JP2020530760A - 細胞、脊椎動物、集団及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
抗体重鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
本発明に従う複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
抗体軽鎖レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも95%純粋である、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
抗体軽鎖レパートリーが、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
複数の前記第一の遺伝子座を含む本発明に従う脊椎動物の複数の脾臓、骨髄、B細胞又は血液細胞。
脾臓、骨髄、B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞又は血液細胞の集団であって、各細胞が本発明に従い、
(a)少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメイン
を含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。
集団によって含まれる少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含むポリクローナル抗体集団であって、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
抗体、抗体可変ドメイン、抗体若しくは抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は抗体若しくはドメインを発現可能である発現ベクター若しくは宿主細胞を同定する若しくは得る方法であって、抗体又はドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)本発明の細胞集団又は本発明の抗体集団を、(例えば、固体支持体に固定化された)前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を(例えば、PCRを使用して)増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程(例えば、ドメインが、抗体鎖によって含まれる)
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。
本発明のポリクローナル抗体集団を発現する複数のB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞。
抗体又は抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を得る方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を本発明の細胞から得る工程;
(b)前記配列を、(例えば、PCRを使用して)増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。
抗原に特異的に結合する抗体の産生のための、抗体産生細胞株を得る方法であって、VH及びVLコードヌクレオチド配列を、宿主細胞(例えば、CHO、HEK、MEF、COS又はHeLa細胞)のゲノムに挿入する工程を含み、
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、
VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
二重特異性4鎖抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、本発明の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、(a)抗体を本発明の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、本発明の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態(例えば、がん)を治療する又は予防するための医薬組成物を産生する方法であって、二重特異性抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程を含み、抗体が、本発明の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
本発明の細胞又は脊椎動物を産生する方法であって、
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、本発明の非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程
を更に含む、方法。
本発明に従う又は本発明の方法に従って得られる、ES又はiPS細胞を移植された非ヒト脊椎動物(例えば、げっ歯類、ラット又はマウス)胚盤胞又は前桑実胚(pre-morula embryo)。
本発明の方法に使用するための導入遺伝子を含み、導入遺伝子が(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域を
含む、核酸。
本発明の方法に使用するための再構成されたVドメインをコードする再構成された可変領域配列を含み、
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に
隣接する前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)第一のヌクレオチド配列が、細胞の抗体軽鎖(例えば、カッパ)遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び第二のヌクレオチド配列が、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(例えば、Eiκ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)第一のヌクレオチド配列が、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び第二のヌクレオチド配列が、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。
1. 第一のヒトVH及びVLドメインを含む第一の抗体を得る工程であって、抗体が、第一の所定の抗原に特異的に結合する工程;又は抗体の前記VL又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列を得る工程;
2.複数の異なるヒトVHドメインを発現させるためのヒト化可変領域を含む、IgH遺伝子座を(ヘテロ接合又はホモ接合型で)含む、トランスジェニックマウスES細胞を得る工程;
3.抗体の軽鎖又はそのVLをコードするヌクレオチド配列をES細胞のゲノムに挿入する工程であって、挿入がES細胞ゲノムのカッパ遺伝子座対立遺伝子のEiκとCκの間である、工程;
4.任意選択で、他のカッパ遺伝子座対立遺伝子を改変(故に、カッパ軽鎖を発現可能ではない)又は対立遺伝子を改変し、それによって、第一又は第二の抗体又はそのVLの軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、前記他のカッパ遺伝子座対立遺伝子のEiκとCκの間に挿入される、工程;
5.(例えば、ES細胞をレシピエント胚盤胞又は前桑実胚(例えば、RAG及び/又はIgHノックアウト胚盤胞又は前桑実胚)に移植する工程及び胚盤胞又は前桑実胚を偽妊娠雌性マウスに移植し、それによって、1つ又は複数の子が雌から出産される工程によって)ES細胞をマウスに発生させる工程であって、マウス又は子が、そのように発生して、軽鎖又はVLを発現可能な少なくとも1つのカッパ遺伝子座を含み、軽鎖又はVLが、マウスによって発現される重鎖又はVHと対合し、VH/VL抗原結合部位を形成する、工程;
6.任意選択で、子孫マウスを得る工程であって、子孫が、軽鎖又はVLを発現可能な少なくとも1つのカッパ遺伝子座を各々含み、軽鎖又はVLが、子孫マウスによって発現される重鎖又はVHと対合し、VH/VL抗原結合部位を形成する、工程;
7.第一及び第二の抗原が異なる、工程5のマウス又は前記子孫マウス(第二の抗原を有する)を免疫する工程;
8.工程7の免疫化マウスから(例えば、工程7の免疫化マウスのB細胞のDNAのPCR及び/又はB細胞のハイブリドーマ技術を使用して)、VL(又は軽鎖のVLと対合する重鎖のVH)と対合するVH(第二のVH)をコードするヌクレオチド配列を得る工程であって、第二のVH及びVLが、第二の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、工程;
9.任意選択で、第一のVHをコードするヌクレオチド配列、第二のVHをコードするヌクレオチド配列、及びVLをコードするヌクレオチド配列を、1つ又は複数の発現ベクターに又は1つ又は複数の宿主細胞のゲノムに挿入する工程であって、各Vヌクレオチド配列が、それぞれ第一の抗体重鎖、第二の抗体重鎖又は抗体軽鎖の発現のために、それぞれ抗体第一CH、第二CH又はCL領域の5'に作動可能に連結されており;任意選択で、第一及び第二のCH領域が、(例えば、荷電対合(charge pair)変異又はノブ-イン-ホール(knob-in-hole)変異を使用して)、一緒に対合する、変異型ヒトCHドメインである第一及び第二のCHドメインをコードする、及び/又は第一及び第二の鎖が、(例えば、0.5-1pI単位で分けられる)異なるpIを有する、工程;
10.任意選択で、工程9の宿主細胞を得、宿主細胞において重鎖及び軽鎖を発現させ、それによって、二重特異性抗体が、産生され、各々が第一の抗原に特異的に結合可能なVH/VL結合部位を含む第一の重鎖-軽鎖対、及び第二の抗原に特異的に結合可能なVH/VL結合部位を含む第二の重鎖-軽鎖対を含む、工程;並びに
11.任意選択で、前記二重特異性抗体を単離する工程。
1.抗マウス(又は抗体のC領域に適合する、他の関連性のある非ヒト脊椎動物、例えば)IgG(例えば、Biacore BR-1008-38)をバイオセンサーチップ(例えば、GLMチップ)に、例えば、一級アミンカップリングによってカップリングする工程;
2.抗マウスIgG(非ヒト脊椎動物抗体)を、試験IgG抗体又は重鎖に曝露して、チップに試験抗体を捕捉する工程;
3.試験抗原を、0nM(すなわち、緩衝液のみ)と共に、1024nM、256nM、64nM、16nM、4nMで、チップの捕捉表面を通過させる工程;及び
4.及び、試験抗体の試験抗原/鎖の結合の親和性を、表面プラズモン共鳴を使用して、例えば、上で考察したSPR条件下で(例えば、生理学的緩衝液中25℃で)決定する工程によってSPRを使用して決定される。SPRは、Biacore(商標)等の任意の標準的なSPR装置を使用するか、又はProteOn XPR36(商標)(Bio-Rad(登録商標))を使用して実施することができる。
1)マウスVλプロモーター+マウスVλ SP
2)マウスVλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
3)マウスVλプロモーター+ヒトVλ SP
4)マウスVλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
6)マウスVKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
7)マウスVKプロモーター+ヒトVλ SP
8)マウスVKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
10)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
11)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+ヒトVλ SP
12)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
14)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
15)非マウスげっ歯類VKプロモーター+ヒトVλ SP
16)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
18)ヒトVλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
19)ヒトVλプロモーター+ヒトVλ SP
20)ヒトVλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
22)ヒトVKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
23)ヒトVKプロモーター+ヒトVλ SP
24)ヒトVKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
26)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
27)非ヒト霊長類Vλプロモーター+ヒトVλ SP
28)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
30)非ヒト霊長類VKプロモーター+非マウスげっ歯類Vλ SP
31)非ヒト霊長類VKプロモーター+ヒトVλ SP
32)非ヒト霊長類VKプロモーター+非ヒト霊長類Vλ SP
34)マウスVλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
35)マウスVλプロモーター+ヒトVK SP
36)マウスVλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
38)マウスVKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
39)マウスVKプロモーター+ヒトVK SP
40)マウスVKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
42)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
43)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+ヒトVK SP
44)非マウスげっ歯類Vλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
46)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
47)非マウスげっ歯類VKプロモーター+ヒトVK SP
48)非マウスげっ歯類VKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
50)ヒトVλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
51)ヒトVλプロモーター+ヒトVK SP
52)ヒトVλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
54)ヒトVKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
55)ヒトVKプロモーター+ヒトVK SP
56)ヒトVKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
58)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
59)非ヒト霊長類Vλプロモーター+ヒトVK SP
60)非ヒト霊長類Vλプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
62)非ヒト霊長類VKプロモーター+非マウスげっ歯類VK SP
63)非ヒト霊長類VKプロモーター+ヒトVK SP
64)非ヒト霊長類VKプロモーター+非ヒト霊長類VK SP
記載:
1. 抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、VH、Vλ又はVκ、例えば、VL)をコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体ヒト可変領域;
(c)軽鎖Cドメインをコードするヒト又はマウス又はラット抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)軽鎖Cドメインをコードする外因性抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒトCκ又はCλ);及び
(d)細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
(a)細胞(例えば、細胞は、げっ歯類、マウス又はラット細胞である)の内因性軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、ヒトVドメイン)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)軽鎖Cドメイン(例えば、細胞が、げっ歯類、マウス又はラット細胞である場合、例えば、ヒトCドメイン)をコードする抗体軽鎖定常領域;及び
(d)任意選択で、細胞の内因性抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
(a)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCκであり;
(b)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCλであり;
(c)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCλであり;又は
(d)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCκである、いずれかの先行する記載の細胞。
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメイン(例えば、VL、Vλ又はVκ、例えば、VH)をコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)前記イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)前記抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座は、(NからC末端方向に)前記可変ドメインのアミノ酸配列に融合された前記シグナルペプチド配列をコードするRNA転写物を発現するように作動可能である、いずれかの先行する記載の細胞。
(a)第一のドメインがVL(例えば、Vκ又はVλ)ドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVHドメインであり;又は
(b)第一のドメインがVHドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVL(例えば、両方Vκ又はVλ)ドメインである、記載11の細胞。
任意選択で、細胞ゲノムは、複数の前記導入遺伝子を含む。
或いは、細胞は、前記遺伝子座に関してヘテロ接合性である。
(a)1つ又は複数のVH遺伝子セグメント;
(b)1つ又は複数のDH遺伝子セグメント;
(c)1つ又は複数のJH遺伝子セグメント;及び
(d)1つ又は複数のCHドメインをコードする重鎖定常領域
を含む、再構成されていない抗体重鎖遺伝子座であり;
重鎖遺伝子座が、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、複数の重鎖を発現するように作動可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖(例えば、カッパ又はラムダ軽鎖)と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、記載1に従属する場合のいずれかの先行する記載の細胞。
(i)直接先行する段落に従う非ヒト脊椎動物(例えば、マウス又はラット)を提供する工程であって、第一の遺伝子座の可変領域が、第一の所定の抗原に特異的に結合する抗体のVHドメインをコードする工程;
(ii)脊椎動物を第二の所定の抗原で免疫する工程であって、脊椎動物が、複数の前記軽鎖を発現し、鎖のVLドメインが、前記VHのコピーと対合して、第二の抗原に特異的に結合するVH/VL抗原結合部位を形成する工程;
(iii)第一及び第二の抗原に結合する1つ又は複数のVH/VL対を単離する工程;又は抗原を結合する前記VH/VL対を発現する、1つ又は複数のB細胞又はハイブリドーマを得る工程;又は前記対のVLをコードするヌクレオチド配列及び/又は前記対のVHのヌクレオチド配列を得る工程;
(iv)任意選択で、ヌクレオチド配列を、VH/VL対合結合部位を含む二重特異性抗体を発現させるための、1つ又は複数の発現ベクター又は1つ又は複数の宿主細胞に挿入する工程であって、各結合部位が、第一及び第二の抗原に特異的に結合可能である工程;及び
(v)任意選択で、前記二重特異性抗体を発現させる工程及び単離する工程
を含む方法。
宿主細胞株から複数の抗体を発現させる工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、宿主細胞株が、工程(i)から(iv)によって得られる又はそのように得られる細胞から培養される方法。
