JPH05505096A - ウィルス感染のトランスジェニック動物モデル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス　、染のトランスジェニ／り　モデル＆墨！ソＬ１ 本発明は一般的に、薬剤スクリーニングのための動物モデルに関し、さらに詳細 には、抗ウイルス性化合物のスクリーニングのためのトランスジェニック動物モ デルに関する。

多（の場合ウィルス感染は、種および／または組織に特異的なものであり、それ は感染が起こるためにウィルスが持具な構造を認識することに起因する。極めて 種に特異的なウィルスの例は、ヒト免疫不全ウィルス、すなわちＨｆＶである。

エイズは、ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩ　Ｖ−’１　）によって引き起こさ れる致命的な疾病である。

エイズの有効なワクチンおよび治療法の開発において、適切な動物モデルがない ことが主要な妨げになっていた。抗エイズ療法に可能な効力を試験するための唯 一の手段は、インビトロ試験である。インビトロ試験とインビボでの効力との間 の相関に関してはほとんど知られていないが、かなり具なると考えられている。

従って、エイズモデルとして作製した一般実験動物を捜す必要に迫られている。

関連のウィルスを用いたモデルが、様々な動物種に企画されてきたが、誓書類、 およびマカクザルのような実験動物をＨＩ　Ｖ−１に感染させる試みは、まだ成 功していない。ヒト以外で再現性を持つて感染する唯一の動物種は、チノパンツ ーマ、ある。１９８９年現在で、エイズ患者からの組織、・インビトロで感染し た自己由来細胞、他の感染チンパンジーからの血液産物、および無細胞ウィルス を用いて、約５０匹のチンパンジーをＨＩＶに感染させた。÷れら動物を２年間 に及び現在、も観察を続けている。抗ＨＩＶ抗体は一貫して血清中に示され、） ＩＩＶは容易に繰り返し末梢血から回収されている。

しかし、これらの動物は、エイズ様疾病症状の徴候をまだ発現していない。

充分な数のチンパンジーがエイズ研究に利用できるかというのもまた、問題とな っている。チンパンジーは絶滅しかけている動物種である。米国においては、自 国のコロニーにおける繁殖で産まれた動物しか実験用に使用することができない 。現在アメリカでは、約１，２００匹のチンパンジーが生物　″医学研究のコロ ニーに属し、８０匹が製薬産業のコロニーに属している。　約３００匹のチンパ ンジーだけが繁殖に適し、１年間に約３５匹を研究用として産生じている。この 数は、チンパンジーを重要なエイズ用の動物モデルとして作製し得る可能性を著 しく制限している。従って、他の実験動物がエイズモデルとしてチンパンジーに 代わることが、エイズ研究の進歩にとってたいへん重要である。

最近になって、合衆国国立衛生研究所のＫｕｌａｇａらが、ヒトＴ−ＩＪンパ栄 栄養ウィルス型型ＨＴＬＶ−１）、ヘルペスウィルス、あるいはＳＶ４０によっ て形質変喚されたウサギニー細胞株が、ＨＩ　Ｖ−１に感染し得ることを示した 。高い力価のＨＩ　Ｖ−１株に感染すると、ウサギ゛の細胞はＨ１’Ｖ−１に特 異的なｍＲＮＡおよびタンパク質の産生を示した。感染細胞の無細胞培養の上清 は、感染性ウィルスを含んでいる。継代によって感受性の高いヒトＴ−細胞株が 確立さ゛れたためである。

さら゛に最近になって２つの研究グループが別々に、ウサギがＨＩ　Ｖ−１に感 染し得ることを示した。ｋｕｌａｇａらがムカ上虹、Ｍｅｄ、　（１９ｇ９）に 、またＦｉｌｉｃｅらがＮａｔｕｒｅ　３３５．３６６−３６９（１９８８）に 、各々結果を公表した。しかしながら、両者の場合においては、高い力価のＨＩ 　Ｖ−１およびヒトの産生細胞が感染を行うために必要であった。ＨＩ　Ｖ−１ によるウサギ細胞′への伝染が、記載されるように、ヒトの細胞がＨｒ　Ｖ−１ に感染する間に起こるのと類似した経路をたどってなされるかどうかもわからな い。

従って本発明の゛目的は、ウィルス感染、特にヒト免疫不全ウィルス感染（ＨＩ 　Ｖ−１）の感染に対し、非トランスジェニック動物よりも感受性の高いトラン スジェニック動物を作製する方法、および手段を提供することにある。

