KR101443050B1 - Ｉｌ-31 단클론성 항체 및 사용법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-31 단클론성 항체를 투여함으로써, 제한은 아니지만 접촉성 피부염, 아토피 피부염, 약물 유발 지연형 피부 알레르기 반응, 독성표피괴사, 피부 T 세포 림프종, 수포성 유천포창, 원형탈모증, 백반증, 장미 여드름, 결절성 양진, 피부경화증, 단순 헤르페스 바이러스, 또는 이것들의 조합을 포함하는 소양성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 단클론성 항체를 발생시키는 하이브리도마를 제공한다.

Description

ＩＬ-31 단클론성 항체 및 사용법{IL-31 MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE}

본 발명은 ＩＬ-31 단클론성 항체 및 사용법에 관한 발명이다.

면역시스템은 림프구를 포함한 광범한 특이적 세포 타입을 숙주로 한다. 림프구는 숙주 면역반응의 특이성을 결정하며, 항체생산 세포의 전구체인 B 림프구와 특이적 면역반응의 발달과 같은 어떤 조절 기능에 필요한 T 림프구의 두 부류를 포함한다.

성숙한 T 세포는 항원이나 다른 자극에 의해 활성화되어, 예를 들어 사이토카인, 생화학적 신호화 분자, 또는 T 세포 집단의 운명에 더 영향을 미치는 수용체를 생산할 수 있다.

B 세포는 B 세포 수용체 및 다른 부속 분자를 포함하는 이들 세포 표면의 수용체에 의해 활성화되어, 사이토카인 생산과 같은 부속 세포 기능을 수행할 수 있다.

단핵구/대식세포 및 T 세포는 이들 세포 표면의 수용체에 의해 활성화될 수 있으며, 림프구에 대한 항원을 나타냄으로써 면역반응에서 중심적인 역할을 할 수 있으며, 또한 많은 사이토카인을 분비함으로써 림프구의 부속 세포로서 작용할 수도 있다.

자연살해(NK) 세포는 T 세포 및 B 세포와 공통의 선조세포를 가지며, 면역감시에서 어떤 역할을 한다. 혈액 림프구의 15% 이하를 구성하는 NK 세포는 항원 수용체를 발현하지 않으며, 따라서 표적세포와의 결합을 위한 필요조건인 MHC 인식을 이용하지 않는다. NK 세포는 어떤 종양세포 및 바이러스 감염 세포의 인식 및 살해에 연루된다. 생체내에서 NK 세포는 활성화를 필요로 한다고 생각되지만, 시험관내에서 NK 세포는 활성화 없이 어떤 타입의 종양세포를 죽이는 것으로 나타났다.

인터류킨은 염증을 포함한 면역학적 반응들을 매개하는 사이토카인의 일족이다. 인터류킨은 다양한 염증 병리학을 매개한다. 면역반응의 중심은 T 세포인데, 이것은 많은 사이토카인 및 항원에 대한 적응면역을 생산한다. T 세포에 의해 생산된 사이토카인들은 1형 및 2형으로 분류되었다(Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). 1형 사이토카인은 IL-2, IFN-γ 및 LT-α를 포함하며, 염증반응, 바이러스 면역, 세포내 기생충 면역 및 동종이식 거부에 연루된다. 2형 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-1O 및 IL-13을 포함하며, 체액반응, 연충면역 및 알레르기 반응에 연루된다. 1형과 2형이 공유하는 사이토카인은 IL-3, GM-CSF 및 TNF-α를 포함한다. 1형과 2형을 생산하는 T 세포 집단이 상이한 타입들의 염증조직으로 우선적으로 이주한다는 것을 뒷받침하는 어떤 증거가 있다.

피부는 면역시스템에서 중요한 역할을 하며, 층들로 구성된다. 표피가 표면층이다. 표피 아래에는 결합조직층인 진피가 있다. 진피 아래에는 다량의 지방조직층인 피하조직이 있다. 순환하는 T 림프구는 정상 및 염증 조건 하에서 피부로 이주한다. 피부 림프구 항원(CLA)이 피부에 향성을 가진 T 세포의 귀소 수용체라고 생각된다. Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14:13-18, 2004.

아토피 피부염, 접촉성 피부염, 약물-유발 알레르기 반응, 피부-향성 바이러스 및 바이러스 관련 소양증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진 및 수포성 유천포창을 포함하는 몇몇 피부질환은 높은 수준의 CLA+ T 세포를 발현하는 것으로 알려져 있다. 이러한 피부 T 세포 매개 질환을 치료해야 할 필요가 있다.

사이토카인 일족의 증명된 생체내 활성은 다른 사이토카인, 사이토카인 작용제, 및 사이토카인 길항제의 막대한 임상 잠재력, 및 이들에 대한 필요성을 예시한다. 사이토카인 IL-31이 새로 확인되었다. IL-31은 마우스에서 과발현되었을 때 피부염-유사 증상을 가져온다. 피부-귀소 T 세포 및 표피 각질세포는 모두 인체의 피부질환의 병리학에 관련되었다. 본 발명은 전-염증성 사이토카인 IL-31의 길항제를 제공함으로써 이들 필요성을 다룬다. IL-31의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있는 본 발명의 이러한 길항제는 가용성 IL-31RA 수용체와 중화 항-IL-31 항체를 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 염증질환에서의 그것의 사용뿐만 아니라, 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명을 상세히 서술하기 전에, 다음 용어를 정의하는 것이 본 발명을 이해하는데 도움이 될 것이다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 다클론성 항체, 친화성-정제된 다클론성 항체, 단클론성 항체, 및 항원-결합 단편들, 예를 들어 F(ab')2 및 Fab 단백질분해 단편을 포함한다. 유전조작된 무손상 항체 또는 단편들, 예를 들어 키메라 항체, Fν 단편, 단쇄 항체 등뿐만 아니라, 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드들도 포함된다. 비-인간 항체는 인간 프레임워크 및 불변영역 위에 비-인간 CDR을 접목함으로써, 또는 전체 비-인간 가변 도메인을 통합시킴으로써(노출된 잔기들을 치환함으로써 인간-유사 표면으로 비-인간 가변 도메인을 선택적으로 "은폐"하는 것이며, 그 결과는 "피복"(veneered) 항체이다) 인간화될 수 있다. 어떤 예에서, 인간화된 항체는 적합한 결합 특징들을 강화하기 위해 인간 가변영역 프레임워크 안에 비-인간 잔기를 보유할 수도 있다. 항체를 인간화함으로써, 생물학적 반감기가 감소될 수 있으며, 인간에 투여했을 때 좋지 않은 면역반응에 대한 가능성이 감소된다.

용어 "키메라 항체" 또는 "키메라 항체들"은 그것의 경쇄 및 중쇄 유전자가 전형적으로는 상이한 종들에 속하는 면역글로불린 가변영역 및 불변영역 유전자로부터의 유전조작에 의해 구성된 항체를 말한다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체로부터의 유전자 가변 세그먼트들이 감마 1 및 감마 3과 같은 인간 불변 세그먼트에 결합될 수 있다. 따라서, 전형적인 치료학적 키메라 항체는 마우스 항체의 가변 또는 항원-결합 도메인과 인간 항체의 불변 도메인으로 구성되며, 물론 다른 포유류 종들도 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 말한다. 면역글로불린의 한 형태가 항체의 기본 구조단위를 구성한다. 이 형태는 테트라머이며, 두 쌍의 동일한 면역글로불린 사슬로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄를 가진다. 각 쌍에서는 경쇄와 중쇄 가변영역이 함께 항원에 대한 결합을 일으키고, 불변영역은 항원 이펙터 기능을 일으킨다.

전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25Kd 또는 214개 아미노산)는 NH2-말단에 있는 가변영역 유전자(약 110개 아미노산)와 COOH-말단에 있는 카파 또는 람다 불변영역 유전자에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50Kd 또는 446개 아미노산)는 유사하게 가변영역 유전자(약 116개 아미노산)와 나머지 전술한 불변영역 유전자(약 330개 아미노산) 중 하나에 의해 암호화된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgG, IgM, IaA, IgD 및 IgE로서 항체의 동형을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 안에서 가변영역 및 불변영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다(일반적으로, Fundamental Immunology(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7(전문이 본원에 참고자료로서 인용된다)를 참조한다).

면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변영역은 3개의 초 가변영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역으로 구성된다. 따라서, 용어 "초 가변영역"은 항원 결합을 일으키는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초 가변영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기, 즉 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초 가변루프"로부터의 잔기, 즉 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)(Chothia and Lesk, 1987, J. MoI. Biol. 196: 901-917)를 포함한다(이것들은 모두 본원에 참고자료로서 인용된다). "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 초 가변영역 잔기를 제외한 그외 다른 가변 도메인 잔기이다. 상이한 경쇄 또는 중쇄를 가진 프레임워크 영역들의 서열은 종들에서 비교적 보존된다. 따라서, "인간 프레임워크 영역"은 자연발생 인간 면역글로불린의 프레임워크와 실질적으로 동일한(약 85% 이상, 일반적으로 90-95% 이상) 프레임워크 영역이다. 구성 경쇄와 중쇄가 조합된 프레임워크 영역인 항체의 프레임워크 영역은 CDR을 배치하고 정렬하는데 사용된다. CDR은 일차적으로 항원 에피토프에 대한 결합을 일으킨다.

따라서, 용어 "사람화된" 면역글로불린은 인간 프레임워크 영역 및 비-인간(일반적으로 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 말한다. CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 "공여자"라고 하고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용자"라고 한다. 불변영역은 존재할 필요가 없지만, 만약 존재한다면, 이들은 실질적으로 인간 면역글로불린 불변영역과 동일해야 하는데, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일해야 한다. 그러므로, 아마도 CDR을 제외한 인간화된 면역글로불린의 모든 부분은 본연의 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 부분들과 실질적으로 동일하다. "인간화된 항체"는 인간화된 경쇄 및 인간화된 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 예를 들어, 인간화된 항체는 상기 정의된 전형적인 키메라 항체를 포함하지 않을 것인데, 이것은, 예를 들어 키메라 항체의 전체 가변영역이 비-인간의 것이기 때문이다.

용어 "유전적으로 변경된 항체"는 본래 항체의 아미노산 서열이 변화된 항체를 의미한다. 항체의 발생에는 재조합 DNA 기술이 관련되기 때문에, 본연의 항체에서 발견된 아미노산의 서열에만 국한될 필요는 없으며, 항체를 재설계하여 원하는 특징들을 획득할 수 있다. 단지 하나 또는 소수의 아미노산을 변화시키는 것에서부터, 예를 들어 가변영역이나 불변영역을 완전히 재설계하는 것까지 많은 가능한 변형들이 있다. 불변영역의 변경은 일반적으로 보체고정, 구성원들과의 상호작용 및 다른 이펙터 기능들과 같은 특징들을 개선하거나 변경하기 위해 만들어질 것이다. 가변영역의 변경은 항원 결합 특징들을 개선하기 위해 만들어질 것이다.

항체에 더하여, 면역글로불린이, 예를 들어 단쇄 또는 Fν, Fab, 및 (Fab')2뿐만 아니라, 디아체(diabody), 선형 항체, 다가 또는 다-특이적 하이브리드 항체를 포함하는 다양한 다른 형태로(상기 설명된 바와 같으며, 보다 구체적인 사항은 Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987) 참조), 그리고 단쇄(예를 들어, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) 및 Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), 이것은 본원에 참고자료로서 인용된다) 형태로 존재할 수 있다(일반적으로, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N. Y., 2nd ed. (1984), 및 Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)를 참조하며, 이것들은 본원에 참고자료로서 인용된다).

본원에 사용된 용어 "단쇄 Fν", "단쇄 항체", "Fν" 또는 "scFν"는 하나의 폴리펩티드 사슬 안에 중쇄와 경쇄 모두로부터의 가변영역을 포함하며 불변영역은 없는 항체 단편을 말한다. 일반적으로, 단쇄 항체는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하며, 이로써 항원 결합을 허용하는 바람직한 구조를 형성하는 것이 가능해진다. 단쇄 항체는 Pluckthun의 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)에서 상세히 논의되며, 또한 본원에 참고자료로서 인용되는 국제특허출원 공보 WO 88/01649, 및 미국특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조한다. 특정 구체예에서, 단쇄 항체는 또한 2-특이적일 수 있고 및/또는 인간화될 수 있다.

"Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 C.sub.H1 및 가변영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.

"Fab' 단편"은 하나의 경쇄와 CH1과 CH2 도메인 사이에 더 많은 불변영역을 함유하는 하나의 중쇄를 함유하며, 이로써 두 중쇄 사이에서 사슬간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.

"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄와 CH1과 CH2 도메인 사이에 불변영역의 일부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이로써 두 중쇄 사이에서 사슬간 이황화 결합이 형성된다.

부정확한 분석방법(예를 들어, 겔 전기영동)에 의해 측정된 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로서 이해될 것이다. 이러한 값이 "약" X 또는 "대략" X로서 표현되었을 때, X의 서술된 값은 ±10%까지 정확한 것으로 이해될 것이다.

본원에 인용된 모든 참고문헌들은 그 전문이 참고자료로서 포함된다.

본 발명은 IL-31에 대한 길항제로서 항체를 사용하고, 이로써 일반적인 염증 및 피부염과 소양성 질환의 증상이 억제됨을 발견한 것에 일부 기초한다. 본 발명은 피부염과 소양성 질환의 효과를 억제, 감소, 예방, 또는 최소화하기 위한 단클론성 항체의 사용을 제공하며, 이에 대해서는 본원에서 더 설명된다. 한 구체예에서, 피부염은 아토피 피부염이다. 다른 구체예에서, 피부염은 결절성 양진이다. 또 다른 구체예에서, 피부염은 습진이다. IL-31은 새로 발견된 T 세포 사이토카인으로서, 마우스에서 과발현되었을 때 피부염-유사 증상을 가져온다. 또한, Dillon et al., Nature Immunol. 5:752-760, 2004를 참조한다. 피부-귀소 T 세포와 표피 각질세포는 모두 인간에서 피부질환의 병리학에 관련되었다. IL-31 mRNA 및 단백질의 발현은 아토피 피부염(AD) 환자와 정상 개체에서 모두 피부-귀소 CLA+ T 세포 집단에만 한정되며, 면역조직화학법(IHC)에 의한 IL-31 수용체인 IL-31RA의 분석은 정상 개체와 비교했을 때 급성 및 만성 AD 환자로부터의 피부 생검시 피부 각질조직에서의 IL-31RA의 발현 수준이 약간 더 높다는 것을 시사한다.

IL-31은 공개된 미국특허출원에서는 Zcyto17rlig로서 이미 설명된 사이토카인의 HUGO 명칭이다(공개번호 제20030224487호, Sprecher, Cindy et al., 2003 참조, 본원에 참고자료로서 인용됨). 또한, Dillon, et al., Nature Immunol.(상동)을 참조한다. IL-31의 헤테로다이머 수용체가 zcytor17(HUGO 명칭, IL-31RA)로서 20030224487에서 또한 설명되었는데, 이것은 OncostatinM 수용체 베타(OSMRbeta)와 헤테로다이머를 형성한다. IL-31은 활성화된 인간 말초혈 세포(hPBC)로부터 발생한 cDNA 라이브러리로부터 분리되었으며, 이것은 CD3에 대해서 선별되었다. CD3는 림프양 기원의 세포, 특히 T 세포에 특유한 세포 표면 마커이다. 인간 IL-31의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 SEQ ID NO:1 및 2에 나타낸다. 뮤린 IL-31의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 각각 SEQ ID NO:10 및 11에 나타낸다. 본원에 사용된 용어 IL-31은 상기 나타낸 미국특허 공개번호 제20030224487호에서 사용된 IL-31을 의미한다. IL-31의 분비신호 서열은 아미노산 잔기 1(Met)에서 23 (Ala)로 이루어지고, 성숙 폴리펩티드는 아미노산 잔기 24(Ser)에서 164(Thr)로 이루어진다(SEQ ID NO:2에 나타냄). 더 나아가, 293T 세포로부터 정제된 IL-31의 N-말단 서열분석에서는 SEQ ID NO:2에 나타낸 바와 같이 잔기 27(Leu)에 N-말단이 보였으며, 성숙 폴리펩티드는 아미노산 잔기 27(Leu)에서 164(Thr)로 이루어졌다(SEQ ID NO:2에 나타냄).

IL-31RA(IL-31 수용체)의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:5에, OncostatinM 수용체 베타(OSMRbeta)의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:7에 나타낸다.

IL-31RA 및 OSMRbeta 수용체는, 제한되는 것은 아니지만, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF 및 G-CSF를 포함하는 제 I 부류 사이토카인 수용체 서브패밀리에 속한다(Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" in Cytokine 5(2):95-106, 1993 참조). IL-31RA 서브유닛은 공동 소유 PCT 특허출원 제US01/20484호(WIPO 공개번호 WO02/00721)에 충분히 설명된다. IL-31RA 서브유닛의 mRNA의 조직분포 분석에 의해 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브셋, CD14+ 단핵구에서의 발현과, CD19+ B 세포에서의 약한 발현이 드러났다. 더욱이, mRNA는 휴지기의 또는 활성화된 단핵구 셀라인인 THP-1(ATCC No. TIB-202), U937(ATCC No. CRL-1593.2) 및 HL60(ATCC No. CCL-240)에서도 모두 존재하였다.

본원에 설명된 IL-31 길항제에 의한 신호전달의 억제, 중화, 차단은 당업자가 알고 있는 많은 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 증식감소를 측정하는 분석법은 AlamarBlue™(AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983); 3,(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-3-카르복시메톡시페닐-2H-테트라졸륨; 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-술포페닐)-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨 히드록시드; 및 시아노디톨릴-테트라졸륨 클로라이드(이것들은 Polysciences, Inc., Warrington, PA에서 시중 구입가능하다)와 같은 염료의 환원 분석; 3H-티미딘의 결합 측정과 같은 유사분열 분석; 예를 들어 나프탈렌 블랙 또는 트립판 블루를 이용한 염료배제 분석; 디아세틸 플루오레세인을 이용한 염료흡수; 및 크롬 방출을 포함한다. 일반적으로, 본원에 참고자료로서 인용되는 Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994를 참조한다. 상기에 더하여, IL-31RA 및 전장 OSMRbeta를 발현하는 BaF3 세포의 예에 대해서는 공개된 미국특허 공개번호 제20030224487호(Sprecher, Cindy et al., 2003)를 참조한다.

일반적으로, 사이토카인은 4개의 알파 나선 구조를 가질 것으로 예상되는데, 나선 A, C 및 D가 리간드-수용체 상호작용에서 가장 중요하며, 이 패밀리의 일원들 중에서 더 많이 보존된다. SEQ ID NO:2에 나타낸 인간 IL-31 아미노산 서열에 관하여, 인간 IL-31, 인간 IL-3, 및 인간 사이토카인 아미노산 서열의 정렬에서, SEQ ID NO:2에 나타낸 대로, IL-31 나선 A는 아미노산 잔기 38-52에 의해; 나선 B는 아미노산 잔기 83-98에 의해, 나선 C는 아미노산 잔기 104-117에 의해; 그리고 나선 D는 잔기 137-152에 의해 한정되는 것으로 예측된다. 구조분석은 A/B 루프가 길고 B/C 루프가 짧으며 C/D 루프가 긴 것을 시사한다. 이 루프 구조는 업-업-다운-다운 나선 조직을 가져온다. 4개 나선 번들 구조에 기초하여, 보존된 IL-31 안의 시스테인 잔기는 본원에 설명된 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 72, 133, 및 147; 그리고 SEQ ID NO:11의 74, 137, 및 151에 해당한다. 일관된 시스테인 배치에 의해 4개 나선 번들 구조가 더 확인된다. 또한, SEQ ID NO:2에 나타낸 잔기 43의 Glu 잔기가 IL-31에서 매우 잘 보존된다. IL-31의 이들 나선은 동족 수용체를 통해 IL-31 신호화의 효과를 차단하는 본원에 설명된 항체에 의한 억제, 감소 또는 중화에 대한 특이적 표적일 수 있다.

인간과 뮤린 IL-31의 서열비교에 기초하여, 보존된 잔기는 알파 나선 C 및 D를 암호화할 것으로 예상된 영역에서 발견되었다. 본원에 설명된 인간 IL-31 폴리펩티드 영역, 도메인, 모티프, 잔기 및 서열을 암호화하는 상응하는 폴리뉴클레오티드를 SEQ ID NO:1에 나타낸다. IL-31의 이들 나선은 동족 수용체를 통해 IL-31 신호화의 효과를 차단하는 본원에 설명된 항체에 의한 억제, 감소 또는 중화에 대한 특이적 표적일 수 있다.

나선 D도 인간과 뮤린 IL-31 사이에서 비교적 보존되는 편이지만, 나선 C가 가장 잘 보존된다. 두 종 모두 이 영역에서 산성 아미노산을 우세하게 가지지만, IL-31과 모노머, 헤테로다이머 또는 멀티머 수용체를 포함하는 IL-31의 수용체 IL-31RA 사이의 상호작용에는 종 특이성을 고려한 차이가 있을 수 있다. IL-31의 루프 A/B와 나선 B는 최저로 보존되고, 나선 C는 루프 C/D를 통해 나선 D 쪽으로 종들 사이에서 가장 잘 보존되는데, 이 영역을 통한 보존은 그것이 기능적으로 유의함을 시사한다. 인간 및 뮤린 IL-31의 나선 D도 또한 보존된다. IL-31RA 수용체 길항제는 IL-31 나선 D 안의 돌연변이를 통하여 설계될 수 있다. 이것들은 잔기 Thr156(SEQ ID NO:2)에서부터 단백질의 절단, 또는 리간드와 수용체의 결합에 기여하지만 신호화 활성은 감퇴시키는 잔기들의 보존을 포함할 수 있다.

본원에 설명된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 및 RNA를 포함함)의 제조법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 전체 RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트로 추출 한 후, CsCl 구배로 원심분리에 의해 분리하는 것을 이용하여 제조될 수 있다(Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). 폴리 (A)+ RNA는 Aviv 및 Leder 방법을 이용하여 전체 RNA로부터 제조된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). 상보성 DNA(cDNA)는 공지된 방법을 이용하여 폴리 (A)+ RNA로부터 제조된다. 대안으로서 게놈 DNA가 분리될 수 있다. 다음에, IL-31 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가, 예를 들어 혼성화 또는 PCR에 의해 확인 및 분리된다.

IL-31의 마우스 오르토로그의 폴리뉴클레오티드 서열이 확인되었고, SEQ ID NO:3에 나타낸다. 마우스 IL-31의 성숙한 서열은 SEQ ID NO:4에 나타낸 대로 잠정적으로 Met1에서 시작하며, 이것은 SEQ ID NO:2에 나타낸 인간 서열에서 Met1에 해당한다. 조직분석에 의하여 마우스 IL-31의 발현이 고환, 뇌, CD90+ 세포, 전립선 세포, 침샘 및 피부에서 발견된다는 것이 밝혀졌다. 더 나아가, 293T 세포로부터 정제된 IL-31의 N-말단 서열분석에 의해 SEQ ID NO:4에 나타낸 대로 N-말단이 잔기 31(Ala)에 있으며, 성숙한 폴리펩티드는 아미노산 잔기 31(Ala)에서 163(Cys)(SEQ ID NO:4에 나타냄)으로 이루어졌다는 것이 밝혀졌다

SEQ ID NO:2에 나타낸 IL-31 단백질 서열에 대한 Hopp/Woods 친수성 프로파일이 발생될 수 있다(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth., 88:1-18, 1986 및 Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). 이 프로파일은 슬라이딩 6-잔기 윈도우에 기초한다. 매장된 G, S, 및 T 잔기와 노출된 H, Y, 및 W 잔기가 무시되었다. 예를 들어, 인간 IL-31에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 54-59, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 129-134, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 53-58, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 35-40 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 33-38을 포함한다. 예를 들어, 마우스 IL-31에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 34-39, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 46-51, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 131-136, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 158-163 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 157-162를 포함한다.

당업자는 전체적인 구조 및 생물학적 프로파일이 파괴되지 않도록 친수성 또는 소수성이 IL-31 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형을 설계할 때 고려될 것임을 인정할 것이다. 치환을 위해 특히 관심 있는 것은 Val, Leu 및 Ile로 구성되는 군이나, Met, Gly, Ser, Ala, Tyr 및 Trp로 구성되는 군에서 선택된 소수성 잔기들이다. 예를 들어, 치환을 견디는 잔기는 SEQ ID NO:2에 나타낸 Val, Leu 또는 Ile, 또는 Met, Gly, Ser, Ala, Tyr, 및 Trp 잔기로 구성된 군을 포함할 수 있다. SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:11 내의 위치들에 있는 보존된 시스테인 잔기들은 상대적으로 치환을 견디지 못할 것이다.

또한, 본 발명은 IL-31 폴리펩티드의 기능적 단편들 및 이러한 기능적 단편들을 암호화하는 핵산 분자와 결합하는 항체를 포함한다. 본원에서 정의된 "기능적" IL-31 또는 그것의 단편은 증식 또는 분화 활성, 특수한 세포 기능을 유도 또는 억제하는 능력, 또는 항-IL-31 항체 또는 IL-31RA 또는 이들 수용체(가용성 또는 고정된)의 항체 또는 IL-31RA/OSMRbeta 헤테로다이머에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 한다. 앞서 본원에서 설명된 대로, IL-31은 SEQ ID NO:2에 나타낸나선 A(아미노산 잔기 38-52), 나선 B(아미노산 잔기 83-98), 나선 C(아미노산 잔기 104-117) 및 나선 D(아미노산 잔기 137-152)를 포함하는 4개 나선 번들 구조를 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 (a) 상기 설명된 나선들 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드 분자; 및 (b) 이들 나선들 중 하나 이상을 포함하는 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 더 제공한다. 융합 단백질의 나머지 폴리펩티드 부분은 또 다른 4개 나선 번들 사이토카인, 예를 들어 IL-15, IL-2, IL-4 및 GM-CSF에 의해, 또는 융합 단백질의 분비를 촉진하는 비-본래 및/또는 미관련 분비신호 펩티드에 의해 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 설명된 IL-31 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드와 결합하는 항체를 제공한다. 이러한 단편이나 펩티드는 전체 단백질이 면역원으로서 사용될 때 항체반응을 도출하는 단백질의 일부인 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프-보유 펩티드는 표준방법을 이용, 확인될 수 있다(예를 들어, Geysen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 81:3998 (1983) 참조). 이들 기능적 단편과 항체의 결합은 동족 수용체에서 IL-31의 신호전달의 억제, 차단, 중화, 및/또는 감소를 가져온다.

반대로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역인 "항원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 어떤 에피토프는 아미노산의 선형 또는 연속 스트레치로 구성되며, 이러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의해 파괴되지 않는다. 단백질의 에피토프를 의태할 수 있는 비교적 짧은 합성 펩티드를 사용하여 단백질에 대한 항체의 생산을 자극할 수 있다는 것이 본 분야에 공지되어 있다(예를 들어, Sutcliffe et al., Science, 219:660 (1983) 참조). 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명된 폴리펩티드와 결합하는 항체(예를 들어, 중화 항체)를 발생시키는데 유용하다. Hopp/Woods 친수성 프로파일을 사용하여 최대의 항원성 잠재력을 갖는 영역을 측정할 수 있다(Hopp et al., 1981(상동) 및 Hopp, 1986(상동)). 예를 들어, 인간 IL-31에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 54-59, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 129-134, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 53-58, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 35-40 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 33-38을 포함한다. 예를 들어, 마우스 IL-31에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 34-39, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 46-51, SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 131-136, SEQ ID NO: 11의 아미노산 잔기 158-163 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 157-162를 포함한다.

항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 적어도 4개 내지 10개의 아미노산, 적어도 10개 내지 14개의 아미노산, 또는 약 14개 내지 약 30개의 아미노산을 함유한다. 이러한 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 IL-31 폴리펩티드의 단편화, 또는 화학적 펩티드 합성에 의해 생산될 수 있으며, 이에 대해서는 본원에서 설명된다. 더욱이, 에피토프는 무작위 펩티드 라이브러리의 파지디스플레이에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); 및 Cortese et al, Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996) 참조). 에피토프를 포함한 작은 펩티드로부터 에피토프를 확인하고 항체를 생산하는 표준방법은, 예를 들어 Mole, "Epitope Mapping" in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson(ed.), pages 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Pep-tide-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), 그리고 Coligan et al., (eds.), Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5 및 pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)에 설명된다.

본원에 설명된 항체의 활성은 IL-31RA 수용체를 발현하는 세포의 증식 및/또는 이 세포와의 결합을 측정하는 다양한 분석법을 이용하여 증식을 억제하거나, 감소시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 특히 관심 있는 것은 IL-31-의존성 세포의 변화이다. IL-31 의존성이 되도록 조작된 적합한 셀라인은 IL-3-의존성 BaF3 셀라인(Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986), FDC-P1(Hapel et al., Blood 64:786-790, 1984), 및 MO7e(Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993)를 포함한다. 공개된 방법에 따라서 성장인자-의존성 셀라인이 확립될 수도 있다(예를 들어. Greenberger et al., Leukemia Res., 8:363-375, 1984; Dexter et al., in Baum et al. Eds., Experime-ntal Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol., 1979, 145-156, 1980).

본원에 설명된 항-IL-31 항체의 활성은 수용체 결합 및 이어진 생리학적 세포반응과 관련된 세포외 산성화 속도 또는 양성자 배설을 측정하는 규소-기반 바이오센서 마이크로피지오미터에 의해서 측정될 수 있다. 전형적인 장치는 Molecular Devices(Sunnyvale, CA)에 의해 제조된 Cytosensor™ 마이크로피지오미터이다. 증식, 이온수송, 에너지 생산, 염증반응, 조절성 및 수용체 활성화 등과 같은 다양한 세포반응이 이 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzvmol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998을 참조한다.

길항제는 또한 리간드-수용체 상호작용 부위를 특성화하기 위한 연구 시약으로서도 유용하다. 길항제는 조혈을 조절하는데 연루되는 세포들의 확장, 증식, 활성화, 및/또는 분화를 억제하는데 유용하다. IL-31 활성의 억제제(IL-31 길항제)는 항-IL-31 항체 및 가용성 IL-31 수용체뿐만 아니라, 다른 펩티드 및 비-펩티드 제제(리보자임을 포함함)를 포함한다.

IL-31의 활성의 억제는 많은 분석법에 의해서 측정될 수 있다. 본원에 개시된 분석법들에 더하여, 수용체 결합, IL-31-의존성 세포반응의 자극/억제 또는 IL-31RA 수용체-발현 세포의 증식을 측정하도록 설계된 다양한 분석법들의 범위 안에서 IL-31 활성의 억제에 대해 샘플이 시험될 수 있다.

또한, IL-31-결합 폴리펩티드는 리간드의 정제에 사용될 수도 있다. 폴리펩티드가 사용 조건에서 접합한 아가로스, 교차결합 아가로스, 유리, 셀룰로오스 수지, 실리카-기재 수지, 폴리스티렌, 교차결합 폴리아크릴아미드 등의 재료로 된 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정된다. 폴리펩티드와 고체 지지체를 연결하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 아민 화학, 브롬화 시아노겐 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 및 히드라지드 활성화를 포함한다. 결과의 매질은 일반적으로 칼럼의 형태로 구성될 것이며, 리간드를 함유하는 유체가 한 번 이상 칼럼을 통과하여 리간드와 수용체 폴리펩티드가 결합할 수 있게 될 것이다. 다음에, 염의 농도, 핵산분리제(chaotropic agent)(구아니딘 HCl), 또는 pH를 변화시킴으로써 리간드-수용체 결합이 파괴되어 리간드가 용리된다.

유리하게, 리간드-결합 수용체(또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편과 시중에서 구입가능한 바이오센서 기기(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 이용하는 분석시스템이 사용될 수 있다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편이 수용체 칩의 표면 위에 고정된다. Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 및 Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993에 이 기기의 이용이 개시된다. 수용체, 항체, 구성원 또는 단편은 플로우 셀 안의 금 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 아민 또는 술프히드릴 화학을 이용하여 공유 부착된다. 시험 샘플이 이 셀을 통과한다. 만일 리간드, 에피토프 또는 보체/항-보체 쌍의 대립 구성원이 샘플에 존재한다면, 그것은 고정된 수용체, 항체 또는 구성원에 각기 결합하여 배지의 굴절률에 변화를 일으킬 것이고, 이것이 금 필름의 표면 플라스몬 공명의 변화로서 검출된다. 이 시스템에 의해 온-레이트(on-rate) 및 오프-레이트(off-rate)의 측정이 가능하며, 이것으로부터 결합 친화성이 계산될 수 있고, 결합의 화학량론이 평가된다. 대안으로서, 리간드/수용체 결합은 SELDI™ 기술(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)을 이용하여 분석될 수도 있다.

IL-31 항체는 전-염증성 IL-31의 생물학적 작용을 차단하는데 사용될 수 있으며, 본원에 설명된 다양한 질환에서 항염 치료제로서 유용하다. 당업자는 항원성 에피토프-보유 폴리펩티드가 IL-31 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO:2)의 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 9개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개 내지 약 30개의 연속 아미노산 잔기를 함유한다는 것을 인정할 것이다. IL-31 폴리펩티드의 더 큰 부분, 즉 아미노산 서열의 30개 내지 100개 잔기에서부터 전체 길이까지를 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 항원 또는 면역원성 에피토프는 부착 택, 애쥬번트, 비히클 및 담체를 포함할 수 있으며, 이에 대해서는 본원에서 설명된다. 적합한 항원은 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 24에서부터 아미노산 번호 164에 의해, 또는 이것의 여녹하는 9개 내지 141개 아미노산 단편에 의해 암호화된 IL-31 폴리펩티드를 포함한다. 다른 적합한 항원은 전장 및 성숙한 IL-31, 나선 A-D, 및 IL-31의 4개 나선 번들 구조의 각 나선 또는 복수 나선 A, B, C, 및 D를 포함하며, 이에 대해서는 본원에 설명된다. 항원으로서 사용하기 바람직한 펩티드는 본원에 설명된 대로 친수성 플롯으로부터 당업자에 의해 예측된 것들과 같은 친수성 펩티드이며, 예를 들어 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 및 158-162; 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 잔기 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 및 157-162이다. 더욱이, 예를 들어 DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc. Madison, WI)을 이용하여 Jameson-Wolf 플롯에 의해 예측된 IL-31 항원성 에피토프가 바람직한 항원으로서 사용되며, 이것은 당업자에 의해 쉽게 측정된다.

이들 항원으로 동물을 접종함으로써 발생한 면역반응으로부터의 항체가 본원에 설명된 대로 분리되어 정제될 수 있다. 다클론성 및 단클론성 항체를 제조하고 분리하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al.(eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc. 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 및 Hurrell, J.G.R., Ed., Mono-clonal Hvbridoma Antibodies: Techniques and Applications. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982를 참조한다.

당업자들에게 명백하듯이, 다클론성 항체는 IL-31 폴리펩티드 또는 그것의 단편으로 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 및 래트와 같은 다양한 온혈동물들을 접종함으로써 발생할 수 있다. IL-31 폴리펩티드의 면역원성은 명반(수산화 알루미늄) 또는 프레운드(Freund) 완전 또는 불완전 애쥬번트와 같은 애쥬번트의 사용에 의해 증가될 수 있다. 또한, 면역화에 유용한 폴리펩티드는 IL-31 또는 그것의 일부와 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질의 융합체와 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전장 분자 또는 그것의 일부분일 수 있다. 만일 폴리펩티드의 일부분이 "합텐-유사형"이라면, 이러한 부분이 면역화를 위해 거대분자 담체(예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드)에 결합되거나 연결되는 것이 유리할 수 있다.

1) 항체가 역치 수준의 결합 활성을 나타내고, 2) 항체가 관련된 폴리펩티드 분자들과 유의한 교차반응을 나타내지 않는 경우에, 항체는 특이적으로 결합된다고 생각된다. 결합의 역치 수준은, 본원의 항-IL-31 항체가 대조표준(비-IL-31) 폴리펩티드에 대한 결합 친화성에 비해 적어도 10배 이상의 친화성으로 IL-31 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합할 경우 측정된 것이다. 항체는 10⁶ M^-1 이상, 바람직하게는 10⁷ M^-1 이상, 더 바람직하게는 10⁸ M^-1 이상, 가장 바람직하게는 10⁹ M^-1 이상의 결합 친화성(Ka)을 나타내는 것이 바람직하다. 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 Scatchard 분석에 의해 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다(Scatchard, G. Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

항-IL-31 항체가 관련된 폴리펩티드 분자들과 유의하게 교차반응하지 않는지의 여부는, 예를 들어 표준 웨스턴 블롯 분석(Ausubel et al., 상동)을 이용하여 IL-31 폴리펩티드를 검출하지만 기지의 관련된 폴리펩티드들은 검출하지 않는 항체에 의해 밝혀진다. 기지의 관련된 폴리펩티드들의 예는 기지의 오르토로그, 및 파라로그와 같은 선행기술에서 개시된 것들, 및 단백질 패밀리의 유사한 기지 구성원들이다. 또한, 스크리닝이 비-인간 IL-31, 및 IL-31 돌연변이 폴리펩티드를 사용하여 행해질 수 있다. 더욱이, 항체는 기지의 관련된 폴리펩티드들에 "대해 스크리닝"될 수 있으며, 이로써 IL-31 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 집단이 분리된다. 예를 들어, IL-31에 대해 발생한 항체는 불용성 매트릭스에 점착된 관련된 폴리펩티드들에 흡착되며, IL-31에 특이적인 항체가 적합한 버퍼 조건 하에서 매트릭스를 통해 흐를 것이다. 스크리닝에 의해 기지의 밀접히 관련된 폴리펩티드들에 대해 비-교차반응성인 다클론성 및 단클론성 항체를 분리하는 것이 가능하다(Anti-bodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특정 항체의 스크리닝 및 분리는 본 분야에 잘 공지되어 있다. Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol., 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984 참조. 항-IL-31 항체에 대한 특이적 결합은 아래 개시되는 본 분야의 많은 방법에 의해서 검출될 수 있다.

단클론성 항체는, 예를 들어, 본원에 열거된 발현시스템으로부터 생산된 정제된 성숙한 재조합 인간 IL-31 폴리펩티드(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 27(Leu)에서 167(Thr)) 또는 마우스 오르토로그를 사용하여 Sprague-Dawley 래트(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 래트에는 각각 완전 프레운드 애쥬번트(Pierce, Rockford, IL) 중의 정제된 인간 재조합 IL-31 단백질 100㎍의 초기 복강내(IP) 주사가 제공된 다음, 2주마다 불완전 프레운드 애쥬번트 중의 정제된 재조합 단백질 50㎍의 부스터 IP 주사가 제공된다. 3차 부스터 주사 투여 후 7일 내지 10일째에 동물에서 채혈하여 혈청을 수집한다.

인간 IL-31-특이적 래트 혈청 샘플을 특이적 항체 표적 바이오틴화 인간 IL-31에 대한 역가에 대해 ELISA에 의해 특성화한다.

2마리의 높은 역가 래트로부터 비장세포와 림프절 세포를 수거하고, 별개의 두 융합 과정에 따라서 PEG 1500을 사용하여 SP2/0(마우스) 골수종 세포에 융합시킨다(융합비 4:1, 비장세포 대 골수종 세포, "Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow and D.Lane, Cold Spring Harbor Press). 융합 후 10일간 성장시킨 다음, 특이적 항체-생산 하이브리도마 풀을 ELISA에 의해 확인한다. ELISA 프로토콜 모두에서 양성인 하이브리도마 풀을 정제된 재조합 IL-31의 수용체 결합 활성을 차단 또는 감소시키는 능력에 대해 더 분석("중화 분석")한다.

ELISA에만 의해, 또는 ELISA와 "중화 분석" 모두에 의해 양성 결과를 제공하는 하이브리도마 풀을 제한 희석에 의해 적어도 두 번 클로닝한다.

조직배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를 재조합 및 본래 인간 IL-31의 정량결정을 위한 ELISA에서의 그들의 유용성에 대해 특성화한다. 항체를 선별하여 정량분석을 전개한다.

조직배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를 BaF3/MPL-IL-31 세포에서 정제된 재조합 huIL-31의 수용체 결합 활성을 차단 또는 감소시키는 능력에 대해 특헝화한다("중화 분석"). 이 방식으로 "중화" 단클론성 항체의 수를 확인한다. 다음에, 설명된 인간 IL-31에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마는 부다페스트 조약하의 원 기탁물로서 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 기탁될 수 있다.

단클론성 항체는 절단, 정제된 IL-31 재조합 융합 단백질을 사용하여 Lewis 래트(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 래트에는 각각 완전 프레운드 애쥬번트(Pierce, Rockford, IL) 중의 정제된 재조합 융합 단백질 100㎍의 초기 복강내(IP) 주사가 제공된 다음, 4주 동안 2주마다 불완전 프레운드 애쥬번트 중의 정제된 재조합 단백질 50㎍의 부스터 IP 주사가 제공된다. 최초 4주간의 면역화 후, 불완전 프레운드 중의 담체 단백질인 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH, Pierce, Rockford, IL)에 커플링된 절단, 정제된 재조합 단백질 50ug의 부스터 IP 주사를 4주 동안 2주마다 투여한다. 4차 부스터 주사의 투여 후 7일 내지 10일째에 동물에서 채혈하여 혈청을 수집했다. IL-31-특이적 래트 혈청 샘플을 특이적 항체 표적으로서 정제된 재조합 융합 단백질 IL-31-Fc와 비-특이적 항체 표적으로서 관련없는 융합 단백질을 500ng/mL씩 사용하여 ELISA에 의해 특성화한다. 한 마리 이상의 높은 역가 래트로부터 비장세포를 수거하고, 최적화된 PEG-매개 융합 프로토콜(Rockland Immunochemicals)에 따라서 SP2/0(마우스) 골수종 세포와 융합시킨다. 융합 후 12일간 성장시킨 다음, 특이적 항체-생산 하이브리도마 풀을 특이적 항체 표적으로서 정제된 IL-31 재조합 융합 단백질과 비-특이적 항체 표적으로서 관련없는 융합 단백질을 각각 500ng/mL씩 사용하여 ELISA에 의해 확인한다. 특이적 항체 표적에만 양성인 하이브리도마 풀을 BaF3/MPL-IL-31 세포에서 수용체 결합 활성을 차단 또는 감소시키는 재조합 huIL-31의 능력("중화 분석") 및 FACS 분석에 의해 항체 표적으로서 결합하는 능력에 대해 더 분석한다. ELISA 분석에서 특이적 양성 결과를 제공하는 하이브리도마 풀과 FACS 또는 "중화 분석"에서 양성 결과를 제공하는 하이브리도마 풀을 제한 희석에 의해 적어도 두 번 클로닝한다.

유사한 방식으로 5개의 래트 항-마우스 하이브리도마가 발생하였으며, 다음의 클론 칭호가 주어졌다: 클론 271.9.4.2.6, 클론 271.26.6.6.1, 클론 271.33.1. 2.2, 클론 271.33.3.2.1, 및 클론 271.39.4.6.5. 실시예 1 참조. 이들 클론에 의해 생산된 단클론성 항체들을 비닝(binning)(즉, 각 항체가 어떤 다른 결합의 결합을 억제할 수 있는지를 측정하는 것), 상대적 친화성, 및 중화를 포함하는 많은 방식으로 특성화했다. 단클론성 항체들은 나머지 4개보다도, 분리된 에피토프에 대해 클론 271.33.3.2.1의 결합을 갖는 다른 두 결합에 속하는 것으로 나타난다. 이들 단클론성 항체 중 4개에 대한 상대적 결합 친화성이 실시예 14에 설명된다.

단클론성 항체의 결합 친화성이 발생할 수 있다. 염소-항-래트 IgG-Fc 감마 특이적 항체(Jackson)을 CM5 Biacore 칩 위에 고정한다. 이 분석법은 항-래트 포착면 위에 각 mAb가 결합하도록 최적화되며, 그 다음 일련의 농도의 IL-31을 mAb를 가로질러 주사하여 회합(Ka) 및 해리(Kd)를 나타낸다. 각 작업 후에, 20mM HCl을 두 번 주사하여 항-래트 항체에 알맞게 표면을 다시 재생시킨다. 각각에 대한 데이터가 생성되며, 평가 소프트웨어(BIAevaluation 소프트웨어 버전 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Sweden)를 사용하여 IL-31 단백질에 대한 항-IL-31 항체 결합의 반응속도학을 평가한다.

뮤린 항-인간 IL-31 mAb가 다음과 같이 발생할 수 있다. 6주 내지 12주 된 IL-31 녹아웃 마우스를 Ribi 애쥬번트와 1:1(v:v) 혼합된 가용성 인간 IL-31-muFc 단백질 25-50ug를 사용하여 주 2회의 일정에 따라 복강내 주사에 의해 면역화한다. 3차 면역화 후 7일 내지 10일째에 안와후에서 출혈시켜 혈액 샘플을 채혈하여 혈청을 수거하고, 중화 분석(예를 들어, 본원에 설명된)으로 IL-31의 결합을 억제하는 능력과, FACS 염색 분석으로 IL-31 핵산절단감염(transfection)된 293 세포 대 핵산전달감염되지 않은 293 세포를 염색시키는 능력을 평가했다. 중화 역가가 평탄역에 도달할 때까지 마우스를 계속 면역화하고 혈액 샘플을 채혈하여 상기 설명된 대로 평가했다. 평탄역에 도달했을 때 최고 중화 역가를 갖는 마우스들에 PBS 중의 가용성 IL-31-Fc 단백질 25-50ug을 혈관내 주사한다. 3일 후, 이들 마우스로부터 비장과 림프절을 수거하고, 이것을 사용하여 하이브리도마를 발생시키는데, 이 과정은, 예를 들어 마우스 골수종(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포나 본 분야의 다른 적합한 셀라인을 이용하여, 본 분야에 공지된 표준방법에 따라 행한다(예를 들어, Kearney, J.F. et al., J Immunol., 123:1548-50, 1979; 및 Lane, R.D. J. Immunol Methods, 81:223-8, 1985를 참조한다).

융합 후 8-10일째에 IL-31-muFc 단백질에 결합하는 능력에 대해서 하이브리도마 상청액에 대한 1차 스크리닝이 HRP-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 카파를 사용하여 ELISA에 의해 수행될 수 있으며, 2차 단계의 시약으로서 항-람다 경쇄를 사용하여 결합된 마우스 항체를 확인한다.

잠정적 항-IL-31 mAb에 의해 인식된 표적 분자 IL-31은 진정한 IL-31인지에 대한 생화학적 확인이 표준 면역침전법과 뒤이은 SDS-PAGE 분석 또는 웨스턴 블롯 과정에 의해 수행되며, 이 두 과정은 모두 IL-31 핵산전달감염된 Baf3 세포 대 핵산전달감염되지 않은 Baf3 세포로부터의 가용성 멤브레인 제조물을 이용한다. mAb가 가용성 IL-31-muFc 단백질을 특이적으로 면역침전시키는 능력이나, 이 단백질을 웨스턴 블롯팅하는에 능력에 대해 시험된다.

조직배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를 중화 분석에 의해 수용체와 결합하는 IL-31의 능력을 차단 또는 억제하는 능력에 대해 특성화했다. 이 방식에서 20개의 "중화" 단클론성 항체들이 확인되었다. 이들 중 10개는 1차 라운드 클로닝 후 "우수 중화제"로 확인되었다: 클론 292.72.3, 클론 292.118.6, 클론 292.63.5, 클론 292.64.6, 클론 292.84.1, 클론 292.109.4, 클론 292.12.3, 클론 292.51.5, 클론 292.39.5, 및 클론 292.105.4. 나머지 10개는 1차 라운드 클로닝 후 다음의 클론 칭호들이 지정되었다: 클론 294.35.2, 클론 294.146.5, 클론 292.152.4, 클론 292.154.4, 클론 294.154.5, 클론 294.35.3, 클론 291.78.4, 클론 294.155.6, 클론 294.158.5, 클론 294.163.2, 및 클론 294.144.3.

2차 라운드 클로닝을 통해 특이적 단클론성 항체들을 얻었고, 다시 중화 분석에 의해 수용체와 결합하는 IL-31의 능력을 차단 또는 억제하는 능력에 대해 특성화했다. "우수 중화제"에 대한 2차 라운드 클로닝 후 클론 칭호들은 다음과 같다: 클론 292.12.3.1, 클론 292.63.5.3, 클론 292.72.3.1, 클론 292.84.1.6, 클론 292.118.6.4, 클론 292.64.6.5.5, 클론 292.39.5.3, 클론 292.51.5.2, 클론 292. 109.4.4, 및 클론 292.105.4.1. 나머지 10개 중 6개는 다음의 클론 칭호들을 가진다: 클론 292.152.4.1, 클론 294.158.5.2, 클론 294.32.2.6.3, 클론 294.144.3.5, 클론 294.154.5.3, 및 클론 294.163.2.1.

상기 설명된 인간 IL-31에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마들이 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(ATCC: 버지니아 매너사스) 특허기탁기관에 원 기탁물로서 기탁되었고, 다음의 ATCC 수탁번호를 받았다: 클론 292.12.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6815); 클론 292.72.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6816); 클론 292.63.5.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6829); 클론 292.118.6.4(ATCC 특허기탁명 PTA-6830); 클론 294.163.2.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6831); 클론 292.84.1.6(ATCC 특허기탁명 PTA-6871); 클론 294.35.2.6.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6872); 클론 294.154.5.6(ATCC 특허기탁명 PTA-6875); 및 클론 294.144.3.5 (ATCC 특허기탁명 PTA-6873).

본원에 설명된 마우스 IL-31에 대한 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마가 부다페스트 조약하에 아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(ATCC: 버니지아 매너사스) 특허기탁기관에 원 기탁물로서 기탁되었고, 다음의 ATCC 수탁번호를 받았다: 클론 271.26.6.6.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6874)

이들 하이브리도마 클론들에 의해 생산된 단클론성 항체는 2mM L-글루타민, 100㎍/mL 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신 술페이트, 및 10% 태아 클론 I 혈청(Hyclone Laboratories)이 첨가된 90% 이스코베 변형 듈베코 배지의 성장배지에서 배양될 수 있다. 클론들은 2x10⁵ 세포/mL에서 배양을 시작, 37℃, 5-6% 일산화탄소 하에 1x10⁵ 내지 5x10⁵를 유지시켜 증식될 수 있다. 세포는 혈청 무함유 조건으로 옮겨져 적응될 수 있다. 세포는 냉동되고, 90% 혈청, 10% DMSO 중에서 액체질소 냉동장치의 증기상 중에 보관된다.

정제된 재조합 단백질 인간 IL-31의 존재하에 성장되었을 때 수용체 결합을 차단, 억제, 방지, 또는 감소시키는 능력에 대해 조직배양 배지 중의 단클론성 항체가 특성화된다. 예를 들어, 이들 클론에 의해 생산된 단클론성 항체는 비닝(즉, 각 항체가 어떤 다른 결합의 결합을 억제할 수 있는지를 측정하는 것), 상대적 친화성, 및 중화를 포함하는 많은 방식으로 특성화되었다. 10개의 우수 중화 항체는 동일한 빈에 들어가며, 나머지 단클론성 항체들은 3개의 다른 빈으로 분류되는 것으로 나타났다. 이에 더하여, 우수 중화 항체 중 8개는 IgG1 동형이고, 나머지 2개는 IgG2a 동형이다.

하이브리도마 상청액의 단클론성 항체들을 염소 항-뮤린 Fc pAb를 사용하여 포착한 다음, 바이오틴화 IL-31의 겉보기 결합 친화성(EC50)을 측정하였다. 이들 분석 조건하에 우수 중화제는 약 4ng/mL Bt-IL31의 EC50 값과 동등한 최저값을 가졌다. 이 약한 중화제의 겉보기 친화성은 약 10ng/mL 내지 236ng/mL Bt-IL31의 범위에 걸쳐 있다.

본원에 설명된 방법에 의해 발생된 단클론성 항체는 다양한 방법에 의해 중화에 대해서 시험될 수 있다. 예를 들어, 공개된 미국특허출원(공개번호 20030224 487, Sprecher, Cindy et al., 2003)에 설명된 루시페라제 분석이 사용될 수 있다. 이에 더하여, 중화는 리간드 및 단클론성 항체의 존재하에 케라티노사이트 배양물로부터의 TARC 및 MDC과 같은 전-염증성 케모카인의 생산 감소를 측정함으로써 시험될 수 있다. 또한, 중화는 본원에 설명된 생체내 모델에 의해 측정될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편들로서, 제한은 아니지만, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fνs (scFν), 단쇄 항체, 이황화-연결 Fνs(sdFν), 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편을 포함한다. 단쇄 항체들을 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변영역(들)을 단독으로 또는 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 전체 또는 부분과 조합하여 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 가변영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 어떤 조합을 또한 포함하는 항원-결합 단편을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 일특이성, 이특이성, 삼특이성, 또는 더 이상의 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 상이한 에피토프들에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지체 재료와 같은 이종성 에피토프에 모두 특이적일 수 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/ 05793; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); 미국특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,819호; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553(1992)을 참조한다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 항체들과 기능상 동등한 유전적으로 변경된 항체를 포함한다. 안정성 및/또는 치료학적 효능이 개선되도록 변형된 항체가 바람직하다. 변형된 항체의 예는 아미노산 잔기의 보존성 치환된 것들, 및 항원 결합 유용성을 나쁜 쪽으로 유의하게 변경시키지 않는 아미노산이 하나 이상의 결실 또는 추가된 것들을 포함한다. 치환은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서부터 치료학적 유용성이 유지되는 한에서 어떤 영역의 완전한 재설계까지에 이르는 범위일 수 있다. 본 발명의 항체는 번역 후(예를 들어, 아실화 및 인산화) 변형될 수 있거나, 또는 합성시(예를 들어, 표지기의 부착) 변형될 수 있다.

유전적으로 변경된 항체는 또한 항-IL-31 항체로부터 유래한 키메라 항체를 포함한다. 키메라 항체는 마우스 또는 래트에서 유래한 가변영역과 인간에서 유래한 불변영역을 포함하며, 이로써 키메라 항체는 반감기가 길어지고, 인간 피험자에 투여되었을 때 면역원성이 적어진다. 키메라 항체의 제조방법은 본 분야에 공지되어 있다. 이들 항체의 가변영역을 인간 IgG의 불변영역에 연결하여 원하는 키메라 항체를 형성할 수 있다.

본 발명에서 사용된 유전적으로 변경된 항-IL-31 항체는 본원에 설명된 항체의 인간화 버전을 포함한다. 인간화된 항체는 마우스 공여자 면역글로불린의 CDR과 인간 수용자 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 프레임워크를 포함한다. 인간화 항체의 제조방법은 미국특허 제5,301,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호; 그리고 제6,180,370호(각각 본원에 그 전문이 참고자료로서 인용됨)에 개시된다. 다음에, 이들 항체의 CDR을 어떤 선택된 인간 프레임워크에 접목시켜 원하는 인간화된 항체를 발생시킬 수 있으며, 이 과정은 본 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 항체는 이들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프(들) 또는 부분(들)에 관하여 설명되거나 특정될 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩티드 부분(들)은, 예를 들어 N-말단 및 C-말단 위치에 의해, 연속하는 아미노산 잔기의 크기에 의해, 또는 표 및 도면에 열거된 대로, 본원에 설명된 대로 특정될 수 있다. 또한, 본 발명의 어떤 에피토프 또는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체는 배제될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 또한 그것을 배제할 수도 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 폴리펩티드와 단클론성 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 경합 억제는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해, 예를 들어 본원에 설명된 경합결합 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 폴리펩티드와 본 발명의 단클론성 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 에피토프와 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공하며, 억제는 경합결합을 측정하는 본 분야에 공지된 어떤 방법, 예를 들어 본원에 설명된 면역분석법에 의해 측정된다. 바람직한 구체예에서, 이 항체는 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 에피토프와의 결합을 경쟁적으로 억제한다.

본 발명의 항체는 변형된, 즉 항체로부터 항-유전자형 반응이 발생하는 것을 방지하지 않는 어떤 타입의 분자를 항체에 공유부착함으로써 변형된 유도체들을 포함한다. 예를 들어, 제한은 아니지만, 항체 유도체는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단기들에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 연결 등에 의해 변형된 항체들을 포함한다. 수많은 화학적 변형들 중 어느 것이, 제한은 아니지만, 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사 합성 등을 포함하는 공지의 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가하여, 유도체는 하나 이상의 비-전형적인 아미노산을 함유할 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 포유류, 바람직하게 인간에서 15일 이상, 바람직하게는 20일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 또는 5개월 이상의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 가지는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 포유류, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 반감기가 증가된 결과, 포유류에서 상기 항체 또는 항체 단편의 혈청 역가가 더 높아지며, 이로써 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도가 줄어들고, 및/또는 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 농도가 감소한다.

생체내 반감기를 증가시킨 항체 또는 항체 단편은 당업자에게 공지된 기술에 의해 발생될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기를 증가시킨 항체 또는 항체 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 연루된다고 확인된 아미노산 잔기를 변형시킴으로써(예를 들어, 치환, 결실 또는 추가) 발생될 수 있다(예를 들어, 본원에 그 전문이 참고자료로서 인용되는 국제공보 WO 97/34631 및 WO 02/060919를 참조한다). 생체내 반감기를 증가시킨 항체 또는 항체 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 고 분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG) 같은 중합체 분자를 부착함으로써 발생될 수 있다. PEG는 다가 링커에 의해 또는 다가 링커 없이 상기 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 PEG의 부위-특이적 콘쥬게이션을 통해서, 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해서 상기 항체 또는 항체 단편에 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 손실이 최소화되는 선형 또는 분지형 중합체 유도화가 사용될 수 있다. 콘쥬게이션 정도는 SDS-PAGE 및 질량분광법에 의해 면밀히 모니터링될 수 있으며, 이로써 PEG 분자와 항체의 적절한 콘쥬게이션이 확보된다. 반응되지 않은 PEG는, 예를 들어 크기배제 또는 이온교환 크로마토그래피에 의해 항-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 수 있다.

본 방법에 의해 설계된 인간화 항체는 항원 결합이나 다른 면역글로불린 기능에 대해 실질적으로 영향이 없는 추가의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다는 것이 이해된다. 보존성 치환은 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr과 같은 의도된 조합을 말한다.

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체를 포함하는 인간화된 면역글로불린은 유전조작에 의해 구성된다. 이미 설명된 대부분의 인간화된 면역글로불린(Jones et al., op. cit.; Verhoeyen et al., op. cit.; Riechmann et al., op. cit.)은 특정한 인간 수용자 면역글로불린 사슬의 프레임워크와 동일한 프레임워크, 및 비-인간 공여자 면역글로불린 사슬로부터의 3개 CDR로 이루어진다. 구체적으로, 인간화된 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원과 결합하는 비-인간 종 항체로부터의 항체 분자이다.

본 발명은 인간화된 면역글로불린 사슬의 프레임워크 안의 한정된 수의 아미노산이 수용자가 아니라 공여자에서의 이들 위치에 있는 아미노산과 동일한 것으로 선택되어야 한다는 기준을 포함하며, 이로써 인간화된 면역글로불린 사슬을 포함하는 항체의 친화성이 증가된다.

본 발명의 항체는, 인간화된 항체를 생산하는 이전 수단(실시예에서처럼 CDR의 출처로서 마우스 항체를 이용하는)에서 친화성 손실에 기여하는 두 가지 원인이 다음의 (1)과 (2)인 모델에 일부 기초하여 발생된다:

(1) 마우스 CDR이 인간 프레임워크와 조합되었을 때, CDR에 가까운 프레임워크 안의 아미노산은 마우스 대신에 인간의 것이다. 이론에 부합되지는 않지만, 이들 변화된 아미노산은 CDR들을 약간 왜곡시킬 수 있는데, 왜냐하면 공여자 마우스 항체에서와는 다른 정전성 또는 소수성 힘을 야기하기 때문이며, 왜곡된 CDR은 공여자 항원에서 CDR이 그랬던 것처럼 항원과 효과적으로 접촉할 수 없을 것이다; 및

(2) CDR의 부분은 아니지만 CDR에 가까이 있는 원 마우스 항체의 아미노산(즉, 프레임워크의 일부분)은 친화성에 기여하는 항원과 접촉할 수 있다. 이들 아미노산은 항체가 인간화될 때 모든 프레임워크 아미노산이 인간의 것으로 되기 때문에 상실된다.

이들 문제를 피하고, 원하는 항원에 대해 매우 강한 친화성을 갖는 인간화된 항체를 생산하기 위하여, 본 발명은 인간화된 면역글로불린의 설계에서 다음 원리들 중 한 가지 이상을 이용한다. 또한, 이 기준은 단독으로, 또는 원하는 친화성 또는 다른 특징들을 달성하기 위해 필요에 따라 조합하여 사용될 수 있다.

한 원리는, 일반적인 것과는 달리 인간화될 공여자 면역글로불린과 상동성인 특정한 인간 면역글로불린으로부터의 수용자 프레임워크를 사용하거나, 아니면 많은 인간 항체들로부터의 콘센서스(consensus) 프레임워크를 사용하는 것이다. 예를 들어, 데이터 뱅크(예를 들어, 내셔날 바이오메디칼 리서치 파운데이션 프로테인 아이덴티피케이션 리소스)에 있는 인간 중쇄(또는 경쇄) 가변영역과 마우스 중쇄(또는 경쇄) 가변영역의 서열의 비교는 상이한 인간 영역들에 대한 상동성 범위가 전형적으로 약 40%에서 약 60-70%까지 크게 변한다는 것을 나타내고 있다. 수용자 면역글로불린으로서 공여자 면역글로불린의 중쇄(각기 경쇄) 가변영역과 가장 상동성인 인간 중쇄(각기 경쇄) 가변영역 중 하나를 선택함으로써, 공여자 면역글로불린에서 인간화된 면역글로불린으로 되면서 더 적은 아미노산이 변화될 것이다. 이로써, 이론에 부합되지는 않지만, CDR 근처에서 CDR의 입체형태를 왜곡시키는 아미노산이 변화될 기회가 더 적어진다고 생각된다. 더욱이, 인간화된 면역글로불린 사슬을 포함하는 인간화 항체의 정확한 전체적인 모양이 공여자 항체의 모양을 더욱 밀접하게 닮을 수 있기 때문에, CDR이 왜곡될 기회가 또한 줄어들게 된다.

전형적으로, 적어도 약 10 내지 20개의 개별 인간 중쇄로 이루어진 대표적인 콜렉션에서 3-5개의 가장 상동성인 중쇄 가변영역 서열들 중 하나가 중쇄 프레임워크를 제공하기 위한 수용자로서 선택될 수 있으며, 경쇄에 대해서도 유사하다. 바람직하게, 1-3개의 가장 상동성인 가변영역 중 하나가 사용될 것이다. 선택된 수용자 면역글로불린 사슬은 가장 바람직하게는 프레임워크 영역에서 공여자 면역글로불린에 대해 적어도 약 65%의 상동성을 가질 것이다.

많은 경우, 수용자 서열로서 동일한 인간 항체로부터의 경쇄 및 중쇄를 사용하는 것이 바람직하다고 할 수 있는데, 이로써 인간화된 경쇄와 중쇄가 서로 우호적으로 접촉하게 될 것이 확실해진다. 이 경우, 공여자 경쇄 및 중쇄는 완전한 서열이 공지된 인간 항체, 예를 들어 Eu, Lay, Pom, Wol, Sie, Gal, Ou 및 WEA 항체 (Kabat et al., op. cit; 때로, 인간 사슬의 마지막 몇 개의 아미노산은 알려지지 않고 있는데, 이때는 다른 인간 항체에 대한 상동성에 의해 추론되어야 한다)로부터의 사슬에 대해서만 비교될 것이다. 인간 항체는 함께 얻어진 경쇄와 중쇄 가변영역 서열이 공여자 경쇄 및 중쇄 가변영역 서열에 대해 전체적으로 가장 상동성이도록 선택될 것이다. 때로는 더 큰 중량의 중쇄 서열이 주어질 것이다. 다음에, 선택된 인간 항체가 경쇄 및 중쇄 수용자 서열을 모두 제공할 것이다. 실제로 인간 Eu 항체가 이 역할을 수행하고 있는 것이 자주 발견된다.

소위 "베스트-핏'이라고 하는 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열이 공지된 인간 가변 도메인 서열들의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 다음에, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크(FR)로서 수용된다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체들의 콘센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용하는 것이다. 몇 개의 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

수용자 면역글로불린이 어떻게 선택되었는지와 무관하게, 인간화된 면역글로불린 사슬의 프레임워크 안의 소수의 아미노산을 수용자에서가 아니라 공여자에서의 이들 위치에 있는 아미노산과 동일하게 선택함으로써 높은 친화성이 달성될 수 있다. 주로, 항원 결합을 변경시키기 위해, 바람직하게는 개선하기 위해 인간 프레임워크 영역에 있는 프레임워크 잔기가 CDR 공여자 항체의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 본 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 학인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정 위치에 있는 일반적이지 않은 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열비교에 의해서 확인된다(예를 들어, Queen et al., 미국특허 제5,585,089호; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이것들은 그 전문이 본원에 참고자료로서 인용된다). 항체는 본 분야에 공지된 다양한 기술들을 이용하여 인간화될 수 있는데, 예를 들어 CDR-접목(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 피복 또는 재표면화(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 사슬 셔플링(미국특허 제5,565,332호)이 이용된다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다(미국특허 제4,816,567호).

두 번째 이론은 공여자로부터 어떤 아미노산이 선택될 수 있는지를 규정하는 다음의 카테고리이다. 바람직하게, 이들 카테고리 중 하나에 있는 대부분 또는 전체 아미노산 위치에서 공여자 아미노산이 사실상 선택될 것이다.

카테고리 1: CDR에서 아미노산 위치가 Kabat et al., op. cit에 의해 규정된다.

카테고리 2: 인간 수용자 면역글로불린의 프레임워크 안의 아미노산이 일반적이지 않다면(즉, "희귀", 이것은 본원에서 대표적인 데이터 뱅크에 있는 인간 중쇄(각기 경쇄) V 영역 사슬의 그 위치에서 약 20% 미만으로, 일반적으로는 약 10% 미만으로 발생하는 아미노산을 나타낼 때 사용된다), 그리고 그 위치에 있는 공여자 아미노산이 인간 서열에서 전형적인 것이라면(즉, "보편", 이것은 대표적인 데이터 뱅크에 있는 서열에서 약 25% 이상, 일반적으로는 약 50% 이상으로 발생하는 아미노산을 나타낼 때 사용된다), 수용자보다는 오히려 공여자 아미노산이 선택될 수 있다. 이 기준은 인간 프레임워크에 있는 비전형적인 아미노산이 항체 구조를 파괴하지 않는 것을 보장하는데 도움이 된다. 더욱이, 일반적이지 않은 아미노산을 인간 항체에서 전형적으로 발생하는 공여자 항체로부터의 아미노산으로 치환함으로써 인간화된 항체는 덜 면역원성으로 될 수 있다. 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변영역 서열은 각각, 서로 특별히 상동성이고 어떤 중요한 위치에는 같은 아미노산을 갖는 서열들의 "서브그룹"으로 분류된다(Kabat et al., op. cit). 인간 수용자 서열에 있는 아미노산이 인간 서열들 중에서 "희귀"인지 "보편"인지를 결정할 때, 이들 인간 서열이 수용자 서열로서 동일한 서브그룹에 들어가는지만을 고려하는 것이 대체로 바람직할 것이다.

카테고리 3: 인간화된 면역글로불린 사슬의 주 서열에 있는 3개의 CDR 중 하나 이상에 바로 인접한 위치에서는 수용자 아미노산보다는 공여자 아미노산(들)이 선택될 수 있다. 이들 아미노산은 특히 CDR에 있는 아미노산과 상호작용할 가능성이 있는데, 수용자로부터 선택되었을 경우에는 공여자 CDR을 왜곡시키고 친화성을 감소시킬 가능성이 있다. 더욱이, 인접한 아미노산은 항원과 직접 상호작용할 수 있으며(Amit et al., Science, 233, 747-753 (1986), 이것은 참고자료로서 본원에 인용된다), 공여자로부터 이들 아미노산을 선택하는 것이 원 항체에 친화성을 제공하는 모든 항원 접촉을 유지하는데 바람직할 수 있다.

카테고리 4: 원 공여자 항체의 전형적인 3-차원 모델은 CDR 밖에 있는 어떤 아미노산들이 CDR에 가까이 있으며, 수소결합, 반데르발스힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR 안의 아미노산들과 상호작용할 가능성이 크다는 것을 나타낸다. 이들 아미노산 위치에서는 수용자 면역글로불린 아미노산보다는 공여자 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이 기준에 따른 아미노산들은 일반적으로 CDR 안의 어떤 원자로부터 약 3 옹스트롬 단위 이내에 측쇄 원자를 가질 것이며, 상기 열거된 바와 같은 확립된 화학적 힘에 따라 CDR 원자와 상호작용할 수 있는 원자를 함유해야 한다.

수소결합을 형성할 수 있는 원자들의 경우, 그들의 핵간 거리가 3 옹스트롬으로 측정되지만, 결합을 형성하지 않는 원자에 대해서는 그들의 반데르발스 표면간 거리가 3 옹스트롬으로 측정된다. 따라서, 후자의 경우에 상호작용할 수 있다고 생각되는 원자들에 대해서 핵은 약 6 옹스트롬(3 + 반데르발스 반경의 합) 이내에 있어야 한다. 많은 경우 핵은 4 또는 5 내지 5 옹스트롬 떨어져 있을 것이다. 아미노산이 CDR과 상호작용할 수 있는지를 결정하는데 있어서, CDR의 일부인 중쇄 CDR 2의 마지막 8개의 아미노산은 고려하지 않는 것이 바람직한데, 왜냐하면 구조적인 관점에서 이들 8개의 아미노산은 오히려 프레임워크의 일부로서 거동하기 때문이다.

CDR의 아미노산과 상호작용할 수 있으며, 이로써 카테고리 4에 속하는 프레임워크 안의 아미노산은 다른 방식으로도 구별될 수 있다. 각 프레임워크 아미노산의 용매 접근성 표면적이 (1) 무손상 항체에서, 그리고 (2) CDR을 제거한 항체로 구성된 가상의 분자에서 두 방식으로 계산된다. 이들 값 사이에 약 10 제곱옹스트롬 이상의 상당한 차이는 프레임워크 아미노산의 용매로의 접근이 CDR에 의해 적어도 부분적으로 차단되며, 따라서 이 아미노산이 CDR과 접촉하고 있음을 나타낸다. 아미노산의 용매 접근성 표면적은 항체의 3-차원 모델에 기초하여 본 분야에 공지된 알고리즘을 이용하여 계산될 수 있다(예를 들어, Connolly, J. Appl. Cryst., 16, 548 (1983) 및 Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971), 둘 다 본원에 참고자료로서 인용됨). 또한, 프레임워크 아미노산은 이따금 다른 프레임워크 아미노산의 입체형태에 영향을 주어 CDR과 접촉하게 함으로써 CDR과 간접적으로 상호작용할 수도 있다.

프레임워크 안의 몇몇 위치에 있는 아미노산은 많은 항체에서 CDR과 상호작용할 수 있다고 알려져 있는데(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989), 및 Tramontano et al., J. Mol. Biol., 215, 175 (1990), 모두 본원에 참고자료로서 인용됨), 경쇄의 위치 2, 48, 64 및 71과 중쇄의 위치 26-30, 71 및 94(Kabat, op. cit.에 따라 넘버링)를 주목할 만하며, 이들 아미노산은 일반적으로 카테고리 4에 들어갈 것이다. 전형적으로, 본 발명의 인간화된 면역글로불린은 이들에 더하여 카테고리 4의 공여자 아미노산(상이한 경우)을 포함할 것이다. 경쇄의 위치 35와 중쇄의 위치 93 및 103에 있는 아미노산들도 또한 CDR과 상호작용할 가능성이 있다. 모든 이들 넘버링 위치에서, 인간화된 면역글로불린에 있어야 할 것으로서 수용자 아미노산보다는 공여자 아미노산(이것들이 상이할 때)을 선택하는 것이 바람직하다. 한편, 경쇄의 최초 5개 아미노산과 같은 카테고리 4에 들어갈 수 있는 어떤 위치는 때로 인간화된 면역글로불린 친화성의 손실 없이 수용자 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. Chothia 및 Lesk(op. cit.)은 Kabat et al.(op. cit.)와는 다르게 CDR을 규정한다. 특히, CDR1은 잔기 26-32를 포함하는 것으로서 규정된다. 따라서, Riechmann et al.(op. cit.)은 공여자 면역글로불린으로부터 이들 아미노산을 선택했다.

또한, 인간화될 항체는 항원에 대한 높은 친화성과 다른 우호적인 생물학적 특성들을 보유하는 것이 중요하다. 이 목표를 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따라서, 인간화된 항체는 모 서열 및 다양한 개념의 인간화된 산물들을 모 서열 및 인간화된 서열들의 3-차원 모델을 이용하여 분석하는 과정에 의해 제조된다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용될 수 있다. 이들 표시된 것의 정밀조사에 의해, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할에 대한 분석, 즉 항원과 결합할 수 있는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석이 가능해진다. 이 방식에서, FR 잔기들은 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가와 같은 원하는 항체 특징이 달성되도록 수용자 및 내포 서열로부터 선택되어 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 그리고 대개 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 연루된다. 항체와 같은 단백질 모델을 창출하는 컴퓨터 프로그램이 일반적으로 이용될 수 있으며, 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Levy et al., Bioche-mistry, 28, 7168-7175 (1989); Bruccoleri et al., Nature, 335, 564-568 (1988); Chothia et al., Science, 233, 755-758 (1986), 모두 본원에 참고자료로서 인용됨). 이것은 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 실제로, 모든 항체들이 유사한 구조를 가지기 때문에, 다른 항체들의 러프 모델로서 필요할 경우 브룩해븐 프로테인 데이터 뱅크로부터 이용할 수 있는 공지된 항체 구조들이 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 이들 모델이 컴퓨터 모니터 상에 표시될 수 있으며, 원자간 거리를 계산하고, 상이한 아미노산 상호작용의 가능성을 추정할 수 있다(Ferrin et al., J. Mol. Graphics, 6, 13-27 (1988) 참조).

인간화된 면역글로불린 아미노산이 공여자로부터 취해질 수 있는 경우를 설명하는 이들 카테고리에 더하여, 인간화된 면역글로불린의 어떤 아미노산은 공여자나 수용자로부터 취해질 수 없는 경우가 카테고리 5로 분류된다:

카테고리 5: 공여자 면역글로불린의 주어진 위치에 있는 아미노산이 인간 서열에서 상기 정의된 "희귀"이고, 수용자 면역글로불린의 이 위치에 있는 아미노산이 또한 인간 서열에서 "희귀"라면, 인간화된 면역글로불린의 이 위치에 있는 아미노산은 인간 서열의 "전형적인" 어떤 아미노산이 되도록 선택될 수 있다. 수용자 서열과 동일한 서브그룹에 속하는 공지된 인간 서열들의 이 위치에서 가장 흔하게 발생하는 아미노산을 선택하는 것이 바람직하다.

인간화된 항체는 일반적으로 마우스 항체에 비하여, 또는 어떤 경우 키메라 항체에 비하여 인간 치료법에 사용하는데 있어서 적어도 세 가지 잠재적인 이점을 가진다:

(1) 이펙터 부분이 인간의 것이기 때문에, 인간 면역시스템의 나머지 부분과 더 잘 상호작용할 수 있다(예를 들어, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 의해 더욱 효과적으로 표적 세포를 파괴한다).

(2) 인간 면역시스템은 이질적인 인간화된 항체의 프레임워크 또는 불변영역을 인식할 수 없으며, 따라서 이러한 항체가 주사되었을 때 항체반응이 전체적으로 이질적인 마우스 항체 또는 부분적으로 이질적인 키메라 항체에 비해서 적어질 수 있다.

(3) 주사된 마우스 항체는 정상 항체의 반감기에 비해 인간 순환계에서 훨씬 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 보고되었다(D. Shaw et al., J. Immunol. 138, 4534 -4538 (1987)). 주사된 인간화 항체는 자연발생한 인간 항체와 더욱 유사한 반감기를 가질 것으로 예상되며, 이로써 더 적은 용량이 보다 덜 빈번하게 주어지게 된다.

한 양태에서, 본 발명은 IL-31과 같은 원하는 항원과 결합할 수 있는 공여자 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 CDR을 암호화하는 재조합 DNA 세그먼트를 발현함으로써 생산되는 인간화 항체를 설계하는 것에 관한 것이다. 수용자 인간 프레임워크 영역을 암호화하는 DNA 세그먼트에 부착된다.

DNA 세그먼트는 전형적으로 자연적으로 결합된 또는 이종성인 프로모터 영역을 포함하는, 인간화된 면역글로불린 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 DNA 서열을 더 포함할 것이다. 발현 제어 서열은 진핵세포 숙주세포를 형질전환시키거나 핵산전달감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵세포 프로모터 시스템일 것이나, 원핵세포 숙주에 대한 제어 서열도 또한 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적합한 숙주에 통합되었다면, 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현에 적합한 조건하에 숙주가 유지되며, 원한다면 인간화된 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 다이머 또는 무손상 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태의 수집 및 정제가 이어질 수 있다(본원에 참고자료로서 인용된 S. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Acad-emic Press, N.Y., (1979)를 참조한다).

인간 불변영역 DNA 서열은 잘 공지된 과정에 따라서 다양한 인간 세포로부터 분리될 수 있으며, 바람직하게는 불멸화된 B 세포로부터 분리된다(Kabat op. cit. 및 WP87/02671 참조). 본 발명의 면역글로불린을 생산하기 위한 CDR은 IL-31 같은 정해진 항원에 결합할 수 있는 단클론성 항체로부터 유사하게 유래될 것이며, 항체를 생산할 수 있는 마우스, 래트, 토끼, 또는 다른 척추동물을 포함하는 어떤 편리한 포유류 공급원에서 잘 공지된 방법에 의해 생산될 것이다. 불변영역 및 프레임워크 DNA 서열을 위한 적합한 공급원 세포, 및 면역글로불린 발현 및 분비를 위한 숙주세포는 많은 출처들로부터, 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻어질 수 있다("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," 6판, (1988) Rockville, Md. U.S.A., 본원에 참고자료로서 인용됨).

본원에 구체적으로 설명된 인간화된 면역글로불린에 더하여, 본연의 서열에 대해 "실질적으로 상동성"인 다른 변형된 면역글로불린들도 당업자에게 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 설계되어 제작될 수 있다. 여러 상이한 인간 프레임워크 영역들이 본 발명의 인간화된 면역글로불린의 토대로서 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 부위-지정 돌연변이와 같은 여러 가지 잘 공지된 기술에 의해 쉽게 달성될 수 있다(본원에 참고자료로서 인용된 Gillman and Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) 및 S. Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987)을 참조한다).

본 발명의 인간화된 항체는 단편들뿐만 아니라 무손상 항체도 포함한다. 전형적으로, 이들 단편은 이들이 유래하는 무손상 항체와 항원 결합을 경쟁한다. 단편들은 전형적으로 적어도 10⁷ M^-1, 더 전형적으로는 10⁸ 또는 10⁹ M^-1의 친화성으로 결합한다(즉, 무손상 항체와 동일한 범위 내에서). 인간화 항체 단편은 분리된 중쇄, 경쇄, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fν를 포함한다. 단편은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분리에 의해 생산된다.

항체의 인간화에 대한 더 상세한 설명은, 유럽특허 EP 239,400, EP 592,106, 및 EP 519,596; 국제공보 WO 91/09967 및 WO 93/17105; 미국특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 제5,565,332호, 제5,585,089호, 제5,766,886호, 및 제6,407,213호; 그리고 Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60; Morea et al., 2000, Methods 20:267-79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55(23Supp):5973s-5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al. 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596을 참조한다.

항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 종래에, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 효소절단을 통하여 유도되었다(예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992), 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)을 참조한다). 그러나, 이들 단편은 형재 재조합 숙주세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 분리될 수 있다. 대안으로서, E. coli로부터 Fab'-SH 단편이 직접 회수되고, 화학적으로 커플링되어 F(ab').sub.2 단편이 형성될 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따라서, 재조합 숙주세포 배양물로부터 F(ab').sub.2 단편이 직접 분리될 수도 있다. 항체 단편을 생산하는 다른 기술들도 당업자에게 자명할 것이다. 더욱이, 단쇄 Fνs 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예들은, 미국특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 설명된 것들을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(또는 그것의 단편, 바람직하게는 폴리펩티드의 적어도 10개, 20개 또는 50개 아미노산)재조합 융합된, 또는 화학적으로 콘쥬게이트(공유 및 비-공유 콘쥬게이션을 모두 포함)되어 융합 단백질을 발생시킬 수 있는 항체들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한, 화학치료제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소활성 독소, 또는 그 단편들), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 콘쥬게이트)와 같은 세포독성제에 콘쥬게이트된 본원에 설명된 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드(또는 그것의 단편, 바람직하게는 폴리펩티드의 적어도 10개, 20개 또는 50개 아미노산)재조합 융합된, 또는 화학적으로 콘쥬게이트(공유 및 비-공유 콘쥬게이션을 모두 포함)되어 융합 단백질을 발생시킬 수 있는 항체들을 포함한다. 융합이 반드시 직접적일 필요는 없으며, 링커 서열을 통해 일어날 수도 있다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드(또는 그것의 단편, 바람직하게는 폴리펩티드의 적어도 10개, 20개 또는 5개 아미노산) 이외의 다른 항원에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 폴리펩티드와 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체를 융합하거나 콘쥬게이션함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 시험관내 또는 생체내에서 특정 세포 타입에 표적화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합 또는 콘쥬게이트된 항체는 또한 본 분야에 공지된 방법을 이용한 시험관내 면역분석법 및 정제법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, Harbor et al., supra, 및 PCT 공보 WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); 미국특허 제5,474,981호; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991)를 참조하며, 이것들은 본원에 참고자료로서 인용된다.

더 나아가, 본 발명은 이종성 폴리펩티드 서열(예를 들어, 가변영역 이외의 다른 항체 도메인)에 융합 또는 콘쥬게이트된 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 면역원성 또는 항원성 에피토프)를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역, 또는 그것의 일부에 융합되거나 콘쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드(그것의 단편 또는 변이체를 포함하는)는 면역글로불린(IgA, IgE, IgG, IgM)의 불변 도메인, 또는 그것의 일부분(CH1, CH2, CH3), 또는 이것들의 어떤 조합 및 이것들의 일부분과 융합될 수 있으며, 그 결과 키메라 폴리펩티드가 생긴다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 부분은 불변영역, 힌지영역, CH1 도메인 또는 전체 도메인 또는 그 일부분의 어떤 조합을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 상기 항체 부분들에 융합 또는 콘쥬게이트되어 멀티머를 형성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 부분은 Fc 부분들 사이의 이황화 결합을 통해서 다이머를 형성할 수 있다. 폴리펩티드와 IgA 및 IgM의 일부분들을 융합함으로써 고차 멀티머 형태가 만들어질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 항체 부분을 융합 또는 콘쥬게이션하는 방법은 본 분야에 공지도어 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,336,603호; 제5,622,929호; 제5,359,046호; 제5,349,053호; 제5,447,851호; 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; PCT 공보 WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); 및 Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341(1992)를 참조한다(상기 참고문헌들은 그 전문이 본원에 참고자료로서 인용된다). 다른 비제한적 예로서, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항체(그것의 단편 또는 변이체를 포함함)는 알부민과 융합될 수 있다(제한은 아니지만, 재조합 인간 혈청 알부민 또는 그것의 단편 또는 변이체를 포함한다(예를 들어, 1999년 3월 2일자 발행된 미국특허 제5,876,969호, EP 특허 제0 413 622호, 및 1998년 6월 16일자 발행된 미국특허 제5,766,883호를 참조하며, 이것들은 본원에 그 전문이 참고자료로서 포함된다). 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항체(그것의 단편 또는 변이체를 포함함)는 이종성 단백질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 또는 인간 혈청 알부민 폴리펩티드)의 N-말단 또는 C-말단 단부에 융합될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 또한 포함된다.

상기 논의된 대로, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 항체 부분에 융합되거나 콘쥬게이트될 수 있으며, 이로써 폴리펩티드의 생체내 반감기가 증가되거나, 본 분야에 공지된 방법을 이용한 면역분석에서 사용된다. 더 나아가, 본 발명의 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하기 위해 상기 항체 부분에 융합되거나 콘쥬게이트될 수도 있다. 한 보고된 예는 인간 CD4-폴리펩티드의 최초 2개 도메인 및 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변영역의 다양한 도메인으로 구성된 키메라 단백질을 개시한다(예를 들어, EP 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)를 참조한다). 항원이 상피장벽을 가로질러 면역시스템까지 송달되는 것의 증진이 IgG 또는 Fc 단편과 같은 FcRn 결합 파트너에 콘쥬게이트된 항원(예를 들어, 인슐린)에서 증명되었다(예를 들어, PCT 공보 WO 96/22024 및 WO 99/04813를 참조한다). 또한, 이황화-연결 다이머 구조(IgG로 인한)를 갖는 항체에 융합되거나 콘쥬게이트된 본 발명의 폴리펩티드는 단독의 모노머 분비된 단백질 또는 단백질 단편보다도 다른 분자에 결합하여 중화시키는데 더욱 효과적일 수 있다(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). 많은 경우 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단에 유리하며, 따라서, 예를 들어 개선된 약동학적 특성을 가져올 수 있다(EP A 232,262). 또는 달리, 융합 단백질이 발현, 검출, 및 정제된 후 Fc 부분의 제거가 바람직할 것이다. 예를 들어, 융합 단백질이 면역화를 위한 항원으로서 사용될 경우 Fc 부분은 치료 및 진단을 방해할 수 있다. 약물개발에서는, 예를 들어, hIL-5 같은 인간 단백질이 hIL-5 길항제를 확인하기 위한 고-처리량 스크리닝 분석을 위해 Fc 부분에 융합되었다(D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995) 참조). 또한, 이러한 기술은 제한은 아니나 2가 콘쥬게이션 제제의 사용을 포함한다(예를 들어, 미국특허 제5,756,065호; 제5,714,631호; 제5,696,239호; 제5,652,361호; 제5,505,931호; 제5,489,425호; 제5,435,990호; 제5,428,139호; 제5,342,604호; 제5,274,119호; 제4,994,560호; 및 제5,808,003호를 참조하며, 이것들의 내용은 그 전문이 본원에 참고자료로서 인용된다).

더욱이, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 그 단편)은 정제를 용이하게 하기 위해 펩티드와 같은 마커 서열에 융합될 수 있다. 더 이상의 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(제한은 아니지만, 면역원성 및/또는 항원성 에피토프를 암호화하는 핵산을 포함함)이 또한 에피토프 택(예를 들어, 적혈구응집소 택("HA") 또는 플래그 택)으로서 관심의 유전자와 재조합될 수 있으며, 이것은 발현된 폴리펩티드의 검출 및 정제에 도움이 된다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)에 제공된 택과 같은 헥사-히스티딘 펩티드이며, 특히 이들 대부분은 시중에서 구입할 수 있다. Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)에 논의된 대로, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 택은, 제한은 아니지만 인플루엔자 적혈구응집소 단백질(Wilson et al., Cell 37:767 (1984))로부터 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 택, 및 "플래그" 택을 포함한다.

더 나아가, 본 발명은 진단제나 치료제에 콘쥬게이트된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 주어진 치료, 진단, 검출 및/또는 예방 섭생의 효능을 측정하기 위한 임상시험 과정의 일부로서, 예를 들어 종양의 발달 또는 진행을 모니터하기 위해서 항체가 진단학적으로 사용될 수 있다. 항체와 검출가능한 물질을 커플링함으로써 검출이 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 각종 효소, 인공 기들, 형광물질, 발광물질, 생체발광물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영에 이용되는 양전자 방출 금속, 및 비-방사성 상자성 금속이온을 포함한다. 본 발명에 따라 진단제로서 사용되는 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 금속이온에 대해서는, 예를 들어 미국특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함한다. 적합한 인공 기 복합체의 예는 스트렙토아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함한다. 적합한 형광물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 염화물 또는 피코에리트린을 포함한다. 생체발광물질의 예는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함한다. 적합한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 111In 또는 99Tc를 포함한다.

더 나아가, 항체 또는 항체 단편은 세포독소, 예를 들어 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속이온과 같은 치료학적 부분에 콘쥬게이트될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 어떤 제제들을 포함한다. 예들은 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브롬화물, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 다이온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 및 이것들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는, 제한은 아니지만, 항대사물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르뮤스틴(BSNU) 및 로뮤스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민백금(II)(DDP)(시스플라틴), 안트라시클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.

본 발명의 콘쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변형하는데 사용될 수 있으며, 치료제 및 약물 부분은 종래의 화학적 치료제에 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 부분은 원하는 생물학적 활성을 지닌 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양괴사인자, a-인터페론, 베타-인터페론, 신경성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴과 같은 단백질; 또는 예를 들어 림포카인, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극인자("G-CSF") 또는 다른 성장인자들과 같은 생물학적 반응 변형제를 포함할 수 있다.

또한, 항체는 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이것은 표적 항원의 면역분석 또는 정제에 특히 유용하다. 이러한 고체 지지체는, 제한은 아니지만 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함한다.

이러한 치료학적 부분과 항체의 콘쥬게이션 기술은 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.), pp. 303-16(Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)을 참조한다.

또는 달리, 항체 헤테로콘쥬게이트를 형성하기 위해 항체가 2차 항체에 콘쥬게이트될 수 있는데, 이것은 그 전문이 본원에 참고자료로서 인용되는 Segal의 미국특허 제4,676,980호에 설명된다.

치료학적 부분과 콘쥬게이트된 항체나 그렇지 않은 항체라도 단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인(들)과 조합하여 투여하여 치료제로서 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 종양 예비-표적화에 이용하기 위해 항체는 "수용체"(스트렙토아비딘 같은)에 콘쥬게이트될 수 있는데, 이때는 항체-수용체 콘쥬게이트가 환자에게 투여되고, 이어서 청소제를 이용하여 순환계로부터 미결합 콘쥬게이트를 제거한 다음, 세포독성제(예를 들어, 방사성핵종)에 콘쥬게이트된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)이 투여된다.

당업자에게 공지된 다양한 분석법을 이용하여 IL-31 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 검출할 수 있다. 전형적인 분석법들이 Antibodies: A Labora-tory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에 상세히 설명된다. 이러한 분석법의 대표적인 예는 동시발생 면역전기영동, 방사성면역분석법, 방사성면역침전법, 효소-연결 면역흡착분석(ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경합 분석, 및 샌드위치 분석을 포함한다. 이에 더하여, 야생형 대 돌연변이 IL-31 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 대해 항체가 스크리닝될 수 있다.

IL-31에 대한 항체는 IL-31를 발현하는 세포에 택의 부착; 친화성 정제에 의한 IL-31의 분리; IL-31 폴리펩티드의 순환 수준을 측정하기 위한 진단분석; 근간을 이루는 병리학 또는 질환의 마커로서 가용성 IL-31의 검출 또는 정량; FACS를 이용하는 분석법; 발현 라이브러리의 스크리닝; 항-유전자형 항체의 발생에서; 그리고 시험관내 및 생체내에서 IL-31 활성을 차단하기 위한 중화 항체 또는 길항제로서 사용될 수 있다. 적합한 직접 택 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기 입자 등을 포함하고, 간접 택 또는 표지는 중간체로서 바이오틴-아비딘 또는 다른 보체/항-보체 쌍의 사용을 특징으로 한다. 본 발명의 항체는 또한 약물, 독소, 방사성핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단학적 또는 치료학적 용도에 사용된다. 더욱이, IL-31 또는 그 단편에 대한 항체는, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 본 분야에 공지된 다른 분석에서 변성된 IL-31 또는 그 단편의 시험관내 검출에 사용될 수 있다.

적합한 검출가능한 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있고, 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기 입자 등을 포함한다. 적합한 세포독성 분자가 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 박테리아 또는 식물 독소(예를 들어, 디프테리아, 톡신, 사포린, 슈도모나스 엑소톡신, 리신, 아브린 등)뿐만 아니라, 요오드-131, 레늄-188 또는 이트륨-90 같은 치료학적 방사성핵종을 포함한다(폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 부착되거나, 예를 들어 킬레이트 부분에 의해 간접적으로 부착된다. 또한, 폴리펩티드 또는 항체는 아드리아마이신 같은 세포독성 약물에 콘쥬게이트될 수 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접적 부착을 위하여, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 보체/항-보체 쌍에 의해 콘쥬게이트될 수 있으며, 이 경우 나머지 한 구성원이 폴리펩티드 또는 항체 부분에 결합된다. 이러한 목적을 위한 전형적인 보체/항-보체 쌍은 바이오틴/스트렙토아비딘이 전형적인 보체/항-보체이다.

또한, 결합 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내에서 IL-31 결합 및 신호전달을 차단하기 위한 IL-31 "길항제"로서 작용할 수 있다. 이들 항-IL-31 결합 폴리펩티드는 IL-31 활성 또는 단백질-결합을 억제하는데 유용할 것이다.

폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적화된 세포 또는 조직 억제 또는 절제(예를 들어, 암세포 또는 암조직의 치료)를 위해 사용될 수 있다. 대안으로서, 폴리펩티드가 다수의 기능적 도메인을 가질 경우(즉, 활성화 도메인 또는 수용체 결합 도메인에 표적화 도메인이 더해진), 표적화 도메인만을 포함하는 융합 단백질이 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 보체 분자를 관심의 세포나 조직 타입으로 보내는데 적합할 수 있다. 단지 융합 단백질만의 도메인이 보체 분자를 포함하는 예에서, 항-보체 분자는 검출가능한 또는 세포독성 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 이로써 이러한 도메인-보체 분자 융합 단백질은 일반적인 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 콘쥬게이트의 세포/조직-특이적 송달을 위한 일반적인 표적화 담체 또는 부형제를 나타낸다.

다른 구체예에서, IL-31 항체-사이토카인 융합 단백질은 표적 조직(예를 들어, 백혈병, 림프종, 폐암, 결장암, 골수종, 췌장암, 난소암, 피부, 혈액 및 골수 암, 또는 IL-31 수용체가 발현되는 다른 암들)의 생체내 살해를 위해 사용될 수 있다(일반적으로, Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997을 참조한다). 설명된 융합 단백질은 항체를 원하는 작용 부위에 표적화함으로써 항체의 국소 농도를 높일 수 있다. 적합한 IL-31 폴리펩티드 또는 항-IL-31 항체는 바람직하지 않은 세포나 조직(즉, 종양 또는 백혈병)을 표적으로 하며, 융합된 사이토카인은 이펙터 세포에 의한 개선된 표적 세포 용해를 매개한다. 이런 목적을 위한 적합한 사이토카인은, 예를 들어 인터류킨 2 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, IL-31 폴리펩티드 또는 항-IL-31 항체가 혈관세포 또는 혈관조직을 표적으로 할 경우, 이러한 폴리펩티드 또는 항체는 재협착을 줄이기 위해 방사성핵종, 특히 베타-방출 방사성핵종과 콘쥬게이트될 수 있다.

본 발명의 단클론성 항체는, 본 분야에 공지되고 본원에 설명된 다양한 생체내 모델에 의해 측정된 바와 같이, IL-31 리간드를 억제, 차단, 또는 중화하는 능력에 대해 측정될 수 있으며, 이러한 모델은, 제한은 아니지만, NC/Nga 모델, OVA 피내 모델, 만성 과민증 모델, 및 만성 합텐 모델을 포함한다.

피부-귀소 T 세포와 표피 각질세포는 모두 인간에서 피부질환의 병리학에 관련되었다. IL-31 mRNA 및 단백질 발현은 인간에서 피부-귀소 CLA+ T 세포 집단에만 제한된다. 이와 같이, 항체 또는 수용체 길항제를 포함하는 IL-31에 대한 길항제는 CLA+ T 세포를 발현하는 피부 및 표피 질환을 치료하는데 유용할 것이다. 이러한 질환은, 예를 들어 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 약물-유발 알레르기 반응, 피부-향성 바이러스 및 바이러스 관련 소양증, 백반증, 피부 T 세포 림프종, 원형탈모증, 장미 여드름, 일반 여드름, 결절성 양진, 및 수포성 유천포창을 포함한다. TARC 및 MDC 같은 케모카인 마커는 IL-31에 대한 중화 단클론성 항체의 효과를 측정하는데 유용하다. 실시예 15에 나타낸 대로, 본원에 설명된 항-IL31 항체를 사용한 치료의 억제 효과는 TARC 및 MDC의 수준을 모니터함으로써 측정될 수 있다.

접촉성 피부염

알레르기 접촉성 피부염은 피부와 접촉하게 된 항원에 대한 T 세포 매개 면역반응으로서 정의된다. 알레르겐 의존성 T 세포 반응이 CLA+ 세포 집단에만 크게 제한되므로, CLA+ T 세포 집단이 피부염의 개시에 연루된다고 생가된다(예를 들어, Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med:181, 1935, (1995)를 참조한다). 최근 데이터는 보편적인 접촉성 과민증 알레르겐인 니켈에 대한 반응에서 CD8+ T 세포를 제외한 기억(CD45RO+) CD4+ CLA+ T 세포만이 증식하여 타입-1(IFN- )과 타입-2(IL-5) 사이토카인을 생산한다는 것을 밝혔다. 더욱이, CD4, CD45RO(기억) 또는 CD69와 조합된 CLA를 발현하는 세포가 니켈-특이적 자극 후에 증가하며, CCR6을 제외한 케모카인 수용체 CXCR3, CCR4, CCR1O을 발현한다. Moed H. et al. Br J Dermatol: 51, 32, (2004) 참조.

동물 모델에서, 알레르기 접촉성 피부염이 T 세포 의존성이며, 알레르기-반응성 T 세포가 알레르겐을 적용한 부위로 이주한다는 것이 증명되었다. 일반적으로, Engeman T.M., et al., J. Immunol:164, 5207 (2000); Ferguson T.A. & Kupper T.S. J. Immunol.: 150, 1172, (1993); 및 Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol:21, 451 (2001)를 참조한다. CLA+ T 세포가 IL-31을 생산하고, 피부 각질세포의 IL-31 자극이 TARC 및 MDC와 같은 전-염증성 케모카인을 유도할 수 있으므로, IL-31은 접촉성 피부염의 병리생리학에 연루될 수 있다. 접촉성 과민증의 마우스 모델에서 중화 IL-31 항체를 사용하였다. 실시예 8 참조.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환에 관련된 염증 및/또는 긁는 증상을 억제, 감소, 중화, 예방 또는 차단함으로써 접촉성 과민증의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

아토피 피부염

아토피 피부염(AD)은 만성적으로 재발하는 염증성 피부질환으로서, 지난 10년간 유병률이 극적으로 증가하였다. 임상적으로 AD는 대단히 가려우며, 판 벗겨짐과 구진이 흔히 나타나고, 만성적인 재발과정을 보이는 것을 특징으로 한다. AD의 진단은 중요하고도 사소한 임상적 소견에 대부분 기초한다. Hanifin J.M. Arch Dermatol: 135, 1551 (1999) 참조. 조직병리학에 의해서 급성 병소에서의 해면화, 과다증 및 집중적 이상각화증이 있음이 밝혀졌으며, 과다증 및 이상각화증과 함께 나타나는 현저한 표피 증식증, 가시세포증/과과립증, 및 림프구 및 풍부한 거대세포와 함께 나타나는 진피의 혈관주변 침윤이 만성 병소의 특징이다.

T 세포는 조직에서 국부적 면역반응의 개시에서 중추적인 역할을 하며, 특히 피부-침윤 T 세포가 피부의 불규칙적 면역반응의 개시 및 유지에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하는 증거가 있다. 피부 염증부위에 침윤한 T 세포의 약 90%가 내피 상의 유도성 유착분자 E-셀렉틴과 결합하는 피내 림프구-결합 Ag(CLA+)를 발현한다(Santamaria-Babi L.F., et al., Eur. J. Dermatol.: 14, 13, (2004) 참조). 대조군 개체와 비교했을 때 AD 환자들의 순환 CLA+ T 세포의 현저한 증가가 문헌에 기록되어 있으며(Teraki Y., et al., Br. J. Dermatol.: 143, 373(2000) 참조), 다른 것들은 AD 환자로부터의 기억 CLA+ T 세포가 CLA-집단과 비교하여 알레르겐 추출물과 우선적으로 반응한다는 것을 증명하였다(Santamaria-Babi, L. F., et al., J. Exp. Med. 181, 1935, (1995) 참조). 인간에서 피부의 아토피 장애의 병리학은 IL-5 및 IL-13 같은 Th-2 타입 사이토카인을 증가된 수준으로 발현하는 CLA+ T 세포의 증가와 관련된다. Akdis M., et al., Eur. J. Immunol.:30, 3533(2000); 및 Hamid Q., et al. J. Allergy Clin. Immunol.: 98, 225 (1996) 참조.

NC/Nga 마우스는 6-8주 정도 되었을 때 비-특정 병원균 무(non-SPF) 조건에 수용되었을 때, 임상적 경과 및 징후, 조직병리학 및 면역병리학을 포함하는 많은 측면에서 인간 AD와 유사한 AD-유사 병소가 자발적으로 발생한다. 반면에, SPF 조건하에 유지된 NC/Nga 마우스에서는 피부 병소가 발생하지 않는다. 그러나, 가공하지 않은 집먼지진드기 항원을 매주 진피내 주사함으로써 자발적 피부 병소 및 긁는 행동의 개시가 SPF 시설에 수용된 NC/Nga 마우스들에서 동시에 발생할 수 있다. Matsuoka H., et al., Allergy:58, 139 (2003) 참조. 따라서, NC/Nga에서 AD의 발생은 AD의 치료를 위한 새로운 치료제를 평가하는 유용한 모델이다.

자발적 AD의 NC/Nga 모델에 더하여, OVA를 이용한 마우스 피내 민감도가 또한 민감화된 마우스의 피부에 단핵 침윤물을 갖는 항원-의존성 표피 및 진피 비후화를 유도하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 이것은 일반적으로 전체 및 특이적 IgE의 혈청 수준을 함께 상승시키지만, 피부 장벽 기능장애나 소양증은 이 모델에서 일반적으로 발생하지 않는다. Spergel J.M., et al. J Clin. Invest. 101:1614 (1998) 참조. OVA로 DO11.10 OVA TCR 트랜스젠 마우스를 민감화함으로써 피부 장벽 불규칙화 및 소양증을 유도하기 위해 이 프로토콜을 변형할 수 있다. 민감화된 항원을 인식할 수 있는 항원-특이적 T 세포의 수가 증가함에 따라서, 눈에 보이는 긁는 행동 및 피부의 태선화/각설을 유도할 수 있는 피부의 염증 수준도 증가할 수 있다.

NC/Nga 자발적 AD 모델과 OVA 피내 DO11.10 모델을 사용하여 AD에서 IL-31과 IL-31RA의 발현뿐만 아니라, IL-31의 효과를 억제, 감소, 또는 중화하는 본원에 설명된 항체의 능력을 조사한다. 본원 실시예 9 및 10 참조. NC/Nga 생체내 모델을 이용한 한 연구에서(실시예 10), 래트 항-마우스 IL-31 항체의 투여는 긁기는 감소하지만 피부염은 감소하지 않는 것으로 나타났다. 본원에서 설명된 항체는 아토피 피부염, 결절성 양진, 및 습진을 포함하는 피부염 및 소양성 질환과 관련된 긁기를 억제하는데 유용하다. 긁기의 중단은 생채기에 좌우되어 발생하는 피부염의 진행을 중지시킬 것이므로, 긁기만의 억제, 감소, 또는 예방은, 제한은 아니지만 아토피 피부염, 결절성 양진, 및 습진을 포함하는 소양성 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다.

본원에 설명된 항-IL-31 항체의 억제 효과를 측정하기 위한 추가적인 모델이 Umeuchi, H. et al., European Journal of Pharmacology, 518:133-139, 2005; 및 Yoo, J. et al., J. Experimental Medicine, 202:541-549, 2005에 설명된다.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써, 아토피 피부염, 결절성 양진 및 습진을 포함하는 피부염 및 소양성 질환의 임상성과를 개선하기 위해 사용될 수 있다.

약물-유도 지연형 피부 알레르기 반응

약물-유도 지연형 피부 알레르기 반응은 매우 비균질적이며, 많은 다른 병리생리학적 사건들을 반영할 수 있다. Brockow K., et al., Allergy: 57, 45 (2002) 참조. 이들 반응에 연루된 면역학적 메커니즘은 항체 또는 세포 매개되는 것으로 밝혀졌다. 즉각적인 약물 알레르기에서 IgE-매개 항체 반응은 양성 피부단자 및/또는 진피내 검사에 의해 20분 후에 증명될 수 있고, 약물에 대한 비즉각적인 반응은 마지막 약물섭취 후 1시간 이상 지나서 발생할 수 있으며, 주로 T-세포에 의해 매개된다. 비즉각적인 T-세포 매개 지연형 반응은, 예를 들어 페니실린에 대한 약물 부작용을 가진 환자에서 발생할 수 있다. 페니실린에 대한 증식성 T 세포 반응은 페니실린 알레르기 환자의 T 세포의 기억(CD45RO+) CLA+ 하위집단에만 제한되는 것으로 밝혀졌으며, CD45RO+ CLA- 서브셋은 증식 반응을 나타내지 않는다. Blanca M., Leyva L., et al., Blood Cells Mol. Dis.:31, 15 (2003) 참조. 지연형 과민증(DTH) 반응이 마우스에서 인위적으로 재현될 수 있는데, 이로써 DTH 반응의 개시 및 지속에 연루될 수 있는 인자들을 평가할 수 있다. IL-31 중화 항체는 지연형 과민 반응에서 효과적일 수 있다. 실시예 51 참조.

독성 표피괴사용해(TEN)은 넒은 범위의 수포가 함께 나타나는 표피의 광범한 아폽토시스를 특징으로 하는 매우 드물지만 대단히 심각한 약물반응이다. 연구에 의해, 수포를 침윤한 림프구는 CLA+ T 세포이며, 이것은 표피 각질세포에 대한 세포독성을 나타낼 수 있다는 것이 밝혀졌다. Leyva L., et al., J. Allergy Clin. Immunol.:105, 157(2000); 및 Nassif A., Bensussan A., et al., J. Allergy Clin. Immunol.:114, 1209 (2004) 참조. 마우스의 표피 및 모낭 각질세포에서 케라틴-5(K5) 프로모터의 제어하에 OVA가 발현되는 트랜스젠 마우스 시스템이 TEN에 대한 동물 모델을 확립하기 위해 발생되었다. K5-OVA 마우스에 입양 전달되었을 때 OVA 특이적 CD8+ T 세포는, 피부-배출 림프절에서 활성화 및 증식을 겪고, K5-OVA 마우스의 피부를 표적으로 하며, 그 결과 TEN을 암시하는 피부 병소가 발달하게 된다. Azukizawa H., et al., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003) 참조.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 TEN의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

수포성 유천포창

수포성 유천포창은 호중구 및 호산구의 진피침윤과 함께 표피하 수포로서 나타나는 표피하 장애이다. 진단은 표피 및 진피-표피 접합부의 특이적 유착 단백질에 대한 항원-특이적 항체의 존재를 특징으로 한다. Jordon R.E., et al., JAMA: 200, 751 (1967)를 참조한다. PBL 및 피부 수포 T 세포의 분석에 의해 수포성 유천포창의 병리학에서 T 세포의 역할을 분석하는 연구에서 IL-4 및 IL-13 같은 Th2-사이토카인을 증가된 수준으로 발현하는 CLA+ T 세포가 지배적으로 있음이 밝혀졌다. Terald Y., et al., J Invest Dermatol:111, 1097 (2001) 참조. 전신적 코르티코스테로이드로 치료된 후의 수포성 유천포창 환자에서는 CLA-가 아니라 인터류킨-13-생산 세포인 CLA+의 빈도가 상당히 감소한다. 코르티코스테로이드 치료 후 CLA+ 세포의 감소는 임상적 개선과 관련된다. Teraki(상동) 참조.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 수포성 유천포창의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

원형탈모증

원형탈모증(AA)는 림프구 침윤의 계속된 활성 때문에 낭 활성이 정지되는 모낭의 조직-제한적 자가면역질환이라고 생각된다. AA에서는 신체의 어느 곳에 완전히 탈모된 반이 생기지만, 실제로 모낭의 상실은 탈모된 병소에서도 일어나지 않는다. 염증의 임상징후는 존재하지 않지만, 활성 질환 부위로부터의 피부 생검은 주로 CD4+ 세포의 낭주변 림프구 염증을 나타내고, CD8+ 낭내 침윤이 함께 나타난다. Kalish R.S. & Gilhar A. J. Investig Dermatol Symp Proc:8, 164 (2003) 참조.

두피를 침윤한 CD4+ 또는 CD8+ 림프구가 CLA를 발현하며, AA를 앓는 개체의 말초혈에서는 CLA+ CD4+ 또는 CD8+ 림프구의 퍼센트가 정상 대조군에 비해 상당히 높다는 것이 연구에 의해 밝혀졌다. 더욱이, 중증 또는 진행성 AA를 가진 환자는 이 질환으로부터 회복중인 환자에 비해 훨씬 높은 CLA-양성반응을 나타내며, CLA+ 세포의 감소는 양호한 임상경과를 말해주는 것이다. Yano S., et al., Acta Derm Venereal:82, 82 (2002) 참조. 따라서, 이들 연구는 CLA+ 림프구가 AA에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이종이식 모델에 의해서 활성화된 T 세포가 AA의 병리학에서 어떤 역할을 할 가능성이 있음이 증명되었다. AA 환자로부터의 손상된 두피를 누드 마우스 위에 이식한 다음, 이식편에서 침윤한 림프구를 상실시켜 털을 다시 자라게 하고, 활성화된 손상된 T 세포를 SCID 마우스로 전달하여 SCID 마우스 상의 인간 두피 체외이식편에 탈모를 전이할 수 있다. Kalish R.S. & Gilhar A. J Investig Dermatol Symp Proc:8, 164 (2003) 참조.

다양한 면역조정 치료법이 이 장애에 대한 유용한 처치들의 일부이지만, 이들 처치들 중 어느 것도 그 효능이 일정하지 않았다. Tang L., et al, J. Invest Dermatol:120, 400 (2003); Tang L., et al., (2004); 및 Tang L., et al., J Am Acad Dermatol:49, 1013 (2003) 참조. 그렇지만, 효과적인 동물 모델에서 이들의 사용은 치료학적 효과의 분자 메커니즘을 상세히 분석할 수 있는 도구를 제공한다. Shapiro J., et al., J Investig Dermatol Symp Proc:4, 239 (1999); Tang L., et al. Old wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models (2003); 및 Verma D.D., et al., Eur J Dennatol, 332 (2004) 참조.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 원형탈모증의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

장미 여드름/일반 여드름

모피지샘 기구의 장애인 일반 여드름은 가장 흔한 청소년기 피부 문제이다. 낭 각질화의 이상이 여드름 병소를 만든다고 생각된다. 장미 여드름은 붉은구진, 농포, 낭포 및 광범한 모세혈관확장증의 존재에 의해 일반 여드름과 구별되며, 면포(화이트헤드)는 존재하지 않는다. 피지선으로부터 피지분비의 증가가 일반 여드름의 병리생리학의 주된 요인이다. 피지 전-염증성 지질; 국소적으로 생산된 상이한 사이토카인들; 피지선세포(sebocyte)에 의해 생산되는 코르티코트로핀-방출 호르몬과 같은 선주변 펩티드 및 신경펩티드; 및 여드름 환자의 건강하게 보이는 선 근처의 신경종말에서 발현되는 섭스턴스 P를 포함하는 다른 피지선 기능들도 또한 여드름의 발생과 관련된다. Zouboulis C. C. Clin Dermatol:22, 360 (2004) 참조.

일반 여드름 및 장미 여드름의 병리생리학은 미지인 채로 남아있지만, 임상관찰 및 조직병리학적 연구는 모피지선 낭의 염증이 장미 여드름 및 일반 여드름의 병리학의 중추일 수 있음을 시사한다. 장미 여드름 병소를 침윤한 T 세포 서브셋의 분석에 의한 초기 연구는 대부분의 T 세포가 CD4를 발현했다는 것을 나타냈다. Rufli T. & Buchner S. A. Demiatologica:169, 1 (1984) 참조.

CD4+ T 세포가 IL-31을 생산하며, IL-31 발현에 대한 피부의 IHC 분석은 IL-31이 피지선 및 땀샘에서 발현된다는 것을 시사한다. 표피 각질세포의 IL_31 자극은 세포 침윤을 가져올 가능성이 있는 케모카인의 발현을 유도하며, 이것은 IL-31이 피부에서 전-염증성 반응에 기여할 수 있음을 시사한다. Dillon S.R., et al., Nat Immunol:5, 752 (2004) 참조. 따라서, IL-31은 장미 여드름 및 일반 여드름의 병리생리학에 기여할 수 있다.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 여드름의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

결절성 양진

결절성 양진은 치료가 어려운 난치성 소양증에 기인하는 태선화되거나 벗겨진 결절의 발진이다. 만성적인 마찰이 태선화, 및 선형으로 벗겨진 부분의 긁기를 초래하고, 개체가 가려운 곳을 집어서 둥근 홈을 내는 동안, 자극된 피부는 결절성 양진이라고 하는 현저히 두꺼워진 구진을 만들려는 경향이 있다. 결절성 양진이 아토피 피부염에 특이적인 것은 아니지만, 이들 결절을 가진 많은 환자는 또한 아토피 반응을 가지는데, 이것은 알레르기 비염, 천식, 또는 음식 알레르기로서 나타난다. 소양성 병소에서 침윤 세포의 대부분은 T 세포이며, 이들 병소는 주로 아토피 환자들에서 가장 가려운 피부 병소이다.

소 감각 피부신경에서 섭스턴스 P와 같은 신경펩티드를 고갈시켜 가려움 및 통증의 지각을 방해하는 항-소양증 알칼로이드인 캡사이신을 사용한 결절성 양진의 국소 치료가 피부 병소의 청소를 가져오는 효과적인고 안전한 섭생인 것으로 증명되었다. Stander S., et al., J Am Acad Dermatol:44, 471 (2001) 참조. 캡사이신 치료를 이용한 NC/Nga 마우스에서 가려움 반응의 연구는 피부염 병소의 자발적 발생이 거의 완전히 방지되었음을 나타냈다. 더욱이, 혈청 IgE 수준의 상승이 현저히 억제되었고, 캡사이신 치료된 마우스의 손상된 피부에서는 침윤한 호산구 및 비만세포의 수가 감소되었다. Mihara K., et al., Br J Dermatol:151, 335 (2004) 참조. 이 그룹의 관찰은 긁기 행동이 다양한 면역학적 반응들을 증진시킴으로써 피부염의 발생에 기여할 수 있음을 시사하는데, 이것은 가려운 감각 및/또는 가려움-관련 생채기 행동의 예방이 AD의 치료에 효과적일 수 있음을 의미한다. Mihara K., et al., Br J Dermatol:151, 335 (2004) 참조. 따라서, 본원에 설명된 항-IL-31 항체는, 이것이 NC/Nga 마우스에서 긁기를 어느 정도 감소시킨다고 본원에서 나타낸 바에 따라, AD, 결절성 양진, 및 다른 소양성 질환의 영향을 최소화하는데 유용할 것이다.

IL-31의 만성적인 송달은 마우스에서 소양증 및 탈모증을 유도한 다음 피부염과 유사한 피부 병소를 발생시키는데, 이것은 IL-31이 가려움을 유발할 수 있음을 시사한다. Dillon S.R., et al., Nat Immunol:5, 752 (2004) 참조. 가려움 반응의 유발에서 IL-31의 관련성이 실시예 52에서 두 방법, 즉 (i) IL-31 처리된 마우스의 캡사이신 치료 및 (ii) Tac1 녹아웃 마우스의 IL-31 처리에 의해 시험되었는데, 이것들은 신경펩티드의 발현 결여로 인해 상당히 감소된 통각수용기 통증 반응을 가진다. 이에 더하여, IL-31 처리된 마우스에서 IL-31의 중화가 소양증과 탈모증을 예방할 수 있는지가 실시예 12에서 시험되었다.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 결절성 양진의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

피부-향성 바이러스 및 바이러스 관련 소양증

말초혈 중의 단순 헤르페스 바이러스(HSV)-특이적 CD8+ T 세포 및 헤르페스 병소로부터 수거된 HSV-특이적 CD8+ T 세포는 CLA를 높은 수준 발현하지만, 비-피부-향성 헤르페스 바이러스-특이적 CD8+ T 세포는 CLA을 발현하지 않는다. Koelle D.M., et al., J Clin Invest:110, 537 (2002) 참조. HSV-2 반응성 CD4+ T 림프구는 또한 CLA를 발현하지만, CD8+ T 림프구에서 이전에 관찰된 것에 비해 낮은 수준으로 발현한다. Gonzalez J.C., et al., J Infect Dis:191, 243 (2005) 참조. 또한, 소양증이 헤르페스 바이러스 감염과 관련되었지만(Hung K. Y., et al., Blood Purif:16, 147 (1998) 참조), HTV와 같은 다른 바이러스 질환들 또한 소양증 피부 병소와 관련되었다. 홍반성구진 피부 병소 및 과다호산구증가증과 주로 관련된 중증의 난치성 소양증이 어떤 비-아토피 HIV-감염 환자에서 관찰된 상태이다. Singh F. & Rudikoff D, Am J Clin Dermatol: 4, 177 (2003); 및 Milazzo R, Piconi S., et al., Allergy:54, 266 (1999) 참조.

피부-향성 바이러스와 소양증 및 CLA+ T 세포와의 관련성은 T 세포를 생산하는 IL-31이 바이러스 감염의 병리생리학에 연루될 수 있음을 시사한다.

따라서, 본원에 설명된 항체에 의한 IL-31의 중화는 질환과 관련된 염증 및/또는 긁기를 억제, 감소, 예방 또는 차단함으로써 피부-향성 바이러스와 관련된 소양증의 임상성과를 개선하는데 사용될 수 있다.

더욱이, 염증은 침입원을 밀어내려는 유기체에 의한 보호반응이다. 염증은 많은 세포 및 체액 매개인자들이 연루되는 계단식 사건이다. 한편, 염증반응의 억제는 숙주에 면역손상을 남길 수 있다. 그러나, 검사되지 않은 채로 방치된다면, 염증은 만성 염증질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 등), 패혈쇼크 및 다발성 기관부전을 포함하는 심각한 합병증을 남길 수 있다. 중요한 것은 이들 다양한 질환 상태가 공통된 염증 매개인자를 공유한다는 점이다. 염증을 특징으로 하는 질환들의 집단은 인간의 질병률과 사망률에 큰 영향을 미친다. 따라서, 본원에 설명된 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩티드와 같은, 항-염증성 항체 및 결합 폴리펩티드가 천식 및 알레르기에서 자가면역 및 패혈쇼크에 이르는 많은 수의 인간 및 동물 질환에서 중요한 치료학적 잠재력을 가질 수 있다는 것이 분명하다. 이와 같이, 본원에 설명된 항-염증성 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩티드는, 특히 관절염, 내독소증, 염증성 장 질환, 건선, 및 관련 질환 등과 같은 질환들에서 본원에 설명된 IL-31 길항제로서 치료학적으로 사용될 수 있다.

1. 관절염

골 관절염, 류마티스 관절염, 상해로 인한 관절염성 관절 등을 포함하는 관절염은 보편적인 염증성 상태인데, 이것은 본 발명의 항-IL-31 항체 및 결합 폴리펩티드와 같은, 항-염증성 항체 및 결합 폴리펩티드의 치료학적 사용으로부터 이익을 얻을 수 있을 것이다. 예를 들어, 류마티스 관절염(RA)은 전 신체에 영향을 미치는 전신적 질환으로서, 가장 보편적인 형태의 관절염 중 하나이다. 이것은 관절 내층 막의 염증을 특징으로 하며, 통증, 강직, 온기, 붉어짐 및 팽윤을 야기한다. 염증성 세포는 뼈와 연골을 효소절단할 수 있는 효소를 방출한다. 류마티스 관절염의 결과, 염증이 생긴 관절 내층, 즉 윤활막이 뼈와 연골로 침입하여 뼈와 연골을 손상시켜, 그 결과 다른 생리학적 효과 중에서도 관절 악화와 심한 통증을 일으킬 수 있다. 연루된 관절은 그것의 모양 및 배열을 잃을 수 있으며, 그 결과 통증이 생기고 움직이지 못하게 될 수 있다.

류마티스 관절염(RA)은 염증 및 이어진 조직손상을 특별한 특징으로 하는 면역-매개 질환으로서, 심한 장애와 증가된 사망률을 가져온다. 여러 사이토카인이 류마티스 관절에서 국소적으로 생산된다. 많은 연구에 의해, 두 가지 단백질분해 전-염증성 사이토카인인 IL-1 및 TNF-알파가 윤활막 염증 및 관절파괴의 진행에 연루된 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것이 증명되었다. 실제로, RA 환자에게 TNF-알파 및 IL-1 억제제의 투여는 임상적 및 생물학적 염증 징후의 극적인 개선과 뼈침식 및 연골파괴의 방사선적 징후의 감소를 가져왔다. 그러나, 이들 고무된 결과에도, 상당한 퍼센트의 환자는 이들 제제에 반응하지 않고 있는데, 이것은 다른 매개인자들 또한 관절염의 병리생리학에 연루됨을 시사한다(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002). 이들 매개인자 중 하나가 IL-31일 수 있는데, 따라서 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너와 같은 IL-31과 결합하거나 이것을 억제하는 분자가 류마티스 관절염 및 다른 관절 질환에서 염증을 감소시키기 위한 가치있는 치료제로서 사용될 수 있다.

류마티스 관절염에 대한 몇몇 동물 모델이 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 콜라겐-유발 관절염(CIA) 모델에서, 마우스에서 인간 류마티스 관절염과 매우 유사한 만성 염증성 관절염이 발생한다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특징을 공유하므로, 이것은 잠재적인 인간 항-염증성 화합물을 스크리닝하기 위한 이상적인 모델이 된다. CIA 모델은 그 발생이 면역반응과 염증반응에 모두 좌우되는 잘 알려진 마우스 모델이다. 면역반응은 B 세포와 CD4+ T 세포의 콜라겐에 반응하는 상호작용을 포함하며, 이것은 항원으로서 제공되고, 항-콜라겐 항체의 생산을 가져온다. 마우스의 자생 콜라겐에 대한 이들 항체 교차-반응 중 일부와 상보성 계단식 반응의 활성화의 결과에 따른, 염증의 매개인자로부터의 조직반응의 결과가 염증 단계이다. CIA 모델을 이용하는 것의 이점은 병리학의 기초 메커니즘이 알려져 있다는 점이다. II형 콜라겐 상의 관련 T 세포 및 B 세포 에피토프가 확인되었으며, 면역-매개 관절염에 관련된 다양한 면역학적(예를 들어, 지연형 과민증 및 항-콜라겐 항체) 및 염증성(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 및 기질-변성 효소) 매개변수들이 결정되었고, 이로써 이것들은 CIA 모델에서 시험 화합물 효능을 평가하는데 사용될 수 있다(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al, Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997; 및 Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).

이들 CIA 모델 마우스에 대한 IL-31RA-Fc4 또는 다른 IL-31RA 가용성 및 융합 단백질과 같은, 폴리펩티드(본원에 설명된 헤테로다이머 및 멀티머 수용체를 포함하는)를 포함하는 가용성 IL-31RA의 투여를 이용하여 질환의 증상을 개선하고 경과를 변화시키기 위한 IL-31RA의 사용을 평가했다. 면역반응 및 염증반응을 조정하는 분자로서 IL-31은 류마티스 관절염의 병리학에 관련되는 SAA의 생산을 유도할 수 있다. IL-31 길항제는 시험관내 및 생체내에서 SAA 활성을 감소시킬 수 있다. 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너와 같은 IL-31 길항제, IL-31RA-Fc4 또는 다른 IL-31RA 가용성 및 융합 단백질과 같은 IL-31RA 포함 폴리펩티드(본원에 설명된 헤테로다이머 및 멀티머 수용체를 포함하는)의 전신적 또는 국소적 투여는 잠재적으로 RA에서 염증반응을 억제할 수 있다. 다른 가능한 치료제는 본 발명의 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

2. 내독소증

내독소증은 박테리아 및 다른 감염성 질환 발생원 같은 감염원, 패혈증, 독성쇼크 증후군으로 인한, 또는 기회감염에 노출된 면역손상 환자에서의 일반적 중증 상태이다. 본 발명의 항-IL-31 항체 및 결합 파트너와 같은, 치료학적으로 유용한 항-염증성 항체 및 결합 파트너가 인간 및 동물에서 내독소증을 예방하고 치료하는데 도움이 될 수 있다. 다른 잠재적인 치료제는 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 본 발명의 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다. 내독소증에서 염증 및 병리학적 효과를 줄이기 위한 다양한 치료제로서 사용될 수 있다.

지질다당질(LPS) 유발 내독소증이 감염성 질환에서 병리학적 효과를 생산하는 많은 전-염증성 매개인자를 참여시키는데, 설치류의 LPS 유발 내독소증이 잠재적인 전-염증성 또는 면역조정성 제제의 약물학적 효과를 연구하는데 광범하게 사용되는 허용되는 모델이다. 그람-음성 박테리아에서 생산된 LPS가 패혈쇼크의 병리학에서 주된 원인물질이다(Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). 쇼크-유사 상태는 사실 동물에 LPS를 1회 주사함에 의해 실험적으로 유도될 수 있다. LPS에 반응하는 세포에 의해 생산된 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 병원체를 표적으로 한다. 이들 생물학적 반응은 침입한 병원체에 대해 숙주를 보호하지만, 이것들은 또한 유해할 수도 있다. 이와 같이, 중증 그람-음성 박테리아 감염의 결과로서 발생하는 선천면역의 대량 자극은 사이토카인 및 다른 분자들의 과잉 생산과, 열, 저혈압, 파종성 혈관내 응고 및 다발성 기관부전을 특징으로 하는 패혈쇼크 증후군인 치사 증후군의 발생을 초래한다(Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).

LPS의 이들 독성 효과는 대부분 다수의 염증 매개인자의 방출을 초래하는 대식세포 활성화에 관련된다. 중화 항-TNF 항체의 투여에 의해 LPS 독성이 예방됨으로써 암시된 바에 따라, 이들 매개인자 중에서도 TNF가 중요한 역할을 하는 것으로 드러났다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 이에 따라, C57B1/6 마우스에 E. coli LPS의 1ug 주사가 주사 후 대략 2시간째에 순환 IL-6, TNF-알파, IL-1, 및 급성 단계 단백질(예를 들어, SAA)의 상당한 감소를 가져올 것임이 매우 확실하다. LPS의 독성은 이들 사이토카인에 의해 매개되는 것으로 나타나므로, 이들 매개인자에 대한 수동적 면역화는 사망률을 감소시킬 수 있다(Beutler et al., Science 22 9:869, 1985). 패혈쇼크의 예방 및/또는 치료를 위한 가능한 면역개입 전략은 항-TNF mAb, IL-1 수용체 길항제, LIF, IL-10, 및 G-CSF를 포함한다. LPS가 내독소증의 병리에 기여할 가능성이 있는 전-염증성 인자들의 생산을 유도하므로, IL-31 폴리펩티드를 길항함에 의한 IL-31 활성, SAA 또는 다른 전-염증성 인자들의 중화를 이용하여 내독소 쇼크에서 보이는 것과 같은 내독소증 증상을 줄일 수 있다. 다른 가능한 치료제는 본 발명의 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

3. 염증성 장 질환. IBD

미국에서는 대략 500,000명의 사람들이 염증성 장 질환(IBD)을 앓고 있는데, 이것은 결장 및 직장(궤양성 결장염) 또는 소장과 대장 모두(크론병)에 영향을 미칠 수 있다. 이들 질환의 병리학은 불투명하지만, 이것은 손상된 조직의 만성적인 염증을 수반한다. 가능한 치료제는 본 발명의 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다. IBD 및 관련 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 줄이기 위한 가치있는 치료제로서 사용될 수 있다.

궤양성 결장염(UC)은 흔히 결장이라 하는 대장의 염증성 질환으로서, 결장의 점막이나 최내층의 염증 및 궤양을 특징으로 한다. 이 염증으로 인해 결장이 빈번히 비워져서 설사가 유발된다. 증상은 변의 설사화와 관련된 비정상적인 경련, 열 및 체중손실을 포함한다. UC의 정확한 원인은 알려지지 않았지만, 최근 연구는 신체의 자연적 방어가 신체가 외래의 것이라고 생각하는 체내 단백질에 대해 작동한다는 것을 시사한다("자가면역반응"). 아마 이것들은 소화관에 있는 박테리아 단백질과 유사하기 때문에, 이들 단백질은 결장의 내층을 파괴하기 시작하는 염증 과정을 조장하거나 자극할 수 있다. 결장의 내층이 파괴됨에 따라 점액, 고름 및 혈액을 방출하는 궤양이 형성된다. 이 질환은 일반적으로 직장 영역에서 시작되며, 결국에는 전체 대장 전체로 확장될 수 있다. 반복된 염증 사건은 흉터 조직과 함께 장 및 직장 벽의 비후화를 가져온다. 결장조직의 괴사 또는 패혈증이 중증 질환에서 발생할 수 있다. 궤양성 결장염의 증상은 심한정도에 따라 변하며, 개시는 점진적일 수도 있고 돌연할 수도 있다. 공격은 호흡기 감염 또는 스트레스를 포함하는 많은 요인에 의해 유발될 수 있다.

현재 이용할 수 있는 UC에 대한 특별한 치료법은 없지만, 치료는 결장 내층에서 비정상적인 염증성 과정을 억제하는데 중점을 두고 있다. 코르티코스테로이드 면역억제제(예를 들어, 아자티오프린, 메르캅토퓨린 및 메토트렉세이트) 및 아미노살리실레이트를 포함한 치료제가 이 질환의 치료에 이용될 수 있다. 그러나, 코르티코스테로이드 및 아자티오프린과 같은 면역억제제의 장기적 사용은 뼈의 얇아짐, 백내장, 감염, 및 간 및 골수에 대한 영향과 같은 심각한 부작용들을 초래할 수 있다. 현재의 치료법이 성공하지 못한 환자에서는 수술이 선택사항이다. 수술은 전체 결장 및 직장의 제거를 수반한다.

만성 궤양성 결장염을 부분적으로 의태할 수 있는 몇몇 동물 모델이 있다. 가장 널리 사용되는 모델은 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산/에탄올(TNBS) 유발된 결장염 모델인데, 이것은 결장에 만성 염증 및 궤양을 유도한다. TNBS가 직장내 점적주입에 의해 감수성 있는 마우스의 결장에 도입되었을 때, 그것은 결장 점막에서 T 세포 매개 면역반응을 유도하며, 이 경우 대장의 전체 장벽 전체적으로 T 세포 및 대식세포의 조밀한 침윤을 특징으로 하는 대대적인 점막염증을 초래한다. 더욱이, 이 조직병리학적 그림은 진행성 체중손실(소모성), 혈설사, 직장탈출, 대장벽 비후화의 임상적 그림을 수반한다(Neurath et al., Intern. Rev. Immunol., 19:51-62, 2000).

또 다른 결장염 모델은 덱스트란 술페이트 나트륨(DSS)를 이용하는데, 이것은 혈설사, 체중손실, 결장의 단축 및 호중구 침윤이 있는 점막궤양에 의해 나타나는 급성 결장염을 유발한다. DSS-유발 결장염은 고유판 쪽으로 염증성 세포의 침윤에 의해 조직학적으로 특정되며, 림프양 과다형성, 국소 크립트(crypt) 손상, 및 상피궤양을 나타낸다. 이들 변화는 상피에 대한 DSS의 독성 효과로 인해서, 그리고 고유판 세포의 포식작용과 TNF-알파 및 IFN-감마의 생산에 의해 발생하는 것으로 생각된다. 그것의 보편적인 사용에도, 인체 질환과의 관련성에 대해 DSS의 메커니즘에 관련된 몇몇 문제는 미해결인 채로 남아 있다. DSS는 SCID 마우스와 같은 T 세포-결핍 동물에서 관찰되기 때문에 T 세포-독립적 모델로서 간주된다.

이들 TNBS 또는 DSS 모델에 IL-31RA-Fc4 또는 다른 IL-31RA 가용성 및 융합 단백질과 같은 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너, 가용성 IL-31RA 포함 폴리펩티드(헤테로다이머 및 멀티머 수용체를 포함하는)를 투여하여 위장관 질환의 증상을 개선하고 그 경과를 변경시키기 위한 IL-31 길항제의 사용을 평가할 수 있다. IL-31은 결장염의 염증반응에서 어떤 역할을 할 수 있으며, IL-31 길항제의 투여에 의한 IL-31 활성의 중화가 IBD에 대한 잠재적인 치료학적 접근법이다. 다른 가능한 치료제는 본 발명의 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너 등을 포함한다.

4. 건선

건선은 700만명 이상의 미국인이 앓고 있는 만성적인 피부 이상이다. 건선은 새로운 피부세포가 비정상적으로 성장할 때 발생하며, 피부의 염증, 팽윤 및 오래된 피부가 충분히 빨리 떨어지지 않아서 생기는 비늘형 반을 초래한다. 가장 흔한 형태인 판상 건선은 은빛의 백색 각질로 위가 덮인 피부의 염증성 반("병소")을 특징으로 한다. 건선은 몇몇 판에만 제한될 수도 있고, 피부의 중간 정도에서 광범한 영역을 포함할 수도 있으며, 두피, 무릎, 팔꿈치 및 몸통에서 가장 흔하게 출현한다. 건선은 눈에 매우 잘 보이지만 접촉전염성 질환은 아니다. 이 질환의 병리학은 손상된 조직의 만성적인 염증을 수반한다. 본 발명의 IL-31RA 폴리펩티드, 가용성 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드, 또는 항-IL-31 항체 또는 결합 파트너가 건선, 다른 염증성 피부질환, 피부 및 점막 알레르기, 및 관련 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 줄이기 위한 가치 있는 치료제로서 사용될 수 있다.

건선은 피부의 T 세포 매개 염증성 장애로서, 상당한 불쾌감을 일으킬 수 있다. 이것은 완전한 치료법이 없는 질환으로서, 모든 연령의 사람이 걸릴 수 있다. 유럽 및 북아메리카 인구의 약 2%가 건선을 앓고 있다. 경증 건선을 앓는 개체는 대체로 그들의 질환이 국소 제제로 제어될 수 있지만, 전세계적으로 100만명 이상의 환자가 자외선 또는 전신적 면역억제 치료법을 필요로 한다. 불행히도, 자외선 조사의 불편과 위험 및 많은 치료법의 독성으로 인해 이것들의 장기적인 사용은 제한된다. 더욱이, 환자는 일반적으로 건선의 재발을 가진다.

IL-31은 중요한 면역학적 기능을 가진다고 알려지고 면역시스템에서 어떤 역할을 하는 세포를 함유하는 조직으로부터 분리되었다. IL-31은 CD3+ 선별된 활성화된 말초혈 세포에서 발현되며, IL-31 발현은 T 세포 활성화 후에 증가한다고 밝혀졌다. 더욱이, 본원 실시예 부문에서 설명된 실험들의 결과는 본 발명의 폴리펩티드가 단핵구/대식세포, T 세포, B 세포, NK 세포 및/또는 분화된 상태의 단핵구/대식세포, T 세포, B 세포, NK 세포 또는 이들 세포의 선조들의 성장/확장에 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 조혈 선조의 증식을 자극하고 성숙세포를 활성화하는 인자가 일반적으로 알려져 있지만, 증식 및 활성화는 또한 추가의 성장인자들을 필요로할 수도 있다. 예를 들어, IL-7 및 Steel Factor(c-키트 리간드)가 NK 선조의 콜로니 형성에 필요했다는 것이 밝혀졌다. IL-7 및 Steel Factor와 조합된 IL-15 + IL-2가 더욱 효과적이었다(Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). 그러나, NK 세포 및/또는 NK 선조의 특정 서브셋의 증식에는 확인되지 않은 사이토카인이 필요할 수도 있다(Robertson et. al., Blood 76:2451-2438, 1990). 유사하게, IL-31은 단독으로 또는 다른 사이토카인과 제휴하거나 상조적으로 작용하여 단핵구/대식세포, T 세포, B 세포 또는 NK 세포의 성장, 증식, 확장 및 분화의 변형을 증진시킬 수 있다.

본 발명은 단핵구/대식세포의 활성화 또는 분화를 억제하는 방법을 제공한다. 단핵구는 여러 조직으로 이주하는 불완전하게 분화된 세포이며, 이주한 조직에서 이들은 성숙하여 대식세포가 된다. 대식세포는 림프구에 대한 항원을 나타냄으로써 면역반응에서 중추적인 역할을 하고, 수많은 사이토카인을 분비함으로써 림프구를 지원하는 보조세포로서의 역할을 한다. 대식세포는 세포외 분자를 내면화할 수 있으며, 활성화시에는 세포내 미생물과 종양세포를 죽일 수 있는 능력이 증가한다. 또한, 활성화된 대식세포는 급성 또는 국소적 염증을 자극하는데 연루된다.

주어진 사이토카인에 대한 수용체의 조직분포는 이 사이토카인이 작용하는 잠재적 부위에 대한 강한 표시이다. IL-31RA의 발현이 단핵구 및 B 세포에서 나타났고, CD3+, CD4+, 및 CD8+ T 세포에 대한 활성화시에 발현은 극적으로 증가했다. 이에 더하여, 두 개의 단핵구 셀라인, THP-1(Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26: 171-176, 1980) 및 U937(Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17:565-577, 1976)이 또한 IL-31RA 발현에 대해 양성이었다.

OSMR의 발현은 매우 광범한 것으로 보고된다(Mosley et al, JBC 271:32635-32643, 1996). IL-31RA 및 OSM 수용체의 이런 분포는 면역반응, 특히 활성화시 T 세포의 확장에서 IL-31의 역할, 또는 면역시스템의 단핵구/대식세포 가지에서의 역할을 뒷받침한다.

따라서, 본 발명의 특정 구체예는 췌장염, I형 당뇨병(IDDM), 췌장암, 췌장염, 그레이브스병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 결장 및 장암, 게실증, 자가면역질환, 패혈증, 기관 및 골수 이식; 외상, 수술 또는 감염으로 인한 염증; 아밀로이드증; 비장비대; 이식편 대 숙주병; 및 염증억제, 면역억제, 조혈, 면역, 염증 및 림프양 세포, 대식세포, T 세포(Th1 및 Th2 세포, CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는)의 증식 감소, 병원체 또는 항원에 대한 면역반응의 억제가 유리한 염증성 질환 및 면역 질환 또는 상태에서 길항제로서 가용성 IL-31RA/OSMR 헤테로다이머의 사용에 관한 것이다. 더욱이, 활성화된 CD4+ 및 CD19+ 세포와 같은 활성화된 면역세포에서 IL-31RA 발현의 존재는, IL-31RA 수용체가 미생물 및 세포파편과 같은 외부 침입자에 대한 신체의 면역방어 반응에 연루될 수 있으며, 염증 및 암 형성 동안 면역반응에서 어떤 역할을 할 수 있음을 나타냈다. 따라서, IL-31과 같은 IL-31RA 수용체 기능에 대한 작용제 또는 길항제인 본 발명의 항체 및 결합 파트너는 면역반응과 염증을 조절하는데 사용될 수 있다.

IL-31은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병 등을 포함하는 자가면역질환의 치료에서와 같이, 면역시스템의 억제에서 유용성을 찾을 수 있다. 또한, 면역억제는 손상된 세포 타입의 증식을 억제함으로써, 조직 또는 기관 이식조직 및 이식편의 거부를 줄이고, T 세포, B 세포 또는 단핵구-특이적 백혈병 또는 림프종, 및 다른 암들을 치료하는데 사용될 수 있다. 더욱이, IL-31은 단핵구, 대식세포, 및 활성화된 T 세포를 검출하고, 특히 단핵구가 상승되거나 활성화되는 질환 상태에서, 이러한 자가면역질환의 진단에 도움이 되도록 사용될 수 있다.

또한, IL-31 폴리펩티드, 펩티드, 항체 등은 IL-31의 순환 수준의 검출을 위한 진단시스템 내에서 사용될 수 있다. 관련된 구체예 내에서, IL-31 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 제제를 사용하여 순환 IL-31 폴리펩티드를 검출할 수 있다. 리간드 폴리펩티드의 상승된 또는 억제된 수준이 암을 포함하는 병리학적 상태의 표시일 수 있다. IL-31 폴리펩티드는 병리학적 과정에 기여할 수 있으며, 잠재된 질환의 간접적인 마커일 수 있다.

더욱이, 당업자는 IL-31의 길항제가 유용하다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, 죽상경화증 병소에서, 최초의 이상 중 하나는 내피세포에 단핵구/대식세포의 국소화이다. 이들 병소는 IL-31에 대한 길항제를 사용하여 예방될 수 있다. 항-IL-31 항체(예를 들어, IL-31 중화 항체), IL-31RA 가용성 수용체, 헤테로다이머 및 멀티머, 및 IL-31 결합 파트너가 또한 IL-31에 대한 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 단모구성 백혈병은 대식세포의 생물학적 산물의 방출을 반영하는 여러 임상적 이상과 관련되는데, 예들은 혈청 및 뇨 중의 리소자임의 높은 수준과 고열을 포함한다. 더욱이, 이러한 백혈병은 단핵세포의 비정상적인 증가를 나타낸다. 이들 효과는 본원에 설명된 것과 같은 IL-31에 대한 길항제에 의해 가능한 예방될 수 있다. 더욱이, 항-IL-31은 본원에 설명된 대로 독성 부분 및 사이토카인과 같은 분자에 콘쥬게이트될 수 있으며, 이로써 백혈병 단핵세포의 살해를 지시한다.

T 세포, 대식세포 및 단핵구-특이적 방식으로 IL-31이 발현되고, 이들 질환이 세포 증식, 기능, 국소화, 및 활성화와 같은 단핵세포 이상을 수반하기 때문에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 및 항체는 이러한 단핵세포 이상을 검출하여 질환의 존재를 표시하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 환자로부터 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 타액, 또는 생검을 채취하고, 그것을 정상 대조군 샘플과 비교하는 것을 수반한다. 조직학, 세포학, 유세포분석, 생화학 및 다른 방법들이 정상 대조군과 비교하여 환자 샘플에서 IL-31의 상대적 수준 또는 국소화, 또는 IL-31을 발현하는 세포, 즉 단핵구를 측정하는데 사용될 수 있다. 대조군과 비교하여 IL-31 발현 수준의 변화(증가 또는 감소), 또는 단핵구 수 또는 국소화의 변화(예를 들어, 정상적으로는 존재하지 않는 조직 내의 단핵세포의 증가 또는 침윤)이 질환의 표시일 것이다. 이러한 진단 방법은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체에 부착된 방사선 측정, 형광, 및 색채 측정 택을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며 본원에 개시된다.

IL-31은 활성화된 단핵세포에서 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 염증을 조절하는데 연루될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 염증 조절 능력에 대해 평가되어 사용될 수 있거나, 염증에 대한 마커로서 사용될 수 있다. IL-31의 전-염증성 및 항-염증성 성질을 측정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며 본원에 논의된다. 더욱이, 그것은 혈청 아밀로이드 A(SAA), α1-안티키모트립신, 및 합토글로빈과 같은 급성 단계 반응물의 생산을 상향 조절하는데 연루될 수 있고, IL-31RA 수용체 리간드의 발현은 염증반응에 연루되는 생체내 지질다당질(LPS)의 주사에 의해 증가될 수도 있다(Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 97:10144-10149, 2000). SAA 같은 급성 단계 단백질의 생산은 단기 생존 메커니즘이라고 하며, 이 경우에는 염증이 유리하다. 그러나, 장기간 동안의 급성 단계 단백질 유지는 만성 염증에 기여하며, 인체 건강에 유해할 수 있다. Uhlar, CM 및 Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, 및 Baumann H. and Gauldie, J. Immuno-logy Today 15: 74-80, 1994 참조. 더욱이, 급성 단계 단백질 SAA는 중증 만성 염증 질환의 병리학에 연관되며, 죽상경화증 및 류마티스 관절염에 연관되고, 아밀로이드증에서 침착되는 아밀로이드 A 단백질의 전구체이다(Uhlar, CM 및 Whitehead, 상동). 따라서, IL-31과 같은 리간드가 전-염증성 분자로서 작용하고 SAA의 생산을 유도하는 경우, 이 리간드에 의해 유발된 급성 단계 반응 단백질과 관련된 염증성 질환 및 다른 질환들을 치료하는데 길항제가 유용할 것이다. 이러한 길항제가 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, 염증을 감소시키는 방법은 염증을 가진 포유류에게 IL-31, 또는 항-IL-31 항체(예를 들어, 중화 항체)의 조성물을 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 더욱이, 염증을 가진 포유류에서 염증반응을 억제하는 방법은 (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 담체 중에 본원에 설명된 IL-31 폴리펩티드 또는 항-IL-31 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 투여 후 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준이 증가하지 않거나 또는 감소한 것이 염증반응이 억제되었다는 표시이다.

IL-31처럼, 그것의 IL-31RA 수용체 cDNA에 상응하는 mRNA의 조직분포의 분석은 mRNA 수준이 단핵구와 전립선 세포에서 가장 높았으며, 활성화된 단핵구와 활성화된 CD4+, 활성화된 CD8+, 및 활성화된 CD3+ 세포에서 상승한다는 것을 나타냈다. 이에 따라, IL-31RA 수용체가 또한 염증반응 및 면역반응을 유도하는데 관련된다. 따라서, 본 발명의 특정 구체예는 췌장염, I형 당뇨병(IDDM), 췌장암, 췌장염, 그레이브스병, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 결장 및 장암, 게실증, 자가면역질환, 패혈증, 기관 및 골수 이식; 이식편 대 숙주병; 및 염증억제, 면역억제, 조혈, 면역, 염증 및 림프양 세포, 대식세포, T 세포(Th1 및 Th2 세포, CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하는)의 증식 감소, 병원체 또는 항원에 대한 면역반응의 억제가 유리한 염증성 질환 및 면역 질환 또는 상태에서 길항제로서 IL-31-항체, 및 IL-31, 뿐만 아니라 가용성 IL-31RA 수용체 헤테로다이머의 사용에 관한 것이다. 더욱이, 활성화된 CD3+, 단핵구, CD4+ 및 CD19+ 세포와 같은 활성화된 면역세포에서 IL-31RA 수용체 및 IL-31 발현의 존재는, IL-31RA 수용체가 미생물 및 세포파편과 같은 외부 침입자에 대한 신체의 면역방어 반응에 연루될 수 있으며, 염증 및 암 형성 동안 면역반응에서 어떤 역할을 할 수 있음을 나타냈다. 따라서, IL-31RA 수용체 기능에 대한 작용제 또는 길항제인 본 발명의 IL-31 및 IL-31 항체를 사용하여 면역반응과 염증을 조절할 수 있다.

IL-31RA 수용체 폴리펩티드에 결합하는 IL-31 폴리펩티드, 및 그에 대한 항체는 다음에 유용하다:

1) 염증은 외상, 조직손상, 수술, 패혈증 또는 감염, 및 천식, 염증성 장 질환(IBD), 만성 결장염, 비장비대, 류마티스 관절염, 재발성 급성 염증성 사건(예를 들어, 결핵)으로 인한 급성 염증의 치료에서, 그리고 아밀로이드증, 및 죽상경화증, 캐슬만병, 천식, 및 급성 단계 반응의 유발과 관련된 다른 질환들의 치료에서 IL-31RA-포함 수용체를 통한 신호화를 길항하거나 차단한다.

2) IDDM, 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 루프스(SLE), 중증근무력증, 류마티스 관절염, 및 IBD와 같은 자가면역질환의 치료에서 IL-31RA 수용체를 통한 신호화를 길항하거나 차단함으로써, IL-31RA 수용체를 통한 면역세포(예를 들어, 림프구, 단핵구, 백혈구)에서의 신호화를 방지하거나 억제한다(Hughes C., et al., J. Immunol 153:3319-3325, 1994). 또는 달리, IL-31에 대한 단클론성 항체(MAb)와 같은 항체들은 또한 원치않는 면역세포를 고갈시켜 자가면역질환을 치료하는 길항제로서 사용될 수 있다. 천식, 알레르기 및 다른 아토피성 질환은 MAb 작용제, 예를 들어 항-IL-31 항체, 가용성 IL-31RA 수용체 가용성 수용체 또는 IL-31RA/CRF2-4 헤테로다이머로 치료될 수 있으며, 이로써 면역반응이 억제되거나 오펜딩 세포가 고갈된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 이용하여 IL-31RA를 통한 신호화를 차단 또는 억제하는 것은 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염 및 췌장암종에 유리할 수 있다. IL-31RA는 MAb를 길항하여 암 성장을 억제하고 면역-매개 살해를 표적화하는 암의 MAb 치료법의 표적으로서 사용될 수도 있다(Holliger P, 및 Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). 또한, 가용성 IL-31RA 수용체 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머에 대한 Mab는 사구체경화증, 막성 신경병증, 아밀로이드증(또한 다른 조직들 중에서도 신장에 영향을 미치는 것), 신장 동맥경화증, 다양한 기관들의 사구체신염, 신장의 섬유증식성 질환, 뿐만 아니라 SLE, IDDM, II형 당뇨병(NIDDM), 신장종양 및 다른 질환들에 관련된 신부전과 같은 신장병증을 치료하는데 유용할 수 있다.

3) IDDM, MS, SLE, 중증근무력증, 류마티스 관절염, 및 IBD와 같은 자가면역질환의 치료에서 IL-31RA 수용체를 통한 신호화를 작용시키거나 개시한다. IL-31은 자가면역을 개선하는 사이토카인 또는 세포 표면 단백질을 분화시키거나, 증식을 변경하거나, 또는 그 생산을 변화시키는 신호 림프구 또는 다른 면역세포일 수 있다. 구체적으로, 사이토카인 분비의 교대 패턴에 대한 T-헬퍼 세포 반응을 조정하여 질환을 개선하도록 자가면역반응을 일탈시킬 수 있다(Smith J. A. et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). 유사하게, IL-31을 이용하여 천식, 알레르기 및 아토피 질환에 연루된 면역세포를 신호화하고, 고갈시키고, 그리고 일탈시킬 수 있다. 또한, IL-31RA 수용체를 통한 신호화는 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종에서 유리할 수 있다. IL-31RA는 췌장암의 MAb 치료법의 표적으로서 사용될 수도 있는데, 이 경우 MAb의 신호화가 암의 성장을 억제하고 면역-매개 살해를 표적화한다(Tutt, A. L. et al., J Immunol. 161:3175-3185, 1998). 유사하게, T-세포 특이적 백혈병, 림프종, 형질세포질환(예를 들어, 다발성 골수종), 및 암종이 본 발명의 IL-31RA-포함 가용성 수용체에 대한 단클론성 항체(예를 들어, 중화 항체)로 치료될 수 있다.

본원에 설명된 항-IL-31 항체, 가용성 IL-31RA 수용체 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 폴리펩티드는 상기 설명된 대로 자가면역질환, 아토피 질환, NIDDM, 췌장염 및 신부전의 치료에서 IL-31RA 수용체 리간드 활성을 중화/차단하는데 사용될 수 있다.

항-IL-31 항체, 및 가용성 IL-31RA-포함 수용체는 IL-31의 길항제로서 유용하다. 이러한 길항효과는 직접적인 중화 또는 자연적인 리간드의 결합에 의해 달성될 수 있다. 길항 용도에 더하여, 가용성 수용체는 IL-31에 결합하여 담체 또는 담체 단백질로서 작용할 수 있으며, 이로써 IL-31을 체내의 다른 조직, 기관 및 세포로 수송할 수 있다. 이와 같이, 가용성 수용체는 가용성-수용체-리간드 복합체를 조직, 특정 면역세포, 단핵구 또는 종양과 같은 특정 부위로 보내는 분자, 폴리펩티드 또는 화학적 부분에 융합되거나 커플링될 수 있다. 예를 들어, 급성 감염이나 일부 암에서는 염증 및 국소 급성 단계 반응 단백질을 유도하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 가용성 수용체 또는 본 발명의 항체를 사용하여 전-염증성 IL-31 리간드의 작용을 구체적으로 지시할 수 있다. Cosman, D. Cyto-kine 5:95-106, 1993; 및 Fernandez-Botran, R. Exp. Qpin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000 참조.

일반적으로, 투여된 IL-31 폴리펩티드(또는 IL-31RA 유사체 또는 융합 단백질)의 투약량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의료상태 및 이전의 의료병력과 같은 요인들에 따라 변할 것이다. 전형적으로, 약 1pg/kg 내지 10mg/kg (제제의 양/환자의 체중)범위의 IL-31 폴리펩티드의 투약량을 수용자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 환경적인 요구에 따라 더 낮거나 높은 투약량도 투여될 수 있다. 당업자는 이러한 투약량을 쉽게 결정할 수 있으며, 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 그것을 조정할 수 있다.

환자에게 IL-31 폴리펩티드의 투여는 국소, 흡입, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 경막내 경로, 국소 카테테르를 통한 관류, 또는 직접적 병소내 주사에 의해 이루어질 수 있다. 주사에 의해 치료 단백질을 투여할 때, 투여는 연속 주입에 의해 또는 단일 또는 다수 볼루스에 의해 이루어질 수 있다.

추가적인 투여 경로는 경구, 점막, 폐, 및 경피 경로를 포함한다. 경구 송달은 폴리에스테르 마이크로스피어, 제인 마이크로스피어, 프로테이노이드 마이크로스피어, 폴리시아노아크릴레이트 마이크로스피어, 및 지질-기반 시스템에 적합하다(예를 들어, DiBase and Morrel "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins" in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)를 참조한다). 비내 송달의 가능성은 이러한 방식의 인슐린 투여에 의해 예시된다(예를 들어, Hinchcliffe and Hlum, Adv. Drug Deliv Rev. 35:199 (1999)를 참조한다). IL-31을 포함하는 건성 또는 액상 입자가 제조되고, 건성-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기 또는 분무기의 도움을 받아 흡입될 수 있다(예를 들어, Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)를 참조한다). 이 접근법은 AERX 당뇨병 관리 시스템에 의해 예시되는데, 이것은 에어로졸화된 인슐린을 폐로 송달하는 손바닥 크기의 전자식 흡입장치이다. 연구에 따르면 48,000 kDa 정도 크기의 단백질이 저주파 초음파의 도움을 받아 치료학적 농도로 피부를 가로질러 송달되었음이 밝혀졌는데, 이것은 경피 투여의 가능성을 예시한다(Mitragotri et al, Science 269:850(19 95)). 전기천공을 사용한 경피 송달은 IL-31 결합 활성을 갖는 분자를 투여할 수 있는 또 다른 수단을 제공한다(Potts et al, Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

제약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해 IL-31 결합 활성을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하는 제약 조성물이 공지된 방법에 따라 조제될 수 있으며, 여기서 치료 단백질은 제약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로서 조합된다. 조성물은 그것의 투여가 수용자 환자에 의해 견뎌질 수 있을 경우 "제약학적으로 허용되는 담체"라고 한다. 멸균된 인산염-완충 식염수가 제약학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체들이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 제19판, (Mack Publishing Company 1995)을 참조한다.

치료 목적에서, IL-31 결합 활성을 갖는 분자와 제약학적으로 허용되는 담체가 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된다. IL-31 결합 활성을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체의 조합은 투여된 양이 생리학적으로 유의할 경우 "치료학적 유효량"으로 투여된다고 한다. 제제는 그것의 존재가 수용자 환자의 생리기능에 검출가능한 변화를 초래한 경우 생리학적으로 유의하다. 예를 들어, 염증을 치료하는데 사용된 제제는 그것의 존재가 염증반응의 적어도 일부를 완화한 경우 생리학적으로 유의하다.

IL-31(또는 IL-31 유사체 또는 융합 단백질)을 포함하는 제약 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 마무리될 수 있다. 액체 형태는 주사용액, 에어로졸, 소적, 국소용액, 및 경구 현탁액에 의해 예시된다. 전형적인 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 제어방출 형태를 포함한다. 후자의 형태는 작은 삼투펌프 및 임플란트에 의해 예시된다(Bremer et al, Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al, "Protein Delivery with Infusion Pumps," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 (Plenum Press 1997)). 다른 고체 형태는 크림, 페이스트, 다른 국소 도포제 등을 포함한다.

또한, 본원에 개시된 항-IL-31 항체는 면역리포솜으로서 조제될 수도 있다. 이 항체를 함유하는 리포솜은 본 분야에 공지된 방법에 의해 제조되는데, 예를 들어 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호에 설명된다. 순환시간이 증진된 리포솜이 미국특허 제5,013,556호에 개시된다.

포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)를 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 특히 유용한 리포솜이 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 포어 사이즈의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경의 리포솜이 얻어진다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편이 이황화 교차 반응에 의해 Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)에 설명된 대로 리포솜에 콘쥬게이트될 수 있다. 화학치료제(독소루비신과 같은)가 리포솜 내에 선택적으로 함유된다. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989) 참조.

항체의 치료학적 조제물은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체와 선택적인 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 혼합함으로써(Remington's Pharma-ceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) 동결건조 조제물 또는 수성 용액의 형태로 저장에 알맞도록 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 것으로서, 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산들과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이트; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물류; EDTA 같은 킬레이트제; 당, 예를 들어 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 나트륨 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 Tween. TM, Pluronics.TM. 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다.

또한, 본원의 조제물은 치료될 특별한 처방에서의 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 서로 나쁜 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들이 함유된다. 예를 들어, 한 조제물 내에 IL-31과 결합하는 항체를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로서, 또는 추가하여, 조성물은 화학치료제 또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

또한, 활성 성분들은, 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 안에, 각기 콜로이드상 약물송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)으로, 또는 마크로에멀젼으로 잡혀있을 수도 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시된다.

생체내 투여에 사용될 조제물은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

지속방출 제제가 제조될 수 있다. 지속방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체로 된 반투과 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태를 가진다. 지속방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-변성 에틸렌-비닐 아세테이트, 변성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot.TM.(락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출하는 것이 가능하지만, 어떤 히드로겔들은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 체내에 그대로 유지될 때, 그것은 37℃에서 수분에 노출된 결과로서 변성되거나 응집될 수 있으며, 그 결과 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변화될 가능성이 있다. 합리적인 전략이 안정화를 위해 고안될 수 있는데, 이것은 수반된 메커니즘에 좌우된다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-이황화 교차를 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견된다면, 안정화는 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 그리고 특정한 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.

리포솜은 피험자에 치료 폴리펩티드를 정맥내, 복강내, 경막내, 근육내, 피하 경로에 의해, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비내 투여에 의해 송달할 수 있는 한 가지 수단을 제공한다. 리포솜은 수성 격막을 둘러싸고 있는 하나 이상의 지질 이중층으로 구성된 극미한 소체이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg et al, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs, 46:618 (1993), 및 Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)를 참조한다). 리포솜은 세포막과 조성이 유사하며, 결과적으로 리포솜은 안전하게 투여될 수 있고 생분해될 수 있다. 제조법에 따라서, 리포솜은 단층 또는 다층 구조일 수 있으며, 리포솜은 0.02㎛에서부터 10㎛ 이상까지의 범위의 직경으로 크기가 변할 수 있다. 다양한 제제들이 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다: 소수성 제제들은 이중층에 들어가고, 친수성 제제들은 내부 수성 공간(들)에 들어간다(예를 들어, Machy et al, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), 및 Ostro et al, American J. Hosp. Pharm. 46:1516 (1989)를 참조한다. 더욱이, 리포솜 크기, 이중층의 수, 지질 조성뿐만 아니라 리포솜의 전하 및 표면 특성을 다양화함으로써 캡슐화된 제제의 치료 유용성을 제어하는 것이 가능하다.

리포솜은 사실상 어떤 타입의 세포에도 흡착할 수 있으며, 그 다음 캡슐화된 제제를 서서히 방출시킨다. 또는 달리, 흡착된 리포솜은 포식세포에 의해 세포내이입될 수 있다. 세포내이입된 후에, 리포솜 지질의 리소솜내 분해와 캡슐화된 제제의 방출이 이어진다(Scherphof et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 작은 리포솜(0.1 내지 1.0㎛)은 전형적으로 간과 비장에 주로 위치한 세망내피 시스템의 세포에 의해 흡수되고, 3.0㎛ 이상의 큰 리포솜은 폐에 부착된다. 세망내피 시스템의 세포에 의한 작은 리포솜의 우선적인 흡수를 이용하여 화학치료제를 간의 대식세포 및 종양으로 송달하고 있다.

세망내피 시스템은 많은 용량의 리포솜 입자로의 포화, 또는 약물학적 수단에 의한 선택적인 대식세포 비활성화를 포함하는 몇몇 방법에 의해 우회될 수 있다 (Claassen et al, Biochim. Biophys. Acta 502:428 (1984)). 이에 더하여, 리포솜막 내에 당지질- 또는 폴리에틸렌글리콜-유도 인지질의 포함이 세망내피 시스템에 의한 흡수를 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

또한, 리포솜은 인지질 조성을 다양하게 하거나, 또는 리포솜에 수용체나 리간드를 삽입함으로써 특정 세포 또는 기관을 표적으로 하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 높은 함량의 비이온성 계면활성제를 사용하여 제조된 리포솜은 간을 표적화하는데 사용되었다(Hayakawa et al, 일본특허 04-244,018; Kato et al, Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). 이들 조제물은 대두 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡시화 수소화된 피마자유(HCO-60)를 메탄올 중에서 혼합하고, 이 혼합물을 진공하에 농축한 다음, 혼합물을 물로 복원시킴으로써 제조되었다. 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)과 대두-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)의 리포솜 조제물이 또한 간을 표적화한다고 알려졌다(Shimizu et al, Biol Pharm. Bull 20:881 (1997)).

또는 달리, 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 수송 단백질과 같은 다양한 표적화 리간드가 리포솜의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 간세포 표면에서만 독점 발현되는 아사이알로당단백질(갈락토오스)를 표적으로 하도록 분지형 갈락토실지질 유도체로 변형될 수 있다(Kato and Sugiyama, Grit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al, Biol. Pharro. Bull. 20:259 (1997)). 유사하게, Wu et al, Hepatology 27:772 (1998)에서는 아사이알로페튜인으로 리포솜을 표지하는 것이 리포솜 혈장 반감기를 단축시키고, 간세포에 의한 아사이알로페튜인-표지 리포솜의 흡수를 대단히 증진시켰다는 것이 제시되었다. 한편, 분지형 갈락토실지질 유도체를 포함하는 리포솜의 간 축적은 아시알로페튜인을 미리 주사함으로써 억제될 수 있다(Murahashi et al, Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). 폴리아코니틸화된 인간 혈청 알부민 리포솜은 간세포에 리포솜을 표적화하는 또 다른 접근법을 제공한다(Kamps et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). 더욱이, Geho, et al. 미국특허 제4,603,044호는 간세포-통제 리포솜 소포 송달 시스템을 설명하는데, 이것은 간의 분화된 대사세포와 관련된 간담즙 수용체에 특이성을 가진다.

IL-31 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 단백질 마이크로캡슐화 표준기술을 이용하여 리포솜 안에 캡슐화될 수 있다(예를 들어, Anderson et al, Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al, Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen et al, Biochim. Biophvs. Acta 1063:95 (1991), Alving et al "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. IH, Gregoriadis (ed.), page 317(CRC Press 1993), Wassef et al, Meth. Enzymol. 149:124(1987)를 참조한다). 상기 주지된 대로, 치료학적으로 유용한 리포솜은 다양한 성분들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 폴리에틸렌글리콜의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

분해가능한 중합체 마이크로스피어가 치료 단백질의 높은 전신적 수준을 유지하도록 설계되었다. 마이크로스피어는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리안하이드리드, 폴리(오르토에스테르), 비생분해성 에틸비닐아세테이트 중합체와 같은 분해가능한 중합체로부터 제조되며, 중합체 안에 단백질이 잡혀있게 된다(Gomb-otz and Pettit, Bioconiugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al, Science 281:1161(1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Qpin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). 또한, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-코팅 나노스피어가 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다(예를 들어, Gref et al, Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)을 참조한다).

당업자에 의해 그외 다른 제형들도 고안될 수 있으며, 예를 들어 Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996)에 제시된다.

예로서, 제약 조성물은 IL-31 폴리펩티드 또는 IL-31 길항제(예를 들어, IL-31 폴리펩티드와 결합하는 항체 또는 항체 단편)를 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 치료 폴리펩티드는 단일 또는 다수 용량의 주사 용액의 형태로, 또는 주사 전에 복원되는 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 또는 달리, 이러한 키트는 치료 폴리펩티드의 투여를 위한 건조-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기를 포함할 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 포함한 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6815; b) ATCC 특허기탁명 PTA-6816; c) ATCC 특허기탁명 PTA-6829; d) ATCC 특허기탁명 PTA-6830; e) ATCC 특허기탁명 PTA-6831; f) ATCC 특허기탁명 PTA-6871; g) ATCC 특허기탁명 PTA-6872; h) ATCC 특허기탁명 PTA-6875; 및 i) ATCC 특허기탁명 PTA-6873로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 IL-31(SEQ ID NO:2)와 IL-31RA (SEQ ID NO:5)의 상호작용을 중화한다. 다른 구체예에서, 항체는 (a) 뮤린 단클론성 항체, 또는 (b) (a)로부터 유래된 인간화 항체, 또는 (c) 항체 단편, 또는 (d) 인간 단클론성 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 택, 자기입자, 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 PEG화를 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 중화 항체이다. 다른 구체예에서, 포유류에 항체의 투여는 폴리펩티드의 전-염증성 활성을 억제, 예방, 감소 또는 차단한다. 다른 구체예에서, 포유류에 항체의 투여는 폴리펩티드의 전-염증성 활성과 관련된 긁기 및 피부염을 억제, 예방, 감소, 또는 차단한다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6815; b) ATCC 특허기탁명 PTA-6816; c) ATCC 특허기탁명 PTA-6871; d) ATCC 특허기탁명 PTA-6829; 및 e) ATCC 특허기탁명 PTA-6830로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도머에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6815; b) ATCC 특허기탁명 PTA-6816; 및 c) ATCC 특허기탁명 PTA-6871로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도머에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6829; 및 b) ATCC 특허기탁명 PTA-6830으로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도머에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6872; 및 b) ATCC 특허기탁명 PTA-6875로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도머에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체가 제공되며, 폴리펩티드는 ATCC 특허기탁명 PTA-6874를 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 중화 항체이다. 한 구체예에서, 포유류에 항체의 투여는 폴리펩티드의 전-염증성 활성을 억제, 예방, 감소 또는 차단한다. 한 구체예에서, 포유류에 항체의 투여는 폴리펩티드의 전-염증성 활성과 관련된 긁기 및 피부염을 억제, 예방, 감소 또는 차단한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 IL-31 항체의 양을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 염증을 감소시키는 방법을 제공하며, 이로써 염증이 감소된다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유류에게 IL-31의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하는, IL-31이 어떤 역할을 하는 염증성 질환을 가진 포유류를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 길항제는 (i) IL-31RA의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드 또는 (ii) IL-31RA의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하고, IL-31의 염증성 활성이 감소된다. 한 구체예에서, 질환은 소양성 질환을 포함하는 염증성 질환이다. 한 구체예에서, 질환은 아토피 피부염이다. 한 구체예에서, 질환은 결절성 양진이다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유류에 IL-31의 길항제를 토여하여 소양증을 감소시키는 단계를 포함하는, IL-31이 어떤 역할을 하는 포유류에서의 소양증의 효과를 감소, 억제, 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 길항제는 (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드, 또는 이것의 단편을 포함하고, IL-31의 소양성 활성이 감소된다. 한 구체예에서, 포유류의 질환은 아토피 피부염이다. 한 구체예에서, 포유류의 질환은 피부염이다. 한 구체예에서, 항체는 본원에 설명된 항체이다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유류에 IL-31의 길항제를 투여하여 포유류에서 가려움을 감소시키는 단계를 포함하는, IL-31이 어떤 역할을 하는 포유류에서의 소양증의 효과를 감소, 억제, 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 길항제는 (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 또는 결합 폴리펩티드, 또는 이것의 단편을 포함하고, 이로써 IL-31의 긁기 활성이 감소된다. 한 구체예에서, 포유류의 질환은 아토피 피부염이다. 한 구체예에서, 포유류의 질환은 피부염이다. 한 구체예에서, 항체는 본원에 설명된 항체이다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 a) 클론 292.12.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6815); b) 클론 292.63.5.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6829); c) 클론 292.72.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6816); d) 클론 292.84.1.6 (ATCC 특허기탁명 PTA-6871); 및 e) 클론 292.118.6.4(ATCC 특허기탁명 PTA-6830)로부터 선택된 하이브리도마 클론 지정번호에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 단클론성 항체를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 a) 클론 294.35.2.6.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6872); b) 클론 294.144.3.5(ATCC 특허기탁명 PTA-6873); c) 클론 294.154.5.6(ATCC 특허기탁명 PTA-6875); 및 d) 클론 294. 163.2.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6831)로부터 선택된 하이브리도마 클론 지정번호에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와의 결합과 경합할 수 있는 단클론성 항체를 포함한 단클론성 항체를 제공하며, 폴리펩티드는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6815; b) ATCC 특허기탁명 PTA-6816; c) ATCC 특허기탁명 PTA-6829; d) ATCC 특허기탁명 PTA-6830; e) ATCC 특허기탁명 PTA-6831; f) ATCC 특허기탁명 PTA-6871; g) ATCC 특허기탁명 PTA-6872; h) ATCC 특허기탁명 PTA-6875; 및 i) ATCC 특허기탁명 PTA-6873으로부터 선택된 ATCC 특허기탁명을 갖는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 단클론성 항체와 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 하이브리도마가 제공되며, 이 하이브리도마는 a) ATCC 특허기탁명 PTA-6815; b) ATCC 특허기탁명 PTA-6816; c) ATCC 특허기탁명 PTA-6829; d) ATCC 특허기탁명 PTA-6830; e) ATCC 특허기탁명 PTA-6831; f) ATCC 특허기탁명 PTA -6871; g) ATCC 특허기탁명 PTA-6872; h) ATCC 특허기탁명 PTA-6875; 및 i) ATCC 특허기탁명 PTA-6873로부터 선택된 ATCC 특허기탁명으로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁된다.

다른 양태에서, 본 발명은 IL-31 폴리펩티드에 대한 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 아미노산 24(Ser)에서부터 아미노산 164(Thr)까지 SEQ ID NO:2에 있는 아미노산 잔기의 연속 서열과 동일한 9개 내지 141개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드; 상기 개시된 것과 같은 폴리펩티드; (c) 아미노산 번호 38-52의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (d) 아미노산 번호 83-98의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (e) 아미노산 번호 104-117의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (f) 아미노산 번호 137-152의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (g) 아미노산 번호 38-152의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (h) 아미노산 번호 24-164의 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (c) 아미노산 번호 38-52의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (d) 아미노산 번호 85-98의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (e) 아미노산 번호 104-118의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (f) 아미노산 번호 141-157의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (g) 아미노산 번호 38-157의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (h) 아미노산 번호 24-163의 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (i) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:11의 Hopp/Woods 친수성 프로파일에 따른 항원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드로 동물을 접종하는 단계, 및 동물로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하며, 상기 친수성 프로파일은 매장된 G, S, 및 T 잔기와 노출된 H, Y, 및 W 잔기가 무시되는 슬라이딩 6-잔기 윈도우에 기초하고, 폴리펩티드는 동물에서 면역반응을 도출하여 항체를 생산한다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 개시된 방법에 의해 생산된 항체(예를 들어, 중화 항체)를 제공하며, 이 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:11의 폴리펩티드와 결합한다. 한 구체예에서, 상기 개시된 항체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:11에 도시된 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

다른 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 IL-31의 존재를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플을 상기 개시된 항체, 또는 항체 단편과 항체 또는 항체 단편과 생물학적 샘플의 결합을 허용하는 조건에서 접촉시키는 단계, 및 (b) 결합된 항체 또는 결합된 항체 단편 중 어느 것을 검출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 암세포를 죽이는 방법을 제공하며, 상기 방법은 환자로부터 암세포를 함유하는 조직 또는 생물학적 샘플을 생체외 취득하거나, 또는 암세포를 생체내 확인하는 단계; 본원에 개시된 방법에 의해 폴리펩티드를 생산하는 단계; 제약학적으로 허용되는 비히클 중에 폴리펩티드를 조제하는 단계; 및 폴리펩티드를 환자에게 투여하거나, 또는 암세포를 폴리펩티드에 노출시키는 단계를 포함하며, 이로써 폴리펩티드가 세포를 죽이게 된다. 한 구체예에서, 상기 개시된 암세포를 죽이는 방법에서, 폴리펩티드는 독소에 더 콘쥬게이트된다. 한 구체예에서, 상기 개시된 항체는, (a) 다클론성 항체, (b) 뮤린 단클론성 항체, (c) (b)로부터 유래된 인간화 항체, (d) 항체 단편, 및 (e) 인간 단클론성 항체로부터 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 38(Val)에서 152 (Leu)까지의 폴리펩티드; (b) SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 27(Leu)에서 164(Thr)까지의 폴리펩티드; (c) SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 24(Thr)에서 164(Thr)까지의 폴리펩티드; 및 (d) SEQ ID NO:2에 도시된 잔기 1(Met)에서 164(Thr)까지의 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 항체는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 택, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 골수 또는 말초혈 세포를, 가용성 사이토카인 수용체가 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포의 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 개시된 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법에서, 조혈세포 및 조혈 선조세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체의 조성물을 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 염증을 가진 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-31-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유류에서 염증반응을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (1) 염증성 분자의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 비히클 중에 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 투여 후 염증성 분자의 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 염증성 분자의 수준과 단계 (3)에서의 염증성 분자의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 염증성 분자 수준이 증가하지 않거나 감소한 것이 염증반응이 억제된 표시이다. 한 구체예에서, 상기 개시된 항체는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 택, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 골수 또는 말초혈 세포를, 가용성 사이토카인 수용체가 없이 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하여, 골수 또는 말초혈 세포의 조혈세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양으로 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 개시된 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법에서, 조혈세포 및 조혈 선조세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 조혈세포 및 조혈세포 선조의 IL-31-유도 증식 또는 분화를 억제하는 방법에서, 림프양 세포는 대식세포 또는 T 세포이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항체의 조성물을 염증을 감소시키기에 충분한 양으로 염증을 가진 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-31-유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 염증을 가진 포유류에서 염증반응을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (1) 염증성 분자의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 비히클 중에 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 투여 후 염증성 분자의 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 염증성 분자의 수준과 단계 (3)에서의 염증성 분자의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 염증성 분자 수준이 증가하지 않거나 감소하는 것이 염증반응이 억제된 표시이다.

다른 양태에서, 본 발명은 포유류에게 IL-31의 길항제를 투여하여 염증을 감소시키는 단계를 포함하는, IL-31이 어떤 역할을 하는 염증성 질환에 걸린 포유류를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 길항제는 IL-31(SEQ ID NO:2)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편과 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 상기 개시된 염증성 질환에 걸린 포유류의 치료 방법에서, 질환은 만성 염증성 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 염증성 질환에 걸린 포유류의 치료 방법에서, 질환은 염증성 장 질환; 궤양성 결장염; 크론병; 아토피 피부염; 습진; 및 건선으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 염증성 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 염증성 질환에 걸린 포유류의 치료 방법에서, 질환은 급성 염증성 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 염증성 질환에 걸린 포유류의 치료 방법에서, 질환은 내독소증; 패혈증; 독성쇼크 증후군; 및 감염성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된 급성 염증성 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 개시된 염증성 질환에 걸린 포유류의 치료 방법에서, 항체는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 택, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터 조직 또는 생물학적 샘플을 취득하는 단계; 조직 또는 생물학적 샘플을 본원에 개시된 항체와 함께 이 항체가 조직 또는 생물학적 샘플 내의 상보성 폴리펩티드에 결합하는 조건에서 인큐베이션하는 단계; 조직 또는 생물학적 샘플 내의 결합된 항체를 가시화하는 단계; 및 정상 대조군 조직 또는 생물학적 샘플과 환자로부터의 조직 또는 생물학적 샘플 내의 결합된 항체의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 정상 대조군 조직 또는 생물학적 샘플에 비하여 환자 조직 또는 생물학적 샘플에 결합된 항체 수준의 증가가 환자에게 있는 염증의 표시인, 환자에서 염증을 검출하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터 조직 또는 생물학적 샘플을 취득하는 단계; SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1의 보체의 적어도 14개의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 표지하는 단계; 이 폴리뉴클레오티드를 조직 또는 생물학적 샘플과 함께 폴리뉴클레오티드가 상보성 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 조건에서 인큐베이션하는 단계; 조직 또는 생물학적 샘플 내의 표지된 폴리뉴클레오티드를 가시화하는 단계; 및 정상 대조군 조직 또는 생물학적 샘플과 환자로부터의 조직 또는 생물학적 샘플 내의 표지된 폴리뉴클레오티드 혼성화의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 정상 대조군 조직 또는 생물학적 샘플에 비하여 환자 조직 또는 생물학적 샘플에 대한 표지된 폴리뉴클레오티드 혼성화의 증가가 환자에게 있는 염증의 표시인, 환자에서 염증을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다음의 비제한적 실시예들에 의해 더 예시된다.

[실시예]

실시예 1

래트 항-마우스 IL-31 MAb의 발생

A. 래트의 면역화 및 혈청 스크리닝

4마리의 3개월 된 암컷 Sprague-Dawley 래트(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 마우스 IL-31로 면역화했다. 래트는 서열 EYMPME(SEQ ID NO:7) (이후 mIL-31-CEE라고 한다)로 구성된 펩티드와 C-말단에서 융합된 정제된 재조합 마우스 IL-31을 약 290ug을 제조자의 지침에 따라 완전 프레운드 애쥬번트(Pierce, Rockford, IL)와 조합하여 복강내 주사함으로써 초기 면역화되었다. 초기 면역화 후, 각 래트는 6주 기간에 걸쳐 2주마다 복강내 경로를 통해 불완전 프레운드 애쥬번트 중의 mIL-31-CEE를 150ug을 추가로 받았다. 3차 및 4차 면역화 후 7일째에, 래트를 안와후 총을 통해 채혈하고, 혈액으로부터 혈청을 분리하여, 용액에서 mIL-31-CEE와 결합하는 능력과, 마우스 IL-31RA로 핵산전달감염된 셀라인 상에서 mIL-31-CEE의 자극 활성을 억제(중화에 의해 측정됨)하는 능력에 대해 분석하였다.

mIL-31-CEE와 결합하는 항혈청 중 래트 항-마우스 IL-31 항체의 능력을 "캡처" 스타일 ELISA 분석을 이용하여 평가하였다. 이 분석에서는 먼저 96 웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 웰들을 0.1M Na2CO3, pH 9.6 중 500ng/mL 농도로 Fc 특이적 항체인 염소 항-래트 IgG(Jackson Immunoresearch)로 100uL/웰로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 다음, 미결합 항체를 흡인하고, 플레이트를 PBS-Tween(0.137M NaCl, 0.0027M KCl, 0.0072M Na2HPO4, 0.0015M KH2PO4, 0.05%v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.2)로 300uL/웰로 2번 세척했다. 웰을 실온(RT)에서 5분간 SuperBlock(Pierce, Rockford, IL) 200uL/웰로 차단시켰고, SuperBlock를 플레이트에서 톡톡 쳐서 제거한 다음, 플레이트를 PBS-Tween으로 2번 세척한 후에 한번 더 차단을 반복했다. 혈청의 연속 10배 희석물(PBS-Tween + 1%w/v 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.05%v/v Proclin 300, pH 7.2 = 희석 버퍼 중)을 1:1000의 초기 희석에서 시작하여 1:1,000,000까지의 범위로 제조했다. 다음에, 각 희석물을 100uL/웰로 세 샘플씩 분석 플레이트로 옮겼는데, 이때 분자의 Fc 부분을 통해 혈청 중의 래트 IgG와 분석 플레이트가 결합한다. 정상 래트 혈청을 음성 대조군으로 사용했다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 웰을 흡인하고, 플레이트를 상기 설명된 대로 2번 세척했다. 다음에, 바이오틴화된 mIL-31-CEE(12:1 몰비, 바이오틴:단백질)를 500ng/mL 농도로 100uL/웰씩 웰에 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 미결합 바이오틴화 mIL-31-CEE을 웰에서 흡인하고 플레이트를 2번 세척했다. 다음에, 스트렙토아비딘(Pierce, Rockford, IL) 표지된 양고추냉이 퍼옥시다제를 500ng /mL 농도로 100uL/웰씩 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 미결합 HRP-SA의 제거 후, 플레이트를 5번 세척하고 테트라메틸벤지딘(TMB) (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 100uL/웰씩 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 실온에서 5분간 인큐베이션했다. 450nm TMB 중지시약(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 100uL/웰씩 첨가하여 색 발생을 중지시켰고, 웰의 흡광도 값을 Molecular Devices Spectra MAX 340 기기에서 450nm에서 읽었다.

동족 리간드를 통해 마우스 IL-31의 자극 활성을 억제(중화에 의해 측정됨)하는 항혈청 중의 래트 항-마우스 IL-31 항체의 능력을 세포 기반 중화 분석을 이용하여 평가했는데, 루시페라제 리포터 시스템을 갖는 mIL-31RA/OSMR베타 핵산전달감염된 Baf3 셀라인(Baf3/KZ134/mcytor17/mOSMR베타)을 사용했으며, 이것은 마우스 IL-31에 의한 세포의 자극에 의해 활성화될 수 있다. 이 분석에서는, 각 항혈청의 분석 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 1X 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신(Lavitrogen, Carlsbad, CA)) 중의 초기 1:250 희석물을 제조했고, 다음에 이들을 각각 1:32000의 최종 희석물까지 연속 2배 희석하였다. 각 항혈청 희석물에 분석 버퍼 중에 4ng/mL로 희석된 mIL-31-CEE를 웰 안의 총 부피가 100uL가 되도록 동일한 부피로 첨가했다. 항체/사이토카인 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 인큐베이션한 다음, 성장 배지로부터 표적 세포를 세척하고, 300,000 세포/mL의 밀도로 조정하여, 100uL/웰씩 항체/사이토카인 혼합물에 첨가했다. mIL-31을 2ng/mL 함유하고 항혈청은 함유하지 않는 분석 배지를 음성 대조군으로 사용했으며, 이것은 이 분석에서 달성될 수 있는 최대 자극을 나타냈다. 37℃, 5% 이산화탄소 하에 16-24시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 1500RPM에서 5분간 원심분리했고, 배지를 조심스럽게 톡톡 쳐서 제거한 다음, 1x 세포용해 완충액(Promega, Madison, WI)을 25uL씩 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 10분간 부드럽게 진동시켜 완전히 세포용해가 일어나도록 한 다음, 세포용해액을 고체 화이트 96-웰 플레이트(Coming/Costar 3917, Acton, MA)로 옮겼다. 루시페라제 분석 기질(Promega)을 40uL씩 각 웰에 첨가했다. 다음에, 발광분석기에서 5초 인테그레이션 간격을 이용하여 루시페라제 활성(STAT 수용체 구성물의 IL-31 활성화로 표시됨)에 대해 간격 웰을 평가하였다.

"캡처" ELISA 분석뿐만 아니라 세포 기판 중화 분석 모두 4마리 래트 모두에서 mIL-31에 대한 상당한 항체 반응이 발생했다는 것을 나타냈으며, 한 마리 래트에서는 나머지 래트들보다 더 강한 반응이 발생했다. 일반적으로, "캡처" ELISA에 의해 측정된 반응은 세포 기반 중화 분석에서 보인 것과 매우 유사했으며, 이것은 IgG 부류 항체가 일차적으로 mIL-31의 억제를 초래했음을 시사한다.

B. 융합

마지막 복강내 면역화 후 4주째에, 가장 현저한 mIL-31 중화 역가를 나타낸 래트를 혈관내 주사에 의해 PBS 중의 mIL-31-CEE 약 150ug으로 마지막으로 면역화했다. 5일 후, 이 래트에서 비장과 림프절을 수거하여 단일 세포 현탁액을 제조한 다음, 본 분야에 공지된 표준방법(Harlow, E. and Lane, D. 1988., "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)에 따라 PEG 1500를 사용하여 4:1 림프양 세포:골수종 세포 비로 Sp2/0 마우스 골수종 셀라인(Shulman, M. et al., Nature 276:269-270, 1976)과 융합하였다. 융합 혼합물을 영양세포층으로서 BALB/c 흉선세포와 조합하여 일련의 96-웰 평면바닥 플레이트에 분배하였다(Oi, V.T. and Herzenberg, L.A., 1980., "Selected Methods in Cellular Immunology", B.B. Mishell and S.M. Shiigi eds. pp. 351-372, Freeman, San Francisco). 4일 후 융합 플레이트의 웰에 70% 배지 대체물과 흉선세포를 한번 공급하였고, 다시 2일 후에 배지만을 공급하였다. 융합물 평판 8일 후에 웰을 분석하였다.

C. 융합물 스크리닝

상기 설명된 mIL-31에 대한 "캡처" ELISA를 일차 스크린으로 이용하였는데, 단 하이브리도마 상청액은 희석하지 않고 시험하였으며, 캡처 플레이트로부터 분석 플레이트 위에 복제 평판하였다. 약 170개의 양성 웰이 확인되었다. 다음에, 이들 각 웰과 소수의 음성 웰로부터의 상청액을 앞서 설명된 세포 기반 중화 분석으로 mIL-31을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. 각각 분석 배지 중 1:8 최종 희석물에서 시험하였다. 후반 희석에서, 하이브리도마 상청액 중의 비-특이적 자극 성분을 충분히 감소시켜, 이들이 관찰된 자극지수에 최소한 기여하도록 하였다. 대부분의 상청액은 어느 정도 mIL-31을 중화하는 것으로 나타났으며, 이들 중 약 10개는 본질적으로 완전히 중화하는 것으로 증명되었고, 나머지는 매우 약한 중화 잠재력을 지니는 또 다른 10개가 아주 약한 중화를 나타내는 지점까지 연속된 억제를 나타낸다. "캡처" ELISA 양성 웰 중 약 150개에서 하이브리도마 세포는 24-웰 플레이트에서의 배양으로 성공적으로 확장되었다. 24-웰 배양물의 밀도가 약 4-6 x 10⁵ 세포/mL에 도달했을 때, 각 웰에서 상청액(약 1.5mL)을 수집하여 저장하고, 각 웰로부터의 세포를 동결보존했다.

24-웰 상청액 각각을 융합 스크리닝에서 사용한 "캡처" ELISA 및 세포-기반 IL-31 중화 분석으로 다시 분석했다. 추가하여, 이들 상청액을 IL-31 분자의 C-말단에 융합된 EYMPME(SEQ ID NO:7) 택으로 또한 구성되고 BHK 세포에서 생산된 IL-31의 인간 상동체를 이용한 "캡처" ELISA에서 시험하였다. 결과는 확장 후 대부분의 마스터 웰 상청액이 용액 중의 마우스 IL-31을 인식하는 능력을 보유했음을 나타내었다. 이들 "캡처" 분석 양성 웰 중, mIL-31 억제 활성은 약 20개의 상청액에 대해 완전 억제 내지는 거의 완전 억제에서부터 10-15개 상청액에 대해서는 본질적으로 억제하지 않는 것에까지 이르는 범위였다. 캡처 분석에서 인간 IL-31-CEE에 대한 교차반응성은 관찰되지 않았는데, 이것은 래트 항-mIL-31 항체 중 어느 것도 인간 IL-31과 교차반응하거나, mIL-31-CEE 분자의 C-말단에 융합된 CEE 택을 인식하지 않았음을 시사한다.

D. 중화 항-mIL-31 MAb를 생산하는 하이브리도마의 선별 및 클로닝

관심의 중화 mAb를 생산하는 클론된 하이브리도마를 분리하기 위해 상위 10개의 IL-31 중화 마스터 웰 중 7개(271.5.7, 271.9.4, 271.26.6, 271.27.4, 271. 33.1, 271.33.3 및 271.39.4)에 있는 세포를 클로닝하였다. 세포는 96-웰 마이크로타이터 세포배양 플레이트에서 표준 저밀도 희석(웰 당 1개 세포 미만) 접근법을 이용하여 흉선세포의 존재하에 클로닝하였고, 분석 전에 단일 초점 성장 동안 웰을 현미경 시험하여 단클론성을 평가하였다. 평판 6일 후, 플레이트의 모든 웰을 "캡처" ELISA에 의해 mIL-31 특이적 IgG에 대해 스크리닝하였다. 특이적 mAb에 대해 양성이었던 6-10개 웰의 상청액과 단일 콜로니의 하이브리도마 성장만을 갖는 웰로부터 기원하는 상청액을 각 클로닝 세트로부터 수거하여, "캡처" ELISA와 세포-기반 중화 분석으로 다양한 희석비에서 다시 스크리닝하여 "최상의" 중화 mAb 생산 클론을 확인하였다. 이들 시험의 결과는 적합한 중화 mAb를 생산하는 하이브리도마 클론들이 세트 271.9.4, 271.26.6, 271.33.1, 271.33.3 및 271.39.4에서만 획득되었음을 나타내었다. 이들 각 세트에서 "최상의" 클론을 다시 클로닝하였고, 서브클론들을 설명된 대로 스크리닝하여 최종 하이브리도마 라인 271.9.4.2.6, 271. 26.6.6.1, 271.33.1.2.2, 271.33.3.2.1 및 271.39.4.6.5를 얻었다. 이들 하이브리도마 각각에 의해 생산된 mAb의 래트 IgG 동형을 ELISA를 이용하여 측정하였는데, 여기서는 바이오틴화된 마우스 항-래트 IgG 동형 특이적 mAb를 사용하였다. 5개의 mAb가 모두 IgG1 서브클래스에 속하는 것으로 판명되었다. 하이브리도마 271.26. 6.6.1은 부타페스트 조약하에 아메리칸 타입 티슈 콜렉션(ATCC, Manassas, VA) 특허기탁기관에 원 기탁물로서 기탁되었으며, ATCC 수탁번호 PTA-6874를 받았다.

충분히 클로닝된 항-마우스 IL-31 mAb 생산 하이브리도마를 각각 하이브리도마 혈청 무함유 배지(하이브리도마-SFM, Invitrogen)에서 성장할 수 있도록 개조하였다. 하이브리도마-SFM에서 성장된 고밀도 세포 배양물로부터의 상청액을 원심분리하여 세포 및 세포 파편들을 제거하고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과하고, 본 분야에 공지된 표준방법을 이용하는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 mAb를 정제했다.

E. MAb의 시험관내 특이적 중화 활성의 순위화

5개의 래트 항-마우스 IL-31 mAb의 각각의 시험관내 특이적 중화 활성의 순위를 매기기 위해, 정제된 mAb를 각각 앞서 설명된 세포-기반 중화 분석으로 다시 시험했는데, 단 mIL-31을 먼저 세포에 첨가한 다음, 이 혼합물을 항체에 첨가하였다. mIL-31-CEE에 대한 중화 활성에 더하여, mAb는 또 위치 108에 있는 시스테인 잔기가 세린 잔기로 전환된 c108smIL-31이라고 명명된 또 다른 형태의 마우스 IL-31에 대해 평가되었다. 후자의 물질은 C-EE 펩티드 없이 E. coli에서 생산되었다. 두 형태의 mIL-31은 모두 1 및 5ug/mL의 최종 농도로 사용하였다. mAb는 분석 배지 중에 20ug/mL의 농도로 조정하였고, 분석 혼합물 중에 10ug/mL에서부터 최종 농도 0.00001ug/mL까지의 범위로 연속 10배 희석하여 두 번씩 시험하였다. Softmax 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하여 IC50 값을 측정하였다. 결과를 표 1에 나타내는데, mAb 271.26.6.6.1, 271.33.1.2.2 및 271.39.4.6.5가 가장 강력한 중화 mAb였으며, 이 시험관내 시험에서 유사한 효능을 가졌다는 것을 나타낸다. 흥미로운 것은 mAb 271.33.3.2.1가 mIL-31의 c108smIL-31 버전에 대해 나머지 mAb들보다 훨씬 덜 효과적이었다는 것인데, 이것은 이 항체가 십중팔구는 나머지 4개의 mAb에 비해 상이한 에피토프 특이성을 가진다는 에피토프 비닝 연구로부터의 결론을 뒷받침한다. 이 mAb가 또 mIL-31의 c108smIL-31 버전에 대해서 mIL-31-CEE 버전과 비교해서도 훨씬 덜 효과적이었다는 사실은 271.33.3.2.1에 인식된 에피토프가 IL-31 분자의 글리코실화 부위에 부분적으로 포함될 수 있음을 시사한다.

[표 1]

실시예 2

마우스 항-인간 IL-31 mAb의 발생

A. 마우스의 면역화 및 혈청 스크리닝

각각 5마리씩 두 그룹의 6주 내지 8주 된 암컷 BALB/c 마우스를 인간 IL-31로 면역화했다. 그룹 1의 마우스는 서열 EYMPME(SEQ ID NO:7)(이후 IL-31-CEE라고 한다)로 구성된 펩티드와 C-말단에서 융합된 정제된 재조합 인간 IL-31를 제조자의 지침에 따라 Ribi 애쥬번트와 조합하여 복강내 주사함으로써 면역화되었다. 이 단백질은 BHK 세포에서 생산되었다. 그룹 2의 마우스도 위치 108의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 전환된 성숙한 형태의 정제된 재조합 인간 IL-31(이후 c1O8sIL-31라고 한다)로 유사하게 면역화되었다. 이 물질은 C-EE 펩티드 없이 E. coli에서 생산되었다. 모든 마우스는 10주 기간 동안 2주마다 50ug의 단백질을 받았다. 3차 및 4차 면역화 후 7 내지 10일째에 마우스의 안와후 총에서 채혈하고, 혈액으로부터 혈청을 분리하여 인간 IL-31과 인간 IL-RA로 핵산전달감염된 셀라인의 결합을 억제하는 능력과, 뒤이은 IL-31의 자극 활성을 억제하는 능력에 대해 분석하였다.

인간 IL-31을 억제하는 각 항혈청의 능력을, 다음과 같이 변형된 IL-31-CEE 또는 c1O8sIL-31 및 BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMR베타 세포(실시예 3 및 4 참조)를 사용한 루시페라제 기반 중화 분석을 이용하여 평가하였다. 각 항혈청을 96-웰 평면바닥 화이트 폴리스티렌 플레이트(Corning/Costar 3917) 아래에서 분석 버퍼(RPMI 1640, 10% FBS, 1mM 나트륨 피루베이트, 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린 G 나트륨, 100ug/mL 스트렙토마이신 술페이트) 중에 항혈청의 초기 1:250 희석에서 시작하여 연속 4배 희석에 의해 2번 적정하였다. 이 분석에서 마우스 혈청의 다소간의 자극 효과를 정규화하려는 시도에서, 초기 1:250 희석을 제외한 모든 희석을 0.2% 정상 BALB/c 마우스 혈청을 더한 분석 버퍼 중에서 수행하였다. 각 웰에서 희석된 항혈청의 부피는 100uL였다. 세포를 분석 버퍼로 1.5회 세척하고, 3 x 10⁶/mL의 농도로 조정하여 IL-31-CEE(100pg/mL) 또는 c108sIL-31(30pg/mL)과 조합한 다음, 이 혼합물을 플레이트에 100uL/웰씩 첨가하였다. 총 분석 부피는 30,000 세포로 구성된 200uL/웰이었고, IL-31의 최종 농도는 50pg/mL(IL-31-CEE) 또는 15pg/mL(c108s IL-31)이고, 항혈청의 최종 희석비는 1:500, 1:2000, 1:8000, 1:32000, 1:128000, 1:512000, 1:2048000 및 1:8192000이었다. 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 하에 16-24시간 인큐베이션한 후, 1250RPM에서 5분간 원심분리하고, 배지를 조심스럽게 톡톡 쳐서 제거한 다음, 1x 세포용해 버퍼 25uL를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 10분간 부드럽게 진동시켜 세포가 용해되도록 한 다음, 루시페라제 분석 기질을 40uL씩 각 웰에 첨가하였다. 다음에, 발광분석기에서 4초 인테그레이션 간격을 이용하여 루시페라제 활성(STAT 리포터 구성물의 IL-31 활성화로 표시됨)에 대해 웰을 평가하였다.

일반적으로 이 분석에서 IL-31-CEE로 면역화된 마우스로부터의 항혈청은 IL-31-CEE와 c1O8sIL-31 모두의 자극 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 판명되었으며, 그 반대도 마찬가지다. 이런 이유 때문에 통상 IL-31-CEE만을 사용하여 더 이상의 중화 분석을 수행하였다. 가장 강한 중화 역가를 가진 이들 마우스를 IL-31과 그것의 동족 수용체의 상호작용을 매우 효과적으로 중화할 수 있는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 발생시키는 것을 목표로 하여 일련의 세 융합에 사용하였다.

B. 융합

융합체 291

1차 융합에는 IL-31-CEE로 면역화된 한 마우스와 c108sIL-31로 면역화된 한 마우스로부터의 림프절 세포를 사용하였다. 이들 각 마우스를 PBS 중에 희석된 각 면역원 15ug으로 6차 면역화했는데, 마지막 면역화 후 3주째에 혈관내 주사에 의해 투여하였다. 3일 후, 이들 마우스로부터 비장과 림프절을 수거하여 합치고, 단일 세포 현탁액(총 4.69 x 10 세포)으로 가공한 다음, 마우스 골수종 셀라인 P3-X63-Ag8.653(Kearney, J.F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979)(P3-X63-AgS.653.3. 12.11로 명명)의 클론에, 본 분야에 공지된 표준방법을 이용하여 2분55초 동안 3mL PEG 1500을 사용하여 2.3:1 림프양 세포:골수종 세포 비로 융합시켰다(Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985). 융합 혼합물을 일련의 96-웰 평면바닥 플레이트에 분배한 다음, 4일 후 70% 배지 대체물을 한번 공급하고, 6일 후 분석했다.

융합체 292

2차 융합에는 IL-31-CEE로 면역화된 한 마우스로부터의 림프양 세포를 사용했다. 상기 언급된 5번의 복강내 면역화에 더하여, 이 마우스에게 마지막 복강내 주사 후 3주째에 PBS 중의 IL-31-CEE를 15ug을 복강내 주사하였으며, 최초 복강내 주사 후 3주째에 유사하게 주사했다. 3일 후, 비장과 림프절을 가공하여(총 2.27 x 10⁸ 세포), 상기 설명된 대로 2분55초 동안 1.8mL PEG 1500을 사용하여 2:1 림프양 세포:골수종 세포 비로 P3-X63-Ag8.653.3.12.11에 융합시켰다. 융합 혼합물을 일련의 96-웰 평면바닥 플레이트에 분배한 다음, 4일 후에 70% 배지 대체물을 한번 공급하고, 5일 후 분석했다.

융합체 294

마지막 융합에는 c108sIL-31만으로 면역화된 한 마우스로부터의 림프양 세포를 사용했다. 앞서 설명된 이 항원을 사용한 5번의 복강내 면역화에 더하여, 이 마우스에게 마지막 복강내 주사 후 6주째에 PBS 중의 c108sIL-31을 15ug을 복강내 주사하였으며, 최초 복강내 주사 후 2주째에 다시 주사했다. 3일 후, 비장과 림프절을 가공하여(총 1.586x10⁸ 세포), 상기 설명된 대로 2분55초 동안 1.5mL PEG 1500을 사용하여 2:1 림프양 세포:골수종 세포 비로 P3-X63-Ag8.653.3.12.11에 융합시켰다. 융합 혼합물을 일련의 96-웰 평면바닥 플레이트에 분배한 다음, 4일 및 6일 후에 70% 배지 대체물을 한번 공급하고, 마지막 공급 후 3일째에 분석했다.

C. 융합체 스크리닝

세 융합체를 모두 상기 설명된 세포-기반 IL-31 중화 분석을 이용하여 스크리닝했는데, 이것은 다음과 같이 두 가지 사항이 변형되었다. 첫째, 분석 플레이트에 있는 희석된 항혈청 대신에, 융합 플레이트의 각 웰로부터의 상청액 100uL를 분석 플레이트 위에 복제 평판했다. 둘째, 분석 혼합물 중 IL-31-CEE의 최종 농도는 150pg/mL이었다.

중화 분석에 더하여, 무작위 선택한 각 융합으로부터의 몇몇 플레이트를 폴리스티렌 ELISA 플레이트 위에 미리 흡착된 IL-31-CEE와 결합할 수 있는 IgG 항체에 대해 스크리닝했다. 이 분석의 목적은 IL-31을 불충분하게 중화했거나 이 사이토카인을 중화하는데 완전히 실패한 항-IL-31 항체 생성 하이브리도마를 함유하는 마스터 웰을 확인하는 것이었다. 이 분석에서, 96-웰 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 웰을 초기에 0.1M Na2CO3, pH 9.6 중에 200ng/mL 농도의 IL-31-CEE를 50uL/웰씩 코팅했다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한 다음, 미결합 항원을 흡인하고, 플레이트를 PBS-Tween(0.137M NaCl, 0.0027M KCl, 0.0072M Na2HPO4, 0.0015M KH2PO4, 0.05% v/v 폴리소르베이트 20, pH 7.2)로 300uL/웰로 2번 세척했다. 웰을 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS-Tween + 1% BSA 200uL/웰로 차단시켰다. 다음에, 플레이트를 톡톡 쳐서 차단 용액을 제거한 다음, 융합 플레이트의 각 웰로부터의 조건 배지 50uL씩을 분석 플레이트의 웰에 복제 평판했다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 미결합 항체를 흡인하고, 플레이트를 PBS-Tween 300uL/웰로 2번 세척했다. HRP 콘쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG, Fc 특이적 항혈청(Jackson Immunoresearch)을 PBS-Tween + 1% BSA 중에 1:5000으로 희석하여 분석 플레이트의 웰에 100uL/웰씩 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 미결합된 2차 단계 항체를 웰에서 흡인하고, 플레이트를 5번 세척했다. 다음에, 각 웰에 테트라메틸벤지딘(TMB)(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 100uL/웰씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 5분간 인큐베이션했다. 450nm TMB 중지시약(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)을 100uL/웰씩 첨가하여 색 발생을 중지시켰고, 웰의 흡광도 값을 Molecular Devices Spectra MAX 340 기기에서 450nm에서 읽었다.

중화 분석의 결과는 융합체 291 및 292에서 각각 52개 및 139개의 웰이 항체를 함유했으며, 항체는 IL-31 자극 활성의 적어도 40%를 억제했음을 나타냈다. 양성반응에 대한 더 엄격한 정의가 융합체 294에 적용되었는데, 이 경우 131개의 웰이 IL-31 활성의 적어도 70%를 억제한 항체를 함유했음이 관찰되었다. IL-31-CEE와 결합한 mAb를 검출하기 위한 ELISA 분석의 결과는 대부분의 사례에서 마스터 웰이 IL-31-CEE와 결합한 IgG 항체를 함유한다고 판명된 경우에는 그것이 또한 세포-기반 중화 분석에서 IL-31-CEE를 억제한 항체를 함유했음을 나타냈다. 그러나, 일부 웰은 ELISA 분석에서는 양성이었지만 세포-기반 중화 분석에서는 상대적으로 약한 억제 능력을 나타냈는데, 이것들은 하기 설명된 이후의 분석을 위해서 저장하였다.

양성 마스터 웰에서 성장한 하이브리도마 세포를 24-웰 플레이트의 배양으로 확장시켰다. 24-웰 배양물의 밀도가 약 4-6 x 10⁵ 세포/mL에 도달했을 때, 각 웰에서 상청액(약 1.5mL)을 각각 수집하여 저장하고, 각 웰로부터의 세포를 동결보존하였다.

D. 강력한 IL-31 중화 MAb를 생산하는 하이브리도마를 분리하기 위한 마스터 웰의 선별 및 클로닝

새로운 24-웰 상청액을 각각 융합 스크린에서 사용된 세포-기반 IL-31 중화 분석을 이용하여 IL-31 중화 능력에 대해 다시 분석하였다. 각 상청액을 희석하지 않고 사용했으며 이중 분석했다. 결과는 확장 후 대부분의 마스터 웰 상청액이 원래 마스터 스크린에서 관찰된 것과 동일하거나 혹은 보다 나은 억제 활성을 여전히 보유했음을 나타냈다. 새로운 마스터 웰 상청액 중 어느 것이 가장 강한 억제 능력을 가지는지 좀더 측정하기 위해서, 이 분석에서 IL-31-CEE를 대략 90% 이상 억제한다고 증명된 상청액을 세포-기반 중화 분석으로 상청액의 희석물들을 시험하여 다시 분석했다. 상청액을 분석 플레이트 상의 융합 배지 쪽으로 연속 3배 희석물로 적정하여, 각 웰을 100uL로 만들었으며, 희석비는 순수, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81 및 1:243이었고, 이 분석은 융합 스크린에 대해 상기 설명된 대로 수행되었다. 이 분석에서 가장 억제성인 상청액이 분명히 확인되었지만, 상청액 중의 항-IL-31 항체의 농도를 알지 못했기 때문에, 어떤 것들이 가장 높은 특이적 활성을 갖는지는 결정할 수 없었다.

구체적인 항체 농도 문제를 다루기 위하여, 상기 설명된 직접 ELISA 분석에서의 IL-31-CEE에 대해 연속 2배 또는 4배 희석물을 이용하여 각 상청액을 적정 형식으로 시험했다. 마이크로소프트 엑셀로 데이터를 도표화한 후, 이 분석에서 관찰된 반 최대 광학밀도(OD)를 제공한 상청액의 희석물을 결정했는데, 이것은 차례로 상청액 중 항-IL-31 항체의 상대적 농도에 대한 어떤 표시를 제공했다.

중화 분석의 데이터와 ELISA 분석의 데이터를 조합함으로써, 각 상청액에 대한 상대적 특이적 활성을 확립하여, 가장 높은 항-IL-31 중화 특이적 활성을 함유하는 20개의 마스터 웰을 확인하였다. 흥미로운 것은 가장 강력한 항-IL-31 중화 마스터 웰이 모두 융합체 292로부터 유래했다는 점이다. 이점은 이들 마스터 웰에 대한 중화 데이터에서 주지되었는데, 여기서는 각 상청액에 대한 최대 IL-31 억제가 순수 및 1:3 희석에서 달성되었지만, 일부 상청액에서 절대적인 중화도가 나머지 것들에 비해 약간 더 높았으며, 이것은 약간 더 낮은 상대적 루시페라제 유닛수에 반영된다. 이것은 "완전" IL-31 중화의 정도가 약간 상이했다는 것으로서 해석되었다. 이 관찰과 각 마스터 웰에 대한 상대적인 중화 특이적 활성을 결합시킴으로써, 20개의 가장 강력한 중화 마스터 웰의 리스트는 겉보기에 최상인 10개로 줄어들었다. 이것들은 292.12, 292.39, 292.51, 292.63, 292.64, 292.72, 292.84, 292.105, 292.109 및 292.118을 포함했다.

이들 상위 10개의 IL-31 중화 마스터 웰 각각에 있는 세포를 클로닝하여 관심의 중화 mAb를 생산하는 클론된 하이브리도마를 분리했다. 세포는 96-웰 마이크로타이터 세포배양 플레이트에서 표준 저밀도 희석(웰 당 1개 세포 미만) 접근법을 이용하여 로닝하였고, 분석 전에 단일 초점 성장 동안 웰을 현미경 시험하여 단클론성을 평가하였다. 클로닝 배지는 HAT 성분이 결핍된 융합 배지로 구성되었다 (IMDM, 10% FC1 혈청, 2mM L-글루타민, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 10% 하이브리도마 클로닝 인자(Roche Applied Science)). 평판 6 내지 8일 후에, 모들 웰의 상청액을 IL-31-CEE 결합된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 스크리닝했다. 상청액이 특이적 mAb에 대해 강한 양성이었고, 단일 콜로니의 하이브리도마 성장만을 나타냈던 각 세트에서 4-6개의 웰로부터의 세포를 24-웰 배양으로 확장시켰고, 결과의 상청액을 IL-31-CEE 결합된 플레이트 상에서 ELISA에 의해, 그리고 세포-기반 IL-31 중화 분석에 의해 재시험하였다. 이들 결과에 기초하여, 각 세트에서 겉보기에 가장 강력한 중화 클론들을 다시 클로닝하여 상기 설명된 대로 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 성장 양성 웰의 95% 이상이 특이적 mAb에 또한 양성이었다면, 더 이상의 서브클로닝 노력은 불필요한 것으로 간주하였고, 이 하이브리도마들을 클론으로서 선언하였다. 단지 하나의 마스터 웰에서, 292.64를 2차 라운드 서브클로닝했는데, 이것은 결과의 클론들 중에서도 특히 원하는 퍼센트의 특이적 mAb 양성을 달성하기 위해 필요했다. 상청액이 특이적 mAb에 대해 강한 양성이었고, 단일 콜로니의 하이브리도마 성장만을 나타내었던 각 최종 서브클론 세트에서 5-6개의 웰로부터의 세포를 24-웰 배양으로 확장하였다. 다음에, 각 하이브리도마 클론을 하이브리도마 클로닝 인자가 결핍된 배지(BVIDM, 10% FC1 혈청, 2mM L-글루타민, 1X 페니실린/스트렙토아비딘) 중에서 성장할 수 있도록 적응시켰는데, 이것은 세포밀도가 적합했을 때 이 배지에 세포들을 분배함으로써 행한다. 적응 후, 각 세트에서 서브클론으로부터 상청액을 수집하여 IL-31-CEE 결합된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 스크리닝했다. 상청액 수집시의 세포밀도에 관련된 역가에 기초하여, "최상의" 최종 클론들을 선택하였는데, 다음 그룹의 최종 클론들이 선별되었다: 292.12.3.1; 292.39.5.3; 292.51.5.2; 292.63.5.3; 292.64.6.5.5; 292.72.3.1; 292.84.1.6; 292.105.4.1; 292.109.4.4; 및 292.118.6.4.

이들 각 하이브리도마에 의해서 생산된 mAb의 마우스 IgG 동형을 마우스 단클론성 항체 이소스트립 테스트(Roche Applied Science)를 이용하여 결정하였다. IgG2a 서브클래스에 속하는 것으로 밝혀진 292.72.3.1 및 292.84.1.6를 제외한 모든 mAb가 IgG1에 속하는 것으로 판명되었다.

E. 강력한 IL-31 중화 MAb들의 시험관내 특이적 중화 활성의 순위화

10개의 강력한 마우스 항-인간 IL-31 mAb의 시험관내 특이적 중화 활성의 순위를 매기기 위하여, 1차 라운드 클론들 각각으로부터 배출된 상청액을 앞서 설명된 세포-기반 중화 분석으로 다시 시험하였다. 먼저, 각 상청액 중 IgG의 양을 기준물질로서 기지 농도의 mAb를 사용하여 단백질 G 칼럼 상에서 HPLC 분석하여 측정하였다. 다음에, 각 상청액을 배출된 상청액을 생성하는데 사용된 것과 동일한 배지 중에 1ug/mL의 IgG 농도로 희석했다. 다음에, 희석된 상청액을 배지 중에 10배 연속 희석하여 적정하여 1ug/mL에서 0.0001ug/mL까지의 농도 범위를 얻었고, 이것을 앞서 설명된 세포-기반 중화 분석으로 세 번씩 시험했는데, 이때 IL-31-CEE 세트의 최종 농도는 300pg/mL(18.27pM)였다. 이 분석의 결과를 표 2에 나타내는데, mAb를 가장 강한 것부터 최소로 강한 것의 순서로 열거했다. mAb 292.84.1과 292. 12.3가 가장 강력한 중화제였고, 그 다음 차례는 mAb 292.72.3과 292.63.5였는데, 이것들은 전자의 2개의 효능의 대략 반인 것으로 나타났다. 나머지 mAb들은 2개의 최상의 mAb에 비해 약 6-9배 더 적은 것으로 나타났다.

[표 2]

상기 결과에 기초하여, 하이브리도마 292.84.1.6, 292.12.3.1, 292.72.3.1, 292.63.5.3, 및 292.118.6.4를 상이한 수준의 특이적 중화능력을 갖는 표본으로서 선택하였고, 부다페스트 조약하에 원 기탁물로서 아메리칸 컬처 타입 티슈 콜렉션 (ATCC, Manassas, VA) 특허기탁기관에 기탁하여, 다음과 같은 ATCC 수탁번호를 받았다: 클론 292.12.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6815); 클론 292.72.3.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6816); 클론 292.63.5.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6829); 클론 292.118.6.4 (ATCC 특허기탁명 PTA-6830); 및 클론 292.84.1.6(ATCC 특허기탁명 PTA-6871).

F. 약한 IL-31 중화 mAb를 생산하는 하이브리도마를 분리해내기 위한 마스터 웰의 선별 및 클로닝

항-인간 IL-31 mAb의 발생에서 흥미로운 것은 상이한 유체들 중에서 IL-31의 양을 정량하기 위한 샌드위치 분석 체제에서 사용될 수 있는 mAb 쌍들의 분리였다. 이러한 mAb 쌍들은 전형적으로 표적 분자 상의 상이한 에피토프들에 대해 특이성을 가지며, 바람직하게는 이 분자와의 결합과는 교차경합을 하지 않는다. 이러한 mAb 쌍들의 후보를 분리하기 위해, 우수한 IL-31 중화 mAb와 약한 중화 잠재력을 지닌 것이 쌍을 이루도록 하는 전략이 선택되었는데, 여기서는 이러한 상이한 기능의 두 항체가 십중팔구 비-중첩(공간적으로 분리된) 에피토프와 결합한다고 가정했다.

융합 스크린에서 이미 주지된 대로, 각 융합으로부터의 몇몇 플레이트를 IL-31-CEE 결합된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 스크리닝하여 항-IL-31 항체 양성인 마스터 웰 상청액을 확인하였다. ELISA 결과와 세포-기반 중화분석 결과의 비교는 IL-31-CEE에는 잘 결합했지만 세포-기반 중화분석에서 이 분자를 그다지 잘 중화하지는 않았던 항체를 함유했던 마스터 웰의 존재를 시사하였다. 더 강한 중화 마스터 웰에서 행했던 것과 마찬가지로, 이들 마스터 웰에서 성장한 하이브리도마 세포를 24-웰 플레이트 배양으로 확장하였다. 24-웰 배양물의 밀도가 약 4-6 x 10⁵ 세포/mL에 도달했을 때, 각 웰에서 상청액(약 1.5mL)을 각각 수거하여 저장하고, 각 웰로부터의 세포를 동결보존하였다.

이들 새로운 상청액을 세포-기반 중화분석(순수 상청액에서부터 시작하여 최종 1:234 희석까지 진행되는 연속 3배 희석)과 래트 항-뮤린 IL-31 mAb의 발생에서 사용된 것과 유사한 "캡처" 스타일 ELISA 분석을 이용하여 시험하였는데, 이때 다음과 같은 차이점이 있었다: 1) 플레이트 코팅 항체로서 양 항-마우스 IgG, Fc 특이적 항체(Jackson Immunoresearch)(1ug/mL), 2) 1시간 동안 PBS-Tween + 1% BSA로 플레이트를 1회 차단, 3) 웰에 첨가된 각 상청액을 1회 적정(순수 상청액에서 시작하여 최종 1:2187 희석까지 진행되는 연속 3배 희석), 그리고 4) 바이오틴화된 IL-31-CEE(바이오틴:단백질 3:1 몰비)를 200ng/mL씩 추가. 이 분석은 샌드위치 스타일 ELISA를 위한 우수한 항체의 본질적인 특성인 용액 중에서 IL-31-CEE에 결합하는 항체의 능력을 평가했기 때문에, 이 분석이 IL-31-CEE 결합된 플레이트에 항체를 결합시키는 것보다 더 적절한 것으로 느껴졌다. 실제로, IL-31-CEE 결합된 플레이트에는 잘 결합하였던 항체를 함유한 많은 마스터 웰 상청액이 용액 중에서는 이 분자를 잘 인식하지 못하는 것으로 관찰되었다.

적합한 항체를 분비하는 하이브리도마를 클로닝할 웰을 선택하기 위하여, 중화분석에서 상청액이 IL-31-CEE를 약하게 중화하였고(50% 미만, 바람직하게는 단지 1-20%), 용액 중에서는 IL-31-CEE에 비교적 잘 결합하였던(순수 농도의 상청액에서 2.0 이상의 OD에 의해 주지됨) 10개의 웰을 확인하였다(291.78, 292.152, 292.154, 294.35, 294.144, 294.146, 294.154, 294.155, 294.158 및 294.163). 클로닝, 클론 스크리닝, 및 최상의 1차 라운드 클론의 선별을 강한 중화 웰에 대해서 상기 설명한 대로 수행하였다.

서브클로닝할 하이브리도마의 수를 줄이기 위해서, 선별한 1차 라운드 클론들 각각으로부터의 고갈된 상청액을 사용하여 두 가지 새로운 분석을 수행하였다. 첫 번째 평가는 Biacore 3000 표면 플라스몬 공명 기기를 이용하여 에피토프 특이성("비닝")에 기초, mAb를 그룹으로 나누려는 시도였다. 우수한 중화 mAb 상청액들 중 하나(292.64.6)와 10개의 약하게 중화하는 1차 라운드 클론 상청액을 서로에 대해 작업하여, 겉보기에 4개의 "빈"이 확인되었다. 빈 1은 우수한 중화 항체만으로 구성되었다. 빈 2는 292.152.4, 292.154.4, 294.35.2, 294.146.5 및 294.154.5로 이루어졌다. 빈 3은 291.78.4, 294.155.6, 294.158.5 및 294.163.2를 포함했다. 빈 4는 294.144.3만을 함유했다. 두 번째 분석은 이번에만 반복된 "캡처" 스타일 ELISA를 포함했는데, 왜냐하면 원래의 마스터 24개 웰 배양 상청액과 비교하여 상청액 중의 특이적 항체 농도가 더 높았기 때문으로, 더 완벽한 적정곡선이 얻어져 IL-31-CEE에 대한 항체 결합의 EC50을 측정할 수 있었다. 결과를 표 3에 나타내는데(비닝 결과 및 세포-기반 중화분석에서 IL-31-CEE 활성의 억제 %와 함께), 이것은 다양한 mAb들에 대한 EC50 값(그리고 추정적으로는 IL-31-CEE에 대한 mAb의 친화성)이 광범위했음을 시사한다.

[표 3]

1) 우수한 중화 mAb(292.64.6)와는 다른 에피토프 빈에 속하고 2) 캡처 스타일 분석에서 낮은 EC50 값에 의해 표시되는 최고의 친화성을 갖는 mAb를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 것이 중요하므로, 1차 라운드 클론 294.35.2, 294.144.3, 294.154.5 및 294.163.2만을 더 강한 중화 mAb에 대해 상기 설명한 대로 최종 클로닝했다. 이런 추가의 서브클로닝의 결과, 다음 그룹의 최종 클론들을 선별하였다: 294.35.2.6.3; 294.144.3.5; 294.154.5.6; 및 294.163.2.1.

이들 각 하이브리도마에 의해 생산된 mAb의 마우스 IgG 동형을 마우스 단클론성 항체 이소스트립 테스트(Roche Applied Science)를 이용하여 결정하였다. 4개 mAb는 모두 IgG1 서브클래스에 속하는 것으로 판명되었다. 4개 하이브리도마의 각 샘플을 부다페스트 조약하에 원 기탁물로서 아메리칸 타입 티슈 콜렉션(ATCC, Manassas, VA) 특허기탁기관에 기탁하였고, 다음의 ATCC 수탁번호를 얻었다: 클론 294.163.2.1(ATCC 특허기탁명 PTA-6831); 클론 294.35.2.6.3(ATCC 특허기탁명 PTA-6872); 클론 294.154.5.6(ATCC 특허기탁명 PTA-6875); 및 클론 294.144.3.5(ATCC 특허기탁명 PTA-6873).

G. 마우스 항-인간 IL-31 mAb와 마우스 IL-31의 교차반응

10개의 강한 중화 mAb와 10개의 약한 중화 mAb로부터의 1차 라운드 클론 상청액 전부를 mIL-31-CEE 결합된 플레이트 상에서 ELISA에 의해 마우스 IL-31을 인식하는 능력에 대해 시험하였다. 어떤 mAb에서도 교차반응성은 보이지 않았는데, 이것은 mAb들이 인간 IL-31에 대한 특이성을 갖는 것이 분명했음을 시사한다. 더욱이, 이들 결과는 항체들 중 어느 것도 이들 연구에 사용된 인간 및 마우스 IL-31 재조합 분자 둘 다의 C-말단 단부에 공통된 CEE 펩티드 택을 인식하지 못했음을 나타내는데, 이것은 원 마스터 웰 상청액에 대해서는 측정되지 않았던 것이다.

실시예 3

IL-31RA/OSMR베타 수용체 루시페라제 분석

4개 유전자로부터의 STAT 전사인자 결합 요소를 함유하는 상보성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 KZ134 플라스미드를 구성했는데, 4개 유전자는 변형된 c-fos Sis 유도성 요소(m67SIE, 또는 hSIE)(Sadowski, H. et al. Science 261:1739-1744, 1993), p21 WAF1 유전자로부터의 p21 SIE1(Chin, Y. et al., Science 272:719-722, 1996), β-카세인 유전자의 포유류 선 반응 요소(Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991), 및 Fcg RI 유전자의 STAT 유도성 요소(Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995)를 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 Asp718-XhoI 양립성 단부를 함유하며, 같은 효소로 효소절단되고 네오마이신 선택성 마커를 함유하는 c-fos 프로모터를 가진 수용자 개똥벌레 루시페라제 리포터 벡터(Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998)에 표준 방법을 사용하여 리게이션하였다. 표준 핵산전달감염 및 선별 방법을 사용하여 KZ134 플라스미드로 BaF3 세포를 안정하게 핵산전달감염시켜 BaF3/KZ134 셀라인을 만들었다.

전장 IL-31RA 또는 IL-31RA/OSMR베타 수용체를 발현하는 안정한 BaF3/KZ134 인디케이터 셀라인을 구성하였다. 표준 기술을 이용하여 클론들을 희석하고 평판하여 선별하였다. 클론들을 인간 IL-31 조건배지 또는 유도인자로서 정제된 IL-31 단백질을 사용하여 루시페라제 분석(하기 B 참조)에 의해 스크리닝하였다. 최고의 루시페라제 반응(STAT 루시페라제에 의한)과 최저의 바탕값을 갖는 클론들을 선별하였다. 안정한 핵산전달감염체 셀라인들을 선별하였다. 이 셀라인들은 셀라인에 핵산전달감염된 수용체에 따라 BaF3/KZ134/IL-31RA 또는 BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMR베타라고 명명하였다.

유사하게, BHK 셀라인을 본원에 설명된 방법을 이용하여 구성하고 본원에 설명된 루시페라제 분석에 사용하였다. 이 셀라인들은 셀라인에 핵산전달감염된 수용체에 따라 BHK/KZ134/IL-31RA 또는 BHK/KZ134/IL-31RA/OSMR베타라고 명명하였다.

BaF3/KZ134/IL-31RA와 BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMR베타 세포를 회전침강시키고, mIL-3 무함유 배지로 세척하였다. 세포를 3번 회전시키고 세척하여 mIL-3를 확실히 제거하였다. 다음에, 혈구계에서 세포를 계수하였다. 세포를 mIL-3 무함유 배지를 사용하여 웰 당 100㎕의 부피로 웰 당 약 30,000 세포로 96-웰 포맷에 평판하였다. 이어진 분석에서 대조군으로서 사용되는 핵산전달감염되지 않은 BaF3/KZ134 세포에 대해서도 같은 과정을 사용하였다. BHK/KZ134/IL-31RA 또는 BHK/KZ134/IL-31RA/OSMR베타 세포를 100㎕ 배지 중에 웰 당 15,000 세포로 96-웰 포맷에 평판하였다. 모 BHK/KZ134 세포를 대조군으로서 사용하였다.

BaF3/KZ134/IL-31RA, BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMR베타, BHK/KZ134/IL-31RA, 또는 BHK/KZ134/IL-31RA/OSMR베타 세포의 STAT 활성를 조건배지 또는 정제된 단백질을 이용하여 평가한다. BaF3/KZ134/IL-31RA, BaF3/KZ134/IL-31RA/OSMR베타, BHK/ KZ134/IL-31RA, 또는 BHK/KZ134/IL-31RA/OSMR베타 세포에 희석된 조건배지 또는 단백질 100㎕를 첨가한다. 조건배지를 사용한 분석은 대조군으로서 핵산전달감염되지 않은 BaF3/KZ134 또는 BHK/KZ134 세포와 나란히 행한다. 총 분석 부피는 200㎕이다. 분석 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 하에 24시간 인큐베이션한 다음, 24시간째에 BaF3 세포를 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 펠릿으로 만들고, 배지를 흡인하고, 세포용해 버퍼(Promega) 25㎕를 첨가한다. BHK 셀라인에 대해서는 세포가 유착성이기 때문에 원심분리 단계가 필요하지 않다. 실온에서 10분 후, 플레이트를 5초 인테그레이션으로 루시페라제 분석 기질(Promega) 40㎕를 첨가한 발광분석기(Labsystems Luminoskan, model RS)에서 읽어서 STAT 리포터 구성물의 활성화를 측정한다.

실시예 4

아데노바이러스 STAT/SRE 리포터 유전자의 일시적 주사에 의한 인간 형질전환된 상피 셀라인에 대한 루시페라제 분석

IL-31 활성의 억제, 감소, 및/또는 중화가 루시페라제 분석에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 인간 형질전환된 셀라인을 각 세포 타입에 대해 특정된 정규 성장배지 중에 10,000 세포/웰로 96-웰 평면바닥 플레이트에 파종할 수 있다. 다음날, 세포를 아데노바이러스 리포터 구성물 KZ136으로 5000의 감염 다중도로 감염시킨다. KZ136 리포터는 혈청반응 요소에 더하여 STAT 요소를 함유한다. 총 부피는 100uL/웰이고, 2mM L-글루타민(GibcoBRL), 1mM 나트륨 피루베이트(GibcoBRL) 및 1x 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물(GibcoBRL)로 보충된 DMEM(혈청-무함유 배지라고 한다)을 사용한다. 세포를 하룻밤 배양한다.

다음날, 배지를 제거하고 유도배지 100㎕로 교체한다. 유도배지는 혈청-무함유 배지 중에 100ng/ml, 50ng/ml, 25ng/ml, 12.5ng/ml, 6.25ng/ml, 3.125ng/ml, 및 1.56ng/ml로 희석된 인간 IL-31이다. 20% FBS의 양성 대조군을 사용하여, 분석에 유효성을 부여하고 아데노바이러스에 의한 감염의 성공을 확실히 한다. 세포를 5시간 유도시킨 다음 배지를 흡인한다. 세포를 PBS로 50㎕/웰로 세척한 다음, 1x 세포용해 버퍼(Promega)로 30㎕/웰로 세포용해시킨다. 실온에서 10분간 인큐베이션한 후, 세포용해액 25㎕/웰을 불투명 화이트 96-웰 플레이트로 옮긴다. 다음에, 플레이트를 루시페라제 기질(Promega)을 40㎕/웰 주사하여 5초 인테그레이션을 사용하여 발광분석기에서 읽는다.

실시예 5

IL-31 항체에 의한 사이토카인 생산의 억제

IL-31은 DU145(질환 셀라인 및 정상 셀라인)에서 IL-6의 생산을 자극할 뿐만 아니라, A549 셀라인을 자극하여 IL-8의 생산을 자극하고, U2OS 셀라인(질환 및 정상)에서는 IL-8의 생산을 감소시키는 것으로 알려졌다. 공개된 미국특허출원을 참조한다(공개번호 20030224487 참조, Sprecher, Cindy, et al, 2003). 이와 같이, 본원에 설명된 IL-31 단클론성 항체의 활성은 이들 인간 질환-상태 상피 셀라인에서 IL-31 활성의 억제, 감소, 및/또는 중화에 의해 측정될 수 있다.

A. 인간 IL-31과 함께 배양된 인간 질환-상태 상피 셀라인에 의한 사이토카인 생산의 억제

세포를 6-웰 플레이트(Costar)에 웰 당 4.5 x 10⁵ 세포 밀도로 평판하고 각 성장배지 중에서 배양한다. 세포는 시험 시약들과 함께 배양한다; 1OOng/mL IL-31 (항체 시험감염 존재 및 부재), 1Ong/mL 인터페론 감마(IFN 감마)(R&D Systems, Minneapolis MN), 1Ong/mL 종양괴사인자 알파(TNF 알파)(R&D Systems, Minneapolis MN), 1Ong/mL IL-1베타(R&D Systems, Minneapolis MN), 또는 1OOug/mL 지질다당 (LPS)(Sigma). 24시간 및 48시간째에 상청액을 수거하여 사이토카인에 대해 분석한다; GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니-자극인자), IL-1b, IL-6, IL-8, MCP-I(대식세포 화학유인 단백질-1) 및 TNFa. BioSource International(Camarillo, CA)의 멀티플렉스 항체 비드 키트를 사용하여 샘플 중의 사이토카인을 측정했다. Luminex-100 기기(Luminex, Austin, TX)에서 분석들을 판독하고, 데이터를 MasterPlex 소프트웨어(MiraiBio, Alameda, CA)를 사용하여 분석한다. 24시간 샘플의 각 셀라인에 대한 사이토카인 생산(pg/mL)을 측정한다.

B. 인간 IL-31과 함께 배양된 정상 인간 상피 셀라인에 의한 사이토카인 생산의 억제

세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 1 x 10⁵ 세포 밀도로 평판하고, 시험 시약들과 함께 배양한다; 1000ng/mL, 100ng/mL 및 10ng/mL IL-31(항체 시험감염 존재 및 부재), 10ng/mL TNFa, 10ng/mL OSM, 10ng/mL IFNa, 10ng/mL TGFb 또는 10ng/mL 림포탁신. 24시간 및 48시간째에 상청액을 수거하여 사이토카인에 대해 분석한다; IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1a, RANTES 및 에오탁신. 사이토카인을 앞서 설명된 대로 분석한다. 48시간 샘플의 각 셀라인에 대한 사이토카인 생산(pg/mL)을 측정한다.

C. 인간 IL-31 및 IFN 감마와 함께 공-배양된 인간 질환-상태 상피 셀라인에 의한 사이토카인 생산의 억제

세포를 24-웰 플레이트에 2 x 10⁵ 세포 밀도로 평판하고, 10ng/mL IFN 감마 +/- 100ng/mL, 10ng/mL 또는 1ng/mL로 IL-31과 함께 공-배양한다. 24시간 및 48시간째에 상청액을 수거하고, f(항체 시험감염 존재 및 부재), 또는 IL-8 and MCP-1에 대해 분석한다. 24시간 샘플의 각 셀라인에 대한 사이토카인 생산(pg/mL)을 측정한다.

실시예 6

형질전화된 골수 내피세포(TRBMEC) 단층에의 U937 단핵구 유착에 대한 IL-31 효과의 억제

IL-31이 내피단층에 대한 U937 세포의 기본적 유착에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다. 특히, IL-31은 TNF알파와 상승작용하여 U937 유착을 더욱 강화시켰다. 공개된 미국특허출원을 참조한다(공개번호 20030224487 참조, Sprecher, Cindy et al., 2003). 따라서, 본원에 설명된 항-IL-31 항체에 의한 IL-31의 억제가 다음의 분석에 의해 측정될 수 있다.

형질전환된 골수 내피세포(TRBMEC)를 미세혈관 성장 보충액(MVGS)(Cascade Biologies)으로 보충된 배지 M131 (Cascade Biologies) 중에서 96-웰 조직 클러스터(Falcon)에 파종한다. 컨플루언시(24시간 후)에서 1% 태아 소 혈청(Hyclone)으로 보충된 M199(Gibco-Life Technologies)로 교체한다. 항체 시험감염의 존재 및 부재하에 인간 재조합 IL-31(시험 시약)을 다양한 농도(0.4에서 10ng/mL까지)로 첨가하여, 유착을 가져오는 면역세포-내피세포 상호작용에 대한 단백질의 영향을 시험한다. 일부 웰에는 IL-31에 더하여 공지된 전-염증성 사이토카인인 종양괴사인자(TNFalpha R&D Systems)를 0.3ng/mL 제공하여, 염증 조건하에서 내피세포에 대한 단백질의 영향을 시험한다. 양성 대조군으로서 0.3ng/mL의 TNF알파를 단독으로 사용하며, 이 사용 농도는 이 시스템에서의 최대 TNF알파 효과의 약 70%를 나타내는데, 즉 내피에 대한 U937 세포(인간 단핵구-유사 셀라인)의 최대 유착을 유도하지 않았다. 이런 이유 때문에, 이 셋업을 이용하여 TNF알파 효과의 상향조절 및 하향조절을 검출할 수 있다. TNF알파가 있을 때와 없을 때 모두의 기초적 유착 수준을 시험 시약의 효과를 평가하기 위한 베이스라인으로 사용한다.

시험 시약, 5μM 칼세인-AM 형광 마커(Molecular Probes)로 염색된 U937 세포와 함께 내피세포를 하룻밤 인큐베이션한 후, 세포를 1% FBS로 보충된 RPMI 1640 (페놀-레드 아님)에 현탁하고, 린스한 TRBMEC 단층 위에서 100,000 세포/웰로 평판한다. 30분 후에 485/538nm의 여기/방출 파장에서 형광 수준을 측정하며(몰리큘라 디바이스 마이크로-플레이트 리더, CytoFluor 어플리케이션), 전후에 웰을 따뜻한 RPMI 1640(페놀-레드 아님)으로 3번 린스하여 비-유착 U937을 제거한다. 린스-전(총)과 린스-후(유착-특이적) 형광 수준을 사용하여 유착 퍼센트를 측정한다(순 유착/순 전체 x 100 = 유착 %).

실시예 7

IL-31 생물학적 분석 프로토콜

hzCYTOR17(IL-31RA), hOSMRB, 및 KZ134로 핵산전달감염된 BAF3 세포를 5x10⁵ 및 1x10⁶ 세포/mL까지 성장시킨다. 세포를 분석 배지(RPMI 1640, 10% FBS, L-글루타민, 나트륨 피루베이트, 및 Pen/Strep(모두 Gibco))로 세척하고, 분석 배지 중에 3x10⁵ 세포/mL로 현탁한다. 96-웰 불투명 플레이트에서 hIL-31 표준물질을 분석 배지 중에서 600pg/mL에서 9.38pg/mL까지 이중 적정하는데, 100㎕/웰, 1:2 연속 희석을 사용한다. 성능 대조군 표준물질을 플레이트에 100㎕ 중 350pg/mL 및 35pg/mL로 이중 첨가한다. 시험 샘플은 주로 1:2 또는 1:4 희석되며, 샘플 웰에 이중 첨가된다. 세척된 BAF3 세포 100㎕를 각 웰에 첨가하며, 최종 농도는 3x10⁴ 세포/웰이다. 플레이트를 37℃, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 16-24시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 1200 RPM에서 5분간 원심분리하고, 배지를 톡톡 쳐서 제거한 다음, 세포용해 버퍼(Promega)를 25㎕/웰씩 각 웰에 첨가한다. 10분 후에 플레이트를 발광분석기(Berthold)에서 판독한다. 발광분석기은 루시페라제 기질 믹스 (Promega) 40㎕/웰을 첨가하며, 4초마다 루시페라제를 통합한다. 발광 값은 스프레드시트로 표출되는데, 여기서 이 값들이 분석되고, 부피 mL 당 10⁶ 세포 당 IL-31의 피코그램으로 전환된다.

실시예 8

생체내 접촉성 과민증의 개시 및 유지에서 IL-31의 연관성

방법 I

BALB/c 마우스의 면도한 등 중앙에 아세톤:올리브오일(4:1) 용액 중에 용해된 0.5% DNFB(2,4-디니트로-플루오로-벤젠, Sigma, St. Louis MO) 25uL을 피펫을 이용하여 바른다. 부형제 대조군은 아세톤:올리브오일만을 25uL 받았다. 5일 후에, 마우스를 흡입챔버에서 이소플루오란으로 마취시키고, 실험 및 대조군 동물의 양쪽 귓바퀴 엔지니어용 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 베이스라인 측정값을 얻는다. 다음에, 모든 마우스의 각 귀의 양측에 아세톤:올리브오일(4:1) 중에 용해된 0.25% DNFB 10uL를 도포하여 마우스를 시험감염시킨다. 오른쪽 귀(시험감염됨)와 왼쪽 귀(시험감염되지 않음)에 차이가 있었기 때문에 24시간 및 48시간 후에 접촉성 과민증을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어용 마이크로미터로 행한다. 첫 시험 마우스의 시험감염된 귀와 시험감염되지 않은 귀의 귀 팽창의 차이에 의해 바탕값을 측정한다.

FACS 및/또는 ELISA 분석용 전혈 및 혈청을 죽이기 전에 채취하고, 조직학용으로 귀를 수거한다.

방법 II (Th2 반응 유도)

1일, 2일 및 8일에 피펫을 이용하여 아세톤/디부틸프탈레이트(MSDS에서 입수가능)의 1:1 용액에 용해된 0.5% FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 100uL를 BALB/c 마우스의 면도된 등 중앙에 바른다. 13일에 마우스를 흡입챔버에서 이소플루오란으로 마취시키고, 실험 및 대조 동물의 양쪽 귓바퀴를 엔지니어용 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 베이스라인 측정값을 얻는다. 각 귀의 등쪽 표면에 0.5% FITC(1:1 아세톤:디부틸프탈레이트) 25uL를 도포하여 마우스를 시험감염시킨다. 오른쪽 귀(시험감염됨)와 왼쪽 귀(시험감염되지 않음)에 차이가 있었기 때문에 24시간 및 48시간 후에 접촉성 과민증을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어용 마이크로미터로 행한다. 첫 시험 마우스의 시험감염된 귀와 시험감염되지 않은 귀의 귀 팽창의 차이에 의해 바탕값을 측정한다. FACS 및/또는 ELISA 분석용 전혈 및 혈청을 죽이기 전에 채취하고, 조직학용으로 귀를 수거한다.

방법 III (Th1 반응 유도)

2% 옥사잘론(4:1 아세톤:올리브오일) 25uL을 피펫을 이용하여 BALB/c 마우스의 면도한 등 중앙에 바른다. 7일에, 마우스를 흡입챔버에서 이소플루오란으로 마취시키고, 실험 및 대조군 동물의 양쪽 귓바퀴 엔지니어용 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 베이스라인 측정값을 얻는다. 각 귀의 등쪽 표면에 옥사잘론 8uL을 도포하여 마우스를 시험감염시킨다. 오른쪽 귀(시험감염됨)와 왼쪽 귀(시험감염되지 않음)에 차이가 있었기 때문에 24시간 및 48시간 후에 접촉성 과민증을 측정한다. 모든 측정은 엔지니어용 마이크로미터로 행한다. 첫 시험 마우스의 시험감염된 귀와 시험감염되지 않은 귀의 귀 팽창의 차이에 의해 바탕값을 측정한다. FACS 및/또는 ELISA 분석용 전혈 및 혈청을 죽이기 전에 채취하고, 조직학용으로 귀를 수거한다.

이 실험의 민감화 단계와 시험감염 단계에서 모두 IL-31에 대한 본원에 설명된 항체를 이용하여 접촉성 과민증의 개시와 유지에서 IL-31의 연관성을 시험한다.

실시예 9

생체내 아토피 피부염에서 IL-31의 연관성

방법 I (NC/Nga 마우스의 민감화)

수컷 NC/Nga 마우스를 CRL Japan에서 구입했다. 도착했을 때 마우스는 4주 된 것들이었고, 적응을 위해 4주 동안 SPF 격리 조건에 수용되었다. 마우스가 약 10-11주 되었을 때 항원 민감화를 시작했다. 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고 전기 바리캉으로 등을 면도했다. 마우스에 피부 병소가 발생할 때까지 약 10ug의 세로무늬먼지진드기(Dp)(Indoor Biotechnologies, 특별주문) 추출물을 5 내지 6주 동안 매주 3번씩 목덜미에 피내 주사했다. 대조군 동물은 매주 3번씩 10uL PBS 피내 주사를 받았다. Dp 추출물은 Matsuoka와 동료들에 의한 방법에 따라서 제조했다. Matsuoka H., et al., Allergy: 58, 139 (2003). 간단히 말해서, 595mg Dp 동결건조 스펜트 배양 추출물을 12mL 멸균 PBS(Gibco)에 용해했다. Dp를 50mL 팔콘 튜브에 넣고 진동 락커 상에서 30분간 혼합했다. 추출물을 200rpm에서 10분간 회전시키고, 상청액을 수거하여 1mL 냉동바이알 튜브에 나누어 넣은 다음, -20℃에 저장했다.

방법 II (DO11.10 마우스의 민감화)

DO11.10 트랜스젠 마우스를 인-하우스 콜로니로부터 자라게 하고, 9.5주 내지 14주 되었을 때 항원 민감화를 시작했다. 피내 민감화하기 24시간 전에, 마우스를 이소플루오란으로 마취시키고, 마우스 몸통 전체(등과 복부)를 전기 바리캉으로 면도했다. 다음에, 마우스 등 위를 엘라스틴 수술테이프(Johnson and Johnson)로 테이프스트립했다. 1㎠ 멸균 가제 패치를 500ug 오브알부민(Calbiochem 32467) 또는 멸균 PBS(Gibco)로 적신 다음, 듀오덤 엑스트라 씬 드레싱(ConvaTec 187932)과 함께 마우스의 왼쪽 등에 부착했다. 다음에, 패치와 드레싱을 엘라스틴 수술테이프로 몸체를 감싸서 덮었고, 이로써 마우스가 패치를 제거하거나 파손시킬 수 없게 하였다. 패치를 7일 동안 착용시킨 후 제거하였다. 다음번 피내 민감화 전에 마우스를 2주간 쉬게 하였다. 마우스는 총 주 3회의 민감화를 받았다.

결과

먼지 진드기 민감화된 NC/Nga 및 OVA 민감화된 DO11.10 동물의 병소 및 비-병소 피부에서 IL-31RA 발현의 면역조직화학 분석은 IL-31RA가 마우스의 표피 각질세포에 의해 발현됨을 나타냈지만, 항원 민감화된 동물과 PBS 민감화된 동물 사이에서 발현 수준에 유의한 차이는 없었다.

실시예 10

래트 항-마우스 IL-31 항체의 투여에 의한 가려움의 억제

또 다른 NC/Nga 마우스 연구에서, 4주 된 수컷 NC/Nga 마우스(SLC, Tokyo)를 경증 내지는 중간 정도의 피부염을 이미 나타내는 중인 NC/Nga 마우스에 노출시켰다. 7주째에 마우스를 세 그룹으로 나누고 다음과 같은 치료를 제공했다. 7주 동안 15일마다, 한 그룹의 마우스에는 IL-31 래트-항-마우스 주사를 10mg/kg씩 주었고, 한 그룹에는 마우스 혈청 알부민 주사를 주었으며, 세 번째 그룹에는 어떤 치료도 제공하지 않았다. 피부 병소의 심한정도에 대해 마우스를 주 2회 임상평가했다. 구체적으로, 피부의 포함(0 = 포함 없음; 1 = 등 포함; 2 = 등 및 안면; 3 = 등, 안면, 및 귀)과 병소의 심한정도(0 = 정상피부; 1 = 각질 및 건조; 2 = 결절성 병소; 3 = 출혈 병소). 추가하여, 긁는 증상을 평가했다. 뒷발가락을 이용한 마우스 생채기를 자동 검출하였고, Micro Act(Neuroscience, Tokyo, Japan)를 이용하여 객관적으로 평가하였다. 케탈라/크실라진 마취하에서 작은 테플론-코팅 자석을 마우스의 양 뒷발의 등쪽에 피하 이식했다. 자석을 가진 마우스를 라운드 코일로 둘러싸인 관찰 챔버에 두었다. 자석의 이동에 의해 코일에 유도된 전류를 증폭하여 기록했다. 다음의 세팅으로 분석 프로그램을 사용하여 긁기 사건을 기록했다: 역치(V) 0.1; 사건 갭(초) 0.2; 최대 Freg(Hz) 20.0; 최소 Freg(Hz) 2.0; 및 최소 지속기간(초) 1.5. 주: NC/Nga 마우스 모델에서, 장기적인 지속(>1.5초)은 마우스에서 피부염-특이적 가려움 감각과 관련되지만, 짧게 지속되는 긁는 행동(0.3-1.5초)은 관련되지 않는다. 측정된 전체적인 1차 종점은 긁기, 피부염, 및 체중이었다.

결과:

전체 기간에 걸쳐 취득된 래트 항-마우스 IL-31 항체를 사용한 치료는 1차 종점을 만족시키지 못했다. 그러나, 추가의 분석에 의해 22-43일의 시간 간격으로 항-IL-31 항체로 치료한 것에 의해 긁기가 상당히 감소한 것이 드러났다. 이 시간 기간에서, 전체 기간에 관해서, 항-IL-31 항체를 사용한 치료는 아토피 피부염-유사 병소의 발생에 영향을 미치지 않았으며, 감소된 동물의 체중증가를 정상화하지 않았는데, 이것은 아마도 임상적 징후의 지연된 개시나, 아니면 치료 종료시 자가-항체를 중화함으로 인한 것 같다. 이 실험에서 긁기 거동은 항체 치료가 개시된 시점에서 대부분의 동물에서 이미 증가하였지만, 피부염은 그렇지 않았다.

실시예 11

생체내 DTH에서 IL-31의 연관성

방법:

DTH 반응을 발생시키기 위해, 0일에 완전 프레운드 애쥬번트(CFA, 50-100uL 총 부피) 중의 100ug 오브알부민(OVA)로 꼬리에서 피하 면역화에 의해 마우스를 항원으로 민감화했다. 1주 후 마우스를 흡입챔버에서 이소플루오란으로 마취시키고, 실험 및 대조군 동물의 양쪽 귓바퀴를 엔지니어용 마이크로미터(Mitutoyo)로 측정하여 베이스라인 측정값을 얻었다. 마우스를 왼쪽 귓바퀴에서 어떤 정맥도 건드리지 않고 피부 바로 아래에 총 부피 10uL로 PBS 중의 OVA 10ug으로 피내 시험감염시켰다. 대조군으로서 마우스는 또한 오른쪽 귓바퀴에 10uL PBS 주사를 받았다. 어떤 경우, 귀에 OVA의 피내 주사를 제공했던 별도의 대조군을 또한 반응을 억제하기 위해 국소 코르티코스테로이드로 치료하여 양성 대조군으로 사용할 수 있다. 시험감염 후 24시간 및 48시간에 마우스를 마취시켜 귀 두께를 측정했다. 결과를 다음과 같이 표현했다: 특이적 귀 팽창 = 실험 귀에 대한 (24시간 측정값 - 0시간 측정값) - 음성 대조군 귀에 대한 (24시간 측정값 - 0시간 측정값). DTH의 표식인 경화는 민감화된 항원의 주사 후 18시간까지 측정가능하며, 24-48시간까지 최대이다. 촉지 경화의 개시 지연이 이 반응을 "지연형"이라고 부르는 이유이다.

결과:

IL-31 트랜스젠 마우스를 DTH에 대해 시험했지만, 시험감염되지 않은 IL-31 트랜스젠 동물에서도 귀 두께가 증가했기 때문에, 야생형 대조군과 비교하여 IL-31 Tg 동물들 사이에서 통계적으로 유의한 DTH 차이는 측정될 수 없었다. 또한, IL-31 수용체 녹아웃 동물을 DTH 반응으로 시험하였는데, 수용체 녹아웃 동물과 야생형 동물 사이에서 DTH 반응의 유의한 차이는 관찰할 수 없었다.

실시예 12

가려움 반응의 유도에서 IL-31의 연관성

방법 I (IL-31 처리된 마우스의 캡사이신 치료)

목덜미에 식염수 중 10% 에탄올 + 10% Tween-80 중의 캡사이신 4mg/mL 용액 0.25mL를 피하 주사하기 전에 10주 된 BALB/c 동물(CRL)을 장기지속 마취제인 부프라노르핀 염산염을 0.1mg/kg 피하 주사하여 마취시켰다. 뉴로톡신 처리 후 동물을 적어도 30분간 마취를 유지하였다. 48시간 후에, 14일 동안 IL-31을 20ug/일씩 연속 송달하는 14일 삼투펌프를 피하 이식했다. 다음 기준을 사용하여 탈모증과 소양증에 대해 마우스를 6일간 매일 모니터했다: 0 = 긁기 없음, 동물은 정상을 나타냄, 1 = 적은 영역에서 외피가 얇아짐, 긁기 주지됨, 2 = 경증의 탈모(작은 반), 생채기, 3 = 중간 정도의 탈모, 긁기, 4 = 중증의 탈모, 과도한 긁기.

결과에 의해 비-캡사이신-치료된 마우스는 IL-31 송달 3일 후에 2.625의 중간 긁기/탈모 점수를 나타냈지만, 캡사이신-치료된 마우스는 1의 상당히 낮은 점수를 나타냈음이 증명되었다. 따라서, IL-31 송달 전에 캡사이신으로 치료된 마우스는 긁기 및 탈모의 발생이 지연되었고, 6일의 실험 동안 긁기 및 탈모의 강도에서도 낮은 점수를 나타냈다. 이들 데이터는 IL-31이 IL-31에 의해 유발된 탈모증 및 소양증에 기여하는 어떤 신경세포 성분을 유도한다는 것을 시사한다. 따라서, IL-31의 중화는 가려움의 발생률 및 강도를 감소시킬 수 있으며, 따라서 가려움을 수반하는 피부장애를 앓는 환자에서 피부염을 감소시킬 수 있다.

방법 II

Tac1 유전자에 대한 동종접합 결손형 마우스는 섭스턴스 P 또는 뉴로키닌 A를 검출할 수 없는 정도로 발현한다. 이들 마우스는 중간 내지는 강한 자극에 대한 통각수용기 통증 반응이 상당히 감소했으며, 따라서 통증/가려움 과정 및 염증 질환 상태에 타치키닌 펩티드의 기여를 연구하기 위한 유용한 도구이다. 12주 된 Tac1 녹아웃 마우스에 IL-31 단백질을 1ug/일씩 송달하는 14-일 삼투펌프를 이식하고, 다음 기준을 사용하여 탈모증과 소양증에 대해서 매일 관찰하였다: 0 = 긁기 없음, 동물은 정상을 나타냄, 1 = 적은 영역에서 외피가 얇아짐, 긁기 주지됨, 2 = 경증의 탈모(작은 반), 긁기, 3 = 중간 정도의 탈모, 긁기, 4 = 중증의 탈모, 과도한 긁기.

이 연구의 결과는 Tac1 결핍 마우스가 야생형 대조군 마우스와 비교했을 때 IL-31 유발 긁기/탈모에 덜 민감했음을 나타낸다. 야생형 마우스는 100%(10/10)에서 IL-31 처리하고 6일까지 긁기 및 탈모의 증거가 발생했지만, Tac1 결핍 마우스는 동일한 시점에서 단지 33.3%(2/6)만이 긁기 및 탈모의 징후를 나타냈다. 이들 데이터는 IL-31-처리된 마우스에서 IL-31이 긁기/탈모 표현형에 기여하는 신경세포 성분을 유발한다는 것과, IL-31의 중화가 피부염과 관련된 긁기의 발생률 및 강도를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

방법 III(IL-31 중화 항체의 투여)

약 8 내지 12주 된 정상 암컷 BALB/c 마우스(CRL)에 1ug/일씩 mIL-31을 송달하는 14-일 삼투펌프(Alzet, #2002)를 피하 이식했다. 마우스 그룹은 래트 항-마우스 IL-31 단클론성 항체 10mg/kg(200ug/마우스)의 복강내(i.p.) 주사를 IL-31 송달 1주 전부터 시작하여 주 2회 받았다. 대조군 마우스는 동일한 투약일정으로 부형제(PBS/0.1% BSA)의 i.p. 주사를 받았다. 다음의 기준을 사용하여 탈모증 및 소양증에 대해 마우스를 매일 점수 매겼다: 0 = 긁기 없음, 동물은 정상을 나타냄, 1 = 적은 영역에서 외피가 얇아짐, 긁기 주지됨, 2 = 경증의 탈모(작은 반), 긁기, 3 = 중간 정도의 탈모, 긁기, 4 = 중증의 탈모, 과도한 긁기.

모든 실험에서, 래트 항-mIL-31 mAb로 치료된 마우스는 약 5일 내지 7일 정도 증상의 개시가 지연되었고, 탈모증과 소양증에 대한 전체적인 점수가 낮아졌다. mAb로 치료된 마우스의 모든 그룹은 (투약 빈도 또는 농도와 관계없이) 연구 13일까지 대조군 마우스와 유사한 탈모증 및 소양증이 발생하였다. 이들 데이터는 IL-31의 중화가 IL-31에 의해 유발된 긁기/탈모 반응의 개시를 지연시킬 수 있음을 시사한다.

실시예 13

마우스-항-인간 IL-31 단클론성 항체의 특성화

(재조합) 인간 인터류킨 31(IL-31)에 특이적인 단클론성 항체(mAb)를 생산하는 21개의 클론 하이브리도마의 패널을 분리했다. 강한 중화 mAb를 생산하는 10개의 하이브리도마를 분리했다. 이것들을 경합 결합 연구에 기초하여 2개의 서브-빈에 배정했다. 약한 중화 mAb를 생산하는 11개의 하이브리도마를 분리했다. 이것들을 경합 결합 연구에 기초하여 4개의 추가 빈에 배정했다. 1개의 mAb는 웨스턴 블롯팅에서 잘 작동했으며, 이것은 또한 면역조직화학법에서도 잘 작동했다. 경합 길항제로서 사용하기 적합한 3개의 mAb를 확인하였다. 샌드위치 면역분석에서 사용하기 적합한 단클론성 항체들을 또한 확인하였다.

A. Biacore에 의한 에피토프 비닝

재료: 캡처 항체는 염소-항-마우스 IgG-Fcγ 특이적 항체(Jackson #115-005-071); 차단 항체는 다클론성 IgG Fc 단편(Jackson Labs.); 항원: CEE 친화성 택을 갖는 BHK에서 생산된 rIL31; Biacore 1000; Biacore CM5 NHS-활성화 칩(Biacore, PN BR-1000-14).

방법: Biacore 1000™ 시스템에서 연구를 수행하였다. BIAlogue v.1.2를 프로그래밍 런 방법에 사용하였다. 염소-항-마우스 Fc 항체를 Biacore CM5 칩에 리신 잔기에 의해 공유적으로 고정시켜 이 연구를 위한 활성 결합 표면을 형성했다. 21개의 마우스 항-huIL31 mAb 클론 조건배지 상청액을 각각 염소-항-마우스 Fc 표면 위에 먼저 주사함으로써 시험될 1차 mAb를 우호적인 방향으로 항-마우스 항체 표면에 결합시킬 수 있었다. 다음에, 남은 결합 부위를 부적합한 다클론성 IgG Fc 단편을 주사하여 차단시켰다. 다음에, 항원(rIL-31)을 주사하여 1차 항체 표면을 캡처하였다. 이어서, 21개 마우스 항-huIL-31 mAb 클론 조건배지 상청액 중 하나를 다시 또 주사하여 2차 항체의 결합을 시험하였다. 1차 mAb와 2차 mAb가 항원의 같은 결합 부위에서 경합했다면 2차 mAb는 결합하지 않았다. 두 mAb가 항원의 같은 결합 부위에서 경합하지 않았다면 2차 mAb는 결합하였다.

각 상청액을 mAb의 전체 세트와 조합하여 1차 mAb로서 시험하였다. 대조 사이클을 수행하여 1차 mAb 또는 항원의 부재하에는 2차 mAb의 반응이 결핍됨을 증명하였다. 자신에 대해 시험된 각 mAb를 음성 대조군으로 사용하여 바탕신호 수준을 확립하였다. 데이터를 BioEvaluation 3.2 RCI 소프트웨어를 사용하여 컴파일링한 다음, 엑셀™로 로딩하여 데이터를 가공했다. 단클론성 항체 쌍을 시험하는 각 사이클 사이에는 염소-항-마우스 Fc 표면을 50mM HCl로 2x30초 세척하여 재생시켰다.

강한 중화 mAb(10개)와 약한 중화 mAb(11개)를 두 개의 분리된 패널에서 연구하였는데, 단 약한 중화 mAb를 연구할 때, 하이브리도마 292.64.6로부터의 mAb는 강한 중화 mAb의 표본으로서 포함시켰다. 추가하여, 최초의 2개 비닝 패널에 대한 에피토프 빈과 관련하여 상대적 친화성 측정값과 중화 데이터를 검토한 후, 비닝의 세 번째 패널은 강한 중화 mAb와 약한 중화 mAb를 모두 포함하는 8개의 "선별된" mAb에 대해 수행하였다.

결과: 단클론성 항체 쌍을 시험한 세 패널을 강한 중화 mAb와 약한 중화 mAb 모두의 분석에 대해 완료하였다. 첫 번째 패널은 서로에 대해 모든 강한 중화 mAb를 시험하였고, 두 번째 패널은 서로에 대해 약한 중화 mAb 모두(그리고 하이브리도마 292.64.6으로부터의 대표적인 강한 중화 mAb)를 시험하였다. 세 번째 패널은 더 이상의 평가를 위해 선별된 강한 중화 mAb와 약한 중화 mAb 모두의 서브셋의 쌍을 명백히 평가하여 완료하였다.

상이한 mAb 쌍들에 대해 측정된 절대반응(RU)의 변화에 더하여, mAb 쌍들 중 몇몇은 이 쌍들의 방향이 바뀌었을 때 상이하게 행동했다(즉, 쌍 중 한 mAb가 1차 대 2차 mAb로서 사용됨). 이러한 행동은 빈번히 관찰되며, 일반적으로 중첩 에피토프를 갖는다고 생각되는 mAb 때문이다.

최초 2개의 완료된 패널의 분석에서 총 4개의 구별되는 빈을 얻었다. 첫 번째 패널에서, 강한 중화 항체는 모두 함께 그룹을 이루어 단일 빈을 한정하였다(빈 1: 292,12.3, 292.39.5, 292.51.5, 292.63.5, 292.64.6, 292.72.3, 292.84.1, 292. 105.4, 292.109.4, 292.118.6). 두 번째 패널에서, 약한 중화 항체들은 3개의 추가적인 주요 빈으로 그룹 지어졌으며(빈 2: 294.35.2, 294.146.5, 292.152.4, 292.152.4, 294.154.5; 빈 3: 294.35.3, 291.78.4, 294.158.5, 294.155.6, 294.16 3.2; 빈 4: 294.144.3), 이것들은 빈 #1(292.64.6)의 표본과는 구별되었다. 추가하여, 패널 2에서 평가된 mAb 쌍들 중 대부분은 mAb가 시험된 방향에 따라 반응의 분명한 비대칭을 나타냈는데, 이것은 결합 부위의 어떤 중첩을 시사한다. 빈 3으로부터의 두 mAb, 294.35.3와 291.78.4는 2차 mAb로서 시험되었을 때 빈 2의 mAb들과 경합한다는 증거를 나타내었다. 또한, 패널 2에서 강한 중화 항체 292.64.6(빈 1)은 1차 항체로서 시험되었을 때 빈 3의 mAb와 경합하는 것으로 나타났다.

초기 2개 비닝 패널의 완료 후에, 가장 강한 중화 mAb와 친화성이 가장 높은 약한 중화 mAb의 그룹을 더 이상의 평가를 위해 선별하고, 패널 3에서 서로에 대해 시험하였다. 세 번째 패널의 결과는 이전의 작업과 전체적으로 일치했으며, 이것은 강한 중화 항체들은 함께 빈에 속하며, 약한 중화 항체들은 확립된 다수의 빈으로 분리되었음을 나타낸다. 추가하여, 세 번째 패널은 빈 2로부터의 두 mAb(294. 35.2 및 292.154.4)의 비닝에서 부분적인 중첩이 있음을 나타냈으며, mAb(292.12. 3, 292.72.3, 292.84)의 서브셋은 빈 1에 배정된다. 이것은 빈 1 안에서 서브-빈 IA 및 IB의 배정을 가져왔다. 패널 3에서, 하이브리도마 292.163.2(빈 3)과 하이브리도마 292.144.3(빈 4)로부터의 mAb들은 단독으로 빈에 속하였다.

B. 마이크로타이터-플레이트(표지가 없는 경합 ELISA) 에피토프 비닝

재료: 캡처 항체는 염소-항-마우스 IgG(Fcγ 특이적) Jackson #115-005-071; 차단 항체는 마우스 IgG1(ZymoGenetics); 하이브리도마로부터의 조건배지 상청액을 이 연구에 사용함; 항원은 술포-NHS-바이오틴 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 바오틴화된 CEE 친화성 택을 가진 BHK에서 생산된 rIL-31; Nunc Maxisorp 96-웰 플레이트(Nalge Nunc, Rochester, NY); ELISA B(PBS, 0.1% Tween 20, 1% BSA); 스트렙토아비딘-HRP(Pierce, Rockford, IL); TMB 기질(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)

방법: 이 방법은 Nagata et al (2004)에 의해 설명된 표지 없는 경합 ELISA (LFC-ELISA)와 유사하다. 에피토프 비닝을 위한 이 방법은 바이오틴화된 rIL-31을 이용했다. 마이크로타이터 플레이트를 ELISA B(PBS, 0.1% Tween 20, 1% BSA)에 희석된 염소 항-마우스 IgG Fc-γ 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch #115-005-071)로 1㎍/mL로 100㎕/웰로 코팅했다. 주위 온도에서 3시간 동인 이 코팅 항체를 결합시킨 후, 각 mAb-함유 조건배지를 ELISA B로 희석하여 약 0.5㎍/mL의 mAb 농도를 얻었고, 4℃에서 하룻밤 염소-항-마우스 IgG 코팅된 플레이트에 결합하도록 방치했다(mAb#l). 병행하여, 두 번째 세트의 조건배지(mAb#2)를 폴리스티렌 시험관에서 ELISA B 중에 0.5㎍/mL mAb로 희석한 다음, 바이오틴화 rIL-31 항원 50ng/mL와 혼합하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. mAb#1을 코팅 항체와 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 관련 없는 항체로 차단하여 플레이트 상의 미점유 부위를 포화시켰다. mAb#2-바이오틴-rIL31 혼합물을 플레이트에 첨가하고 결합하도록 두었다. 이 분석에서 (비-경합) 대조군으로서, 50ng/mL의 바이오틴화 rIL-31을 고정된 mAb#1을 함유하는 웰에 (mAb#2와 함께 예비 인큐베이션하는 것 없이) 직접 첨가하였다. 바이오틴화-IL-31-mAb#2 복합체와 함께 인큐베이션한 후, 스트렙토아비딘-HRP(Pierce, Rockford, IL)을 0.5㎍/mL로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 TMB 기질(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)로 전개시키고, 450nm에서 각 웰의 흡광도를 플레이트 리더(Molecular Devices SpectraMax340, Sunnyvale, CA)를 사용하여 측정하였다. mAb#1이 mAb#2와 다른 에피토프를 인식했다면, 바이오틴-rIL-31-mAb#2 복합체는 플레이트에 결합하였고, 그 결과 높은 흡광도가 읽혔다. mAb#1이 mAb#2와 같은 에피토프를 인식했다면, 바이오틴-rIL-31-mAb#2 복합체는 플레이트에 결합하지 않았고, 그 결과 낮은 흡광도가 읽혔다.

결과: 21개 mAb의 전체 패널을 일련의 6개의 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 동시에 그들 자신에 대해 시험하였다. 450nm에서의 흡광도(A450nm)를 각 조합 및 방향에 대해 기록하고 컴파일링하였다. 모든 경우 자기-자기 조합에서는 낮은 흡광도 값이 얻어졌다. 자기-자기 대조군에 더하여, 50ng/mL rIL-31-바이오틴 (mAb#2와의 경합 없이)의 양성 대조군을 모든 플레이트에서 각 1차 mAb를 사용하여 시험하였다. 각 1차 mAb에 대해 두 양성 대조군 샘플을 얻었으며, 두 샘플의 값은 유사했다. 11개의 약한 중화 mAb 중 9개(빈 2, 3, 또는 4로부터)에 대한 양성 대조군 웰(mAb#2 없는)로부터 얻어진 흡광도 값은 나머지 mAb들에 대한 대조군 샘플에서 측정된 흡광도 값보다 적었다. 아마도 이것은 이들 mAb의 낮은 친화성(높은 EC50)에 기인했던 것 같다. 이 결과의 해석을 용이하게 하기 위해, 열을 가로지른 mAb의 어떤 조합(캡처 mAb(mAb#1)이 일정하게 고정됨)에 대해 측정된 최대 흡광도를 100%의 값으로 지정되도록 흡광도 값을 정규화했다. 정규화된 값은 두 구별되는 그룹에 들어갔다: 큰 클러스터의 값은 경합과 일치한 32%의 값 이하에 들어갔으며, 두 번째 큰 클러스터의 값은 경합 결핍과 일치한 32% 이상에 들어갔다. 32% 역치값을 사용하여 mAb의 각 조합 및 방향을 두 구별되는 카테고리(비경합, 및 경합) 중 하나에 배정했다. 분류된 데이터를 사용하여, 계급식 클러스터링 알고리즘에 기초하여 자동적으로 비닝을 수행하였다. Biacore를 이용한 비닝 실험 동안 관찰되었던 것과 마찬가지로, 어떤 mAb 쌍은 mAb가 1차 mAb로서 사용되었는지에 따라 다르게 분류되었다. 두 방향에서의 경합에 필요한 높은 수준의 엄격성을 사용하여 mAb들을 1차 빈에 배정했다. 이어서, 한 방향만의 경합에 필요한 좀 덜 엄격한 기준을 사용하여 행동의 사소한 차이에 기초. mAb들을 서브-빈에 배정하는 것을 도왔다. 정규화된 데이터를 높은 엄격성 기준에 기초, 5개의 1차 빈 배정에 따라 그룹으로 나누었다. 추가하여, mAb를 서브-빈에 배정하는 상호작용을 가시화하는 것을 돕기 위해 mAb의 조합 및 방향을 색으로 암호화하였다(흰색은 경합, 검은색은 비경합).

경합 ELISA에 의한 비닝의 결과는 Biacore를 사용한 연구 결과에 기초한 빈 배정과 일치한다. 엄격한 비닝 기준을 사용하여 다음의 빈들을 한정하였다:

빈 #1 (강한 중화 mAb를 모두 함유): 292.72.3, 292.64.6, 292.63.5, 292. 51.5, 292.39.5, 292.12.3. 292.118.6, 292.109.4, 292.105.4, 292.84.1

빈 #2: 294.35.2, 294.154.5, 294.146.5, 292.154.4, 292.152.4

빈 #3: 294.35.3, 294.163.2, 294.158.5, 294.155.6

빈 #4: 294.144.3

빈 #5: 291.78.4

빈 #1을 주목하면, 빈 #1의 하이브리도마 중 3개(292.72.3, 292.12.3, 292. 84.1)로부터의 mAb가 2차 mAb(mAb#2)로서 사용되었을 때 빈 #2로부터의 mAb 중 3개와 경합하는 것으로 나타났다. 이 행동에 기초하여, 빈 1을 2개의 서브-빈으로 나누었다: #1A 및 #1B, 여기서 빈 #1B이 비닝에서 빈 2의 mAb와 경합하는 mAb를 함유한다. 빈 #1A는 292.64.6, 292.63.5, 292.51.5, 292.39.5, 292.118.6, 292.109.4, 292.105.4를 함유한다. 빈 #1B는 292.72.3, 292.12.3, 및 292.84.1을 함유한다.

빈 #2에 주목하면, 세 가지 구별되는 상호작용이 분명하며, 이것을 사용하여 빈 #2를 3개 서브-빈으로 나누었다. 빈 #2는 하이브리도마 294.146.5로부터의 mAb를 함유하는데, 이것은 빈 #1과 #2 모두로부터의 모든 mAb와 경합한다. 빈 #2B는 하이브리도마 294.35.2 및 294.154.5로부터의 mAb를 함유하는데, 이것은 빈 #1로부터의 (2차) mAb들과 경합한다. 빈 #2C는 하이브리도마 292.154.4 및 292.152.4로부터의 mAb를 함유하며, 이것은 2차 mAb로 사용되었을 때 빈 #4로부터의 mAb와 경합한다.

빈 #3, #4, 및 #5에 주목하면, 빈 #3의 mAb들(하이브리도마 294.35.3, 294. 163.2.1, 및 294.155.6로부터)은 이들이 2차 mAb로서 사용되었을 때 빈 #4와 #5로부터의 mAb들과 경합한다. 빈 #4(하이브리도마 294.144.3.5로부터)와 #5로부터의 mAb는 주로 그것들의 mAb와의 상호작용에 의해 서브-빈 #2C로 구분된다(그리고 하이브리도마 294.144.3로부터의 mAb의 웨스턴 블롯 상에서의 독특한 비닝 특성).

21개 mAb의 모든 패널을 LFC-ELISA 형식을 이용하여 동시에 시험했을 때, 빈 1과 서브-빈 #1A 및 #1B는 분명히 확인되었다. 또한, mAb의 경합 패널이 동시에 시험되었을 때 빈 #2와 #3의 부분적 중첩이 확인되었으며, 빈 #2는 3개의 서브-빈으로 나누어졌다. Biacore 데이터에 기초한 빈 배정과의 한 사소한 편차는 하이브리도마 291.78.4와 294.144.3으로부터의 mAb가 LFC-ELISA 데이터에 엄격한 기준이 적용되었을 때 2개의 구별되는 빈에 배정되었다는 점이다. Biacore 연구에 기초하여, 하이브리도마 291.78.4로부터의 mAb는 빈 #3에 배정되었다.

C. 플레이트 기반 친화성 측정

재료: 캡처 다클론성 항체는 염소-항-마우스 IgG(Fcν 특이적)(Jackson Imm-unoResearch West Grove, Pennsylvania #115-005-071); 차단 다클론성 항체는 마우스 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, #209-005-082); 하이브리도마로부터의 조건배지 상청액을 이 연구에 사용함; 항원은 술포-NHS-바이오틴 키트(Pierce, Rock-ford, IL)를 사용하여 바이오틴화된 CEE 친화성 택을 가진 BHK에서 생산된 rIL-31; Nunc Maxisorp 96-웰 플레이트(Nalge Nunc, Rochester, NY); ELISA B(PBS, 0.1% Tween 20, 1% BSA); 스트렙토아비딘-HRP(Pierce, Rockford, IL) ; TMB 기질(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD).

방법: 이 방법은 van Heyningen(1986)에 의해 설명된 방법과 유사하다. 마이크로타이터 플레이트를 ELISA B(PBS, 0.1% Tween 20, 1% BSA)에 희석된 염소 항-마우스 IgG Fc-ν 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch #115-005-071) 1㎍/mL를 사용하여 100㎕/웰씩 코팅했다. 주위 온도에서 3시간 이 코팅 항체를 결합시킨 후, 각 정제된 단클론성 항체 상청액을 ELISA B에 희석하여 약 1㎍/mL의 mAb 농도를 만들고, 주위 온도에서 1시간 동안 플레이트에 결합하도록 두었다. 바이오틴화 rIL-31 항원의 연속 희석물을 ELISA B 중에 500ng/mL에서 0ng/mL까지 제조하고 웰에 첨가했다. 바이오틴화 항원과 함께 인큐베이션한 후에, 0.5㎍/mL의 스트렙토아비딘-HRP(Pierce, Rockford, IL)를 플레이트에 첨가했다. 플레이트를 TMB 기질(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)로 전개시키고, 450nm에서 각 웰의 흡광도를 플레이트 리더(Molecular Devices SpectraMax340, Sunnyvale, CA)에서 측정했다. 두 지점을 평균하고, 데이터를 4-파라미터 핏을 사용하여 분석했다. 4-파라미터 핏의 "C" 값이 겉보기 EC50(ng/mL)으로서 기록되는데, 이것이 분석에서 반-최대 반응을 생산하는 바이오틴-rIL-31 농도이다.

결과: 4-파라미터 핏을 21개 mAb 모두의 실험곡선으로부터 얻었다. 이 분석에서 반-최대 반응을 생산한 바이오틴-rIL-31의 농도(EC50)는 3.3에서 236 ng/mL의 범위였고, 10개의 강한 중화 mAb는 모두 비슷한 낮은 EC50을 나타내었다(3.3-4.4ng /mL).

D. 웨스턴 블롯팅

재료: 항원은 CEE 친화성 택을 가진 BHK에서 생산된 rIL-31; 4-12% NuPAGE 비스-트리스 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA); 비-환원 샘플 버퍼(Invitrogen, Carl-sbad, CA); 분자량 표준물질 SeeBlue(Invitrogen); 1x MES 작업 버퍼(Invitrogen); 웨스턴 A 버퍼(50mM 트리스 pH 7.4, 5mM EDTA, 150mM NaCl, 0.05% Igepal, 0.25% 젤라틴); 0.2㎛ 니트로셀룰로스 막(Invitrogen); 양 항-마우스 IgG-HRP(Amersham, Piscataway, NJ); rIL-31에 특이적인 친화성 정제된 토끼 pAb(ZymoGenetics); 당나귀 항-토끼 Ig-HRP(Amersham); Lumi-Light Plus 화학발광 시약(Roche, Mannheim, Germany); Lumi-Imager(Mannheim-Boehringer)

방법: 웨스턴 블롯 상에서 변성된 및 변성/환원된 rIL-31을 검출하는 mAb의 능력을 이 연구에서 시험하였다. rIL-31 항원을 환원 또는 비-환원 샘플 버퍼와 혼합하고 10분간 70℃에서 가열한 다음, 4-12% NuPAGE 비스-트리스 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에 100ng/레인으로 로딩하였다. 분자량 표준물질은 SeeBlue(Inv-itrogen)였고, 전기영동은 1X MES 작업 버퍼(Invitrogen)에서 수행하였다. 겔 내의 단백질 밴드를 0.2㎛ 니트로셀룰로스 막(Invitrogen)으로 옮기고, 웨스턴 A 버퍼(50mM 트리스 pH 7.4, 5mM EDTA, 150mM NaCl, 0.05% Igepal, 0.25% 젤라틴) 중의 2.5% 무지방 건조유 중에서 하룻밤 차단시켰다. 니트로셀룰로스 막을 약 0.1㎍/mL mAb 농도의 각 단클론성 항체로 프로빙하였다. 다음에, 블롯을 양고추냉이 퍼옥시다제(양 항-마우스 IgG-HRP; Amersham, Piscataway, NJ)에 콘쥬게이트된 2차 항체로 프로빙하였다. 양성 대조군으로서 별개의 웨스턴 블롯을 rIL-31에 특이적인 토끼 다클론성 항체(ZymoGenetics) 0.1㎍/mL과, 양고추냉이 퍼옥시다제(당나귀 항-토끼 Ig-HRP; Amersham)에 콘쥬게이트된 2차 항체로 프로빙하였다. 웨스턴 블롯 상의 밴드를 Lumi-Light Plus 시약(Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 검출하였으며, 화학발광이 Lumi-Imager(Mannheim-Boehringer) 상에 기록되었다.

결과: 항 IL-31 mAb의 웨스턴 블롯 분석은 21개 하이브리도마 중 단지 3개로부터의 mAb들만이 변성된 rIL-31 항원을 검출했음을 나타내었다. 가장 강한 신호는 하이브리도마 294.144.3에 의해 생산된 mAb로부터 얻어졌다. 이 mAb는 또한 비-환원/변성 rIL-31보다 환원/변성 rIL-31을 더욱 강하게 검출하였다. 이 mAb에서 관찰된 신호 강도는 다클론성 항체 대조군에서 얻어진 것과 유사했다. 하이브리도마 294.144.3로부터의 mAb는 평가된 나머지 mAb와는 분리된 빈에 속한다. 다른 두 하이브리도마(292.84.1 및 292.64.6)로부터의 단클론성 항체는 비-환원/변성 rIL-31을 매우 약하게 검출했지만, 환원/변성 rIL-31은 검출하지 않았다. 이 약한 신호는 스캐닝된 블롯에서는 재현되지 않았다. 이들 두 mAb는 빈 #1로부터의 중화 항체이다.

실시예 14

IL-31 리간드에 대한 래트 항-마우스 단클론성 항체의 상대적 결합 친화성

IL-31 리간드에 대한 4개의 토끼-항-Ms-IL-31-리간드 mAb들의 상대적 결합 친화성을 다음과 같이 측정하였다. 클론 271.26.6.6.1, 클론 271.33.3.2.1, 클론 271.33.1.2.2, 및 클론 271.39.4.6.5을 분석하였다. 염소-항-래트 IgG-Fcν 특이적 항체(Jackson)를 CM5 Biacore 칩 위에 고정하였다. 예비 시험 후, 각 mAb가 항-래트 캡처 표면 위에 결합하도록 분석을 더 최적화한 다음, 결합 및 해리를 볼 수 있도록 mAb를 가로질러 IL-31 리간드를 연속 농도로 주사했다. 각 작업 후, 30mM HCl을 2번 주사하여 고정된 항-래트 항체에 맞춰 표면을 다시 재생시켰다. 각 mAb에 대해 데이터가 발생했으며, 평가 소프트웨어를 사용하여 상대적인 반응속도값을 한정하였다.

mAb-항원 결합 곡선의 평가에 의해 발생된 상대적 반응속도 데이트를 표 4에 나타낸다.

[표 4]

실시예 15

AD 마우스 모델에서 항 IL-31 항체에 반응한 TARC 및 MDC의 환원

방법 I

6주 된 수컷 NC/Nga 마우스(CRL Japan)를 50㎍ 먼지 진드기 추출물(D. pter-onyssinus, Indoor Biotechnologies)로 주 3회 등 위에서 피내 민감화시키고, AD-유사 병소에 대하여 점수를 기록하였다. 민감화 5주 후에 마우스를 안락사시키고, 오른쪽 귀를 절제하여 RPMI + 2% FBS(GIBCO Invitrogen)로 보충된 48-웰 배양접시 (Coming)의 한 개 웰에 두었다. 플레이트를 5% 이산화탄소 습도제어 인큐베이터에 두었다. 24시간 후 상청액을 수거하여 다음 분석 때까지 -20℃에서 냉동시켰다.

방법 II

12주 된 암컷 NC/Nga 마우스(CRL Japan)를 10㎍ SEB(Toxin Technology)로 주 3회 귀와 등 위에서 피내 민감화시켰다. 마우스를 AD-유사 병소에 대하여 점수를 기록하였다. 민감화 5주 후에 마우스를 안락사시키고, 각 마우스의 주사된 귀에서6mm 생검 천공물을 취하여 RPMI + 2% FBS(GIBCO Invitrogen)로 보충된 48-웰 배양접시 (Coming)의 한 개 웰에 두었다. 플레이트를 5% 이산화탄소 습도제어 인큐베이터에 두었다. 24시간 후 상청액을 수거하여 다음 분석 때까지 -20℃에서 냉동시켰다.

두 연구에서 마우스의 그룹은 10mg/kg의 래트 항-마우스 IL-31 단클론성 항체 또는 부형제 중 하나로 처리되었으며, 민감화 1 내지 2주 후에 시작하여 매주 2번씩 복강내 주사하였다.

24시간 상청액 샘플 중 TARC 및 MDC 농도를 종래의 ELISA(R&D Systems)에 의해 측정하였다.

두 연구에서 TARC 및 MDC 농도는 대조군 마우스와 비교하여 항-IL-31 처리된 마우스로부터의 귀 상청액에서 더 낮았지만, 이들 결과를 ANOVA로 분석했을 때 통계적 유의성이 없었는데, 이것은 아마도 샘플 크기가 작았기 때문인 것 같다. 두 실험으로부터의 데이터를 합해서 분석한 경우에는 처리된 그룹들 간에 통계적으로 유의한 차이가 있다.

실시예 16

IL-31 중화 항체의 투여

약 8 내지 12주 된 정상 암컷 BALB/c 마우스(CRL)에 mIL-31을 1ug/mL씩 송달하는 14일 삼투펌프(Alzet, #2002)를 피하 이식했다. 마우스의 그룹은 IL-31를 송달하기 1주 전에 시작하여 주 2회 래트 항-마우스 IL-31 단클론성 항체 10mg/kg (200ug/마우스)의 복강내(i.p.) 주사를 받았다. 대조군 마우스는 동일한 투약일정으로 부형제(PBS/0.1% BSA)의 i.p. 주사를 받았다. 다음 기준을 사용하여 탈모증과 소양증에 대해 마우스를 매일 기록하였다: 0 = 긁기 없음, 동물은 정상을 나타냄, 1 = 적은 영역에서 외피가 얇아짐, 긁기 주지됨, 2 = 경증의 탈모(작은 반), 긁기, 3 = 중간 정도의 탈모, 긁기, 4 = 중증의 탈모, 과도한 긁기.

모든 실험에서, 래트 항-mIL-31 mAb로 치료된 마우스는 약 5일 내지 7일 정도 증상의 개시가 지연되었고, 탈모증과 소양증에 대한 전체적인 점수가 낮아졌다. mAb로 치료된 마우스의 모든 그룹은 (투약 빈도 또는 농도와 관계없이) 연구 13일까지 대조군 마우스와 유사한 탈모증 및 소양증이 발생하였다. 이들 데이터는 IL-31의 중화가 IL-31에 의해 유발된 긁기/탈모 반응의 개시를 지연시킬 수 있음을 시사한다.

전술한 것으로부터, 본 발명의 특정 구체예들이 예시의 목적으로 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 만들어질 수 있음이 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다.

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SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR REGULATING NK CELL ACTIVITY <130> 6803.204-WO <140> PCT/DK2004/000470 <141> 2004-07-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Arg 130 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213> mus musculus <400> 9 Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Thr Pro Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala 65 70 75 80 Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Val Asn Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Asn Pro Arg Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 10 Gly Phe Ser Phe Thr Pro Tyr Gly Val His 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> mus musculus <400> 11 Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> mus musculus <400> 12 Asn Pro Arg Pro Gly Asn Tyr Pro Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (4)

1. ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6815의 하이브리도마에 의해 생산되는 단클론성 항체로부터 유래된 인간화된 단클론성 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단클론성 항체는 인간 면역글로불린 불변 도메인을 가지는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리뉴클레오티드.
2. 하기의 작동 가능하게 연결된 요소를 포함하는 발현 벡터:
   전사 프로모터;
   제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 세그먼트; 및
   전사 종결자.
3. 제 2 항의 발현 벡터를 포함하는 배양된 세포로서, 상기 세포는 DNA 세그먼트에 의해 암호화된 단클론성 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는, 배양된 세포.
4. 제 3 항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
   발현된 단클론성 항체를 회수하는 단계;
   를 포함하는, 단클론성 항체를 생산하는 방법.