JP2018527005A - 繁殖可能なxy雌マウスを生成するための多能性細胞の選択 - Google Patents
繁殖可能なxy雌マウスを生成するための多能性細胞の選択 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018527005A JP2018527005A JP2018514376A JP2018514376A JP2018527005A JP 2018527005 A JP2018527005 A JP 2018527005A JP 2018514376 A JP2018514376 A JP 2018514376A JP 2018514376 A JP2018514376 A JP 2018514376A JP 2018527005 A JP2018527005 A JP 2018527005A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- days
- cells
- medium
- pluripotent
- human mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 title description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 969
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 550
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 335
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 225
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 201
- 206010049290 Feminisation acquired Diseases 0.000 claims abstract description 84
- 208000034793 Feminization Diseases 0.000 claims abstract description 84
- 230000001135 feminizing effect Effects 0.000 claims abstract description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 427
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 301
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 276
- 101150077884 Eif2s3y gene Proteins 0.000 claims description 237
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 172
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 172
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 171
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 118
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 95
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 93
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 86
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 73
- -1 halide salts Chemical class 0.000 claims description 69
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 58
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 58
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 58
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 53
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 53
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 47
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 47
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 44
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 44
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 43
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 43
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 42
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 34
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 32
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 30
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical group [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 26
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 18
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 17
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 16
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 229910001508 alkali metal halide Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 12
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 230000002028 premature Effects 0.000 claims description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 6
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims 3
- 101150059736 SRY gene Proteins 0.000 abstract description 148
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 89
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 abstract description 88
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 88
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 48
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 abstract description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 137
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 51
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 49
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 48
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 48
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 46
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 46
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 36
- 101100489384 Mus musculus Zfy2 gene Proteins 0.000 description 34
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 32
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 28
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 27
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 26
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 25
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 25
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 22
- 230000008859 change Effects 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 108700010045 sry Genes Proteins 0.000 description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 15
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 15
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 15
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 14
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 13
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 10
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 101100053842 Mus musculus Zfy1 gene Proteins 0.000 description 7
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 7
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 7
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 6
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 6
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 6
- 101100262425 Mus musculus Uba1y gene Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 150000005323 carbonate salts Chemical class 0.000 description 6
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 5
- 101150112093 FGF9 gene Proteins 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 101100144701 Mus musculus Drosha gene Proteins 0.000 description 5
