CN107557386B

CN107557386B - 促进人多能干细胞异种嵌合的方法

Info

Publication number: CN107557386B
Application number: CN201710601104.1A
Authority: CN
Inventors: 潘光锦; 黄可; 朱艳玲
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2037-07-21
Also published as: CN107557386A

Abstract

本发明涉及促进人多能干细胞异种嵌合的方法。该方法包括改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平，所述预定蛋白质具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。该方法，可以促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，为在异种动物中获得人源性细胞、组织或器官奠定基础。

Description

促进人多能干细胞异种嵌合的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及促进人多能干细胞异种嵌合的方法，更具体地，本发明涉及促进人胚胎干细胞异种嵌合的方法、构建体、重组细胞以及试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术

由人多能干细胞经过种间嵌合得到的人源化器官在再生医学应用上具有广阔前景。目前的观点认为，多能干细胞能否形成嵌合体很大程度上取决于多能干细胞所处的多能性状态。体外培养的多能干细胞根据所处的多能性状态主要可以分为两类，例如，来源于植入前囊胚的小鼠胚胎干细胞(mESCs)被认为是处于一种比较初始的原始(naive)状态，而来源于植入后囊胚的小鼠外胚层干细胞(mEpiSCs)则处于一种始发(primed)状态。Naive和primed状态的多能干细胞在嵌合体形成实验上具有显著差异。其中，naive状态的mESCs能够整合到早期囊胚中并在随后的发育过程中分化为胚胎的各个组织，而primed状态的mEpiSCs则不能整合到植入前的囊胚中，但是可以整合到植入后的胚胎中，由此可知，细胞与胚胎发育阶段的匹配对嵌合体形成至关重要。而同样是来源于植入前胚胎内细胞团的人胚胎干细胞(hESCs)被证明在细胞多能性状态上与小鼠的EpiSCs相似，并且也不能整合到植入前的小鼠胚胎中。

因此，可以有效促进人多能干细胞异种嵌合的方法还有待进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

将mEpiSCs注入到植入前的囊胚中后，这群细胞会发生凋亡，同样地，将人primed状态的hESCs移植到异种胚胎中时，hESCs也会发生凋亡。为得到由人多能干细胞产生的嵌合体，目前有多个实验室通过将primed状态的人多能干细胞逆转为类似于

状态的细胞，再将这种类似naive状态的人多能干细胞注射到小鼠或其它异种植入前囊胚中来得到嵌合体。但实验结果证明通过上述方法得到嵌合体的效率十分低；更重要的是，目前该将人primed状态的细胞转变为类似

状态的细胞方法繁琐，且耗时较长。基于上述问题，发明人发现通过在primed状态的hESCs中过表达BMI1，可以有效地促进可以促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)嵌合到小鼠胚胎和胚外组织中，包括内中外三胚层、卵黄囊和胎盘中；同时也可以促进hESCs嵌合到兔和猪中，并且发明人发现，上述促进作用是通过抑制hESCs整合到植入前的囊胚中引发的凋亡而实现的。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种促进人多能干细胞异种嵌合的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平，所述预定蛋白质具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。根据本发明实施例的方法，可以促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，为在异种动物中获得人源性细胞、组织或器官奠定基础。

MHRTTRIKITELNPHLMCVLCGGYFIDATTIIECLHSFCKTCIVRYLETSKYCPICDVQVHKTRPLLNIRSDKTLQDIVYKLVPGLFKNEMKRRRDFYAAHPSADAANGSNEDRGEVADEDKRIITDDEIISLSIEFFDQNRLDRKVNKDKEKSKEEVNDKRYLRCPAAMTVMHLRKFLRSKMDIPNTFQIDVMYEEEPLKDYYTLMDIAYIYTWRRNGPLPLKYRVRPTCKRMKISHQRDGLTNAGELESDSGSDKANSPAGGIPSTSSCLPSPSTPVQSPHPQFPHISSTMNGTSNSPSGNHQSSFANRPRKSSVNGSSATSSG(SEQ ID NO：1)。