宿主細胞株から複数の抗体を発現させる工程を含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、各宿主細胞ゲノムが、二重特異性抗体の重鎖可変ドメインをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、可変ドメインが、第一の抗原を特異的に結合可能であり、ヌクレオチド配列が、本発明の脊椎動物のB細胞のヌクレオチド配列と同一(又は少なくとも80、85、90又は95%同一)であり、脊椎動物が、第一の抗原で免疫されている方法。一例では、各宿主細胞ゲノムは、B細胞のヌクレオチド配列と同一(又は少なくとも80、85、90又は95%同一)である、軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、重鎖及び軽鎖ドメインが対合したVH/VL第一抗原結合部位を形成する。任意選択で、方法は、そのような複数の二重特異性抗体を単離する工程及び任意選択で、抗体を担体、希釈剤又は賦形剤で更に製剤化して、組成物(例えば、医薬組成物)を産生する工程を含む。本発明はまた、この方法又は本発明の任意の他の方法によって得られる又は入手可能な、そのような複数の抗体又は組成物に関する。
(b)細胞はラット細胞であり、可変領域はヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーは細胞の内因性抗体遺伝子座(例えば、カッパ遺伝子座)でのラットイントロンエンハンサー(例えば、内因性ラットイントロンエンハンサーと同一の配列)であり、前記定常領域はマウス、ラット又はヒト定常領域(例えば、細胞の内因性ラット定常領域)である、いずれかの先行する記載の細胞。
(a)ヒトIGLV3-21及びIGLJ3(例えば、IGLV3-21*01及びIGLJ3*02)の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGLV3-21(例えば、IGLV3-21*01)プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(b)ヒトIGK1-39及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV1-39プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(c)ヒトIGK3-20及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV3-20プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(d)ヒトVpreB及びJλ5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列VpreBプロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、いずれかの先行する記載の細胞。
(a)少なくとも95、96、97、98又は99%(又は100%)の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメイン(例えば、ヒト生殖系列Vκ及びJκ遺伝子セグメント又はヒト生殖系列Vλ及びJλ遺伝子セグメント)を含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。
任意選択で、集団は、少なくとも100、1000、10000、100000、1000000、10000000、100000000、又は1000000000の異なるVHドメイン種を含む。
(a)記載41の細胞集団又は記載42若しくは43の抗体集団を、(例えば、固体支持体に固定化された)前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列(例えば、DNA、cDNA、RNA又はmRNA配列)と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を(例えば、PCRを使用して)増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程(例えば、ドメインが、抗体鎖によって含まれる)
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。
(a)第一及び第二の対における軽鎖が、前記VLドメインを含み、
(b)第一の対の重鎖が、記載45に列挙されるVHドメインを含み、VHドメインが、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成し、及び結合部位が、記載45に列挙される前記抗原に特異的に結合可能であり;
(c)第二の対の重鎖が、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成する、前記更なるVHドメインを含み、及び結合部位が、記載46に列挙される前記更なる抗原に特異的に結合可能である、記載46の方法。
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を記載41又は47の細胞から得る工程;
(b)前記配列を、(例えば、PCRを使用して)増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
(a)第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;
(b)第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;及び
(c)第一及び第二の抗原が、異なり;
第一及び第二の重鎖及び軽鎖が、対合可能で、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む二重特異性4鎖抗体を産生し、
(d)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み;及び
(e)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHドメインを含む、記載52の方法。
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
(a)(i)第三の細胞ゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して軽鎖を発現する第三の細胞株を産生する工程によって軽鎖を発現可能な第三の細胞株を産生する工程;
(b)軽鎖を第三の細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、記載54の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、記載54の方法。
(a)第一及び/又は第二の細胞又は細胞株のゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域(例えば、ヒト定常領域)の5'に作動可能に挿入される工程;及び
(b)軽鎖をVH配列を含む細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、記載54の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、記載54の方法。
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、記載41又は47の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。
(a)抗体を記載52又は53の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;及び
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、記載54から60のいずれか1つの方法によって得られる抗体と同一である又はそれと同一である可変ドメインを含む、方法。
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸(例えば、DNA又はcDNA)を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、記載29から39のいずれか1つの非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程
を更に含む、方法。
(g)軽鎖イントロンエンハンサー;
(h)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(i)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、細胞において、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である。
(a)前記イントロンエンハンサー(例えば、Eiκ、例えば、マウス又はラットEiκ);
(b)前記再構成された抗体可変領域(例えば、ヒトVLコード可変領域);及び
(c)前記抗体定常領域(例えば、ヒトCLコード領域)
を含む導入遺伝子を得る工程;及び
前記導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入する工程
を含み、それによって、前記抗体遺伝子座が、細胞によって含まれる、記載63から65のいずれか1つの方法。
(a)細胞ゲノムのイントロンエンハンサーと軽鎖遺伝子座のCL;又は
(b)細胞ゲノムのイントロンエンハンサー(Eμ)と重鎖遺伝子座のCμ
の間に挿入する工程を含む、記載63から65のいずれか1つの方法。
(a)記載68に列挙される前記抗体を発現する更なる細胞(例えば、ハイブリドーマ又はB細胞)を得る工程;
(b)i.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む、更なる細胞のDNA(例えば、染色体DNA又はcDNA)配列得る又はコピーする工程;又は
ii.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む更なる細胞のRNA配列(例えば、mRNA配列を得る又はコピーする工程、及び前記RNA配列のDNAコピーを生じさせる(例えば、PCRを使用して)工程
を含み、それによって、前記核酸を得る、記載68の方法。
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む、核酸(例えば、DNA)。
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に
隣接する前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)5'相同アームが、細胞の抗体軽鎖(例えば、カッパ)遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(例えば、Eiκ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)5'相同アームが、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能であり、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び