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000008948 male sex determination Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 5
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 5
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 5
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 4
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 4
- 230000008182 oocyte development Effects 0.000 description 4
- 230000034004 oogenesis Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 4
- 241000699718 Akodon Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 241000699709 Microtus Species 0.000 description 3
- 241001232540 Myopus Species 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 102100022978 Sex-determining region Y protein Human genes 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 241000288716 Talpa Species 0.000 description 3
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000008771 sex reversal Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 102000003957 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108010067022 Type III Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101150065870 Zfy2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 2
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 2
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 2
- 230000006408 female gonad development Effects 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 230000023508 male gonad development Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000036301 sexual development Effects 0.000 description 2
- 230000035938 sexual maturation Effects 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003363 Allium ursinum Species 0.000 description 1
- 108010005853 Anti-Mullerian Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- 238000010446 CRISPR interference Methods 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 1
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 1
- 108010010285 Forkhead Box Protein L2 Proteins 0.000 description 1
- 102100035137 Forkhead box protein L2 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N His-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MAJYPBAJPNUFPV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100030173 Muellerian-inhibiting factor Human genes 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 108010049175 N-substituted Glycines Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004107 Penicillin G sodium Substances 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700032475 Sex-Determining Region Y Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100039362 Transducin-like enhancer protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710101305 Transducin-like enhancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101150010310 WNT-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 102000052548 Wnt-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700020984 Wnt-4 Proteins 0.000 description 1
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 description 1
- 108700029634 Y-Linked Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000868 anti-mullerian hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940049706 benzodiazepine Drugs 0.000 description 1
- 150000001557 benzodiazepines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.OC(O)=O HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010026638 endodeoxyribonuclease FokI Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000024485 female sex determination Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000001182 human Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019369 penicillin G sodium Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229940067631 phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000010741 sumoylation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009107 upstream regulation Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5073—Stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2015年9月17日出願の米国特許出願第62/219,927号明細書の利益を主張し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
9.17kbのファイル484387SEQLIST.txt内に記載された配列表は、2016年9月16日に作成されたものであり、これは参照によって本明細書に組み込まれる。
大半の遺伝子改変は、2つの既存の対立遺伝子のうち1つに改変を作製するようにXY ES細胞を標的とすることによって実施され、得られたドナーマウスES細胞は、遺伝子改変についてヘテロ接合体である。しかしながら、遺伝子改変についてホモ接合体であるマウスを得ることが多くの場合に望ましい。改変を含む本質的に完全にES細胞由来の雌マウスは、F0世代では産まれないため、F0雄は、少なくとも1匹の雌(F1雌)が遺伝子改変についてヘテロ接合体の可能性がある同腹仔を生成するために典型的には雌(例えば、適合する近交系雌)と交配させる。次いで、ヘテロ接合体F1雌をF1ヘテロ接合体雄と互いに交雑させて、ホモ接合体子孫を得る。このような交配に必要なのは、高額な費用と時間のかかるステップである。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書では同じ意味として使用され、コード及び非コードアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸ポリマー形態を含む。本用語は、修飾されているポリマー、例えば、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなども含む。
繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するための方法及び組成物が提供される。方法及び組成物は、F0世代において繁殖可能な雌XY動物を生成することができるXY多能性もしくは全能性動物細胞、インビトロ細胞培養物、または胚を作製することを伴う。このような細胞(ならびに胚及びそれらに由来する動物)は、雌化培地中でXY多能性または全能性細胞を培養すること、ならびにDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性を評価することによって作製され得る。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。あるいは、このような細胞(ならびに胚及びそれらに由来する動物)は、Y染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるように改変され得る。低オスモル濃度培地などの雌化培地中でXY多能性または全能性動物細胞を維持することによって、XY多能性もしくは全能性動物細胞(またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物)におけるY染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物もまた提供される。雌化培地中でXY多能性または全能性動物細胞の集団を維持するため、及びF0世代において繁殖可能な雌XY動物を生成する高い能力を有する細胞またはクローンを選択するための方法及び組成物もまた提供される。雌化活性を有する化合物についてスクリーニングするため、またはDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/もしくは活性の評価によって雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物もまた提供され、XY多能性または全能性細胞におけるその発現及び/または活性は、動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向と逆相関する。
A.F0世代において繁殖可能なXY雌を生成することができるXY多能性または全能性細胞を作製する方法