上述具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白是BMI1。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述细胞为primed状态的人胚胎干细胞。利用本申请所述的方法，可克服primed状态的人多能干细胞在异种植入前囊胚中来得到嵌合体中效率低下的问题。利用本申请所述的方法，成功实现了将primed状态的人多能干细胞异种植入前囊胚中得到嵌合体。

根据本发明的实施例，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过过表达所述细胞中的预定蛋白质实现的。发明人惊奇地发现，使细胞过表达BMI1能够有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。发明人还通过实验发现，过表达BMI1有效促进人多能干细胞异种嵌合是通过抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡实现的。

根据本发明的实施例，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过向所述细胞中引入具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子而进行的：(a)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(d)在严谨条件下，能够与(a)或(b)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，向细胞中引入上述核苷酸分子进而实现BMI1的过表达而能够有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且发明人还发现，向细胞中引入上述核苷酸分子而实现BMI1的过表达还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡。

ATGCATCGAACAACGAGAATCAAGATCACTGAGCTAAATCCCCACCTGATGTGTGTGCTTTGTGGAGGGTACTTCATTGATGCCACAACCATAATAGAATGTCTACATTCCTTCTGTAAAACGTGTATTGTTCGTTACCTGGAGACCAGCAAGTATTGTCCTATTTGTGATGTCCAAGTTCACAAGACCAGACCACTACTGAATATAAGGTCAGATAAAACTCTCCAAGATATTGTATACAAATTAGTTCCAGGGCTTTTCAAAAATGAAATGAAGAGAAGAAGGGATTTTTATGCAGCTCATCCTTCTGCTGATGCTGCCAATGGCTCTAATGAAGATAGAGGAGAGGTTGCAGATGAAGATAAGAGAATTATAACTGATGATGAGATAATAAGCTTATCCATTGAATTCTTTGACCAGAACAGATTGGATCGGAAAGTAAACAAAGACAAAGAGAAATCTAAGGAGGAGGTGAATGATAAAAGATACTTACGATGCCCAGCAGCAATGACTGTGATGCACTTAAGAAAGTTTCTCAGAAGTAAAATGGACATACCTAATACTTTCCAGATTGATGTCATGTATGAGGAGGAACCTTTAAAGGATTATTATACACTAATGGATATTGCCTACATTTATACCTGGAGAAGGAATGGTCCACTTCCATTGAAATACAGAGTTCGACCTACTTGTAAAAGAATGAAGATCAGTCACCAGAGAGATGGACTGACAAATGCTGGAGAACTGGAAAGTGACTCTGGGAGTGACAAGGCCAACAGCCCAGCAGGAGGTATTCCCTCCACCTCTTCTTGTTTGCCTAGCCCCAGTACTCCAGTGCAGTCTCCTCATCCACAGTTTCCTCACATTTCCAGTACTATGAATGGAACCAGCAACAGCCCCAGCGGTAACCACCAATCTTCTTTTGCCAATAGACCTCGAAAATCATCAGTAAATGGGTCATCAGCAACTTCTTCTGGTTGA(SEQ ID NO：2)。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码具有选自下列氨基酸序列之一的蛋白质：(a)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；(c)(a)与(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，利用本发明的构建体导入受体人多能干细胞，能够有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。

根据本发明的实施例，上述构建体还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子是具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子：(a)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(d)在严谨条件下，能够与(a)或(b)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，利用该构建体导入受体人多能干细胞进而实现BMI1的过表达能够有效地促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且发明人发现，利用该构建体导入受体人多能干细胞可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡。

根据本发明的实施例，所述构建体选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。构建体的形式不受特别限制。任选地，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，与野生型细胞相比，所述重组细胞中预定蛋白质的表达水平被改变，所述预定蛋白质具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；(c)(a)与(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，本发明的重组细胞能够过表达BMI1，从而有效地促进自身的异种嵌合，进而进入到鼠、兔和猪等异种动物体内。并且，该重组细胞在异种嵌合过程中其自身凋亡显著下降。

根据本发明的实施例，上述重组细胞还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述重组细胞中预定蛋白质的表达水平被改变是通过过表达所述预定蛋白实现的。发明人发现，过表达BMI1可以有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡。

根据本发明的具体实施例，所述重组细胞为primed状态的人胚胎干细胞。本申请的primed状态的人多能干细胞克服了异种植入前囊胚中来得到嵌合体中效率低下的问题。本申请的primed状态的人多能干细胞异种植入前囊胚中可得到嵌合体。

根据本发明的实施例，所述过表达是通过向所述细胞中引入前面所述的构建体实现的。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种试剂在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于促进人多能干细胞异种嵌合，所述试剂用于过表达预定蛋白，所述预定蛋白具有下列氨基酸序列的至少之一：(a)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：1的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的氨基酸序列。发明人惊奇地发现，所述试剂盒可以有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡。

根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述试剂为携带具有选自下列核苷酸序列之一的核苷酸分子的构建体：(a)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO：2的至少之一所示的核苷酸序列的一部分；(c)与(a)和(b)中所示核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选至少99％序列同一性的核苷酸序列；(d)在严谨条件下，能够与(a)或(b)中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。发明人发现，所述构建体导入受体人多能干细胞进而实现BMI1的过表达可以有效促进人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESCs)进行异种嵌合，进入到鼠、兔和猪等异种动物体内，同时还可以抑制人primed状态的人多能干细胞的凋亡。

根据本发明的实施例，其特征在于，所述构建体选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。构建体的形式不受特别限制。任选地，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。

需要说明的是，说明书中描述：“同一性”是本领域所熟知的，是指两个或多个核酸序列之间经序列比较后决定的关系；在本领域中，“同一性”也指核酸分子序列之间的序列相关程度，由这些序列的碱基匹配程度决定；“同一性”可以根据已知的方法容易地计算出，这些方法包括，但不限于，描述于Computer Molecular Biology，Lesk编辑，牛津大学出版，纽约1993；Biocomputing：Infornatics and Genome Projects，Smith编辑，Academic出版，纽约1988；Computer Analysis of Sequence Data，第一部分，Griffin和Griffin编辑，Humana出版，新泽西，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，Academic出版1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov和Devereux编辑，Stockton出版，纽约1991；和Carillo和Lipman，SIAM J，应用数学，48：1073，1988。

最后，需要说明的是，本发明的促进人多能干细胞异种嵌合的方法是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和不断的优化工作才完成的。

附图说明

图1是根据本发明实施例的BMI1过表达示意图，

其中，A和B分别表示采用qPCR和western blot方法检测在添加Dox的情况下，H1-DsRed+BMI1与对照组H1-DsRed相比BMI1的表达情况；C表示流式检测H1-DsRed+BMI1与H1-DsRed细胞表达DsRed的情况。

图2是根据本发明实施例的过表达BMI1抑制hESCs进入小鼠胚胎后发生的凋亡的示意图，

其中，A表示过表达BMI1的细胞没有发生凋亡，细胞膜保持完整，所以是Annexin V阴性；B表示过表达BMI1使细胞存活下来并嵌合进入小鼠胚胎中；

图3是根据本发明实施例的过表达BMI1促进hESCs嵌合进入小鼠胚胎并分化为三胚层细胞的示意图，

其中，A表示免疫荧光检测相应胚胎中人源细胞表面标记分子Stem121及DsRed的表达；B表示免疫荧光分别检测嵌合胚胎中Calponin、PAX6、SOX17及DsRed的表达；

图4是根据本发明实施例的过表达BMI1促进hESCs嵌合进入小鼠胚胎及胚外组织中的示意图；从左到右分别是胎盘，卵黄囊，胚胎；

图5是根据本发明实施例的过表达BMI1促进hESCs嵌合进入猪和兔的胚胎中的示意图，其中，A表示猪；B表示兔。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1构建BMI1基因诱导表达的人胚胎干细胞系