本発明の目的はさらに、まだ感染していない個体を保護するための、安全でかつ 有効な抗ウィルス性ワク゛チンの開発、および既に感染した個体を治療する薬の 開発に用いられる、トランスジェニック動物を提供す“ることである。

本発明のもう一つの目的は、エイズを含めた゛これらウィルスによって引き起こ される疾病のためのモデルとして、ウィルス、特にＨＩＶ−１の感染性および復 製を研究する方法、および手段を提供することである。

本発明のさらにもう一つの目的は、ヒトＴ４レセプターのような、ウィルスに対 する細胞表面のレセプターの発現、あるいはヒトＴリンパ栄養ウィルス夏型（Ｈ Ｔ　Ｌ　Ｖ−１）　ｔａｘ遺伝子のような転写アクチベーターの発現を、トラン スジェニック動物、および培養細胞中に導くことができる融合遺伝子を提供する ことである。

１五二！旦 ウィルス感染、特にヒトの免疫不全ウィルスのためのトランスジェニック動物モ デルは、動物のつ、イルス感染に不可欠な成分をコードする遺伝子を胚の染色体 に組み入れることによって作製される。ウィルスの感染および複製に不可欠な遺 伝子を発現させることで、ウィルスの感染および複製を阻害する化合物をアッセ イする手段が提供される。

好ましい実施態様においては、培養細胞、あるいはトランスジ講ニック動物は、 ＨＩ　Ｖ−１による感染に必要なｌあるいはそれ以上の成分を発現するよう改変 される。この成分は、ヒトＴ４レセプターのような細胞レセプター；　ｔｘｔ、 　ｖＪ４、およびｒｅｖのような感染細胞におけるＨＩＶ−１遺伝子の発現を・ 制御する調節タンパク質；クモザルのヘルペスウィルス、ＨＴ　ＬＶ−１、ある いは５ｖ４０ウイルスよって与えられるヘルパー遺伝子の機能；およびＮＦ−ｋ Ｂ、・Ｓ　ｐ　ｌ、あるいはＡＰ−１のようなヒト細胞転写因子である。　゛　 ・　・ヒＩ”Ｃｐ、ｊ４．レセプター、すなわちヒトの細胞がＨＩ　Ｖ−１に感 染するのに必要なレセプターをリンパ系細胞の表面に発現するトランスジェニッ クマウスの産生の１例が、本発明の技術の効果を証明し・ている。　。

及ｉ旦！皇呈量里 図１は、動物のゲノムに導入したＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−１ｔａＸ融合遺伝子の概略図 である。斜線部分は、ＣＤ４遺伝子プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲ，ある いはヒトリポソームタンパク質の遺伝子プロモーターのような、組織特異的プロ モーター／エンハンサ−を示す。白い部分はＨＴＬＶ−１ｔａｘコーディング配 列を示す。ＳＶ４０転写終結シグナルは、黒い部分で示される。

図２は、Ｃ，、、Ｄ４ゲノムのクローンの概略図である。ＣＤ４ゲノムのクロー ンは、コスミドｐＷＥ１５におけるヒ・トのゲノムライブラリーより単離され、 ９ａｍＨＩおよびＮｏ　ｔ　Ｉの切断による。遺伝子地図作製により解析された 。ｐｃＤ１７Ａ、２、ｐｃＤ４．１、およびｐｃＤ２Ｂ、１の遺伝子地図は、Ｍ ａｄｄｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃ＋、　８４．９１５ ５−９１５９（１９８＋１）に公表された参照遺伝子地図をもとに構成された。

１豆旦星亙仄晟皿　・ 本発明は、ＨＩＶに感染し得る、トランスジェニック、動物および５動物細胞の 産生に関して記載している。特に下記の実施例１１、抗ＨＩ　Ｖ−１活性を有す る化合物のアッセイとして使われる、ＣＤ４〈ヒ）、Ｔ４レセプターはＨＩＶ外 被タンパク質や結合に不可欠１である）の取り込みおよび発現のための、。

ベクターの構築を示している。本実施例は、公知の技術および市販の試薬を用い て、他のタンパク質の取り込み、および発現のためのベクターを構築するため、 当業者により改変され得る。このタンパク質は、種に特異的な、あるいは組織に 特異的なウィルスに対する、抗ウイルス性化合物およびワクチンのアッセイとし て、トランスジェニック細胞および動物の発現に必要なものである。本明細書の 用語「抗ウイルス性剤（ａｒ＋ｔｉｖｔｒａｌｓ）　Ｊには、抗ウイルス性薬剤 、ワクチン、および他のウィルス特異性阻害剤が含まれる。

Ｋ鼠二Ｒｈ立二ユ ＨＩ　Ｖ−１感染に不可欠な成分は、次の３つのグループに分類され得る。　（ １）ヒトＴ４レセプターのような、ＨＩＶの結合および侵入に起因する細胞レセ プターおよび関連のタンパク質、　（２）ｔａｔ（ウィルスのトランスアクチベ ーター）、直、および工のような、感染細胞においてＨＩ　Ｖ−１遺伝子の発現 を制御する調節タンパク質、およびく３）例えばクモザルのヘルペスウィルス、 ＨＴＬＶ−１，あるいはＳＶ４０ウィルスによって提供される、ヘルパー遺伝子 機能である。そして（４）ＮＦ−ｋＢ％　Ｓｐｌ、あるいはＡＰ−１のような、 ＨＩＶの複製を担う宿主細胞因子である。

（１）ＨＴＶの結合および侵入を担う細胞レセプターおよび関連のタンパク質。

ヘルパーＴ−細胞のりンパ球としても知られる１４９７８球は、ヒトの免疫系に おいて重要な役割を果たしている。これらの細胞は、ＣＤ４と呼ばれる、細胞表 面上の糖タンパク質を発現する。ＨＩＶ感染の間、ＨＩＶの外被タンパク質ｇｐ １２０が、ＣＤ４のレセプターにしっかりと結合し、ウィルスの細胞内への侵入 を媒介する。従って、ＣＤ４レセプターは、エイズに至るＨＩＶの病原の不可欠 な成分である。最近ではＷｅｉｎｅｒらが、１個以上の非ＣＤ４タンパク質が、 ＨＩＶ−１と細胞レセプターとの相互作用に関与していることを示唆している。

しかしながら、これらのタンパク質は、クローン化あるいは精製がされていない 。

動物は、これらのタンパク質のアナログを発現し得るが、これらのタンパク質は ＨｔＶの結合および侵入に対するヒトのタンパク質よりは恐らく有効ではない。

動物を感染に対しより感受性にさせるために、ヒトのタンパク質をコードスル遺 伝子を、動物ゲノムの中に組み入れて動物体内に発現させ、）（ＩＶ感染に対し てより感受性にする。

ＣＤ４の遺伝子は、図１に示されるように、クローン化されている。ｌＦｅ１ｎ ａｒらにより記載された、タンパク質をコードする遺伝子がクローン化されると 、それらはトランスジェニック動物を作るのに使用されるベクターの構築のため に、組み換えＤＮＡ技術を用いて操作され、また作られ得る。

これらの遺伝子を含むベクターは、マイクロインジェクシ冒ンの技術によって胚 に導入される前に、ウサギ培養細胞における発現が試験され得る。

（２）感染細胞においてＨＩＶ−１遺伝子の発現を制御する、調節タンパク質。

ＨＩ　Ｖ−１は、遺伝的に複雑なウィルスである。その正常な複製周期には、多 くの調節遺伝子を必要とする。これらには、工（トランスアクチベーター）、± （分化レギュレーター）、およびｖｉｆ（感染因子）が含まれる。ＨＩＶが主と してヒトの細胞に感染する理由の一つは、これら調節タンパク質がヒト以外の宿 主細胞における発現に効果がないからだと思われる。

１！以上のＨｒ　Ｖ調節タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、ＨＩ Ｖ感染に対しより感受性であり得る。これらの遺伝子の大部分はクローン化され ている。それらは、トランスジェニック動物を作るのに用いられる発現ベクター を構築するために組換えＤＮＡの技術を用いて操作され得る。

（３）他のウィルスによって提供されるヘルパー遺伝子機能。

動物のゲノムの中に導入する融合遺伝子の構築物を形成するため、ＨＴＬＶ−ｒ 　ｔａｘ遺伝子が操作されている。Ｓｃｈｍｉｄら、ム」二組２１６．１０６５ −１０７０（１９８２＞は、ＨＴＬＶ−Ｉｔ”形質転換されたヒトＴ−細胞株は 、インビトロでのＨＩＶ−１感染に対し著しく感受性であると報告した。最近に なってＲｕｂｅｎら、Σｃｉｅｎｃｅ　２４１Ｊ９−９２（１９８８）によって 、ＨＴＬＶ−１トランスアクチベーター（ｔａＸ）遺伝子産物は、インターロイ 牛ンー２レセプター遺伝子の発現を活性化することが示された。Ｚａｃｋら、紅 」二組２４０．１０２１ｉ−１０２９（１９８８）！＝よってもまた、インビト ロでＨＩＶ−１に感染したヒト末檎血の白血球が、非感染性ＨＴＬＶ−１ウィル スピリオンによって、分裂誘発性の刺激を受けた後に、大量のＨｆ　Ｖ−１を産 生ずるよう誘発され得ることが報告された。従ってＴ−細胞で発現された１個以 上のＨＴＬＶ−■ウィルス遺伝子から誘導されるトランス遺伝子を持っている、 トランスジェニックウサギは、ＨＩＶ感染に対しより感受性になる可能性が高い 。

）（ＩＶ−１は、たとえそれがＣｏ　ｎ　Ａ、植物性赤血球凝集素、あるいはイ ンターロイキン−２によって活性化されたとしても、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１に形質転 換されたウサギ細胞に感染するが、形質転換されていない末檎血のリンパ球には 感染しない。この結果から、１個以上のＨＴＬＶ−１遺伝子産物は、形質転換さ れた細胞をＨＩＶ！！染に対し感受性にすることがわかる。

ＨＴＬＶ−１のトランスアクチベーター（ｔａＸ）が、ウィルス遺伝子のすべて をトランス活性化することに加え、感染細胞においてインターロイキン−２レセ プター遺伝子を活性化するという、Ｒｕｂａｎらの所見に基づいて、ｔａｘコー ディング配列を含む機能的転写単位が構築される。　ＮＡ　Ｔｕｇ　ｒ　Ｖｉｒ ｕｓｅｓ、　Ｗｅｆｓｓら編、箪２巻（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１１８４）に記載されるように、ｔａＸは、ＨＴＬＶ −１ゲノムにおける２つのエクソンによってコードされる。連続した完全なｔａ ｘコーディング配列は、ＨＴＬＶ−［ゲノムの一部、および化学合成されたオリ ゴヌクレオチドを用いることにより、構築され得る。

それを、適当なプロモーター／エンハンサ−により促進（開始）され、ＳＶ４０ ポリ八部位へより終結される発現ベクタ−の中に挿入する。プロモーター／エン ハンサ−は、図１に示されるように、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ ）ＬＴＲ、リポソームタンパク質遺伝子、およびＣＤ４遺伝子プロモーターを含 有している。ＨＩ　Ｖ！！！、受性がｔｔｌＫ遺伝子に起因しないことが証明さ れれば、他のウィルス細胞遺伝子は操作され、動物のゲノムの中に導入され搏る 。

（４）Ｈｔｖ遺伝子を調節する宿主細胞因子ヒト細胞因子の中には、ＨＩＶ遺伝 子の発現に重要なものもある。Ｇｒｉｆｆｉｎらは、単核細胞系列におけるＨＩ Ｖ遺伝子発現がＮＦ−ＫＢによって調節されることを報告した。同じ因子がまた 、活性化されたＴ−細胞においてＨｒＶエンハンサ−を刺激する。Ｊｏｎｅｓら は、ヒｌ−５ｐ１転写因子が、エイズレトロウィルスのＬＴＲ内にあるプロモー ター配列に結合し、インビトロでＲＮＡ合成を５〜８倍活性化させることを示し た。

これらの因子は精製が可能で、またそのｃＤＮＡは、組換えＤＮＡの技術を用い てクローン化され得る。各々のｃ　ＤＮＡは、適当なプロモーター／エンハンサ −と継ぎ合わせて、組織特異的発現ベクターを作成し得る。あるいはＮＦ−ＫＢ 、およびＳｐｌの染色体のＤＮＡがクローン化され得る。それらの内因性プロモ ーター／エンハンサ−は、遺伝子を発現させるのに使用される。ＤＮＡの構築物 は、マイクロインジェクシ璽ン法によって動物の胚の中に導入される。

感染に対しより感受性のトランスジェニック動物が作られる、好ましい実施態様 においては、他の動物、特にマウスもま・た有用であるが、トランスジェニック ウサギがＨＩＶ感染モデルとして作製される。ウサギは安価で、数が豊富にあり 、また扱い易い。その生理学、免疫学、および生理学は極めて広範囲に研究され ている。ある面では、その免疫系はヒト免疫系に類似している。

一般の二ニーシーラントウサギ、あるいはウサギニー細胞株が、適当な操作によ ってＨＩ　Ｖ−１に感染し得るという所見は１、＋ランスジェニックウサギが適 切な遺伝子操作の後にＨＩｖ−！ｌ’ＦＦｌ染により感受性になるという、強い 科学的基礎を提供する。これらのトランスジェニックウサギは、エイズのワクチ ンおよび治療法の開発にとって非常に貴重な手段となる。

理想的なウサギモデルは、ウィルス血症、潜伏、および免疫機能障害および起こ り得る腫瘍性疾患を進行させる疾病を含む、長期間のＨＩＶ惑染を模擬すること によってエイズのような疾病を発現させなければならない。これらのトランスジ ェニックウサギはまた、以下のことを研究するためにも用いられ得る。　（ａ） ウィルスの構造タンパク質および／または調節タンパク質と、宿主のそれとの間 の分子的相互作用、（ｂ）宿主免疫系を逃れるウィルスの能力、（ｃ）ＨＩＭが 正常な細胞機能および免疫機能に代わるものを誘発する、分子的メカニズム、お よび（ｄ）ウィルスの保持、潜伏、および疾病の進行の分子的メカニズム。トラ ンスジェニックウサギがＨＩＶ−１感染に対し、感受性であるが、エイズ様疾病 を発現させることができない場合でも、それらはさらなる研究にとって、そして さらに遺伝子を操作するための目的に、なお有用である。

１亘■ ヒトＣＤ４２：　の単離、ベクターの　、およびトランスジェニ、り　における 　の　°みおよび当業者には周知の組換えＤＮＡ技術を、研究に一貫して使用し た。これらの技術には、クローンニング、形質転換、スクリーニング、アガロー スゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、制限酵素切断地図、Ｄ ＮＡフラグメントの修飾、プラスミドＤＮＡの調製、サザーンブロッティング法 、およびフィルターハイプリダイゼーシ１ンが含まれる。

詳細なプロト；−ルは、Ｍａｎｉａｔｉｓら、　ｏ　ｃｕ　ｏｎ’　：Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｇ　Ｂａｒｂｏｒ、ＮＹ　 １９１１２）、Ｄａｖｉｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ＮＹ　１９８０）、あるいは多くの試薬会社より提供された手引に見出し得る。

ＤＮＡ塩基配列決定法もまた、当業者には／ｌ知の技術であり、Ｓａｎｇｅｒの チェーンターミネーション法を含む。これはｓ２ｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４８３−５４８７（１９７７ン、およ びＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９，３０９−３ ２１（１９１１１）によるもので、スプライス部位におけるＤＮＡ１１ｉ＊物の 確認のためのヌクレオチド配列の決定に用いられる。多くの製造元が試薬牛フト および詳細なプロトフールの両方を提供している。

ハイプリダイゼータ１ンのプローブ、およびＤＮＡ配列のプライマーに用いられ るオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成され る。このサービスは市販で手に入れ得る。

ヒトＣＤ４レセプター　の単 Ｃｅ１ｌ　４２．９３−１０４（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８４．９１５５−９１５９（１９８））に報告されるように、Ｍ ａｄｄｏｎらはヒトＣＤ４のｃＤＮＡ、ｔｄよびＣＤ４染色体ＤＮＡの断片をク ローン化した。

しかしながら、１個のクローン中に完°全な遺伝子は、１つも単離されなかった 。

ヒトＣＤ４のｃ　ＤＮＡは、コスミドベクターｐＷＥ１５中でクローン化された ２つのヒトの染色体のライブラリーをスクリーニングするための、ハイブリダイ ゼータ１ンブａ−ブとして用られた。ｐＷＥ　１５は、Ｗａｈｌら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵｓＡ　１１４．２１６０−２１６４（ １９８７＞により開発された。ライブラリーの１つは、ヒト胎盤ＤＮＡ由来であ り、もう１つはヒトリンパ球ＤＮＡ由来である。両方のライブラリーは、製造元 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、Ｃａ１Ｒｏｒｒ＋ｆａ）から得た。

染色体ライブラリーより単離されたヒトＣＤ４の染色体ＤＮＡを含むクローンは 、チェーンターミネーシＪン法による部分的ヌクレオチド配列決定によって確認 された。

ヒトＣＤ４染色体クローンは、制限エンドヌクレアーゼの切断地図作成によって 分析された。好ましくはプロモーター／エンハンサ−１完全なコーディング配列 、およびポリ八部位を含む完全な遺伝子のみを胚のマイクロインジェクシ■ンの 研究に用いる。ｐＷＥ１５ベクターを基本としたコスミドクローンは、３５〜４ ０ｋｌ）の染色体ＤＮＡ　（２４）を収容する能力を持つ。これは２８ｋｂの長 さの完全なヒトＣＤ４遺伝子に充分な長さである。

ヒトＣＤ４遺伝子の部分的制限酵素エンドヌクレアーゼの切断地図が図２に示さ れている。すべてのコーディング配列、およびプロモーターを含有するものを含 めた、この遺伝子の様々な領域を囲むコスミドクローンのいくつかは、ｃＤＮＡ それ自身か、あるいは５゛末端に対する３６塩基対のオリゴヌクレオチドのどち らかによって、ヒトＤＮＡの染色体ライブラリー（胎盤およびリンパ球）をスク リーニングすることにより単離された。

オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：５’−ＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡ　 ＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴ　ＴＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴ　−３’５’−ＴＴ ＣＴＧＴＧＧＧＣＴＣＡ（ｉｆｌ：ＴＣＣＣＴ　ＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴ ＴＣ−３’および ５“−ＴＧＴＡ工ＣＣＣＣＴ　ＴＴ丁ＴＴＧＣＣＣＡ　ＧＣＡＣＣＡＣ丁ＴＴ　 ＧＴ工ＴＣＣ−３°。

数種のポジイティブクローンは、インサイチ二ハイブリダイゼーシ腸ンによって 同定された。それらは、チェーンターミネータ１ン法を用いてサブクローニング および部分配列決定法により確認された。それらはさらに、挿置したｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａ　ｓあるいはオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたサザーンブロッテ ィング法を組み合わせた、制限エンドヌクレアーゼによる切断地図作製によって 分析された。Ｍａｄｄｏｎらにより公表された参照遺伝子地図と比較することに より、ｐｃＤ１７Ａ、２、ｐｃＤ４．１．　およびＰＣＤ２Ｂ、１のりｏ−ンの 遺伝子地図を構築することが可能である。ｐＣＤ１７Ａ、、２クローンは５，５ ｋｌ）の５′プロモーター／エンハンサ−を含ム、完全ナヒトＣＤ４遺伝子をカ バーしている。クローンのｐＣＤ４１は、箪２のイントロンから始まるＣＤ４遺 伝子の３°部分を含む。ｐｃＤ２Ｂ、ｌクローンは、始めの２つのエクソン、お よび５°配列の大部分しかカバーしない。ｐｃＤ１７Ａ、２の挿入部全体は、Ｎ ｏｔｒ消化によりコスミドベクターから完全な形で切り離し得る。Ｎ０ｔｌによ り産生した４０ｋｔ）の挿入部は、精製され、マイクロインジェクシ璽ン用バッ ファーに溶解され３μｇ　／　ｍ　ｌとし、ウサギ胚へのマイクロインジェクシ 賛ン用とした。

マイクロインジェクションの手順は、ｌ［ｎｉｇｈｔら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａ　ｔ ｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｆ、ＵｓＡ　８５．３１３０−３１３４＜１９８８）により 公表されたものに類似している。成体の雄および雌のウサギが、一般的に使用さ れる。ウサギ接合体のドナーは、交配の４日前に、５０国際単位の雌性線刺激ホ ルモンが皮下注射される。交配後すぐに、それらに１５０国際単位の絨毛性性腺 刺激ホルモンが静脈注射される。１９時間麦、単細胞の接合体が、ウサギドナー の卵管から流れ出て来る。

この手順を用いて得られた前核に、４０ｋｌ）のヒトＣＤ４染色体ＤＮＡ、（３ μｇ／ｍ＋）が注入された。１５０１Ｅｔ際単位の絨毛性性腺刺激ホルモンを静 脈注射するか、あるいは不稔性の雄と交配させることにより、２日早く偽妊娠さ せた受容ウサギの卵管采の末端を通して、注入された接合体は、移植された。

妊娠は完遂される。生まれた動物は、数週齢に成長させる。

リンパ球調製のため、末梢血が採血される。高分子量の染色体ＤＮＡは、リンパ 球から単離され、サザーンブロツティング法による分析に用いられる。ヒトＣＤ ４遺伝子の完全なコピーを持つトランスジェニックウサギを用いて、トランス遺 伝子の発現の証拠を試験する。例えば、トランスジェニックリンパ球をヒトＣ、 Ｄ　４ポリペプチドに対する抗体と反応させ、そしてリンパ球をフルオレセン積 置した第１抗体に対するフルオレセン１ｍした第２抗体で染色することにより行 う。機能的ヒトＣＤ４遺伝子を持っているトランスジェニックウサギのＴ４リン パ球は、その表面上にヒトＣＤ４レセプタ一分子を発現するべきである。

トランスジェニックウサギのＨＩ　Ｖ−１による感ｔｋは、にｕｌａｇａら、Ｌ 」μＬ且ｕ４（１９８９＞に従って行われる。ＨＩ　Ｖ−１による感染のために 、ＨＩ　Ｖ、１に感染した５Ｘ１０’個のＡ３．Ｏ１細胞の静脈注射をウサギに 、１回施す（Ａ３．．０１は、白血病の個体由来のヒトＴ−細胞株であり、ＨＩ 　Ｖ−１感染に対し、著しく寛容的である）ｄ　注射された細胞は、無細降培養 の上清中の多核細胞の形成、および逆転写酵素の活性をモニターすることで測定 すると、・は（２最大限に感染される。感染後３週間経過して得られた血清のサ ンプルは、ＥＬＩＺＡ法によってＤｕｐｏｎＬ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ ）製の牛ノドを用いてＨＩ　Ｖ−１タンパク質に対する抗体の存在を試験する。

さらに、ウェスタンプロｙ）法による分析を用いて、ウサギ抗体によって、ＨＩ 　Ｖ−１によってコードされたタンパク質の認謙が決定される。

宿主ＤＮＡ中のＨＩ　Ｖ−１ゲ／ムの存在はまた、ポリメラーゼ連鎖反応を用い て、遺伝子増幅により同定され得る。ＨＩＶ−１ゲノムにおける領域のプラス鎖 およびマイナス鎖にアニーリングするよう設計されたオリゴヌクレオチドのプラ イマーは、容易に特徴付けられ得る領域を増幅するよう使用され得る。

抗ウイルス性化合物、およびワクチンのスクリーニング用のトランスジェニック 動物モデル、ならびに作成方法の改変および変異は、本発明の前述の詳細な記述 から当業者には１明である。このような改変および変異は、添付の請求の範囲内 である。

国際調査報告 一一一一−＾−一一一−ベゴ／υ５９０１０５２４８“瞳“―−１−＾−−帽暑 陶一一・ＶＴ／ＩＫＯｎ／（１”ｉフム８ＰＣＴＩＴクワｎ１０５；！４８

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．抗ウィルス性を試験するためのトランスジェニック動物モデルであって、選 択されたウィルスによる真核細胞の感染に不可欠なタンパク質をコードする遺伝 子を取り込んで、発現している真核細胞を含む、トランスジェニック動物モデル 。
2. ２．前記ウィルスが、ヒト免疫不全ウィルスである、請求項１に記載のトランス ジェニック動物モデル。
3. ３．請求項１に記載のトランスジェニッタ動物モデルであって、前記不可欠なタ ンパク質が、ウィルスによる細胞内への結合および侵入を担う細胞レセプターお よび関連タンパク質、感染細胞におけるウィルス遺伝子の発現を制御する調節タ ンパク質、他のウィルスによってコードされるヘルパー遺伝子機能、およびウィ ルスの複製に関与する宿主細胞因子からなる群から選択されるトランスジェニッ タ動物モデル。
4. ４．請求項２に記載のトランスジェニッタ動物モデルであって、前記不可欠なタ ンパク質が、ＣＤ４細胞レセプター、ｔａｔ、ｖｉｆ、およびｒｅｖ調節タンパ ク質；ヘルペスウィルス、ＨＴＬＶ、およびＳＶ４０ヘルパーウィルス遺伝子の 機能的産物；および細胞因子であるＮＦ−ｋＢ、Ｓｐ１、およびＡＰ−１からな る群から選択される、トランスジェニック動物モデル。
5. ５．前記真核細胞が、細胞培養中で培養される、請求項１に記載のトランスジェ ニック動物モデル。
6. ６．前記真核細胞が、トランスジェニック動物である、請求項１に記載のトラン スジェニッタ動物モデル。
7. ７．前記動物が、トランスジェニックマウスである、請求項６に記載のトランス ジェニック動物モデル。
8. ８．前記動物が、トランスジェニックウサギである、請求項６に記載のトランス ジェニック動物モデル。
9. ９．前記遺伝子が、ＣＤ４をコードし、該ＣＤ４が、トランスジェニック動物の 細胞表面上で発現される、請求項６に記載のトランスジェニック動物モデル。
10. １０．前記動物細胞が、トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックウ サギからなる群から選択される動物である、請求項９に記載のトランスジェニッ ク動物モデル。
11. １１．ウィルスの感染あるいは複製を阻害する化合物をアッセイする方法であっ て、選択されたウィルスによる真核細胞の感染に不可欠なタンパク質をコードす る遺伝子を取り込んで、発現している真核細胞を含む、抗ウィルス性を試験する ためのトランスジェニッタ動物モデルを提供することを包含する、方法。
12. １２．前記ウィルスが、ヒト免疫不全ウィルスである、請求項１１に記載の方法 。
13. １３．請求項１１に記載の方法であって、前記不可欠なタンパク質が、ウィルス による細胞内への結合および侵入を担う細胞レセプターおよび関連タンパク質、 感染細胞におけるウィルス遺伝子の発現を制御する調節タンパク質、他のウィル スによってコードされるヘルパー遺伝子機能、およびウィルスの複製に関与する 宿主細胞因子からなる群から選択される、方法。
14. １４．請求項１１に記載の方法であって、前記不可欠なタンパク質が、ＣＤ４細 胞レセプター、ｔａｔ、ｖｉｆ、およびｒｃｖ調節タンパク質；ヘルペスウィル ス、ＨＴＬＶ、およびＳＶ４○ヘルパーウィルス遺伝子の機能的産物；および細 胞因子であるＮＦ−ｋＢ、Ｓｐｌ、およびＡＰ−１からなる群から選択される、 方法。
15. １５．前記真核細胞が、細胞培養中で培養され、さらに該細胞を、ウィルス感染 、あるいはウィルスの複製の阻害を試験するための化合物の存在下で、培養する ことを包含する、請求項１１に記載の方法。
16. １６．前記真核細胞が、トランスジェニック動物であり、さらに該動物に、ウィ ルス感染、あるいはウィルスの複製の阻害を試験するための化合物を投与するこ とを包含する、請求項１１に記載の方法。
17. １７．前記動物が、トランスジェニックマウスである、請求項１６に記載の方法 。
18. １８．前記動物が、トランスジェニックウサギである、請求項１６に記載の方法 。
19. １９．前記遺伝子が、ＣＤ４をコードし、該ＣＤ４が、細胞表面上で発現される 、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．前記動物が、トランスジェニックマウス細胞およびトランスジェニッタウ サギ細胞からなる群から選択されるトランスジェニッタ動物の細胞である、請求 項１９に記載の方法。
21. ２１．抗ウィルス性を試験するためのトランスジェニック動物モデルを作るため のベクターであって、プロモーターおよび選択されたウィルスによる細胞の感染 に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子との組合せを含有し、該組合せが、真 核細胞のゲノムの中に導入され、そして導入後、タンパク質をコードする遺伝子 を発現することができる、ベクター。
22. ２２．前記ウィルスが、ヒト免疫不全ウィルスである、請求項２１に記載のベク ター。
23. ２３．請求項２１に記載のベクターであって、前記不可欠なタンパク質が、ウィ ルスによる細胞内への結合および侵入を担う細胞レセプターおよび関連タンパク 質、感染細胞におけるウィルス遺伝子の発現を制御する調節タンパク質、他のウ ィルスによってコードされるヘルパー遺伝子機能、およびウィルスの複製に関与 する宿主細胞因子からなる群から選択される、ベクター。
24. ２４．請求項２２に記載のベクターであって、前記不可欠なタンパク質が、ＣＤ ４細胞レセプター、ｔａｔ、ｖｉｆ、およびｒｏｖ調節タンパク質；ヘルペスウ ィルス、ＨＴＬＶ、およびＳＶ４０ヘルパーウィルス遺伝子の機能的産物；およ び細胞因子であるＮＦ−ｋＢ、Ｓｐｌ、およびＡＰ−１からなる群から選択され る、ベクター。
25. ２５．前記プロモーター／エンハンサーが、ヒトＣＤ４遺伝子から誘導され、そ してＣＤ４タンパク質をコードする遺伝子と組み合わされる、請求項２２に記載 のベクター。