XY遺伝子型を有する表現型的に雌の動物(例えば、マウス)は、特異的変異の結果として生成され得る。例えば、Lovell−Badge et al.(1990)Development 109:635−646を参照し、Colvin et al.(2001)Cell 104(6):875−889も参照のこと。しかしながら、このようなXY雌動物は、多くの場合に生殖不能である、または繁殖可能である場合、非常に不十分な妊孕力を有する。標的ゲノム遺伝子座の標的遺伝子改変についてホモ接合体の動物を生成することと関連して最も有用であるには、性転換及び繁殖力の両方が、XY雌で達成される必要がある。本明細書で提供される方法及び組成物によって、F0世代において繁殖可能な雌XYを生成することができるXY多能性もしくは全能性動物細胞または胚が作製され得る。このような細胞(ならびにインビトロ細胞培養物、胚、及びそれらに由来する動物)は、Y染色体の領域をサイレンシングすることによって作製され得る。場合により、細胞はまた、雌化培地中で培養され得る、ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるように改変され得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするためにXY動物細胞(例えば、XY多能性または全能性細胞、例えば、XY ES細胞など)を改変し、それによって一部の細胞を、繁殖可能な雌動物に発達する可能性のあるドナーXY多能性または全能性細胞に変換し、その結果、細胞をレシピエント胚に移植して繁殖可能な雌子孫を生じ得るための方法及び組成物が提供される。したがって、ドナーXY多能性または全能性細胞は、繁殖可能な表現型的に雌の動物を含むF0 XY子孫を生成することができる。
F0世代において繁殖可能なXY雌を促進する様々な方法及び組成物で用いられる培養培地は、それが多能性または全能性細胞(例えば、ES細胞、iPS細胞、XY ES細胞、XY iPS細胞など)を維持するというようなものである。「維持する」、「維持すること」、及び「維持」という用語は、本明細書に記載される多能性または全能性細胞(ES細胞またはiPS細胞を含む)の特性または表現型のうち少なくとも1つ以上の安定した保存を指す。このような表現型は、細胞の多能性または全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、及びその他の機能的特性を維持することを含み得る。「維持する」、「維持すること」及び「維持」という用語はまた、細胞の増殖または培養されている細胞数の増加を包含し得る。本用語は、細胞が分裂して数が増加し続ける場合もあり、またはそうでない場合もある一方で、細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件をさらに考慮する。細胞は、様々な濃度の二酸化炭素中で培養され得る。一例では、細胞は5%二酸化炭素中で培養される。
Y染色体の領域のサイレンシングは、以下でさらに定義されるような雌化培地中でXY多能性または全能性細胞を培養または維持することによって達成され得る。同様に、Y染色体の領域をサイレンシングするさらなる改変を有するXY多能性または全能性細胞もまた、以下でさらに定義されるような雌化培地中で培養することによって維持され得る。培地中において十分な時間、細胞を培養することによって、細胞は、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するXY多能性または全能性細胞へと変換され得るため、結果として細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得る。WO2011/156723及びKuno et al.(2015)Transgenic Res.24(1):19−29(その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる)は、宿主胚へのXYドナー細胞の導入及び好適な宿主での懐胎後、繁殖可能なXY雌動物が、F0集団において産生され得るように培養下でXYドナー細胞を維持するために、このような雌化培養培地(例えば、本明細書内の他の箇所に開示されるような低オスモル濃度培地または低塩培地)を用いる方法及び組成物を提供する。いくつかのこのような方法では、特定のXY多能性または全能性細胞クローンが繁殖可能なXY雌動物を生成する傾向は、0%〜60%であり得、これらの雌化効果は、対照非雌化培地中でクローンを再成長させることによって反転され得ない。このようなF0 XY雌は、正常な雌の外的及び内的構造を有し得、宿主胚の寄与及びキメラ現象が一切ない、完全にドナー細胞由来であり得、生殖器を含む全ての組織中に1本のX染色体及び1本のY染色体を有し得、かつ可視の染色体異常もなく、正常なXY雄の核型を有し得る。雌化培地中で培養されたXY多能性または全能性細胞に由来するF0 XY雌は、XX雌と同等の繁殖力及び妊孕力を有し得る。例えば、いくつかのこのような方法では、F0 XY雌は、F1 XX雌対照物のおよそ90%の繁殖力と比較して60〜70%の繁殖力を有する。いくつかのこのような方法では、9か月の交配試験においてF0 XY雌とF1 XX雌との間で妊孕力には全く差がない。
動物XY多能性または全能性細胞またはクローンが、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向を決定するための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
Y染色体の領域をサイレンシングする改変を有するXY多能性または全能性細胞は、レシピエント胚に移植されて繁殖可能な雌子孫を生じ得るように、一部の細胞を、繁殖可能な雌動物へと発達する可能性を有するXY多能性または全能性細胞に変換させるために、Sryタンパク質の減少したレベル及び/または活性をもたらす遺伝子改変をさらに含み得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるXY多能性または全能性細胞は、Sryタンパク質の減少したレベル及び/もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含み得る、またはそれらが、Sryタンパク質の減少したレベル及び/もしくは活性をもたらす遺伝子改変を含まないようにし得る。「性決定領域Y」タンパク質または「Sry」タンパク質は、DNA結合タンパク質の高移動度群(HMG)ボックスファミリーのメンバーである転写因子である。Sryは、雄性決定を開始する精巣決定因子である。様々な生物からのSryタンパク質の配列が既知であり、この配列は、マウス(アクセッション番号Q05738)、ラット(GenBank:CAA61882.1)、ヒト(アクセッション番号Q05066)、ネコ(アクセッション番号Q67C50)、及びウマ(アクセッション番号P36389)からのものを含み、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
Y染色体の領域をサイレンシングするようにXY多能性または全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物は、雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性もしくは全能性動物細胞を培養することを伴う方法ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。同様に、雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性または全能性動物細胞を培養することを伴う方法は、Y染色体の領域をサイレンシングするようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変するために提供される方法及び組成物ならびに/またはSryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させるようにXY多能性もしくは全能性動物細胞を改変することを伴う方法と組み合わされ得る。XY多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするように改変されたドナーXY多能性または全能性細胞を含むインビトロ細胞培養物がさらに提供される。本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養されるドナーXY多能性または全能性を含むインビトロ細胞培養物もまた提供される。このような細胞を維持または培養するための方法及び組成物もまた提供される。細胞は、Sryタンパク質のレベル及び/または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、XY多能性または全能性細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域をサイレンシングするように改変された少なくとも1種の異種ドナー多能性または全能性XY細胞を有する内部細胞塊を含むF0胚がさらに提供される。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持された少なくとも1種の異種ドナー多能性または全能性XY細胞を有する内部細胞塊を含むF0胚がさらに提供される。異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、本明細書に開示される方法によって生成され得る。異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、Sryタンパク質のレベル及び/または活性を減少させる改変をさらに含み得る。同様に、異種ドナー多能性または全能性XY細胞は、標的ゲノム遺伝子座に対して少なくとも1つの追加の標的遺伝子改変をさらに含み得る。
Y染色体の領域のサイレンシングを含む改変を有するXY多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するために使用され得る。同様に、本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地中で培養または維持されるXY多能性または全能性細胞を用いる様々な方法及び組成物が、標的ゲノム遺伝子座に対して追加の標的遺伝子改変を場合により含む繁殖可能なF0 XY雌動物を生成するために使用され得る。例えば、本明細書に開示される方法によって生成されるF0 XY雌動物は、F1世代を生成するために野生型動物と交雑させた場合に繁殖可能であり得る。
F0世代において繁殖可能な雌XY動物を作製するための方法及び組成物が提供される。このような方法によって生成され、得られた繁殖可能な表現型的に雌のXY動物もまた提供される。F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を作製する方法は、(a)本明細書内の他の箇所に開示される改変ドナーXY多能性または全能性細胞(すなわち、F0世代において繁殖可能なXY雌を生成することができるドナーXY多能性または全能性細胞)のいずれかを宿主胚に導入すること、(b)ステップ(a)の宿主胚をレシピエント雌動物に導入して、宿主胚を懐胎させること、及び(c)表現型的に雌のXY動物を含むF0 XY動物子孫を得て、性成熟に達すると、F0の表現型的に雌のXY動物が繁殖可能になることを含み得る。F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を作製するその他の方法は、(a)本明細書内の他の箇所に開示される改変胚のいずれかをレシピエント雌動物に導入して、胚を懐胎させること、及び(b)表現型的に雌のXY動物を含むF0 XY動物子孫を得て、性成熟に達すると、F0の表現型的に雌のXY動物が繁殖可能になることを含み得る。
いくつかの方法では、Y染色体の領域をサイレンシングする遺伝子改変を有するXY多能性または全能性細胞(すなわち、XY ES細胞またはXY iPS細胞)に由来する、得られた繁殖可能なXY雌F0世代を動物と交雑させて、F1世代子孫を得る。F0世代雌XY非ヒト動物は、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または完全にドナーXY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)に由来し得る。
標的遺伝子改変(例えば、Y染色体の領域をサイレンシングする、Sryタンパク質のレベル及び/もしくは活性を減少させる、または本明細書内の他の箇所に開示されるような任意の追加の標的ゲノム遺伝子座を改変する)を作製するための様々な方法及び組成物が使用され得る。標的遺伝子改変を作製する1つの手段は組換えによるものであり、これは2つのポリヌクレオチド間における遺伝情報の交換という任意のプロセスを含む。二本鎖切断(DSB)に応答する組換えは、主として2つの保存されたDNA修復経路:すなわち、非相同末端結合(NHEJ)及び相同組換え(HR)によって生じる。Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886−897を参照し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。NHEJは、相同鋳型の必要なく、切断末端を互いに直接連結することによる核酸の二本鎖切断の修復を含む。NHEJによる不連続配列の連結によって、多くの場合に二本鎖切断部位の近傍に欠失、挿入、または転座がもたらされ得る。このようなシステムは、例えば、標的機能喪失遺伝子改変の生成に用途を見出す。