首先构建过表达载体，将BMI1基因连接到可诱导表达载体FUW上，构建FUW-BMI1质粒，FUW载体带有筛选标记puromycin，可以进行药物筛选；然后将FUW-BMI1载体与FUW-rtTA辅助质粒共感染primed状态hESCs，此处为带DsRed荧光的人H1以及H9人胚胎干细胞(H1/H9-DsRed，DsRed整合到人基因组VVSR1位点)；在添加doxycycline(Dox)的情况下，可以有效地诱导BMI1和puromycin抗性基因共表达，然后在细胞培养基中添加puromycin进行筛选，可以去除未表达BMI1的细胞；经过筛选存活下来的细胞即为表达BMI1的primed状态hESCs。以H1-DsRed细胞为例，结果如图1所示，通过qPCR和western blot检测，在mRNA和蛋白水平检测BMI1的表达，相对于未感染BMI1病毒的对照组，所构建的BMI1过表达细胞系H1-DsRed+BMI1可以有效地表达BMI1(图1A-B)。同时，图1C证明，H1-DsRed+BMI1与H1-DsRed都带有DsRed荧光。

图1C流式图内，右边的曲线表达检测细胞的荧光值，左边的曲线表示相应未整合DsRed细胞(H1+BMI1与H1)的荧光值。误差棒：平均值+SEM；***p<0.001，ttest。

实施例2过表达BMI1可以抑制hESCs进入小鼠胚胎后发生的凋亡，并促进人鼠嵌合

如图2所示，图2A中，将H1-DsRed与H1-DsRed+BMI1细胞用细胞消化液Accutase消化3-5分钟至细胞解离成单细胞后，离心去上清，并用培养基重悬后置于冰上，利用胚胎显微注射技术将细胞分别注射10个目的细胞到小鼠桑葚胚中，并在体外培养24小时到达囊胚期；然后用含4％多聚甲醛的固定液固定胚胎30分钟，用磷酸缓冲液(PBS)洗三遍后，4度过夜孵育带FITC荧光的AnnexinⅤ，最后用DAPI定位细胞核，处理好的胚胎样品利用共聚焦显微镜观察并分析。此处采用免疫荧光法，利用荧光标记的磷脂结合蛋白Annexin V标记凋亡细胞，图2A中，上图中箭头表达Annexin V+/DsRed+的发生凋亡的人源细胞；下图中箭头表示Annexin V-/DsRed+未发生凋亡的人源细胞。图2B中，将H1-DsRed与H1-DsRed+BMI1细胞分别通过显微注射到囊胚期小鼠胚胎，然后将胚胎移植回假孕鼠体内，过表达BMI的实验组孕鼠每天喂食含有2毫克/毫升Dox的水以维持BMI1的表达，在小鼠胚胎发育到第10.5天(E10.5)时取出胚胎，通过荧光显微镜检测DsRed表达的情况。

发明人发现，在小鼠囊胚内H1-DsRed因发生凋亡而导致细胞膜内侧的膜磷脂酰丝氨酸外翻，与荧光标记的Annexin V特异性结合，而绝大多数H1-DsRed+BMI1由于过表达BMI1抑制凋亡故不结合Annexin V而存活下来，如图2A所示；并且H1-DsRed+BMI1细胞可以嵌合进入小鼠胚胎中，如图2B所示。

实施例3过表达BMI1可以促进hESCs嵌合进入小鼠胚胎并分化为三胚层细胞

将解离成单细胞的H1-DsRed与H1-DsRed+BMI1细胞通过胚胎显微注射技术分别注射10-15个细胞到囊胚期小鼠胚胎，然后移植回假孕鼠体内，过表达BMI的实验组孕鼠每天喂食含有2毫克/毫升Dox的水以维持BMI1的表达，在小鼠胚胎发育到E10.5时，收取胚胎，用含4％多聚甲醛的固定液固定胚胎，将固定过后的胚胎放入30％蔗糖溶液进行脱水处理，成功脱水后的胚胎用于冷冻切片，并对胚胎切片染色；其中，图3中的Stem121、Calponin、PAX6和SOX17为一抗，通过二抗Alexa Fluor 488进一步标记以检测荧光表达。

发明人发现，只有过表达BMI1之后，人源的细胞才能整合到小鼠胚胎中，Stem121为人胞质蛋白特异抗体，如图3A所示；并且有效地分化为三胚层细胞，包括Calponin+的中胚层细胞、PAX6阳性的外胚层细胞和SOX17+的内胚层细胞，如图3B所示。

实施例4过表达BMI1可以促进hESCs嵌合进入小鼠胚外组织

将解离成单细胞的H1-DsRed与H1-DsRed+BMI1细胞通过胚胎显微注射技术分别注射10-15个细胞到囊胚期小鼠胚胎，然后移植回假孕鼠体内，过表达BMI的实验组孕鼠每天喂食含有2毫克/毫升Dox的水以维持BMI1的表达，在小鼠胚胎发育到E10.5时，收取胚胎，及其胚外组织，包括胎盘(placentas)和卵黄囊(Yolk Sac)。

发明人发现，通过在荧光显微镜下观测DsRed的表达情况，发现H1-DsRed移植后的胚胎及胚外组织中，不能检测到DsRed荧光表达；而H1-DsRed移植后的胚胎及胚外组织中，包括胎盘和卵黄囊中，可以检测到DsRed荧光的表达。以上结果证明，过表达BMI1可以有效地促进primed状态hESCs整合到小鼠的胚胎及胚外组织中，如图4所示。

实施例5过表达BMI1可以促进hESCs嵌合进入猪和兔的胚胎

将解离成单细胞的H1-DsRed与H1-DsRed+BMI1细胞通过胚胎显微注射技术分别注射5个细胞到猪的桑葚胚(如图5A所示)；分别注射7个细胞到兔的桑葚胚(如图5B所示)，并在体外培养到囊胚期；然后用含4％多聚甲醛的固定液固定胚胎30分钟，用磷酸缓冲液(PBS)洗三遍后，4度过夜孵育带FITC荧光的AnnexinⅤ，最后用DAPI定位细胞核，处理好的胚胎样品利用共聚焦显微镜观察并分析。此处采用免疫荧光法，利用荧光标记的磷脂结合蛋白Annexin V标记凋亡细胞。其中，图5A和图5B中，上图中的箭头表达Annexin V+/DsRed+的发生凋亡的人源细胞；下图中的箭头表示Annexin V-/DsRed+未发生凋亡的人源细胞。

发明人发现，过表达BMI1可以抑制primed状态的hESCs由于移植进入猪和兔的囊胚中发生的凋亡，从而促进hESCs嵌合进入猪和兔的胚胎，如图5所示。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 促进人多能干细胞异种嵌合的方法

<130> PIDC317349

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> BMI1的氨基酸序列

<400> 1

Met His Arg Thr Thr Arg Ile Lys Ile Thr Glu Leu Asn Pro His Leu

1 5 10 15

Met Cys Val Leu Cys Gly Gly Tyr Phe Ile Asp Ala Thr Thr Ile Ile

20 25 30

Glu Cys Leu His Ser Phe Cys Lys Thr Cys Ile Val Arg Tyr Leu Glu

35 40 45

Thr Ser Lys Tyr Cys Pro Ile Cys Asp Val Gln Val His Lys Thr Arg

50 55 60

Pro Leu Leu Asn Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Gln Asp Ile Val Tyr

65 70 75 80

Lys Leu Val Pro Gly Leu Phe Lys Asn Glu Met Lys Arg Arg Arg Asp

85 90 95

Phe Tyr Ala Ala His Pro Ser Ala Asp Ala Ala Asn Gly Ser Asn Glu

100 105 110

Asp Arg Gly Glu Val Ala Asp Glu Asp Lys Arg Ile Ile Thr Asp Asp

115 120 125

Glu Ile Ile Ser Leu Ser Ile Glu Phe Phe Asp Gln Asn Arg Leu Asp

130 135 140

Arg Lys Val Asn Lys Asp Lys Glu Lys Ser Lys Glu Glu Val Asn Asp

145 150 155 160

Lys Arg Tyr Leu Arg Cys Pro Ala Ala Met Thr Val Met His Leu Arg

165 170 175

Lys Phe Leu Arg Ser Lys Met Asp Ile Pro Asn Thr Phe Gln Ile Asp

180 185 190

Val Met Tyr Glu Glu Glu Pro Leu Lys Asp Tyr Tyr Thr Leu Met Asp

195 200 205

Ile Ala Tyr Ile Tyr Thr Trp Arg Arg Asn Gly Pro Leu Pro Leu Lys

210 215 220

Tyr Arg Val Arg Pro Thr Cys Lys Arg Met Lys Ile Ser His Gln Arg

225 230 235 240

Asp Gly Leu Thr Asn Ala Gly Glu Leu Glu Ser Asp Ser Gly Ser Asp

245 250 255

Lys Ala Asn Ser Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ser Thr Ser Ser Cys Leu

260 265 270

Pro Ser Pro Ser Thr Pro Val Gln Ser Pro His Pro Gln Phe Pro His

275 280 285

Ile Ser Ser Thr Met Asn Gly Thr Ser Asn Ser Pro Ser Gly Asn His

290 295 300

Gln Ser Ser Phe Ala Asn Arg Pro Arg Lys Ser Ser Val Asn Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ala Thr Ser Ser Gly

325

<210> 2

<211> 981

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 编码BMI1核酸的核苷酸序列

<400> 2

atgcatcgaa caacgagaat caagatcact gagctaaatc cccacctgat gtgtgtgctt 60

tgtggagggt acttcattga tgccacaacc ataatagaat gtctacattc cttctgtaaa 120

acgtgtattg ttcgttacct ggagaccagc aagtattgtc ctatttgtga tgtccaagtt 180

cacaagacca gaccactact gaatataagg tcagataaaa ctctccaaga tattgtatac 240

aaattagttc cagggctttt caaaaatgaa atgaagagaa gaagggattt ttatgcagct 300

catccttctg ctgatgctgc caatggctct aatgaagata gaggagaggt tgcagatgaa 360

gataagagaa ttataactga tgatgagata ataagcttat ccattgaatt ctttgaccag 420

aacagattgg atcggaaagt aaacaaagac aaagagaaat ctaaggagga ggtgaatgat 480

aaaagatact tacgatgccc agcagcaatg actgtgatgc acttaagaaa gtttctcaga 540

agtaaaatgg acatacctaa tactttccag attgatgtca tgtatgagga ggaaccttta 600

aaggattatt atacactaat ggatattgcc tacatttata cctggagaag gaatggtcca 660

cttccattga aatacagagt tcgacctact tgtaaaagaa tgaagatcag tcaccagaga 720

gatggactga caaatgctgg agaactggaa agtgactctg ggagtgacaa ggccaacagc 780

ccagcaggag gtattccctc cacctcttct tgtttgccta gccccagtac tccagtgcag 840

tctcctcatc cacagtttcc tcacatttcc agtactatga atggaaccag caacagcccc 900

agcggtaacc accaatcttc ttttgccaat agacctcgaa aatcatcagt aaatgggtca 960

tcagcaactt cttctggttg a 981

Claims

1.一种促进人多能干细胞异种嵌合的方法，其包括改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平，所述预定蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过过表达所述细胞中的预定蛋白质实现的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为商业化人多能干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改变所述细胞中预定蛋白质的表达水平是通过向所述细胞中引入核苷酸分子而进行的，其中，所述核酸分子的核苷酸序列为SEQID NO：2所示。

4.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于促进人多能干细胞异种嵌合，所述试剂用于过表达预定蛋白，所述预定蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂为携带核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。