KR20020048971A - 제1형 사이토카인 수용체 ｔｃｃｒ - Google Patents

제1형 사이토카인 수용체 ｔｃｃｒ Download PDF

Info

Publication number
KR20020048971A
KR20020048971A KR1020027005032A KR20027005032A KR20020048971A KR 20020048971 A KR20020048971 A KR 20020048971A KR 1020027005032 A KR1020027005032 A KR 1020027005032A KR 20027005032 A KR20027005032 A KR 20027005032A KR 20020048971 A KR20020048971 A KR 20020048971A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tccr
antibody
cells
cell
polypeptide
Prior art date
Application number
KR1020027005032A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100840033B1 (ko
Inventor
프레데릭 제이. 데사우바제
이크발 그루얼
오스틴 엘. 거니
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20020048971A publication Critical patent/KR20020048971A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100840033B1 publication Critical patent/KR100840033B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

본 발명은 알레르기 자극에 대한 반응으로 Th1 세포 또는 Th2 세포가 주로 분비하는 사이토카인에 의해 매개되는 질병을 비롯한, 면역 관련 질환의 치료 및 진단 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TCCR 유전자의 상대적인 발현 수준 및 TCCR의 아고니스트 또는 길항제에 근거하여 T 세포가 Th1 아형 또는 Th2 아형으로 편중된 분화를 하도록 하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Th1-매개 질환 및 Th2-매개 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