所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。天然に存在する、もしくは天然ヌクレアーゼ剤が用いられ得る、または改変もしくは操作ヌクレアーゼ剤(例えば、所望の認識部位におけるニックもしくは二本鎖切断を特異的に認識して誘導するために、その天然型から操作される(改変もしくは誘導される)ヌクレアーゼ)が用いられ得る。
標的化ベクターは、核酸インサートをゲノム標的遺伝子座中に導入して、核酸インサート及び核酸インサートに隣接する相同腕を含むために用いられ得る。標的化ベクターは、線状形態または環状形態であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。参照を容易にするために、相同腕は、本明細書において5’及び3’(すなわち、上流及び下流)相同腕と称される。本用語は、標的化ベクター内の核酸インサートに対する相同腕の相対位置に関する。5’及び3’相同腕は、標的遺伝子座内の領域に対応し、これらは本明細書においてそれぞれ「5’標的配列」及び「3’標的配列」と称される。
いくつかの方法は、小さな標的化ベクターまたはsmallTVECを利用する。Y染色体に対して標的遺伝子改変を作製するためにsmallTVECを使用する例は、例えば、WO2015/200805及びUS2015/0376651に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。「smallTVEC」は、短い相同腕を含む標的化ベクターを含む。smallTVEC上の相同腕の長さは、例えば、約400bp〜約1000bpであり得る。smallTVECの相同腕は、対応する標的部位との相同組換え事象を促進するのに十分な任意の長さ、例えば、約400bp〜約500bp、約500bp〜約600bp、約600bp〜約700bp、約700bp〜約800bp、約800bp〜約900bp、または約900bp〜約1000bpを含む長さであり得る。smallTVEC上の相同腕の好ましい長さは、約700bp〜約800bpである。smallTVECの5’及び3’相同腕の合計は、例えば、約0.5kb〜約10kbであり得る。このような方法では、短い長さの相同腕は、より長い相同腕を有する標的化ベクターと比較した場合、標的化効率を向上させ得る。高頻度反復配列を有するY染色体の性質によって、smallTVECの短腕は、Y染色体上における高度に特異的な標的化を可能にし得る。
一部の標的化ベクターは、「大きな標的化ベクター」または「LTVEC」であり、これは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列に対応し、かつそれらに由来する相同腕を含む標的化ベクターを含む。LTVECを使用して標的遺伝子改変を生成する例は、例えば、WO2015/088643、US2015/0159175、US2015/0159174、US2014/0310828、US2014/0309487、及びUS2013−0309670に開示されていて、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。LTVECは、細胞中で相同組換えを実施することを目的とするその他の手法で典型的には使用される配列よりも大きな核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターも含む。例えば、LTVECは、従来のプラスミドに基づく標的化ベクターではそれらのサイズ制限のために収容できない大きな遺伝子座の改変を可能にする。例えば、標的遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤(例えば、Casタンパク質)によって誘導されるニックまたは二本鎖切断の不存在下では、従来の方法を使用しても標的化できない、または不正確にしか、もしくは大幅に低い効率でしか標的とされ得ない細胞の遺伝子座であり得る(すなわち、5’及び3’相同腕がこの遺伝子座に対応し得る)。
細胞中への核酸の導入を可能にする様々な方法及び組成物が、本明細書で提供される。いくつかの場合には、核酸を導入するために用いられるシステムは、特定のゲノム遺伝子座における標的組込みを可能にする。このようなシステムは様々な成分を用いて、参照を容易にするために、「標的ゲノム組込みシステム」という用語は一般に、組込み事象に必要な全ての成分(例えば、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ切断部位、挿入DNAポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチドのうち1つ以上)を含む。
様々な種類の標的遺伝子改変が、Y染色体の領域をサイレンシングするために(例えば、Y染色体の領域の欠失または破壊によって)使用され得る。例えば、タンパク質のレベル及び/または活性の減少は、タンパク質をコードする遺伝子に対する、またはタンパク質のレベルもしくは活性に影響を及ぼす、もしくはそれらを制御するゲノム遺伝子座に対する標的遺伝子改変によって達成され得る。このような標的改変としては、例えば、1つ以上のヌクレオチドの付加、1つ以上のヌクレオチドの欠失、1つ以上のヌクレオチドの置換、点変異、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックアウト、対象となるポリヌクレオチドもしくはその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種、外因性、もしくはオルソロガス核酸配列との置換え、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、またはこれらの組合せを挙げることができる。例えば、少なくとも1、2、3、4、5、7、8、9、10またはそれを超えるヌクレオチドが、標的ゲノム改変を形成するために変化され得る。欠失、挿入、または置換えは、本明細書内の他の箇所に開示されるような任意のサイズのものであり得る。様々な方法が、標的遺伝子改変を生成するために使用され得る。例えば、Wang et al.(2013)Cell 153:910−918、Mandalos et al.(2012)PLOS ONE 7:e45768:1−9、及びWang et al.(2013)Nat Biotechnol.31:530−532を参照し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
様々な方法が、欠失または挿入などの標的改変を有する細胞を同定するために使用され得る。このような方法は、標的遺伝子座に(例えば、第1及び第2CRISPR RNA認識配列間に)標的改変を有する1つの細胞を同定することを含み得る。スクリーニングは、改変ゲノム遺伝子座を有するこのような細胞を同定するために行われ得る。
上記方法及び組成物(例えば、細胞、胚)の動物としては、哺乳動物、魚類、及び鳥類を含む、任意の動物を挙げることができる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類(例えば、サル、マーモセット、アカゲザル、及び類人猿)、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット)、家畜または農業哺乳動物(例えば、ヤギ、雄ウシ、シカ、バイソン、ウマなどのウマ種、ウシ及び去勢ウシなどのウシ種、ヒツジなどのヒツジ種、ならびにブタ及び雄ブタなどのブタ種)、ならびに馴化哺乳動物(例えば、ネコ、イヌ、ウサギ、及びフェレット)が挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、及びアヒルが挙げられる。非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であり得る。例えば、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業哺乳動物、馴化哺乳動物、魚類、または鳥類であり得る。
細胞またはクローンが化合物の存在下で培養される場合、動物XY多能性または全能性細胞またはクローンに対して雌化活性を有する(すなわち、細胞またはクローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向を高める)化合物についてスクリーニングするための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
動物XY多能性または全能性細胞またはクローンに対する雌化活性増加(すなわち、細胞またはクローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向の増加)のために、雌化培地中で成分の濃度を最適化するための方法及び組成物が提供される。動物XY多能性または全能性細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向は、これらのクローンにおけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現または活性と逆相関する。動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の発現喪失は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのサイレンシングが強くなるほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。同様に、動物XY多能性または全能性細胞(例えば、XY ES細胞)におけるこれらの遺伝子のうち1つ以上の活性喪失または発現及び/もしくは活性の減少は、どの細胞クローンがF0世代においてXY雌動物を生成することになるかを予測し得る:観察されるDdx3y、Uty、及びEif2s3yの発現が低下するほど、XY ES細胞クローンがF0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY動物を生成する傾向がますます高くなる(例えば、実施例3を参照のこと)。言い換えれば、これらの遺伝子のうち1つ以上の発現及び/または活性は、XY雌生成を予測するための代理マーカーであり得る。
本明細書内の他の箇所に開示されるような雌化培地(例えば、低オスモル濃度培地)中でXY多能性または全能性動物細胞を維持することによって、XY多能性もしくは全能性動物細胞(またはインビトロ細胞培養物、胚、もしくはそれらに由来する動物)におけるY染色体の領域をサイレンシングするための方法及び組成物ならびにY染色体の領域におけるサイレンシングを同定するためにXY多能性または全能性細胞をアッセイするための方法及び組成物もまた提供される。このような方法は、例えば、標的改変が遺伝子の発現を低減または排除するために使用されることになる状況(例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害するためのノックアウト)に用途を見出し得る。雌化培地での培養によるサイレンシングに要する時間は、特異的標的改変の生成よりもはるかに短いため、サイレンシングを達成することがより効率的な手段である。
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略号、及びアミノ酸の3文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端で始まり、3’末端へと進む(すなわち、各ラインの左から右へ)という標準規則に従う。各ヌクレオチド配列の1本鎖のみが示されているが、表示された鎖の任意の参照によって、相補鎖が含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと進む(すなわち、各ラインの左から右へ)という標準規則に従う。
材料及び方法
ES細胞培養。本明細書に記載される全ての結果は、VGF1、すなわち、発明者らのC57BL6NTac/129S6SvEv F1ハイブリッドXY ES細胞株を用いて実施された実験からの結果であった(Poueymirou et al.(2007)Nat.Biotechnol.25:91−99、Valenzuela et al.(2003)Nat.Biotechnol.21:652−659)。ES細胞を、以前に記載された通りに培養した(Matise et al.(2000)Production of targeted embryonic stem cell clones.In:Joyner AL(ed)Gene targeting:a practical approach.Oxford University press,New York,pp101−132)。表3に示したNaHCO3濃度を有する特注の高グルコースDMEM培地(LifeTech)に、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの2−メルカプトエタノール、4mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(Life Technologies)、15%FBS(Hyclone)、ならびに2,000U/mlの白血病抑制因子(LIF、Millipore)を補充した。培地のオスモル濃度を、単一試料用浸透圧計(Advanced Instruments,Inc.モデル3250)で測定した。エレクトロポレーション法では、発明者らは、120μlのエレクトロポレーション緩衝液(Millipore)中に溶解させた1.5μgの標的化ベクターDNAを、7.5×106ES細胞と混合して、BTX多層エレクトロポレーションプレート(Harvard Apparatus)に移した。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で10分間インキュベートして、その後2つの15cmゼラチン化ディッシュ上に播種した。選択培地を、エレクトロポレーションから48時間後に添加し、それ以降毎日取り替えた。コロニーを、エレクトロポレーションから10日後に選定して、トリプシンを含有する96ウェルプレートの個々のウェルに移し、その後、細胞をゼラチン化96ウェルプレート中に播種した。3日後、細胞を再度トリプシン処理して、3分の2の各ウェルの内容物を凍結し、残存する3分の1をDNA抽出のために新しいプレートに移した。
交配試験及び表現型決定試験の両方についてVELOCIMICE(登録商標)の収率を最適化するために、発明者らは、遺伝子標的化実験中に、及び8細胞胚注入前に様々なES細胞培養培地を試験した。発明者らが評価した1つの成分は、Knockout(商標)DMEM(KO−DMEM、Life Technologies)として既知の基本培地であった。当初、KO−DMEMを用いて調製した培地中で成長させたES細胞では、標準的なDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)を用いて作製した培地中で維持した細胞と比較して、発明者らが、より少ない雄VELOCIMICE(登録商標)を得たという点で良い結果にならなかったと思われた。しかし、発明者らは、雌VELOCIMICE(登録商標)の大幅な増加も観察した:34の異なる遺伝子についての標的化実験から得られた78のクローン注入から生成したVELOCIMICE(登録商標)の31%が、雌であった(表3、KO−DMEM)。従来のDMEM培地中で成長させた500を超える標的ES細胞クローンの注入に関する、発明者らのマウス生成データベースで記録した結果の後ろ向き比較によって、全てのVELOCIMICE(登録商標)において1%のみが、雌であると同定されたことが明らかとなった(表3、DMEM)。稀な雌VELOCIMICE(登録商標)は、交配させなかったため、さらに調査しなかった。KO−DMEM培地中で成長させたXY ES細胞クローンからの雌の高発生率にもかかわらず、この実験からの雄と雌のVELOCIMICE(登録商標)における18%全収率は、DMEM培地中で誘導したクローンを用いた発明者らの過去の経験と同一であった(表3、KO−DMEM及びDMEM)。
不和合性の遺伝的背景(Eicher et al.(1982)Science 217:535−537、Taketo−Hosotani et al.(1989)Development 107:95−105)または性決定に必要な遺伝子の変異(Bagheri−Fam et al.(2008)Dev.Biol.314:71−83、Barrionuevo et al.(2006)Biol.Reprod.74:195−201、Bogani et al.(2009)PLoS Biol 7:e1000196、Chaboissier et al.(2004)Development 131:1891−1901、Colvin et al.(2001)Cell 104:875−889、Gierl et al.(2012)Dev.Cell 23:1032−1042、Hammes et al.(2001)Cell 106:319−329、Katoh−Fukui et al.(1998)Nature 393:688−692、Meeks et al.(2003)Nat.Genet.34:32−33、Tevosian et al.(2002)Development 129:4627−4634、Warr et al.(2012)Dev.Cell 23:1020−1031)によって引き起こされるものであろうと、マウスの雄から雌への性転換は、ほぼ常に不妊症を伴う。主要な雄の性決定遺伝子であるSryに変異を持つ一部のXY雌は、繁殖可能であるが、小さく稀な同腹仔及び短い生殖寿命を有する(Lovell−Badge and Robertson(1990)Development 109:635−646)。最近では、類似した低繁殖力及び妊孕力が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)での指向性標的化によって生成されたSryの41塩基対(bp)欠失を持つXY雌マウスについて報告された(Wang et al.(2013)Nat.Biotechnol.31:530−532)。TALEN誘導Sry変異の別の例では、2bp欠失を持つ1匹のXY雌マウスが生殖不能であることが見出された(Kato et al.(2013)Sci.Rep.3:3136)。
胚を発達段階の性交後日数(dpc)11.5日で切離し、タイラーステージ診断を使用してそれらのおよその段階を決定した。妊娠期間が同腹仔内で大幅に変動するため、個々の胚についてのより正確なステージ診断を、後肢芽の後方から尾部の末端まで尾体節(ts)数を計数することにより達成した。この技術を使用して、8尾体節を有する胚は、10.5dpcであり、18尾体節は11.5dpcであり、30尾体節は12.5dpcである(Hacker,Capel,Goodfellow and Lovell−Badge,Devel 1995から)。
表11は、VGF1 ES細胞株における遺伝子標的化によるXY ES細胞クローンが、8細胞胚へのXY ES細胞クローンのマイクロインジェクション後に雌VELOCIMICE(登録商標)を生成する傾向を示す。全てのクローンを、標的化及びマイクロインジェクションプロセス全体を通して、KO−DMEMに基づく培地中で維持し、培養した。クローンのこの試料から、XY雌VELOCIMICE(登録商標)を生成する能力がクローン特異的であり、0〜60%の範囲であることは明らかである。これらの結果は、複数回のマイクロインジェクション実験で再現可能であった:雌を生成しなかったクローンが、反復マイクロインジェクションにおいてこの形質を維持したのに対して、雌を生じたクローンは、反復マイクロインジェクション実験においておよそ同じ比率の雌を生じる傾向があった。効果を、DMEMに基づく培地中でクローンを再成長させることによって反転できなかった。ES細胞を、標的化プロセス全体、すなわち、エレクトロポレーション、薬物耐性コロニーの選択、標的変異についてのスクリーニング、増殖、及び凍結保存において、DMEMに基づく培地またはKO−DMEMに基づく培地のいずれかで成長させて維持した遺伝子標的化実験からのES細胞クローンを解凍し、8細胞胚へのマイクロインジェクションに備えて3日間、反対の培地中で成長させた。DMEMに基づく培地中で誘導したクローンは、低頻度の雌VELOCIMICE(登録商標)生成を維持し、これは、KO−DMEMへの短時間曝露で増加し得なかった。同様に、KO−DMEMに基づく培地中で誘導したクローンは、より高頻度の雌VELOCIMICE(登録商標)を生成し、DMEMへの短時間曝露によって、雌を生成するXYクローンの傾向が低減することはなかった。
SryのlacZ置換対立遺伝子を含む標的欠失を、Sry開始コドンとインフレームで融合したlacZならびに38及び37kbの相同腕に隣接し、bMQライブラリー(129S7/SvEv Brd−Hprt b−m2)からのBACに基づくネオマイシン耐性遺伝子を含む挿入カセットを含む大きな標的化ベクター(LTVEC)を用いて作製した。LTVEC(NIH KOMPプロジェクトVG12778 LTVEC(URL“velocigene.com/komp/detail/12778”のWorld Wide Web(www)上でインターネットによって入手可能)を参照のこと)は、その相同腕において、Sry発現に関する全ての既知の制御エレメントを含む。そのlacZコードベータ−ガラクトシダーゼは、Sry遺伝子の組織特異的かつ発達段階特異的発現のレポーターとして機能する。標的化ベクターを用いたSry遺伝子の正確な標的化によって作製した対立遺伝子は、Sryコード配列の欠失及び挿入カセットによる置換を含む。標的化ベクターを使用して、VGB6(B6A6としても知られる)C57BL/6及びVGF1(F1H4としても知られる)C57BL6/129 F1ハイブリッドES細胞株の両方でSry遺伝子を標的とした。VGF1(F1H4)マウスES細胞は、雌C57BL/6NTacマウスを雄129S6/SvEvTacマウスと交雑させることによって生成したハイブリッド胚に由来した。したがって、VGF1 ES細胞は、129S6/SvEvTacマウスからのY染色体を含有する。VGF1細胞株から生成した雌XYマウスは、129S6/SvEvTacマウスに由来するY染色体を含有する。
どのY染色体遺伝子がマウス胚性幹(ES)細胞中で発現されて、性転換マーカーの候補であり得るのかを決定するために、RNA−seq分析をF1H4 ES細胞で行った。表15に示す通り、Eif2s3y、Ddx3y、Erdr1、Kdm5d、Uty、Ube1y1、Zfy1、Zfy2、Rbmy1a1、Sly、Usp9y、LOC100041346は、F1H4 ES細胞において検出可能な発現レベルを有する。Sryは、F1H4 ES細胞中で検出可能な発現レベルを有しなかった。
Claims (99)
- 非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における雌化活性に関する標的化合物のスクリーニング方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、前記第1集団が、標的化合物の存在下で培養され、前記第2集団が、前記標的化合物の不存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイし、それによって雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞におけるDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性の減少によって同定されることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関することと、
(d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。 - ステップ(b)の前記アッセイによって、mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの前記発現及び/または活性の減少によってステップ(b)で同定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記雌化活性が、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞における、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性の欠如によってステップ(b)で同定される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、請求項7または8に記載の方法。
- ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、前記第1集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(c)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記標的化合物の不存在下で、ステップ(a)の前記培地が、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的化合物の不存在下で、ステップ(a)の前記培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、請求項17に記載の方法。 - 前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、請求項17または18に記載の方法。
- 前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項17〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項23に記載の方法。
- 前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、請求項24に記載の方法。
- 前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、請求項25に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(d)が、前記宿主胚を胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的化合物の存在下で培養される、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の作製方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む低オスモル濃度培地中で培養し、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有することと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記集団において前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイすることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するためにドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関すること
とを含む、前記方法。 - ステップ(b)の前記アッセイによって、前記mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項30に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項30に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性に基づいて選択される、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、請求項33に記載の方法。
- ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(c)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項30〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、請求項30〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、請求項30〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、請求項30〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、請求項30〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、請求項39に記載の方法。
- 前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、請求項30〜40のいずれか1項に記載の方法。 - 前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、請求項30〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、請求項30〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項30〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項30〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項30〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項46に記載の方法。
- 前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、請求項47に記載の方法。
- 前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、請求項48に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、請求項47〜49のいずれか1項に記載の方法。
- (d)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(e)ステップ(d)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(f)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とをさらに含む、請求項30〜50のいずれか1項に記載の方法。 - 前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(d)が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項51に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記低オスモル濃度培地中で培養される、請求項51または52に記載の方法。
- (a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞においてDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性レベルを検出するための検出試薬と、
(b)前記検出試薬を使用して、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するための前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の予測傾向と検出を相互に関連付けるための説明書
とを含む、キット。 - 前記検出試薬が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現を検出するための、1つ以上のプライマーセット及び/または1つ以上のプローブを含む、請求項54に記載のキット。
- 雌化培地における標的培地成分の前記濃度の最適化方法であって、
(a)非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の第1集団及び第2集団を、前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに好適な基本培地及び添加物を含む培地中で培養し、
前記第1集団が、第1濃度の前記標的培地成分の存在下で培養され、前記第2集団が、前記第1濃度とは異なる第2濃度の前記標的培地成分の存在下で培養されることと、
(b)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1及び第2集団の各々で前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞のうち1種以上をアッセイすることと、
(c)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞で減少する場合に、前記第1濃度を選択することと、
(d)Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に基づいて、F0世代において繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を生成するために、前記第1集団からドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を選択し、前記F0世代における前記繁殖可能な表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物の前記比率が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の前記発現及び/または活性に逆相関することと、
(e)前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞を宿主胚に導入することと、
(f)ステップ(e)の前記宿主胚をレシピエント雌非ヒト哺乳動物に導入して、前記宿主胚を懐胎させることと、
(g)表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物を含むF0 XY非ヒト哺乳動物子孫を得て、性成熟に達すると、前記F0の表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物が繁殖可能かつ妊孕可能になること
とを含む、前記方法。 - ステップ(b)の前記アッセイによって、前記mRNAレベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項56に記載の方法。
- ステップ(b)の前記アッセイによって、前記タンパク質レベルでDdx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現が検出される、請求項56に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、請求項56〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、請求項56〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1集団からの前記1種以上の非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている場合に、前記第1濃度がステップ(c)で選択される、請求項56〜60のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(d)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞、すなわち、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記多能性を維持するのに十分であるが、繁殖可能な雌子孫を生じる前記細胞の能力を変化させない培地中で培養された前記細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、請求項56〜61のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(d)の前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記第2集団からの対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する、請求項56〜62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記対照非ヒト哺乳動物XY多能性細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの減少した発現及び/または活性を有する、請求項62または63に記載の方法。
- ステップ(b)が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち1つ以上の発現及び/または活性について、非ヒト哺乳動物XY多能性細胞の前記第1集団における少なくとも2種の前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞をアッセイすることを含み、ステップ(d)が、前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞として、他方のアッセイした細胞と比較して、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の最も低い発現及び/または活性を有するステップ(b)の前記アッセイした細胞を選択することを含む、請求項56〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の発現及び/または活性を欠いている、請求項56〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yの発現及び/または活性を欠いている、請求項56〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び第2集団が、アッセイステップ(b)の前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、請求項56〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、胚性幹(ES)細胞である、請求項56〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、VGF1マウスES細胞である、請求項69に記載の方法。
- ステップ(a)の前記培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kg未満のオスモル濃度を有する低オスモル濃度培地である、請求項56〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記低オスモル濃度培地が、以下の特性:
(I)前記低オスモル濃度培地が、約218mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(II)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(III)前記低オスモル濃度培地が、約11mS/cm〜約13mS/cmの伝導度を有すること、
(IV)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(V)前記基本培地が、塩化ナトリウムを約50mM〜約110mMの濃度で含むこと、
(VI)前記基本培地が、炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含むこと、
(VII)前記基本培地が、重炭酸ナトリウムを約13mM〜約25mMの濃度で含むこと、
(VIII)前記基本培地が、約85mM〜約130mMのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総濃度を有すること、
(IX)前記基本培地が、塩化ナトリウムを87±5mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、261±26mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、
(X)前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で、及び炭酸塩を約17mM〜約30mMの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約200mOsm/kg〜約329mOsm/kgのオスモル濃度を有すること、ならびに
(XI)前記低オスモル濃度培地が、218mOsm/kgのオスモル濃度を有し、前記基本培地が、塩化ナトリウムを50mM〜110mMの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを13mM〜25mMの濃度で含むこと
のうち1つ以上を有する、請求項71に記載の方法。 - 前記基本培地が、炭酸塩を約18mM〜約44mMの濃度で含む、請求項71または72に記載の方法。
- 前記基本培地が、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩を約50mM〜約110mMの濃度で含む、請求項71〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炭酸塩が重炭酸ナトリウムであり、前記アルカリ金属及び前記ハロゲン化物の前記塩が塩化ナトリウムであり、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kg〜約322mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項71〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基本培地が、塩化ナトリウムを約3mg/mLの濃度で、及び重炭酸ナトリウムを約2.2mg/mLの濃度で含み、前記低オスモル濃度培地が、約216mOsm/kgのオスモル濃度を有する、請求項71〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、げっ歯類である、請求項56〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項77に記載の方法。
- 前記げっ歯類がC57BL/6系統を含むマウスである、請求項78に記載の方法。
- 前記Y染色体が、C57BL/6系統、129系統、またはBALB/c系統からのものである、請求項79に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、C57BL/6系統及び129系統を含むマウスである、請求項78〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主胚が前桑実期胚であり、ステップ(e)が、前記宿主胚を前記胚盤胞期まで培養することをさらに含む、請求項56〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物XY多能性細胞が、前記宿主胚への導入前に少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、2週間、3週間、または4週間の間、前記標的培地成分の存在下で培養される、請求項56〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、標的ゲノム遺伝子座に標的遺伝子改変を含む、請求項1〜53及び56〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子改変が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点変異、またはこれらの組合せを含む、請求項84に記載の方法。
- (h)子孫を生成するために前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物を交配させること
をさらに含む、請求項1〜29、51〜53、及び56〜85のいずれか1項に記載の方法。 - 少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または全ての前記XY子孫が、表現型的に雄かつ繁殖可能である、請求項86に記載の方法。
- 前記XY子孫には表現型的に雌がいない、請求項86または87に記載の方法。
- 前記交配が、前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物をコホートF0 XY雄非ヒト哺乳動物と交雑させて、ここで前記繁殖可能なF0 XY雌非ヒト哺乳動物及び前記F0 XY雄非ヒト哺乳動物が各々、遺伝子改変についてヘテロ接合体であること、ならびに前記遺伝子改変についてホモ接合体であるF1子孫非ヒト哺乳動物を得ることを含む、請求項86〜88のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY子孫が、性成熟に達すると繁殖可能になる表現型的に雌のXY非ヒト哺乳動物である、請求項1〜29、51〜53、及び56〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 繁殖可能な表現型的に雌のXY動物である前記F0 XY子孫の前記パーセンテージが、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫ではより高い、請求項90に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する前記F0雌の全てが、XY遺伝子型を有する、請求項1〜29、51〜53、及び56〜91のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、繁殖可能である、請求項1〜29、51〜53、及び56〜92のいずれか1項に記載の方法。
- 繁殖可能な前記F0 XY雌の前記パーセンテージが、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY子孫ではより高い、請求項93に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、少なくとも2匹、3匹、4匹、5匹、6匹、7匹、8匹、9匹、または10匹の仔を有する同腹仔を産生することができる、請求項1〜29、51〜53、及び56〜94のいずれか1項に記載の方法。
- F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される前記平均産子数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、請求項95に記載の方法。
- 前記ドナー非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来する少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の前記F0 XY雌が、それらの生涯において少なくとも2匹、3匹、4匹、5匹、6匹、7匹、8匹、9匹、または10匹の同腹仔を産生することができる、請求項1〜29、51〜53、及び56〜96のいずれか1項に記載の方法。
- F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される一生涯における同腹仔の前記平均数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、請求項97に記載の方法。
- F0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌により産生される一生涯における子孫の前記平均数が、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上のより高い発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌と比較した場合に、Ddx3y、Uty、及びEif2s3yのうち前記1つ以上の減少した発現及び/または活性を有する非ヒト哺乳動物XY多能性細胞に由来するF0 XY雌または繁殖可能なF0 XY雌ではより高い、請求項1〜29、51〜53、及び56〜98のいずれか1項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562219927P | 2015-09-17 | 2015-09-17 | |
US62/219,927 | 2015-09-17 | ||
PCT/US2016/052345 WO2017049240A1 (en) | 2015-09-17 | 2016-09-16 | Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018527005A true JP2018527005A (ja) | 2018-09-20 |
JP2018527005A5 JP2018527005A5 (ja) | 2019-10-10 |
JP6868615B2 JP6868615B2 (ja) | 2021-05-12 |
Family
ID=57113699
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018514376A Active JP6868615B2 (ja) | 2015-09-17 | 2016-09-16 | 繁殖可能なxy雌マウスを生成するための多能性細胞の選択 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10893666B2 (ja) |
EP (1) | EP3349573A1 (ja) |
JP (1) | JP6868615B2 (ja) |
KR (1) | KR102382458B1 (ja) |
CN (1) | CN108697068B (ja) |
AU (1) | AU2016324305B2 (ja) |
CA (1) | CA2998642C (ja) |
HK (1) | HK1256687A1 (ja) |
IL (1) | IL257982B2 (ja) |
MX (1) | MX2018003354A (ja) |
RU (1) | RU2729407C1 (ja) |
SG (1) | SG10201913789VA (ja) |
WO (1) | WO2017049240A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108998540A (zh) * | 2018-08-18 | 2018-12-14 | 兰州大学 | 绵羊eif2s3y基因的单核苷酸多态性标记及其检测引物、试剂盒、方法及应用 |
CN110656167A (zh) * | 2019-09-27 | 2020-01-07 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 用于y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字pcr的检测方法 |
CN111321232B (zh) * | 2020-03-18 | 2022-08-16 | 西北农林科技大学 | 一种快速检测肉牛eif4a2基因拷贝数变异的方法及其应用 |
CN113558012A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-10-29 | 陈米米 | 一种哺乳动物繁育雌性多胎的方法 |
CN114015705A (zh) * | 2021-11-28 | 2022-02-08 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种小鼠体外受精繁育性别选择方法 |
CN115251007B (zh) * | 2022-09-02 | 2024-01-26 | 山西医科大学 | 一种新品系裸大鼠、其培育方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011156723A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Production of fertile xy female animals from xy es cells |
WO2015200805A2 (en) * | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997041209A1 (en) | 1996-04-29 | 1997-11-06 | Leuven Research & Development Vzw | Pluripotent rabbit embryonic stem (es) cell lines and their use in the generation of chimeric rabbits |
EP1067141A1 (en) * | 1999-06-11 | 2001-01-10 | Rijksuniversiteit te Leiden | A male-specific protein homologue involved in histocompatibility |
AU1581001A (en) * | 1999-11-02 | 2001-05-14 | University Of Massachusetts | Use of haploid genomes for genetic diagnosis, modification and multiplication |
CA2394812A1 (en) | 1999-12-20 | 2001-06-28 | Anthony C.F. Perry | A method to produce cloned embryos and adults from cultured cells |
WO2003071869A1 (fr) | 2002-02-27 | 2003-09-04 | Yasumitsu Nagao | Procede de construction d'animal chimere a lignee germinale |
WO2003073843A2 (en) | 2002-03-05 | 2003-09-12 | Artemis Pharmaceuticals Gmbh | Inbred embryonic stem-cell derived mice |
EP1516924A1 (en) | 2003-09-17 | 2005-03-23 | Fundacion IVI para el Estudio de la reproduccion Humana (FIVIER) | Generation of human embryonic stem cells from triploid zygotes |
JP4688793B2 (ja) | 2004-03-23 | 2011-05-25 | 敏宏 赤池 | 多能性幹細胞の増殖方法 |
ES2667169T3 (es) | 2004-10-19 | 2018-05-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Método para generar un animal no humano homocigótico para una modificación genética |
US8962311B2 (en) | 2006-08-09 | 2015-02-24 | Valneva | Method of obtaining chicken embryonic stem cells |
GB0623635D0 (en) | 2006-11-27 | 2007-01-03 | Stem Cell Sciences Uk Ltd | Pluripotent cell growth media |
WO2009037337A1 (en) | 2007-09-20 | 2009-03-26 | Novartis Ag | Robust and tissue independent gender-specific transcript markers for molecular gender determination |
JP2012516689A (ja) * | 2009-02-08 | 2012-07-26 | ザ ユニバーシティー オブ メルボルン | 性決定および性決定特定に関する方法 |
CN102762718B (zh) | 2009-10-13 | 2015-06-17 | 干细胞技术公司 | 用于分化干细胞的重量克分子渗透压浓度控制 |
WO2012022634A1 (en) * | 2010-08-16 | 2012-02-23 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Classification, diagnosis and prognosis of multiple myeloma |
PL3207124T3 (pl) | 2014-10-15 | 2019-11-29 | Regeneron Pharma | Sposoby i kompozycje do wytwarzania lub utrzymywania komórek pluripotencjalnych |
-
2016
- 2016-09-16 CA CA2998642A patent/CA2998642C/en active Active
- 2016-09-16 KR KR1020187009166A patent/KR102382458B1/ko active IP Right Grant
- 2016-09-16 SG SG10201913789VA patent/SG10201913789VA/en unknown
- 2016-09-16 CN CN201680067024.6A patent/CN108697068B/zh active Active
- 2016-09-16 EP EP16778528.6A patent/EP3349573A1/en active Pending
- 2016-09-16 AU AU2016324305A patent/AU2016324305B2/en active Active
- 2016-09-16 WO PCT/US2016/052345 patent/WO2017049240A1/en active Application Filing
- 2016-09-16 MX MX2018003354A patent/MX2018003354A/es unknown
- 2016-09-16 RU RU2018113330A patent/RU2729407C1/ru active
- 2016-09-16 US US15/268,452 patent/US10893666B2/en active Active
- 2016-09-16 JP JP2018514376A patent/JP6868615B2/ja active Active
-
2018
- 2018-03-08 IL IL257982A patent/IL257982B2/en unknown
- 2018-12-06 HK HK18115672.3A patent/HK1256687A1/zh unknown
-
2020
- 2020-12-11 US US17/119,076 patent/US20210112788A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011156723A1 (en) * | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Production of fertile xy female animals from xy es cells |
WO2015200805A2 (en) * | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TRANSGENIC RES, (2015), VOL.24, PP.19-29, JPN6020031425, ISSN: 0004331913 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3349573A1 (en) | 2018-07-25 |
HK1256687A1 (zh) | 2019-10-04 |
MX2018003354A (es) | 2018-05-28 |
US20210112788A1 (en) | 2021-04-22 |
CA2998642A1 (en) | 2017-03-23 |
IL257982B1 (en) | 2023-01-01 |
JP6868615B2 (ja) | 2021-05-12 |
KR20180058731A (ko) | 2018-06-01 |
NZ740899A (en) | 2021-11-26 |
WO2017049240A8 (en) | 2018-05-24 |
CN108697068A (zh) | 2018-10-23 |
AU2016324305A1 (en) | 2018-04-12 |
IL257982B2 (en) | 2023-05-01 |
US20170079250A1 (en) | 2017-03-23 |
IL257982A (en) | 2018-05-31 |
SG10201913789VA (en) | 2020-03-30 |
CA2998642C (en) | 2023-09-12 |
RU2729407C1 (ru) | 2020-08-06 |
US10893666B2 (en) | 2021-01-19 |
AU2016324305A9 (en) | 2019-01-03 |
KR102382458B1 (ko) | 2022-04-04 |
CN108697068B (zh) | 2022-02-11 |
WO2017049240A1 (en) | 2017-03-23 |
AU2016324305B2 (en) | 2022-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220056482A1 (en) | Methods for making genetic edits | |
EP2863736B1 (en) | Genetically edited animals and methods for making the same | |
US20210112788A1 (en) | Production of fertile xy female animals by silencing of genes on the y chromosome | |
CN107090470B (zh) | 经遗传修饰的动物及其生成方法 | |
US20190223417A1 (en) | Genetically modified animals having increased heat tolerance | |
NZ740899B2 (en) | Selection of pluripotent cells for production of fertile xy female mice |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190830 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190830 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200825 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201120 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210329 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210412 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6868615 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |