JPH08508642A

JPH08508642A - Ｈｉｖ及び細胞と関連する因子により制御されるデリバリーシステム

Info

Publication number: JPH08508642A
Application number: JP6520813A
Authority: JP
Inventors: ジアザック，イレーン，アン; ブラディー，ヒュー，ジョセフ，マーティン; マイルス，コリン，グレアム; ペニントン，ダニエル，ジョン; エイブラハム，ディヴィッド，ジョン; クレイグ，ロジャー，キングドン
Original assignee: メディカル・リサーチ・カウンシル; セレクシス・リミテッド
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-21
Publication date: 1996-09-17
Also published as: CA2158252A1; WO1994021806A1; AU6261494A; EP0689602A1; AU696399B2; GB9305759D0

Abstract

(57)【要約】ウイルス感染の疑いのある細胞内で効果的に直接又は間接的に感染を阻止、除去又は弱化する物質をエンコードした遺伝子を発現するのに効果的なベクターを含む有効量のデリバリーシステムを被検体に投与することを含むウイルス感染の予防又は治療方法が開示される。前記遺伝子は、ウイルス及び細胞と特定的に関連する因子を通して、細胞内において操作状態と非操作状態との間の調節を受ける。本発明の方法は、標的細胞内の遺伝子産生物の効果的な制御を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ及び細胞と関連する因子により制御されるデリバリーシステム本発明は、ＡＩＤＳの阻止又は治療のための方法に関する。より詳細には、本発明はＨＩＶの複製及び拡散を阻止するための方法及びこれを行うための薬剤に関する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体として認識されている（Barre-Sinoussi et al.，1983；Ga11o et al.，1 984）。慣用の治療戦略は、ＡＺＴ等の抗ウイルス薬剤及び防止作用を有するワクチンの開発が中心であった。しかしながら、細胞内免疫的アプローチ（Baltim ore，1988）により、ＨＩＶの複製を阻止するための分子的政略の開発が始まった（Malim et al.，1989，Trono et al.，1989，Sczakiel et al.，1991，Sull- enger et al.，1990）。インビボにおける細胞特異性療法のための分子系が記載され、それにより抗ＨＩＶ産生物をエンコードする遺伝子の発現を、特定細胞においてのみ活性のある遺伝子の調節領域によって制御することができる。これは多くの方法によって達成することができるが、ＡＩＤＳの治療において最も魅力的である二つの方法は、ＨＩＶによる感染を受けやすい細胞内における抗ウイルス遺伝子産生物の細胞特異的発現、及び実際にＨＩＶに感染した細胞のこのような発現の制限である。細胞特異的除去による治療に関する最初の研究では、ジフテリア毒Ａ又はリシンＡ鎖遺伝子等の細胞障害性剤を、水晶体（Breitman et al.，1987；Landel et al.，1988）又は下垂体（Behringer et al.，1988）特異性プロモーターの制御下において使用していた。これらの構造体のマウスの胎芽へのマイクロインジェクション、及び遺伝子導入動物の産生の結果、レンズ又は下垂体細胞の破壊が生じた。しかしながら、漏出プロモーター因子を用いる場合には、構成的細胞致死性及び哺乳類細胞のジフテリア及びリシン毒に対する極度の感受性のために、これらの毒素は体細胞療法には不適切である。ヒトに対する除去的療法において使用可能と思われるより融通性のある毒素をコードした遺伝子が記載されている（Bo-relli et al.，1988）。単純ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子産生物は致死的条件適合細胞であり、アシクロビア（ＡＣＶ）又はガンシクロビア（ＧＣＶ）等のヌクレオシド類似物の存在下においてのみ哺乳類細胞に対して毒性を有することが示されている。これらの類似物は、ｔｋ遺伝子産生物に対して高い調和性を有する一方で内在的哺乳類ｔｋに対してはほとんど又は全く調和性を有していないため、活動的サイクリング細胞を殺す。ｔｋ遺伝子導入マウスを抗ヘルペス薬剤によって処置することにより、インビボリンパ球特異的致死性のモデルシステムが立証された（Bo-relli et al.，1988，Heyman et al.，1989）。条件的毒性の特異性はリンパ球特異的転写制御因子によるものであり、ｔｋ導入遺伝子発現の水準及び／又は薬剤投与量については、量的融通性は生来のものである。これらの研究において薬剤を回収すると、成熟したリンパ球は正常な数に戻る。従って、インビボ除去システムは再発生的且つ可逆的であり、幹細胞には影響を与えないものである。抗ＨＩＶ治療において使用可能であると思われる別のシステムとして、ＨＩＶに感染しやすい細胞におけるデコイ遺伝子の発現が挙げられる。ＨＩＶウイルスの複製に関わる天然蛋白質に対する拮抗体として作用するデコイ遺伝子は、蛋白質をエンコードする。例えば、デコイ遺伝子は、宿主又はウイルスゲノム上のトランス作用因子応答部位に結合することができるが転写を活性化することができないトランス作用因子蛋白質の欠陥性突然変異体をエンコードし得る。トランスドミナント突然変異が多くのウイルス性トランス作用因子において報告されており、この突然変異により野生型蛋白質が標的遺伝子をトランス作用する能力は破壊又は弱化される。例としてＥ１Ａ（Glen et al.，1987）、ｔａｘ（Wachsman et al.，1987）、及びＶＭ６５（Friedman et al.，1988）のトランスドミナント突然変異が挙げられる。Ｔａｔトランス作用因子（Pearson et al. ，1990）及びＲｅｖトランス作用因子（Bevac et al.，1992）に関して、ＨＩＶ遺伝子における同様の突然変異が報告されている。ＨＩＶ感染細胞においてこのような突然変異体蛋白質が発現すると、天然のトランス作用因子及びその結果として生じるトランス作用活性の損失と戦うこととなる。デコイ遺伝子アプローチを用いることによる潜在的な欠点は、感染ウイルスの非存在下でデコイが発現すると、デコイ遺伝子産生物の産生により宿主免疫応答が起こり、宿主細胞が破壊されることである。従って、ＨＩＶ感染において遺伝子発現の特異性を制御し、これをＨＩＶに感染しやすい細胞、好ましくはＨＩＶ感染細胞に限定することが望ましい。従来技術において、ＨＩＶ及びＡＩＤＳに関してのみならず、この目的を解決しようと多くの方法での努力がなされてきた。まず、前述の通り、少くとも幾分かの組織特異性を示すプロモーター因子及びエンハンサー因子を選択することができる。しかしながら、遺伝子移動アプローチにおいてこのような因子を単独で使用することにより、導入遺伝子は組込部位依存状態で一定に発現されるため、抗ＨＩＶ薬剤の発現到達レベルが不確かになる。さらに条件適合細胞除去アプローチでは、不適切な組織形式における遺伝子のいかなる漏出も許容されない。遺伝子型制御領域（ＬＣＲｓ）は、遺伝子移動アプローチにおいて遺伝子の位置独立、コピー数依存発現を起こす因子である。これらの領域はまた、クローン化遺伝子の高レベル発現を許容し、組織特性を有することが示されている。グロビン遺伝子において最初に発見された（Grosveld et al.，1987）ため、これらの因子は、細胞ゲノムのクロマチン構造内における独立調節域の創生に関わり、共トランスファー遺伝子の活性を保証するものであると考えられる。グロビン遺伝子に関するもの以外の多くの遺伝子型制御領域も報告されている。例えばＴリンパ球のＣＤ２遺伝子（Greaves et al.，1989）、マクロファージのリソザイム（Bo-nifer et al.，1990）、及びＢ細胞のクラスIIＭＨＣ遺伝子（Carson and Wiles，1993）が挙げられる。遺伝子型制御領域は、クローン化遺伝子の有効な組織特異的発現を支配できることが知られている。しかしながらこれらの領域が細胞の感染状態に応答するか否かについては知られていない。ＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター因子は、ｃｉｓ−作用制御配列、エンハンサー、転写開始部位、及びＴａｔ応答領域（ＴＡＲ）からなる（Rosen et al.，1985、Jones et al.，1986、Peterlin et al.，1986、Gar -cia et al.，1987、Muesing et al.，1987、Siekevitz etal.，1987、Feng and Holland，1988、Harrich et al.，1989）。この基本的構造は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２のどちらにも保存されている（Guyader et al.，1987、Arya andGall o，1988、Markovitz et al.，1990）。