Description

제1형 사이토카인 수용체 ＴＣＣＲ{Type I Cytokine Receptor TCCR}
면역 관련 질환 및 염증성 질환은, 정상적인 생리 과정에서는 상해 또는 손상에 응답하여 상해 또는 손상에 대한 복구를 개시하고, 외부 생물체에 대해 선천성 및 후천성 방어 기작을 개시하는 아주 복잡하고도 흔히 여러가지의 상호 관련된 생물학적 경로의 발현 또는 결과로 인한 것이다. 정상적인 생리적 경로가 직접적으로 반응 강도에 의해, 또는 비정상적인 조절이나 과도한 자극의 결과로서, 또는 자신에 대한 반응으로, 또는 이들의 조합으로 인해 추가의 상해 또는 손상을 일으키는 경우에 질병 또는 병변이 나타난다.
이들 질병의 발병은 대개 다단계 경로를 포함하며, 대개 여러 다른 생물학적 시스템/경로가 관련되어 있지만, 이들 경로 중 하나 이상의 주요 지점에 개입하면 경감 또는 치료 효과를 얻을 수 있다. 치료적 개입은 유해한 과정/경로에 대한 길항작용 또는 이로운 과정/경로에 대한 촉진작용에 의해 나타날 수 있다.
T 림프구 (T 세포)는 포유동물의 면역 반응에서 중요한 성분이다. T 세포는 주요 조직 적합 복합체 (MHC) 내의 유전자에 의해 코딩된 자신의 분자 (self-molcule)와 결합된 항원을 인식한다. 상기 항원은 항원 전달 세포 (antigen presenting cell), 바이러스 감염 세포, 암 세포, 이식편 등의 표면에 있는 MHC 분자와 함께 드러나게 된다. T 세포계는 숙주 포유동물에게 건겅상의 위협을 주는 이들 변형된 세포를 제거한다. T 세포에는 헬퍼 T 세포 (helper T cell) 및 세포 독성 T 세포 (cytotoxic T cell)가 포함된다. 헬퍼 T 세포는 항원 전달 세포 상의 항원-MHC 복합체를 인식하고 난 후, 비약적으로 증식한다. 또한, 헬퍼 T 세포는 다양한 사이토카인, 즉 림포카인을 분비하며, 이는 B 세포, 세포독성 T 세포 및 면역 반응에 관여하는 다른 다양한 세포의 활성화에 중심적인 역할을 한다.
헬퍼 T 세포의 활성화 및 클론 확장은 체액성 면역 반응 및 세포 매개성 면역 반응 둘 모두에 있어서 중요한 사건이다. 헬퍼 T 세포 활성화는 T 세포 수용체 (TCR)-CD3 복합체와 항원 전달 세포 표면의 항원-MHC가 상호 작용함으로써 개시된다. 이러한 상호작용은 다단계 생화학 반응을 매개하여, 휴지기의 헬퍼 T 세포가 세포 주기로 진입하도록 유도하고 (G0기에서 G1기로의 전이), IL-2 및 때로는 IL-4에 대한 고 친화도 수용체의 발현을 일으킨다. 활성화된 T 세포는 주기적인 증식 및 분화를 통해 기억 세포 (memory cell) 또는 작동 세포 (effector cell)로 발달한다.
포유동물의 면역계는 다수의 독특한 세포로 구성되어 있는데, 이들 세포는 침입한 세균, 바이러스, 독소 및 다른 비-숙주 물질로부터 숙주를 방어하는 작용을한다. 면역계의 특이성에 주된 역할을 하는 세포 유형을 림프구라고 부르며, 림프구에는 B 세포 및 T 세포의 2가지 유형이 있다. T 세포는 흉선에서 발생한다는 데서 명명된 것이며, B 세포는 골수에서 발생하는 데서 명명된 것이다. T-세포군에는 억제 T 세포 (suppressor T cell), 세포독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포와 같은 수종의 아형군이 있다. T-헬퍼 세포 아군은 Th1 및 Th2의 두 가지 면역 경로를 결정한다. Th1 세포 (CD4+ 세포의 기능적 아형군)는 세포 매개성 면역 반응을 상승시키는 능력이 특징이다. Th1 세포는 사이토카인 Il-2 및 인터페론-γ를 생산하며, Il-10, Il-4,, Il-5 및 Il-6의 부재에 의해 확인된다.
Th2 세포 역시 CD4+ 세포이지만, Th1 세포와는 구별된다. Th2 세포는 항체 생산을 담당하며, 사이토카인 Il-4, Il-5, Il-10 및 Il-13을 생산한다 (도 1 참조). 이들 사이토카인은 Th1 및 Th2 반응을 상호 저해하도록 하는 데 중요한 역할을 한다. Th1 세포에 의해 생산된 인터페론-γ는 Th2 세포의 증식을 저해하는 반면 (도 2), Th2 세포에 의해 생산된 IL-10은 인터페론-γ의 생산을 억제한다 (도 2).
4개의 헬릭스 번들 (4 helical bundle) 카이토카인족의 구성원 (Bazan, J.F., 1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87:6934-8)은 T 헬퍼 세포가 공통의 전구 세포로부터 각기 다른 Th1 및 Th2 작동 세포군으로의 확장과 말기 분화에 중요한 역할을 하는 것이 발견되었다 (문헌 [O'Garra, A., 1998,Immunity, 8:275-83] 참조). IL-4는 주로 Th2 세포의 발달에 영향을 주는 반면, IL-12는 Th1 세포의 분화에 관여하는 주요 인자이다 (문헌 [Hsieh, C.S.,et al, 1993,Science,260:547-9], 문헌 [Seder, R.A.,et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10188-92], 문헌 [Le Gros, G.,et al., 1990,J Exp Med, 172:921-9], 문헌 [Swain, S.L.,et al., 1991,Immunol Rev, 123:115-44] 참조). 따라서, IL-4가 결핍되거나 (Kuhn, R.,et al, 1991,Science, 254:707-10), IL-4 수용체 사슬이 결핍되거나 (Noven-Trauth, N.,et al., 1997,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10838-43), 또는 IL-4 특이적 전사 인자 STAT6이 결핍된 (Shimoda, K.,et al., 1996,Nature, 380:630-3) 생쥐는 Th2 반응에 결손이 있는 반면, IL-12가 결핍되거나 (Magram, J.,et al., 1996,Immunity, 4:471-81), IL-12 수용체 (IL-12R) 1 사슬이 결핍되거나 (Wu, C.,et al., 1997,J. Immunol. 159:1658-65), 또는 IL-12 특이적 전사 인자 STAT4가 결핍된 (Kaplan, M.H.,et al., 1996,Nature, 382:174-7) 생쥐는 Th1 반응에 결함이 있다.
Th-1 및 Th-2 세포 아형은 Th-0 세포로 명명된 공통의 전구 세포로부터 유래된다고 여겨진다. Th-1 및 Th-2 아형의 사이토카인 생산은 상호 배타적인데 반해, Th-0 세포는 이들 사이토카인의 대부분 또는 전부를 생산한다. Th-1 및 Th-2 아형이 생산하는 상이한 사이토카인들의 분비 프로필은 작동 세포 메카니즘과 세포독성 세포의 선택에 있어 중요한 역할을 한다. Th-1 세포가 분비하는 Il-2 및 γ-인터페론은 대식세포 및 세포독성 세포를 활성화시키는 경향이 있는 반면, Th-2 세포가 분비하는 Il-4, Il-5, Il-6 및 Il-10은 호산구 및 마스트세포의 생산을 증가시킬 뿐만 아니라, IgE를 비롯한 항체의 생산을 증가시키고, 세포독성 세포의 기능을 저하시키는 경향이 있다. Th-1 반응패턴 또는 Th-2 반응 패턴으로 정해지고 나면 다른 아형군의 생산을 저해하는 사이토카인을 생산함으로써 그 패턴이 유지된다. Th-1 세포에 의해 생산된 γ-인터페론은 Il-4 및 Il-10과 같은 Th-2 사이토카인의 생산을 저해하는 반면, Th-2 세포에 의해 생산된 Il-10은 Il-2 및 γ-인터페론과 같은 Th-1 사이토카인의 생산을 저해한다.
Th1 세포 아군에 의해 생산된 사이토카인과 Th2 세포 아군에 의해 생산된 사이토카인 간의 미묘한 균형이 깨지면 숙주에게 질환이 생기게 된다. 예를 들어, Th1 사이토카인의 과생산은 자가면역성 염증 질환, 다발성 경화증 및 염증성 장질환 (예, 크론병 (Crohn's disease), 국한성 장염, 원위 회장염, 육아종성 장염, 국한성 회장염, 말단 회장염)을 일으킬 수 있다. 유사하게, Th2 사이토카인의 과생산은 아나필락시스성 과민, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 춘계 결막염, 습진, 두드러기 및 음식물 알레르기를 비롯한 알레르기성 질환을 일으킨다 (문헌 [Umetsuet al.,Soc. Exp. Biol. Med.215:11-20 (1997)] 참조).
1997년 5월 19일 출원된 국제 공개 제97/44455호 및 문헌 [Sprecheret al.,Biolchem. Biophys. Res. Commun.246:82-90 (1998)]에서는 쥐 및 인간의 TCCR 분자에 대해 특정 정도의 서열 동일성을 갖는 사이토카인 수용체 분자를 기술하고 있다. 선행 기술에서 쥐 및 인간의 사이토카인 수용체는 흉선, 비장, 림프절 및 말초 혈액 림프구를 비롯한 림프 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있고, 추가로 B-세포 및 T-세포 둘 모두에 존재하는 것으로 확인되었으며, 아마도 면역 반응의 전개와 조절에 있어서 면역 세포의 증식, 분화 및(또는) 활성화에 관련된 기능을 하는 것으로 알려졌다. 그러나, 국제 공개 제97/44455호 및 상기 스프레처(Sprecher) 등의 문헌에서는 Th1 아형과 Th2 아형으로의 T-세포 분화와 사이토카인 분비 프로필을 조절하는데 있어서 TCCR 또는 그의 상동체의 정확한 역할을 확인하지 못했고, 또한 사이토카인 T-세포 아형의 분비가 관여하는 질환의 숙주도 확인하지 못했다.
<발명의 개요>
본 발명은 인간을 비롯한 포유동물의 면역 관련 질환, 구체적으로 T-세포 분화 경로가 Th1 아형 또는 Th2 아형으로 편중되어 야기된 생리적 현상 (예, 사이토카인 분비 프로필) 및 질병의 진단과 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 TCCR (이전에 NPOR로 알려짐)의 코딩 유전자 및 아미노산 서열의 확인 (TCCR의 결여 또는 불활성화로 인해 포유동물에서 T-세포의 분화가 Th2 유형으로 편중되게 된다)에 기초한 것이다. 어떤 면역 질환은 Th1 아형 또는 Th2 아형으로 T-세포가 분화하는 것을 억제하거나 강화시킴으로써 치료가 가능하다.
또한, 본 발명은 유효량의 TCCR 길항제를 투여하는 것을 포함하는, Th1 아형 대신 Th2 아형으로 T 세포가 분화하는 것을 상승, 촉진 또는 강화하는 방법에 관한 것이다. 임의로, 상기 방법은 포유동물에게 시행하며, 유효량은 치료상 유효량이다. 임의로, 상기 TCCR 길항제는 항원 자극 (예, Il-4, Il-5, Il-10 및 Il-13)이 있을 때 T-세포를 Th2 아형 세포로 분화시켜, Th2 사이토카인 분비 프로필을 일으킨다. Th1 사이토카인의 과생산이 특징이어서 Th-2 아형의 분화 촉진을 통한 균형 유지 효과와 그에 따른 사이토카인 분비 프로필에 반응하게 되는 질병에는 자가면역성 염증 질환 (예, 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병,자가면역성 포도막망막염, 염증성 장질환 (예, 크론병, 궤양성 장염), 자가면역성 갑상선 질환) 및 동종이식편 거부 반응이 포함된다.
또한, 본 발명은 유효량의 TCCR 또는 아고니스트 (agonist)의 투여를 포함하는, Th2 아형으로 T-세포의 분화를 방지, 저해 또는 약화시키는 (즉, Th1 아형으로의 분화를 일으키는) 방법에 관한 것이다. 임의로, 상기 방법은 포유동물에게 시행하며, 유효량은 치료상 유효량이다. 임의로, 이 TCCR 또는 아고니스트에 의해 유도된 분화는 항원 자극 (예, γ-인터페론)이 있을 때 Th1 사이토카인 분비 프로필을 일으킨다. Th2 사이토카인의 과생산 (또는 Th1 사이토카인의 불충분한 생산)이 특징이어서 Th1 아형의 분화 촉진을 통한 균형 유지 효과에 반응하게 되는 질병에는 감염성 질환 (예, 레이시마니아 매이저 (Leishmania major), 마이코박테리움 레프래 (Mycobacterium leprae), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondi), 호흡기 합포체 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스) 및 알레르기성 질환 (예, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 춘계 결막염)이 있으며, 이를 치료하는 데 효과적일 것으로 기대된다.
한 실시 태양에서, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체 (예, 항-TCCR)에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 항체는 TCCR 폴리펩티드의 활성을 모방하거나 (아고니스트 항체), 역으로 TCCR 폴리펩티드의 활성을 저해 또는 중화시킨다 (길항제 항체). 다른 측면에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는다. 상기 항체는 표지될 수 있고, 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 추가의측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 항-특수형 항체이다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 상기 기술한 용도를 갖는 조성물 또는 의약을 제조하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 용도에 관한 것이다.
추가의 실시 태양에서, 본 발명은 항-TCCR 항체를 코딩하는 핵산 및 그러한 핵산을 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 추가의 실시 태양에서, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에서 배양하고, 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수함으로써 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드의 하나 이상의 기능 또는 활성을 저해하는 TCCR 폴리펩티드의 길항제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드의 하나 이상의 기능 또는 활성을 촉진 또는 상승시키는 TCCR 아고니스트에 관한 것이다. 그러한 길항제 및(또는) 아고니스트는 TCCR 변이체, 펩티드 단편, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA), 리보자임 또는 항체 (모노클로날 항체, 인간화 항체, 특이적 항제, 단일쇄 항체, 이종접합 항체 또는 상기 언급한 항체의 단편)인 것이 바람직하다. 또한, TCCR 아고니스트는 잠재적인 TCCR 리간드를 포함할 수 있으며, 잠재적인 TCCR 길항제는 가용성 TCCR 세포외 도메인 (ECD)을 포함할 수 있다.
추가의 실시 태양에서, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 상보체에 혼성화하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 DNA인 것이 바람직하며, 혼성화는 엄격 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 그러한 핵산 분자는 본원에서 확인된, 증폭된 유전자의 안티센스 분자로서 작용할 수 있으며, 따라서 각각의 증폭된 유전자의 조절에, 또는 증폭 반응에 있어서 안티센스 프라이머로서 그 유용성이 있다. 또한, 그러한 서열은 라이보자임 및(또는) 삼중 나선 서열의 일부로서 사용할 수 있으며, 따라서 증폭된 유전자의 조절에 이용할 수 있다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 세포를 항-TCCR 항체에 노출시키는 단계 및 그 세포에 대한 항체의 결합 여부를 결정하는 단계를 포함하는, TCCR 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시 태양에서, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을, (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료에서 및 (b) 동일한 세포 유형의 이미 알고있는 정상적인 조직 세포의 대조구 시료에서 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서 Th1-매개 질환 또는 Th2-매개 질환을 진단하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 시험 시료에서의 발현 수준이 대조구에 비해 낮은 것은 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 Th2-매개 질환이 존재함을 나타내고, 상기 시험 시료에서의 발현 수준이 대조구에 비해 높은 것은 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 Th-1 매개 질환이 존재함을 나타낸다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 항-TCCR 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료와 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 시험 시료 내에서 항체와 TCCR 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 검출은 정성적 또는 정량적으로 수행할 수 있고, 동일한 세포 유형의 이미 알고 있는 정상적인 조직 세포인 대조구 시료에서 복합체 형성을 모니터링한 것과 비교하여 수행할 수 있다. 시험 시료 내에 형성된 복합체의 양이 더 많은 경우는 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 TCCR 및 Th1-매개 질환이 존재함을 나타내며, 그 양이 더 적은 경우는 그 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 Th2-매개 질환이 존재함을 나타낸다. 항체에 검출 가능 표지를 붙이는 것이 바람직하다. 예를 들어, 복합체 형성은 광학 현미경, 플로우 싸이토미터법, 형광측정법 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 시험 시료는 일반적으로 면역계에 결함 또는 이상이 있는 것으로 의심되는 개체로부터 얻는다.
다른 실시 태양에서, 본 발명은 적합한 포장 내에 항-TCCR 항체 및 담체 (예, 완충액)를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 항체를 사용하여 TCCR 폴리펩티드를 검출하는 방법에 대한 지시서를 포함하는 것이 바람직하다.
추가의 실시 태양에서, 본 발명은 용기 (container), 용기 표면의 라벨 및 용기 내에 담긴 활성 성분을 포함하는 조성물을 포함하는 제품에 관한 것이다. 상기 조성물은 포유동물에서 면역 반응을 촉진 또는 저해하는데 효과적인 것이고, 용기 표면의 라벨은 상기 조성물이 면역 관련 질환을 치료하는 데 이용될 수 있음을 표시하는 것이고, 상기 조성물 내의 활성 제제는 TCCR 폴리펩티드의 발현 및(또는) 활성을 촉진 또는 저해하는 제제이다. 바람직한 측면에서, 상기 활성 제제는 TCCR 폴리펩티드 또는 항-TCCR 항체이다.
추가의 실시 태양은 후보 화합물과 TCCR 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 시간과 조건 하에 이들 두 성분을 접촉시키는 것을 포함하는, TCCR 폴리펩티드의 발현 및(또는) 생물학적 활성을 조절할 수 있는 화합물의 확인 방법이다. 구체적인 측면에서, 후보 화합물 또는 TCCR 폴리펩티드 중 어느 하나는 고체 지지체 상에 고정한다. 다른 측면에서, 고정되지 않은 성분에는 검출 가능 표지를 붙인다.
본 발명은 신규 DNA의 확인 및 단리, 신규 폴리펩티드의 재조합 생산, 및 면역 관련 질환의 진단 및 치료용 조성물 및 그 방법, 특히 Th1 아형 및 Th2 아형으로의 T-세포 분화 및 사이토카인 분비 프로필을 조절하는 방법과 사이토카인 분비 프로필에 관련된 질환이 있는 숙주에 관한 것이다.
도 1은 CD4+ T 세포의 Th1 및 Th2 세포로의 분화, 분화에 영향을 주는 주된 사이토카인, 항원 자극시 각각의 아군으로의 분화에 의해 분비되는 주된 사이토카인 및 분비된 사이토카인 프로필에 의해 매개되는 생리적 작용에 대한 모식도이다.
도 2는 Th1 T-세포 아형에 의해 분비된 사이토카인과 Th2 T-세포 아형에 의해 분비된 사이토카인 간의 상호관계를 설명하는 음성 피드백의 순환에 대한 모식도이다.
도 3은 인간 TCCR (hTCCR)의 아미노산 서열 (서열 1)을 도시하고 있다. 상기 서열은 1996년 5월 23일 출원된 국제 공개 제97/44455호에도 기재되어 있으며, 또한 진뱅크 (GenBank)에 수탁 번호 4759327로 올라있다. 또한, 이 서열은 문헌 [Sprecheret al.,Biochem. Biophys. Res. Commun.246(1):82-90 (1998)]에 기술되어 있다. 서열 1에서, 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1번 내지 약 32번으로 확인되었고, 막횡단 도메인은 아미노산 잔기 약 517번 내지 약 538번으로, N-글리코실화 부위는 잔기 약 51번 내지 54번, 76번 내지 79번, 302번 내지 305번, 311번 내지 314번, 374번 내지 377번, 382번 내지 385번, 467번 내지 470번, 563번 내지 566번으로, N-미리스토일화 부위는 잔기 약 107번 내지 112번, 240번 내지 245번,244번 내지 249번, 281번 내지 286번, 292번 내지 297번, 373번 내지 378번, 400번 내지 405번, 459번 내지 464번, 470번 내지 475번, 531번 내지 536번 및 533번 내지 538번으로 확인되었고, 원핵세포막 지단백질의 지질 부착 부위는 잔기 약 522번 내지 532번으로, 성장 인자 및 사이토카인 수용체족의 시그너처 1 (signature 1) 서열은 잔기 약 41번 내지 54번으로 확인되었다. 또한, 잔기 183번 내지 191번에서 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 위한 수용체의 두번째 서브유닛과 상당한 상동성이 있는 영역이 있다.
도 4는 쥐 TCCR (mTCCR)의 아미노산 서열 (서열 2)을 도시하고 있다. 상기 서열은 1996년 5월 23일 출원된 특허 WO97/44455호에도 기재되어 있으며, 또한 진뱅크에 수탁 번호 7710109로 올라있다. 또한, 이 서열은 문헌 [Sprecheret al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(1):82-90 (1998)]에도 기술되어 있다. 서열 2에서, 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1번 내지 약 24번으로 확인되었고, 막횡단 도메인은 아미노산 잔기 약 514번 내지 약 532번으로, N-글리코실화 부위는 잔기 약 46번 내지 49번, 296번 내지 299번, 305번 내지 308번, 360번 내지 361번, 368번 내지 371번 및 461번 내지 464번으로, 카세인 키나제 II 인산화 부위는 잔기 약 10번 내지 13번, 93번 내지 96번, 130번 내지 133번, 172번 내지 175번, 184번 내지 187번, 235번 내지 238번, 271번 내지 274번, 272번 내지 275번, 323번 내지 326번, 606번 내지 609번 및 615번 내지 618번으로, 티로신 키나제 인산화 부위는 잔기 약 202번 내지 209번으로, N-미리스토일화 부위는 잔기 약 43번 내지 48번, 102번 내지 107번, 295번 내지 300번, 321번 내지 326번, 330번 내지 335번, 367번 내지 342번, 393번 내지 398번, 525번 내지 530번 및 527번 내지 532번으로, 아미드화 부위는 잔기 약 240번 내지 243번, 원핵세포막 지단백질의 지질 부착 부위는 잔기 약 516번 내지 526번으로 확인되었고, 성장 인자 및 사이토카인 수용체족의 시그너처 1 서열은 잔기 약 36번 내지 49번으로 확인되었다. (1) 인간 에리트로포이에틴 (erythropoietin)과 상당한 상동성이 있는 영역은 잔기 약 14번 내지 51번이고, (2) 쥐 인터루킨-5 (interleukin-5) 수용체와 상당한 상동성이 있는 영역은 잔기 약 211번 내지 219번이다.
도 5는 hTCCR (서열 1) 및 mTCCR (서열 2)를 비교한 것이다. 동일한 아미노산은 음영 처리하였고, 최적화된 정렬을 위해 도입된 갭 (gap)은 대시 (-)로 나타내었다. 신호 펩티다제 절단 예측 부위는 화살표 머리로 나타내었다. 잠재적인 N-글리코실화 부위는 별표로 나타내었다. WSX 모티프, 막횡단 도메인 및 box1 모티프는 상자로 표시하였다.
도 6은 성인 조직 및 태아 조직에서의 발현 프로필을 나타내는 인간 TCCR의 노던 블롯 (Northern blot)이다. 성인의 경우, hTCCR은 흉선에서 가장 많이 발현되고, 또한 말초 혈액 백혈구 (PBL), 비장에서도 신호가 존재하며, 뿐만 아니라 폐에서도 약한 발현이 존재한다. 태아 조직의 경우, TCCR은 폐 및 신장에서 약한 발현을 나타내고 있다. TCCR의 발현 프로필은 TCCR이 혈구 발생 및 분화, 특히 흉선 세포의 혈구 발생 및 분화에 관여할 수 있음을 나타내고 있다.
도 7(A-B)는 TCCR -/- 생쥐에서 T 세포의 개수 및 표현형을 관찰한 것이다. 도 7A는 TCCR -/- 생쥐로부터 얻은 CD4+/CD8+ T 세포의 FACS 분석 결과에 대한 등고선 도식 (야생형과의 비교 그림)이다. 도 7B는 CD4+/CD8+/TcR+의 FACS 분석 결과에 대한 등고선 도식이다. TCCR -/- 생쥐에서 T 세포의 개수에 주목할만한 차이가 없는 것은 T 세포 증식이 손상되지 않았음을 의미하는 것이다.
도 8(A-B)는 인간 T 세포에서의 TCCR의 발현을 관찰한 것이다. 도 8A는 인간 T 세포에서의 인간 TCCR 및 pan T 세포 표면 마커 CD2에 대한 FACS 분석의 등고선 도식이다. 도 8B는 인간 B 세포에서 인간 TCCR 및 B 세포 표면 마커 CD20에 대한 FACS 분석 등고선 도식이다. 두 도면 중 가장 좌측의 도식은 적절한 형광 색소 (fluorochrome)를 붙인 2차 항체를 나타내고 있다. 통합하여 볼 때, 도 8A 및 8B는 TCCR이 인간 T 세포의 아군에는 존재하며 B 세포에서는 감지 가능한 양만큼 존재하지 않음을 보여주고 있다.
도 9(A-C)는 상동 재조합을 이용한 TCCR 유전자 표적화 방법에 대한 모식도이다. 도 9A는 TCCR 엑손 (채워진 상자로 표시됨) 및 인트론 (상자 사이에 그은 선)이 있는 야생형 대립 유전자를 나타내고 있다. "E" 및 "B"는 각각 EcoRI 및 BamHI 엔도뉴클레아제로 절단되는 부위를 나타낸다. 도 9B는 TCCR의 엑손 3 내지 8이 플라스미드 벡터 pGK-neo로부터 유래된 네오마이신 내성 유전자로 치환된 표적화 벡터를 도시하고 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터 유래된 티미딘 키나제 유전자 (갠시클로비어 (gancyclovir)로부터의 선별적 압력에 대한 내성을 부여하는 유전자)가 엑손 1의 5'에 삽입되었다. 도 9C는 내생 유전자와 표적화 벡터 간의 상동 재조합이 일어난 후 최종 표적화 또는 "녹아웃 (knockout)" 대립 유전자를 나타내고 있다.
도 10(A-C)는 각각 TCCR 표적화 벡터로 형질 감염 (transfection)되었음을 확증하는 서던 블롯 (Southern Blot), PCR 반응의 전기영동 영상 및 노던 블롯이다. 도 10A는 게놈 DNA를 네오마이신/갠시클로비어 약물 선별에 대해 내성인 ES 세포로부터 얻고, 이를 TCCR에 대해 특이적인 방사성 표지 프로브와 혼성화시킨 것이다. 좌측으로부터 두번째 레인에서, 10 Kb 및 12 Kb 단편 둘 모두가 존재하는 것은 TCCR 대립 유전자 중 하나가 제거되었음을 나타내는 것이다. 도 10B는 TCCR -/- 생쥐 꼬리로부터 얻어 PCR로 증폭한 게놈 DNA의 반응 산물이다. PCR 프라이머는 야생형 TCCR 대립 유전자와 재조합 실험으로부터 생성된 표적화 ("녹아웃") 대립 유전자를 구별할 수 있도록 설계하였다. 레인 1 및 레인 2 (좌측으로부터 계수)는 TCCR 야생형을 나타내는 밴드 패턴을 보여주고 있다. 레인 3은 TCCR -/- 생쥐로부터의 PCR 밴드이며, 레인 5 및 6은 TCCR 이형접합체 생쥐 (+/-)의 것을 나타내고 있다. 도 10C는 TCCR에 특이적인 프로브와 혼성화시킨 노던 블롯이다. 레인 1은 TCCR -/- 생쥐로부터 얻은 것이고, 레인 2는 야생형 생쥐로부터 얻은 것이다. TCCR -/- 생쥐로부터 아무 신호도 없는 것은 TCCR의 기능적 전장 mRNA가 생산되지 않았음을 나타내는 것이다.
도 11(A-B)는 TCCR -/- 생쥐에서 알레르기성 기도 염증의 증가를 나타낸 것이다. 도 11A는 폐에 침윤하는 림프구의 개수를 측정한 결과 진드기 항원 (DMA)으로 감작화된 TCCR -/- 생쥐가 보다 큰 Th2 반응을 나타낸다는 것을 보여주고 있다.
도 12(A-B)는 IFN-γ의 생산량을 측정하여 얻은 TCCR -/- 생쥐에서의 Th1/Th2 반응을 그래프로 도식화한 것이다. 도 12A에서, TCCR -/- 생쥐로부터 단리한 T-세포는 Th1 경로에 따른 분화를 일으키는 IL-12과 함께 배양시켰다. 이들 세포에 대해 IFN-γ, IL-4 및 IL-5의 생산량을 분석 시험하였다. 도 12A에서 엷게 음영처리된 막대가 나타내는 바와 같이, IFN-γ가 TCCR -/- 생쥐에서 현저하게 낮은 수준으로 생산되었다. 이는 TCCR -/- 생쥐에서 Th1 반응이 크게 약화되었음을 나타내는 것이다. 도 12B는 Th2 경로에 따른 분화를 일으키는 IL-4와 함께 T-세포를 배양한 결과를 그래프로 도식화한 것이다. 이는 사이토카인 생산량이 TCCR -/- 생쥐의 T 세포와 야생형 대조구 세포 간에 차이가 없음을 나타내고 있다.
도 13은 TCCR -/- 생쥐에서 생산된 Ig 수준을 그래프로 도식화한 것이다. Ig 아형인 IgG1, IgG2, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA의 수준을 관찰하였다. 엷게 음영처리된 막대가 나타내는 바와 같이, TCCR -/- 생쥐는 야생형 대조구에 비해 IgG2a를 적게 생산하였다. 나머지 IgG 수준은 그리 다르지 않았다. IgG2a는 Th1 세포에 의해 생산되며, TCCR -/- 생쥐에서 그 부재가 확연한 것은 본 명세서에 기재한 다른 분석 시험에서 관찰된 Th1 반응의 감소를 확증하는 것이다.
도 14는 오발부민 (ovalbumin)으로 이미 면역화된 TCCR -/- 생쥐에서 생산된 IgG 수준을 그래프로 도식화한 것이다. 생쥐에게 1일 및 21일째 되는 날에 OVA 100 ㎍을 주사하고, 26일째 되는 날에 채혈하였다. 야생형과 비교하여 동형접합 녹아웃 생쥐에서의 IgG1 및 IgG2a의 수준을 측정하였다. 그래프의 좌측면에 나타난 바와 같이, IgG1 수준은 야생형 및 녹아웃 생쥐에서 동등한 반면, IgG2a 수준은 야생형에 비해 TCCR -/- 녹아웃 생쥐에서 현저하게 낮으며, 이는 TCCR -/- 생쥐에서의 약화된 Th1 반응을 반영하고 있다.
도 15(A-B)는 쥐의 비장세포 중 어떠한 세포 유형이 TCCR을 발현하는지를 보여주는 그래프 도식이다. 도 15A는 CD4, CD8, CD19, NK1.1 및 F4/80 세포에서의 발현 수준을 도시하고 있으며, CD4 T 세포 및 자연 살상 세포 (natural killer cell)에서의 발현 수준이 가장 높다. 도 15B는 Th0, Th1 및 Th2 세포에서의 발현 수준을 도시하고 있으며, Th0 세포에서 발현 수준이 가장 높았고, Th1 및 Th2 세포 둘 모두에서 CD4 세포의 분화는 하향조절되었다. TCCR 발현을 실시간 PCR에 의해 검출하였고, 리보솜의 하우스키핑 유전자 (housekeeping gene)인 rpl19를 표준으로 삼았다 (Heid, C.A.,et al., 1996,Genome Res.,6:986-94).
도 16(A-D)는 TCCR-결핍 생쥐로부터 유래된 림프절 세포의, 항원에 의해 유도된 사이토카인 생산 및 증식을 그래프로 도식화한 것이다. 야생형 및 TCCR-결핍 생쥐를 프로인드 완전 면역반응 항진제 (complete Freund's adjuvant, CFA) 중의 KLH로 면역화시켰다. 9일 후 림프절을 수득하고, 앞서 나타낸 KLH의 존재 하에 배양하고, 그의 IFN (도 16A), IL-4 (도 16B), IL-5 (도 16C)의 생산량 또는 증식량 (도 16D)을 분석하였다. 데이타는 각 군마다 동물 5 마리로부터 유래된 평균 +/- SD 값으로 나타낸 것이다. 두 KLH 농도 모두에서 야생형 및 KO 간의 IFN?에 대한 단일 T-검정 (unpaired T-test)에 의한 P 값은 0.004 미만이었다.
도 17(A-C)는 IgG 아형 농도에 대한 효과 및 엘.모노사이토게네스 (L. monocytogenes) 감염에 대한 민감도를 그래프로 도식화한 것이다. 야생형 및 TCCR-결핍 생쥐로부터 혈청을 수득하고, IgG 아형의 총농도를 ELISA에 의해 결정하였다 (도 17A). OVA/CFA를 예비 처리한 생쥐로부터 OVA-특이적 IgG1 및 IgG2a를얻었다. CFA 중의 OVA로 면역화된 야생형 및 TCCR-결핍 생쥐로부터 혈청을 수득하고, OVA-특이적 ELISA에 의해 IgG1 (1:320000 희석) 및 IgG2a (1:5000 희석) 수준을 결정하였다 (도 17B). 5 마리의 TCCR-결핍 생쥐 및 야생형 동복자(同腹子)에 엘.모노사이토게네스 3 x 104CFU를 피하주사하여 감염시켰다. 3 또는 9일 후, 간을 수득하여 세균 역가를 결정하였다 (도 17C). 데이타는 각 군마다 동물 5 마리로부터 유래된 평균 +/- SD 값으로 나타낸 것이다. 두 시점 모두에서 WT 및 KO 간의 단일 T-검정에 의한 P 값은 0.001 미만이었다.
도 18(A-D)는 Th 세포 분화 및 증식의 시험관 내 유도를 그래프로 도식화한 것이다. 야생형 또는 TCCR-결핍 생쥐의 비장으로부터 정제한 CD4+ T 세포는 ConA및 방사능이 조사된 야생형 APC의 존재 하에 (도 18A), 또는 항-CD3 및 항-CD28을 자극원으로 하여 (도 18B) Th1 또는 Th2 세포로 분화하였다. IFN 및 IL-4의 생산량은 ELISA에 의해 결정하였다. 데이타는 각 군 당 생쥐 5마리의 풀 (pool)의 평균 +/- SD 값으로 나타낸 것이다. ND는 검출되지 않았음을 의미한다. 도 18C는 IL-2로 유도된, 야생형 및 TCCR-결핍 생쥐로부터의 비장세포 증식을 도시하고 있다. 앞서 나타낸 바와 같이 ConA로 활성화된 비장세포를 24시간동안 IL-12의 증가된 농도의 존재 하에 배양하였다. 최종 6시간동안 [3H]-티미딘을 혼입시켜 세포 증식량을 측정하였다. 도 18D는 자극되지 않은 비장세포 (흰 막대) 및 ConA로 자극된 비장세포 (검은 막대)의 IL-12R mRNA 수준을 도시하고 있다. 비장 T 세포는 72시간동안 ConA로 자극하였고, IL-12R 1 및 IL-12R 2의 mRNA 수준을 실시간 정량PCR (타크맨, Taqman)에 의해 결정하였다. 배수 증가량은 야생형의 자극되지 않은 세포에 존재하는 RNA 수준과 비교한 것이다.
도 19는 타크맨 분석에서 사용된 프라이머 및 프로브를 나타내는 서열 5 내지 서열 16의 서열을 도시하고 있다.
I. 정의
"면역 관련 질환"이란 용어는 포유동물의 면역계 성분이 그 포유동물에게 병을 일으키거나, 병을 매개하거나 또는 달리 병에 기여하는 질병을 의미한다. 또한, 면역 반응의 촉진 또는 간섭으로 그 질병의 진행을 완화하는 효과가 있는 질병도 포함된다. 이 용어 내에는 면역-매개 염증 질환, 비-면역-매개 염증 질환, 감염성 질환, 면역결핍 질환, 종양 형성 등이 포함되어 있다.
"Th1 매개 질환"이란 용어는 T-세포가 Th1 아형으로 과다하게 생산되거나 그에 편중되어 분화하는 것을 비롯하여 Th1 사이토카인의 과생산이 특징인 질병을 의미한다. 그러한 질병으로는, 예를 들어 자가면역성 염증 질환 (예, 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병, 자가면역성 포도막망막염, 갑상선중독증, 피부경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환 (예, 크론병, 궤양성 대장염, 국한성 장염, 원위 회장염, 육아종성 장염, 국한성 회장염, 말단 회장염), 자가면역성 갑상선 질환, 악성 빈혈) 및 동종이식편 거부반응이 포함된다.
"Th2 매개 질환"이란 용어는 T-세포가 Th2 아형으로 과다하게 생산되거나 그에 편중되어 분화하는 것을 비롯하여 Th2 사이토카인의 과생산이 특징인 질병을 의미한다. 그러한 질병으로는, 예를 들어 감염성 질환 (예, 레이시마니아 매이저, 마이코박테리움 레프래, 칸디다 알비칸스, 톡소플라스마 곤디, 호흡기 합포체 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 등)의 감염 악화 및 알레르기성 질환, 예를 들어 아나필락시스성 과민, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 춘계 결막염, 습진, 두드러기 및 음식물 알레르기 등이 포함된다.
T 세포가 Th1 및 Th2 아형으로 분화하는 작용 (예, 사이토카인 분비 프로필)에 의해 매개되며, 본 발명에 따라 치료 가능한 다른 면역 질환, 면역-관련 질환 및 염증성 질환의 예로는, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 악성 소아 관절염, 척추관절염, 전신성 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근병증 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역성 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색뇨증), 자가면역성 혈소판 감소증 (특발성 혈소판 감소성 자반증, 면역 매개 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브씨병 (Grave's disease), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 소아성 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 자가면역성 염증 질환 (예, 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병, 자가면역성 포도막망막염, 갑상선중독증, 피부경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환 (예, 크론병, 궤양성 대장염, 국한성 장염, 원위 회장염, 육아종성 장염, 국한성 회장염, 말단 회장염), 자가면역성 갑상선 질환, 악성 빈혈) 및 동종이식편 거부반응, 당뇨병, 면역 매개 신장병 (사구체신염, 신세관간질성 신장염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랭-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증과 같은 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초성 질환, 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스에 의한 간염), 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐감수성 장병증 및 휘플병 (Whipple's disease), 수포성 피부병, 다형홍반 및 접촉피부염, 건선을 비롯한 자가면역성 또는 면역 매개 피부병, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민 및 두드러기와 같은 알레르기성 질병, 호산구성 폐증, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역학적 질병, 이식편 거부반응 및 이식편-대-숙주병을 비롯한 이식 관련 질환이 포함된다. AIDS (HIV 감염), A형, B형, C형, D형 및 E형 간염, 헤르페스 (herpes) 등과 같은 바이러스성 질병, 세균성 감염, 진균성 감염, 원충성 감염, 기생충성 감염 및 호흡기 합포체 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 등을 비롯한 감염성 질환과 아나필락시스성 과민, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 춘계 결막염, 습진, 두드러기 및 음식물 알레르기 등과 같은 알레르기성 질환이 포함된다.
"치료"란 질환의 병리 상태의 발달 또는 변화를 예방하기 위해 수행하는 개입을 의미한다. 따라서, "치료"는 치료제를 사용한 치료 및 억제 또는 예방 조치모두를 가리키며, 그 목적은 목적하는 병리적 증상 또는 장애를 예방, 저지 (경감) 또는 완화시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 인간에는 이미 질병에 걸린 인간 뿐만 아니라 질병을 예방해야하는 인간도 포함된다. 면역 관련 질환 (예, Th1-매개 질환 및 Th2-매개 질환)의 치료에서, 치료제는 질환의 병리 성분에 대한 반응을 직접 감소 또는 증가시킬 수 있거나, 그 질병을 다른 치료제, 예를 들어, 항생제, 항진균제, 항염제, 화학요법제 등에 의한 처리에 보다 감응성이도록 할 수 있다.
"유효량"이란 용어는 Th1 아형 또는 Th2 아형 중 어느 하나로 T 세포의 분화가 검출 가능하게 편중되는 것 및(또는) T 세포 아형이 분비하는 사이토카인 분비 프로필이 검출 가능하게 편중되는 것을 야기, 유도 또는 유발하는 TCCR 폴리펩티드, 그의 아고니스트 및(또는) 그의 길항제의 최소 농도이다. 또한, "치료상 유효량"이란 Th1-매개 질환 또는 Th2-매개 질환을 치료하는데 효과적인 TCCR 폴리펩티드, 그의 아고니스트 및(또는) 그의 길항제의 최소 농도(량)이다.
"만성" 투여란 급성 방식과 달리 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "간헐적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다.
면역 관련 질환의 "병리"에는 환자의 건강에 손상을 주는 모든 현상이 포함된다. 이러한 것으로는 비정상적 또는 조절될 수 없는 세포 생장, 항체 생산, 자가항체 생산, 보체 생산 및 활성화, 인접 세포의 정상적인 기능 방해, 비정상적인 수준으로 사이토카인 또는 다른 분비 산물을 분비하는 것, 임의의 염증성 반응 또는 면역학적 반응에 대한 억제 또는 강화, 염증 세포 (호중구, 호산구, 단핵구, 림프구)의 조직 공간 내로의 침윤 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 다른 치료제와 "배합하여" 투여한다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것이 포함된다.
본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제가 포함된다. 생리학상 허용되는 담체는 종종 pH 완충 수용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM(상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICSTM(상표명)가 포함된다.
본원에 사용된 "세포독성제"란 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 I131,I125, Y90및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것을 말한다.
본원에 사용된 "생장 억제제"는 특히 본원에서 확인된 어떠한 유전자이든지 그를 과다발현하는 암세포의 시험관내 또는 생체내 생장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 생장 억제제는 S기에 그러한 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 생장 억제제의 예에는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서)차단하는 물질, 예를 들어 G1기 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질이 포함된다. 전형적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] 1 장, 특히 13페이지에 기재되어 있다.
"사이토카인"이란 용어는 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 세포군이 방출하는 단백질의 일반 용어이다. 이러한 사이토카인의 예에는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 같은 성장 호르몬: 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴락신; 프로릴락신; 난포 자극 호른몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반의 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 β; 뮐러의 억제 물질; 생쥐 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 전환 성장 인자 (TGF); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론-α,-β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (CSF); 과립세포-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립세포-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨(IL); TNF-α 및 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드가 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 사이토카인은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양액으로부터의 단백질 및 고유 서열의 사이토카인의 생물학적으로 활성인 균등물을 포함한다.
본원에 사용된 "TCCR 폴리펩티드", "TCCR 단백질" 및 "TCCR"이란 용어는 천연 서열 TCCR 또는 TCCR 폴리펩티드 변이체 (본원에 추가로 정의된 바와 같음)를 포함한다. TCCR 폴리펩티드는 인간 조직 유형 등의 각종 공급원 또는 또다른 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다.
"천연 서열 TCCR"은 자연으로부터 유래된 TCCR 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 TCCR 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 및(또는) 합성 수단으로 제조할 수 있다. "천연 서열 TCCR"이란 용어는 구체적으로 TCCR 폴리펩티드의 자연 발생 말단 절단형 또는 분비형(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 자연 발생 말단 절단형 (예를 들어, 대체 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생 대립유전자적 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 실시 태양에서, 천연 서열 인간 TCCR은 도 3 (서열번호 1)에 기재된 아미노산 서열 1번 내지 636번을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 TCCR이다. 유사하게, 천연 서열 쥐 TCCR은 도 4 (서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열 1번 내지 623번을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 TCCR이다. 또한, 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에 기재된 TCCR 폴리펩티드는 아미노산 위치 1로서 지칭되는 메티오닌 잔기에서 시작하는 반면, 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치하는 다른 아미노산 잔기가 TCCR 폴리펩티드에 대한 개시 아미노산 잔기로서 사용될 수 있다.
"TCCR 폴리펩티드 세포외 도메인" 또는 "TCCR ECD"란 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 없는 TCCR 폴리펩티드 형태를 의미한다. 통상적으로 TCCR 폴리펩티드 ECD는 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1％ 미만으로 포함할 것이며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5％ 미만으로 포함할 것이다. 본 발명의 TCCR 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인(들)은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 바와같이 막횡단 도메인의 어느쪽 말단이든지 약 5 개 아미노산 범위 내에 존재한다. 따라서, 본 발명의 한 실시 태양에서, 인간 TCCR 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 1번 또는 약 33번 내지 X1번 (이 X1번은 도 3 (서열번호 1)의 512번 잔기 내지 522번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임)을 포함한다. 유사하게, 쥐 TCCR 폴리펩티드의 세포외 도메인은 아미노산 1번 또는 약 25번 내지 X2번 (이 X2번은 도 4 (서열번호 2)의 509번 잔기 내지 519번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임)을 포함한다.
"TCCR 변이체 폴리펩티드"란 (a1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 33번 잔기 내지 636번 잔기, (a2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 쥐 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 25번 잔기 내지 623번 잔기, (b1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X3번 잔기 내지 636번 잔기 (상기 X3번은 도 3 (서열번호 1)의 아미노산 잔기 27번 내지 37번 중 임의의 아미노산 잔기임), (b2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X4번 잔기 내지 623번 잔기 (상기 X4번은 도 4 (서열번호 2)의 아미노산 잔기 20번 내지 30번 중 임의의 아미노산 잔기임), (c1) 1 또는 약 33번 내지 X1번 (이 X1번은 도 3 (서열번호 1)의 512번 잔기 내지 522번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (c2) 1번 또는 약 25번 내지 X2번 (이 X2번은 도 4 (서열번호 2)의 509번 잔기 내지 519번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d1) X5번 내지 636번 (상기 X5번은 도 3 (서열번호 1)의 533번 잔기 내지 543번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d2) X6번 내지 623번 (상기 X6번은 도 4 (서열번호 2)의 527번 잔기 내지 537번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (e) 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 서열 동일성이 약 80％ 이상인, 하기 정의된 바와 같은 활성 TCCR 폴리펩티드를 의미한다.
그러한 TCCR 변이체 폴리펩티드에는, 예를 들면 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)의 서열의 N- 및(또는) C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 TCCR 폴리펩티드가 포함된다. 통상, TCCR 변이체 폴리펩티드는 (a1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 33번 잔기 내지 636번 잔기, (a2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 쥐 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 25번 잔기 내지 623번 잔기, (b1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X3번 잔기 내지 636번 잔기 (상기 X3번은 도 3 (서열번호 1)의 아미노산 잔기 27번 내지 37번 중 임의의 아미노산 잔기임), (b2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X4번 잔기 내지 623번 잔기 (상기 X4번은 도 4 (서열번호 2)의 아미노산 잔기 20번내지 30번 중 임의의 아미노산 잔기임), (c1) 1 또는 약 33번 내지 X1번 (이 X1번은 도 3 (서열번호 1)의 512번 잔기 내지 522번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (c2) 1번 또는 약 25번 내지 X2번 (이 X2번은 도 4 (서열번호 2)의 509번 잔기 내지 519번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d1) X5번 내지 636번 (상기 X5번은 도 3 (서열번호 1)의 533번 잔기 내지 543번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d2) X6번 내지 623번 (상기 X6번은 도 4 (서열번호 2)의 527번 잔기 내지 537번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (e) 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 81％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 아미노산서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 아미노산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 아미노산 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 약 99％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
TCCR 변이체 폴리펩티드는 약 10개 이상의 아미노산 길이, 통상적으로 약 20개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 30개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 40개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 50개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 60개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 70개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 80개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 90개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 100개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 150개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 200개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 250개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 300개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 400개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 500개 이상의 아미노산 길이, 보다 통상적으로 약 600개 이상의 아미노산 길이 또는 이를 초과하는 아미노산 길이로 이루어진다.
본원에서 확인된 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 TCCR 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 TCCR 서열의 아미노산 잔기와 동일한,후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(％)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드 (source code)는 표 3(A-Q)에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 3(A-Q)에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 3(A-Q)에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 다양하지 않다.
본 발명에 이용하기 위해, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2A 내지 2B는 "PRO"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(％)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 아미노산 서열 동일성(％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschulet al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드 받거나 미국 국립 보건원 (메릴랜드주 베테스다 소재)으로부터 얻을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정되어 있다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
또한 "본 발명의 폴리펩티드"란 용어 내에는 상기 기술한 바와 같이 수행된 아미노산 서열 동일성 비교와 관련해서, 비교 서열이 동일한 것 뿐만 아니라, 서열 내에 유사한 성질을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 이들 폴리펩티드를 "양성"이라고 지칭한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 나타내는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 I에 기재되어 있음)이다. 본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (％)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (％)을갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 나타내는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (％)은 A에 대한 B의 양성값 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