(c)任意選択で、前記イントロンエンハンサー配列
を含み、可変領域配列が細胞ゲノムに挿入される場合、可変領域は(NからC末端方向に)シグナル配列-Vドメイン-Cドメインを含む抗体鎖の発現のために、プロモーター及びシグナルペプチドコード配列の3'に作動可能に連結するように挿入される、記載73の核酸。
他の用語は、本明細書に本発明の様々な態様の記載の中で定義される。
マウスES細胞ターゲティングのためのターゲティングベクターの構築
1.1 pUC57_N128L_KIベクターDNA合成
N128Lは、ヒトIGLV3-21*01及びIGLJ3*02(VLドメイン配列は、以下で与えられる)から再構成されたヒトλ軽鎖である。野生型ヒトIGLV3-21*01プロモーター(pVλ)及びシグナルペプチド(SP)、マウスイントロンκエンハンサー(miEκ)、及びN128L軽鎖可変領域及び定常領域を含有するDNA断片を、Genscriptで合成した。カッパ遺伝子座中のVκとJκ領域の間の1kb断片及びマウスκ定常領域(Cκ)とマウス3'κエンハンサー(m3'Eκ)の間の1kb断片を、N128Lノックインカセットをターゲティングするための相同アームとして使用した。ターゲティングの成功後、マウスCκを含むカッパ対立遺伝子DNAを、N128Lノックインによって置き換えた(図1)。
EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pAベクターを、NotI及びAscIで消化した。3.6kb断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAquick(商標)PCR精製Ki(QIAGEN)を使用して精製した。pUC57_N128L_KIベクターを、NotI及びAscIで消化した。7.9kb断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAquick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。NotI-AscI-消化EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pA及びpUC57_N128L_KI断片を、添付の指示マニュアル中に記載される方法に従いT4リガーゼ(New England Biolabs)を使用してライゲーションした。大腸菌DH10B株(ElectroMax(商標)DH10B(Invitrogen))を、ライゲーション溶液で形質転換した。それぞれのプラスミドDNAを、QIAprep(商標)Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を使用して、得られたアンピシリン耐性クローンから単離した。生じたそれぞれのアンピシリン耐性形質転換体を、サンガーシークエンシングによって挿入を有することを確認した。
pUC57_N128L_EF1α_Puro_2A_EGFP_SV40pAターゲティングベクターに関して、プラスミドDNAを、添付の指示マニュアル中に記載される方法によってQIAprep Maxi plus Kit(商標)(QIAGEN)を使用してシークエンシング検証クローンから単離した。それぞれのプラスミドDNAを、サンガーシークエンシングによって挿入を有することを確認した。
N128LノックインマウスES細胞株の生成
2.1 マウスES細胞の調製
2つの独立のマウス胚性幹細胞(ES)株からの細胞を、エレクトロポレーションのためにSTOフィーダープレートで増殖させた。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。ノックイン構築物を、エレクトロポレーションを使用して導入した。
標的化ES細胞を、C57BL6株胚盤胞にインジェクションした。インジェクション後、胚盤胞を、インジェクション前に3日間、精管切除した雄とつがいにしたC57BL6株F1ハイブリッド雌の子宮に移した。キメラ胚を、軽鎖ノックインを含む子に発生する偽妊娠レシピエントにおいて出産予定日まで発生させた。
共通軽鎖マウス
共通軽鎖ノックイン対立遺伝子及びIgH遺伝子座に機能的な再構成されていないヒトVH領域を有する八匹のキメラマウスを、ヒト TargetXで免疫した。
SYVLTQPPSVSVAPGETARITCGGDNIGRKSVYWYQQKSGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDGSSDHWVFGGGTKLTVL
IGHV1-3*01、IGHV1-8*01、IGHV1-18*01、IGHV1-46*03、IGHV3-7*01、IGHV3-9*01、IGHV3-11*01、IGHV3-15*01、IGHV3-20*d01、IGHV3-21*03、IGHV3-23*04、IGHV3-30*18、IGHV3-33*01、IGHV3-48*02、IGHV3-53*01、IGHV4-4*02、IGHV4-31*03、IGHV4-34*01、IGHV4-39*01、IGHV4-59*01、IGHV4-61*01、IGHV5-51*01、IGHV6-1*01及びIGHV7-4-1*01。
マウスES細胞ターゲティングのための共通軽鎖ターゲティングベクターの構築
更なる共通軽鎖マウスは、以下の通り作られた。
共通軽鎖ターゲティングベクターの生成
野生型ヒトVλプロモーター(pVλ)及びシグナルペプチド(SP)、マウスイントロンκエンハンサー(miEκ)、及びヒト軽鎖可変領域及び定常領域をコードするヌクレオチド配列を含有するDNA断片を合成した。軽鎖可変ドメインは、以下に使用されるTarget Y以外の標的(Target Z)に対し特異性を有する。VκとJκ(1-5)の間の1kb断片及びマウスκ定常領域(Cκ)とマウス3'κエンハンサー(m3'Eκ)の間の1kb断片を、共通軽鎖ノックインカセットをターゲティングするための相同アームとして使用した。ターゲティングの成功後、ヒトJκ(1-5)及びマウスCκは、共通軽鎖ノックインカセットによって1つ又は両方の対立遺伝子を置き換えられる。
2つの独立のマウス胚性幹細胞(ES)株からの細胞を、エレクトロポレーションのためにSTOフィーダープレートで増殖させた。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。
継代前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。継代前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量のM15培地を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞 懸濁液に解離させた。
凍結前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。凍結前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量の2X凍結培地(新たに調製した60%DMEM、20%FBS、20%DMSO)を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞懸濁液に解離させた。96ウェルプレートを、密封し、-80℃フリーザー内でポリスチレンボックスに配置して非常に緩徐な凍結プロセスを促進させた。
ES細胞をPBS緩衝液で二回洗浄し、プロテイナーゼK(1mg/mL)を有する50μLのES細胞溶解緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5、10mM EDTA、0.5%SDS、10mM NaCl)を96ウェルプレートの各ウェルに付加した。プレートを、密封し、ウェットティッシュで包み、ランチボックスに配置した。ランチボックスを一晩55℃でインキュベートした。
凍結した96ウェルプレートを、-80℃フリーザーから取り出し、プレートのすべてのウェルが透明になるまで37℃インキュベーター中で解凍した。2mLの新鮮なM15培地を、24ウェルSTOフィーダープレートの各ウェルに付加した。96ウェルプレートの所望のウェルからの全ての内容物を、24ウェルプレートのウェルに移した。全ての標的化クローンを24ウェルプレートに移した後に、プレートをTCインキュベーター中37℃で培養した。ES細胞は、それらが顕微鏡下で80%から85%集密に到達するまで新鮮なM15培地を与えられた。それらがコンフルエントになったら、それらを1:1で6ウェルSTOフィーダープレートに継代し、マイクロインジェクションのために凍結した。
マウスES細胞を、解凍し、インジェクション前に増殖させた。インジェクション前二時間、ES細胞は新鮮なM15培地を与えられた。インジェクション前、ES細胞を、PBS緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを付加することによってプレートから解離させた。37℃で20分間インキュベーション後、トリプシンを、同じ容量の新鮮なM15培地を付加することによって不活化した。ES細胞を、繰り返しピペッティングすることによって単一細胞懸濁液に解離させ、インジェクションのために氷上に置いた。
Target Yに対する抗体の産生
免疫
共通軽鎖キメラマウスを、以下に記載の通りTarget Yで免疫した。第一の免疫として、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、40μg/頭のTarget Yを、皮下に投与した。四週後、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、5μg/頭のTarget Yを、腹腔内注射によって投与した(第一の追加免疫)。一週後、四匹のマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。第一の追加免疫後四週、CpG(Sigma)及びAlum(1:1抗原)によってエマルジョン化した、2μg/頭のTarget Yを、別の四匹のマウスに腹腔内注射によって投与した(第二の追加免疫)。一週後、これらのマウスを屠殺し、脾臓を摘出した。
採取及び処理した脾臓組織を、20mLの3%FBS/PBS中に再懸濁した。細胞を、40℃で10秒間、300gでペレット化し、300μlの3%FBS/PBS緩衝液中に再懸濁した。
20ulのFcブロッカーを、10秒間付加し、使用前4℃で保管した。
BCT技術は、本明細書中に参照によって組み込まれる、WO2015/040401に一般に記載される。
抗体発現及び精製のより詳細については実施例6及び7を参照されたい。
混合物1: 1ウェル当たり25μlのB細胞ブリッジ産物+55μlのRSM+100ngのPBase
混合物2: 1μlのExpiFectamine(商標)293(Invitrogen)+79μlのRSM
抗体の発現
哺乳動物の一過性発現システムにより、タンパク質の可動性及び急速な産生を可能にする。それらは、ヒト又は他の哺乳動物タンパク質の発現について理想的であり、その理由は、これらのシステムが、よりネイティブなフォールディング及び翻訳後修飾を有する組換えタンパク質を生成するからである。
1. トランスフェクションの前日、Expi293細胞を、自動細胞カウンター(Eve細胞カウンター)で計数し、約1.7x106細胞/mlの密度で予め温めた発現培地に播種し、回転振盪機インキュベーター(37℃、8%CO2、140rpm)中で一晩インキュベートした。
2. トランスフェクションの日、細胞を計数し、細胞数を2.5x106細胞/mlに調整した。2000μlの細胞懸濁液を、24ディープウェルプレートに分配し、Kuhner振盪培養器(37℃、8%CO2、225rpm)に配置した。
プラスミドDNAを含有する混合溶液を、Expi293細胞のトランスフェクションのために調製した。2mLの細胞培養に関して、各1μgの重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを使用した。超純水中に希釈された2μgのDNAプラスミド混合物を、各トランスフェクションについて使用した。
トランスフェクション
混合物1: 40μlのOpti-MEM(登録商標)I培地中に希釈した2μgのプラスミドDNA。
混合物2: 80μlのExpiFectamine(商標)293トランスフェクション試薬+40μlのOptiMEM I培地の2つの混合物を調製した。
混合物2を、混合物1と組み合わせ、室温で20-30分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、165μlのDNA-ExpiFectamine(商標)293試薬複合体を、24ディープウェルプレートの各ウェルに分配した。細胞を、Kuhner振盪培養器(37℃、8%CO2、225rpm)において6日間インキュベートした。細胞培養上清を、トランスフェクション後6日で採取した。
共通軽鎖マウスからの抗体の精製
96ウェルプレート精製を採用して、Expi293F細胞培養上清から抗体を精製した。この方法により、抗体スクリーニング実験における複数サンプルの急速なスモールスケールの親和性抗体精製が可能になる。高い回収%を達成するために、MabSelect Sure LX(商標)が使用される、これはプロテインA親和物であり、非常に動的な結合活性(60mgのヒトIgG/ml培地)、長時間の滞留時間、アルカリ寛容性及び低いリガンド漏出性を有する。
1. MabSelect Sure LX樹脂(GE Healthcare)を、1X PBS(Gibco)中に平衡化して、貯蔵緩衝液を除去して、10%スラリーの最終濃度とした。
2. 600μlの10%スラリーが、96ウェルプレート AcroPrep(商標)Advance(Pall)の各ウェルに付加される。
3. 樹脂を、70x rcfで1分、4℃で遠心分離した。
4. 樹脂を、300μlの1X PBSで洗浄し、70x rcfで1分スピンした。この工程を、二回反復した。
5. 2mlの細胞培養上清(pH7-8)を、96ウェル精製プレート中のMabSelect Sure LX樹脂にローディングし、70-100x rcfで1分間遠心分離した。
6. プレートを、600μlの1x PBSを使用して洗浄し、70-100x rcfで1分間遠心分離した。この工程は、全体で四回実施された。
7. 70μlの溶出緩衝液(IgG Elute Pierce)を、各ウェルに付加し、1分インキュベートした。
8. プレートを、70-100x rcfで1分間遠心分離して溶出液を採取した。この工程は、全体で二回実施された。
抗原Yに対する抗体のSPR分析
実験の目的
SPR分析を実施して、Target Yに対するHit 1(すなわち、本発明者らの共通軽鎖マウスからのラムダタイプ抗体)の相互作用の結合親和性及び動力学を決定した。精製された抗体の親和性及び動力学を、ベンチマーク及びアイソタイプ対照(ISTC)と比較した。
表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して抗原Yに対する結合親和性(KD)を決定した(動力学定数 オン率(kon)及びオフ率(koff))。Biacore 8K(GE Healthcare)システムを使用して分析を実施した。
実施例7からの精製された単一特異性抗体(リガンドと呼ばれる)を、およそ2ug/mlで抗ヒトIgG Fc CM4表面に捕捉した。リガンドを、全8フローチャネルの全てのアクティブチャネル中に10ul/分で60秒間インジェクションした。この実施を、ランニング緩衝液として中性pHのHBS-P 1X+CaCl2 2.5mMを使用して25℃で実施した。
ベンチマーク1:抗体 抗抗原Y
ベンチマーク2:抗体 抗抗原Y
NB:結合観察されず
hIgG4PE ISTC:ヒトアイソタイプ対照IgG4
Hit 1抗体は、IgG4PE形式であった。
Hit 1は、表2に提供される親和性レンジ中で抗原Yに対する結合及び抗原Yに対する速い会合(kon)及び解離(koff)率を示した。抗原Yに対する結合は、ISTCで観察されなかった。
Hit 1抗体は、ベンチマーク抗体と比べて抗原Yに対して類似する動力学速度及び結合親和性を示す。これにより、本発明者らの共通軽鎖マウスが、望ましい結合動力学で標的抗原に特異的に結合するヒト可変ドメインを有する抗体を生成することができることが示される。
共通軽鎖マウスからのB細胞集団の分析
本発明者らは、本発明のマウスのB細胞コンパートメントを分析した。結果は、以下の通り図5から図9に示される。「標的化Rag-/-」マウスは、操作されたES細胞に由来する、実施例4に記載された通り産生されたマウスである。したがって、マウスのゲノムは、再構成されたヒトラムダ軽鎖ノックイン及びIgH遺伝子座によって含まれる再構成されていないヒト重鎖可変領域を含んでいた。
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似する全生存脾臓細胞数を有していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後の全生存脾臓細胞数。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウスは、低い全生存脾臓細胞数を提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウスは、野生型マウス(野生型)と比較して、類似するCD19陽性、B220陽性B細胞数を有していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後の全脾臓B細胞数。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小の全B細胞(CD19+/B220+)数を提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて二回の抗原追加免疫)後のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージ。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージを提示した。標的化Rag-/-、標的化ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中のCD19陽性、B220陽性の脾臓B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて一回又は二回いずれかの抗原追加免疫)後のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージ。対照として、未免疫Rag-/-欠損マウス(Rag-/-ナイーブ)は、最小のCD19陽性、B220陽性脾臓B細胞集団パーセンテージを提示した。標的化Rag-/-、標的化操作ES細胞及びRag-/-欠損胚盤胞に由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス;Rag-/-ナイーブ、未免疫Rag-/-欠損マウス。
標的化ES細胞(標的化Rag-/-)でマイクロインジェクションされたRag-/-胚盤胞から生成されたキメラマウス中の抗原陽性IgG B細胞集団パーセンテージは、野生型マウス(野生型)と類似していた。未開示抗原(Target Y)での免疫化(初回抗原刺激、続いて一回又は二回いずれかの抗原追加免疫)後の抗原陽性、CD19陽性又はB220陽性、IgM陰性及びIgD陰性脾臓B細胞集団パーセンテージ。標的化Rag-/-、標的化操作ES細胞及びRag-/-欠損マウスに由来するキメラマウス;野生型、野生型マウス。
Rag-/-欠損胚盤胞にマイクロインジェクションされた操作されたES細胞に由来する「標的化Rag-/-」キメラマウスは、野生型マウスと類似する様式で、初回抗原刺激及び一回又は二回いずれかの抗原追加免疫後にIgM陰性、IgD陰性、抗原陽性脾臓B細胞を産生した。比較して、非キメラRag-/-欠損マウスは、脾臓B細胞を産生しなかった。これらの観察は、Rag-/-胚盤胞にマイクロインジェクションされた操作されたES細胞から生成されたマウスが、機能的な免疫応答を有し、免疫化計画に応答して、抗原陽性IgG B細胞を生成するとの本発明者らの観察を支持している。
イントロダクション
抗原Yでの免疫化後、前記抗原に特異的なクラススイッチした抗体を発現する脾臓B細胞を、処理し、単一細胞をソーティングした。標的化Rag-/-キメラマウスを、機能的な免疫システムの証拠について分析し、野生型対照マウスと比較した。また追加の比較を非キメラRag-/-マウスに対して行い、最小のベースライン免疫応答が実証された。
サンプルの処理:
免疫化マウスから脾臓を、除去し、無菌的な手順を使用する40μm細胞ストレーナーを使用して均質化した。細胞を遠心分離(350rcfで10分間、4℃)によってペレット化し、上清を慎重に吸引した。赤血球を1mlのACK溶解緩衝液を使用する溶解によって除去し、2分間、室温でインキュベートした。溶解反応を、過剰の3%FBS/RPMI緩衝液を付加することによって終了させた。引き続いて、細胞を、40μm細胞ストレーナーを使用して濾過し、以前の通りペレット化し、340μl緩衝液に再懸濁した。処理した細胞において発現された任意のFc受容体を、ブロックし、B細胞の非特異的な染色を除去し、Fcブロッカーを使用して抗体媒介性の特異的な染色を維持した。この段階で、全細胞数を取得した。
脾臓から調製した単一細胞懸濁液を、以下の様式で染色した。成熟し、クラススイッチしたB細胞脾臓集団を、BUV395-コンジュゲート抗CD45R(選択)、BUV395-コンジュゲート抗CD19(選択)、BV786-コンジュゲート抗IgM(枯渇)及びBV605-コンジュゲート抗IgD(枯渇)を使用して規定した。B細胞以外の細胞、例えば、好中球及び単球、CD8陽性T細胞、マクロファージ、CD4陽性T細胞及び樹状細胞を、それぞれ、APCCy7-コンジュゲート抗Ly-6G/C、APC-H7-コンジュゲート抗CD8a、APCCy7-コンジュゲート抗F4/80、APC-H7-コンジュゲート抗CD4及びAPC-Cy7-コンジュゲート抗CD11cを使用して除外した。抗原陽性集団を、Alexa-647で標識された免疫化に使用された同じ抗原を使用して同定した。生存可能ではない細胞を、7-AADを使用して除外した。細胞の抗原-未標識対照プールを生じさせて、FMO(Fluorescence Minus One)が誘導されることを可能にした。追加の陽性染色対照及び7AAD(生/死)対照も取った。全ての染色反応を、3%FBSを有する100μlのPBS中の1×106細胞を使用して4℃で20分インキュベートした。サンプルを、3%FBSを有する400μlのPBS中で二回洗浄し、BD FACSAria Fusionフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。全ての獲得されたデータを、Flow-Jo(商標)ソフトウェアを使用して分析した。所望の細胞は、RNA溶解緩衝液を含有する96ウェルプレートに直接的にソーティングされた単一細胞であった。次に、サンプルを、B-Cell Technology(BCT)を使用して処理した。
Claims (74)
- 抗体軽鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)軽鎖イントロンエンハンサー;
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;及び
(c)軽鎖Cドメインをコードする抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。 - 遺伝子座がカッパ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがEiκである、請求項1に記載の細胞。
- 細胞がマウス細胞であり、遺伝子座がラムダ軽鎖遺伝子座であり、エンハンサーがマウスラムダ2-4又は4-10エンハンサーである、請求項1に記載の細胞。
- (a)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCκであり;
(b)再構成されたVドメインがVκであり、CドメインがCλであり;
(c)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCλであり;又は
(d)再構成されたVドメインがVλであり、CドメインがCκである、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞。 - 抗体重鎖遺伝子座(第一の遺伝子座)を含み、遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)重鎖イントロンエンハンサー(Eμ);
(b)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域;
(c)任意選択のスイッチ配列;及び
(d)重鎖CH1ドメインをコードする抗体重鎖定常領域
を含み、遺伝子座が、(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記CH1ドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、細胞。 - 遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(c)前記イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)前記抗体軽鎖定常領域
を含み、遺伝子座は、(NからC末端方向に)前記可変ドメインのアミノ酸配列に融合された前記シグナルペプチド配列をコードするRNA転写物を発現するように作動可能である、請求項1から5のいずれか一項に記載の細胞。 - ES、iPS、ハイブリドーマ又はB細胞である、請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞。
- 再構成されたVドメインが、カッパ又はラムダVドメインである、請求項1から7のいずれか一項に記載の細胞。
- 可変領域が第一の所定の抗原又は第一のエピトープに対する結合特異性を有するVドメインをコードし、遺伝子座が前記特異性を保持するVドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である、請求項1から8のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が、第二の抗体鎖を発現するように作動可能である第二の抗体遺伝子座を含み、第二の鎖が、第一の再構成されたVドメインと共に結合部位を形成する第二の再構成されたVドメインを含み、結合部位が所定の抗原又はエピトープに特異的に結合可能である、請求項1から9のいずれか一項に記載の細胞。
- 所定の抗原が互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なり;又はエピトープが互いに異なり、前記他の及び第二のVドメインが異なる、請求項9に従属する場合の請求項10に記載の細胞。
- (a)第一のドメインがVLドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVHドメインであり;又は
(b)第一のドメインがVHドメインであり、第二の及び前記他のVドメインがVLドメインである、請求項11に記載の細胞。 - 可変領域がエンハンサーの3'に、0.5kb内にある、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞。
- 遺伝子座が定常領域の3'にある第二のエンハンサーを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が非ヒト哺乳動物、マウス、ラット又はげっ歯類細胞である、請求項1から14のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記定常領域が細胞の内因性抗体遺伝子座にある、請求項1から15のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記内因性遺伝子座が内因性カッパ鎖遺伝子座である、請求項1に従属する場合の請求項16に記載の細胞。
- 前記内因性遺伝子座が内因性重鎖遺伝子座である、請求項5に従属する場合の請求項16に記載の細胞。
- 遺伝子座が、内因性抗体遺伝子座の外側の位置で細胞のゲノムによって含まれる導入遺伝子によって含まれる、請求項1から15のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞が前記遺伝子座に関してホモ接合性である、請求項1から19のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞ゲノムが第二の抗体遺伝子座を含み、第二の遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(a)1つ又は複数のVH遺伝子セグメント;
(b)1つ又は複数のDH遺伝子セグメント;
(c)1つ又は複数のJH遺伝子セグメント;及び
(d)1つ又は複数のCHドメインをコードする重鎖定常領域を含む、再構成されていない抗体重鎖遺伝子座であり;
重鎖遺伝子座が、任意選択で複数の抗原特異性又は親和性を含む、複数の重鎖を発現するように作動可能であり、各前記重鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、請求項1に従属する場合の請求項1から20のいずれか一項に記載の細胞。 - 細胞が1つ又は複数の更なる抗体遺伝子座を含み、各更なる遺伝子座が、軽鎖を発現可能であり、各前記軽鎖は、第一の遺伝子座によってコードされる抗体鎖と対合可能で、抗原結合部位を含む対合した鎖を産生する、請求項5に従属する場合の請求項1から20のいずれか一項に記載の細胞。
- 各可変領域又は遺伝子セグメントがヒトである、請求項1から22のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞がマウス細胞であり、各定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である、請求項1から23のいずれか一項に記載の細胞。
- 各前記エンハンサーが細胞の内因性エンハンサーである、請求項1から24のいずれか一項に記載の細胞。
- 細胞がマウス細胞であり、各前記エンハンサーがマウスエンハンサーである、請求項1から25のいずれか一項に記載の細胞。
- (a)細胞がマウス細胞であり、可変領域がヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーが細胞の内因性抗体遺伝子座でのマウスイントロンエンハンサーであり、前記定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である;又は
(b)細胞がラット細胞であり、可変領域がヒト可変領域であり、イントロンエンハンサーが細胞の内因性抗体遺伝子座でのラットイントロンエンハンサーであり、前記定常領域がマウス、ラット又はヒト定常領域である、請求項1から26のいずれか一項に記載の細胞。 - 再構成された可変領域が、
(a)ヒトIGLV3-21及びIGLJ3の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGLV3-21プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(b)ヒトIGK1-39及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV1-39プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(c)ヒトIGK3-20及びIGKJ1又は5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列IGKV3-20プロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている;
(d)ヒトVpreB及びJλ5の再構成であり、任意選択でヒト生殖系列VpreBプロモーター及び/又はシグナルペプチドコードヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項1から27のいずれか一項に記載の細胞。 - 請求項1から28のいずれか一項に記載の複数の細胞を含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
- 前記脊椎動物の生殖系列が、請求項1から28のいずれか一項に規定される、第一の遺伝子座(及び任意選択で第二の遺伝子座)を含む、請求項29に記載の脊椎動物。
- 脊椎動物が、前記細胞と第一の遺伝子座を含まない複数の他の細胞のキメラであり、脊椎動物の生殖系列が前記第一の遺伝子座を含まない、請求項29に記載の脊椎動物。
- 第一の複数の細胞及び第二の複数の細胞を含み、第一の複数の細胞が同じ第一の同一の抗体遺伝子座を含み、第二の複数の細胞が同じ追加の同一の抗体遺伝子座を含み、各前記抗体遺伝子座が、請求項1から28のいずれか一項に規定の第一の遺伝子座の通りであり、脊椎動物が、前記第一の同一の遺伝子座からの第一の複数の抗体鎖及び前記追加の遺伝子座からの第二の複数の抗体鎖を発現可能であり、並びに第一の細胞の抗体遺伝子座が、第二の細胞の抗体遺伝子座と異なる、請求項29から31のいずれか一項に記載の脊椎動物。
- 脊椎動物が第三の複数の細胞を含み、第三の複数の細胞が同じ更なる抗体遺伝子座を含み、更なる遺伝子座が請求項1から28のいずれか一項に規定され且つ第一及び第二の細胞の前記抗体遺伝子座と異なり、脊椎動物が、更なる遺伝子座からの第三の複数の抗体鎖を発現可能である、請求項32に記載の脊椎動物。
- 脊椎動物が、前記細胞と請求項1から28のいずれか一項に規定の第一の遺伝子座又は前記追加の又は更なる遺伝子座を含まない複数の他の細胞のキメラである、請求項32又は33に記載の脊椎動物。
- 抗体軽鎖レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも95%純粋である、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
- レパートリーが、単一の再構成されたVLドメイン種に関して少なくとも99%純粋である、請求項35に記載の脊椎動物。
- 軽鎖レパートリーの軽鎖の残りが、前記VLドメイン種の変異体を含む、請求項35又は36に記載の脊椎動物。
- トランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、脊椎動物の抗体軽鎖レパートリーの全てのVLドメインの少なくとも95%が、脊椎動物のゲノムによって含まれる同じ軽鎖可変領域配列によってコードされる、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
- 前記組換えに由来する全てのVLドメインの少なくとも99%が、同じVLアミノ酸配列を含む、請求項38に記載の脊椎動物。
- 請求項1から28のいずれか一項に規定の複数の第一の遺伝子座を含む、請求項29から39のいずれか一項に記載の脊椎動物の複数の脾臓、骨髄、B細胞又は血液細胞。
- 脾臓、骨髄、B細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞又は血液細胞の集団であって、各細胞が請求項1又は請求項1に従属する場合の請求項2から28のいずれか一項に規定され;任意選択で、細胞が少なくとも10の異なる抗体種を発現し、
(a)少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含み;又は
(b)抗体が、第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含み、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、集団。 - 集団によって含まれる少なくとも95%の抗体が同じ軽鎖VLドメインを共有し、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
- 第一のVL遺伝子セグメント及び第一のJL遺伝子セグメントの組換えに由来するVLドメインを含むポリクローナル抗体集団であって、前記組換えに由来する全ての前記VLドメインの少なくとも95%が、同じVLアミノ酸配列を含み、集団が少なくとも10の異なるVHドメイン種を含む、ポリクローナル抗体集団。
- 抗体、抗体可変ドメイン、抗体若しくは抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は抗体若しくはドメインを発現可能である発現ベクター若しくは宿主細胞を同定する若しくは得るための方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)請求項41に記載の細胞集団又は請求項42若しくは43に記載の抗体集団を、前記抗原と接触させる工程;
(b)前記集団によって発現される又は含まれる抗体を前記抗原に結合させる工程;及び
(c)抗原に結合する1つ又は複数の抗体を単離する又は同定する工程、又は前記1つ又は複数の抗体のVH及び/又はVLドメインを単離する又は同定する工程;又は前記VH又はVLをコードするヌクレオチド配列を同定する工程;及び
(d)任意選択で、
(i)同定された前記抗体又はドメインを、それをコードするヌクレオチド配列と相関させ、それによって、前記配列を同定する工程;
(ii)前記配列を増幅する工程及びコードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程;及び
(iii)任意選択で、前記抗体又はドメインを発現させる工程及び単離する工程
を含み、工程(i)及び(ii)は、任意の順序で実施することができる、方法。 - 同定された抗体のVH及びVLドメインをコードするVH及びVLヌクレオチド配列を増幅する方法を使用する工程を含み、VH及びVLヌクレオチド配列を、VH及びVLの共発現のためにベクター又は細胞に挿入して、抗原に結合可能な対合したVH/VL結合部位を生成する工程、及び結合部位を発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を更に含む、請求項44に記載の方法。
- VHドメインの更なる種の存在下でVH及びVLを発現させる工程を含み、VL及び更なるVHが、更なる抗原に結合可能な更なる対合したVH/VL部位を形成し、更なる抗原及び請求項45に記載された抗原が異なり、方法が、結合部位を共発現させる工程(及び任意選択で単離する工程)を含み、結合部位が、ベクター又は細胞によってコードされる二重特異性抗体によって含まれ、二重特異性抗体が、各前記抗原に対するそれぞれの結合部位を含む、請求項45に記載の方法。
- 二重特異性抗体が、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む4鎖抗体であり、
(a)第一及び第二の対における軽鎖が、前記VLドメインを含み、
(b)第一の対の重鎖が、請求項45に記載されたVHドメインを含み、VHドメインが、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成し、及び結合部位が、請求項45に記載された前記抗原に特異的に結合可能であり;
(c)第二の対の重鎖が、前記VLドメインとVH/VL結合部位を形成する、前記更なるVHドメインを含み、及び結合部位が、請求項46に記載された前記更なる抗原に特異的に結合可能である、請求項46に記載の方法。 - 各4鎖抗体が変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進し;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、請求項47に記載の方法。
- 請求項42又は43に記載のポリクローナル抗体集団を発現する複数のB細胞、ハイブリドーマ、CHO細胞、HEK細胞、MEF細胞、COS細胞、HeLa細胞。
- VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を請求項41又は47に規定の細胞から得る工程及び工程(d)(i)において、ヌクレオチド配列を使用して、その1つ又は複数と、抗原を結合する前記抗体の1つ又は複数のVH及び/又はVLドメインとを相関させる工程を含む、請求項44から48のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体又は抗体可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を得るための方法であって、抗体若しくはドメインが、標的抗原に特異的に結合可能であり、方法が、
(a)VL及び/又はVHコードヌクレオチド配列を請求項41又は47に規定の細胞から得る工程;
(b)前記配列を増幅する工程;及び
(c)任意選択で、コードされる抗体又はドメインの発現のために配列を発現ベクター又は宿主細胞ゲノムに挿入する工程
を含む、方法。 - 抗原に特異的に結合する抗体の産生のための、抗体産生細胞株を得るための方法であって、VH及びVLコードヌクレオチド配列を、宿主細胞のゲノムに挿入する工程を含み、
(a)各VH配列が、VH及びCドメインを含む細胞による重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入され;
(b)各VL配列が、VL及びCドメインを含む細胞による軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入され;
(c)発現される重鎖が、軽鎖と対合可能で、重鎖-軽鎖対を産生し、各対が、抗原に結合可能なVH/VL結合部位を含み;及び
(d)VH及びVLコードヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及びVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。 - 第一及び第二のVHコードヌクレオチド配列を細胞ゲノムに挿入する工程を含み、
(a)第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;
(b)第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;及び
(c)第一及び第二の抗原が、異なり;
第一及び第二の重鎖及び軽鎖が、対合可能で、第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含む二重特異性4鎖抗体を産生し、
(d)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み;及び
(e)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHドメインを含む、請求項52に記載の方法。 - 二重特異性4鎖抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)(i)第一の細胞ゲノムに前記第一のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第一のVH及びCドメインを含む第一の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第一の重鎖を発現する第一の細胞株を産生する工程によって第一の重鎖を発現可能な第一の細胞株を産生する工程;
(d)(i)第二の細胞ゲノムに前記第二のVHをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VH配列が、第二のVH及びCドメインを含む第二の重鎖の発現のために抗体重鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して第二の重鎖を発現する第二の細胞株を産生する工程によって第二の重鎖を発現可能な第二の細胞株を産生する工程;
(e)第一の重鎖を第一の細胞株から、及び第二の重鎖を第二の細胞株から発現させる工程及び前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(iii)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(iv)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(v)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程
を含み、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。 - (a)(i)第三の細胞ゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び(ii)細胞を培養して軽鎖を発現する第三の細胞株を産生する工程によって軽鎖を発現可能な第三の細胞株を産生する工程;
(b)軽鎖を第三の細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、請求項54に規定の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、請求項54に記載の方法。 - (a)第一及び/又は第二の細胞又は細胞株のゲノムに前記VLをコードするヌクレオチド配列を挿入する工程であって、VL配列が、VL及びCドメインを含む軽鎖の発現のために抗体軽鎖定常領域の5'に作動可能に挿入される工程;及び
(b)軽鎖をVH配列を含む細胞株から発現させる工程であって、軽鎖が、請求項54に規定の工程(e)の軽鎖である工程
を含む、請求項54に記載の方法。 - 前記鎖を混合する工程が、細胞株を共培養する工程によって実施される、請求項54、55又は56に記載の方法。
- 前記鎖を混合する工程が、細胞株によって発現される鎖を単離する工程及び単離された鎖を一緒に混合する工程によって実施される、請求項54、55又は56に記載の方法。
- 二重特異性4鎖抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第一及び第二の抗原に対する、それぞれの結合部位を含み、抗原が互いに異なり、各抗体が第一の重鎖-軽鎖対及び第二の重鎖-軽鎖対を含み、
(a)第一の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第一のVHを含み、第一のVH(第一の重鎖の一部として発現される場合)が、VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第一の抗原に特異的に結合可能な第一のVH/VL結合部位を形成し;及び
(b)第二の重鎖-軽鎖対の重鎖が、第二のVHを含み、第二のVH(第二の重鎖の一部として発現される場合)が、前記VL(軽鎖の一部として発現される場合)と対合可能で、第二の抗原に特異的に結合可能な第二のVH/VL結合部位を形成し;
方法が、
(c)前記第一のVHを含む第一の重鎖、前記第二のVHを含む第二の重鎖及び前記VLを含む軽鎖を一緒に混合する工程であって、それによって、(i)第一の重鎖が、軽鎖と対合して前記第一の重鎖-軽鎖対を産生し、(ii)第二の重鎖が、軽鎖と対合して前記第二の重鎖-軽鎖対を産生し;及び(iii)第一の重鎖-軽鎖対が、第二の重鎖-軽鎖対と対合し、それによって、前記二重特異性抗体を産生する工程を含み、
VH及び/又はVLが、VH及び/又はVLコードヌクレオチド配列によってコードされ、ヌクレオチド配列が、請求項41又は47に規定の1つ又は複数の細胞のVH及び/又はVLコードヌクレオチド配列の配列である、方法。 - 各4鎖抗体が変異型重鎖定常領域を含み、第一及び第二の重鎖-軽鎖対の重鎖の対合を促進し;任意選択で、変異がノブ-イン-ホール変異又は荷電対合変異である、請求項54から59のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防するための医薬組成物を産生するための方法であって、
(a)抗体を請求項52又は53に記載の方法によって産生される細胞株から発現させる工程;及び
(b)抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程
を含み、
(c)任意選択で、抗体が、請求項54から60のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体と同一である、方法。 - ヒト又は非ヒト動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防するための医薬組成物を産生するための方法であって、二重特異性抗体を希釈剤又は賦形剤と混合する工程を含み、抗体が、請求項54から60のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体と同一である、方法。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載の細胞又は請求項29から39のいずれか一項に記載の脊椎動物を産生するための方法であって、
(a)再構成された抗体Vドメインをコードする再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程;及び
(b)可変領域又はそのコピーを細胞のゲノムに挿入し、それによって、可変領域が前記ゲノム中の抗体遺伝子座によって含まれる工程であって、
遺伝子座が(5'から3'方向に)、
(c)抗体遺伝子座イントロンエンハンサー;
(d)前記再構成された抗体可変領域;及び
(e)抗体Cドメインをコードする抗体定常領域
を含み、遺伝子座が(NからC末端方向に)前記再構成されたVドメイン及び前記Cドメインを含む抗体鎖を発現するように作動可能である工程;及び
(f)任意選択で、細胞が非ヒト脊椎動物ES細胞又はiPS細胞であり、方法が、請求項29から39のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物を細胞から生成する工程を更に含む、方法。 - 可変ドメインがVLであり、CドメインがCLである、請求項63に記載の方法。
- 前記挿入する工程が、細胞の染色体DNAとの相同組換え又は部位特異的組換えを使用して実施される、請求項63又は64に記載の方法。
- (5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む導入遺伝子を得る工程;及び
前記導入遺伝子を細胞のゲノムに挿入し、それによって、前記抗体遺伝子座が、細胞によって含まれる工程
を含む、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可変領域を、
(a)細胞ゲノムの軽鎖遺伝子座のCLとイントロンエンハンサーとの間;又は
(b)細胞ゲノムの重鎖遺伝子座のCμとイントロンエンハンサー(Eμ)との間
に挿入する工程を含む、請求項63から65のいずれか一項に記載の方法。 - 可変領域が、所定の抗原に特異的に結合する抗体のVドメインをコードする、請求項63から67のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項63に記載された再構成された抗体可変領域を含む核酸を得る工程が、
(a)請求項68に記載された前記抗体を発現する更なる細胞を得る工程;
(b)i.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む、更なる細胞のDNA配列を得る又はコピーする工程;又は
ii.Vドメインをコードする再構成された可変領域配列を含む更なる細胞のRNA配列を得る又はコピーする工程、及び前記RNA配列のDNAコピーを生じさせる工程
を含み、それによって、前記核酸を得る、請求項68に記載の方法。 - 結果として生じる細胞を培養して、複数の細胞を産生する工程を含み、各細胞が請求項1から28のいずれか一項に記載される、請求項63から69のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載の又は請求項63から70のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、ES又はiPS細胞を移植された非ヒト脊椎動物胚盤胞又は前桑実胚。
- 請求項66に記載の方法に使用するための導入遺伝子を含み、導入遺伝子が(5'から3'方向に)、
(a)前記イントロンエンハンサー;
(b)前記再構成された抗体可変領域;及び
(c)前記抗体定常領域
を含む、核酸。 - 請求項67に記載の方法に使用するための再構成されたVドメインをコードする再構成された可変領域配列を含み、
(a)細胞ゲノムの第一のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが5'に隣接する、及び/又は
(b)細胞ゲノムの第二のヌクレオチド配列にハイブリダイズするための相同アームが3'に隣接する
前記再構成された可変領域配列を含み;
(c)5'相同アームが、細胞の抗体軽鎖遺伝子座の配列であって、そのCL領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサーの3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能とし、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCL領域を含む遺伝子座を産生する;又は
(d)5'相同アームが、細胞の重鎖抗体遺伝子座の配列であって、そのCμ領域の5'にある配列に相同的であり、及び3'相同アームが、前記遺伝子座の配列であって、遺伝子座のイントロンエンハンサー(Eμ)の3'にある配列に相同的であり、それによって、相同アームと細胞のゲノムの間の相同組換えが、可変領域配列を挿入可能とし、それによって、(5'から3'方向に)、イントロンエンハンサー、前記可変領域及びCμ領域を含む遺伝子座を産生する、核酸。 - 核酸又は5'相同アームが(5'から3'方向に)、
(a)可変領域の転写を促進する作動可能なプロモーター;
(b)可変ドメインシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列;及び
(c)任意選択で、前記イントロンエンハンサー配列
を含み、可変領域配列が細胞ゲノムに挿入される場合、可変領域が、(NからC末端方向に)シグナル配列-Vドメイン-Cドメインを含む抗体鎖の発現のために、プロモーター及びシグナルペプチドコード配列の3'に作動可能に連結するように挿入される、請求項73に記載の核酸。
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