CN104250291B - 改变细胞命运的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了改变细胞命运的方法，构建体，用于改变细胞异染色质蛋白HP1a在细胞中表达量和定位的方法，用于改变细胞染色质结构的方法，用于改变细胞组蛋白H3甲基化的方法以及细胞。其中，改变细胞命运的方法包括使所述细胞过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。利用该方法能够使细胞过表达Gadd45家族蛋白，能够有效打开细胞的染色质，从而能够方便有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

Description

改变细胞命运的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及改变细胞命运的方法，构建体，用于改变细胞异染色质蛋白HP1a在细胞中表达量和定位的方法，用于改变细胞染色质结构的方法，用于改变细胞组蛋白H3甲基化的方法，以及细胞。

背景技术

伴随着胚胎干细胞细胞核心转录因子（Oct4,Sox2,Nanog）调控机理的逐渐阐明,日本科学家Yamanaka成功利用四个转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc将小鼠成纤维细胞变成了诱导多能干细胞（iPSCs），为获得特定个体的多能性干细胞指明了新的方向。在短短几年时间里，iPSCs邻域取得了日新月异的进展。各个物种各种体细胞的重编程都在实验室中获得成功。除逆转录病毒和慢病毒外，科学家们发展了各种非整合载体，大大提高了iPSCs的安全性。同时，人们还找到大量其他的重编程因子如Nanog，Lin28，Esrrb，Tbx3等等，这些因子有的可以促进iPS的效率，提高iPS的质量，有的可以替代一个或几个Yamanaka因子。

重编程技术的目标就是在临床上解决病人特异的多能细胞的大量获得难题。科学家已经在实验室成功用重编程技术和基因修复技术治疗了镰刀型贫血的小鼠。虽然这个技术离临床还很遥远，但是科学家们已经成功诱导出许多单基因突变疾病的病人iPS细胞，用作药物筛选和基因修复。在iPS基础上，转分化研究也出现热潮。这种转分化技术比重编程技术的优势在于它可以不经过iPS细胞和分化的步骤，直接将易得体细胞转换成另一种病变组织的细胞。

重编程和发育分化一样是细胞命运的改变。但是在细胞向其他细胞转变的过程中发生了什么，也是人们迫切想知道的。

然而，目前如何改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程，仍有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的方法。

首先，需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

生长抑制和DNA损伤蛋白（Growth arrest and DNA damage,Gadd)家族是在一个紫外照射细胞的试验中发现的。人们发现细胞针对紫外辐射，养分不足，低氧，高渗透压，亚砷酸盐,甲基汞,甲基甲磺酸等刺激能使Gadd家族蛋白大量表达。Gadd45亚家族是研究得最多的Gadd蛋白，它有三个成员：Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g。这三个蛋白有约50%的相同序列，它们拥有一个高度保守的结构域；其中Gadd45a是研究得最多最详尽的一个。

Gadd45a最开始是从接受紫外处理的中国仓鼠卵巢细胞中分离得到的,因为它在这种细胞中的mRNA水平快速提高。后来发现,它能被一系列DNA损伤试剂和生长抑制信号所诱导表达,如乙烷磺酸盐MMS,过氧化氢,氮芥,生长因子缺失等。Gadd45a基因位于一号染色体(1p31.2-p31.1），编码了一个只有165个氨基酸的酸性小蛋白（18.4kD）。它在细胞中的半衰期大约为30小时，在pH中性溶液中带负电荷。Gadd45a在不同物种间非常保守，在人，恒河猴，家猫，仓鼠，小鼠，大鼠中的相同氨基酸超过90%。

基因毒型压力调控Gadd45a表达的信号通路很复杂，有很多不同的机制:针对不同的压力有不同的机制。在受离子辐射的人类细胞中，p53蛋白能诱导Gadd45a mRNA水平上升。Gadd45a是第一个被发现的受p53调控的压力诱导基因。Gadd45a的表达有p53依赖和p53不依赖两条途径调控：暴露在离子辐射中后，其受p53依赖途径调控；而接受紫外照射后，其受p53不依赖途径调控。

Gadd45a的过表达就会导致细胞生长抑制。Gadd45a参与了G2/M监测点，它通过阻止cdc2和细胞周期蛋白B的相互作用来抑制细胞周期，不让细胞进入M期。而且，抑制Gadd45a表达可以缓解G2/M期的周期停滞。抑制Gadd45a的表达可能是细胞的一种存活机制，如肿瘤细胞,其不能抑制Gadd45a就能逃脱凋亡。一些在细胞或动物体中抑制Gadd45a表达的研究表明，用siRNA干扰Gadd45a或Gadd45a突变的细胞，能逃脱凋亡途径，致瘤的概率增加，DNA修复也变弱了。反过来，正常的Gadd45a表达和调控可以阻止有DNA损伤的细胞进入M期。因此，Gadd45a基因在正常细胞中表现为一个保护机制。

Gadd45a的大多数生理功能都是通过与其它调控性的蛋白结合来发挥的,如DNA复制和修复复合物组分PCNA。Gadd45a和其他两个Gadd45蛋白都能与PCNA相互作用，并能消除它们对细胞生长的抑制。Gadd45a除了可以控制细胞周期G2/M监测点外，还可能参与调控细胞凋亡。在一些已知的可以导致凋亡的基因毒性试剂处理下，Gadd45a在各种细胞系中都表现出高表达。Gadd45a和MEKK4/MTK1相互作用并激活JNK/p38信号通路，可以诱导凋亡。Gadd45a的另一个引人注目的生物学功能是其参与DNA修复。接受紫外照射后，Gadd45a可以直接结合在核心组蛋白上，使组蛋白-DNA复合体变得松散。这个发现表明了Gadd45a能识别发生变化的染色质，并与之结合，从而使得DNA可以与修复蛋白作用。而且有报道表明Gadd45a与核苷酸剪切修复相关基因XPG有相互作用，进一步证明Gadd45a参与了DNA的修复。Gadd45a还可能与DNA的主动去甲基化有关。在哺乳动物细胞系中过表达Gadd45a可以使特定位点以及全基因组脱甲基。Gadd45a的这个功能是通过核苷酸剪切修复复合体发挥的。Gadd45a的另一个重要的生物学功能是Gadd45a的缺失会导致基因组的不稳定及肿瘤发生。尽管Gadd45家族蛋白已经被阐述得比较清楚了，但是它们还有许多重要功能或作用机理需要我们继续探索。

在重编程过程中，表观遗传发挥着决定作用：多能性细胞与体细胞相比，染色体结构处于一个开放的状态。一些与之相对应的酶如组蛋白脱甲基化酶Jhdm1b等，化合物如组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA和丁酸钠等都被发现可以提高重编程技术的效率。同时重编程过程和分化过程也是表观遗传学研究非常好的细胞模型。除表观遗传外，p53-p21信号等细胞周期抑制基因被发现是iPS的障碍，抑制这些信号可以大大提高重编程，但会增加iPS细胞的成癌可能性。MET也被发现是重编程过程中必需发生的过程。利于MET的信号促进iPS，相反MET抑制剂则会阻碍iPS。除此之外，另一个对iPS机理研究的重要突破是细胞糖代谢方式对细胞命运有重要作用。与体细胞的氧化磷酸化不同，胚胎干细胞和iPS细胞主要采用糖酵解来功能。科学家们发现抑制氧化磷酸化,促进糖酵解有助于重编程。

与体细胞相比，胚胎干细胞/iPS细胞的染色质结构是开放的。这个开放有两层含义：一是多能性基因和细胞正常生长所必需的基因的染色质出于开放状态，基因高表达；二是分化基因的染色质也相对开放，随时准备着向各个方向的分化，但这些基因此时不表达，会在分化过程中选择性表达。因此，从体细胞到iPS细胞其实是一个染色质打开的过程。然而，重编程过程中，染色质怎样被打开以及打开染色质对重编程有什么影响还没有人报道。

而本发明的发明人，发现并鉴定出Gadd45家族蛋白的过表达可以打开染色质，促进重编程的效率。因而，发明人认为，Gadd45蛋白的这个新功能可以用来研究细胞命运变化。进而，发明人发现，Gadd45家族蛋白的过表达能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

由此，本发明有效地提出了一种能够改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的方法。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“细胞命运”是指从一种细胞类型向另一种细胞类型的转变，包括体细胞的重编程、转分化以及干细胞的分化。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种改变细胞命运的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使所述细胞过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ IDNO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为Gadd45a蛋白的氨基酸序列，具体为：MTLEEFSAAEQKTERMDTVGDALEEVLSKARSQRTITVGVYEAAKLLNVDPDNVVLCLLAADEDDDRDVALQIHFTLIRAFCCENDINILRVSNPGRLAELLLLENDAGPAESGGAAQTPDLHCVLVTNPHSSQWKDPALSQLICFCRESRYMDQWVPVINLPER(SEQ ID NO：1)；SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列为Gadd45b蛋白的氨基酸序列，具体为：MTLEELVASDNAVQKMQAVTAAVEQLLVAAQRQDRLTVGVYEAAKLMNVDPDSVVLCLLAIDEEEEDDIALQIHFTLIQSFCCDNDIDIVRVSGMQRLAQLLGEPAETLGTTEARDLHCLLVTNCHTDSWKSQGLVEVASYCEESRGNNQWVPYISLEER(SEQ ID NO：2)；SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列为Gadd45g蛋白的氨基酸序列，具体为：MTLEEVRGQDTVPESTARMQGAGKALHELLLSAQRQGCLTAGVYESAKVLNVDPDNVTFCVLAADEEDEGDIALQIHFTLIQAFCCENDIDIVRVGDVQRLAAIVGADEEGGAPGDLHCILISNPNEDTWKDPALEKLSLFCEESRSFNDWVPSITLPE(SEQ ID NO：3)。

发明人惊奇地发现，利用本发明的改变细胞命运的方法，使细胞过表达Gadd45家族蛋白，能够有效打开细胞的染色质，从而能够方便有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。此外，根据本发明的实施例，该方法简单易行，效率高，可重复性好。

根据本发明的实施例，所述细胞为体细胞或干细胞。由此，能够显著有效地改变体细胞或干细胞的细胞命运。

根据本发明的实施例，进一步包括使所述细胞表达Sox、Klf4、Oct4和c-Myc的至少一种。由此，打开细胞的染色质的效率更高，从而改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的效果更显著。

根据本发明的实施例，所述细胞表达Sox、Klf4和Oct4。根据本发明的另一些实施例，所述细胞进一步表达c-Myc。由此，打开细胞的染色质的效率更高，从而改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的效果更显著。

根据本发明的实施例，使细胞过表达Gadd45家族蛋白的方法不受特别限制，例如可以向细胞中引入能够表达Gadd45家族蛋白的基因即可。根据本发明的一些具体示例，向细胞中引入具有选自下列之一核苷酸序列的核苷酸分子：（a）SEQ ID NO：4～6的至少之一所示的核苷酸序列；（b）SEQ ID NO：4～6的至少之一所示的核苷酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示核苷酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的核苷酸序列；（d）在严谨条件下，能够与（a）、（b）或（c）中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：4所示核苷酸序列为Gadd45a蛋白的编码基因的序列，具体为：atgactttggaggaattctcggctgcagagcagaagaccgaaaggatggacacggtgggcgatgccctggaggaagtgctcagcaaggctcggagtcagcgcaccattacggtcggcgtgtacgaggctgccaagctgctcaacgtagaccccgataacgtggtactgtgcctgctggctgctgacgaagacgacgaccgggatgtggctctgcagatccatttcaccctcatccgtgcgttctgctgcgagaacgacatcaacatcctgcgggtcagcaacccgggtcggctagctgagctgctgctactggagaacgacgcgggcccggcggagagcgggggcgccgcgcagaccccggacctgcactgtgtgctggtgacgaacccacattcatcacaatggaaggatcctgccttaagtcaacttatttgtttttgccgggaaagtcgctacatggatcagtgggtgcccgtgattaatctcccggaacggtga(SEQ ID NO：4)；SEQ ID NO：5所示核苷酸序列为Gadd45b蛋白的编码基因的序列，具体为：atgaccctggaagagctggtggcgagcgacaacgcggttcagaagatgcaggcggtgactgccgcggtggagcagctgctggtggccgcgcagcgtcaggatcgcctcaccgtgggggtgtacgaggcggccaaactgatgaatgtggaccccgacagcgtggtcttgtgcctcctggccatagacgaagaagaggaggatgatatcgctctgcagattcacttcaccctgatccagtcgttctgctgcgacaatgacattgacatcgtccgggtatcaggcatgcagaggctggcgcagctcctgggggagccggcggagacattgggcacaaccgaagcccgagacctgcactgcctcctggtcacgaactgtcatacagattcctggaaaagccaaggcttggtggaggtggccagttactgtgaagagagcagaggcaataaccaatgggtcccctatatctctctagaggaacgctga(SEQ ID NO：5)；SEQ IDNO：6所示核苷酸序列为Gadd45g蛋白的编码基因的序列，具体为：atgactctggaagaagtccgtggccaggatacagttccggaaagcacagccaggatgcagggcgccgggaaagcactgcacgaacttctgctgtcggcgcagcgccagggctgtctgaccgctggcgtctacgagtccgccaaagtcctgaatgtggaccctgacaatgtgaccttttgcgtgctggctgccgatgaagaagatgagggcgacatagcgctgcagatccatttcacgttgattcaggcgttctgctgtgagaacgacattgatatcgtgcgcgtgggagacgtgcagaggctggcggcgatcgtgggcgccgacgaagaggggggcgcgccgggagacctgcattgcatcctcatttcgaatcctaatgaggacacatggaaggaccctgccttggagaagctcagtttgttctgcgaggagagccgcagcttcaacgactgggtgcccagcatcacccttcccgagtga(SEQID NO：6)。由此，能够使细胞高效地过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效打开细胞的染色质，从而能够有效地改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。

发明人发现，利用本发明的构建体能够有效地将上述编码Gadd45家族蛋白的相关基因引入受体细胞，并使受体细胞成功过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效打开该受体细胞的染色质，从而能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子的序列不受特别限制，只要能够使被引入的受体细胞能够有效过表达Gadd45家族蛋白即可。根据本发明的实施例，所述第一核酸分子包括具有选自下列之一核苷酸序列的核苷酸分子：（a）SEQ ID NO：4～6的至少之一所示的核苷酸序列；（b）SEQ ID NO：4～6的至少之一所示的核苷酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示核苷酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的核苷酸序列；（d）在严谨条件下，能够与（a）、（b）或（c）中所示核苷酸序列的至少之一或其互补序列杂交的核苷酸序列。由此，利用该构建体能够有效地将上述编码Gadd45家族蛋白的相关基因引入受体细胞，并使受体细胞高效地过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程。

根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括第二核酸分子，所述第二核酸分子包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地确定构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，优选地所述报告蛋白为发光蛋白，更优选地所述报告蛋白为绿色荧光蛋白。

根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同构建体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的植物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同构建体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，该筛选标记基因优选新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源构建体的重组细胞的效率。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的再一方面，本发明提供了一种用于改变细胞异染色质蛋白HP1a在细胞中表达量和定位的方法。根据本发明的实施例，该方法包括向细胞中引入前面所述的构建体，以便在所述细胞中过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，利用本发明的方法，能够使细胞过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效用于改变细胞异染色质蛋白HP1a在细胞中表达量和定位。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于改变细胞染色质结构的方法。根据本发明的实施例，该方法包括向细胞中引入前面所述的构建体，以便在所述细胞中过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。发明人发现，利用本发明的方法，能够使细胞过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效用于改变细胞染色质结构。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于改变细胞组蛋白H3甲基化的方法。根据本发明的实施例，该方法包括向细胞中引入权利要求7～11任一项所述的构建体，以便在所述细胞中过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，利用本发明的方法，能够使细胞过表达Gadd45家族蛋白，进而能够有效用于改变细胞组蛋白H3甲基化。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种细胞。根据本发明的实施例，与野生型细胞相比，该细胞过表达具有选自下列之一氨基酸序列的蛋白质：（a）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列；（b）SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的一部分；（c）与（a）或（b）中所示氨基酸序列具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%，进一步优选至少99%序列同一性的氨基酸序列。根据本发明的实施例，本发明的细胞能够过表达Gadd45家族蛋白，重编程效率高，从而能够有效用作研究细胞命运变化的模型。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“严谨条件”是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。典型的严谨条件例如可以举出在钾浓度约25mmol/L～约50mmol/L以及镁浓度约1.0mmol/L～约5.0mmol/L中，进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mmol/L的KCl以及1.5mmol/L的MgCl₂下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning3rd(J.Sambrook etal.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参照并入本说明书。本领域技术人员可以通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等，来容易地选择上述条件。）（说明书中描述：“同一性”是本领域所熟知的，是指两个或多个核酸序列之间经序列比较后决定的关系；在本领域中，“同一性”也指核酸分子序列之间的序列相关程度，由这些序列的碱基匹配程度决定；“同一性”可以根据已知的方法容易地计算出，这些方法包括，但不限于，描述于Computer MolecularBiology，Lesk编辑，牛津大学出版，纽约1993；Biocomputing：Infornatics and Genome Projects，Smith编辑，Academic出版，纽约1988；ComputerAnalysis of Sequence Data，第一部分，Griffin和Griffin编辑，Humana出版，新泽西，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，Academic出版1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov和Devereux 编辑，Stockton出版，纽约1991；和Carillo和Lipman，SIAM J，应用数学，48：1073，1988。）。

需要说明的是，本发明的改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程的方法是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和不断的优化工作才完成的。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，Gadd45蛋白促进重编程实验的结果，其中，

图1A显示了在三因子SKO基础上单独过表达Gadd45蛋白的Gadd45蛋白促进重编程实验的结果，

图1B显示了在四因子SKOM基础上单独过表达Gadd45蛋白的Gadd45蛋白促进重编程实验的结果；

图2显示了根据本发明一个实施例，Gadd45a蛋白对MEF细胞HP1α蛋白水平的影响实验的结果；

图3显示了根据本发明一个实施例，过表达Gadd45a蛋白后MEF细胞中常异染色质中组蛋白H1的动力学曲线图；

图4显示了根据本发明一个实施例，Gadd45a蛋白对组蛋白H3甲基化修饰的影响实验的结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

为了克隆Gadd45家族三个基因，本发明人首先制备了cDNA，即提取出细胞的RNA，然后用寡聚d（T）为引物反转录信使RNA，就得到cDNA。接着，设计引物，直接从cDNA中扩增得到Gadd45基因序列，连接到合适的真核表达载体上。

一方面可以直接将Gadd45基因导入到常用的小鼠或人细胞中进行功能实验检测；另一方面可以将Gadd45基因导入到真菌中进行蛋白纯化，以作细胞外功能检测和抗体制备。

本文中使用的术语“合适的真核表达载体”包括可以表达蛋白质的任何载体，在以下的实施例中，选择逆转录病毒包装载体pMXs；蛋白纯化载体选择pGEX-4T-2。本文中所述的“细胞”为任何可以获得的细胞，在以下的实时例中，选择小鼠胚胎成纤维细胞；真菌选择酵母。

可以通过本领域已知的任何手段转染或感染细胞，在以下的实施例中，选择慢病毒包装后感染细胞。可以使用本领域已知的各种方法检测蛋白质对核小体或染色质结构的影响；可以使用本领域已知的各种方法检测蛋白质对细胞命运转换的影响。

将Gadd45蛋白引入到体细胞重编程体系中，可以检测Gadd45蛋白对体细胞多能性获得的影响。体细胞重编程是指将重编程因子Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc导入到体细胞中如小鼠胚胎成纤维细胞，经过一段时间的培养，细胞会变成小鼠胚胎干细胞类似的细胞，能自我更新和有多能性。当在重编程因子基础上，过表达Gadd45蛋白后，重编程效率会大大提高。在去掉c-Myc的三因子诱导重编程体系中，Gadd45蛋白仍然有促进重编程的功能。在不同的培养体系中，Gadd45的这个功能会一直保持。

在以下的实施例中，Gadd45蛋白对染色质结构的影响主要是集中研究了Gadd45a蛋白的功能。如免疫荧光技术可用来研究Gadd45a对异染色质蛋白HP1a的定位多少的影响；光漂白后恢复技术科用来研究Gadd45a对组蛋白H1动态学的影响；染色质免疫沉淀技术可用来研究Gadd45a蛋白对组蛋白H3甲基化修饰的影响等等。

实施例1：Gadd45蛋白的克隆

以细胞的cDNA为模板，利用表1所示的引物分别扩增Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g片断，然后用琼脂糖凝胶电泳回收。通过在pMXs载体的多克隆位点PmeI酶切后插入PCR片段，连接，转化，挑菌，测序，最后分别得到Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g的逆转录病毒包装质粒。

表1克隆Gadd45蛋白片断的引物

实施例2：Gadd45蛋白促进重编程实验

用Plat-E细胞系包装出重编程因子Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc以及Gadd45a，Gadd45b和Gadd45g的逆转录病毒。用注射器收集病毒，用0.45微米的滤器过滤到离心管中，补加适量的新鲜培养基（总体积10厘米盘大概12毫升），加入polybrene混匀，可保存在4℃，也可立即用作感染。再24小时后，按同样方法收集病毒，为二次感染。

二次感染后的MEF细胞换用各种诱导培养基；常用的即是mESC培养基或者在mESC培养基中添加各种化合物分子。之后，每天需要更换新鲜培养基，直到实验结束。如果要计量iPS的效率，就要采用OG2-MEF（内源Oct4启动子上偶联有GFP蛋白）。当iPS克隆有GFP荧光时，表明了内源Oct4的表达，是成功重编程的标志。此时可以在显微镜下数出GFP荧光阳性的克隆，即为iPS的诱导效率。

图1显示了Gadd45蛋白促进重编程实验的结果。其中，图1A显示了在三因子SKO基础上单独过表达Gadd45蛋白的Gadd45蛋白促进重编程实验的结果，具体地，在三因子SKO（即Sox2，Klf4，Oct4）基础上，单独过表达Gadd45蛋白，并在不同培养基中诱导：mESC，mESC+Vc和iCD1培养基，然后统计GFP阳性克隆数量，获得图中所述的结果。图1B显示了在四因子SKOM基础上单独过表达Gadd45蛋白Gadd45蛋白促进重编程实验的结果，具体地，在四因子SKOM（即Sox2，Klf4，Oct4、c-Myc）基础上，单独过表达Gadd45蛋白，并在不同培养基中诱导：mESC，mESC+Vc和iCD1培养基，然后统计GFP阳性克隆数量，获得图中所述的结果。

由图1可知，当在Sox2，Klf4，Oct4和c-Myc四个因子或者只有Sox2，Klf4和Oct4三个因子的基础上，分别感染Gadd45a，Gadd45b或Gadd45g，都可以大大增加GFP阳性克隆数量及重编程效率。

实施例3：Gadd45a对异染色质蛋白HP1a的影响实验

在分析Gadd45a对异染色质蛋白HP1a的影响时，首先要包装出Gadd45a的逆转录病毒来，感染MEF（任何MEF均可）。培养3天后，用PBS洗一遍，用4%多聚甲醛室温固定半小时。固定后吸取多聚甲醛，换上PBS。用甘氨酸溶液洗一遍，再用PBS洗3次，然后用Triton X100和BSA的混合溶液通透封闭1小时。PBS洗3次后孵育一抗HP1a抗体至少1小时；用洗液洗5次后孵育荧光二抗。最后用DAPI染细胞核，PBS洗一遍，用封片剂将玻片封闭在载玻片上，然后用激光共聚焦显微镜观察拍照。

图2显示了Gadd45a蛋白对MEF细胞HP1α蛋白水平的影响实验的结果。如图2所示，在感染了空载体对照的MEF细胞中，HP1a在细胞核中表达量强，形成一个个聚集；而Gadd45a感染的MEF中，虽然也能形成一些HP1a的聚集，但整体水平比对照组显著下降。这些结果表明Gadd45a能影响HP1a蛋白的量和定位。

实施例4：Gadd45a对组蛋白H1动态学的影响实验

MEF细胞被接种在用多聚赖氨酸包被的35毫米的玻璃底小皿中。接着用荧光融合蛋白GFP-Histone1和HP1a-mCherry包装的病毒共同感染，然后用Gadd45a包装的病毒感染MEF，3天后进行FRAP检测。HP1a-mCherry是用来区分常染色质和异染色质：有HP1a红色聚集的即为异染色质，其余部位为常染色质。

挑选荧光强度（指H1-GFP）适中的细胞，先拍照作为对照，在选定索要漂白的区域：一个直径为25像素的圆形，用倍于正常100%的激光透射该圆形区域，漂白绿色荧光。然后拍下一系列光漂白后的图像（平均每0.5秒一张），大概2分钟后，荧光强度趋于稳定，停止拍照。保存图像。

图3显示了过表达Gadd45a蛋白后MEF细胞中组蛋白H1的动力学曲线图。由图3可知，Gadd45a能同时显著增加常染色质和异染色质的H1的动力学，表明Gadd45a蛋白能打开染色质的结构，无论常异。

实施例5：Gadd45a蛋白对组蛋白H3甲基化修饰的影响实验

收集感染了空载体对照和Gadd45a病毒的MEF细胞，用终浓度1%的甲醛固定后，再用终浓度0.125M的甘氨酸终止。PBS洗两遍后，用适量PBS重悬细胞，按每管1000万细胞分装。离心去上清。将细胞沉淀置于冰上，加入1毫升裂解缓冲液A，冰上裂解10分钟后，1400g4℃离心5分钟。去上清后加入200微升裂解缓冲液B，冰上裂解10分钟。超声，将基因组破碎成片断400-500bp左右。

取适当体积的protein A和protein G磁珠混合，取出保存液后，用200微升PBST重悬，加入相应抗体（如H3K9及H3K27甲基化抗体）和IgG，4℃旋转结合3小时。用PBST洗磁珠。将超声样品用IP缓冲液稀释10倍，取10微升做Input对照，取400微升加入到磁珠，4℃旋转结合过夜。第二天用低盐清洗液，高盐清洗液，LiCl清洗液和TE溶液洗磁珠。最后加入200微升的Chelex-100溶液和1微升蛋白酶，56℃1100转反应半小时，沸水浴10分钟，离心取上清，即可作QPCR模板。最后用QPCR方法检测H3K9和H3K27甲基化修饰情况。

图4显示了Gadd45a蛋白对组蛋白H3甲基化修饰的影响实验的结果。由图4可知，感染Gadd45a的MEF细胞中内源Oct4、Nanog和Sox2启动子上的Oct4结合位点的组蛋白甲基化修饰H3K9Me2，H3K9Me3，H3K27Me2及H3K27Me3都有所减少。同时，前面的实施例实验表明Gadd45a能降低MEF细胞中HP1α的水平；而HP1α和H3K9Me3及H3K27Me3相互作用，都是异染色质结构的组成部分。H3K9Me2/3和H3K27Me2/3修饰的减少既和前面实验结果相符，也再次证明了Gadd45a能打开异染色质。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种促进体细胞重编程的方法，其包括使所述体细胞过表达Sox、Klf4和Oct4以及具有选自SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体细胞进一步过表达c-Myc。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达具有选自SEQ ID NO：1～3的至少之一所示的氨基酸序列的蛋白质是通过向所述体细胞中引入具有选自SEQ ID NO：4～6的至少之一所示的核苷酸序列的核苷酸分子实现的。

4.一种用于改变细胞异染色质蛋白HP1a在细胞中表达量和定位的方法，其特征在于，包括向细胞中引入构建体，以便在所述细胞中过表达具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质，

其中，所述构建体包括第一核酸分子，所述第一核酸分子编码具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一核酸分子包括具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的核苷酸分子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建体进一步包括第二核酸分子，所述第二核酸分子包括编码报告蛋白的序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为发光蛋白。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述报告蛋白为绿色荧光蛋白。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建体进一步包括筛选标记基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述筛选标记基因为药物抗性基因。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述药物抗性基因为新霉素抗性基因。

12.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。

13.一种用于改变细胞组蛋白H3甲基化的方法，其特征在于，包括向细胞中引入构建体，以便在所述细胞中过表达具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质，

其中，所述构建体如权利要求4～12任一项所定义的。