"TCCR 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "TCCR 변이체 뉴클레오티드 서열"이란 하기 정의한 바와 같은 활성 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 (a1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 33번 잔기 내지 636번 잔기, (a2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 쥐 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 25번 잔기 내지 623번 잔기, (b1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X3번 잔기 내지 636번 잔기 (상기 X3번은 도 3 (서열번호 1)의 아미노산 잔기 27번 내지 37번 중 임의의 아미노산 잔기임), (b2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X4번 잔기 내지 623번 잔기 (상기 X4번은 도 4 (서열번호 2)의 아미노산 잔기 20번 내지 30번 중 임의의 아미노산 잔기임), (c1) 1 또는 약 33번 내지 X1번 (이 X1번은 도 3 (서열번호 1)의 512번 잔기 내지 522번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (c2) 1번 또는 약 25번 내지 X2번 (이 X2번은 도 4 (서열번호 2)의 509번 잔기 내지 519번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d1) X5번 내지 636번 (상기 X5번은 도 3 (서열번호 1)의 533번 잔기 내지 543번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d2) X6번 내지 623번 (상기 X6번은 도 4 (서열번호 2)의 527번 잔기 내지 537번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (e) 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과 서열 동일성이 약 80％ 이상인 핵산 분자를 의미한다. 통상, TCCR 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 33번 잔기 내지 636번 잔기, (a2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 쥐 TCCR 폴리펩티드의 1번 잔기 또는 약 25번 잔기 내지 623번 잔기, (b1) 도 3 (서열번호 1)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X3번 잔기 내지 636번 잔기 (상기 X3번은 도 3 (서열번호 1)의 아미노산 잔기 27번 내지 37번 중 임의의 아미노산 잔기임), (b2) 도 4 (서열번호 2)에 도시한 인간 TCCR 폴리펩티드의 X4번 잔기 내지 623번 잔기 (상기 X4번은 도 4 (서열번호 2)의 아미노산 잔기 20번 내지 30번 중 임의의 아미노산 잔기임), (c1) 1 또는 약 33번 내지 X1번 (이 X1번은 도 3 (서열번호 1)의 512번 잔기 내지 522번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (c2) 1번 또는 약 25번 내지 X2번 (이 X2번은 도 4 (서열번호 2)의 509번 잔기 내지 519번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d1) X5번 내지 636번 (상기 X5번은 도 3 (서열번호 1)의 533번 잔기 내지 543번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임), (d2) X6번 내지 623번 (상기 X6번은 도 4 (서열번호 2)의 527번 잔기 내지 537번 잔기로부터의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (e) 도 3 (서열번호 1) 및 도 4 (서열번호 2)에 기재된 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산 서열과 약 80％ 이상의 핵산 서열 동일성, 바람직하게는 약 81％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97％ 이상의 핵산 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98％ 이상의 핵산 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 약 99％ 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
통상, TCCR 변이체 폴리뉴클레오티드는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 길이, 통상적으로 약 60개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 90개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 120개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 150개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 180개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 210개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 240개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 270개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 300개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 450개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 600개 이상의 뉴클레오티드 길이, 보다 통상적으로 약 900개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 이를 초과하는 뉴클레오티드 길이로 이루어진다.
본원에서 확인된 TCCR 폴리펩티드 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 퍼센트(％)"는 TCCR 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 TCCR 폴리펩티드 코딩 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값(％)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 표 3(A-Q)에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 3(A-Q)에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 3(A-Q)에 기재된 원시 코드로부터 편집할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용 체계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집하여 이용할 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 다양하지 않다.
본 발명의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성(％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성(％)과 같지않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2C 내지 2D는 "PRO-DNA"로 지칭되는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭되는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성 값(％)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 핵산 서열 동일성(％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschulet al.,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드 받거나 미국 국립 보건원 (미국 20892 메릴랜드주 베테스다)으로부터 얻을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정되어 있다.
NCBI-BLAST2가 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성(％)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성(％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성(％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
다른 실시 태양에서, TCCR 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 전장 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 본 발명의 활성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. TCCR 변이체 폴리펩티드는 TCCR 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것들일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 아미노산 서열 동일성 서열 비교와 관련하여 "양성"이란 용어는 동일하지는 않으나 성질이 유사한, 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 포함한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 나타내는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 I에 기재되어 있음)이다.
본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (％)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 나타내는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (％)은 A에 대한 B의 양성값 (％)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 성분으로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 성분은 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 1 종 이상의 TCCR 천연 환경 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내의 원래 위치에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자는 TCCR 코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되어 있는 1종 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 자연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않아야 한다. 단리된 TCCR 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 TCCR 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 TCCR 폴리펩티드를 발현하는 세포에 함유된 TCCR 코딩 핵산 분자를 포함한다.
"조절 서열"이란 용어는 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된다"는 것은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 반드시 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 종래의 방법에 따라 사용한다.
"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-TCCR 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-TCCR 항체 조성물, 단일쇄 항-TCCR 항체 및 항-TCCR 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적합한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로 하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 목적하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의된 "엄격 조건" 또는 "고도의 엄격 조건"이란 (1) 세척시 이온 강도가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42℃, 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산 나트륨이 함유된 50mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50％ (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 또는 (3) 50％ 포름아미드, 5x SSC (0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산 나트륨, 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42℃에서 사용하고, 42℃에서 0.2x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척하며, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1x SSC를 이용한 고도로 엄격한 세척을 수행하는 것이다.
"적당한 엄격 조건"이란 문헌 [Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989]에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 강도 및 SDS ％)의 이용을 말한다. 적당한 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5x SSC (150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산삼나트륨), 50mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20mg/ml의 잘린 연어 정자 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1x SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그가 부착된"이란 "태그 폴리펩티드"에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 매우 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 교차반응하지 않는 것이 바람직하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (약 10 내지 20개의 잔기가 바람직함).
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생 TCCR 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성을 보유하는 본 발명의 단백질의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 본 발명의 천연 또는 자연 발생 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력이라기 보다는 천연 또는 자연 발생 TCCR 폴리펩티드에 의한 생물학적 기능 (억제 또는 촉진 능력)을 말한다. 유사하게, "면역학적" 활성이란 본 발명의 천연 또는 자연 발생 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다.
본원에 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인될 수 있는 항체 또는 다른 길항제 (예를 들어, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)와 관련된 "생물학적 활성"은 그러한 분자가 조직 내 염증 세포의 침윤을 저지하거나 유도하고, T-세포 증식 또는 활성화를 저지 또는 유도하고, 세포에 의한 사이토카인 분비를 저지 또는 유도하는능력을 말한다. 다른 바람직한 활성은 혈관 투과성을 증가시키거나 이를 저지하는 것이다. 가장 바람직한 활성은 Th1/Th2 반응을 조절하는 것이다 (예, Th1 반응 감소 및(또는) Th2 반응 증가, Th2 반응 감소 및(또는) Th1 반응 증가).
"조절" 또는 "조절하는"이란 T 세포가 Th1 아형군 및 Th2 아형군으로 분화함으로써 일어나는 생리 현상 (예, 사이토카인 분비 프로필)의 상향조절, 하향조절 또는 변형을 의미한다. 상기 용어가 의도하는 범위 내에서의 세포 과정으로는 특이적 유전자의 전사; 대사작용, 증식, 분화, 유착 (adhesion), 신호 전달, 세포사멸 (apoptosis) 및 생존과 같은 정상적인 세포 기능과 전환 (transformation), 분화 차단 및 전이와 같은 비정상적인 세포 과정이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"길항제"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 본 발명의 천연 서열 TCCR 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해 또는 중화 (예, Th1/Th2 세포 기능의 하향조절)하는 모든 분자를 포괄한다. 이와 비슷하게 "아고니스트"란 용어도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 TCCR의 생물학적 활성을 흉내내거나, 상승시키거나 또는 촉진시키는 모든 분자를 포괄한다. 적합한 아고니스트 또는 길항제로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 본 발명의 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다. TCCR 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법에는 TCCR 폴리펩티드를 후보 아고니스트 분자 또는 후보 길항제 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 TCCR 폴리펩티드와 통상 관련된 하나이상의 생물학적 활성의 변화 (예, Th1/Th2 세포 기능 또는 효과의 상향조절/하향조절)를 측정하는 단계가 포함될 수 있다.
"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의되며, 일반적으로 유기 화합물이다.
"항체(Ab)" 및 "이뮤노글로불린 (Ig)"은 동일한 구조 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이 항원에 특이적으로 결합하는 반면, 이뮤노글로불린은 항체 및 항원 특이성이 없는 다른 항체 유사 분자 둘 다를 포함한다. 이뮤노글로불린 등의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 농도로 생성되며 골수종에 의해 농도가 증가한다. "항체"라는 용어는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 항-TCCR 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-TCCR 항체 조성물 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-TCCR 항체 및 항-TCCR 항체의 단편 (하기 참조)을 통칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 항체는 항체와 접촉할 수 있는 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 도메인에 결합할 수 있다. 예를 들어, 전체 폴리펩티드가 분비되는 경우, 항체는 그 폴리펩티드의 임의의 세포외 도메인 또는 결합을 위해 그 항체가 이용 가능한 폴리펩티드 상의 임의의 도메인에 결합할 수 있다.
"천연 항체" 및 "천연 이뮤노글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 상이한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄 사이에서 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이란 용어는 항체들 간에 가변 도메인의 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 "고도 가변 영역"으로 불리는 3개 또는 4개의 세그먼트에 집중된다. CDR을 결정하는 데에는 (1) 종간 서열 가변성에 기반한 접근 방식 (즉, 문헌 [Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interests(National Institute of Health, Bethesda, MD 1987)]에 의함) 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정구조학에 기반한 접근 방식 (Chothia, C.et al.,Nature342:877 (1989))의 2가지 이상의 방법이 있다. 그러나, 두 방법이 다른 잔기를 기술하고 있다는 점에서, 이들을 조합하여 하이브리드 CDR을 정의하는 것이 가능하다.
가변 도메인에서 보존도가 보다 높은 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 이루는 3개의 CDR에 의해 연결되는, 주로 β-시트의 입체형태인 프레임워크 영역 4개를 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 ([Kabatet al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포의 세포독성에서 항체의 관여와 같은 다양한 작용기 기능을 보인다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체 (Zapataet al.,Protein Eng.8(10):1057-1062 (1995); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'을 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스 (동종형), 예를 들어 IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중새 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불리운다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 대한 서브유닛 구조와 3차원 구조는 잘 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도된 매우 특이적인 항체이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정군(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정군에 대한 것이다. 모노클로날 항체는 그 특이성 이외에 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양액으로 합성할 수 있다는 장점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻었다는 항체 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특별한 방법으로 항체를 제조하는데 요구되는 것으로 여겨지지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 문헌 [Kohleret al.,Nature,256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [Clacksonet al.,Nature,352:624-628 (1991)] 및 문헌 [Markset al.,J. Mol. Biol.,222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,750,373호, 동 제5,571,698호, 동 제5,403,484호 및 동 제5,223,409호에 기술된, 파지미드 및파지 벡터를 이용한 항체 제조법을 참조한다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrisonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]]).
비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환되며, 특히 그러한 경우, 상기 특정 FR 잔기는 3차원 공간 상에서 결합 부위 및(또는) 항체의 구조에 영향을 주게 된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 수식은 항체 성능을보다 개량하고 극대화시키도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 일부를 포함할 것이다. 보다 상세 설명을 위해, 문헌 [Joneset al.,Nature, 321: 522-525 (1986)], 문헌 [Riechmannet al.,Nature,332: 323-329 (1988)] 및 문헌 [Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한 임의로, 인간화 항체에는, 항체의 항원 결합 영역이 짧은 꼬리 원숭이 (macaque monkey)를 목적 항원으로 면역화시켜 제조한 항체에서 유래된 것인 "영장류화 (Primatized)" 항체가 포함된다. 구세계 원숭이 (Old World monkey)로부터의 잔기를 포함하는 항체는, 예를 들어 미국 특허 제5,658,570호, 동 제5,693,780호, 동 제5,681,722호, 동 제5,750,105호 및 동 제5,756,096호에 기술되어 있다.
또한, 본 발명에서 항체 및 그의 단편에는, 하나 이상의 CDR 영역 및(또는) 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 바뀌도록 변형되어, 그 항체가 결합하는 항원에 대해 항체 또는 그의 단편의 친화도가 변형되는 "친화도 성숙" 항체가 포함된다. 친화도 성숙은 출발 항체에 비해 항원에 대한 성숙 항체의 친화도가 증가하거나 감소하도록 할 수 있다. 통상적으로, 출발 항체는 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 또는 쥐 항체이며, 친화도 성숙 항체는 상기 출발 항체보다 더 높은 친화도를 갖는다. 성숙 과정동안, 임의의 표준 방법을 통해 CDR 영역 또는 프레임워크 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 바뀌게 된다. 적합한 방법에는 널리 공지된 카세트 돌연변이 유발법 (문헌 [Wellset al., 1985,Gene 34:315] 참조) 및 올리고뉴클레오티드 매개 돌연변이 유발법 (문헌 [Zolleret al., 1987,Nucleic Acids Res.,10:6487-6504] 참조)을 이용한 위치 지정 돌연변이법이 포함된다. 또한, 많은 돌연변이를 생산하고, 항원 또는 리간드에 대해 증가된 친화도에 근거하여 돌연변이의 풀 또는 라이브러리로부터 원하는 친화도를 가진 돌연변이를 선별하는, 공지된 선별 방법을 이용하여 친화도 성숙을 수행할 수 있다. 공지된 파지 디스플레이 (phage display) 기술이 본 명세서에서 편리하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,750,373호 및 동 제5,223,409호 등을 참조한다.
또한, 인간 항체도 본 발명의 항체의 범위 내에 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리 (문헌 [Hoogenboom and Winter,J. Mol. Biol.,227:381 (1991)] 및 문헌 [Markset al,J. Mol. Biol.,222:581(1991)] 참조)를 포함하는, 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 콜(Cole) 등의 기술 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 유용하다 (문헌 [Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 문헌 [Boerneret al,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)], 미국 특허 제5,750,373호 참조). 마찬가지로, 예를 들어, 내생성 이뮤노글로불린 유전자 전체 또는 그 일부가 불활성화된 생쥐와 같은 트랜스제닉 동물에 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 이러한 접근법은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks et al.,Bio/Technology10, 779-783 (1992); Lonberget al.,Nature368, 856-859 (1994), Morrison,Nature368, 812-13 (1994); Fishwild et al.,Nature Biotechnology14, 845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology14, 826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH및 VL도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다 (sFv에 관해서는 문헌 [Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조).
"디아바디(diabody)"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함(VH-VL)하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 결합시키기에는너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 결합시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11611호 및 문헌 [Hollingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체라는 용어가 본 발명의 다양한 폴리펩티드에 대하여 지칭되는 경우, 이는 자신의 자연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체를 의미한다. 그의 자연 환경 성분은 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질이 있을 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체, 예를 들어 항체 또는 폴리펩티드는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원래 위치에 존재하는 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"란 단어가 본 명세서에 사용되는 경우, 이는 화합물, 예를 들어 항체 또는 폴리펩티드에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (예, 방사성 동위원소표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"이란 본 발명의 화합물이 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예에는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어, 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 포함된다. 특정 실시 태양에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시 태양에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"이란 약물 (예를 들어, 본원에서 개시한 항-ErbB2 항체 폴리펩티드 및 임의로 화학요법제)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소낭(小囊)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형태로 배열되어 있다.
본원에 사용된 "이뮤노어드헤신"이란 이뮤노글로불린 불변 도메인의 작용기 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종"임), 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중의 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM 등 어떠한 이뮤노글로불린으로부터든지 얻을 수 있다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A.전장 TCCR 폴리펩티드
본 발명은 T 세포가 Th1 아형 및 Th2 아형으로 분화하는 것에 대한 조절을 비롯하여, TCCR 폴리펩티드를 면역 관련 장애 및 그의 합병증의 치료에 이용하기 위한 신규 방법을 제공한다. 특히, TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인, 단리하고, 그의 Th-1 매개 질환 및 Th-2 매개 질환에서의 용도를 하기 추가의 상세한 설명에 개시하였다. TCCR은 천연 서열 분자 및 정의부에서 제공된 바와 같은 변이체 둘 다를 의미하며, hTCCR 및 mTCCR이란 용어는 각각 도 3 (서열 1) 및 도 4 (서열 2)에 도시된 단일 천연 서열 폴리펩티드를 의미하는 것임을 주의하여야 한다. 그러나, 단순하게 본 발명의 명세서에서는 DNA41419 (hTCCR) 및(또는) DNA120632 (mTCCR) 뿐만 아니라 추가의 천연 상동체 및 TCCR의 상기 정의에 포함된 변이체에 의해 코딩된 단백질을 그의 기원이나 제조 방식에 상관 없이 "TCCR"로 지칭할 것이다.
DNA41419 (hTCCR, 서열 1)에 의해 코딩되는 단백질의 예측된 아미노산 서열은 일상적인 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열로부터 결정할 수 있다. 본원에서 기술한 TCCR 폴리펩티드 및 코딩 핵산에 대해서, 본 출원인은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을확인하였다.
상기 인용한 ALIGN-2 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 전장 천연 서열 hTCCR (도 3, 서열 1) 및 mTCCR (도 4, 서열 2) 서열이 승인 번호 475327 및 7710109를 갖는 데이호프 (Dayhoff) (진뱅크) 서열과 특정 정도의 서열 동일성이 있음을 확인하였다.
B.TCCR 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 TCCR 폴리펩티드 이외에, TCCR 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. TCCR 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 TCCR 폴리펩티드 DNA에 도입하고(하거나) 원하는 TCCR 폴리펩티드를 합성함으로써 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 세포막 부착 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 TCCR 폴리펩티드 번역후 프로세싱을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명된 전장 천연 서열 TCCR의 다양한 도메인에서의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 TCCR의 아미노산 서열 변화를 초래하는 TCCR을 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 TCCR 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 TCCR 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환 (예를 들어, 루이신의 세린으로의 치환), 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드의 TCCR 폴리펩티드 단편도 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘릴 수 있으며 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 TCCR 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
TCCR 단편은 많은 통상의 기술 중 임의의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법으로는 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 TCCR 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것이 포함된다. 그러나, 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 증폭하고 단리하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, 폴리펩티드 단편은 도 3 (서열 1) 및 도 4 (서열 2)에 도시된 천연 TCCR폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
구체적인 실시 태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 I에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 I에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
원래 잔기 치환체의 예 바람직한 치환체
Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V) val, leu, ilelys, gln, asngln, his, lys, arggluserasnasppro, alaasn, gln, lys, argleu, val, met, ala, phe, 노르루이신노르루이신, ile, val, met, ala, phearg, gln, asnleu, phe, ileleu, val, ile, ala, tyralathrsertyr, phetrp, phe, thr, serile, leu, met, phe, ala, 노르루이신 vallysglngluserasnaspalaargleuileargleuleualathrsertyrpheleu
폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지하는 그의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환하는 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개 (위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법 (Carteret al.,Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zolleret al.,Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 유발법 (Wellset al.,Gene,34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발법 (Wellset al.,Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)) 또는 다른 공지 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 통상, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변화시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (Cunningham and Wells,Science, 244: 1081-1085 (1989)). 또한, 알라닌은 통상 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 (Creighton,The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia,J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C.TCCR의 변형
TCCR의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 TCCR 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 TCCR 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는, 예를 들어 항-TCCR 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 TCCR를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제에는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질이 포함된다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton,Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 본 발명의 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (잠재성 있는 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 상기 천연 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
상기 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는, 예를 들어 상기 천연 서열 폴리펩티드에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-결합 글리코실화 부위의 경우). 상기 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 결합시키는 것이다. 이러한 방법은, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 국제 공개 제87/05330호 및 문헌 [Aplin and Wriston,CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin,et al.,Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 문헌 [Edgeet al.,Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 (문헌 [Thotakuraet al.,Meth. Enzymol., 138:350 (1987)] 참조).
공유결합 변형에 대한 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 본 발명의 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 TCCR은 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시 태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 본 발명의 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태인 본 발명의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Fieldet al.,Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evanet al.,Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborskyet al.,Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드에는 Flag-펩티드 (Hoppet al.,BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)), KT3 에피토프 펩티드 (Martinet al.,Science, 255:192-194 (1992)), α-튜불린 에피토프 펩티드 (Skinneret al.,J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 태그 (Lutz-Freyermuthet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))가 포함된다.
다른 한 실시 태양에서, 키메라 분자는 본 발명의 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태 ("이뮤노어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 가변 영역의 적어도 일부를 본 발명의 폴리펩티드의 가용성 (막횡단 도메인이 결실 또는 불활성화됨) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시 태양에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D.TCCR의 제조
이하에 설명되는 내용은 주로 TCCR 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 TCCR을 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 TCCR을 제조할 수 있다. 예를 들어, TCCR 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다 (문헌 [Stewartet al.,Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)], 문헌 [Merrifield,J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기 (Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. TCCR의 상이한 단편을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 TCCR을제조할 수 있다.
1. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 단리
TCCR 코딩 DNA는 TCCR mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 TCCR DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. TCCR 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성법에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 (Sambrooket al., 상기 문헌; Dieffenbachet al.,PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)).
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 적당한 엄격성 및 고도의 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrooket al., 상기 문헌)에 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 진뱅크와 같은 공개 데이타베이스 또는 다른 비공개 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
2. 숙주세포의 선별 및 형질전환
숙주세포는 TCCR 생성을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrooket al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 전기천공법 (electroporation)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 (상기 Sambrooket al.)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공법은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene ,23:315(1983)] 및 1989년 6월 29일 공개된 국제 공개 제89/05859호에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb,Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingenet al.,J. Bact.,130:949(1977)] 및 문헌 [Hsiaoet al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(USA),76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 전기천공법, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keownet al.,Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 문헌 [Mansouret al.,Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이.콜라이 (E. coli)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 이.콜라이 균주, 예를 들어 이.콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이.콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이.콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 이.콜라이 균주 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이.콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 등의 장내세균과 (Enterobacteriaceae), 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형tonA를 갖는 이.콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형tonA ptr3을 갖는 이.콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kan r 를 갖는 이.콜라이 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244), 완전한 유전자형tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 를 갖는 이.콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성degP결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이.콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 공포된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이.콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 TCCR 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse,Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleeret al.,Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtet al.,J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berget al.,Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia)(유럽 특허 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (유럽 특허 183,070; Sreekrishnaet al.,J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia)(유럽 특허 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Caseet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일 공고된 유럽 특허 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 국제 공개 제91/00357호) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans)(Ballance et al,,Biochem. Biophys. Res. Commun.,112:284-289 [1983]; Tilburnet al.,Gene,26:205-221 [1983]; Yeltonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (A. niger) (Kelly and Hynes,EMBO J.,4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 생장할 수 있는 효모를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony,The Biochemistry of Methylotrophs,269(1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화 TCCR의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 생장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Grahamet al.,J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)), 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather,Biol. Reprod., 23:243-251(1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업자라면 적절한 숙주세포를 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
TCCR을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 개시점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
TCCR은 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 TCCR 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모에서의 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공고된 유럽 특허 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 국제 공개 제90/13646호에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 유도할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1 종 이상의 숙주세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 개시점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 개시점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 개시점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 불리우는 선별 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선별 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예에는 본 발명의 폴리펩티드 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포를 확인할 수 있게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나아제가 있다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaubet al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:4216(1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp1유전자이다 (문헌 [Stinchcombet al.,Nature,282:39(1979); Kingsmanet al.,Gene,7:141(1979);Tschemperet al.,Gene,10:157(1980)]).trp1유전자는 트립토판으로의 생장능이 결여된 효모의 변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 (Jones,Genetics,85: 12 (1977)).
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 TCCR 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재성 있는 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Changet al.,Nature, 275:615 (1978); Goeddelet al.,Nature, 281:544 (1979)]), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel,Nucleic acid Res., 8:4057 (1980)], 유럽 특허 제36,776호), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 (문헌 [deBoeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)])를 포함한다. 또한, 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 TCCR을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제 (문헌 [Hitzemanet al.,J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 참조) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hesset al.,J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)] 참조), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터가 포함된다.
생장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 유럽 특허 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주세포내의 벡터로부터의 TCCR 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주세포 시스템에 적합한 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 TCCR 코딩 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예에는 복제 개시점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 싸이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 TCCR 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 TCCR 코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 TCCR의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주세포는 문헌 [Gethinget al.,Nature, 293:620-625 (1981); Manteiet al.,Nature,281:40-46 (1979)], 유럽 특허 제117,060호 및 동 제117,058호에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭 및 발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)] 참조), 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 원래 위치에서의 (in situ) 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체 (duplex), RNA 이중체 및DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중체를 표면에 결합시켜, 표면 상에 결합체가 형성될 때 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 TCCR DNA에 대한 항체 및 천연 서열 TCCR DNA에 융합되어 있으며, 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
TCCR의 형태는 배양 배지 또는 숙주세포 용해액으로부터 회수될 수 있다. 세포막에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 세포막으로부터 방출될 수 있다. TCCR의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 TCCR을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼, 및 TCCR의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 TCCR의 특성에 따라 결정될 것이다.
6. 조직 분포
다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 결정함으로써 본 발명의 폴리펩티드가 발현하는 조직의 위치를 확인할 수 있다. 그러한 유전자의 위치는 본 발명의 폴리펩티드 활성을 촉진 및 저해함에 의해 어떠한 조직에서 가장 영향을 받을 것인가에 대한 정보를 제공한다. 또한, 특정 조직 내의 유전자 위치는 하기 논의된 활성 차단 분석 시험 (activity blocking assay)을 위한 시료 조직을 제공한다.
상기한 바와 같이, 각종 조직에서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절히 표지된 프로브를 사용하여 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci., USA,77:5201-5205[1980]] 참조), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 원래 위치에서의 혼성화로 측정하여 mRNA의 전사를 정량적으로 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 단면의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 이들은 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 본 발명의 천연 서열 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 DNA 서열 기재의 합성 펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 융합되어 있으며 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외생성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체를 제조하는 일반 기술 및 노던 블롯팅 및 원래 위치에서의 혼성화에 대한 특정 프로토콜은 하기에 제시하였다.
E. TCCR의 용도
1. 일반적인 용도
TCCR은 IL-12 β-2 수용체, G-CSFR 및 IL-6 수용체와 상동성이 있으며, IL-12 β-2 수용체와 가장 상동성이 높고 (26％), 사이토카인 수용체 중 WS(G)XWS 계열에 속한다. 이들 수용체는 세포, 특히 혈구 생장 및 분화에 관련된 세포의 생장 및 분화를 조절할 수 있는 신호를 전달한다. 예를 들어, G-CSF는 화학요법 후 호중구의 분화를 위한 임상적 이용에 폭넓은 용도가 있음이 발견되었다. 이러한 유형의 사이토카인 수용체 및 그의 아고니스트/길항제는 혈액 질환 및 암 질환의 치료에서 중요한 역할을 할 것이다. TCCR은 T-헬퍼 세포에서, 특히 T 세포가 Th1 아형군 및 Th2 아형군으로 분화하는 데 대한 조절에서 중요한 역할을 하는 것이 발견되었다. 결과와 같이, TCCR 및 그의 아고니스트/길항제는 원하는 치료 목적에 따라 T-헬퍼 세포 1 반응 (Th1) 또는 T-헬퍼세포 2 반응 (Th2)에 대한 포유동물의 면역 반응을 통한 치료 방법으로 유용할 수 있다.
CD4+ T 세포는 알레르기성 염증 반응에 관여하는 다른 모든 세포형의 동원 (recruitment), 생장 및 분화를 상승시킴으로써 알레르기성 염증 반응에서 중요한 역할을 하고 있다. CD4+ 세포는 B 세포에서 IgE 합성의 유도, 마스트세포의 생장과 림프구, 지방 세포 및 호염기구의 염증 부위에로의 동원을 증진시키는 인터루킨 (IL-4) 및 IL-13을 비롯한 수종의 사이토카인을 분비함으로써 상기의 기능을 수행한다. 또한, CD4+ T 세포는 IL-5 (호산구 및 B 세포의 생장과 분화를 증진) 및 IL-10 (마스트세포의 생장 및 분화 증진과 γ-인터페론의 생산 저해)을 생산한다. Th2 세포로 불리는 CD4+ T 세포의 아형군에 의해 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13가 함께 생산되며, 이는 알레르기 환자에게서 증가하는 것으로 발견되었다.
Th1 세포는 대식 세포 활성화 및 세포 매개 면역을 유도하는 데에 중요한 사이토카인 (IFN-γ, IL-2, 종양 괴사 인자-β [TNF-β])을 분비한다. Th2 세포는 체액성 면역 및 알레르기성 질환에 중요한 사이토카인 (IL-4, IL-5 및 IL-10)을 분비한다. Th1 사이토카인이 Th2 사이토카인의 생산을 저해하는 반면, Th2 사이토카인은 Th1 사이토카인의 생산을 저해한다. 이러한 음성 피드백 순환은 편향된 사이토카인 프로필의 생산을 강화한다. 이들 "반대" 사이토카인의 생산 간의 미묘한 균형 유지는 중요한데, 이는 Th1 사이토카인의 과발현이 자가면역성 염증 질환과 동종이식 거부반응을 일으키는 것으로 여겨지기 때문이다. 동시에, Th2 사이토카인의 과생산은 천식 및 알레르기성 비염과 같은 알레르기성 염증 질환을 일으키거나, 또는 세포내 병원체에 대해 비효율적으로 면역된다.
문헌 [DeKruyff,Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 215(1):11-20 (1997)]에서는 감염에 대한 감수성이 면역력의 부재에 의한 것이라기보다는 적절한 사이토카인 프로필을 분비하는 T-세포의 발생 과정으로 설명되는 모델을 제안하였다. 알레르기성 질환은 부적절하게 Th2 사이토카인을 분비하는 CD4+ T 세포로 인해 유발되는데, 알레르기가 없는 개체는 IgE 합성과 마스트세포 및 호산구 분화를 저해하는 Th1 사이토카인을 분비하는 T 세포가 발생하기 때문에 증상을 나타내지 않게 되는 것이다. 다른 방식으로 언급하자면, 알레르기성 비염 및 천식이란, 정상적으로는 "Th2" 조절/억제 세포로 분화되는 T 세포가 대신에 알레르기성 염증을 개시 및 강화하는 "Th2" 세포로 발달하게 되는, 병리학적 비정상 또는 병리학적 구강/비강 내성을 나타낼 수 있는 것이다.
일반적으로 사이토카인 수용체는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 다중-도메인 구조가 특징이다. 일반적으로 세포외 도메인은 리간드와 결합하는 기능을 하며, 막횡단 도메인은 수용체를 세포막에 고정시키는 기능을 하고, 세포내 도메인은 일반적으로 세포 내의 신호 전달에 관여하는 작동자 (effector)이다. 그러나, 리간드-결합 및 작동자 기능은 다중체 (multimeric) 수용체 중의 별도의 서브유닛 (subunit) 상에 존재한다. 리간드 결합 도메인은 그 자체가 다중 도메인을 가질 수 있다. 다중체 수용체란 일반적으로 (1) 동형이량체 (homodimer), (2) 리간드 결합 도메인 및 작동자 도메인 둘 모두가 있는 서브유닛을 갖는 이형이량체 (heterodimer), (3) 개별적인 기능이 있는 서브유닛 성분을 갖는 다중체를 포괄하는 넓은 의미의 용어이다. 사이토카인 수용체에 대해서는 문헌 [Urdahl,Ann. Reports Med. Chem.26:221-228 (1991)] 및 문헌 [Cosman,Cytokine 5:95-106 (1993)]에 추가로 개괄 및 분류되어 있다.
특이적인 면연 관련 용도 (예, Th1 및 Th2 세포 매개 생리 작용) 뿐만 아니라, TCCR 코딩 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)가 혼성화 프로브로서의 용도, 염색체 맵핑 및 유전자 맵핑의 용도와 안티-센스 RNA 및 안티-센스 DNA의 생성을 위한 용도를 비롯하여 분자 생물학 업계에서 다양한 용도를 가지고 있다. 또한, TCCR 핵산은 본원에서 기술하는 재조합 기술에 의한 TCCR 폴리펩티드의 제조에도 유용하다.
도 3 (서열 1) 및 도 4 (서열 2)에 기술된 전장 천연 서열 TCCR 유전자 또는 그의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용하여 전장 TCCR cDNA를 단리하거나 도 3 및 도 4 (각각 서열 1 및 서열 2)에 기재된 TCCR 서열과 원하는 서열 동일성을 갖는 다른 cDNA (예를 들어, 자연 발생적인 TCCR 변이체를 코딩하는 것 또는 다른 종으로부터의 TCCR)를 단리하는데 사용할 수 있다. 임의로, 상기 프로브의 길이는 약 20개 내지 50개의 염기이다. 혼성화 프로브는 서열 1 및 서열 2의 뉴클레오티드 서열의 영역 (과도한 실험 없이 또는 천연 서열 TCCR의 프로모터, 인헨서 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 결정될 수 있음)으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝법은 공지된 DNA 서열을 사용하여 염기 약 40개의 선별된 프로브를 합성하고, 이로써 TCCR 유전자의 코딩 영역을 단리하는 것을 포함한다. 혼성화 프로브는32P 또는35S와 같은 방사성 뉴클레오티드 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통해 프로브와 커플링된 알칼린 포스파타제와 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지에 의해 표지될 수 있다. 본 발명의 TCCR 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브는 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하여 프로브가 혼성화하는 상기 라이브러리의 구성원이 무엇인지 결정하는데 사용할 수 있다. 혼성화 기술은 하기 실시에에서 보다 자세하게 기술되어 있다. 임의의 EST 또는 본원에 개재된 다른 서열 단편이 본원에 개재된 방법을 이용하여 프로브로서 유사하게 사용될 수 있다.
TCCR 핵산의 다른 유용한 단편으로는 표적 TCCR mRNA에 결합할 수 있거나 (센스) TCCR DNA에 결합할 수 있는 (안티센스) 단일쇄 핵산 서열 (RNA 또는 DNA임)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 따른, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 TCCR DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 그러한 단편은 일반적으로 뉴클레오티드 약 14개 이상, 바람직하게는 뉴클레오티드 약 14 내지 30개를 포함한다. 소정의 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 근거하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 기술은, 예를 들어 문헌 [Stein and Cohen,Cancer Res. 48:2659 (1998)] 및 문헌 [van der Krolet al.,BioTechniques6:958 (1998)]에 기술되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산 서열에 결합하면 이중체의 촉진된 분해, 전사 또는 번역의 미숙 종결을 비롯한 여러 수단에 의하거나 다른 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중체가 형성된다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 TCCR 단백질의 발현을 차단하는 데 사용될 수 있다. 또한, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 수식된 당-포스포디에스테르 골격 (또는 국제 공개 제91/06629호에 기술된 다른 당 결합)을 가지며, 그러한 당 결합이 내생 뉴클레아제에 내성인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 내성 당 결합이 있는 그러한 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 안정 (즉, 효소 분해에 대한 내성이 가능)하지만, 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성은 그대로 보유하고 있다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는 국제 공개 제90/10048호에 기술된 바와 같은 유기 성분 및 폴리-(L-리신)과 같이 표적 핵산 서열을 위해 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 다른 성분에 공유 결합된 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한, 엘립티신 (ellipticine)과 같은 삽입성 물질 (intercalating agent) 및 알킬화제 또는 금속 복합체가 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 결합하여 그 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염, 전기천공법을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법 또는 엡스테인-바 (Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용하여, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직한 방법에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 적합한 레트로바이러스 벡터 내로 삽입된다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포는 생체 내 또는 생체 외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉된다. 적합한 레트로바이러스에는 쥐 레트로바이러스인 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스)로부터 유래된 것들이나 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C (국제 공개 제90/13641호 참조)로 명명된 이중 카피 벡터가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 국제 공개 제91/04753에 기술된 바와 같이 리간드 결합 분자와 접합을 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토카인 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 리간드 결합 분자의 접합은 리간드 결합 분자가 그의 대응 분자 또는 수용체에 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않는 것이 바람직하며, 그렇지 않을 경우 상기 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드나 그의 접합된 물질은 세포 내로의 진입이 차단된다.
별법으로, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 국제 공개 제90/10448호에 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입된다. 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 내생 리파제에 의해 세포 내에서 분리되는 것이 바람직하다.
또한, 프로브를 PCR 기술에 사용하여 밀접하게 관련된 TCCR 코딩 서열을 확인하기 위한 서열의 풀을 생성할 수 있다.
또한, TCCR 코딩 뉴클레오티드 서열은 그 TCCR을 코딩하는 유전자를 맵핑하기 위한 혼성화 프로브 또는 유전병이 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 제작하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 제공된 뉴클레오티드 서열은 인 사이투 (in situ) 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 결합 분석 및 라이브러리와의 혼성화 스크리닝과 같이 공지된 기술을 이용하여 염색체 및 염색체의 특이적인 영역에 대해 맵핑할 수 있다.
TCCR은 수용체이기 때문에, TCCR 코딩 서열은 다른 단백질과 결합하는 단백질을 코딩한다. 따라서, 본 발명의 TCCR 단백질은 결합 상호 작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석 시험에서 사용될 수 있다. 그러한 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 저해제가 확인될 수 있다. 또한, 그러한 결합 상호작용에 관여하는 단백질은 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 저해제 또는 아고니스트를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 또한, TCCR 수용체는 상관관계가 있는 리간드(들)을 단리하는데 사용될 수 있다. 스크리닝 분석 시험을 이용하여 천연 TCCR의 생물학적 활성을 모방하는 선도 (lead) 화합물 또는 TCCR의 리간드를 발견할 수 있다. 그러한 스크리닝 분석 시험은 화학물질 라이브러리의 초고속 활성 검색을 가능하게 하는 분석 시험을 포함하며, 이는 소분자 약물 후보 물질을 확인하는데 특히 적합하다. 이에 해당하는 소분자로는 합성 유기 화합물 또는 무기 화합물이 포함된다. 분석 시험은 단백질-단백질 결합 분석 시험, 생화학적 스크리닝 분석 시험, 면역검정 (immunoassay) 및 세포계 분석 시험을 비롯한 다양한 형식으로 수행될 수 있으며, 이들은 당업계에서 잘 특성화되어 있다.
또한, 본원에 기술한 TCCR 폴리펩티드는 단백질 전기영동 목적을 위한 분자량 마커로서 사용될 수 있다.
본원에 기술한 TCCR 폴리펩티드 코딩 핵산 분자 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 염색체 확인에 유용하다. 이에 대해서, 신규 염색체 마커를 확인할 필요가 지속적으로 있어 왔는데, 실재 서열 데이타에 근거한 염색체 마킹 시약은 현재 소수만이 이용 가능하기 때문이다. 본 발명의 각 TCCR 핵산 분자는 염색체 마커로서 사용될 수 있다.
또한, TCCR 폴리펩티드 및 본 발명의 핵산 분자는 조직형별 검사에 사용될 수 있으며, 본 발명의 TCCR 폴리펩티드는 조직마다 달리 발현될 수 있다. TCCR 핵산 분자는 PCR용, 노던 분석용, 서던 분석용 및 웨스턴 분석용 프로브를 생성하는데 유용성이 있다.
2. 항체 결합 연구
본 발명의 TCCR 폴리펩티드 활성은 항-TCCR 항체가 조직 세포상의 TCCR 폴리펩티드 효과 저해 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합 항체가 있으며, 그 제조 방법은 하기와 같다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석으로 수행할 수 있다 (Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.. 147-158 (CRS Press, Inc., 1987)).
경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하는데 있어 시험 샘플 분석물과과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 좌우된다. 시험 샘플중 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양 측정을 촉진시키기 위해, 항체는 경쟁전 또는 후에 불용화시켜, 항체에 결합하는 표준 물질 및 분석물이 결합되지 않은 채로 남아있는 표준 물질 및 분석물로부터 쉽게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
샌드위치 분석은 각각 검출할 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 항체를 사용하는 방법을 포함한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고체 지지체상에 고정되는 제1 항체에 의해 결합되고, 그후 분석물에 제2 항체가 결합됨에 따라, 불용성 3부 결합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체는 그 자체로 검출가능한 성분으로 표지 (직접 샌드위치 분석)할 수 있거나, 또는 검출가능한 부분에 의해 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 (간접 샌드위치 분석) 측정할 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 유형은 ELISA 분석이며, 이 경우 검출가능한 성분은 효소이다.
면역조직화학에서, 종양 샘플은 신선한 상태이거나 또는 냉동시킬 수 있으며, 또는 파라핀에 매몰시키거나 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
3. 세포 기재의 분석 시험
세포 기재 분석및 동물 모델은 유전자 증폭 분석에서 발견된 사항을 입증하며, 본원에서 확인된 유전자 및 폴리펩티드와 면역 관련 질환의 발달 및 병인 사이의 관계를 더 이해하는데 이용할 수 있다.
또다른 연구에서, 특정 면역 관련 질환에 관련된 것으로 공지된 세포 유형의 세포는 본원에서의 cDNA로 형질감염시키고, cDNA가 면역 기능을 촉진하거나 저해하는 능력을 분석한다. 적합한 세포는 목적하는 유전자로 형질감염될 수 있고, 면역 기능 활성을 모니터링할 수 있다. 이어서, 상기 형질감염된 세포주는 면역 기능을 저해하거나 촉진하는, 예를 들어 T 세포 증식 및 염증 세포 침윤을 조절하는 폴리- 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는데 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 코딩 서열로 형질감염된 세포는 추가로 면역 관련 질환의 치료를 위한 후보 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물 (transgenic animal, 하기 기재된 바와 같음)로부터 유래된 1차 배양액이 세포 기재의 분석에서 사용될 수 있지만, 안정한 세포주가 바람직하다. 트랜스제닉 동물로부터 연속성 세포주를 유도해내는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Smallet al.,Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)).
적합한 세포 기재 분석 시험으로 혼합 림프구 반응 (MLR)이 있다 (Current Protocols in Immunology, unit 3.12; edited by J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institute of Health, Published by John Wiley ＆ Sons, Inc.). 이 분석 시험에서, 시험 화합물이 활성화 T 세포의 증식을 촉진하거나 저해하는 능력을 시험할 수 있다. 반응 T 세포 현탁액을 동종이계 자극자 (allogenic stimulator) 세포와 함께 배양하고, 삼중수소화 티미딘의 흡수량를 통해 T 세포의 증식을 측정하였다. 이 분석 시험은 T 세포 반응성에 대한 일반적인 측정법이다. 활성화에 대해서 대부분의 T 세포가 반응하고 IL-2를 생산하기 때문에, 이 분석 시험에서 반응 상의 차이는 반응하는 세포에 의한 IL-2 생산의 차이로 일부 반영된다. MLR 결과는 표준 림포카인 (IL-2) 검출 분석 시험에 의해 입증할 수 있다 (상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, 3.15, 6.3] 참조).
MLR 분석 시험에서 T 세포 증식 반응은 분석 시험된 분자의 직접적인 유사분열 촉진성 때문이거나 외부 항원에 의해 유도된 활성화 때문일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 T 세포 촉진 활성에 대한 추가의 입증은 동시촉진 (costimulation) 분석 시험에 의해 얻어질 수 있다. T 세포 활성화는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 매개된 항원 특이적 신호 및 제2 리간드 결합 상호작용, 예를 들어 B7 (CD80, CD86)/CD28 결합 상호작용을 통해 매개된 동시촉진 신호를 필요로 한다. CD28 가교결합은 활성화 T 세포에 의해 림포카인 분비를 증가시킨다. T 세포 활성화는 음성 효과 또는 양성 효과를 갖는 리간드의 결합을 통해 음성 조절과 양성 조절 둘 다를 받는다. CD28 및 CTLA-4는 B7에 결합하는 Ig 군 (superfamily)에 관련된 당단백질이다. CD28와 B7의 결합은 T 세포 활성화의 양성 동시 촉진 효과를 갖는다. 역으로, CTLA-4와 B7의 결합은 음성 T 세포 불활성화 효과를 갖는다 (Chambers, C.A. and Allison, J.P.,Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:396; Schwartz, R.H.,Cell(1992) 71:1065; Linsey, P.S. and Ledbetter, J.A.,Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C.H.et al.,Immunol. Today(1994) 15:321; Jenkins, M.K.,Immunity(1994) 1:405). 동시촉진 분석 시험에서, 본 발명의 폴리펩티드는 T 세포 동시 촉진 또는 저해 활성에 대해서 분석 시험하였다.
예를 들어 MLR 및 동시촉진 분석 시험에 의해 결정된, T 세포 증식의 촉진자 (동시촉진자) 및 아고니스트, 예를 들어 아고니스트 항체인 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 본 발명의 다른 화합물은 부족한, 최적값 이하의 또는 불충분한 면역 기능이 특징인 면역 관련 질환을 치료하는 데 유용하다. 이들 질병은 T 세포의 증식 및 활성화 (예, T 세포 매개 면역, Th1 및(또는) Th2 사이토카인 생산)를 촉진하고, 본 발명의 촉진 폴리펩티드와 같은 촉진성 화합물의 투여를 통해 포유동물의 면역 반응을 개선함으로써 치료할 수 있다. 촉진 폴리펩티드는, 예를 들어 TCCR 리간드 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트 항체일 수 있다.
본 발명에서와 같은 촉진 화합물의 직접적인 용도는 4-1BB 당단백질 (항원처리된 T 세포 상에 발현된 리간드 (4-1BBL)에 결합하며 T 세포 활성화 및 성장 신호를 전달하는 종양 괴사 인자 수용체군의 일원임)을 이용한 실험으로 입증되었다 (Alderson, M.E.et al.,J. Immunol. (1994) 24;2219).
또한, 아고니스트 촉진 화합물의 용도 역시 실험을 통해 입증되었다. 항-4-1-BB 항체 아고니스트의 처리에 의한 4-1BB의 활성화는 종양의 소거를 증가시켰다 (Hellstrom, I. and Hellstrom, K.E.,Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1). 하기에 보다 상세하게 기술되는 종양 치료용 면역항진제 요법은 본 발명의 촉진 화합물의 용도에 대한 또다른 예이다.
또한, 면역 촉진 또는 상승 효과는 MLR 분석 시험에서 저해제로 확인된 단백질의 활성을 길항하거나 차단함으로써 이루어질 수 있다. 상기 화합물의 저해 활성을 무효화함으로써 전체적으로 촉진 효과가 일어난다. 적합한 길항제/차단 화합물은 저해 단백질을 인식하고 결합하여, 이를 통해 그 단백질과 그의 수용체가 효과적으로 상호작용하는 것을 차단하고, 그 수용체를 통한 신호 전달을 저해하는 항체 또는 그의 단편이다. 이 효과는 항-CTLA-4 항체를 이용한 실험에서 상기 항체가 아마도 CTLA-4 결합에 의해 야기된 저해 신호를 제거함으로써 T 세포 증식을 상승시킨 것으로 입증되었다 (Walunas, T.L.et al,Immunity(1994) 1:405).
한편, T 세포 증식/활성화 및(또는) 림포카인 분비의 직접적인 저해제인 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 본 발명의 다른 화합물은 면역 반응을 억제하는 데 직접적으로 사용될 수 있다. 이들 화합물은 면역 반응의 정도를 감소시키고, 과민성, 최적값 초과의, 또는 자가면역 반응이 특징인 면역 관련 질환을 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 화합물의 이러한 용도는, CTLA-4의 수용체 B7에 대한 결합이 T 세포를 불활성화 시키는 상기 기술된 실험에 의해 입증될 수 있다. 본 발명의 직접적인 저해 화합물은 비슷한 방식으로 기능한다.
별법으로, 본 발명의 촉진 폴리펩티드와 결합하고 이들 분자의 촉진 효과를 차단하는 화합물, 예를 들어 항체는 전체적으로 저해 효과를 나타내며, T 세포 증식/활성화 및(또는) 림포카인 분비를 저해함으로써 T 세포 매개 면역 반응을 억제하는 데 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 촉진 효과를 차단하면 포유동물의 면역 반응이 억제된다. 이러한 용도는 항-IL2 항체를 이용한 실험에서 입증되었다. 이들 실험에서, 항체가 IL2에 결합하여, IL2가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단함으로써 T 세포 저해 효과를 나타내었다.
4. 동물 모델
세포 기재 시험관내 분석 시험의 결과는 T 세포 기능에 대한 생체내 동물 모델 및 분석 시험을 이용하여 추가로 입증할 수 있다. 잘 공지되어 있는 각종 동물 모델은 면역 관련 질환의 발생 및 변인에 있어서 본원에서 확인된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 소분자 길항제를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 길항제의 효능을 시험하는데 사용할 수 있다. 상기 분자의 생체내 특성으로 인해 특히 인간 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 면역 관련 질환의 동물 모델로는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물이 있다. 비-재조합 동물로는 설치류 모델, 예를 들어 쥐 모델이 있다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐의 이식 등을 사용하여 세포를 순계 생쥐에 도입하여 제조한다.
이식편-대-숙주병은 면역적격 세포가 면역 억제된 또는 면역 내성인 환자에게 이식되는 경우 일어난다. 공여자 세포는 숙주 항원을 인식하고 반응한다. 상기 반응은 생명을 위협하는 심각한 염증에서부터 설사 및 체중 감소의 온화한 경우까지 다양할 수 있다. 이식편-대-숙주병 모델은 MHC 항원 및 소수의 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 과정이 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.3]에 상세히 기술되어 있다.
피부 동종 이식편 거부 반응에 대한 동물 모델은 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하고, 이식 거부 반응에서 T 세포의 역할을 측정하는 수단이다. 가장 일반적이고 허용되는 모델은 쥐의 꼬리 피부 이식편을 사용한 것이다.반복 실험 결과 피부 동종이식편 거부 반응은 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 세포독성-작동자 T 세포에 의해 매개되며, 항체는 매개하지 않는 것으로 나타났다 (Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H.,Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992). 적합한 과정이 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.4]에 상세히 기술되어 있다. 본 발명의 화합물을 시험하는 데 사용될 수 있는 다른 이식 거부 반응 모델로는 문헌 [Tanabe, M.et al.,Transplantation(1994)58:23] 및 문헌 [Tinubu, S.A.et al.,J. Immunol. (1994) 4330-4338]에 기술되어 있는 동종 심장 이식 모델이 있다.
지연형 과민에 대한 동물 모델도 세포 매개 면역 기능에 대한 분석 시험을 제공한다. 지연형 과민 반응은 항원 자극 후 일정 시간이 경과된 후까지 염증이 최고점에 도달하지 않는 것이 특징인 T 세포 매개 생체내 면역 반응이다. 또한, 이들 반응은 다발성 경화증 (MS)과 같은 조직 특이적 자가면역성 질환 및 실험용 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS를 위한 모델)에서 일어난다. 적합한 과정이 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.5]에 상세히 기술되어 있다.
EAE는 T 세포 및 단핵구 염증과 추후에 중추신경계에서 일어나는 액손의 탈수초화가 특징인 T 세포 매개 자가면역성 질환이다. 일반적으로 EAE는 인간의 MS를 위한 관련 동물 모델로서 간주된다 (Bolton, C.,Multiple Sclerosis(1995) 1:143). 급성 모델 및 재발-관해형 모델 둘 모두가 개발되었다. 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.1 and 15.2]에 기술된 프로토콜을 이용하여, 본 발명의 화합물로 면역 매개 탈수초화 질병에 대한 T 세포 촉진 또는 저해 활성을 시험할 수 있다. 또한 문헌 [Duncan, I.D.et al.,Molec. Med. Today(1997) 554-561]에 기술된 바와 같이 중추신경계로 이식된 핍지교세포 또는 슈반 (Schwann) 세포에서의 수초 질병에 대한 모델을 참조한다.
접촉 과민은 세포 매개 면역 기능의 단순 지연형 과민 생체 내 분석 시험이다. 이 과정에서는, 피부를 외부 합텐에 노출시키고, 지연형 과민 반응이 일어나면, 이를 측정 및 정량한다. 접촉 과민은 초기 과민기와 그 후의 유도화기가 관여한다. 유도화기는 T 림프구가 이전에 접촉했던 항원과 만나는 경우에 일어난다. 돌기 및 염증이 일어나고, 이는 인간 알레르기성 접촉성 피부염의 훌륭한 모델이 된다. 적합한 과정은 문헌 [Current Protocols in Immunology, Eds. J.E. Cologan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach and W. Strober, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1994, unit 4.2]에 상세하게 기술되어 있다. 또한, 문헌 [Grabbe, S. and Schwarz, T,Immun. Today 19(1):37-44 (1998)]을 참조한다.
관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이 모델은 인간 자가면역 류마티스성 관절염의 임상적, 조직학적 및 면역학적 특성을 공유하며, 인간 자가면역 관절염에 대한 허용된 모델이다. 생쥐 및 쥐 (rat) 모델은 활막염, 연골조직 및 연골하 골의 미란(靡爛)이 특징이다. 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.5]에 기술된 프로토콜을 이용하여, 본 발명의 화합물로 자가면역 관절염에 대한 활성을 시험할 수 있다. 또한, 문헌 [Issekutz, A.C.et al.,Immunology(1996) 88:569]에 기술된, CD18에 대한 모노클로날 항체를 이용한 모델 및 VLA-4 인테그린을 이용한 모델을 참조한다.
오발부민으로 동물을 민감화시키고, 그 후 에어로졸에 의해 전달되는 동일 단백질로 상기 동물을 항원 자극함으로써 항원-유도된 기도 과민 반응, 폐 호산구증다증 및 염증이 유도된 모델에서 천식 모델이 기술되었다. 수종의 동물 모델 (기니아 피그 (guinea pig), 쥐, 비-인간 영장류)에서 에어로졸 항원으로 항원 자극시에 인간의 아토피성 천식과 유사한 증상이 나타났다. 쥐 모델은 인간 천식의 많은 특성을 가지고 있다. 본 발명의 화합물로 천식의 치료에 대한 활성 및 효과를 시험하는 데 적합한 과정이 문헌 [Wolyniec, W.W.et al.,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777] 및 그 안에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 건선 유사 질병에 대한 동물 모델 상에서 시험될 수 있다. 증거는 T 세포가 건선의 병인임을 시사하고 있다. 본 발명의 화합물은 생쥐가 건선과 유사한 조직학적 피부 병변을 나타내고 있는, 문헌 [Schon, M.P.et al.,Nat. Med. (1997)3:183]에 기술된 scid/scid 생쥐 모델에서 시험될 수 있다. 다른 적합한 모델에는 문헌 [Nickoloff, B.J.et al,Am. J. Pathol.(1995)146:580]에서 기술된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 생쥐 키메라가 있다.
재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 제조하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인된 유전자의 코딩부를 관심있는 동물의 게놈으로 유전공학적으로 도입함으로써 만들 수 있다. 트랜즈제닉 조작을 위한 표적으로 이용될 수 있는 동물로는 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 인간을 제외한 영장류, 예를 들어, 비비, 침팬지, 원숭이가 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 형질도입유전자 (transgene)를 상기와 같은 동물로 도입하는 당업계에 공지된 기술로는 전핵 미세주입 (microinjection)(Hoppe 및 Wanger, 미국 특허 제4,873,191호); 생식세포주로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전달 (예를 들어, 문헌 [Van Puttenet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148-615[1985]] 참조); 배의 간세포로의 유전자 표적화 (문헌 [hompsonet al.,Cell, 56:313-321[1989]] 참조); 배의 전기천공법 (문헌 [Lo,Mol. Cell Biol., 3:1803-1814[1983]] 참조); 정자 매개된 유전자 전달 (문헌 [Lavitranoet al.,Cell, 57:717-73[1989]] 참조)이 있다. 검토를 위해서는, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적상, 트랜스제닉 동물은 트랜스 유전자를 그 세포에만 갖는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 트랜스 유전자는 단일 트랜스 유전자로서 또는 연쇄체(concatamer)로, 예를 들어 헤드-투-헤드 (head-to-head) 또는 헤드-투-테일 (head-to-tail) 텐덤으로 통합될 수 있다. 특정 세포 유형으로의 트랜스 유전자의 선택적 도입은 또한, 예를 들어 문헌 [Laskoet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-6236 (1992)]의 기술로 수행할 수 있다.
트랜스제닉 동물에서의 트랜스 유전자의 발현은 표준 기술로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭은 트랜스 유전자를 입증하는데 사용할 수 있다. 이어서, mRNA 발현 정도는 원래 위치에서의 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학 등의 기술을 이용하여 분석할 수 있다.
나아가, 상기 동물은, 예를 들어 면역 세포가 특정 조직으로 침윤하는 것을 결정하는 조직학적 관찰에 의해 면역 질병 병리의 징후에 대해 관찰할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 본 발명의 화합물로 처리하여 본 화합물의 T 세포 증식자극 또는 저해 정도를 결정하는 차단 실험을 수행할 수 있다. 이들 실험에서, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는, 상기 기술된 바와 같이 제조된 차단 항체를 동물에게 투여하고, 면역 기능에 대한 효과를 결정한다.
또한, TCCR 또는 그의 수식된 형태를 코딩하는 핵산은 트랜스제닉 동물 또는 "녹아웃" 동물을 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이는 치료상 유용한 작용제의 개발 및 스크리닝에 유용하다. "녹아웃"이란 내생 유전자를 "녹아웃"시키거나 상동 재조합을 사용하여 제거한 트랜스제닉 동물을 기술하는 당업계의 용어이다. 상동 재조합이란 내생 유전자에 대해 상동성인 표적화 벡터의 영역을 기술하기 위해 사용하는 당업계의 용어이다. 이들 상동성 영역은 서로 혼성화하고, 숙주의 게놈으로 재조합되어 공유된 상동성 영역에 의해 정해진 위치 및 방향으로 숙주의 내생 서열을 벡터 인서트 서열로 치환하게 된다. 녹아웃 동물의 유전자형은 그 유전자의 이름 뒤에 "-/-"로 표기한다. 이는 "-/+"로 지칭되는, 단지 하나의 대립 유전자만 "녹아웃된" 동물과 구별된다. "녹아웃"된 내생 유전자는 더이상 그 동물의 모든 세포에서 발현되지 않는다. 특이적인 세포에 대해 상세하게 분석하여 제거된 유전자의 기능을 확인할 수 있다.
트랜스제닉 동물 (예, 생쥐 또는 쥐)은 형질도입유전자를 포함하는 세포를 갖는 동물인데, 형질도입유전자는 태아기, 예를 들어 배 단계에서 동물 또는 그 동물의 조상에 도입된다. 형질도입유전자는 세포의 게놈내에 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발달한다. 한 실시태양에서, TCCR을 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 TCCR을 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고,이 게놈 서열을 사용하여 TCCR을 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생성시킬 수 있다. 특히, 생쥐 또는 쥐와 같은 트랜스제닉 동물을 생성시키는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이며, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 TCCR 형질도입유전자의 도입에는 특정 세포가 표적이 된다. 배 단계에서 동물의 생식 라인에 도입된 TCCR을 코딩하는 한 카피의 형질도입유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 TCCR을 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은 예를 들어 TCCR을 폴리펩티드의 과다발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 생각되는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 상기 시약으로 동물을 처리하면, 형질도입유전자를 보유하는 미처리 동물에 비해 병리학적 증상의 발생은 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대한 잠재적인 치료적 개입을 나타낸다.
별법으로, 본원에서 확인된 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 내생성 유전자와 동물의 배세포로 도입된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA사이의 동형 재조합 결과 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 결함이 있거나 변형된 "녹아웃" 동물을 만들 수 있다. 예를 들어, TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용할 수 있다. 특정 TCCR을 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자로 치환할 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스(kb)의 비변형된 플랭킹 (flanking) DNA (5' 및3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함되어 있다 (동형 재조합 벡터의 설명의 경우, 예를 들어 문헌 [Thomas and Capecchi,Cell, 51:503 (1987)] 참조). 벡터를 배세포 세포주로 (예를 들어, 전기천공법) 도입하고, 도입된 DNA가 내생성 DNA와 함께 동형 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915(1992]). 이어서, 선별된 세포는 동물 (예를 들어, 생쥐 또는 쥐)의 포배로 주사하여 집합체 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, inTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배는 적합한 가임신 암컷 대리모 동물 및 배로 이식하여 "녹아웃" 동물을 유도하였다. 생식 세포에 동형 재조합 DNA를 함유하는 자손은 표준 기술로 확인할 수 있고, 동물의 모든 세포가 동형 재조합 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 녹아웃 동물은, 예를 들어 특정 병인적 증상을 방어하는 능력 및 TCCR 폴리펩티드의 부재로 인한 변인적 증상의 발생을 특징으로 한다.
본 발명을 위해, Th1 및(또는) Th2 면역 반응과 그에 의해 매개되는 질환의 TCCR 효현작용 (agonization)/길항작용 (antagonization)의 효과를 연구하기 위한 녹아웃 생쥐를 만들었다.
5. 키메라 수용체
추가로, 키메라 수용체를 만들어 미지의 리간드를 갖는 수용체에 의한 신호 전달 효과를 결정할 수 있다. 키메라 수용체는 리간드의 단리 없이 수용체의 기능을을 관찰하는 수단임이 증명되었다 (문헌 [Changet al.,Mol. Cell Biol.18(2):896-905 (1998)] 참조).
6. 면역항진제 요법
한 실시 태양에서, 본 발명의 면역촉진 화합물은 종양 (암)의 치료를 위한 면역항진제 요법에서 사용될 수 있다. T 세포가 인간 종양 특이적 항원을 인식한다는 것은 이제 잘 확립된 사실이다. MAGE, BAGE 및 GAGE 유전자족에 의해 코딩되는 일군의 종양 항원은 성인의 모든 정상적인 조직에서 발현하지 않지만, 흑색종, 폐 종양, 두경부 종양 및 방광암과 같은 종양에서는 주목할만한 양으로 발현된다 (문헌 [DeSmet, C.et al., (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7149] 참조). T 세포의 동시촉진은 종양 퇴화 및 항-종양 반응을 유도한다는 것이 시험관내 및 생체내에서 증명되었다 (Melero, I.et al.,Nature Medicine(1997) 3:682; Kwon, E.D.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997) 94:8099; Lynch, D.H.et al.,Nature Medicine(1997) 3:625; Finn, O.J. and Lotzc, M.T.,J. Immunol. (1998) 21;114). 본 발명의 촉진 화합물을 항진제로서 단독으로 또는 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제와 함께 투여하여, T 세포 증식/활성화 및 종양 항원에 대한 항-종양 반응을 촉진할 수 있다. 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제는 공지된 투여 처방 계획을 이용하여 통상적인 양으로 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물에 의한 면역촉진 활성은 성장 조절제, 세포독성제 또는 화학요법제의 양을 감소시킬 수 있도록 하여, 환자에 대한 잠재적 독성을 저하시킬 수 있다.
7. 후보 약물의 스크리닝 분석 시험
후보 약물에 대한 스크리닝 분석 시험은 본원에서 확인된 TCCR 핵산에 의해코딩되는 폴리펩티드에 결합하거나 그와 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 고안되었다. 그러한 스크리닝 분석 시험은 키메라 라이브러리의 스크리닝을 고도로 처리하여 특히 소분자 후보 약물을 확인하는데 적합할 수 있는 분석을 포함한다. 예상되는 소분자로는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-이뮤노글로불린 융합체와, 특히 폴리- 및 모노클로날 항체를 비롯한 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체 및 상기 항체 또는 항체 단편의 키메라 또는 인간화 형태와 또한 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체를 비롯한 합성 유기 또는 무기 화합물이 있다.
분석 시험은 당업계에 잘 특성화되어 있는 단백질-단백질 결합 분석 시험, 생화학적 스크리닝 분석 시험, 면역 분석 시험 및 세포 기재의 분석 시험을 비롯한 각종 형식으로 수행할 수 있다. 모든 약물 후보 분석 시험은 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 후보 약물이 이들 두 성분이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시키는 것을 필요로한다는 점에서 공통적이다.
결합 분석 시험에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출할 수 있다. 본 발명의 TCCR 폴리펩티드는 수용체이기 때문에 TCCR ECD 단편도 TCCR 변이체, 그의 길항제 및(또는) 그의 아고니스트를 비롯한 약물 후보를 확인할 목적으로 적합하게 사용될 수 있다. 특정 실시 태양에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 후보 약물은 고상 지지체, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트상에 공유결합적 또는 비공유결합적 부착으로 고정시킨다. 비공유결합적 부착은 일반적으로 고상 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코딩하고 건조시켜 이루어진다. 별법으로, 고정될 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체, 예를 들어 모노클로날 항체는 고상 표면에 폴리펩티드를 고정시키는데 사용할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어 고정된 성분을 갖는 코팅 표면에 가하여 수행한다. 반응이 완료되면, 비반응성 성분은 예를 들어, 세척하여 제거하고, 고상 지지체상에 고정된 결합체를 검출한다. 원래의 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 갖고 있는 경우, 표면상에 고정된 표지가 검출되면 이는 결합체가 형성되었음을 가리키는 것이다. 원래의 고정되지 않은 성분이 표지를 갖지 않는 경우, 예를 들어 고정된 결합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 결합체 형성을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 특정 TCCR 단백질과 상호작용하지만, 그에 결합하지는 않는 경우, 그 단백질과의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 있어 잘 공지된 방법으로 분석 시험할 수 있다. 그러한 분석 시험법으로는, 전통적인 연구법, 예를 들어 가교결합, 동시-면역침전 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시 정제법이 있다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Chevary and Nathans,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-95828 (1991)]에 개시된 바와 같이 필드 (Field)와 그의 공동 연구자의 문헌 [Fields and Song,Nature, 340:245-246(1989); Chienet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9578-9582(1991)]에 기재된 효모 기재의 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할수 있다. 많은 전사 활성화 인자, 예를 들어 효모 GAL4는 두 개의 물질적으로 독특한 조절 도메인으로 이루어져 있는데, 그 중 하나는 DNA 결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사 활성 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "투-하이브리드 시스템 (two-hybrid system)"으로 불림)은 그러한 특성을 이용하며, 2 종의 하이브리드 단백질, 즉 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA 결합 도메인에 융합되어 있는 단백질, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성 도메인에 융합되어 있는 단백질을 사용한다. GAL4-활성화 프로모터에 의한 조절하에 있는 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질로 검출할 수 있다. 투 하이브리드 기술을 이용하여 두 특이적 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전 키트 (매치메이커 (MATCHMAKER), 상표명)는 Clontech로부터 구입할 수 있다. 이 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관련된 단백질 도메인을 지도화하는 것은 물론 그러한 상호작용에 결정적으로 중요한 아미노산 잔기를 정확하게 나타내는데까지 확장하여 사용할 수 있다.
본원에서 확인된 TCCR 폴리펩티드와 다른 세포내 성분 및 세포외 성분 사이의 상호작용을 방해하는 화합물을 발견하기 위해, 반응 혼합물은 증폭된 유전자의 생성물 및 세포간- 또는 세포외 성분을 이들 생성물이 상호작용하고 결합할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시켜 제조한다. 결합을 억제하는 시험 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 존재 및 부재하에 실행한다. 또한,제3 반응 혼합물에 위약을 가하여 양성 대조용으로 이용한다. 혼합물중에 존재하는 시험 화합물과 세포간- 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결합체 형성)은 상기한 바와 같이 모니터링한다. 시험 화합물을 함유하지 않는 반응 혼합물이 아닌 대조 반응물(들)에서 결합체가 형성되면, 이는 시험 화합물과 그의 반응 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 것을 가리키는 것이다.
8. 면역 관련 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
면역 관련 질환 (예, Th1- 및(또는) Th2-매개 질환)의 치료에 유용한 조성물로는 면역 기능, 예를 들어 T 세포 증식/활성화, 림포카인 분비 또는 면역 세포 침윤을 저해 또는 촉진하는 단백질, 항체, 유기 소분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중 나선 분자 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화되어 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질로의 번역을 저해한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 번역 개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이로부터 유래된다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도누클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 [Rossi, Current Biology,4:469-471 (1994)] 및 1997년 9월 18일에 공개된 국제공개 제97/33551호를 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일쇄이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 후그스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하도록 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 상기 국제 공개 제97/33551호를 참조한다.
이들 분자는 상기 논의된 임의의 스크리닝 분석 시험 또는 그의 임의의 조합 및(또는) 당업자에게 널리 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인될 수 있다.
또한, 본원에서 기술된 TCCR 폴리펩티드, 아고니스트 및 길항제 (TCCR 분자)는 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 TCCR 분자는 제약상 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있으며, 그에 의해 TCCR 분자는 제약상 허용되는 담체 비히클 (vehicle)과 배합된다. 치료 제형은 바람직한 순도를 갖는 활성 성분을 임의 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액 형태의 보관용으로 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량과 농도에서 환자에게 무독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산, 아스코르브산 등의 항산화제, 저분자량 (약 10 개 잔기 미만의) 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린 등의 단백질,폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산, 단당류, 이당류, 및 그밖에 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, EDTA 등의 킬레이트제, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알콜, 나트륨 등의 염-형성 카운터이온, 및(또는) Tween (상표명), Pluronics (상표명) 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이는 동결건조 및 재용해 (reconstitution) 전 또는 후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본원의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 출입구가 있는 용기, 예를 들면 정맥내 용액제 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알에 담을 수 있다.
투여 경로는 공지된 방법, 예를 들면 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방계에 의한 방법이 있다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 목적하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 변할 수 있다. 적합한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자라면 잘 아는 것이다. 동물 실험 결과는 인간 치료에 효과적인 투여량을 결정하는데 믿을만한 지침을 제공한다. 종간의 효과적인 투여량의 척도화는 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" InToxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press,New York 1989, pp. 42-96]의 원리에 따라 수행될 수 있다.
TCCR 분자를 생체내 투여용으로 이용하는 경우, 정상적인 투여량은 투여 경로에 따라 1일 포유동물 체중 당 약 10 ng/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상으로 다양할 수 있으며, 약 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일이 바람직하다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌에서 제공되며, 예를 들어 미국 특허 제 4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호를 참조한다. 다른 치료 및 다른 장애에 대해서는 다른 제형이 효과적이며, 특정 기관 또는 조직을 치료할 목적으로 투여하는 경우, 다른 기관 및 조직에 대한 투여와는 다른 방식의 전달을 필요로 할 것으로 예측된다.
TCCR 분자의 서방형 투여가 TCCR 분자의 투여를 요구하는 임의의 질병 또는 장애의 치료에 적합한 분비 특성의 제형인 경우, TCCR 분자의 미세캡슐화 (microencapsulation)가 예상된다. 재조합 단백질의 서방형 미세캡슐화는 인간 성장 호르몬 (rhGH), 인터페론-α, -β, -γ (rhIFN-α, -β, -γ), 인터루킨-2 및 MN rgp120 (문헌 [Johnsonet al.,Nat. Med. 2:795-799 (1996)], 문헌 [Yasuda,Biomed. Ther. 27:1221-1223 (1993)], 문헌 [Horaet al.,Bio/Technology8:755-758 (1990)], 문헌 [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems" inVaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds., (Plenum Press: New York, 1996), pp.439-462], 국제 공개 제97/03692호, 동 제96/40072호, 동 제 96/07399호 및 미국 특허 제5,654,010호 참조).
TCCR 분자의 서방형 제형은 폴리-락틱-코글리콜산 (PLGA) (강한 생체적합성 정도 및 광범위한 생분해성 성질을 보이는 중합체)을 이용하여 개발할 수 있다. PLGA의 분해산물인 락트산 및 글리콜산은 인체로부터 신속하게 제거된다. 또한, 이 중합체의 분해능력은 그 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 수년으로 조정될 수 있다. 추가의 정보를 위해, 문헌 [Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer," inBiogradable Polymers as Drug Delivery Systems, M. Chasin and R. Langeer, editors (Marcel Dekker;New York, 1990), pp.1-41]을 참조한다.
9. TCCR의 아고니스트 및 길항제의 확인
또한, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드 효과를 모방 또는 상승시키는 (아고니스트) 화합물 또는 TCCR 폴리펩티드의 기능 또는 활성 하나 이상을 방해 또는 저해하는 화합물을 확인하기 위한 화합물 스크리닝법을 제공한다. 그러한 길항제 및 아고니스트로는 TCCR 변이체, 펩티드 단편, 소분자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA) 또는 항체 (모노클로날 항체, 인간화 항체, 특이적 항체, 단일쇄 항체, 이종접합 항체 또는 상기 언급한 항체의 단편)이 바람직하다. 또한, TCCR 길항제는 잠재적인 TCCR 리간드를 포함할 수 있는 반면, 잠재적인 TCCR 아고니스트는 가용성 TCCR 세포외 도메인 (ECD)을 포함할 수 있다.
길항제 및(또는) 아고니스트 약물 후보에 대한 스크리닝 분석 시험은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 TCCR 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 이루는 화합물 또는 상기 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호 작용을 방해하는화합물을 확인하도록 설계되었다. 그러한 스크리닝 분석 시험에는 화학물질 라이브러리의 초고속 활성 검색을 가능하게 하는 분석 시험이 포함되며, 이는 소분자 약물 후보 물질을 확인하는데 특히 적합하다.
분석 시험은 당업계에 잘 특성화되어 있는 단백질-단백질 결합 분석 시험, 생화학적 스크리닝 분석 시험, 면역 분석 시험 및 세포 기재의 분석 시험을 비롯한 각종 형식으로 수행할 수 있다.
길항제에 대한 본원의 스크리닝 분석 시험은 TCCR 폴리펩티드와 후보 약물이 이들 두 성분이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건 하에 접촉시키는 것을 필요로 한다는 점에서 공통적이다.
TCCR 길항제 및 아고니스트를 확인하는 데 유용하고 적합한 분석 시험의 예는 상기에서7. 후보 약물의 스크리닝 분석 시험이라는 제하로 이미 확인되었다.
길항제 분석 시험에 대한 추가의 예로서, 특정 활성 및 화합물이 TCCR 폴리펩티드에 대한 길항제임을 가리키는 TCCR 폴리펩티드 존재 하에 관심있는 활성을 억제하는 화합물의 능력에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 가할 수 있다. 별법으로, 길항제는 TCCR 폴리펩티드 및 잠재성 있는 길항제를 막결합된 TCCR 폴리펩티드 수용체와 경쟁적 억제 분석 조건하에 조합하여 검출할 수 있다. TCCR 폴리펩티드는 방사능 등으로 표지하여 수용체에 결합된 상기 TCCR 폴리펩티드 분자의 수로 잠재성 있는 길항제의 유효성을 결정하는데 사용할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 많은 방법, 예를 들어 리간드 패닝 및 FACS 소팅 (Coligan et al.,Current Protocols in Immune.,1(2); Chapter 5(1991))으로 입증할 수 있다. 바람직하게는, 발현 클로닝은 TCCR 폴리펩티드로부터 폴리아데닐화 RNA가 제조되고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리가 풀로 분배되고, TCCR 폴리펩티드에 반응하지 않은 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용하는 경우에 이용한다. 유리 슬라이드상에서 생장한 형질감염된 세포를 표지된 TCCR 폴리펩티드에 노출시킨다. TCCR 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위 특이적 단백질 키나아제에 대한 인식 부위를 포함시키는 등 각종 수단으로 표지시킬 수 있다. 고정화 및 배양 후, 슬라이드는 방사능자동사진 분석을 한다. 양성 풀을 확인하여 서브풀을 제조한 후, 상호작용성 서브풀 제조 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염시킴으로써 결국에는 추정 수용체를 코딩하는 단일 클론을 수득한다.
길항제에 대한 다른 분석 시험에서, 상기 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 조제를 후보 화합물의 존재 하에 표지된 TCCR 폴리펩티드와 함께 배양한다. 그 후, 상기 화합물이 이 상호 작용을 상승 또는 차단하는 능력을 측정할 수 있다.
잠재성 있는 길항제의 보다 특이적인 예로는 이뮤노글로불린과 TCCR 폴리펩티드와의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드와, 구체적으로는 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체를 비롯한 항체, 또는 그러한 항체의 키메라 형태 또는 인간화 형태 또는 단편은 물론 인간 항체 및 항체 단편이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 잠재성 있는 길항제는 단백질, 예를 들어 수용체를 인식하지만 효과를 부여하지 않아 TCCR 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 TCCR 폴리펩티드의 돌연변이형과 밀접하게 관련되어 있다.마지막으로, 잠재성 있는 다른 TCCR 길항제는 이용 가능한 리간드와 경쟁할 수 있으며, 천연 TCCR 수용체 신호를 효과적으로 없애는 TCCR ECD이다.
잠재성 있는 다른 TCCR 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 작제물이며, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA는 표적화된 mRNA에 혼성화됨으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질 번역을 억제한다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성 또는 안티센스 RNA 또는 DNA를 통한 유전자 발현을 억제하는데 사용할 수 있으며, 이들 두 방법은 폴리뉴클레오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기초로 한다.
예를 들어, 본원에서의 성숙 TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용된다. DNA 뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적이도록 설계 (삼중 나선에 대해서는 문헌 [Leeet al.,Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooneyet al.,Science, 241:456(1988); Dervanet al.,Science, 251:1360(1991)] 참조)하여, 전사 및 TCCR 폴리펩티드 생성을 억제시킨다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화되고, mRNA 분자가 TCCR 폴리펩티드로 번역되는 것을 억제한다 (안티센스에 대해서는 문헌 [Okano, Nerochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 상기된 올리고뉴클레오티드는 또한 세포로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA가 TCCR 폴리펩티드의 생성을 억제하도록 생체내 발현될 수 있게 된다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역개시 부위로부터 유도된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이가 바람직하다.
잠재성 있는 길항제로는 TCCR 폴리펩티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 생장 인자 또는 관련 결합 부위에 결합하여 TCCR 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도뉴클레아제에 의해 절단함으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 문헌 [Rossi,Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 1997년 9월에 공개된 국제 공개 제97/33551호를 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일쇄이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 후그스틴 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은, 예를 들어 상기 국제 공개 제97/33551호를 참조한다.
이들 분자들은 상기 기재된 임의의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는)당업자에게 잘 알려진 임의의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
10. TCCR 및 유전자 치료
TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 유전자 치료법에도 사용될 수 있다. 유전자 치료법에 사용될 경우, 유전자는 치료상 유효한 유전자 산물의 생체내 합성을 달성하기 위해, 예를 들면 결함있는 유전자를 대체하기 위해 세포내로 도입된다. "유전자 치료법"은 단일 처치에 의해 지속 효과가 달성되는 전통적인 유전자 치료법 및 치료상 유효한 DNA 또는 mRNA의 일회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수가 제한적이어서 이런 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되면 저해제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (Zamecnik et al.,Proc. Natl. Acad., Sci. USA 83, 4143-4146 (1986)). 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형, 예를 들어 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함으로써 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는 데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되는가 또는 생체내에서 목적하는 숙주의 세포로 전달되는가에 따라 달라진다. 시험관내 포유동물 세포로 핵산을 전달하는데 적합한 기술은 리포솜법, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합법, DEAE-덱스트란법, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전이 기술로 현재 바람직한 것으로는 바이러스 (통상적으로, 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개 형질감염 등이 있다 (Dzau et al.,Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용되는 경우에는, 엔도사이토시스에 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 표적화에 사용하고(하거나) 흡수를 촉진시킬 수 있는데, 그러한 단백질의 예로는, 특정 세포 유형에 향성(向性)이 있는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내부화를 경험하는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 등이 있다. 수용체 매개 엔도사이토시스 기술은 예를 들면 문헌 [Wu et al.,J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987), 및 Wagner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 [Anderson et al.,Science256, 808-813 (1992)]을 참조한다.
11. 항체
또한, 본 발명은 항-TCCR 항체를 제공한다. 대표적인 항체로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중 특이적 항체 및 이형접합 항체가 포함되며, T 세포 증식, 호산구 침윤 등을 저해할 수 있거나 (길항제), 또는 촉진할 수 있는 (아고니스트) 항체 단편을 포함한다.
i. 폴리클로날 항체
항-TCCR 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어 면역화제 및 필요한 경우 보조제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 보조제는 피하 또는 복강내 수회 주사하는 방법으로 포유동물에 주사될 것이다. 면역화제는 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역처리되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 저해제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 보조제의 예는 프로이드 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역처리 방법은 불필요한 실험 없이도 당업자에 의해 선택될 수 있다.
ii. 모노클로날 항체
별법으로, 항-TCCR 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein,Nature,256:495 (1975)]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 생쥐, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역처리하여 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 임파구를 유도한다. 별법으로, 임파구는 시험관 내에서 면역처리할 수 있다.
면역화제는 일반적으로 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우 말초 혈액 임파구 ("PBL")가사용되나, 인간 이외의 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 임프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 임파구와 불멸화된 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding,Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화된 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 쥐 또는 생쥐 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포가 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양 배지 ("HAT 배지")는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 생산을 높은 수준으로 안정하게 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되었다 [Kozbor,J. Immunol.,133: 3001 (1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 TCCR에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정하였다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스카트카르트 (Scatchard) 분석 (Munson and Pollard,Anal. Biochem.,107:220 (1980))에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법 [Goding,상기문헌]에 의해 배양시켰다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들면, 둘베코스 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또는, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수종양으로서 생체내 배양시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제시킬 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들면, 쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 백터 내로 넣은 다음, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 다른 방법으로는 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 발현 벡터를 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성의 쥐과 동물 서열 부위를 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 그러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단이 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하기 위해서 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
ii. 인간 항체 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-TCCR 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 키메라 이뮤노글로불린, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 작은 서열)이다. 인간화 항체는, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Joneset al.,Nature,321: 522-525 (1986);Riechmannet al.,Nature,332: 323-329 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)].
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터의 그에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 [Joneset al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmannet al.,Nature,332: 323-327 (1988); Verhoeyenet al.,Science,239: 1534-1536 (1988)]에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯한 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 [Hoogenboom and Winter.,J. Mol. Biol.,227: 381 (1991); Marks et al.,J. Mol. Bio.,222: 581 (1991)]. 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al.,J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 유전자도입 동물, 예를 들어 생쥐에 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내부 이뮤노글로불린 유전자는 부분적으로 또는 완전히 실활화된다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 상기 사항은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Markset al.,Bio/Technology10, 779-783 (1992); Lonberget al.,Nature 368, 856-859 (1994), Morrison,Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildet al.,Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar,Intern. Rev. Immunol. 1365-93 (1995))에 기재되어 있다.
또한, 항체는 상기 기술한 바와 같이 공지된 선별법 및(또는) 돌연변이법을 이용하여 친화도 성숙된 것일 수 있다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 성숙 항체가 제조된 곳으로부터의 출발 항체 (일반적으로 쥐 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체)에 비해 5배, 더 바람직하게는 10배, 보다 더 바람직하게는 20 또는 30배 큰 친화도를 갖는다.
iv. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중의 하나는 본 발명의 폴리펩티드에 대한 것이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein and Cuello,Nature,305: 537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 방법이 국제 공개 제93/08829호 (1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌 [Traunecker et al.,EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합은 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌 [Suresh et al.,Methods in Enzymmology,121: 210(1986)]을 참조한다.
국제 공개 제96/27011호에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종 이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 인터페이스에 생성시켰다. 이는 이종 이량체의 수율을 동종 이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennanet al.,Science 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질 가수분해로 잘라서 F(ab')2단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 복합 물질인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 결합의 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다.생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
이.콜라이로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 [Shalabyet al.,J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자가 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이.콜라이로부터 별도로 분비되었으며 시험관내에서 지시된 화학적 방법으로 연결하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과다 발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 여러 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다 [Kostelnyet al.,J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종 이량체의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종 이량체를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 동종 이량체를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 상기 두 도메인을 동일 쇄로 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 쌍을 이루게 되며, 그 결과 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다 (문헌 [Gruberet al.,J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조). 2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다 (Tuttet al.,J. Immunol. 147:60 (1991)).
전형적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 두 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 또는, 특정 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-폴리펩티드 팔 영역 (arm)을 백혈구 상 개시 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 결합하는 팔 영역과 연결할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성 물질을 국소화할 수 있다. 이러한 항체는 폴리펩티드-결합 팔 영역과 세포독성 물질 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔 영역을 가지고 있다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자 (TF)와 결합한다.
v. 이종접합 항체
이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료 (국제 공개 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호)하기 위해 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응에 의해 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다.
vi. 작용기 기능 조작
작용기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여, 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종 이량체 항체는 내부화 능력이 향상되고(되거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)이 증대된다 (문헌 [Caronet al.,J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 문헌 [Shopes,J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조). 또한, 문헌 [Wolffet al.Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하여 증대된 항암 활성을 지닌 동종 이량체 항체를 제조할 수 있다. 별법으로, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (문헌 [Stevensonet al.,Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조).
vii. 면역결합체
또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예를 들어, 효소적으로 활성인 세균, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소 (즉, 방사성결합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역결합체에 관한 것이다.
상기 면역결합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 콜레라 독소, 보툴리누스 독소, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 사포린, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사결합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질 결합 물질, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 결합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14로 표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 결합시키는 전형적인 킬레이트제이다 (국제 공개 제94/11026호 참조).
또다른 실시 태양으로, 항체를 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 결합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 결합하지 않은 결합체를 제거하고 세포독성 물질 (예를 들어, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
viii. 면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Epsteinet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985), 문헌 [Hwanget al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)] 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 미국 특허제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martinet al.,J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 (문헌 [Gabizonet al.,J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조).
ix. 항-TCCR 항체의 용도
본 발명의 항-TCCR 항체는 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 항-TCCR 항체는 TCCR에 대한 진단 분석 시험, 예를 들어 특이적인 세포, 조직 또는 혈청 내에서 TCCR의 발현 검출에 사용할 수 있다. 경쟁적 결합 분석 시험, 직집 또는 간접 샌드위치 분석 시험과 비균질 또는 균질상 중에서 수행되는 면역침전 분석 시험 (Zola,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.. 147-158, CRC Press, Inc., (1987))과 같이 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 시험 기술을 사용할 수 있다. 진단 분석 시험에서 사용하는 항체는 검출 가능한 성분으로 표지할 수 있다. 감출 가능한 성분은 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 신호를 생성할 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출 가능한 성분은3H,14C,32P,35S 또는125I와 같은방사성 동위원소, 플루오레신 이소티오시난트, 로다민 또는 루시페린과 같은 형광 또는 화학발광 화합물, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼록시다제일 수 있다. 문헌 [Hunteret al,Nature,144:945(1962); Davidet al.,Biochemistry,13:1014 (1974); Painet al.,J. Immunol. Meth.,40:219 (1981); 및 Nygren,J. Histochem. and Cytochem.,30:407 (1982)]에 기재된 방법을 비롯하여 항체를 검출가능한 잔기에 결합시키기 위한 당업계에 공지된 임의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 항-TCCR 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 TCCR의 친화성 정제에도 유용하다. 이 과정에서, TCCR에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세파덱스 수지 또는 여과지에 적합한 지지체에 고정된다. 그 후에, 고정된 항체를 정제될 TCCR이 함유된 시료와 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합한 TCCR 폴리펩티드를 제외하고 시료 내의 모든 물질을 실질적으로 제거하기 위해 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 지지체는 다른 적합한 용매로 세척하여 항체로부터 TCCR 폴리펩티드를 방출시킨다.
10. 제약 조성물
면역 관련 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 활성 분자, 폴리펩티드 및 항체 뿐만 아니라 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
TCCR의 세포내 부분을 표적화하거나 세포 내에 있는 TCCR을 표적화하기 위해서는 내부화 항체가 바람직하다. 또한, 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marascoet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).
항체의 치료 제제는 저장을 위해, 소정의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형체 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여된 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산의 완충액과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸), 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 일당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은염-형성 카운터 이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 스크리닝 분석에 의해 확인된 화합물은 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 유사한 방법으로 제형화될 수 있다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정 증상에 있어 필요에 따라 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 세포독성 물질, 사이토카인 또는 생장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방형 제제도 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOTTM(상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.
11. 치료 방법
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 활성 화합물을 이용하여, 조직 내의 염증 세포 침윤, T 세포 증식 촉진, T-세포 증식 저해, 혈관 투과성의 증가 또는 감소 또는 그의 저해를 특징으로 하는 질병을 비롯한 T 세포 매개 질환과 같은 다양한 면역 관련 질환 및 증상을 치료할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 다른 화합물로 치료되는 대표적인 증상 또는 장애로는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 골관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (피부경화증), 특발성 염증 근병증 (피부근염, 다발성 근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작상 야간혈색뇨증), 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판 감소성 자반증, 면역 매개 혈소판 감소증), 갑상선염 (그레이브씨병, 하시모토 갑상선염, 소아성 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역 매개 신장병 (사구체신염, 신세관간질성 신장염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랭-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증과 같은 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초성 질병, 감염성 간염 (A형, B형, C형, D형, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스에 의한 간염), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담증성 경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질병, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐감수성 장병증 및 휘플병, 수포성 피부병, 다형홍반, 접촉피부염, 건선을 비롯한 자가면역 또는 면역 매개 피부병, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민 및 두드러기와 같은 알레르기성 질병, 호산구성 폐증, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역학적 질병, 이식편 거부반응 및 이식편-대-숙주병과 같은 이식 관련 질병이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
전신성 홍반성 루푸스에서, 질병의 주요 매개자는 자가 단백질/조직에 대한 자가-활성 항체의 생산 및 그 후의 면역-매개 염증 발생이다. 항체는 직접적 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 직접적으로 조직 손상에 관여한다는 것은 증명되지 않았지만, T 림프구는 자가-활성 항체의 발생에 필요하다. 따라서, 발병은 T 림프구에 의존적이다. 신장, 폐, 근골격계, 점액피부, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액을 비롯한 여러 기관 및 계가 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염 (RA)은 관절 연골의 손상을 일으키는 다중 관절의 활액막이 주로 관여하는 만성 전신성 자가면역 염증 질환이다. 발병은 T 림프구 의존적이고, 류마티스성 인자, 즉 자신의 IgG를 표적으로 하는 자가-항체의 생산이 관련되어 있으며, 그로써 생성된 면역 복합체가 활액 및 혈액 내에서 높은 수준에 이르게 된다. 관절 내에서 이들 복합체는 림프구 및 단핵구가 활액막 내로 현저하게 침윤하도록 유도하고, 그 후에 현저한 활액막 변화를 유도하며, 추가로 막대한 호중구와 함께 상기 유사한 세포가 침윤하는 경우, 관절 열극/활액의 현저한 변화가 유도된다. 영향을 받는 조직은 1차적으로 관절이며, 대개 대칭적인 패턴을 보인다. 그러나, 두 가지 주요 형태로 관절외 질병도 일어날 수 있다. 한 형태는 지속적인 진행성 관절 질병을 동반한 관절외 병변 및 폐섬유증, 혈관염 및 피부 궤양의 전형적인 병변이 발달하는 것이다. 관절외 질병의 두번째 형태는 RA 질병 경로에서 후기에, 때로는 관절 질병이 나아진 이후에 발생하는 소위 펠티 증후군 (Felty's syndrome)이며, 이는 호중구 감소증, 혈소판 감소증 및 비종대의 존재를수반한다. 이는 여러 기관에서 경색 형성을 동반한 혈관염, 피부 궤양 및 회저를 동반할 수 있다. 또한, 환자에게는 대개 관절 환부 위의 피하조직에 류마티스성 결절이 발생하며, 말기 결절은 침윤된 염증 세포 혼합물로 둘러싸인 괴사 중심을 가지고 있다. RA에서 발생할 수 있는 다른 징후로는 심막염, 흉막염, 관상동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염 및 류마티스성 결절이 포함된다.
소아성 만성 관절염은 대개 16세 미만의 연령에서 시작되는 만성 특발성 염증 질환이다. 그의 표현형은 RA와 일부 유사하며, 류마티스성 인자가 양성인 일부 환자들은 소아성 류마티스성 관절염으로 분류된다. 상기 질병은 세가지 주요 범주 (소수관절, 다관절 및 전신성)로 분류된다. 상기 관절염은 심각할 수 있으며, 보통 파괴적이고, 관절 강직을 일으키며, 발육을 저해한다. 다른 징후로는 만성 전포도막염 및 전신성 아밀로이드증이 포함될 수 있다.
척추관절증은 일부 공통적인 임상적 특성이 있고, HLA-B27 유전자 산물의 발현이 공통적으로 관여하는 장애의 한 군이다. 상기 장애로는 강직성 척추염, 라이터증후군 (Reiter's syndrome)(반응성 관절염), 염증성 장질환에 관련된 관절염, 건선에 관련된 관절염, 연소기형 강직성 척추관절증 및 미분화 척추관절증이 포함된다. 특징적인 성질에는 척추염을 동반하거나 동반하지 않는 천장골염, 염증성 비대칭 관절염, HLA-B27 (제I형 MHC의 HLA-B 좌위의 혈청학상 정의된 대립 유전자)의 관여, 안구 염증 및 다른 류마티스성 질병에 관여하는 자가항체의 부재가 포함된다. 상기 질병의 유도에 가장 중요하게 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이며, 이는 제I형 MHC 분자에서 제시된 항원을 표적화하는 세포이다. CD8+ T 세포는 마치 제I형 MHC 대립 유전자인 HLA-B27가 제I형 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 HLA-B27에 대해 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프가 세균성 또는 다른 미생물성 항원 에피토프를 모방할 수 있으며, 따라서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있을 것이라는 가설이 제기되었다.
전신성 경화증 (피부경화증)은 병인이 알려져있지 않다. 상기 질병의 특징은 피부의 경결(硬結)이며, 이것은 아마도 활성 염증 과정에 의해 유도된 듯하다. 피부경화증은 국부적이거나 전신성일 수 있으며, 혈관 병변이 일반적이고, 미소혈관계의 내피세포 손상이 전신성 경화증에 있어 초기의 중요한 증상이며, 혈관 손상은 면역 매개된 것일 수 있다. 많은 환자에게서 피부 병변에 단핵구 침윤이 존재하고, 항-핵 항체가 존재하는 것이 면역학적 근거로 포함된다. ICAM-1이 대개 피부 병변에서의 섬유세포의 세포 표면 상에서 상향조절되며, 이는 이들 세포와 T 세포의 상호작용이 상기 질병의 발병에 역할을 할 수 있음을 시사하는 것이다. 관련된 다른 기관으로는 위장관 (비적상적인 연동운동/운동성을 일으키는 평활근 위축 및 섬유증), 신장 (궁상 소엽간 소동맥에 영향을 주는 구심성 내피하 내막 증식과 그로 인한 신장 피질 혈류의 감소에 의한 단백뇨, 고질소혈증 및 고혈압), 골근육 (위축, 간질성 섬유증, 염증), 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증) 및 심장 (수축대 괴사, 반흥/섬유증)이 포함된다.
피부근염, 다발근염 등을 비롯한 특발성 염증성 근병증은 병인이 알려지지 않은 만성 근육 염증 질환이며, 근육 약화를 일으킨다. 근육 손상/염증은 대개 대칭적이고 진행성이다. 자가항체가 대부분의 형태에서 관련되어 있다. 이들 근염-특이적 자가항체는 단백질 합성에 관여하는 성분, 단백질 및 RNA의 기능을 표적화하고 저해한다.
쇼그렌 증후군은 면역-매개 염증 및 추후의 눈물샘 및 침샘의 기능적 파괴로 인한 것이다. 상기 질병은 염증성 결합조직 질병에 관련되거나, 이를 동반할 수 있다. 상기 질병은 Ro 및 La 항원 (둘 모두 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가 항체 생산에 관련되어 있다. 병변은 담즙성 경변, 말초신경병증 또는 감각신경변증 및 촉진성 자반병을 비롯한 다른 징후 또는 연관과 함께 건성각결막염, 구내건조증을 일으킨다.
전신성 혈관염은 국소빈혈/괴사/환부 혈관에 의해 공급받은 조직의 퇴화 및 일부 경우에 있어서 그에 따른 말단 기관 기능 장애를 일으키는 혈관의 염증 및 추후의 손상이 원발성 병변인 질병이다. 또한, 혈관염은 류마티스성 관절염, 전신성 경화증 등과 같은 다른 면역-염증 매개 질환, 특히 면역 복합체의 형성과 관련된 질병에서 속발성 병변 또는 후유증으로서 나타날 수 있다. 원발성 전신성 혈관염군에는 전신성 괴사성 혈관염 (다발동맥염, 알레르기성 혈관염 및 육아종증, 다발혈관염), 베게너 육아종증 (Wegener's granulmatosis), 임파종성 육아종증 및 거대세포 동맥염이 포함된다. 그밖의 혈관염으로는 점막-피부 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병 (Kawasaki's disease)), 단발성 CNS 혈관염, 베체트병 (Behet's disease), 폐색성혈전맥관염 (버거씨병 (buerger's disease)) 및 피부 괴사성 세정맥염이 포함된다. 상기 열거된 혈관염 중 대부분의 유형에 대한 발병 기전은 1차적으로 혈관벽의 이뮤노글로불린 복합체의 침착 및 그 후에 ADCC나 보체 활성화 또는 둘 모두를 통한 염증 반응의 유도로 인한 것으로 여겨진다.
사르코이드증은 병인이 알려져 있지 않은 증상이며, 신체 대부분의 조직 (폐의 관여가 가장 일반적)에서 상피양 육아종이 존재하는 것을 특징으로 한다. 발병은 질병 부위에서 활성화 대식세포 및 림프양 세포의 존속과 이들 세포형이 분비하는 국부성 또는 전신성 활성 산물의 분비로 인한 그 후의 만성 후유증을 수반한다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역 범혈구감소증 및 발작성 야간 혈색뇨증을 비롯한 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 세포의 표면 상에 발현되는 항원과 반응하는 항체의 생산으로 인한 것며, 이는 보체 매개 용해을 통한 항체 코팅 세포의 제거 및(또는) ADCC/Fc-수용체-매개 기전을 반영한다.
혈소판감소성 자반증을 비롯한 자가면역 혈소판감소증 및 다른 임상적 세팅 (clinical setting), 혈소판 파괴/제거의 면역-매개 혈소판감소증은 항체 또는 보체의 혈소판 유착 및 추후의 보체 용해에 의한 제거, ADCC 매개 기전 또는 FC-수용체 매개 기전의 결과이다.
그레이브씨병, 하시모토 갑상선염, 소아성 림프구성 갑상선염 및 위축성 갑상선염을 비롯한 갑상선염은 갑상선 내에 존재하며 대개 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체의 생산으로 인한 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 자연적 모델 (쥐 (BUF 및 BB 쥐) 및 닭 (비만 닭 품종))과 인위적 모델 (타이로글로불린 (thyroglobulin)이나 갑상선 마이크로좀 항원 (갑상선 퍼옥시다제)로 동물을 면역화시킴)을 비롯한 실험 모델이 존재한다.
제I형 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 췌장 섬 β-세포가 자가면역으로파괴된 것이며, 이 파괴작용은 자가-항체 및 자가-반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체도 인슐린-비-반응성의 표현형을 일으킨다.
사구체신염 및 신세관간질성 신장염을 비롯한 면역 매개 신장병은 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생산 결과로 인하여 직접적으로, 또는 다른 비-신장 항원에 대해 반응성인 항체 및(또는) 면역 복합체의 신장 내 침착 결과로 인하여 간접적으로 항체 또는 T 림프구가 매개하는 신장 조직 손상의 결과이다. 따라서, 면역-복합체를 형성하는 다른 면역-매개 질환도 간접적인 후유증으로서 면역 매개 신장병을 유도할 수 있다. 직접 또는 간접 면역 기전 둘 모두 신장 조직에 병변 발달을 발생/유도하는 염증 반응을 야기하여, 그로 인하여 기관 기능 손상 및 일부 경우 신부전의 진행을 일으킨다.
다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 길랭-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증과 같은 중추신경계 및 말초신경계의 탈수초성 질병은 자가면역 기반을 가지고, 핍지교세포에서 일어나거나 수초에 직접적으로 일어난 손상의 결과로 신경 탈수초화가 일어나는 것으로 여겨진다. MS에서, 상기 질병의 유도 및 진행이 T 림프구에 의존적임을 시사하는 증가가 있다. 다발성 경화증은 T 림프구-의존성이며, 재발-관해형 경로 또는 만성 진행형 경로 중 어느 하나를 갖는 탈수초성 질병이다. 병인은 알려져있지 않지만, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역 모두가 기여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개의 소교세포 침윤 및 대식세포 침윤을 포함하며, CD4+ T림프구가 병변에서 우세한 세포형이다.핍지교세표 사멸 및 추후의 탈수초화에 대한 기전은 알려져있지 않지만, T 림프구가 동인(動因)인 듯하다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐간질염을 비롯한 염증성 및 섬유성 폐병은 면역-염증 반응의 조절 장애와 관련될 수 있다. 상기 반응의 저해가 치료에 도움이 될 것이다.
수포성 피부병, 다형홍반 및 접촉피부염을 비롯한 자가면역 피부병 또는 면역-매개 피부병은 자가-항체에 의해 매개되며, 그 발병은 T 림프구-의존적이다.
건선은 T 림프구-매개 염증성 질병이다. 병변은 T 림프구, 대식 세포 및 항원 처리 세포 (antigen processing cell)와 일부 호중구의 침윤을 포함한다.
천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민 및 두드러기를 비롯한 알레르기성 질병은 T 림프구 의존적이다. 이들 질병은 주로 T 림프구 매개 염증이나 IgE 매개 염증 또는 그 둘의 조합에 의해 매개된다.
이식편 거부 반응 및 이식편-대-숙주병 (GVHD)을 비롯한 이식 관련 질병은 T-림프구 의존적이며, T 림프구 기능의 저해가 개선에 도움이 된다.
면역 및(또는) 염증 반응에의 개입이 유익한 다른 질병에는 바이러스 감염 (AIDS, A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 및 헤르페스가 포함되지만, 이에 한정되지 않음), 세균성 감염, 진균성 감염 및 원충성 감염과 기생충성 감염을 비롯한 감염성 질환 (MLR을 촉진하는 분자 (또는 유도체/아고니스트)를 치료에 사용하여 감염원에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있음), 면역결핍 질환 (MLR을 촉진하는 분자, 유도체/아고니스트를 사용하여 선천성, 후천성, 감염에 의해 유도되거나 (예를 들어, HIV 감염) 또는 의인성(醫因性) 면역 결핍의 증상을 위해 면역 반응을 상승시킬 수 있음) 또는 종양 형성이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 인간 암 환자가 종양 형성 세포 상의 항원에 대한 항체 및(또는) T 림프구반응을 발달시킨다는 것이 증명되었다. 또한, 종양 형성에 대한 동물 모델에서 면역 반응의 강화가 특정 종양 형성에 대해 거부 반응 또는 퇴화를 일으킬 수 있음이 증명되었다. MLR에서 T 림프구 반응을 강화하는 분자는 생체 내에서 종양에 대한 면역 반응을 강화하는 데 사용된다. MLR에서 T 림프구 증식 반응을 강화하는 분자 (또는 소분자 아고니스트 또는 효현 방식으로 동일 수용체에 영향을 주는 항체)는 암의 치료를 위한 요법제로 사용될 수 있다. 또한, MLR에서 림프구 반응을 저해하는 분자는 생체 내에서 종양 형성동안 종양 형성에 대한 면역 반응을 억제하도록 기능하며, 그러한 분자는 종양 형성 세포 자체에서 발현되거나, 또는 그 발현이 다른 세포에서의 종양 형성에 의해 유도될 수 있다. 그러한 저해 분자에 대한 길항작용 (항체 또는 소분자 길항제에 의하거나 다른 수단에 의함)은 면역-매개 종양 거부 반응을 강화한다.
또한, 염증촉진성이 있는 분자의 저해는 재관류 손상, 뇌졸중, 심근 경색, 동맥경화, 급성 폐 손상, 출혈성 쇽 (shock), 화상, 폐혈증/폐혈증성 쇽, 급성 세뇨관 괴사, 자궁내막증, 퇴행성 관절 질환 및 췌장염에 있어서 치료상 이익이 있을 수 있다.
본 발명의 화합물 (예, 폴리펩티드 또는 항체)는 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소또는 흡입 (비강내, 폐내) 경로에 의한 장기간의 연속 관주와 같은 공지된 방법 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.
면역항진제 요법에서, 항암제의 투여와 같은 다른 치료법이 본 발명의 단백질, 항체 또는 화합물의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역 항진제로 치료되는 환자는 또한 항암제 (화학요법제) 치료 또는 방사선 치료를 받을 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 문헌 [Chemotherapy ServiceEd., M.C.Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 항체와 같은 항암제의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물 (유럽 특허 제616812호 참조)에 대해 공지된 투여량의 상기 분자와 항체를 배합하여 투여할 수 있다.
또한, CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에 1 종 이상의 사이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 본원의 항체를 생장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 생장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 생장 억제제와 본원 항체의 복합 작용 (상승)으로 인하여 투여량을 저하시킬 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항체와 같은 항암제의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 심각성 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 이 약제는 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자에 의존하여 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
12. 제품
본 발명의 또다른 실시 태양에서, 질환의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 이 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 채취구 (access port)(예를 들어, 이 용기는 정맥 주사용액 백이거나, 피하 주사기 바늘이 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음)가 있을 수 있다. 상기 조성물의 활성 성분은 통상 본원에서 확인된 유전자 생성물의 활성을 방해할 수 있는 항암제, 예를 들어 항체이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 라벨은 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 알려준다. 이 제품은 또한 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 들어있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
13. 면역 관련 질환의 진단 및 예후
특정 면역 관련 질환에서 과다 발현되는 단백질과 같은 세포 표면 단백질이 약물 후보 또는 질병 치료에 대한 훌륭한 표적이다. 상기 단백질은 면역 관련 질환 상태에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 이들 질병의 진단 및 예후에 부가적인 용도를 나타낸다. 예를 들어, 다발성 경화증에서 증폭된 유전자의 단백질 산물을 표적으로 하는 항체는 진단제 또는 예후제로서 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질 ("마커 유전자 생성물")의 발현을 정성 또는 정량 검출하는데 사용할 수 있다. 항체는 형광 표지와 같이 검출 가능한 표지물이 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 유세포 분석법, 형광법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터링될 수 있다. 이 기술은, 증폭된 유전자가 생장 인자와 같은 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석법은 상기에 기재된 바와 같이 수행된다.
원래 위치에서 (in situ) 마커 유전자 생성물에 대한 항체 결합을 검출하는 것은, 예를 들어 면역형광현미경법 또는 면역전자현미경법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 시료를 분리하여, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 반응시킨다. 또한, 이 절차는 조사된 조직에서 마커 유전자 생성물이 어떻게 분포하는지 결정하게 해준다. 원래 위치에서의 검출에 다양한 조직학적 방법을 쉽게 사용할 수 있음이 당업자들에게 명백할 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션이다. 달리 언급이 없는 한, 본 발명은 상기 및 문헌 [Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Inniset al.,PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., Y.Y., 1990; Harlowet al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait,Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R. I. Freshney,Animal Cell Culture, 1987; 및 Coliganet al.,Current Protocols in Immunology, 1991)에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 절차를 이용한다.
실시예 1
TCCR의 단리 및 클로닝
사이토카인 수용체 및(또는) WS(G)XWS 도메인을 특징으로 하는 수용체를 이용하여 공용 EST 데이타베이스를 검색하고 hTCCR (서열 1) 및 mTCCR (mTCCR)을 단리하였다.
또한, 도 4 (서열 2)에 도시한 쥐 TCCR는 1996년 5월 23일 출원된 국제 공개 제97/44455호에서 뿐만 아니라 승인번호 7710109번으로 진뱅크에서 공개되어 있다. 또한, 선행 기술 분자가 문헌 [Sprecheret al.,Biolchem. Biophys. Res. Commun. 246(1):82-90 (1998)]에 기술되어 있다. 도 4 (서열 2)에서, 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1번 내지 약 24번으로 확인되었고, 막횡단 도메인은 아미노산 잔기 약 514번 내지 약 532번으로, N-글리코실화 부위는 잔기 약 46번 내지 49번, 296번 내지 299번, 305번 내지 308번, 360번 내지 361번, 368번 내지 371번 및 461번 내지 464번으로, 카세인 키나제 II 인산화 부위는 잔기 약 10번 내지 13번, 93번 내지 96번, 130번 내지 133번, 172번 내지 175번, 184번 내지 187번, 235번 내지 238번, 271번 내지 274번, 272번 내지 275번, 323번 내지 326번, 606번 내지 609번 및 615번 내지 618번으로, 티로신 키나제 인산화 부위는 잔기 약 202번 내지 209번으로, N-미리스토일화 부위는 잔기 약 43번 내지 48번, 102번 내지 107번, 295번 내지 300번, 321번 내지 326번, 330번 내지 335번, 367번 내지 342번, 393번 내지 398번, 525번 내지 530번 및 527번 내지 532번으로, 아미드화 부위는 잔기 약 240번 내지 243번, 원핵세포 막 지단백질의 지질 부착 부위는 잔기 약 516번 내지 526번으로 확인되었고, 성장 인자 및 사이토카인 수용체족의 제1 서명 서열은 잔기 약 36번 내지 49번으로 확인되었다. (1) 인간 에리트로포이에틴에 대해 주목할만한 상동성 영역이 존재하는 곳은 잔기 약 14번 내지 51번이고, (2) 쥐 인터루킨-5 수용체에 대해 주목할만한 상동성 영역이 존재하는 곳은 잔기 약 211번 내지 219번이다.