一過性形質感染アッセイにおいてＴａｔが存在すると、ｍＲＮＡ転写を支配するＨＩＶロングターミナルリピートのレベルが劇的に増加することが示されている（Rosen et al.，1985、Muesing etal. ，1987、Laspia et al.，1989）。Ｔａｔトランス作用はロングターミナルリピートのためにＴＡＲ領域の存在を必要とし、非常に方向依存的且つ位置依存的である（Peterlin et al.，1986、Sharp and Marcinial，1989）。Ｔａｔトランス作用機構はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶについて共通である（Emerman et al.，1987、 Guyader et al.，1987、Fenrick et al.，1989、Shibata et al.，1990、Berkho ut et al.，1990）。しかしながら、この三つのＴａｔ遺伝子産生物は、その作用において完全には相互変換し得るものではない。この二つのＨＩＶ株からのＴａｔ遺伝子産生物及びＳＩＶ遺伝子産生物は、ＨＩＶ−２プロモーターを効果的にトランス作用し、ＨＩＶ−１プロモーター及びＳＩＶプロモーターは、それ自身の特異的なＴａｔ蛋白質によって最大限にトランス作用されるのみである（Em erman et al.，1987；Fenrick et al.，1989；Shibata et al.，1990）。これらの機能に関する研究は、Ｔａｔ蛋白質の構造及びＴＡＲ領域の幹ループ構造に関する研究に支持されている（Fenrick etal.，1989；Berkhout et al.，1990）。よってＨＩＶ−２プロモーター及びＴＡＲ因子は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に感染したヒト細胞内、又はＳＩＶ感染プライメット細胞内において最適に機能する。ＴＡＲ因子を有する５’ＨＩＶプロモーター除去構造体は、ＨＩＶプロモーターのＴａｔトランス作用が維持される一方で、転写の基礎水準が劇的に減少することを示す（Arya andGallo，1988；Berkhout et al.，1990；Zeichner et al. ，1991；Berkhout et al.，1992）。ＨＩＶ−１の５’エンハンサー／プロモーター因子は、二つのＮＦκＢ結合部位と三つのＳｐ１部位を有し、塩基の転写において優位的役割を果たす。ＮＦκＢはマイトジェン誘導Ｔ細胞等の多くの細胞型に見られる細胞転写因子である。マイトジェン誘導により、ＣＤ４＋ヒトＴ細胞におけるＨＩＶ−１関連塩基転写を増加させることができることが示されている（Nabel and Baltimor e，1987）。発癌性の研究により、この増加はＮＦκＢ部位に起源を発することがわかった。１つ以上のＳｐ１部位を除去することにより、トランス作用に影響を及ぼし、ＨＩＶプロモーターからの塩基転写を低下させることが示されている（Jo-nes et al.，1986；Harrich et al.，1989；Berkhout etal.，1992）。最後に、ＴＡＴＡ配列は塩基転写及びＴａｔ誘導転写の両方に絶対的に必要である（Garcia et al.，1989；Li et al.，1991；Berkhout et al.，1991）。ＨＩＶ −１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶは同様のエンハンサー、プロモーター、及びＴＡＲモチーフ配列を有するが、ＨＩＶ−２プロモーターの塩基及びＴａｔトランス作用転写の近位上流因子の効果は、未だ完全には分析されていない。ＨＩＶ感染の標的は、主にＣＤ４＋Ｔリンパ球であるが、マクロファージ、樹枝状細胞及び脳内に存在するいくつかの細胞（McCune改定1991）を含む。これらの細胞は、共通の造血幹細胞に由来すること、及びＨＩＶ感染感受性以外については、ほとんど共通の特徴を有さない。造血幹細胞はＨＩＶに感染しない（Moli na et al.，1990；Davis et al.，1991）。造血システム内においてＨＩＶ感染細胞のみの特異的細胞除去は、ＨＩＶ感染細胞（Ｔａｔ陽性）とＨＩＶ未感染細胞（Ｔａｔ陰性）との間のＨＩＶプロモーターに対する遺伝子発現の差異調節を必要とする。ＨＩＶ感染はＣＤ４によりウイルス侵入レベルに限定されるが、非ＣＤ４＋ヒト細胞は、形質感染の研究によって示されるように（Barry et al.，1991）、活性的にＨＩＶ配列を転写することができる。治療は、抗ウイルス配列の造血幹細胞内への誘導を必然的に伴い得る（従って抗ウイルス配列を担持する全ての前駆体及び成熟細胞型を有する完全な血液システムを創生する）ので、非感染（Ｔａｔ陰性）細胞型からの塩基転写が存在しないことを必要とする。抗ウイルス治療の目的のために上述の技術を使用するためにこれまでなされてきた試みは、いくつかの場合において、これらの問題の存在を認識していた。しかしながら、これに対する実行し得る解決を行うことについては成功していない。例えば、ＷＯ９０／１１３５９にはＴａｒトランス作用化細胞除去システムが規定されている。しかしながら、このシステムからの転写の塩基レベルは非常に高いので、ＨＩＶ陰性細胞までもが殺されてしまう。さらに、インビボでＨＩＶプロモーターの制御下において遺伝子産生物を発現するためになされてきた全ての試みでは、ウイルス感染に見られるように、Ｔ細胞発現を再産生することに失敗している。ＨＩＶプロモーターによって制御される導入遺伝子は、遺伝子導入マウスにおいて必ず異所性的に発現するが、Ｔ細胞等のリンパ性組織中では発現しない（Morr-ey et al.，1991；Skowronski 1991 ；Salomon et al.，1994）。抗ウイルス剤が異所的に発現し、また最も大切なことにはＴリンパ球においては発現しないが、伝染工程を停止するためにはＴリンパ球は保護又は特異的に除去されることが望ましいので、このような発現パターンは、抗ＨＩＶ遺伝子治療においては全く不適当である。例えばＷＯ９０／１１３５９に記載されるような方法は、使用されるプロモーター転写の塩基レベルが許容レベルまで低下されたとしても、遺伝子治療に適用できるものではない。このシステムをインビボで使用すると、ＨＩＶ感染を受けやすい細胞以外の細胞が広範囲に渡って死ぬ結果となる。本発明の第一の特徴によれば、感染を直接又は間接的に阻止し、除去し、又は弱化するのに有効な薬剤をエンコードする遺伝子を、ウイルスの感染を受けやすい細胞内において発現するのに有効なベクターを含むデリバリーシステムを、有効量で被検体に投与することを含み、該遺伝子は該ウイルス及び細胞に特異的に関連する因子により作用状態と不作用状態とに制御される、ウイルス感染の阻止又は治療のための方法が提供される。本発明の方法の薬剤をエンコードする遺伝子は、不作用状態と作用状態とに制御される。不作用状態とは、遺伝子がこの状態にある場合、遺伝子産生物の抗ウイルス効果が実質的に存在しないことを意味する。抗ウイルス遺伝子産生物が蛋白質である場合には、抗ウイルス効果が存在しないということは、通常蛋白質が産生されないことに起因し、これは細胞の蛋白質発現機構に過度の負担を追わせることを阻止する。例えば、抗ウイルス剤が不作用状態において細胞障害性剤である場合には、顕著な規模での細胞の死亡を起こすのに充分な毒素が産生されない。反対に、作用状態においては、被検体のウイルス感染を阻止、除去または弱化するために充分な抗ウイルス剤が産生される。しかしながら、二つの状態の間の制御は転写レベル以外の手段によって行われることが理解される。例えば、転写遺伝子の挿入が制御され得る。本発明の方法において使用される抗ウイルス剤は、単独または第二の薬剤との組合せによって、ウイルス感染を阻止、除去、または弱化することができるいかなる薬剤であってもよい。第二の薬剤を使用する場合には、この第二の薬剤は、非標的性態様で被検体に投与されるプロトドラッグ等のドラッグであってもよい。この第二の薬剤は、次に抗ウイルス剤によって感染部位において活性化されてもよい。適切な抗ウイルス剤としては、毒素、遺伝子転写及び蛋白質合成阻害剤、免疫活性剤、又は細胞の代謝及び生育性に直接影響を与えることができる他の薬剤、並びにドラッグ等の第二の薬剤を活性化することができる別の因子を挙げることができる。例えばこの薬剤は、酵素又はリボザイムであってもよい。さらに細胞遺伝子又はウイルス遺伝子及びデコイ遺伝子の発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似物を含む。一般的に、本明細書で使用する「ベクター」という術語は、本発明の遺伝子を構成する核酸を意味し、「デリバリーシステム」という術語は、ベクターを標的細胞に導入するために用いられる手段を意味する。これらのものは、リポソームにより運ばれるエピソームベクターの場合のように完全に分離しているか、又はウイルスベクターの場合のように密接に関連している。本発明の方法において、ベクターは細胞内に遺伝子を発現することのできるいかなる核酸であってもよい。本発明において使用するのに適した核酸ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれるか又はエピソーム状態で維持され、裸のＤＮＡ、リポソーム又はリヤプター仲介デリバリーシステム等の非ウイルスデリバリーシステムによって送達される円形及び線状ＤＮＡ、レトロウイルスベクター等のウイルスベクター、アデノ随伴又はアデノウイルスベクター、及び当業者に公知他のウイルスベースのベクターが挙げられる。好ましくはベクターのターゲティングは、デリバリーシステムがウイルスに感染しやすい細胞によって選択的に取り込まれるように、デリバリーシステムを設計することにより達成される。これはデリバリーシステムをウイルスに感染した細胞上に見られる特異的リセプターに向けることにより、又は前駆細胞に向け、それにより送達された遺伝子が、ウイルスに感染しやすい特定系統の細胞内で実質的に発現するようにすることにより行ってもよい。ベクターを多能性前駆細胞に送達すること、又は非標的デリバリーシステムを使用することには、明らかな欠点がある。特に、本発明の遺伝子をウイルス感染しやすい細胞へ選択的に送達することができず、一つ以上の細胞型が前駆体から派生し、このような細胞型のすべてが感染しやすいというわけではない。本発明によれば、前述の欠点は、組織特異的因子の制御下で遺伝子を使用することにより克服される。本発明の利点は、標的デリバリーシステムと組み合わせて使用することができ、ウイルス感染の治療における第二レベルの制御を提供する。抗ウイルス剤の制御された組織特異的発現は、ＬＣＲ配列を使用することにより造血細胞内においてインビボで効果的に達成することができる。ＨＩＶ感染の治療において、ＣＤ２及びマクロファージＬＣＲの使用が特に好ましい。組織特異的制御因子の使用は、ウイルス関連因子に応答する調節因子の使用と組み合わせられる。これにより抗ウイルス遺伝子の発現が、実際にウイルス感染した細胞においてのみ生じることが確実となる。また長期間に渡って発現され得る形質感染遺伝子産生物に対する宿主免疫応答の可能性が、顕著に削減される。この戦略は抗ウイルス剤としてのデコイ遺伝子と有利に組合される。抗ＨＩＶ療法のための適当なデコイ遺伝はＨＩＶエンコード蛋白質Ｒｅｖ，Ｔａｔ，Ｖｐｕ及びＮｅｆの誘導体を含む。突然変異型のＲｅｖ及びＴａｔの産生はＨＩＶウイルスによる感染を阻害する。組織特異性ＬＣＲを用いることにより感染突然変異体若しくは野生型蛋白質の発現水準の上昇がリンパ組織において達成され得ることが見いだされている。また、細胞を除去するか又はウイルス生育を阻止するよう作用する薬剤を用いてもよい。かような薬剤は細胞障害性ポリペプチド、リボザイム、蛋白分解酵素及びヌクレアーゼを含む。更に、ウイルス関連因子に応答する調節因子の使用によりウイルス阻害又は選択的細胞除去のためのプロドラッグアプローチの使用が可能とされる。というのは抗ウイルス遺伝子はウイルス感染の存在下においてのみ活動状態にあるからである。ウイルス関連因子とはウイルス依存する遺伝子の発現を調節することのできる因子を示すことを意図する。たとえば、該因子はウイルス感染の特定の存在下（又は不存在下）においてのみ細胞により発現される。また、該因子はウイルスによりエンコードされる。好ましくは、この因子は本発明の遺伝子の転写を調節するであろう。該因子は他の手段たとえば本発明の遺伝子の産生物を特異的に活性化することにより若しくは本発明の遺伝子と一体的に作用し、生物学的作用を潜在化することにより活性となることが予想される。たとえば、本発明の遺伝子はウイルストランス作用因子により制御されることがある。好ましくは本発明の遺伝子はウイルストランス作用因子によりトランス作用化され得るウイルスプロモーター／エンハンサーにより制御される。任意に、トランス作用を担うプロモーター／エンハンサー因子は他の非ウイルス性又は合成プロモーター／エンハンサーに組込れてそのトランス作用活性化性に寄与する。トランス作用化ウイルスプロモーターの例は当業者には明瞭であり、アデノウイルスＥＩＡプロモーター／エンハンサー、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサー、レトロウイルスＬＴＲ因子、たとえばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ＬＴＲ並びにヘルペスウイルス及びボックスウイルスからのプロモーター／エンハンサーを含む。ＨＩＶ感染の場合、Ｔａｔトランス作用因子を用いてもよい。この因子はＬＴＲなどのＴａｔ応答プロモーター中に含まれるＴＡＲ因子を介して作用する。Ｔａｒ因子により調節されるプロモーターからの発現はＨＩＶＴａｔ蛋白質の存在下に非常に増大される。従って、本発明の遺伝子からの転写はＴａｔ蛋白質が存在するＨＩＶにより感染された細胞内において非常に増大されるであろう。ＨＩＶ関連因子を通して調節を行なうためにはＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーターの使用が特に好ましい。細胞特異性遺伝子発現のためのＨＩＶ−２プロモーターの使用は前述した。しかし、このプロモーターはある薬剤と組合されると過度となる基礎転写水準を示す。従って、ＨＩＶ−２プロモーターは転写の基礎水準を減小させるため好ましくは修飾させる。修飾は多数の戦略に従ってなされる。たとえば、転写の水準を減少させる負の調節因子の使用が予想される。しかしながら、転写の基礎水準を減少させるためのプロモーター配列の修飾が特に好ましい。プロモーター配列は細胞特異性調節因子に応答する調節因子を除去するため修飾してもよい。たとえば、ＨＩＶ−２プロモーターはＳＰＩ及びＮＦκＢ因子に応答する因子を含む。故に、細胞特異性因子により活性化を担う因子は好ましくは突然変異化するか除くのがよい。細胞特異性因子による活性化を担う因子の除去又は突然変異化は転写の基礎水準を減少させるが、ウイルス特異性因子によるプロモーターのトランス作用への応答水準に、過度な程度まで悪影響を与えてはならないことが確実とならなければならないことが留意されるであろう。故に、好ましくは細胞特異性因子に応答する全ての因子が除去されるわけではない。ＨＩＶ−２プロモーターの修飾が全ての抗ウイルス剤に関連して必要ではないことが留意される。たとえば、デコイ遺伝子の発現に用いられた際に少量のプロモーターからの漏出は、被験体の細胞へ過度に害のあるものではないであろう。しかしながら、細胞障害性薬剤を発現するためプロモーターが使用された際たとえ少量の漏出でも受入れられないことが明らかであろう。本発明の方法を実行するため、本発明によれば上述の遺伝子を含むポリ核酸配列が更に提供される。本発明によれば、更に本発明のポリ核酸配列を含むベクター並びに本発明のポリ核酸配列及びベクターの治療法における使用が提供される。実施態様の詳細な説明下記の図面を参照して実施例のみにより本発明を以下に記載する。図１：ＨＩＶ−２ｔｋレトロウイルス仲介ＨＩＶ特異性細胞内分子除去の提案方法。図２：Ａ：ＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーター構造体。ＮＦκＢｄ及びＮＦκＢｐは各々遠位及び近位ＮＦκＢ部位を示す。ｍＳＰ１は突然変異ＳＰ１部位を示す。ＨＩＶ−２プロモーター配列はＰＣＲにより生成され、次いでヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）リポーター遺伝子の上流側でクローニングされ、ｐＨ２ｇｈ１〜ｐＨ２ｇｈ８を作成した。また、同一の配列が単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ遺伝子の上流側でもクローニングされ、プラスミドｐＨ２ｔｋ１〜ｐＨ２ｔｋ８を作成した。Ｂ：ＨＩＶ−２プロモーター構造体の配列。図３：一過性形質感染されたＣＯＳ細胞におけるＨＩＶ−２プロモーター構造体の異なるＴａｔ−トランス作用発現。ｐＨ２ｇｈ１，ｐＨ２ｔｋ３，ｐＨ２ｔｋ４，ｐＨ２ｇｈ５，ｐＨ２ｇｈ７及びｐＨ２ｇｈ８はＴａｔの不存在下（−）又は存在下（＋）にヒトβグロビン発現プラスミドｐβＢＳＶ３２８でＣＯＳ細胞中に共に形質感染された。形質感染された細胞からのＲＮＡはＨＩＶ−２ｔｋ又はＨＩＶ−２ｈＧＨ転写体のいずれかに特異的な³²Ｐ末端ラベルＤＮＡプローブ及びヒトβグロビン遺伝子の３’末端へ交雑された。矢印は正確に開始されたＨＩＶ−２ｈＧＨ転写体及びＨＩＶ−２ｔｋ転写体並びにβグロビン形質感染コントロール（２１２個の塩基）の３’末端により保護された断片を示す。図４：ＨＩＶ−２レトロウイルスベクターデザイン及びＨＩＶ−２ｔｋを含むレトロウイルスにて感染された細胞のウイルス通過分析。Ａ）ＳＶ４０プロモーター及び５’ＬＴＲに対して逆方向にクローニングされたＨＩＶ−２ｔｋ配列を示すｐＬＡベクターの概略図。Ａｓｐ７１８部位は図示の通りである。Ｂ）レトロウイルスＬＡ１，ＬＡ４及びＬＡ５にて感染されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のＤＮＡに関するサザンブロット分析。Ａｓｐ７１８切断ＤＮＡはｔｋ遺伝子を含むＢｇII I−ＢａｍＨＩ断片でプローブされた。プラスミドコントロールＡｓｐ７１８切断物はｐＬＡ１，ｐＬＡ４及びｐＬＡ５と記されたレーンにより示される。感染３Ｔ３細胞の集団及びクローンのＤＮＡはＬＡＩで感染された細胞についてはｐｏｐ１，３１．１及び３１．２と表示し、ＬＡ４にて感染された細胞についてはｐｏｐ４，３４．１及び３４．２と表示し、ＬＡ５にて感染された細胞についてはｐｏｐ５，３５．１及び３５．２と表示する。Ｃ）ｔｋ遺伝子によりプローブされたＬＡ１，ＬＡ４及びＬＡ５で感染されたＣＥＭ細胞の集団（ｐｏｐ１，ｐｏｐ４及びｐｏｐ５）からのＤＮＡに関するサザンブロット分析。第１，第３及び第５レーンが各プラスミドコントロールである。該集団はプロジューサーで共に培養され１−１．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８中における４週間の選択に引続いて産生された。Ｄ）ＬＡ１感染ＨｅＬａクローンＨ１．２−Ｈ１．６からのＤＮＡに関するサザンブロット分析。Ａｓｐ７１８分解ＤＮＡはｔｋ遺伝子によりプローブされた。図５：ＬＡ１にて感染された細胞におけるｔｋの異なるＴａｔトランス作用発現。Ａ）ＬＡ１にて感染されＴａｔを含む３Ｔ３細胞のＳ１分析。ＴａｔなしのＬＡ１感染３Ｔ３からのＲＮＡ及びＴａｔを含む３個のサブクローン（３１．１Ａ，Ｂ及びＣ）はＨＩＶ−２ｔｋ特異性ＤＮＡプローブ及びβアクチンプローブへ交雑した後Ｓ１ヌクレアーゼ保護により分析された。３０．１ＤはＴａｔ形質感染未感染系である。βアクチンプローブは各レーンのＲＮＡ量に対する正常化コントロールである。Ｂ）ｐＳＶ２Ｔａｔによる一過性形質感染前（−）及び後（＋）のＬＡ１により感染されたＣＥＭ細胞集団（Ｃ１）のＳ１分析。ＲＮＡはＨＩＶ−２ｔｋ及びβアクチン特異性プローブへ交雑された。βアクチンプローブは各レーンのＲＮＡ量を正常化するのに用いる。Ｃ）ｐＳＶ２Ｔａｔによる一過性形質感染前（−）及び後（＋）のＬＡ１感染ＨｅＬａクローン（Ｈ１．４，Ｈ１．５及びＨ１．２）のＳ１分析。ＨＩＶ−２ｔｋ及びβアクチン転写体の分析は上述のように行われた。図６：ＨＩＶ−２ｔｋレトロウイルス感染３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞の異なるＴａｔトランス作用除去。ＧＣＶ処理はＬＡ１感染Ｔａｔ陰性３Ｔ３細胞（３１．１）、ＬＡ１感染Ｔａｔ陽性（３１．１Ａ及び３１．１Ｂ）、未感染Ｔａｔ陽性（３０．１Ｄ）及び３Ｔ３細胞（Ａ）並びにＬＡ１感染（３１．１）、ＬＡ４感染（３４．１）及び３Ｔ３細胞（Ｂ）について行なわれた。ＴａｔなしのＬＡ−１感染ＨｅＬａ細胞（Ｈ１．４）Ｔａｔを有するＬＡ−１感染ＨｅＬａ細胞（Ｈ１．４Ａ及びＨ１．４Ｂ）並びに未感染ＨｅＬａ細胞（Ｃ）及びＬＡ−１感染（Ｈ１．４），ＬＡ４感染（Ｈ４）及びＬＡ５感染（Ｈ５）ＨｅＬａ細胞（Ｄ）へも又ＧＣＶを投与した。ＧＣＶのモル濃度は表示の通りである。図７：遺伝子導入マウスを産生するのに用いたＣＤ２ＬＣＲ及び６５０ｂｐＮｅｆフラグメントを含む構造体。図８：Ａ）ＣＤ２ｎｅｆ遺伝子導入マウスのサザンブロット。Ｂ）ｎｅｆ導入遺伝子の組織特異性調節。図９：ＣＤ２Ｎｅｆ遺伝子導入マウスのリンパ組織におけるＣＤ４及びＣＤ８細胞サブセットの分散。遺伝子導入（Ａ）Ｆ系１１４７対立遺伝子及び（Ｂ）Ｂ系１１９１対立遺伝子並びに非遺伝子導入同腹子からの胸腺細胞、リンパ節細胞及び脾臓細胞をＣＤ４（ＰＥ縦軸）及びＣＤ８（ＦＩＴＣ横軸）について染色した。Becton Dickinson ＦＡＣＳcanを用いて各サンプル中に１０⁴個の細胞を分析した。相対蛍光強度を対数スケールにて示し、双方に対する陰性細胞、双方に対する陽性細胞及びＣＤ４／ＣＤ８単独陽性細胞のパーセントを示す。図１０：Ｎｅｆ遺伝子導入胸腺細胞上のＣＤ４及び他のＴ細胞表面マーカーの発現水準。（Ａ）Ｆ系１１４７対立遺伝子及び（Ｂ）Ｂ系１１９１対立遺伝子からの非遺伝子導入及び遺伝子導入同腹子の胸腺細胞は抗ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ３及びＴｈｙ−１抗体で染色した。ヒストグラムプロットは非遺伝子導入細胞（実線）、遺伝子導入細胞（太線）及び非染色コントロール（点線）についての細胞数（縦軸）及び蛍光強度（対数スケール、横軸）を示す。図１１：Ｎｅｆ遺伝子導入マウスの胸腺細胞増殖。ＮｅｆＦ系，Ｂ系，Ａ系及びＤ系の非遺伝子導入同腹子の胸腺細胞変動数（白抜き記号）及び遺伝子導入同腹子の胸腺細胞変動数（黒塗記号）は抗ＣＤ３ε抗体及びＰＭＡで刺激され、増殖は〔³Ｈ〕チミジン導入により測定された。ＰＭＡ単独では活性化は生じなかった（図示せず）。活性度は導入〔³Ｈ〕ｃ．ｐ．ｍ対細胞数としてプロットする。図１２：ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２導入遺伝子の構造。図１３：ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２導入遺伝子による胎芽マイクロインジェクションにより産生されたＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２遺伝子導入マウスを示すＤＮＡスロットブロット。図１４：ＨｅＬａ細胞へ形質感染された際のＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２導入遺伝子の発現を示すＨｅＬａ細胞ＲＮＡのＳ１分析。図１５：Ａ：２０コピーＨＩＶ−２ＹＫＣＤ２創始動物（founder animal）由来の組織からのＤＮＡのサザンブロット分析。Ｂ：図１５Ａの創始動物（founder animal）組織由来のＲＮＡのＳ１保護分析。表１：ＣＯＳ細胞中の一過性形質感染後のｈＧＨ発現の基礎及びＴａｔトランス作用水準。ＣＯＳ細胞はｐＨ２ｇｈ１乃至ｐＨ２ｇｈ８，αβガラクトシダーゼ発現ベクターで共に形質感染され形質感染効率を正常化した。表示の場合ｐＳＶ２Ｔａｔ発現ベクター。各形質感染は少くとも３回別個の場合について２重又は３重に行われた。表２：ＣＥＭ細胞における一過性形質感染の後のｈＧＨ発現の基礎及びＴａｔトランス作用水準。ＣＥＭ細胞はｐＨ２ｇｈ１乃至ｐＨ２ｇｈ８，αβガラクトシダーゼ発現ベクターで共に形質感染され、形質感染効率を正常化した。表示の場合ｐＳＶ２Ｔａｔ発現ベクター。各形質感染は少くとも３回の独立した実験において行った。表３：ＣＤ２−ｎｅｆ遺伝子導入マウスにおけるＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞サブヤット変化。種々の年令の同腹子の３頭の遺伝子導入マウス及び３頭の非遺伝子導入マウスの胸腺細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体で染色した。１個の胸腺当り１０４個の染色細胞がBecton Dickinson ＦＡＣＳcanで分析された。双方に対する陰性集団、双方に対する陽性集団、ＣＤ４単独陽性集団、ＣＤ８単独陽性集団が分けられ、全胸腺細胞のパーヤントとして表示される。非遺伝子導入及び遺伝子導入マウスについての平均値及び標準偏差が示される。表４：ＣＤ２ｎｅｆ遺伝子導入マウスにおけるＴ細胞表面におけるＣＤ４及びＣＤ８のダウンレギュレーション。種々の年令の同腹子の３頭の遺伝子導入マウス及び３頭の非遺伝子導入マウスの胸腺細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体にて染色した。１個の胸腺当り１０⁴個の染色細胞がBecton Dickinson ＦＡＣＳcanにて分析された。ＤＮ，ＤＰ，ＣＤ４ＳＰ及びＣＤ８ＳＰ集団が分けられ次いで単一のパラメーター（ＣＤ４又はＣＤ８）ヒストグラムとして蛍光強度の対数（横軸）に対する細胞数（縦軸）で表示された。各集団の平均蛍光値が得られた。これらの値は遺伝子導入及び非遺伝子導入同腹子について平均化し、これらの間の差は非遺伝子導入マウスについての平均蛍光パーセントとして示す。Ｎ／Ｃは変化なし。物質及び方法プラスミド構造使用した全ＨＩＶ−２配列は前述のＨＩＶ−２ＬＴＲの配列に基づいた（Guya der等，１９８７）。ＨＩＶ−２ＬＴＲの領域はプラスミドｐＨＩＶ−２ＬＴＲＣＡＴ（−５５６／＋１５６）を用いたＰＣＲ増幅により形成された（Emerman等，１９８７）。オリゴヌクレオチドプライマーはクローニングの便宜のため制限酵素部位に組込んで合成された。各増幅フラグメントの３’末端はプライマー９（3'）CGTGAACC GGCCACGACCCGTTCATGACCTAGGTG（5'）からのもので、このプライマーはＨＩＶ− ２ＬＴＲ配列＋９６〜＋１１６及びＳｃａＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を端部に含む。５’末端はまたプライマー１〜５においてＨｉｎｄIII，Ｂｇ１II及びＸｈｏＩ並びにプライマー６〜８においてＨｉｎｄIIIプラスＸｈｏＩの制限酵素を含んでいた。プライマー中のＨＩＶ−２ＬＴＲ配列は次の通りであった（５’− ３’）。図２に示す構造体は対応Ｎｏ．１〜８と各場合プライマー９とから形成された。ＰＣＲ増幅は１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ₂及び２００μＭｄＮＴＰｓにおいて２００ｎｇｐＨＩＶ−２ＬＴＲＣＡＴ鋳型及び４μｌＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いて９４℃の変性、５５℃のアニーリング及び７２℃の延長にて行われた。増幅された産生物はクレノウフラグメントを用いて平滑化され、次いでＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで切断された後、ｐθ ＧＨ（Selden等，１９８６）のＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩ部位ヘクローニングされｐＨ２ｇｈ１〜ｐＨ２ｇｈ８を作成した。また、同一のＰＣＲ増幅配列を単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子へ融合した。ｐＨ２ｔｋ１，３，４及び５は各ｐＨ２ｇｈプラスミドのＨＩＶ−２ＬＴＲＢｇIII−ＳｃａＩ断片をＢａｍＨＩ直線化ｐＵＣ１９、及びｔｋ遺伝子を含むＢａｍＨＩ− ＢｇIII（クレノウ平滑化）断片（Wagner等，１９８１）へ結合することにより作成された。ｐＨ２ｔｋ７及び８は同一のｔｋ断片をＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ直線化ｐＵＣ１９及び各々ｐＨ２ｇｈ７並びにｐＨ２ｇｈ８からのＨＩＶ−２ＬＴＲを含むＨｉｎｇIII−ＳｃａＩ断片へ結合することにより作成された。構造はジデオキシシークエンシング（Sanger等，１９７７）によりチェックされた。細胞培養及び形質感染全ての細胞は５％ＣＯ₂中３７℃にて生育され全ての培地にはペニシリン１０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加えた。ＣＯＳ−７細胞は１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭ中に保持され、前述したＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ（Sambrook等，１９８９）を用いて形質感染された。一過性感染分析のため、ｐＨ２ｇｈ及びｐＨ２ｔｋプラスミド（１０〜１５μｇＤＮＡ）がｐＳＶ２Ｔａｔに対し４：１の比で形質感染された（Fenrick等，１９８９）。ラジオイムノアッセイにて分析される形質感染には正常化コントロールとして５μｇアクチンＬａｃＺが共に形質感染された。Ｓ１分析にて検定されるものには、７．５〜１５μｇのｐβＢＳＶ３２８、ヒトβ グロビン発現プラスミド、が共に形質感染された。ｐβＢＳＶ３２８はｐβＢＳＶ３２８のＢａｍＨＩ部位内ヘクローニングされたヒトβグロビン遺伝子を含む４．９ｋｂＢｇIII断片である（Grosveld等，１９８２）。ＨｅＬａ細胞は１０％ウシ胎児血清を有するＤＭＥＭに保持された。これらは４８時間細胞をＤＮＡリン酸カルシウム共沈へ露呈するリン酸カルシウム共沈手法により形質感染され、次いで回収した。ＣＥＭ細胞（ヒト白血病ＣＤ４＋細胞系）は１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ１６４０に保持された。再産生可能ＣＥＭ細胞の形質感染はエレクトロポレイション（electroporation）を用いて行われた。０．８ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０中１×１０⁷細胞／ｍｌのＣＥＭ細胞を５００μＦ及び３００Ｖにて刺激した（BioRad遺伝子パルサー）。形質感染には１００μｇＤＮＡの各ｐＨ２ｇｈプラスミド、５０μｇｐＳＶ２Ｔａｔ及び正常化コントロールとしての５０μｇｐＣＭＶＬａｃＺ発現ベクター（Tassios and LaTh angue，１９９０）を用いた。アンホトロピックレトロウイルスパッケージング細胞系ＰＡ３１７（Miller及びButtimore，１９８６）及びＡＭ１２（Markowicz 等，１９８８）は１０％ウシ新生児血清を有するＤＭＥＭに保持された。伝染性組み換えレトロウイルス産生のため、パッケージング細胞はリン酸カルシウム共沈手法を用いて各ｐＬＡベクター１２μｇで形質感染された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％ウシ新生児血清を有するＤＭＥＭに保持された。レトロウイルス感染３Ｔ３細胞はリン酸カルシウム共沈手法を用いてｐＳＶ２Ｔａｔ及びハイグロマイシン発現プラスミド（R．Zamoyskaからの）にて１０：１の比にて形質感染された。形質感染後２４時間で細胞は分割され、安定的に形質感染されたクローンがハイグロマイシンＢ（Sigma）１２０μｇ／ｍｌにおいて選択分離された。ヒト成長ホルモン及びＬａｃＺアッセイＣＯＳ及びＣＥＭ細胞の一過性形質感染後７２時間でヒト成長ホルモンリボーター遺伝子発現が測定された。形質感染された細胞から上澄液が集められ、１００μｌをTandem−ＲＨＧＨ装置（Hybritech）を用いてラジオイムノアッセイにて分泌ヒト成長ホルモンについてのアッセイに用いた。各アッセイにて作成された標準曲線から分泌ｈＧＨの水準はｎｇ／ｍｌにて測定された。擬似形質感染コントロールの少しの背影水準は形質感染サンプルの結果から差引いた。ｈＧＨ水準は共に形質感染されたＬａｃＺ発現ベクターを参釈して正常化された。アクチンプロモーター増強ＬａｃＺ発現（Gunning等，１９８７）はＣＯＳ細胞にて用い、ＣＭＶプロモーター増強ＬａｃＺ発現はＣＥＭ細胞形質感染において用いられた。形質感染の各サンプルにつき等容量の細胞の溶出物が基質クロロフェノールレッドβ−Ｄガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ，Boehringer Mannheim）を用いて前述のように（Simon及びLis，１９８７）ＬａｃＺ活性についてアッセイされた。ＲＮＡ分析前述のようにＲＮＡは３Ｍ塩化リチウム／６Ｍ尿素を用いて細胞から分離された（Fraser等，１９９０）。³²Ｐ末端ラベル化プローブを用いて全細胞ＲＮＡ０．５〜２５μｇについてAntoniou等（１９８８）に記載されるようＳ１分析を行った。図３に示されるように、ＨＩＶ−２ｈＧＨ転写体のプローブはｐＨ２ｇｈ１のＰｓｔＩ−ＡｖａＩＩ（脱リン酸化末端）であり、ＨＩＶ−２ｔｋ転写体のプローブはｐＨ２ｔｋ１からのＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ（脱リン酸化末端）断片であった。ヒトβグロビン遺伝子の３’末端のプローブ（７００個の塩基）はＥｃｏＲＩ−ＳａII断片であり、ＥｃｏＲＩは最終エキソン内にあり、α³²ＰｄＡＴＰの存在下逆転写酵素を充てんすることによりラベル化される。保護断片は２１２個の塩基である。βアクチンのための同じプローブが相互交雑によりマウス及びヒト細胞系に用いられた。ｐＨＦβＡ−１からのＸｈｏＩ−ＡｖａＩ断片（Gunn ing等，１９８３）は脱リン酸化し、末端ラベル化してヒト細胞からのＲＮＡと１４５個の塩基及びマウス細胞からのＲＮＡと１１２個の塩基を有する保護断片を与えた。転写体の倍数誘導（fold induction）はホスファーイメジャー（Mole cular Dynamics）又はジョイス−ローブルクロモスキヤンデンシトメーターで定量された。レトロウイルスベクター構造ウイルス産生及び感染レトロウイルスベクターはｐＨ２ｔｋプラスミドからのｔｋ遺伝子へ融合された選択ＨＩＶ−２ＬＴＲ配列をｐＬＡにクローニングすることにより産生された。５’−３’ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアダプターが合成された。アダプターはＸｈｏＩ部位へアニーリングするための５’オーバーハンド及びＢａｍＨＩ部位へアニーリングするための３’オーバーハンドを含んでいたが、結合後にはＸｈｏＩ又はＢａｍＨＩ部位のいずれも再形成はされないであろう。ｐＬＡはＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ直線化ｐＬＪをアダプター及びＭｏ−ＭＬＶゲノムのｇａｇ領域の一部を含むＰｖｕＩ− ＸｈｏＩ（残基４１９〜１５６０）へ結合することにより構成された。ウイルスはｐＨ２ｔｋ１，ｐＨ２ｔｋ４及びｐＨ２ｔｋ５並びにｐＬＡ５からのＨＩＶ− ２ｔｋを含むＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングすることにより作成された。パッケージング細胞系ＰＡ３１７及びＡＭ１２は上述のように形質感染された。形質感染後１日でパッケージング細胞は分割され、Ｇ４１８０．４ｍｇ／ｍｌ（Gioco-BRL）において１０〜１４日間生育された。Ｇ４１８抗抗性コロニーは分離され、前述のようにより大きい力価のクローンは細胞上澄液中のウイルスＲＮＡの分析により同定された（Huszar等，１９８９）。ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞はポリブレン８μｇ／ｍｌ中クローニングされたパッケージング細胞の上澄液で感染され、０．６ｍｇ／ｍｌＧ４１８中で選別された。ＣＥＭ細胞はStevenson等（１９８８）により前述されたようにパッケージング細胞と共に培養することにより感染された。感染集団はＧ４１８１〜１．５ｍｇ／ｍｌ中４週間後に分離された。ＨＩＶ−２ｔｋベクターにより感染された細胞にはMarkowicZ等（１９８８）に記載される方法により測定されるよう長期の培養後複製能力（コンピテント）ウイルスはなかった。ＤＮＡの分析制限酵素によって切断されたゲノムＤＮＡをサザン法によりニトランナイロンフィルターに移した。Sambrook等（１９８９）に記載されている通りに交雑と洗浄を行った。２．８ｋｂの、ｔｋ遺伝子のＢｇＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＯＬＢ標識プローブとして用いた。ガンシクロビア（Ganciclovir）処理ウシ胎児血清１０％を有するＤＭＥＭ中の３×１０⁴ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４穴のプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のそれぞれの穴に植えた。２日後、ガンシクロビア（ＧＣＶ）（Ｓｙｎｔｅｘ）を培地に様々な濃度で加え、このＧＣＶを含んだ培地は２日ごとに交換した。３７℃、５％ＣＯ₂で８日置いた後、細胞を洗浄し、７０％エタノールと５％メチレンブルーで染色した。実施例１ＨＩＶ−２プロモーターの構造体Ｔａｔトランス作用を維持する一方で修飾ＨＩＶ−１プロモーターからの基礎転写水準の減少を得ることが可能であることを示す、ＨＩＶプロモーター研究の結果に基づき、ＨＩＶ−２プロモーター配列を含むプラスミドが構成された。前記ＨＩＶ−２プロモーターは、そのＴＡＲ領域がＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶ誘導Ｔａｔに対し応答性が高く、将来もっとも広い範囲の応用と試験を提供することができるという理由で使用された。８つの最小のプロモーターの構造体（図２）を、塩基の置換、消去及び野生型ＨＩＶ−２ＬＴＲの因子結合サイトと一致した配列を組み合わせ、ＰＣＲ法を用いて発生させた。これらの構造体は全てＨＩＶ−２ＴＡＴＡ配列及びＴＡＲ領域を含み、かつ以下の５’要素を含む１）−２３０位までの野生型ＨＩＶ−２、２）最小ＴＡＴＡプロモーター、３）ＮＦκＢサイトを有するプロモーター、４）３つのＳｐ１サイトを有するもの、５）単一のＳｐ１サイトを有するもの、６）同様だがＳｐ１サイトが変異したもの、７）近位のＮＦκＢサイトと変異したＳｐ１サイト、及び８）変異した近位のＮＦκＢサイトと変異したＳｐ１サイト。プロモーター配列の構成中、可能であれば、因子結合要素とＴＡＴＡ配列との間隔を保った。ＨＩＶ−２プロモーター構造体の基礎活性は減少されるＨＩＶ−２プロモーターの基礎転写を導く能力は、形質感染したＣＯＳ及びＣＥＭ（ＣＤ４陽性ヒトＴ）細胞中のｈＧＨリポーター遺伝子の一過性発現（Seld en等、１９８６）により試験された。表１に示す通り、ｈＧＨ発現の基礎水準は、両方の細胞系の全ての修飾プロモーター構造体において減少した。ＣＯＳ細胞において、ｈＣＨ蛋白質水準は０．５２〜１．２ｎｇ／ｍｌであり、野生型プロモーター１（４．９ｎｇ／ｍｌ）の多くても４分の１であった。修飾された構造体によりＣＥＭ細胞中で産生されたｈＧＨ蛋白質の基礎水準は０．２５〜１．９ｎｇ／ｍｌであり、野生型プロモーター（３．５ｎｇ／ｍｌ）と比較して水準が２分の１〜１４分の１に減少した。全体の中で、構造体４においてもっとも低い基礎活性水準が検出された。ＮＦκＢサイトまたはＳｐ１サイトの消去は、いずれも効果的に基礎活性を減少させた。基礎活性がＳ１保護アッセイにおいてｍＲＮＡの分析によって測定された際、少量のリポーター遺伝子の転写体が検出され、減少したｈＧＨ蛋白質基礎水準と対応した。ＨＩＶ−２プロモーター構造体はトランス作用を受け、活性水準を変化することができるＨＩＶ−２プロモーター構造体について、形質感染したＣＯＳ及びＣＥＭ細胞内でＴａｔトランス作用を受ける能力を試験した。我々の結果は、両方の細胞系において全てのプロモーター配列はＨＩＶ−１Ｔａｔによってトランス作用を受ける（程度は異なるが）ことを示している（表１及び２）。ＣＯＳ細胞において、野生型のプロモーター形質感染体は、最適にトランス作用を受け、ｈＣＧの発現が２０倍になった。一方、構造体３、４、５及び７を受容した形質感染体は、４〜１０倍のトランス作用を受けた。ｈＧＨ蛋白質の水準は、構造体１で産生された１００ｎｇ／ｍｌから、構造体３、４、５及び７によってそれぞれ３、５、１２及び３．４ｎｇ／ｍｌに減少した。ＣＥＭ細胞においては、Ｔａｔトランス作用はｈＧＨ産生を大きく増加させた。野生型のプロモーターによって増強されたｈＧＨ産生は４２６ｎｇ／ｍｌに増加し、構造体３、４及び５によるｈＧＨ発現水準はそれぞれ３２、４３及び６９ｎｇ／ｍｌに上昇した。驚くべきことに、トランス作用の際、構造体５（１つのＳｐ１サイトのみ）を含むＣＯＳ及びＣＥＭ細胞が、構造体４（３つのＳｐ１サイト）より高い水準のｈＧＨを産生した。また、構造体４と５とのＣＥＭ細胞中のトランス作用度（１５３倍と１３８倍）は、野生型構造体１によりなされたＴａｔ誘導トランス作用（１２３倍）より高かった。２つのＮＦκＢサイトを有する構造体３は４３倍トランス作用を受けたのみであった。レトロウイルスベクターによるＨＩＶ−２ｔｋ配列の形質導入プロモーター構造体１、４及び５はもっとも高くトランス作用を受けた一方減少した基礎活性を持っていたので、これらのプロモーターをｔｋ遺伝子と共に、レトロウイルスベクターｐＬＡ中に逆方向に入れクローンしｐＬＡ１、ｐＬＡ４及びｐＬＡ５をそれぞれ産生した（図４Ａ）。感染３Ｔ３細胞のＧ４１８耐性による測定で、アンホトロピックプロデューサークローンＬＡ１、ＬＡ４及びＬＡ５はそれぞれ力価５×１０³、１×１０³及び５×１０³ＣＦＵ／ｍｌを有していることが分かった。ＬＡ１、４及び５プロウイルス組込み体を感染させた３Ｔ３、ＨｅＬａ及びＣＥＭ細胞を試験した際、我々は固有ウイルス（８．１ｋｂ）配列がゲノムＤＮＡに存在していることを確かに見いだした（図４）。さらに、低い頻度で、いくつかのレトロウイルスゲノムの転移を示す、より小さいｔｋ交雑バンド（７．３ｋｂ及び６．４ｋｂ）が見いだされた。前記７．３ｋｂのプロウイルス組込み体はｔｋ遺伝子のポリアデニル化シグナルの直ぐ３末端側の配列（０．８ｋｂ）を消去していることが見いだされた。トランス作用を受けたｔｋ発現は、レトロウイルス媒介遺伝子形質転換後に発生するレトロウイルス媒介遺伝子形質転換のＨＩＶ−２ｔｋ配列の発現に対する効果を調べるために、我々はＬＡ１を感染させた３Ｔ３、ＨｅＬａ及びＣＥＭ細胞中の、基礎及びトランス作用を受けたＨＩＶ−２ｔｋｍＲＮＡ水準を調べた。３Ｔ３クローン（３１．１）、ＣＥＭ集団（Ｃ１）及び３つのＨｅＬａクローン（Ｈ１．２、Ｈ１．４及びＨ１．５）のＳ１分析の結果を図５に示す。我々は感染した３１．１クローンの転写トランス作用を３つの安定なＴａｔ形質感染サブクローン（３１．１Ａ、３１．１Ｂ及び３１．１Ｃ）の分析により試験し、ｔｋ発現の３倍の増加を検出した（図５Ａ）。従来の実験結果は、これが３Ｔ３細胞において期待される最大水準のＴａｔトランス作用であることを示唆している（Ta ssios等、1990）。Ｔａｔ発現ベクターのＨ１．４及びＨ１．５クローンへの一過性形質感染の際、我々は５〜６倍の転写体の増加を観察した。前記Ｈ１．２クローンも、トランス作用を受けることができるが、より低い、約２倍程度である（図５Ｃ）。ＣＥＭ細胞もまた、４倍トランス作用を受けた（図５Ｂ）。これらの一過性アッセイを用いる際には、形質感染ＨｅＬａ及びＣＥＭ細胞の一部分のみが実際にＴａｔ発現ベクターを取り込む。ＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドの形質感染とβ−ガラクトシダーゼ染色によって測定された取り込みの効率は２〜６％と決定された（結果図示せず）。これは、これらの細胞中のトランス作用量が、さらに１６〜５０倍増加されていたことを示す。ＨＩＶ−２ｔｋ感染細胞の差異的除去レトロウイルス感染細胞を差異的に殺すことがin vitroで起こっているかどうかを決定するために、Ｔａｔ発現ベクターが安定に形質感染した後のＬＡ１感染３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞について、ガンシクロビア（Ganciclovir，ＧＣＶ）の細胞毒性効果を試験した。ＨＩＶ−２ｔｋ構造体１の基礎発現の結果、３Ｔ３細胞（３１．１）が、４μＭを越えるＧＣＶ濃度で完全に除去され（図６Ａ及びＢ）、一方０．３μＭ未満のＧＣＶは、Ｔａｔ形質感染サブクローン３１．１Ａ及び３１．１Ｂに対し完全に細胞毒性を有していた（図６Ａ）。同じレトロウイルスが感染したＨｅＬａ細胞（Ｈ１．４）は、３Ｔ３クローンに比べ、ＧＣＶに対し４０倍感受性があり、０．１μＭを越えるＧＣＶ濃度によって殺された（図６Ｃ）。２０ｎＭ程度の低いＧＣＶ濃度は、Ｔａｔ発現ＨｅＬａサブクローンＨ１．４Ａ及びＨ１．４Ｂを殺すのに十分であった。これらの結果は、レトロウイルスベクターを介しての遺伝子形質導入後における、ＨＩＶ−２プロモーターの予想しうるＴａｔ誘導トランス作用と、ヒト及びマウスの両方においての差異的ＧＣＶ感受性とを示す。修飾したＨＩＶ−２プロモーター構造体による減少した基礎活性の機能的試験として、我々はＬＡ１感染３Ｔ３細胞とＬＡ４感染細胞とのＧＣＶ感受性を比較した（図６Ｂ）。ＬＡ１感染３Ｔ３細胞（３１．１）は、４μＭを越えるＧＣＶで完全に除去され、一方ＬＡ４感染３Ｔ３細胞（３４．１）はプロドラッグに対してより感受性が低く、完全な除去のために１６μＭを越えるＧＣＶを必要とした。図６Ｄに示す通り、我々はまたＬＡ１感染ＨｅＬａ細胞のＧＣＶ感受性を、ＬＡ４及びＬＡ５感染細胞と比較した。ＬＡ１感染ＨｅＬａ細胞（Ｈ１．４）は、０．１μＭを越えるＧＣＶによって完全に除去されたが、ＬＡ４及びＬＡ５感染細胞は、細胞毒性のために１μＭを越えるＧＣＶ濃度を必要とした。かくして、ＧＣＶの基礎発現細胞に対する細胞毒性効果は、ＬＡ４及びＬＡ５レトロウイルス中の修飾ＨＩＶ−２プロモーターを用いることにより大きく減少した。実施例２ＣＤ２Ｎｅｆ遺伝子導入マウスが、胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞中でＮｅｆを発現する４系統の遺伝子導入マウスを、ヒトＣＤ２プロモーターとＬＣＲ要素と６２１ｂｐのＮｅｆフラグメントを含む構造体を用いて産生した（図７）。ＨＩＶ−１Ｎｅｆ遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を、スレオニンをアミノ酸１５位に有する１１４７とアラニンを１５位に有する１１９１のin vivoにおけるＮｅｆの効果を調べるために用いた。In vitroの研究は、両方の対立遺伝子についてのＣＤ４のダウンレギュレーションを示す（Guy等、１９９０）が、１１４７対立遺伝子のみが１５位でリン酸化を受ける。４つの系からのＤＮＡ；Ａ（１１４７）、Ｆ（１１４７）、Ｂ（１１９１）及びＤ（１１９１）をサザンブロット分析法により分析し、コピー回数を、それぞれ６、２５、４８及び２６と決定した（図８Ａ）。スロットブロットＲＮＡ分析は、４つの系全てにおいてＮｅｆ導入遺伝子の発現を示した（図８Ｂ）。発現は臓器特異的で、胸腺及び脾臓でのみ観察された（図８Ｂ）。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ転写体のプロービングとホスファーイメージング（phosuphorimaging）によるＲＮＡの定量は、発現水準が４つの異なる系においてコピー回数依存発現と一致することを示した。それぞれ６：２５：４８：２６の導入遺伝子コピー回数を持つＡ：Ｆ：Ｂ：Ｄについて、胸腺におけるＲＮＡ発現水準の比は６：２２：３０：２２であった。ウエスタンブロット分析により、４つの遺伝子導入マウス系全てのＮｅｆ蛋白質の脾臓（図８Ｃ）と胸腺（図示せず）における発現を確認した。胸腺細胞と末梢Ｔ細胞集団はＮｅｆ遺伝子導入マウスにおいて変更されるＮｅｆが遺伝子導入マウスのＴ細胞に対し効果を有していたかどうかを調べるために、胸腺、及び末梢リンパ器官即ち脾臓及びリンパ節の細胞についてＦＡＣＳ分析を行った。ＣＤ４及びＣＤ８特異的抗体を別個のＴ細胞のサブ集団の分析に使用した。図９は、遺伝子導入及び遺伝子非導入同腹子の、それぞれのＦＡＣＳ分析の例を示す。全ての系において我々はＣＤ４単独陽性（single positive ，SP）胸腺細胞のパーセントの減少と付随するＣＤ４／ＣＤ８共に陽性（double positive，DP）の細胞のパーセントの増加を観察した。共に陰性（double nega tive，DN）のものとＳＰＣＤ８細胞のパーセントがＡ、Ｄ系及びＢ系において同様に保たれた（図９Ｂ）一方、ＣＤ８ＳＰ細胞の割合は若干減少し、ＤＮ細胞はＦ系において増加した（図９Ａ）。１２のマウス同腹子（各実験ごとに、３つの遺伝子導入をしたもの及び３つの遺伝子導入をしなかった同腹子組）からのデータが比較された際、同様の統計的に有意な変化が全ての系で検出された（表３）。Ａ、Ｂ及びＤ系における胸腺細胞の細胞数の合計は、平均１０％の減少を示したが、Ｆ系において、胸腺細胞数の大きな減少（約７０％）が観察された（表２）。Ｆ系のもっとも大きな絶対数の減少は、ＣＤ４ＳＰサブセットで観察され、その結果細胞は１５分の１になった。ＣＤ８ＳＰ細胞の総数は１２分の１に減少した一方、ＤＮ細胞の数は有意には変化しなかった。Ｄ遺伝子導入系においては、胸腺細胞の総量の減少はＦ系より少なかったが、ここでもまた有意なＣＤ４ＳＰサブセットにおける減少が観察された。末梢Ｔ細胞集団が試験された際、リンパ節及び脾臓のＣＤ４ＳＰ細胞の一定しない減少が、Ａ、Ｂ及びＤ系で見られた。しかしながら、Ｆ系はリンパ節ＣＤ４ＳＰ細胞の割合の大きな減少を示した。通常遺伝子非導入リンパ節は、５１．１％（＋／−３．４）のＣＤ４ＳＰを含んでいたが、わずか１４．７％（＋／−６．７）のみがＮｅｆ遺伝子導入リンパ節において検出され、３．５分の１の減少を示した。ＣＤ８ＳＰサブセットにおいて、２３．５％（＋／−１．９）から８．５％（＋／−３．９）の減少が観察された。さらに、脾臓細胞総数はＡ、Ｂ及びＤ系では変化しなかったが、Ｆ系においては、ＣＤ４ＳＰ区分が１．５分の１に減少した。かくして、Ｎｅｆ遺伝子発現は一貫して胸腺ＣＤ４ＳＰ細胞の絶対数が減少する結果をもたらし、一つの系においてこの効果が末梢リンパ器官に対して増強された。Ｎｅｆ発現は、発生過程のＴ細胞表面のＣＤ４をダウンレギュレーションする結果をもたらすＮｅｆ遺伝子の１１４７及び１１９１対立遺伝子が形質感染したＴ細胞系のＣＤ４のダウンレギュレーションが他者によって見いだされているので、我々はＮｅｆ遺伝子導入マウス中のＴ細胞もまたin vivoにおいてＣＤ４をダウンレギュレーションするかどうかを調べた。ＦＡＣＳヒストグラム分析は、Ｎｅｆ遺伝子導入マウスの胸腺細胞においてＣＤ４の表面水準が減少したことを明らかにした（図１０）。前記ダウンレギュレーションは、４つの系全てにおいて、両方のＮｅｆ対立遺伝子について観察された（表４）。コントロールとして、ＣＤ８、ＣＤ３及びＴｈｙ−１に特異的な抗体を、ダウンレギュレーシヨン効果の特異性を調べるために使用した。両方のＮｅｆ遺伝子導入対立遺伝子について、ＣＤ８水準はわずかに減少することが見いだされ、また胸腺細胞の、通常の高ＣＤ３発現集団が、Ｆ系において大きく減少し、他の３つの系ではそれほど大きくは減少しないことが見いだされた。高ＣＤ３細胞のこの減少は、胸腺のＣＤ４ＳＰ細胞の減少とよく相関する。Ｔｈｙ−１水準は変化しなかったので、Ｎｅｆの特異的な効果が示された。どのサブセットがＣＤ４水準ダウンレギュレーションを受けているかを決定するために、我々は分けられたＣＤ４ＳＰ及びＤＰ胸腺細胞集団のヒストグラム分析を行った。１２の同腹子マウスにおいて、一致した１７％から７２％の通常水準のＣＤ４表面のダウンレギュレーションが全てのＤＰ集団において観察された。系Ｆからの胸腺細胞は、もっとも大きい水準のダウンレギュレーションを示した。いくつかのダウンレギュレーション（ＤＰ集団を除く）においてもまた、通常水準と比較して最大２８％までのＳＰ細胞の減少が見られた。リンパ節Ｔ細胞を調べた際、いくつかではあるが一致したＣＤ４のダウンレギュレーションが、Ｆ系のみにおいて観察された（結果図示せず）。これは、ＣＤ４発現の低い細胞がまれに胸腺を離れ末梢に行くことを示唆している。Ｔ細胞活性化はＮｅｆ遺伝子導入マウスにおいて減少するＣＤ４のダウンレギュレーション又はＣＤ４＋細胞の損失が、胸腺細胞又は末梢Ｔ細胞の活性化に負の効果を持っているかどうかを調べるため、分裂促進剤誘導又は抗ＣＤ３ε媒介活性化アッセイを行った。カルシウムイオノホア（イノマイシン）及びホルボールエステル（ＰＭＡ）を介して活性化させたのち³Ｈチミジンの組み込みによって測定された胸腺細胞の増殖は、両方の対立遺伝子のＮｅｆ遺伝子導入及び遺伝子非導入細胞間の小さな差異を明らかにした。これは、遺伝子導入胸腺細胞の分裂促進剤に対する全ての反応は減少されていないことを示している。しかしながら、抗ＣＤ３ε抗体とＰＭＡを有したＴ細胞リポーター− ＣＤ３複合体を介して細胞が活性化された際、遺伝子導入胸腺細胞と遺伝子非導入のものの間に、測定可能な差異が観察された（図１１Ｂ）。この活性化の減少は、Ｎｅｆ１１４７対立遺伝子と１１９１対立遺伝子の両方を持つ遺伝子導入系において見られた。これらの実験において、滴定曲線の右へのシフトは、明らかに、遺伝子非導入胸腺細胞において観察されたものと等量の活性化水準を達成するためにはより多くの遺伝子導入胸腺細胞を必要とすることを示している。これらの変化は、遺伝子導入胸腺のＳＰＣＤ４細胞の定量的な損失とよく相関している（表３）。さらに、ＣＤ３ε媒介活性化の減少が、Ｆ系からの末梢Ｔ細胞について行われた増殖アッセイにおいて観察され（結果図示せず）、リンパ節のＣＤ４ＳＰ細胞数の減少と対応した。従ってｎｅｆが胸腺細胞におけるＣＤ４発現のダウンレギュレーションを担っていることは明らかであり、我々はこれが細胞内のＣＤ４の隔絶によるものであることを見いだした。従ってＮｅｆは、細胞の感染状態を無差別的に発現している際のデコイ蛋白質としては有用ではない。実施例３ＬＣＲ存在下におけるＴ細胞中の組織特異的なＨＩＶ−２プロモーター調節遺伝子産生物発現を示すために、ＣＤ２ＬＣＲの存在下でＨＩＶ−２プロモーターの調節下においてＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子を発現する導入遺伝子を持つ遺伝子導入マウスを作成した。高水準の発現のためのＣＤ２ＬＣＲ要素を含むＨＩＶ−２ＬＴＲ増強転写ユニットの構成２つの同一なＮＦｋＢサイト、３つのＳｐ１サイト、転写開始サイト、ＴＡＴＡ配列及びＴＡＴ結合領域であるＴＡＲを含む３５０塩基対のＨＩＶ−２ＬＣＲフラグメントを、２．８ｋｂのＨＳＶ−１チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子に結合した。前記ＴＫ遺伝子は、自身の転写開始コドン、ポリアデニル化及び終止配列を含むが、プロモーターを含まない。５．５ｋｂのヒトＣＤ２ＬＣＲを含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ＨＩＶ−２ＴＫ配列の下流に結合した。完全な構造体（８．７ｋｂ）を、ＸｈｏＩを切断することによりプラスミド配列から分離することができる。ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２遺伝子導入マウスの作成ＨＩＶ−２プロモーターを含む８．７ｋｂのＸｈｏＩフラグメント、ＴＫ遺伝子及びヒトＣＤ２ＬＣＲを、受精マウス卵にマイクロインジェクションした。３２の子が生まれ、尾の生検を生後９日後に行った。ＤＮＡを調製し、スロットブロット分析を行った。図示する通り、ヒトＣＤ２プローブがスロットブロットフィルターとハイブリッド化した際、３２の尾のＤＮＡサンプルのうち７つにおいてシグナルが観察された（カラムＡ及びＢ）。導入遺伝子コピー回数のコントロール（カラムＣ）は、０、１、１０及び４０コピーのＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２構造体において期待されるシグナルを示している。遺伝子導入創始（founder）マウスのコピー回数は５回から１００回以上である。２０コピーのＨＩＶｔｋＣＤ２導入遺伝子を含む創始マウス２Ａ（図１３）を屠殺し、様々な組織からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析に用いた。ＤＮＡはＰｓｔＩ及びＸｂａＩで切断し、導入遺伝子内の内部フラグメントを解放し、１％アガロースゲルで泳動した。前記ＤＮＡはナイロンフィルターに転写し、ＣＤ２プローブとハイブリッド化した。分析された全ての組織、即ち胸腺（Ｔ）、脾臓（Ｓ）、リンパ節（ＬＮ）、脳（Ｂｒ）、心臓（Ｈ）、腎臓（Ｋ）、肺（Ｌｇ）、肝臓（Ｌｉ）及び筋肉（Ｍ）は導入遺伝子について陽性であった。これは、この創始動物はモザイクではないことを示している。ＬＮのレーンの遅い移動バンドは、このＤＮＡの一部分のみの切断物を示している。細胞当たり０、１、１０及び２０のコピー回数のコントロールが示されている（図１５ａ）。ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２導入遺伝子はＨｅＬａ細胞において大きく発現するＨｅＬａ細胞に、ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２構造体（ＨｅＬａ２）、及びコントロールとしてＨＩＶ−２ＴＫ構造体（ＨｅＬａ１）を一過性に（２４時間）形質感染させた。同時に、これらの細胞に、ＣＭＶ−グロビン定量コントロール及びＨＩＶ−２プロモーターからのトランス作用発現のためのｐＳＶ−ＴＡＴを共に形質感染させた。総ＲＮＡを、擬似形質感染ＨｅＬａ細胞及び２つの形質感染集団（ＨｅＬａ１及び２）から分離した。Ｓ１ヌクレアーゼＲＮＡ保護が行われた際、両方の形質感染した集団が高水準のＴａｔトランス作用化ＴＫ導入遺伝子の発現を示した。共に形質感染した遺伝子、ＴＡＴ及びグロビンもまた発現した。擬似形質感染したＨｅＬａ細胞においては、何の発現も観察されなかった。かくして、ＨＩＶ−２ＴＫＣＤ２構造体はヒト細胞系において、ＣＤ２ＬＣＲの存在による追加転写効果なしに発現される。ＨＩＶｔｋＣＤ２導入遺伝子のリンパ特異的発現創始遺伝子導入マウス２Ａ（ｔｇ）及び遺伝子非導入同腹子（ｎｏｎ−ｔｇ）について、ｔｋ転写体に特異的なプローブを用いてＳ１分析を行った（図１５Ｂ）。前記プローブはレーンＰに示され、ｔｋ遺伝子を発現する陽性細胞系はレーン＋に示されている。β−アクチンプローブを、それぞれの組織サンプル；即ち腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）、胸腺（Ｔ）、血液（Ｂ１）、脳（Ｂｒ）、肝臓（Ｌｉ）、肺（Ｌｇ）、リンパ節（ＬＮ）、筋肉（Ｍ）及び皮膚（Ｓｋ）のＲＮＡ量の定量に用いた。これらの結果は、リンパ組織（リンパ節、脾臓及び胸腺）発現を示しており、Ｔ細胞特異的発現を有力に示唆している。非リンパ組織では何の発現も見られないが、脳においては多少の発現が見られる。ｔａｔの非存在下で、基礎発現が観察されている。我々は、ｔａｔによるＨＩＶプロモータのトランス作用に伴い、特にリンパ組織において、転写が１００〜２００倍に増加することを期待する。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブラディー，ヒュー，ジョセフ，マーティンオランダ国シーエックス・アムステルダム・1066，プレスマンラール・121，エイチ―４，ザ・ネザーランズ・キャンサー・インスティテュート，ディヴィジョン・オブ・モリキュラー・ジェネティクス (72)発明者マイルス，コリン，グレアムイギリス国グローセスター・ジーエル２・０キューエス，アーギル・プレイス・11, マイルス (72)発明者ペニントン，ダニエル，ジョンイギリス国ランカシャー・ピーアール７・１ヴィーピー，コーリー，アストレー・ヴィレッジ，メアフィールド・５ (72)発明者エイブラハム，ディヴィッド，ジョンイギリス国ケント・エムイー20・６イーエヌ，メイドストーン，ディットン，シーダー・クロース・12 (72)発明者クレイグ，ロジャー，キングドンイギリス国チェシア・シーダブリュー11・０エックスエー，サンドバッチ，スモールウッド，スペン・グリーン，ジュビリー・ハウス・ファーム（無番地)

Claims

【特許請求の範囲】１．感染を直接又は間接的に阻止し、除去し、又は弱化するのに有効な薬剤をエンコードする遺伝子をウイルスの感染を受けやすい細胞内において発現するのに有効なベクターを含むデリバリーシステムであって、薬剤として用いるため該遺伝子は該ウイルス及び細胞に特異的に関連する因子により作用状態と不作用状態とに制御されるデリバリーシステム。２．前記遺伝子は組織特異性因子に応答する第１の調節因子とウイルス特異性因子に応答する第２の調節因子とを含む請求項１記載のデリバリーシステム。３．前記第１の調節因子が１個又はそれ以上のＬＣＲ又は機能的に同等のＬＣＲの断片を含む請求項２記載のデリバリーシステム。４．前記ＬＣＲがＣＤ２ＬＣＲ又はマクロファージＬＣＲである請求項３記載のデリバリーシステム。５．前記第２の調節因子がウイルスエンコード因子に応答する請求項２乃至４のいずれか１項記載のデリバリーシステム。６．前記ウイルスエンコード因子がウイルストランス作用因子である請求項５記載のデリバリーシステム。７．前記調節因子が任意に修飾されたウイルスプロモーターである請求項５又は６記載のデリバリーシステム。８．前記ウイルスプロモーターがＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーターである請求項７記載のデリバリーシステム。９．前記ＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーターが転写の基礎水準を減少するよう修飾される請求項８記載のデリバリーシステム。 10．前記ＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーターが図２の構造体４又は構造体５である請求項９記載のデリバリーシステム。 11．前記細胞が多能性前駆細胞である前項のいずれか１項記載のデリバリーシステム。 12．前記細胞が造血細胞である前項のいずれか１項記載のデリバリーシステム。 13．前記デリバリーシステムが、非ウイルス性デリバリーシステムである前項のいずれか１項記載のデリバリーシステム。 14．前記デリバリーシステムがリポソーム、リセプター仲介又はＤＮＡ形質感染デリバリーシステムである請求項１３記載のデリバリーシステム。 15．前記デリバリーシステムがウイルス性デリバリーシステムである請求項１乃至１２のいずれ１項記載のデリバリーシステム。 16．前記デリバリーシステムがレトロウイルス、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスデリバリーシステムである請求項１５記載のデリバリーシステム。 17．ウイルス感染を阻止し、除去し又は弱化するのに有効な前記薬剤がデコイ蛋白質である前項のいずれ１項記載のデリバリーシステム。 18．前記デコイが任意に修飾された形態のＨＩＶによりエンコードされたＲｅｖ，Ｔａｔ，Ｖｐｕ，Ｖｐｒ又はＮｅｆである請求項１４記載のデリバリーシステム。 19．ウイルス感染を阻止し、除去し又は弱化するのに有効な前記薬剤が細胞障害性剤である請求項１乃至１６のいずれか１項記載のデリバリーシステム。 20．前記細胞障害性剤が第２の薬剤と協同して作用する請求項１９記載のデリバリーシステム。 21．前記第２の薬剤がプロドラッグである請求項２０記載のデリバリーシステム。 22．細胞内においてウイルス感染を直接又は間接的に阻止し、除去し又は弱化するのに有効な薬剤をエンコードする遺伝子を含むポリ核酸配列であって、前記遺伝子は前項のいずれか１項記載のウイルス及び／又は細胞と特異的に関連する因子により作用状態と不作用状態とに制御されるボリ核酸配列。 23．請求項２２記載のポリ核酸配列を含むベクター。 24．請求項２３記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 25．治療法にて用いるための請求項２２記載のポリ核酸配列又は請求項２３記載のベクター。 26．請求項１乃至２１のいずれか１項記載のデリバリーシステム又は請求項２２記載のポリ核酸配列又は請求項２３記載のベクターの抗ウイルス療法に用いるための組成物の製造における使用。 27．請求項１乃至２１のいずれか１項記載のデリバリーシステム又は請求項２２記載のポリ核酸配列又は請求項２３記載のベクターを有効量被験体に投与することからなるウイルス感染の阻止又は治療のための方法。