are mated, artificially inseminated, in vitro inseminated, or microinseminated to have one of the chromosome pairs of ES cells Male and female heterozygotes can be obtained. The resulting male and female heterozygotes can be crossed to easily obtain homozygotes.
  • female chimeric animals produced from female genetically modified ES cells can be bred, artificially or in vitro fertilized, or subjected to microinsemination to male and female heterozygotes having one of the ES cell chromosome pairs. Can be obtained.
  • the present invention provides the following method and a chimeric animal produced by the method.
  • a method for producing a germ-line chimeric animal in which germ cells are derived from totipotent cells comprising using an early embryo that cannot form germ cells and a totipotent cell.
  • the totipotent cells are embryonic stem cells (ES cells) or embryonic germ cells (EG cells).
  • the totipotent cell is a nuclear transfer embryo or an embryonic stem cell (ES cell) or a embryonic germ cell (EG cell) derived from a nuclear transfer embryo.
  • ES cell embryonic stem cell
  • EG cell embryonic germ cell
  • a female chimeric animal derived from a totipotent cell introduced with a germ cell is crossed with a male animal of a desired strain, or an ovum obtained from the female chimeric animal is a sperm of a desired strain
  • a heterozygous animal wherein one of the chromosome pairs is derived from a totipotent cell which can be produced by the method according to any of (12) to (14).
  • a homozygote obtained by mating male and female heterozygous animals in which one of the chromosome pairs is derived from a totipotent cell which can be produced by the method according to any of the above (12) to (14). Zygote animal.
  • the chimeric animal of the present invention is prepared by injecting totipotent cells such as ES cells into an early embryo that cannot genetically form germ cells. All germ cells of the obtained chimeric animal are derived from the injected totipotent cells, for example, ES cells when ES cells are used. In the following description, ES cells will be described as an example of totipotent cells, but the totipotent live cells are not limited to ES cells. All the spermatozoa or eggs obtained from the chimeric animal are derived from ES cells, the chromosomes derived from ES cells are always transmitted to the next generation of offspring, and one of the gene pairs is a gene from ES cells. It becomes a terrorist zygote.
  • 'Early embryos that are unable to form germ cells, such as fertilized embryos, are produced by utilizing germ cell dysgenesis caused by genetic factors.
  • two methods can be proposed. That is, since the first male of a crossbreed in a mouse shows sterility, an experimental mouse (Mus musculus domesticus) and a mouse in a sib-heterologous relationship are naturally mated to obtain a cross-fertilized embryo. At this time, it is preferable to obtain eggs from females of experimental mice having excellent reproductive ability. That is, it is desirable to obtain a cross-fertilized embryo by naturally mating a female of an experimental mouse (Mus musculus domesticus) with a male having a sibling heterogeneity. In particular, a large number of fertilized embryos can be obtained by breeding 3 to 4-week-old young mouse for experimental use after hormone treatment to induce superovulation.
  • mice such as C57BL / 6 can be used.
  • Mus spretus Mus caroli, Mus adjuvanti, etc. can be used as the heterozygous mouse that is a mating partner, but the information on in vitro insemination is relatively accumulated.
  • etus is preferable, and a combination of a C57BL / 6 female mouse and a Mus spretus male mouse capable of stably obtaining an inbred hybrid embryo is preferable.
  • a C-kit mutant mouse for example, a fertilized embryo (Wv / W or W / Wv) obtained by forward / reverse crossing of Wv / + mouse and W / + mouse or in vitro insemination is It can be produced using the fact that germ cell dysplasia occurs.
  • Wv / W or W / Wv fertilized embryos female ES cells can be used to produce female germline kimera.
  • the fertilized embryos thus obtained are all fertilized embryos that do not genetically form germ cells.
  • germ cells of chimeric mice obtained by injecting ES cells into the embryo sperm or eggs derived from all ES cells are formed.
  • the spermatozoa (germ cells) of the male chimeric mouse thus obtained are derived from ES cells, and the offspring obtained by mating this chimeric mouse with an experimental female mouse are heterozygous having one of the ES cell chromosome pairs. Be a body.
  • the thus obtained chimeric mouse is a germline chimeric mouse derived from ES cells.
  • spermatozoa are collected and micro-fertilization (ICSI
  • the next generation of offspring can be obtained using techniques such as).
  • female germ-line chimeric animals can be produced using female ES cells. In this case, it is advantageous to produce a genetically modified animal that has undergone mitochondrial modification or the like.
  • the present invention can efficiently produce a germ-line chimeric animal.
  • genetically modified mice such as knockout mice derived from ES cells derived from inbred mice, which have hardly been successful until now, can be produced.
  • ES cells from which germline chimeras could not be obtained so far may have genetically modified mice.
  • a germ-line chimeric animal can be efficiently produced by producing a cloned embryo from a somatic cell or a somatic cell in which a gene has been modified by nuclear transfer and applying the method of the present invention.
  • a germ-line chimeric animal can be efficiently produced by producing a cloned embryo from a somatic cell or a somatic cell in which a gene has been modified by nuclear transfer and applying the method of the present invention.
  • Becomes Birds, reptiles and amphibians It can also be applied to laboratory animals such as fish and fish.
  • aneuploid embryos can be used as sterile embryos. It can also be applied to wildlife.
  • next-generation offspring of a chimeric animal in which all germ cells obtained from the present invention are derived from ES cells male and female heterozygous animals in which one of the chromosome pairs is derived from ES cells can be obtained. By mating the obtained male and female heterozygotes, homozygous animals (homotype-modified animals) can be produced.
  • a fallopian tube was attached to the mineral oil site of the droplet.
  • the oviduct was broken using two 27G injection needles under a stereomicroscope, and the cumulus cell group including the ovum was introduced into the mTYH medium droplet. In order to prevent blood and tissue contamination, care was taken not to put the fallopian tube in the culture medium.
  • spermatozoa are euthanized by dislocation of the cervical vertebrae, and the epididymis is excised.
  • the blood attached to the epididymis is wiped off with a Kimwipe and then held with fingers.
  • the sperm mass that came out was scored with a 23G injection needle at the thickest vas deferens, scraped with an ait needle, and covered with mineral oil in 0.3 ml of mTYH medium or mTYH medium (199.37 mM NaCl).
  • 4. 78mM KC1 1. 7 ImM CaC 12, 1. 19mM KH 2 P0 4, 1. 19mM MgS0 4, 25. 07mM NaHC0 3, l.
  • EDTA added M16 medium (94. 59niM NaCl, 4. 78raM KC1 , 1. 71mM CaC 12, 1. 19mM KH 2 P0 4,
  • Blastocyst stage prepared by in vitro fertilization of eggs of inbred C57BL / 6 female mice (B6-mtSPE) having the Mus spretus-type mitochondrial DNA and wild-type inbred Mus spretus spermatozoa described in Example 1.
  • Embryos mitochondrial DNA and wild-type inbred Mus spretus spermatozoa described in Example 1.
  • Embryos (mitochondrial DNA is Mus spretus type) are processed according to standard methods.
  • ES cells derived from the inbred C57BL / 6 mitochondrial DNA was Mus musculus domesticus type
  • 5 embryonic stem cells were injected per embryo to obtain 48 injected embryos.
  • mice obtained in Example 2 were bred to sexual maturity. Three types of coats, low mosaic, medium mosaic and black, were selected and sperm were collected from the epididymis. Germ lineage was examined by PCR analysis of the mitochondrial DNA of the obtained sperm. When sperm is derived from ES cells, mitochondrial DNA of Mus musculus domesticus type is detected, and when sperm is derived from fertilized egg, mitochondrial DNA of Mus spretus type is detected. As a result of analysis by the nested-PCR method (Kaneda H et al., PNAS 92, 4542-4546 (1995)), spermatozoa obtained in all mice were derived from ES cells.
  • spermatozoa could not be confirmed in crossbred F1 male mice obtained by in vitro insemination of eggs of C57BL / 6 mice (B6-mtSPE) and Mus spretus spermatozoa, and crossing with C57BL / 6 mice
  • B6-mtSPE C57BL / 6 mice
  • Mus spretus spermatozoa Mus spretus spermatozoa
  • the chimeric animal obtained by the present invention Since the germ cells produced by the chimeric animal obtained by the present invention are derived from the injected ES cells, the chimeric animal is crossed with an animal of a desired strain, or the sperm obtained from the chimeric animal is By transferring a fertilized egg obtained by in vitro insemination with an egg of the same strain to a foster parent and obtaining a litter, heterozygous male and female animals in which one of the chromosome pairs is derived from ES cells can be obtained. Homozygous animals can be produced by mating the sexes of the heterozygotes thus obtained.
  • the ES cells used here can be ES cells that have been subjected to the desired genetic modification by homologous recombination or the like, so that homozygous animals with the genetic modification can be easily obtained. it can.
  • reciprocal mating or in vitro fertilization of Wv / + and W / + mice When a fertilized embryo of a C-kit mutant mouse such as a Wv / W or W / Wv fertilized embryo obtained by the above method is used, not only male but also female germ cells cannot be formed. Therefore, regardless of whether the ES cells are male or female, the ES cells injected into all the germ cells of the obtained chimeric mice contribute, and are not limited to male ES cells. Germline chimeric animals can also be produced using the ES cells.
  • male or female chimeric animals can be bred or in vitro fertilized to obtain male and female heterozygotes having one of the ES cell chromosome pairs. Can be.
  • the obtained male and female heterozygotes can be easily crossed to each other to obtain a homozygote, which is extremely useful for gene function analysis.
  • a female chimeric animal prepared by establishing a genetically modified female ES cell can be bred or artificially inseminated to obtain a male-female heterozygote having one of the chromosome pairs of the ES cell.
  • homozygotes can be easily obtained in the same manner. It is also considered that homozygotes can be obtained by crossing male and female chimeric animals. Genetically modified animals obtained by the above method are extremely useful for gene function analysis.
  • Such operations can be easily performed, and germ-line chimeric animals that have been inefficient in the past can be efficiently produced.

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Description

生殖系列キメラ動物の作製方法 隱分野]
本発明は、 遺伝的に生殖細胞を形成できない初期胚 （一般に胚盤胞） と全能性 細胞を用いることにより、 生殖細胞が形成されたキメラ動物の作製方法、 および 得られる個体の生殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物に関する。 ここで言 う全能性細胞とは生殖細胞に分ィ匕しうる多能性細胞である。 更に、 該キメラ動物 から得られるヘテロ接合体動物およびホモ接合体動物に関する。
[背景技術]
発生工学技術の進歩により確立された胚性幹細胞 (ES細胞） を受精胚に戻し て個体に発生させる手法 (Evans MJ & Kaufman MK, Nature 292, 154-156 (1981 ) )と相同組換えを ES細胞に施すという手法 （Zi jlstra M et al. , ature 342, 435-438 (1989) ; Thompson S et al.， Cell 56, 313-321 (1989) )を糸且み合わせ ることがマウスを用いて最初に行われ、 ノックァゥトマウスなどの遺伝子改変マ ゥスの作製技術が確立された。 この技術の完成により、 これまでは専ら酵母やシ ョウジョゥバエでしカ行えなかった変異体を作り、 遺伝子の機能を採るというこ とが哺乳動物でも行うことができるようになり、 ポストゲノム時代の遺伝子機能 解析に不可欠な重要な技術の 1つとして注目されている。
ノックアウトマウスなどの遺伝子改変動物を効率よく作製するには大きく分け て 3つのポイントがある。 第 1点は優良な ES細胞を樹立すること。 第 2点は ES 細胞において遺伝子改変を効率よく行うこと。 第 3点は遺伝子改変された ES細 胞がキメラマウスを形成し、 得られたキメラマウスにおいて ES細胞で行った遺 伝子改変が生殖系列に伝播され次世代に伝達されることにある。
これまでの技術開発のなかで、 第 1点の優良な ES細胞の樹立はマウスの系統 に大きく依存し、 樹立の確率が低いことに加え、 樹立できた ES細胞は継代を重 ねるに従い生殖系列への伝播能を失うため、 莫大な労力をつぎ込んで樹立した E s細胞も、 出来る限り、 継代を繰り返さずに使用しているのが現状である。 特に、 近交系マウスの ES細胞を用いる場合はその傾向が著しい。
第 2点は相同組換え技術およびそれに関連する技術の改善が繰り返され、 実用 段階の技術として頻繁に利用されている。
第 3点には問題点が多い。 特に、 キメラマウスは作製できたが生殖系列への伝 播がないという苦レ、経験を多くの研究者がしており、 ノックアウトマウスの作製 においてはこの第 3点が大きな壁となっている。 このため、 実際には、 生殖系列 への伝播実績があり、 出来る限り継代を重ねてレ、ない ES細胞を入手して使用す る方法が取られているのが現状である。
一方、 ES細胞は受胎産物を構成する全ての細胞系譜において正常な発達を遂 げる能力を有するが、 個体発生の過程において、 注入する ES細胞が注入される 受精胚 （一般に胚盤胞） に比べて胎盤などの胚外の細胞系譜に寄与する能力が低 レヽと考えられている（Beddington R S & Robertson E J, Development 105, 733 - 737 (1989) ； Nagy A et al. , Development 110, 815-821 (1990) )。 そこで、 ES 細胞と発生分化の方向が主に胚外の胎盤へ偏りがある胚とを組み合わせることで、 ES細胞を胚への発生分化の方向に導き、 生殖組織を含む全ての組織が ES細胞に 由来するマウスを得る手法が提案されている。 この場合には、 マウスの ES細胞 とマウスの 4倍体胚との組み合わせが最も適すると考えられている。 すなわち、 4倍体胚単独では着床後まで発生することは少なく、 妊娠中期に至るものはほと んどない（Kaufman M H & Webb S， Development 110, 1121-1132 (1990))。 4倍 体 と正常な胚 （2倍体） とのキメラでは、 4倍体細胞は胚自体にはほとんど寄 与しない反面、 胚外の膜組織へはかなり広範に寄与することが報告されている（T arkowski A K, J. Embryol. Exp. Morph. 41, 47—64 (1977) )。 そこで、 マウス E S細胞とマウス 4倍体胚を組み合わせることで互いに補足し合って会合体キメラ を作製する方法が提案されている。 この場合には、 胎仔は ES細胞に由来するの に対し、 大部分の胚外組織は 4倍体細胞に由来する極性のあるキメラが作製され ることが報告された （Nagy A et al. , Development 110, 815-821 (1990) ) 。 し かし、 この手法により、 近交系マウスの ES細胞よりキメラ個体を取得できた例 は極めて稀であり、 得られた場合もキメラマウスは呼吸障害や奇形などの障害を 発症して長くは生存できず （Eggan K et al. , PNAS 98, 6209-6214 (2001))、 生 殖系列キメラの実用的な作製方法とすることは困難である。
このため、 遺伝子改変されたキメラ個体を形成し、 得られたキメラ個体におけ る ES細胞に由来する遺伝子改変が生殖系列に伝播された次世代の個体を効率よ く作製する技術の開発が切望されている。
[発明の開示]
本発明者らは、 上述の状況を鑑み、 生殖系列キメラの作製方法について鋭意研 究を行った。 すなわち、 本発明が解決すべき課題と目的は、 遺伝子改変を施した ES細胞等の全能性細胞を用いてノックァゥトマウス等の遺伝子改変動物を効率 よく作製することにある。 とりわけ生殖系列キメラマウスの効率的な作製方法を 構築することにある。 すなわち、 ノックアウトマウス等の遺伝子改変マウスの作 製においては、 遺伝子改変した ES細胞を用いたキメラマウスを作製することは できるが、 得られたキメラマウスには、 遺伝子改変された ES細胞を生殖系列に 伝播できず、 遺伝子改変が次世代に伝達されないという問題をこれまでの研究者 は経験してきた。 改変遺伝子を持った子孫が出来るキメラマウスの作製が望まれ、 これを解決する必要に迫られていた。 本発明は、 このような改変遺伝子が次世代 に伝達されないという問題を解決するためになされたものである。
.このため生殖細胞を形成することができない初期胚と全能性細胞を用い、 この 全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物を作製すればよいことに想到し、 本発 明の完成に到ったものである。 ここでいう全能性細胞とは、 生殖細胞に分化しう る多能性細胞、 すなわち ES細胞 · EG細胞などの幹細胞や、 始原生殖細胞、 内部 細胞塊、 核移植胚などの再構築胚を含む。
本発明は生殖細胞を形成することができな ヽ初期胚に ES細胞などの全能性細 胞を導入し、 この全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法及ぴ ES 細胞などに施した遺伝子改変が子孫に伝達される動物を提供することを課題とす る。
そこで本発明者らは、 本課題を解決するために ES細胞 （胚性幹細胞） などの 全能性細胞による、 生殖系列キメラマウスを効率的に作製する方法を検討した。 なお、 本発明において生殖系列キメラとは、 キメラ動物の生殖細胞が導入した 全能性細胞に由来していることを意味する。 一般に ES細胞を用いた生殖系列キ メラマウスは、 ES細胞の由来となった系統と毛色の異なる系統との間でキメラ マウスを作製し、 得られたキメラマウスと ES細胞の由来となった系統と毛色の 異なる系統のマウスを交配して、 その産仔を得て、 ES細胞の由来となった系統 の毛色を確認するまでは生殖系列キメラマウスであるかどうかを確認することが できない。 また、 特に雄性の場合、 ES細胞から生殖細胞が形成されていたとし ても、 生殖細胞に占める ES細胞の寄与率が低い場合には ES細胞の遺伝子を有す る産仔を得ることは困難である。 また、 ES細胞由来の精子数が少ない場合や精 子の活性が低い場合には受精に至らず次世代の産仔を得ることはできない。 更に、 遺伝子改変をミトコンドリァに施す場合には、 ミトコンドリァが卵子由来である ため、 雌性の ES細胞を使用して雌性の生殖系列キメラマウスを作製しなければ ならない。
精巣内又は卵巣内に、 ES細胞に由来する生殖細胞だけを有するキメラマウス を得ることができれば、 次世代の産仔は確実に ES細胞に由来した染色体を持つ ことができ、 生殖系列キメラマウスを効率よく作製することができる。 仮に、 雄 性のキメラマウスが得られたが、 得られたキメラマウスの精子の数が少ない場合 や、 精子の活性が低い場合であっても、 顕微受精 (ICSI)などの技術を用いて容易 に次世代産仔を得ることができる。
尚、 雌性のキメラマウスの場合には、 自然交配、 人工授精、 体外授精、 或は顕 微受精により次世代産仔を取得することができる。
本発明は以上の検討に基づいてなされたもので、 生殖系列キメラ動物の作製方 法に関する。 また、 該方法により得られるキメラ動物及ぴ該キメラ動物から得ら れる遺伝子改変動物に関する。 すなわち、 本発明は、 遺伝的に生殖細胞を形成す ることができない初期胚 （一般に胚盤胞） と、 全能性細胞とを用いることで、 生 殖細胞が全能性細胞に由来するキメラ動物を作製する方法およびそれにより得ら れる生殖系列キメラ動物である。 本発明における遺伝的に生殖細胞を形成するこ とができない初期胚は、 異種交雑種第 1代が生殖細胞を欠失するという遺伝的要 因を利用することで作製することができる。 この生殖細胞の欠失が雌雄生殖細胞 のいずれに現れるかは動物種により異なる。 例えば、 マウスでは雄性生殖細胞が 欠失する。 即ち、 実験用マウスの C57BL/6と異種マウスの Mus spretusとの正逆 の交配、 或は体外授精により得られる交雑種胚は雄性不稔となる（Matsuda Y et al.， PNAS 88， 4850-4854 (1991))。 また、 c- kit変異マウスの、 例えば Wv/+マ ウスと W/+マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚 (Wv/W又は W/Wv) は、 雌雄両性で生殖細胞を形成することができない （不稳 Z不妊） ので、 この遺伝的要因を利用することで雌雄それぞれの生殖細胞を欠いたマウスを作製 することができる （Kussell ES, Adv Genet 20, 357-459 (1979) ) 。 特に、 Wv/W 又は W/Wv受精胚を用いる場合は雌性の ES細胞を用いて雌性の生殖系列キメラを 作製することができる。 また、 核移植胚またはトランスジエニック胚としても作 製することができる。
本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全て ES細胞に由来するため、 雄性キメラ動物を交配、 人工授精、 体外授精、 或は顕微受精して、 ES細胞の染 色体対の一方を持つ雌雄のへテロ接合体を得ることができる。 得られた雌雄のへ テロ接合体を交配してホモ接合体を容易に得ることができる。
更に、 雌性の遺伝子改変を施した ES細胞から作製した雌性のキメラ動物を交 配、 人工授精、 体外授精、 或は顕微受精して ES細胞の染色体対の一方を持つ雌 雄のへテロ接合体を得ることができる。
本発明は以下のような方法とその方法によって作製されるキメラ動物を提供する ものである。
( 1 ) 生殖細胞を形成することができない初期胚と、 全能性細胞を用いること を特徴とする、 生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
( 2 ) 生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる 受精胚、 核移植胚、 またはトランスジエニック胚である前記 (1)の作製方法。
( 3 ) 全能性細胞が胚性幹細胞 （ES細胞） 又は胚性生殖細胞 （EG細胞） であ る前記 (1)又は (2)の作製方法。
( 4 ) 全能性細胞が核移植胚ぁるいは核移植胚由来の胚性幹細胞 (ES細胞)又 は胚性生殖細胞 (EG細胞)である前記 (1)又は (2)の作製方法。
( 5 ) 動物がマウスである前記 (1)乃至 (4)のいずれかの作製方法。 ( 6 ) 生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マゥス （Mus muscul us domesticus)とその同胞異種関係にある Mus spretusのマウスとの正逆の交酉己 或は体外授精で得られる受精胚である前記 (5)の作製方法。
( 7 ) 生殖細胞を形成することができない初期胚が c - kit変異によりなされる 受精胚である前記 (1)乃至 (5)のいずれかの作製方法。
( 8 ) 前記 (1)乃至 (7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖 細胞が、 導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
( 9 ) 前記 (1)乃至 (7)のいずれかの作製方法により作製することができる生殖 細胞が、 導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
( 1 0 ) 前記 (1)乃至 (7)のいずれかの作製方法により作製することができる生 殖細胞が、 導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
( 1 1 ) 動物がマウスである前記 (8)乃至 (10)のいずれかのキメラ動物。
( 1 2 ) 生殖細胞が、 導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、 所望 する系統の雌性動物とを交配する力、 又は、 前記雄性キメラ動物から得られた精 子を、 所望する系統の卵子に体外授精または顕微受精することにより得られる受 精胚を仮親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、 染色体 対の一方が全能性細胞に由来するへテ口接合体動物の作製方法。
( 1 3 ) 生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、 所望す る系統の雄性動物とを交配するか、 又は、 前記雌性キメラ動物から得られた卵子 を所望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮 親に移植することによって個体を発生させることを特徴とする、 染色体対の一方 が全能性細胞に由来するへテロ接合体動物の作製方法。
( 1 4 ) 前記 (9)および (10)により得られるキメラ動物の雌雄を交配、 人工授 精、 体外授精、 或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
( 1 5 ) 動物がマウスである前記 (12)乃至（14)のいずれかの作製方法。
( 1 6 ) 前記 (12)乃至（14)のいずれかの方法で作製することができる、 染色体 対の一方が全能性細胞に由来するへテロ接合体動物。 ( 1 7 ) 前記 (12)乃至 (14)のいずれかの方法で作製することができる、 染色体 対の一方が全能性細胞に由来するへテロ接合体動物の雌雄を交配することにより 得られるホモ接合体動物。
( 1 8 ) 動物がマウスである前記 (16)又は（17)の動物。
[発明を実施するための最良の形態]
本発明のキメラ動物は、 遺伝的に生殖細胞を形成することができない初期胚に 対して ES細胞のような全能性細胞を注入することで作製する。 得られたキメラ 動物の全ての生殖細胞は注入した全能性細胞、 例えば ES細胞を用いた場合には、 ES細胞に由来する。 以下の説明においては、 全能性細胞の一例として ES細胞を 例示して説明するが、 全能†生細胞を ES細胞に限つたものではない。 得られたキ メラ動物の精子、 又は卵子は全て ES細胞に由来し、 次世代の産仔には必ず ES細 胞に由来した染色体が伝播し、 遺伝子対の一方は ES細胞の遺伝子であるへテロ 接合体となる。
'生殖細胞を形成することができない初期胚、 例えば受精胚は遺伝的要因により 起こる生殖細胞の形成不全を利用することで作製する。 このためには、 2種の方 法を提案することができる。 すなわち、 マウスでは異種交雑種第 1代の雄は不稔 を示すことから、 実験用マウス （Mus musculus domesticus) とその同胞異種関 係にあるマウスを自然交配して異種交雑受精胚を得る。 このとき繁殖能力に優れ た実験用マウスの雌から卵子を得る方が好ましい。 すなわち、 実験用マウス （Mu s musculus domesticus)の雌とその同胞異種関係にある雄を自然交配して異種交 雑受精胚を得ることが望ましい。 特に、 3週齢から 4週齢の若齢期実験用雌マウ スをホルモン処理して過剰排卵を誘起した後に交配することで多くの受精胚を得 ることができる。
更に、 過剰排卵を誘起した若齢期の実験用雌マウスから採取した卵子と異種マ ウスの精子を体外授精して得た異種交雑種胚を効率よく大量に得ることができる。 実験用マウスは C57BL/6などが使用できる。
—方、 交酉己相手である異種マウスは Mus spretusや Mus caroli、 Mus pahari 等が使用できるが、 体外授精に関する情報が比較的集積されてきている Mus spr etusが好ましく、 異種交雑種胚を安定して得ることができる C57BL/6雌性マウスと Mus spretus雄性マゥスの組み合わせが好ましい。
更に、 第 2の方法として、 C- kit変異マウス、 例えば、 Wv/+マウスと W/+ マウスとの正逆の交配或は体外授精により得られる受精胚 (Wv/W又は W/Wv) は 生殖細胞の形成不全が起こるということを利用して作製することができる。 特に、 Wv/W又は W/Wv受精胚を用いる場合は雌性の ES細胞を用いて雌性の生殖系列キ メラを作製することができる。
このようにして得られた受精胚はすべて遺伝的に生殖細胞を形成しない受精胚 である。 その結果、 この胚に ES細胞を注入して得られたキメラマウスの生殖細 胞では、 全て ES細胞に由来する精子又は卵子が形成される。
かくして得られた雄性のキメラマウスの精子 （生殖細胞） は ES細胞に由来し、 このキメラマウスと実験用雌マゥスを交配して得られた産仔は ES細胞の染色体 対の一方を持つヘテロ接合体となる。 このように得られる該キメラマウスは ES 細胞由来の生殖系列キメラマウスとなる。 更に、 得られる該キメラマウスの精子 数が少ない場合や精子の活性が低レ、場合には自然交配では受精に至らなレ、が、 そ の場合にも、 精子を採取して顕微受精 （ICSI) などの技術を用いて次世代産仔を 得ることができる。 一方、 Wv/W受精胚を用いる場合は雌性の ES細胞を用いて雌 性の生殖系列キメラ動物を作製することができる。 この場合、 ミトコンドリア改 変等を行った遺伝子改変動物を作製する場合は有利である。
以上述べたとおり、 本発明は生殖系列キメラ動物を効率よく作製することがで きる。 本発明の適応によって、 これまでほとんど成功していない近交系マウス由 来 ES細胞からのノックアウトマウスなどの遺伝子改変マゥスが作製できると予 測される。 また、 これまで生殖系列キメラを得ることができなかった ES細胞か らも、 遺伝子改変マウスができる可能性がある。 また ES細胞に限らず全能性細 胞ならば応用が可能であると考えられる。
上記はマウスによつて例示したがこの操作はすべての哺乳動物に応用すること ができる。 例えば家畜などにおいては、 体細胞、 或は遺伝子を改変した体細胞か ら核移植によりクローン胚を作製し、 本発明の方法を適用することによって効率 的に生殖系列キメラ動物を作製することが可能となる。 また鳥類や爬虫類、 両生 類、 魚類などの実験動物にも応用することができる。 この場合異数体胚を不妊胚 として用いることも可能である。 さらに、 野生動物にも応用することもできる。 さらに、 本発明により得られる全ての生殖細胞が ES細胞に由来するキメラ動 物の次世代産仔からは、 染色体対の一方が ES細胞に由来する雌雄のへテロ接合 体動物を得ることができ、 得られた雌雄のへテロ接合体を交配することでホモ接 合体動物 （ホモ型遺伝子改変動物） を作製することができる。
[実施例]
以下の実施例をもって本発明を詳細に説明するが、 これらは単に例示するのみ であり、 本発明はこれらによつて何ら限定されるものではなレ、。
実施例 1
キメラ作製に用いる受精胚の調製
( 1 ) 雄性の生殖細胞を形成することができなレ、受精胚の取得
3. 5週齢の Mus spretus型ミトコンドリアを持つ C57BL/6雌マゥス （B6_mtSPE
：戻し交配により細胞質内のミトコンドリァを野生種由来近交系 Mus spretusの それに置換した C57BL/6マウス） の腹腔に妊馬血清性腺刺激ホルモン （PMSG) を 5IU/0. 05ml/匹の割合で投与し、 その 48時間後に絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG) を 5IU/0. 05ml/匹の割合で投与して過剰排卵誘起処理を施した。 次に過剰排卵誘 起処理を施した雌マウスと、 性成熟した （6週齢以上） 雄の野生種由来近交系 M us spretusと同居させて自然交配させた。 交配確認後 3. 5日目の雌マウスの子 宫を摘出して、 M2培地 （94. 7mM NaCl, 4. 78raM KC1, 1. 71mM CaC12, 1. 19mM KH2P04,
1. 19mM MgS04, 4. OOmM NaHC03, 21. OmM HEPES, 23. 3mM乳酸ナトリウム， 0. 3 3mM ピルビン酸ナトリゥム， 1 g/L グルコース， 4 g/L BSA, 100 IU/mLぺニ シリン， 50 /z g/mL ストレプトマイシン） で還流して採取した胚を同培地で洗浄 して同胞異種胚 （胚盤胞期胚） を調製した。
一方、 体外授精により同胞異種胚を調製する場合は、 前述の方法で過剰排卵誘 起処理を施した C57BL/6雌マウス （hCG投与後 16時間後） を頸椎脱臼で安楽死 させて卵管を摘出し、 ミネラルオイルで覆つた mTYH培地 （199. 37mM NaCl, . 78 mM KC1, 1. 71mM CaC12, 1. 19mM KH2P04, 1. 19mM MgS04, 25. 07mM NaHC03, 1. OOmM ピルビン酸ナトリウム， 4 g/L BSA, 100 IU/mL ぺニシリン， 50 ^ g/mL スト レプトマイシン） 液滴のミネラルオイル部位に採取した卵管をつけた。 次に、 実 体顕微鏡下で 2本の 27G注射針を用いて卵管を破り、 卵子を含む卵丘細胞群を m TYH培地液滴内に導入した。 尚、 血液や組織の混入を防ぐため、 卵管は培地内に 入れないように注意した。 精子は前培養を行うため、 Mus spretus雄マウスを頸 椎脱臼により安楽死させて精巣上体尾部を摘出し、 精巣上体尾部に付着している 血液をキムワイプでふき取った後、 指で保持して最も太い精管をめがけて 23G注 射針で切れ目を入れ、 出てきた精子塊を、 ait針ですくい取り、 ミネラルオイルで 覆つた 0. 3mlの mTYH培地液または mTYH培地 （199. 37mM NaCl, 4. 78mM KC1, 1. 7 ImM CaC12, 1. 19mM KH2P04, 1. 19mM MgS04, 25. 07mM NaHC03, l. OOmM ピルビン酸ナ トリウム， 1 g/L グ/レコース， 4 g/L BSA, 100 IU/raL ぺニシリン， 50 u g/ aL ストレプトマイシン） に導入して C02インキュベーター内で 2〜 8時間培養して 前培養を行った。 前培養を終えた精子を先に調製した卵子を含む受精用培地 (mTY H培地）に最終精子濃度が 1〜5 X 105個/ mLになるように媒精した。 媒精した卵子 を C02インキュベーター内で 8〜： 10時間培養した。 次に、 卵子を発生用の 0. ImM
EDTA添加 M16培地 （94. 59niM NaCl， 4. 78raM KC1, 1. 71mM CaC12, 1. 19mM KH2P04,
1. 19mM MgS04, 25. 07mM NaHC03, 23. 28mM乳酸ナトリウム， 0. 33raM ピルビン酸 ナトリゥム， 1 g/L グルコース， 4 g/L BSA, 100 IU/mL ぺニシリン， 50 g/mL ストレプトマイシン)で洗浄後に同培地に移し、 実体顕微鏡で受精卵を確認した 後、 C02インキュベーター内で 96時間培養し、 胚盤胞期胚を調製した。
( 2 ) 雌雄両性の生殖細胞を形成することができない受精胚の取得
生殖細胞形成に関与する C- kitの変異を持つ W系統へテロ接合体の雌雄マウス の交配又は体外授精によって Wv/W或は W/Wvホモ接合体の受精胚の作製を（1)に記 載した方法に準じて胚盤胞期胚を調製した。
実施例 2
キメラマウスの作製
実施例 1に記載した Mus spretus型ミトコンドリア DNAを持つ近交系 C57BL/6 雌マウス (B6-mtSPE)の卵子と野生種由来近交系 Mus spretus精子の体外授精法で調 製した胚盤胞期胚（ミ トコンドリア DNAは Mus spretus型）に対して常法に従レ、近 交系 C57BL/6由来の ES細胞（ミトコンドリア DNAは Mus musculus domesticus型 )を注入した。 48個の胚盤胞期胚を使用して、 1個の胚に対して 5個の ES細胞を 注入し、 48個の注入胚を得た。 8週齢の精管結紮雄マウスと交配することで得た 交配 2日目の 3匹の 6週齢の仮親用 CD- 1雌マウス子宮に 16個の注入胚を移植し、 3匹のキメラ産仔を得た。
実施例 3
キメラマウス生殖細胞の系譜
実施例 2で得た雄性キメラマウスを飼育して性成熟させた。 毛色で低モザイク、 中モザイク及び黒色の 3種を選抜し、 精巣上体尾部より精子を採取した。 得られ た精子のミトコンドリア DNAを PCR解析することで、 生殖細胞の系譜を調べた。 精子が ES細胞に由来する場合は Mus musculus domesticus型のミトコンドリア DNAが、 受精卵に由来する場合は Mus spretus型のミトコンドリア DNAが検出さ れる。 Nested- PCR法 (Kaneda H et al. , PNAS 92, 4542-4546 (1995) )の解析の結 果、 いずれのマウスにおいても得られた精子は ES細胞に由来した。 尚、 C57BL/6 マウス（B6- mtSPE)の卵子と Mus spretus精子の体外授精で得られた異種交雑種 F 1雄性マウスにおいて精子を確認することは出来ず、 また、 C57BL/6マウスとの 交配でも産仔を得ることができなかつたことから、 異種交雑種 F1雄性マウスが 生殖細胞を形成できないことを確認した。
[産業上の利用の可能性]
本発明により得られるキメラ動物の作る生殖細胞は注入した ES細胞に由来す るため、 該キメラ動物と所望する系統の動物との交配により、 或は、 該キメラ動 物から得られた精子と所望する系統の卵子で体外授精して得られた受精卵を仮親 に移植することにより産仔を得ることで、 染色体対の一方が ES細胞に由来する ヘテロ接合体の雌雄動物を得ることができる。 こうして得られたヘテロ接合体の 雌雄を交配することでホモ接合体動物を作製することができる。 通常、 ここで使 用する ES細胞は、 予め相同組換えなどにより所望する遺伝子改変を施した ES細 胞を使用することができるため、 遺伝子改変がなされたホモ接合体動物を容易に 得ることができる。 更に、 Wv/+マウスと W/+マウスの正逆の交配或は体外授精 により得られる Wv/W又は W/Wv受精胚などの C- kit変異マウスの受精胚を用いた 場合、 雄性のみらならず雌性の生殖細胞も形成することができない。 このため E S細胞は雄性のみならず雌性であっても、 得られたキメラマウスの全ての生殖細 胞に注入した ES細胞が寄与するため、 雄性の ES細胞に限定されることなく、 雌 雄いずれの ES細胞でも生殖系列キメラ動物を作製することができる。
また本発明により作製されるキメラ動物の生殖細胞は全て ES細胞に由来する ため、 雄性キメラ動物を交配或は体外授精して ES細胞の染色体対の一方を持つ 雌雄のへテロ接合体を得ることができる。 この得られた雌雄のへテロ接合体は、 相互に交配してホモ接合体を容易に得ることができるため、 遺伝子機能解析に極 めて有用である。 更に、 遺伝子改変を施した雌性 ES細胞を榭立して作製した雌 性のキメラ動物を交配或は人工授精して ES細胞の染色体対の一方を持つ雌雄の ヘテロ接合体を得ることができる。 この得られた雌雄のへテロ接合体を交配する ことで同様にホモ接合体を容易に得ることができる。 また、 キメラ動物の雌雄を 交配することでホモ接合体を得ることもできると考えられる。 以上の方法で得ら れる遺伝子改変動物は、 遺伝子機能解析に極めて有用である。
そしてこのような操作を簡便に行うことが可能となり、 従来非効率的であった 生殖系列キメラ動物の作製を効率的に行うことが可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . 生殖細胞を形成することができない初期胚と、 全能性細胞を用いることを 特徴とする、 生殖細胞が全能性細胞に由来する生殖系列キメラ動物の作製方法。
2. 生殖細胞を形成することができない初期胚が異種間交雑により得られる受 精胚、 核移植胚、 またはトランスジエニック胚である請求項 1に記載の作製方法。
3 . 全能性細胞が胚性幹細胞 （ES細胞） 又は胚性生殖細胞 （EG細胞） である 請求項 1又は請求項 2に記載の作製方法。
4. 全能性細胞が核移植胚あるいは核移植胚由来の胚性幹細胞 (ES細胞)又は 胚性生殖細胞 (EG細胞）である請求項 1又は 2に記載の作製方法。
5 . 動物がマウスである請求項 1〜4のレ、ずれかに記載の作製方法。
6 . 生殖細胞を形成することができない初期胚が実験用マゥス （Mus musculus domesticus)とその同胞異種関係にある Mus spretusのマウスとの正逆の交配或 は体外授精で得られる受精胚である請求項 5に記載の作製方法。
7 . 生殖細胞を形成することができない初期胚が c— k i t変異によりなされ る受精胚である請求項 1〜 5のいずれかに記載の作製方法。
8 . 請求項 1〜 7のいずれかの作製方法によつて作製することができる生殖細 胞が、 導入した全能性細胞に由来するキメラ動物。
9 . 請求項 1〜 7のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖細 胞が、 導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物。
1 0 . 請求項 1〜 7のいずれかの作製方法によって作製することができる生殖 細胞が、 導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物。
1 1 . 動物がマウスである請求項 8〜1 0のいずれかに記載のキメラ動物。
1 2 . 生殖細胞が、 導入した全能性細胞に由来する雄性キメラ動物と、 所望する 系統の雌性動物とを交配する力 \ 又は、 前記雄性キメラ動物から得られた精子を、 所望する系統の卵子に体外授精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親 に移植することによつて個体を発生させることを特徴とする、 染色体対の一方が 全能性細胞に由来するへテ口接合体動物の作製方法。
1 3. 生殖細胞が導入した全能性細胞に由来する雌性キメラ動物と、 所望する系 銃の雄性動物とを交配する力、 又は、 前記雌性キメラ動物から得られた卵子を所 望する系統の精子に体外受精や顕微受精することにより得られる受精胚を仮親に 移植することによって個体を発生させることを特徴とする、 染色体対の一方が全 能性細胞に由来するへテロ接合体動物の作製方法。
1 4. 請求項 9および 1 0により得られるキメラ動物の雌雄を交配、 人工授精、 体外授精、 或は顕微授精することで得られるホモ接合体動物の作製方法。
1 5. 動物がマウスである請求項 1 2〜 1 4のいずれかに記載の作製方法。
1 6. 請求項 1 2〜： 1 4のいずれかの方法で作製することができる、 染色体対 の一方が全能性細胞に由来するへテロ接合体動物。
1 7. 請求項 1 2〜 1 4のいずれかの方法で作製することができる、 染色体対 の一方が全能性細胞に由来するへテロ接合体動物の雌雄を交配することにより得 られるホモ接合体動物。
1 8. 動物がマウスである請求項 1 6又は 1 7に記載の動物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016539660A (ja) * 2013-11-07 2016-12-22 オズジーン・ホールディングス・プロプライエタリー・リミテッドＯｚｇｅｎｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ 遺伝子改変動物を作製するための組成物および方法
WO2017175745A1 (ja) * 2016-04-04 2017-10-12 国立大学法人 東京大学 生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006009297A1 (ja) * 2004-07-20 2008-05-01 恭光 長尾 Ｅｓ細胞を用いたキメラ作製
US9309537B2 (en) 2009-12-01 2016-04-12 National Cancer Center Chimeric rat produced using rat embryonic stem cells in the presence of an ES cell differentiation suppressant
AU2011265306C1 (en) * 2010-06-11 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Production of fertile XY female animals from XY ES cells
ES2901074T3 (es) 2014-06-26 2022-03-21 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso
MX2017004890A (es) 2014-10-15 2018-02-12 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la generación o el mantenimiento de células pluripotentes.
AU2016324305B2 (en) 2015-09-17 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Selection of pluripotent cells for production of fertile XY female mice
CN107557386B (zh) * 2017-07-21 2020-09-29 中国科学院广州生物医药与健康研究院 促进人多能干细胞异种嵌合的方法
EP4144857A4 (en) * 2020-03-06 2024-02-28 Mingceler Biotechnology Co Ltd PROCESS FOR PREPARING AN ANIMAL

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HORII T. ET AL.: "Serum-free culture of murine frimodial germ cells and embryonic germ cells", TERIOGENOLOGY, vol. 59, no. 5-6, March 2003 (2003-03-01), pages 1257 - 1264, XP002969408 *
NAGAO Y. ET AL.: "Decreased physical performance of congenic mice with mismatch between the nuclear and the mitochondrial genome", GENES. GENET. SYST., vol. 73, no. 1, 1998, pages 21 - 27, XP002969407 *
NAKAYAMA H. ET AL.: "Growth competition between W mutant and wild-type cells in mouse aggregation chimeras", DEV. GROWTH DIFFER., vol. 32, no. 3, 1990, pages 255 - 261, XP002969406 *
See also references of EP1486116A4 *
SUZUKI O. ET AL.: "Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells", EXP. ANIM., vol. 48, no. 3, 1999, pages 213 - 216, XP002969405 *
YUKIMITSU NAGAO ET AL.: "Ishu mitochondria o motsu kinkokei mice-kan de mitomerareta hyogen keishitsu no sa", CHIKUSAN KENKYU SEIKA JOHO, vol. 12, 1998, pages 11 - 12, XP002969409 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016539660A (ja) * 2013-11-07 2016-12-22 オズジーン・ホールディングス・プロプライエタリー・リミテッドＯｚｇｅｎｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ 遺伝子改変動物を作製するための組成物および方法
US11937586B2 (en) 2013-11-07 2024-03-26 Ozgene Holdings Pty Ltd Compositions and methods for producing genetically modified animals
WO2017175745A1 (ja) * 2016-04-04 2017-10-12 国立大学法人 東京大学 生殖細胞欠損動物を用いる遺伝子改変動物の作製方法

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