도 3 (서열 1)에 도시한 인간 TCCR에 높은 상동성이 있는 폴리펩티드가 1996년 5월 23일 출원된 국제 공개 제97/44455호에 공개되어 있으며, 이는 승인 번호 4759327번으로 진뱅크에서도 이용 가능하다. 또한, 선행 기술 분자가 문헌 [Sprecheret al.,Biolchem. Biophys. Res. Commun. 246(1):82-90 (1998)]에 기술되어 있다. 도 3 (서열 1)에서, 신호 펩티드는 아미노산 잔기 1번 내지 약 32번으로 확인되었고, 막횡단 도메인은 아미노산 잔기 약 517번 내지 약 538번으로, N-글리코실화 부위는 잔기 약 51번 내지 54번, 76번 내지 79번, 302번 내지 305번, 311번 내지 314번, 374번 내지 377번, 382번 내지 385번, 467번 내지 470번, 563번 내지 566번으로, N-미리스토일화 부위는 잔기 약 107번 내지 112번, 240번 내지 245번, 244번 내지 249번, 281번 내지 286번, 292번 내지 297번, 373번 내지 378번, 400번 내지 405번, 459번 내지 464번, 470번 내지 475번, 531번 내지 536번 및 533번 내지 538번으로 확인되었고, 원핵세포 막 지단백질의 지질 부착 부위는 잔기 약 522번 내지 532번으로, 성장 인자 및 사이토카인 수용체족의 제1 서명 서열은 잔기 약 41번 내지 54번으로 확인되었다. 또한, 잔기 183번 내지 191번에서 인간 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 위한 수용체의 두번째 서브유닛과 주목할만한 상동성이 있는 영역이 있다.
인간 TCCR (서열 1) 및 쥐 TCCR (서열 2) 서열을 비교한 것이 도 5에 도시되어 있다. 비교 결과 인간 및 쥐의 서열 간에 서열 동일성이 약 62％인 것으로 나타났다.
실시예 2
TCCR "녹아웃" 생쥐
1. 표적화 벡터의 제조
"표적화 벡터"란 용어는 유전자 제거를 위해 제작된 핵산 서열을 지칭하는 당업계의 용어이다. 도 9A는 본 실시예에서 단리된 TCCR 분자용 표적화 벡터를 기술하고 있다. 구체적으로, 상기 표적화 벡터는 첫 2개의 엑손을 포함하는 2.4 kb XhoI-HindIII 단편 및 엑손 9번 내지 14번을 포함하는 6.0 kb EcoRI-BamHI 단편을이용하여 제작되었다. 단리된 특이적 TCCR 유전자는 엑손 14개와 인트론 13개를 포함하고 있다. 이 표적화 벡터에서, 겐타마이신 내성을 부여하는 pGK-neo 유전자를 이용하여 엑손 3 내지 8번을 치환하고, 엑손 1번 및 2번을 온전하게 남겨두었다. 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK) 코딩 영역을 1번 엑손의 5'에 위치시켜, 갠시클로비어에 의한 선별이 가능하도록 하였다. 갠시클로비어와 같은 약물 선별 가능 마커는 표적화 벡터를 포함하는, 안정적으로 형질감염된 세포주의 선별을 가능하게 하며, 추가로 내생 유전자로부터 구별되는 표적화 구조물에 독특한 핵산 단편을 증폭하도록 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 프라이머를 제작하는 것이 가능하게 된다. 이 구조물은 pBluescript 벡터 (Stratagene, 캘리포니아 라 졸라) 내로 삽입되고, DH10B 박테리아 내로 형질전환되었다. 단일 콜로니를 수득하고, 대량의 표적화 벡터를 제조하는 데 이용하였다.
2. TCCR -/- 줄기 세포의 제조
표적화 벡터를 NotI 제한 효소로 분해 절단하여 선형화시키고 배아 줄기 (ES) 세포 내로 형질감염시켰다. ES 세포는, 발생 중인 배아의 배선 (germ line) 내로 삽입되어 표적화 벡터가 그의 후손에게 전달되도록 하는 능력으로 선별된다. 바람직하게 선택된 ES 세포주는 DSGS 세포주이지만, D3 세포주 (ATCC CRL-1934)도 사용할 수 있다. PBS 0.8 ml에 재현탁시킨 ES 세포 2 내지 5백만개를 이용하여 전기천공법을 수행하였다. 선형화된 표적화 벡터 (20 ㎍)를 상기 세포에 첨가하고, 이를 멸균 전기천공 큐벳 (0.4 cm, Bio-Rad, 캘리포니아주 허큘리스)에 담았다. 500 ㎌, 240 볼트로 설정된 Bio-Rad 전기전공 장치를 이용하여 전기천공법을 수행하였다. 상기 큐벳의 내용물을 ES 배지 410 ml 중으로 옮겼다. ES 배지는 고농도 글루코스 DMEM (Gibco 11960-010), 10％ FBS (ES 세포 검증, Gibco 16141-061) 및 ESGRO 쥐 LIF 1000 유닛/ml (Gibco 13275-0290)로 구성되었다. 그 후, 이들 세포를 96웰 디쉬 20개에 분취하였다. 표적화 벡터의 형질감염 후, 상기 언급한 약물을 치사량 농도로 사용하여 ES 세포를 선별하였다. 예를 들어 G418의 경우, 400 ㎍/ml을 사용하였다. 표적화 벡터를 운반하는 ES 세포만이 생존에 필수적인 항생제 내성 마커를 가지고 있다. 그 후, 선별된 ES 세포 콜로니에 대해서 서던 블롯팅 (도 10A), PCR (도 10B), 내생 표적 유전자의 mRNA 발현 부재 여부 (도 10C)를 통해 상기 벡터가 올바로 삽입되었는지 스크리닝하였다. 그 후, 상기 기준을 통과한 ES 클론은 배아 내로 미세주입하는 데 사용하였다.
3. 주입 및 TCCR -/- 생쥐의 스크리닝
당업계에서 적합한 임의의 기술, 바람직하게는 미세주입에 의해, 이전 단계로부터 선별 및 스크리닝된 ES 세포 콜로니를 발생중인 배아 내로 전달하였다. 적합한 미세주입 기술은 문헌 [Hoganet al.,Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986]에 기술되어 있다. 차후에 확인 가능한 경우 임의의 배아를 사용할 수 있지만, 미세주입을 위해 선택된 배아는 수컷이고, 표적 벡터를 포함하는 ES 세포의 유전자에 의해 코딩되는 털 색깔과 반대의 털 색깔을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 백색 모피를 지닌 동물로부터의 ES 세포는 갈색/흑색 모피를 발생시키는 배아 내로 주사한다. 이러한 방식에 의해, 성공적으로 미세주입된 배아를 성숙한 성체로서 모자이크 털 색깔에 근거하여 선별할 수 있다. 생성된 모자이크 동물 (시조, founder)는 TCCR -/+ 이었고, 그 후 역교배 (다른 TCCR -/+ 자손과 교배)시켜 TCCR -/- 생쥐를 만들었다. TCCR -/- 유전자형을 확증하기 위해, 꼬리 조직을 60℃에서 밤새 용해 완충액 (lysis buffer) 0.5 ml 중에서 배양시킨 꼬리 조각으로부터 DNA를 추출하였다. 상기 용해 완충액은 0.5％ SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 7.5 mM EDTA (pH 8.0) 및 프로티나제 K (Boehringer-Mannheim) 1 mg/ml로 구성되었다. 밤새 배양시킨 후, 8 M 아세트산 칼륨 분취액 75 ㎕, CHCl3 600 ㎖을 전체 반응물과 혼합하고, 이를 10분동안 실온에서 원심분리하였다. 수성층을 제거하고, 별도의 에펜도르프 튜브에 넣고, 여기에 100％ 에탄올 600 ㎖을 첨가하고, 5분동안 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. DNA 펠렛을 70％ 에탄올로 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. 잔여 에탄올을 제거한 후, DNA 펠렛을 물 150 내지 200 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 그 후, 이 DNA는 서던 블롯팅 및 PCR 분석에서 사용 가능하였다. 서던 블롯을 위해, neo 유전자를 프로브로서 사용할 수 있었고, PCR을 위해서는 ES 세포 스크리닝용 프라이머를 사용하였다.
결과는 도 10A, 10B 및 10C에 나타내었으며, 이는 TCCR 유전자가 성공적으로 제거되었음을 보여주고 있다. TCCR-결핍 생쥐는 생존 가능하고, 생식 가능하고 외적으로 드러난 비정상적 성질이 나타나지 않았다. 상세한 조직학적 관찰 결과 어떠한 명백한 결점도 나타나지 않았다. CD3, CD4, CD8, CD25, CD19, B220, CD40, NK1.1, DX5, F4/80, CD14, CD16, MHC II 및 CD45에 대한 항체로 염색된, 여러 야생형 및 녹아웃 생쥐의 흉선, 비장, 림프절 및 파이어 소절 (Peyer's patch)로부터의세포로 유식 세포계측 분석을 수행한 결과 두 유전자형 간에는 어떠한 심한 차이도 나타나지 않았다.
실시예 3
TCCR -/- 생쥐에서 증가된 알레르기성 기도 염증
천식은 기관지 폐색 및 염증을 유발하는 다수의 알레르기성 인자 및 비-알레르기 유발성 인자가 상호작용하여 일어나는 복잡한 질병이다. 기도 염증의 주요 측면 중 하나는 Th2 세포에 의한 기도 벽의 침윤이다. 본원에서 만든 TCCR -/- 생쥐는 보다 큰 Th2 반응을 갖고 있기 때문에, 알레르기성 기도 염증을 연구하는 데 유용한 모델이다.
동물: TCCR -/- 생쥐 12마리 및 야생형 동복자 (WT) 11마리를 무작위적으로 하기의 네 군으로 나누었다: 제1군 - 비-감작 TCCR -/-; 제2군 - 비-감작 TCCR WT (n=4); 제3군 - 감작 TCCR -/- (n=8); 및 제4군 - 감작 TCCR WT (n=7).
감작; 알럼 (Alum) 1 mg/㎖에 흡착된 진드기 항원 (Bayer Pharmaceutical) 300 유닛/㎖을 제0일에 0.1 ㎖ 부피로 복강내 (IP) 투여하여 생쥐 15마리 (수컷 및 암컷)를 감작시켰다. 비-감작 대조구 생쥐 (n=8)은 0.9％ NaCl 0.1 ㎖ 및 알럼 1 mg/㎖을 IP 투여하였다. 두 생쥐 군 모두 제7일째에 항원 (감작군) 또는 NaCl (비-감작군)을 IP 주사하여 부스팅하였다.
흡입 유발원 (inhalation challenge): 감작 및 자극 후, 제16일째에 출발하여 DMA 흡입 유발원을 4회 투여하였다. 에어로졸화를 위해, 둘베코 (Dulbecco) PBS 및 Tween-20 (등록상표) 0.1％로 희석시켜 분무기 내 진드기의 최종 농도를6000 유닛/㎖로 만들었다. 모든 흡입 유발원은 Plexglas (등록상표) 파이 노출 챔버에서 투여하였다. 처음에 PARI IS-2 분무기를 이용하여 DMA를 20분동안 에어로졸화시키고, 그 후 1.5 ㎖를 다시 채워 넣고, 19분동안 노출시켰다. 폐에 침착된 총 투여량은 DMA 약 6.5 AU이었다.
AHR (마취): 제24일째에, 최후 DMA 에어로졸 유발원을 투여한지 약 18시간 후, 생쥐를 펜토바르비탈 (25 mg/kg) 및 우레탄 (1.8 g/kg) 혼합물로 마취시키고, 우측 경정맥 상에 1 cm 를 절개하여 카테터를 삽입하였다. 경정맥을 절개하여 개방하고, 카테터 (PE-50에 연결된 PE-10)를 삽입하고, 제자리에 있도록 묶어두었다. 추가로, 상기 생쥐를 기관 절개하였다 (1 cm 경부 절개, 기관지를 절개하여 개방하고, 캐뉼라 (cannula)를 삽입하고, 제자리에 있도록 묶어둠). 그 후, 흉부 확장 및 기도 압력을 측정하기 위해, 상기 생쥐에 Plexiglas (등록상표) 유식 체적변동기록계 (plethysmograph)를 넣었다. 빈도 170 bpm 및 Vt 9 ㎕/gm의 100％ 산소를 이용하여 상기 생쥐에게 산소를 공급하였다. 컴퓨터화 (Buxco Electronics) 데이타 포착 프로그램을 이용하여 호흡기 (폐 내성 및 동적 탄력성)를 지속적으로 모니터링하였다. 기준선 측정 후, 원액 농도가 200 ㎍/㎖인 MCH를 사용하여 상기 생쥐에게 메타콜린 (MCH 투여량 500 ㎍/kg)을 1회 10초 투여하였다.
희생: 기도 반응성 측정이 완료된 후, EDTA 튜브를 이용하여 후-안구 동을 통해 채혈하여 혈청을 얻었다. 복부를 개방하고, 하행대동맥을 절단하고, 횡경막을 절단하였다. 상기 동물이 방혈하는 시간이 지난 후, 기관지폐포세정 (BAL)을 수행하였다. 앞서 삽입하였던 기관지 캐뉼라를 통해 멸균 염수 (생쥐 체중 당 30㎍/g)의 동일 볼루스로 폐를 3회 세척하였다. 상기 볼루스는 폐의 총 수용량의 약 70％를 채웠다. BAL 시료 (회수 평균 80％)를 1000 x g로 4℃에서 10분동안 원심분리하였다. 상청액을 따라버리고, 즉시 -80℃로 냉각시켰다. 세포 펠렛을 2％ BSA (Sigman, 미저리주 세인트루이스)가 함유된 PBS 250 ㎖ 중에 재현탁시키고, 그 후 자동화 계수기 (Baker Instruments, 펜실바니아, 앨런타운)를 이용하여 계산하고, BAL 세포/㎕의 총수를 기록하였다. 그 후, 상기 세포 현탁액을 ㎕ 당 세포 200개가 되도록 맞추고, 사이토스핀 (cytospin) (Shandon, Inc., 펜실바니아주, 피츠버그)을 이용하여 800 x g에서 10분동안 코팅된 Superfrost Plus 현미경 슬라이드 상에 원심분리하였다. 슬라이드를 공기 중에서 건조시키고, 100％ 메탄올 중에서 1분동안 고정시키고, Diff-QuikTM(Baxter Health Care, 플로리다주, 마이애미)로 염색하였다. 백혈구 감별 검사에서 슬라이드 당 세포 200개 이상이 얻어진 것으로 확인되었다.
BAL 후, mRNA 분석을 위해 우측 폐, 비장 및 기관지 림프절을 수거하고, 액체 질소에서 동결시켰다 (그 후 드라이 아이스 상에 둠). 추후의 유전자형 분석 (genotyping)을 위해 꼬리를 절단하여 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. 상기 생쥐의 남아있는 좌측 폐를 수거하여 심각도 및 두 실험군 간에 폐의 병리적 변화 특성을 평가하고 비교하였다. 이는 폐 조직을 10％ 중성 완충된 포르말린 중에 초기 고정시키고, 파라핀 중에 포매하고, 3 ㎛ 절편을 헤모톡실린 및 에오신으로 염색하여 이루어졌다. 1차 기관지를 따라 폐 절편을 얻고, 전체 절편을 맹목적으로 평가하고, 기도 및 혈관 주위의 염증의 심각도에 따라 점수를 매겼다. 기도 상피 세포 비대량은 0 (염증 및 기도 변화 없음) 내지 4 (현저한 염증 및 기도 변화)를 이용하여 점수를 매겼다.
IgE ELISA: 총 IgE 샌드위치 ELISA를 위해, BAL 액 또는 혈장 시료를 희석시키지 않거나 ELISA 완충액 중에서 1:2 내지 1:20 (BAL) 및 1:25 내지 1:200 (혈장)으로 희석하여 사용하였다. 포획 항체는 토끼 항-생쥐 IgE (PBS 중 2 ㎍/㎖)이었고, 플레이트를 24 내지 48시간동안 4℃에서 코팅하였다. 표준은 쥐 IgE (PharMingen, 캘리포니아주 샌디에고)이었고, 이는 100 ng/㎖ 농도에서 출발하여 1:2 비율로 연속 희석하였다. 검출 항체인 비오틴화 FcεRI-IgG를 1 내지 1.5시간동안 1:2000으로 희석시켜 사용하였다. HRP-SA 및 효소 발색 단계는 사이토카인 분석 시험에서 이용된 것과 동일하였다.
그 결과는 야생형보다 TCCR -/- 생쥐의 폐에 림프구 침윤이 현저하게 증가한 것으로 나타났다 (도 11).
실시예 4
이.콜라이에서의 TCCR 발현
본 실시예는 이.콜라이 내의 재조합 발현에 의해 TCCR의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다. 처음에 원하는 TCCR 코딩 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (이.콜라이에서 유래; 문헌 [Bolivaret al.,Gene2:95 (1977)] 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), TCCR 코딩 부위, 람다 전사 종결부 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
이어서, 상기 문헌 (Sambrooket al.)에 기재된 방법을 이용하여 선택된 이.콜라이 균주를 형질전환시키는데 라이게이션 혼합물을 사용하였다. LB 평판 배지에서 생장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 단리하여, 제한 분석법 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
항생제가 포함된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 선별된 클론을 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규모의 배양액 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양한 후, 발현 프로모터를 작동시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 더 배양한 후에 원심분리로 세포를 수획하였다. 원심분리로 얻어진 세포 펠릿을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 TCCR 단백질을 정제하였다. 또한, TCCR은 하기 과정을 이용하여 이.콜라이에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 성공적으로 발현되었다. 선택된 프라이머를 사용하여 TCCR을 코딩하는 DNA를 처음에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위와 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서 빠른 정제, 및 엔테로키나아제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시킨 후, 균주 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)) 기재의 이.콜라이 숙주를 형질전환시키는데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지 (물 500 ㎖ 중에 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 디프코(Difco) 효모 추출물, 5.36 g 쉐필드 히카아제 (Sheffield hycase) SF, 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조)에 50 내지 100배로 희석하고, 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 분리하여 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 정제 및 리폴딩시킬 때까지 냉동보관하였다.
이.콜라이 페이스트 발효액 (6 내지 10 g 펠릿) 0.5 내지 1 ℓ를 10배 부피(w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 베크만 (Beckman) 초강력 원심분리기에서 40,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액 (6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 투명하게하였다. 투명한 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 콰이아젠 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5 ㎖에 로딩하였다. 50 mM 이미다졸 (Calbiochem, Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 단백질을 용출시키고, 원하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 이루어진, 새로이 제조한 리폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4％ (약 pH 3)가 되도록 TFA를 가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10％가 되도록 가하였다. 10 내지 80％의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키코 0.1％ TFA의 이동 완충액을 이용하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피에서 리폴딩된 단백질을 분석하였다. A280흡광도가 나타나는 분획의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 통상, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분으로 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거한다.
바람직하게 폴딩된 TCCR 단백질을 포함하는 각각의 분획을 회수하여, 용액에 부드러운 질소 기류를 사용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법이나 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4％ 만니톨이 함유된 20 mM Hepes, pH 6.8로 단백질을 제제화하였다.
실시예 5
포유동물 세포에서 TCCR의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 TCCR의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
pRK5 벡터 (1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허 제307,247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, 상기 문헌 (Sambrooket al.)에 기재된 라이게이션 방법을 이용하여 TCCR DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5에 라이게이션시켜, TCCR 폴리펩티드 DNA를 삽입하였다. 결과의 벡터를 pRK5-TCCR이라 명명하였다.
한 실시 태양에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 우태아 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 포함된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 가득 차도록(confluent) 배양하였다. pRK5-TCCR DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA (Thimmappayaet al.,Cell, 31: 543(1982)) 약 1 ㎍과 혼합하여, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2500 ㎕에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4500 ㎕를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡입 제거하고 PBS 중의 20％ 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안 가하였다. 이어서, 293세포를 무혈청 배지로 세척하고 새로운 배지를 가하여 5일간 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 수집하고 회전 필터에서 농축시켜 15％ SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 TCCR 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(무혈청 배지에서), 이를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌 [Somparyracet al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981)]에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 TCCR DNA를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도가 되도록 배양하고 pRK5-TCCR DNA 700 ㎍을 가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿 상에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 20％ 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 다시 넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 TCCR을 포함하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 선택된 방법으로 정제하였다.
다른 실시 태양으로, TCCR을 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-TCCR 벡터를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 세포를 배양하고 배지(만으로) 또는35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체하였다. TCCR 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 바람직하게는 6일 가량 배양물을 배양한 후에 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 TCCR을 포함하는 배지를 농축시켜 선택된 방법으로 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부착된 TCCR은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. TCCR은 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입체는 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 번역 프레임에 맞게 배큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 TCCR 삽입체는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선별 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 TCCR을 포함하는 배양 배지를 농축시켜 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다.
또한, TCCR을 CHO 및(또는) COS 세포에서의 일시적 발현 과정 또는 CHO 세포에서의 다른 안정된 발현 과정에 의해 발현시킬 수 있다.
하기 실험 과정을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현시켰다. 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열이 (1) 힌지 CH2 도메인을 포함하는 IgG 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현되고(되거나) (2) 폴리-His 태그가 부착된 형태로서 단백질이 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubelet al.,Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997)]에 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 부위가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucaset al.,Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779(1996)]에 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염 후에 플라스미드의 안정하게 유지되는 세포를 선별할 수 있다.
시판되는 형질감염 시약인 슈퍼펙트 (상표명)(Superfect, Qiagen), 도스퍼 (상표명)(Dosper) 또는 퓨진 (상표명)(Fugene, Boehringer Mannheim)을 이용하여, 원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기 문헌 (Lucas et al.)에 기재된 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10-7세포를 하기 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 내용물을 넣고 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 흡입 제거하고 세포를 10 ㎖ 선택 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 송아지 태 혈청을 포함하는, 0.2 ㎛ 여과지를 통해 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 선택 배지 90 ㎖를 포함하는 100 ㎖ 회전 플라스크에 세포를 분주하였다. 1 내지 2일 후, 선택 배지 150 ㎖로 채워진 250 ㎖ 회전 플라스크로 세포를 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 회전 플라스크에 ㎖당 3 x 105개의 세포를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용하였다. 3 L 생산 회전 플라스크에 1.2 x 106세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 소포제 0.6 ㎖(예를 들어, 35％ 폴리디메틸 실록산 유상액, Dow Corning 365 의약 등급 유상액)을 가하였다. 전체 생산기 동안, 필요에 따라 pH를 약 7.2가 유지되도록 조절하였다. 10일 후 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 4℃에 보관하거나 정제용 컬럼에 즉시 로딩하였다.
폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다.이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 (pH6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
실시예 6
효모에서의 TCCR의 발현
다음 방법은 효모에서 TCCR의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 TCCR의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. TCCR을 코딩하는 DNA 및 프로모터를 TCCR의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우에는 TCCR의 발현을 위해, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 TCCR 신호 펩티드 및 다른 포유동물의 신호 펩티드 (예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열)를 코딩하는 DNA, 및 링커 서열 (필요한 경우)과 함께 TCCR 코딩 DNA를 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 TCCR을 단리하고 정제할 수 있다. TCCR을 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
실시예 7
배큘로바이러스-감염 곤충 세포에서의 TCCR의 발현
다음 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
TCCR을 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그 (IgG의 Fc 영역과 같이)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393 (Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하는 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 요컨데, TCCR을 코딩하는 서열이나 TCCR을 코딩하는 서열의 원하는 부분 (예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 세포외 단백질의 경우에 성숙 단백질 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
리포펙틴 (GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여, 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (상표명) (BaculoGold™) 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, "Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌[O'Reilleyet al.,Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 따라 수행하였다.
이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 TCCR은, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 하기와 같이 정제될 수 있다. 문헌 [Rupertet al.,Nature, 362: 175-179(1993)]에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 요컨데, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 얼음에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 투명하게하고, 상층액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (Qiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 제조하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 A280기준선까지 컬럼을 세척하고, 이 시점에서 분획을 회수하기 시작하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색하거나 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA (Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된His10-태그가 부착된 TCCR을 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) TCCR의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
별법으로, 하이 5 (high 5) 세포에 혼입시키는 변형된 배큘로바이러스 방법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu (Stratagene)과 같은 적합한 시스템으로 증폭시키거나, 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 (5') 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (예를 들어, IgG의 Fc 영역)가 포함된다. pIE1-1 (Novagen)과 같이 상업적으로 시판되는 플라스미드에서 유도된 것을 포함하는 다양한 벡터가 사용될 수 있다. pIE1-1및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질이 구성적으로 발현되도록 고안된 것이다. 이 플라스미드는 단지 다중 클로닝 부위의 방향만 다르고, 비감염 곤충 세포에서 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서를 포함하고 있다. pIE1-1및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하기 때문에 융합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 요컨데, 원하는 서열 또는 원하는 서열의 부분 (예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 (3') 하류에 인간 IgG의 Fc 영역 (pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다.
하이 5 세포를 CO2, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 27℃의 조건하에서 50％가 채워지도록 배양하였다. 각각의 150 mm 플레이트에 사용하기 위해, 원하는 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30㎍을 Ex-세포 배지 (배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu, JHR Biosciences #14401-78P, 주의: 이 배지는 빛에 민감함) 1 ㎖과 혼합하고, 별도의 튜브에 셀펙틴 (CellFECTIN, Gibco BRL #10362-010) 100㎕를 Ex-세포 배지 1 ㎖과 혼합 (볼텍싱으로 혼합)하였다. 상기 2가지 용액을 혼합하여 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Ex-세포 배지 8 ㎖을 DNA와 셀펙틴의 혼합물 2 ㎖에 가하고, 이를 미리 Ex-세포 배지로 1회 세척된 하이 5 세포에 가하였다. 이어서, 플레이트를 어두운 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA와 셀펙틴의 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-세포 배지로 1회 세척하여 과량의 셀펙틱을 제거한 후, 신선한 Ex-세포 배지 30 ㎖을 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그가 부착된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드 (QIAGEN) 또는 IgG 태그가 부착된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 배큘로바이러스 발현 벡터 내 서열의 발현을 측정하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지 (0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인 (Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신 (Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액 (pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그가 부착된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔, 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석, 및 원하거나 필요한 경우 기타 분석 방법으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
실시예 8
TCCR와 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 TCCR에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 상기의 문헌 (Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 TCCR을 포함하는 본 발명의 정제된 TCCR 융합 단백질, 및 세포 표면에 재조합 TCCR을 발현하는 세포가 포함된다. 당업자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
생쥐, 예를 들어 Balb/c를 프로인트 완전 면역보강제에 유화된 TCCR 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (Ribi Immunochemical Research, 메사추세츠주 해밀튼)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 면역화된 생쥐를 10 내지 12일 후에 선택된 면역보강제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 생쥐를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 후-안구 동을 통한 채혈 방법으로 생쥐에서 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-TCCR 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 TCCR을 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 생쥐를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1과 융합시켰다 (35％ 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비-융합세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
TCCR에 대한 반응성을 위해 하이브리도마 세포를 ELISA로 스크리닝할 수 있다. TCCR에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 순계의 Balb/c 생쥐가 항-TCCR 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이은 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
실시예 9
특이적 항체를 이용한 TCCR 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 TCCR 폴리펩티드를 당업계의 단백질 정제에 대한 다양한 표준 기술에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어, 전구-TCCR (pro-TCC) 폴리펩티드, 성숙 TCCR 폴리펩티드 또는 전-TCCR (pre-TCCR)폴리펩티드는 목적 TCCR 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용한 면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 일반적으로, 면역친화도 컬럼은 항-TCCR 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지 상에 공유결합으로 커플링시켜 제작한다.
폴리클로날 이뮤노글로불린은 면역 혈청으로부터 황산 암모늄 침전법 또는 고정된 단백질 A (Protein A) (Pharmacia LKB Biotechnology, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서의 정제에 의해 제조할 수 있다. 유사하게, 모노클로날 항체는 생쥐의 복수액 (ascite fluid)으로부터 황산 암모늄 침전법 또는 고정된 단백질 A 상에서의 정제에 의해 제조할 수 있다. 부분적으로 정제된 이뮤노글로불린은 CnBr로 활성화된 SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology) 크로마토그래피 수지에 공유결합된다. 제조업자의 지시에 따라, 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 차단하고, 유도체 수지를 세척하였다.
가용성 형태의 TCCR 폴리펩티드를 함유하는 세포로부터 분획을 제조하여 그러한 면역친화도 컬럼을 TCCR 폴리펩티드의 정제에 이용할 수 있다. 이 조제는 전체 세포 또는 분별 원심분리를 통해 얻은 세포기관 분획에 세제 (detergent)를 첨가하거나 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 가용성화시킴으로써 유래된 것이다. 별법으로, 신호 서열을 포함하는 가용성 TCCR 폴리펩티드는 세포가 배양되고 있는 배지로 유용한 양만큼 분비될 수 있다.
가용성 TCCR 폴리펩티드-함유 조제를 면역친화도 컬럼에 통과시키고, TCCR 폴리펩티드가 선택적으로 부착되도록 하는 조건 하에서 (예, 세제의 존재 하에 고 이온강도 완충액 중에서) 상기 컬럼을 세척하였다. 그 후, 항체/TCCR 폴리펩티드 결합이 붕괴되는 조건 하에서 (예, 약 pH 2 내지 3과 같은 낮은 pH 완충액 또는 고농도의 우레아나 티오시아네이트 이온과 같은 카오트로프 (chaotrope)) 상기 컬럼을 용출시키고, TCCR 폴리펩티드를 수득하였다.
실시예 10
약물 스크리닝
다양한 약물 스크리닝 기술 중 어떠한 것에 의해서든 TCCR 폴리펩티드를 이용하거나, 또는 그의 단편을 결합시킴으로써 화합물을 스크리닝하는 데 특히 유용한 방법을 이용할 수 있다. 그러한 시험에서 사용되는 TCCR 폴리펩티드는 용액 중에서 유리된 상태이거나, 고상 지지체에 고정되어 있거나, 세포 표면 상에서 지지되어 있거나, 또는 세포 내에 위치하고 있었다. 약물 스크리닝의 한 방법으로 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현시키는 재조합 핵산에 의해 안정적으로 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주세포를 이용한다. 그러한 형질전환된 세포에 대해서 경쟁적 결합 분석 시험을 통해 약물을 스크리닝하였다. 생존하고 있든 고정된 형태이든 그러한 세포는 표준 결합 분석 시험용으로 사용할 수 있다. 예를 들어, TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편과 시험 대상 제제 간의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, TCCR 폴리펩티드 및 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 간의 복합체가 시험 대상 제제에 의해 감소되는 정도를 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명은 TCCR 폴리펩티드-관련 질병 또는 질환에 영향을 줄 수 있는 약물 또는 임의의 다른 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이들 방법에는 그러한 제제를 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계 및 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 (i) 상기 제제와 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편 간의 복합체의 존재 또는 (ii) TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편과 세포 간의 복합체의 존재에 대해 분석 시험을 하는 단계가 포함된다. 그러한 경쟁적 결합 분석 시험에서, TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편은 일반적으로 표지되어 있다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편을 결합 형태로 존재하는 것과 분리하고, 유리된 또는 복합체를 이루지 않은 표지의 양을 특정 제제가 TCCR 폴리펩티드에 결합하거나 TCCR 폴리펩티드/세포 복합체를 방해하는 능력의 척도로 삼았다.
폴리펩티드에 대해 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고속 활성검사 스크리닝법은 약물 스크리닝을 위한 다른 기술을 제공하며, 이는 1984년 9월 13일 공개된 국제 공개 제84/03564에 자세히 기술되어 있다. 간략하게, 다수의 서로 다른 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고체 물질 상에서 합성하였다. TCCR 폴리펩티드용으로 이용하기 위해, 상기 펩티드 시험 화합물을 TCCR 폴리펩티드와 반응시키고, 세척하였다. 결합된 TCCR 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법으로 검출하였다. 또한, 상기 언급한 약물 스크리닝 기술에서 사용하기 위해 정제된 TCCR 폴리펩티드를 직접 플레이트 상에 코팅할 수도 있다. 또한, 비-중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하고, 이를 고상 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 TCCR 결합 폴리펩티드와 결합 가능한 중화 항체가 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 단편과의 결합에 대해 특이적으로 시험 화합물과 경쟁하는 경우, 경쟁적 약물 스크리닝 분석 시험의 이용에 관한 것이다. 이러한 방식에서, 상기 항체를 이용하여 TCCR 폴리펩티드와 하나 이상의 항원성 결정인자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.
실시예 11
합리적 약물 설계 (Rational Drug design)
합리적 약물 설계의 목적은 목적하는 생물학적 활성 폴리펩티드 (즉, TCCR 폴리펩티드) 또는 이들과 상호작용하는 소분자, 예를 들어 아고니스트, 길항제 또는 저해제의 구조적 유사체를 생산하는 데 있다. 이들 예 중 어떠한 것도 TCCR 폴리펩티드의 보다 활성이거나 보다 안정한 형태인 약물 또는 생체 내에서 TCCR 폴리펩티드의 기능을 상승시키거나 방해하는 약물을 만드는 데 이용할 수 있다 (문헌 [Hodgson,Bio/Technology9:19-21 (1991)] 참조).
한 접근 방법에서, TCCR 폴리펩티드의 3차원 구조 또는 TCCR 폴리펩티드-저해제 복합체의 3차원 구조를 X-선 결정학에 의하거나, 컴퓨터 모델링에 의하거나 또는 가장 일반적으로 이들 방식을 함께 이용하여 결정한다. TCCR 폴리펩티드의 모양과 전하 둘 다를 확인하여 구조를 밝히고 그 분자의 활성 부위(들)을 결정하여야 한다. 드물게, 상동성 단백질의 구조에 기반한 모델링을 통해 TCCR 폴리펩티드의 구조에 관하여 유용한 정보를 얻을 수 있다. 두 경우 모두에서, 관련 구조적 정보를 이용하여 유사한 TCCR 폴리펩티드-유사 분자를 설계하거나, 또는 효율적인 저해제를 확인한다. 합리적 약물 설계에 대한 유용한 예로는 문헌 [Braxton and Wells,Biochemistry31:7796-7801 (1992)]에 나타난 바와 같이 활성 또는 안정성을 개선한 분자 또는 문헌 [Athaudaet al.,J. Biochem. 113:742-746 (1993)]에 나타난 바와 같이 천연 펩티드의 저해제, 아고니스트 또는 길항제로서 작용하는 분자가 포함될 수 있다.
또한, 상기 기술한 바와 같이 기능 분석 시험에 의해 선별된 표적-특이적 항체를 단리하고, 그 후 그의 결정 구조를 밝히는 것이 가능하다. 이 접근방식은 대체로 추후 약물 설계의 기반이 될 수 있는 파마코어 (pharmacore)를 얻도록 한다. 항-개별성 항체 (항-id)를 생성시켜 단백질 결정학을 모두 기능적, 약리학적 활성 항체로 우회하도록 하는 것이 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 유사체일 것으로 기대된다. 그 후, 항-id를 이용하여 화학적 또는 생물학적으로 생산된 펩티드군으로부터 펩티드를 확인 및 단리할 수 있다. 그 후, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용한다.
본 발명에 의해, TCCR 폴리펩티드의 충분량을 만들어 X-선 결정학과 같은 분석 연구를 수행하는데 이용 가능하도록 할 수 있다. 또한, 본원에서 제공하는 TCCR 폴리펩티드 아미노산 서열의 지식이 X-선 결정학 대신에 또는 그와 함께 컴퓨터 모델링 기술을 이용하는 데 지침을 제공할 것이다.
표 2(A-D)는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 아미노산 서열 동일성 ％ (표 2(A-B)) 및 핵산 서열 동일성 ％ (표 2(C-D))을 측정하기 위해 하기 기재된 방법을 이론상으로 예시한 것이다. 이 때, "PRO"는 본 발명의 해당 폴리펩티드에 대한 이론상의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 해당 "PRO" 폴리펩티드가 비교되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 이론상의 해당 "PRO"-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 해당 "PRO-DNA" 핵산 분자가 비교되는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 이론상의 아미노산 잔기를 나타내고, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 이론상의 뉴클레오티드를 나타낸다.
실시예 12
면역 반응의 발생에 있어서 TCCR의 역할
T 세포 반응: 항-KLH 반응을 위해, 생쥐의 뒷발바닥에 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium Tuberculosis) 균주인 H37Ra (Difco Laboratories, 미시간주 디트로이트) 1mg/㎖을 함유하는 염수 중 KLH 100 ㎍ (CFA-함유 1:1 현탁액)으로 면역화시켰다. 9일 후, 슬와 림프절을 수거하여 세포 현탁액을 제조하였다. 상기 림프절 세포를 5％ FCS를 첨가한, 다양한 농도의 KLH 하의 DMEM 배지 중에서 배양하였다 (웰 당 5 X 105). 5일 배양의 마지막 18시간동안 [3H]-티미딘 (ICN, 캘리포니아주 어바인) 1 μCi를 첨가하여 증식 정도를 측정하고, 방사능의 혼입 정도를 액체 섬광 계수 (liquid scintillation counting)에 의해 분석 시험하였다. KLH로 예비 처리한 야생형 생쥐 또는 TCCR-결핍 생쥐로부터의 5 x 105배수 림프절 세포 (draining lymph node)를 최종 용적 200 ㎖의 96웰 플레이트에서 지정량의 KLH 존재 하에 배양함으로써 T 세포에 의한 사이토카인 생산 분석 시험을 수행하였다. 96시간의 배양 후, 배양 상청액 150 ㎕를 각 웰로부터 수거하여, 제시된 조건 하에서 Pharmingen (캘리포니아주 샌디에고)로부터의 항체를 이용한 ELISA에 의해 사이토카인 수준을 결정하였다.
T 세포 분화의 시험관 내 유도: 야생형 또는 TCCR-결핍 동복자의 췌장 및 림프절로부터 유래된 CD4+T 세포를 항-CD4 자성 비드 (MACS)로 정제하였다. 정제된 T 세포 (106세포/㎖)를 방사선이 조사된 (3000 rad) 유전적 동계의 야생형 또는 녹아웃 APC (106/㎖) 및 ConA (2.5 ㎍/㎖, Boehringer, 독일 만하임)의 존재 하에 활성화시키거나, 또는 항-CD3 5 ㎍/㎖ 및 항-CD28 항체 1 ㎍/㎖로 코팅된 플레이트 상에 플레이팅함으로써 활성화시켰다. Th1 분화를 위해 상기 배양 배지에 IL-2 (20 U/㎖), IL-12 (3.5 ng/㎖, R＆D Systems) 및 항-IL-4 항체 (Pharmingen) 500 ng/㎖을 부가하였고, Th2 분화를 위해 IL-2 (20 U/㎖), IL-4 (103 U/㎖, R＆D Systems) 및 항-IFN 항체 (Phamingen) 500 ng/㎖를 부가하였다. 3일 후, RNA 추출을 위해 세포를 용해시키거나, 또는 세포를 강하게 세척하고, 계수하고, ConA (2.5 ㎍/㎖)의 존재 하에서 또는 항-CD3 항체 5 ㎍/㎖로 코팅된 플레이트 상에서 106 세포/㎖에서 재촉진시켰다. 24시간 후, 상청액을 수득하고 사이토카인의 존재에 대해서 분석 시험을 하였다.
총 이뮤노글로불린 수준 및 OVA-특이적 이뮤노글로불린 수준: 생후 12주 이상의 면역화되지 않은 생쥐를 출혈시키고, 다양한 동종형 (isotype)의 이뮤노글로불린의 존재 하에서 ELISA에 의해 혈청을 분석하였다. 항-OVA 특이적 항체를 위해, 생후 6주의 야생형 또는 TCCR-결핍 생쥐를 불완전 프로인드 면역반응 항진제 (i.p.) 중의 OVA 100 ㎍으로 면역화시켰다. 유발 7일 후, 생쥐를 출혈시키고, OVA-특이적 항체의 존재에 대해 혈청을 분석 시험하였다.
실시간 PCR 분석: 쥐 비장세포를 FACS에 의해 T 헬퍼 세포 (CD4 양성, F4/80 음성, 순도 97％), B 세포 (CD19 양성, 순도 97％), 자연 살상 세포 (NK1.1양성, 순도 99％) 및 대식세포 (F4/80 양성, 순도 95％ 초과)로 분리하고, MACS에 의해 세포독성 T 세포 (CD8 양성, 순도85％)로 분리하였다. 모든 RNA를 Qiagen RNeasy 컬럼으로 추출하고, DNAse I으로 분해하여 오염 DNA를 제거하였다. 타크만18을 이용하여 RNA를 TCCR에 대해 프로브로 사용하였다. 모든 반응은 2회 실시되었고, 리보솜 하우스키핑 유전자인 rpl19를 기준으로 하였다. 무-RT 대조구 반응이 포함되었으며, 모든 시료에 오염 DNA가 없는 것으로 나타났다. 모든 프라이머 및 프로브의 서열은 도 19에 기술되어 있다.
야생형 생쥐 및 TCCR-결핍 생쥐를 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)으로 면역화시키고, 9일 후 수득한 배수 림프절에 대해 KLH 존재 하에서 시험관 내 촉진 후 사이토카인 생산을 평가하였다 (도 16A 및 B). KLH로 유발된 경우 TCCR-결핍 세포가 IFN을 생산하는 능력은 주목할만하게 손상된 반면, IL-4의 생산은 현저하게 상승하였다. TCCR가 결핍된, 시험관 내에서 예비 처리한 림프절 세포의 IL-5 생산 및 항원 유도에 의한 증식은 정상이었다 (도 16C 및 D). IFN 생산의 정상적인 수준은 TCCR-결핍 생쥐의 LPS 자극에서 측정되었는데, 이는 아마도 이들 생쥐의 IFN 생산에 내재적 결손이 없을 것임을 시사하고 있다. 이들 결과는 TCCR-결핍 생쥐가 Th1 반응을 개시하는 능력에 손상을 입었음을 나타내고 있다. Th1 반응의 손실은 IL-12와 같은 Th1 사이토카인 결핍 생쥐에서 관측되었던 바와 유사하게 Th2 반응의 증가를 수반하였다 (Magram, J.,et al., 1996,Immunity, 4:471-81; Wu, C.,et al., 1997,J. Immunol., 159:1658-65).
세포 면역 반응을 조절하는 역할에서뿐만 아니라, IFN은 이뮤노글로불린(Ig) 동종형 조절에도 관여하고 있다. 구체적으로, IFN은 IgG2a 항체의 생산을 상승시키며, 그보다는 덜하지만 IgG3 항체의 생산을 상승시키는 것으로 알려져 있다 (Snapper, C.M., ＆ Paul, W.E., 1987,Science, 236:944-7; Huang, S.,et al., 1993,Science, 259:1742-5). Th1 세포에 의한 IFN 생산 감소와 함께, TCCR-결핍 생쥐는 총 혈청 IgG2a 농도가 감소한 반면, 모든 다른 이뮤노글로불린 동종형의 수준은 정상이었다 (도 17A). 또한, 오발부민 (OVA)로 생체내 유발 시, TCCR-결핍 생쥐는 OVA-특이적 IgG2a의 역가가 심각하게 감소되었다 (대조구의 약 20％; 도 17B).
Th1 반응은 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes, L. monocytogenes)와 같은 세포내 병원체에 대한 방어에 중요하다. Th1 반응의 조절에 있어서 TCCR의 생체내 역할을 추가로 확인하기 위해, TCCR-결핍 생쥐 및 대조구 동복자를 엘.모노사이토게네스 치사량 미만의 투여량 (3x104콜로니 형성 유닛 (CFU))으로 감염시켰다. 세균 역가는 감염 후 3일 또는 9일째에 결정하였고, TCCR-결핍 생쥐의 간에서 106배까지 높은 것이 발견되었다 (도 17C).
그 후, 시험관 내에서 Th1 반응의 분화를 조절하는 TCCR의 역할을 관찰하였다. 야생형 생쥐 및 TCCR-결핍 생쥐로부터의 CD4+ T 세포를 방사선이 조사된 APC의 존재 하의 시험관 내에서 Th1 세포 발생이나 Th2 세포 발생을 선호하는 조건 하에 분화시켰다. 배양 3 내지 4일 후, 세포를 세척하고, ConA로 재촉진시키고, 24시간 후, 상청액에서 사이토카인의 존재를 분석하였다. Th1 세포로 분화된 경우,TCCR-결핍 림프구는 그의 야생형 동복자보다 80％ 적은 IFN을 생산하였다. 반면, IL-4 및 항-IFN 항체의 존재 하에서 배양된 TCCR-결핍 림프구는 IL-4를 약간 더 생산하였다. CD4+ CD45RBbhigh야생형 T 세포에서 유사한 결과를 얻었다. 이 효과는 2가지 이유에서 T 세포에 고유한 것이다. 첫째로, T 세포가 야생형 생쥐 또는 TCCR-결핍 생쥐로부터 유래된 APC의 존재 하에서 분화된 경우 유사한 결과를 얻었다. 둘째로, 플레이트에 고정된 항-CD3/CD28을 이용하여 T 세포 분화를 수행하는 경우, 상기 효과는 무-APC 시스템에서 재현 가능하다 (도 18B). 또한, 세포내 FACS 염색으로 측정한 바와 같이, IFN 생산의 감소는 IFN 생산 세포의 감소와 상호관련되어 있다. 관찰된 Th1 결핍이 IL-12 수용체의 결손으로 인한 것은 아닌 듯 한데, 이는 상기 수용체의 두 서브유닛이 활성화된 T 세포 내에서 정상적으로 발현되었기 때문이다. IL-12는 여전히 ConA로 자극된 야생형 생쥐 및 TCCR-결핍 생쥐로부터의 T 세포의 증식을 촉진하기 때문에, 이들 생쥐의 IL-12 신호 전달 경로에는 결손이 없는 듯 하다 (도 18C 및 D).
표 3(A-Q)는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 위한 완전한 원시 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하기 위해 통상 UNIX 운용 체계용으로 컴파일될 수 있다.

Claims (34)

  1. T 세포를 유효량의 TCCR 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포가 Th1 아형 대신 Th2 아형으로 분화되는 것을 상승, 촉진 또는 강화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상승, 촉진 또는 강화가 포유동물에서 일어나며, 유효량이 치료상 유효량인 방법.
  3. 포유동물에게 치료상 유효량의 TCCR 폴리펩티드 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 Th-1 매개 질환을 치료하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, Th1-매개 질환이 자가면역성 염증 질환 및 동종이식편 거부반응으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 자가면역성 염증 질환이 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병, 자가면역성 포도막망막염, 염증성 장질환 및 자가면역성 갑상선 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 길항제가 소분자인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 길항제가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 길항제가 생물학적 활성을 결여한 TCCR 변이체인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 길항제가 모노클로날 항체인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 항체가 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는 것인 방법.
  13. 제3항에 있어서, 길항제가 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 방법.
  14. 제3항에 있어서, 길항제가 TCCR 리간드인 방법.
  15. 유효량의 TCCR 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, T 세포가 Th2 아형으로 분화되는 것을 방지, 저해 또는 약화시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 방지, 저해 또는 약화가 포유동물에서 일어나며, 유효량이 치료상 유효량인 방법.
  17. 포유동물에게 치료상 유효량의 TCCR 폴리펩티드 또는 아고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 Th2-매개 질환을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, Th2-매개 질환이 감염성 질환 및 알레르기성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 감염성 질환이 레이시마니아 매이저 (Leishmania major), 마이코박테리움 레프래 (Mycobacterium leprae), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondi), 호흡기 합포체 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 알레르기성 질환이 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 및 춘계 결막염으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 아고니스트가 소분자인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 아고니스트가 생물학적 활성을 갖는 TCCR 변이체인 방법.
  23. 제15항에 있어서, 아고니스트가 모노클로날 항체인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 항체가 비-인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 갖는 것인 방법.
  25. 제15항에 있어서, 아고니스트가 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 방법.
  26. 제15항에 있어서, 아고니스트가 안정한 TCCR ECD인 방법.
  27. 세포를 항-TCCR 항체에 노출시키는 단계 및 상기 항체와 상기 세포의 결합을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 항체와 상기 세포의 결합이 TCCR 폴리펩티드의 존재를 나타내는 것인, 세포 내에서 TCCR 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법.
  28. TCCR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을, (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 시료에서, 및 (b) 동일한 세포 유형의 이미 알고있는 정상적인 조직 세포의 대조구 시료에서 검출하는 것을 포함하며, 상기 시험 시료 내의 발현 수준이 대조구 시료에 비해 낮은 것은 Th2-매개 질환이 존재함을 나타내고, 상기 시험 시료 내의 발현 수준이 대조구에 비해 높은 것은 Th-1 매개 질환이 존재함을 나타내는 것인, 포유동물에서 Th1-매개 질환 또는 Th2-매개 질환을 진단하는 방법.
  29. TCCR 폴리펩티드와 후보 화합물이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 이들 두 성분을 접촉시키는 것을 포함하는, TCCR 폴리펩티드의 발현을 저해할 수 있는 화합물을 확인하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 후보 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 있는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 고정되지 않은 성분이 검출 가능한 표지를 운반하는 것인 방법.
  32. TCCR 폴리펩티드와 후보 화합물이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 이들 두 성분을 접촉시키는 것을 포함하는, TCCR 폴리펩티드의 생물학적 활성을 저해할 수 있는 화합물을 확인하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 후보 화합물이 고체 지지체 상에 고정되어 있는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 고정되지 않은 성분이 검출 가능한 표지를 운반하는 것인방법.
KR1020027005032A 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의 조절 KR100840033B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16054299P 1999-10-20 1999-10-20
US60/160,542 1999-10-20

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077028670A Division KR100874280B1 (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의조절

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020048971A true KR20020048971A (ko) 2002-06-24
KR100840033B1 KR100840033B1 (ko) 2008-06-19

Family

ID=22577314

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027005032A KR100840033B1 (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의 조절
KR1020087017088A KR20080068767A (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의조절
KR1020077028670A KR100874280B1 (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의조절

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087017088A KR20080068767A (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의조절
KR1020077028670A KR100874280B1 (ko) 1999-10-20 2000-10-18 Ｔ 헬퍼 세포 매개 질환의 치료를 위한 ｔ 세포 분화의조절

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20040234522A1 (ko)
EP (1) EP1222209A2 (ko)
JP (1) JP4931310B2 (ko)
KR (3) KR100840033B1 (ko)
CN (1) CN1279054C (ko)
AU (2) AU1095001A (ko)
BR (1) BR0015055A (ko)
CA (1) CA2389317A1 (ko)
IL (2) IL148936A0 (ko)
MX (1) MXPA02003897A (ko)
NZ (1) NZ531141A (ko)
WO (1) WO2001029070A2 (ko)
ZA (1) ZA200202468B (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA02003897A (es) * 1999-10-20 2002-12-13 Genentech Inc Modulacion de la diferenciacion de celulas t para el tratamiento de enfermedades mediadas por las celulas t auxiliares.
US7393532B1 (en) 2000-10-18 2008-07-01 Genentech, Inc. Modulation of T cell differentiation for the treatment of T helper cell mediated diseases
EP2338910B1 (en) * 2002-01-18 2015-07-08 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor Zcytor17 multimers
US9738700B2 (en) 2002-01-18 2017-08-22 Zymogenetics Inc. ZCYTOR17 heterodimeric cytokine receptor
WO2004069173A2 (en) * 2003-01-31 2004-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for modulating an inflammatory response
CN1921886A (zh) * 2004-02-17 2007-02-28 先灵公司 调节细胞因子活性的方法；相关药剂
CA2591587A1 (en) * 2004-12-16 2006-06-22 Genentech, Inc. Methods for treating autoimmune disorders
CA2657934C (en) * 2006-07-19 2017-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Wsx-1/p28 as a target for anti-inflammatory responses

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5009772A (en) 1989-02-27 1991-04-23 Kerr-Mcgee Corporation Solvent extraction process
DE69008521T2 (de) 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
CA2055435A1 (en) 1989-05-10 1990-11-11 Eli Gilboa Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
MX9204374A (es) * 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
CA2150262C (en) * 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO1997033551A2 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Millennium Pharmaceuticals Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
CA2253942A1 (en) * 1996-05-10 1997-11-20 Biogen, Inc. Common gamma chain blocking agents
US5792850A (en) * 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
MXPA02003897A (es) * 1999-10-20 2002-12-13 Genentech Inc Modulacion de la diferenciacion de celulas t para el tratamiento de enfermedades mediadas por las celulas t auxiliares.
WO2003091424A1 (fr) * 2002-04-26 2003-11-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de criblage d'un anticorps agoniste
DE60336930D1 (de) * 2002-12-31 2011-06-09 Schering Corp IL-27 et IL-2 pour le traitement du cancer
CA2591587A1 (en) * 2004-12-16 2006-06-22 Genentech, Inc. Methods for treating autoimmune disorders

Also Published As

Publication number Publication date
CN1409726A (zh) 2003-04-09
IL148936A0 (en) 2002-09-12
ZA200202468B (en) 2003-06-25
CN1279054C (zh) 2006-10-11
JP4931310B2 (ja) 2012-05-16
US20110097325A1 (en) 2011-04-28
WO2001029070A2 (en) 2001-04-26
WO2001029070A8 (en) 2001-09-20
NZ531141A (en) 2005-07-29
AU2006200374A1 (en) 2006-02-23
BR0015055A (pt) 2002-07-16
CA2389317A1 (en) 2001-04-26
KR20070121855A (ko) 2007-12-27
KR100874280B1 (ko) 2008-12-18
PL355284A1 (en) 2004-04-05
KR100840033B1 (ko) 2008-06-19
IL148936A (en) 2010-12-30
AU1095001A (en) 2001-04-30
US20070134238A1 (en) 2007-06-14
KR20080068767A (ko) 2008-07-23
EP1222209A2 (en) 2002-07-17
US20040234522A1 (en) 2004-11-25
AU2006200374B2 (en) 2009-12-10
JP2003512824A (ja) 2003-04-08
WO2001029070A3 (en) 2002-05-02
MXPA02003897A (es) 2002-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5401001B2 (ja) 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
US7863422B2 (en) Anti-PRO87299 antibodies
KR101224659B1 (ko) 면역 관련 질환의 치료를 위한 신규 조성물 및 방법
JP2010115195A (ja) 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
JP2010220614A (ja) 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
JP2010088434A (ja) 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
JP2013051961A (ja) 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
US20110097325A1 (en) Modulation of T cell Differentiation for the treatment of T helper cell mediated diseases
JP2010046065A (ja) インターロイキン−８と相同なポリペプチドとその治療用途
JP2005519590A (ja) 免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
US7393532B1 (en) Modulation of T cell differentiation for the treatment of T helper cell mediated diseases
US20060210556A1 (en) Novel composition and methods for the treatment of immune disorders
JP2006515748A (ja) リウマチ様関節炎の治療のための組成物と方法
JP3988821B2 (ja) 免疫関連疾患を治療するための組成物及び方法
KR20070034619A (ko) 인터루킨-８ 동종 폴리펩티드 및 이의 치료적 용도
RU2375078C2 (ru) Новая композиция и способы лечения связанных с иммунитетом заболеваний

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130531

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140529

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160330

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee