JP2008541704A - Ｉｌ−３１モノクローナル抗体とその使用法 - Google Patents

Ｉｌ−３１モノクローナル抗体とその使用法 Download PDF

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Abstract

本発明は、特に限定されないが、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、薬物誘導性遅延型皮膚アレルギー反応、毒性表皮壊死、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、白斑、酒さ性ざ瘡、結節性痒疹、強皮症、単純ヘルペスウイルス、またはこれらの組合せを含むそう痒性疾患を、ＩＬ−３１モノクローナル抗体を投与することにより治療する方法に関する。本発明はさらに、当該モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを提供する。

Description

免疫系にはリンパ球を含む広範囲の特異的細胞型が存在する。リンパ球は宿主の免疫反応の特異性を決定し、Ｂリンパ球（抗体産生細胞の前駆体である）とＴリンパ球（特異的免疫応答の出現のような特定の制御機能に必要である）の２つのクラスを含む。
成熟Ｔ細胞は抗原または他の刺激により活性化されて、例えばサイトカイン、生化学的シグナル伝達分子、または受容体（これはさらにＴ細胞集団の運命に影響を与える）を産生し得る。
Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体や他の補助分子を含む細胞表面上の受容体を介して活性化されて、サイトカインの産生のような補助細胞機能を果たすことができる。
単球／マクロファージおよびＴ細胞はその細胞表面上の受容体により活性化することができ、リンパ球に抗原を提示することにより免疫応答において中心的役割を果たし、また無数のサイトカインを分泌することによりリンパ球に対する補助細胞として作用する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞はＴ細胞やＢ細胞と共通の前駆細胞を有し、免疫監視において役割を果たす。血液リンパ球の最大１５％を占めるＮＫ細胞は抗原受容体を発現せず、従って標的細胞への結合の要件としてＭＨＣ認識を使用しない。ＮＫ細胞は、ある腫瘍細胞やウイルスに感染した細胞の認識と死滅に関与している。インビボではＮＫ細胞は活性化が必要であると考えられているが、インビトロではＮＫ細胞は、活性化無しでいくつかの型の腫瘍細胞を死滅させることが証明されている。
インターロイキンは、炎症を含む免疫学的応答を仲介するサイトカイン群である。インターロイキンは種々の炎症性病理を介在する。免疫応答に中心的なのはＴ細胞であり、これは多くのサイトカインや、抗原に対する適応免疫を生成する。Ｔ細胞により産生されるサイトカインは、１型と２型として分類されている（Ｋｅｌｓｏ，Ａ．Ｉｍｍｕｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７６：３００−３１７，１９９８）。１型サイトカインには、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＬＴ−αがあり、炎症応答、ウイルス免疫、細胞内寄生体免疫、および同種移植片拒絶に関与している。２型サイトカインには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３があり、体液性応答、蠕虫免疫、およびアレルギー応答に関与している。１型と２型に共通のサイトカインには、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αがある。Ｔ細胞集団を産生する１型および２型が異なる型の炎症性組織に選択的に遊走することを示唆する、いくつかの証拠がある。
皮膚は免疫系において重要な役割を果たし、層からなる。表皮は表面の層である。表皮の下には、結合組織の１つの層である真皮がある。真皮の下には下皮があり、これは大量の脂肪組織の層である。循環しているＴリンパ球は、正常な条件および炎症性条件下で皮膚に遊走する。皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）は、皮膚に対する向性を有するＴ細胞のホーミング受容体であると考えられている。Ｓａｎｔａｍａｒｉａ−Ｂａｂｉ，Ｌ．，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４：１３−１８，２００４。
いくつかの皮膚疾患が高レベルのＣＬＡ＋Ｔ細胞を発現することが知られており、例えばアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘導性アレルギー反応、皮膚向性ウイルスおよびウイルス関連そう痒症、白斑、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ性ざ瘡、尋常性ざ瘡、結節性痒疹、および水疱性類天疱瘡がある。このような皮膚Ｔ細胞介在疾患を治療すす必要性が存在する。
サイトカインファミリーの証明されたインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、およびサイトカインアンタゴニストの大きな臨床的可能性およびこれらの必要性を示す。ＩＬ−３１は新しく同定されたサイトカインである。ＩＬ−３１はマウスで過剰発現されると、皮膚炎様症状を引き起こす。皮膚ホーミングＴ細胞と表皮ケラチン細胞の両方とも、ヒトの皮膚疾患の病理に関与するとされている。本発明は、炎症促進性サイトカインであるＩＬ−３１に対するアンタゴニストを提供することにより、これらの必要性に取り組む。ＩＬ−３１の活性を阻止、阻害、緩和、拮抗または中和し得る本発明のこのようなアンタゴニストには、可溶性ＩＬ−３１ＲＡ受容体と中和性抗ＩＬ−３１抗体がある。本発明はさらに、炎症性疾患におけるこれらの使用、ならびに関連組成物と方法を提供する。
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、以下の用語を説明することが本発明の理解の助けになるであろう。
本明細書において用いる場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製したポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）2及びＦａｂタンパク質分解性フラグメントを含む。遺伝子操作された完全な抗体またはフラグメント、例えばキメラ抗体、Ｆｖフラグメント、１本鎖抗体など、ならびに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドも含まれる。非ヒト抗体は、ヒトフレームワークおよび定常領域に非ヒトＣＤＲを移植するか、または全非ヒト可変ドメインを取り込むことによりヒト化することができる（場合により、露出された残基の置換によりヒト様表面でこれらを「おおい隠し（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」、その結果は「ベニヤ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体である）。ある例ではヒト化抗体は、ヒト可変領域フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強する。ヒト化抗体により、生物学的半減期が延長され、ヒトへの投与時の有害免疫応答の可能性が小さくなり得る。
用語「キメラ抗体」又は「キメラ抗体群」は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作により、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域および定常領域遺伝子から構築されている抗体を示す。例えばマウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変セグメントをヒト定常セグメント（例えばガンマ１とガンマ３）に結合してもよい。すなわち典型的な治療用キメラ抗体は、マウス抗体からの可変ドメインまたは抗原結合ドメインとヒト抗体からの定常ドメインとを具備するハイブリッドタンパク質であるが、他の哺乳動物種も用いることができる。
本明細書において用いる場合、用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされた１つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を示す。免疫グロブリンの１つの型は抗体の基本的な構造単位を構成する。この型はテトラマーであり、各対が１つの軽鎖と１つの重鎖とを有する２つの同一の対の免疫グロブリン鎖からなる。各対において軽鎖と重鎖の可変領域は、共に抗原への結合を引き起こし、定常領域は抗体エフェクター機能を果たす。
完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）とＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によりコードされる。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）と他の上記定常領域遺伝子の１つ（約３３０アミノ酸）によりコードされる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、抗体イソタイプをそれぞれＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥとして規定する。軽鎖と重鎖内で可変領域と定常領域とは、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域により連結され、重鎖はまた約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域を含む（一般的には、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｐａｕｌ，Ｗ編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、１９８９）、第７章を参照（参照することにより全ての目的のためにその全体が組み込まれる）。
免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変領域は、３つの超可変領域が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。すなわち用語「超可変領域」は、抗原結合を引き起こす抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）［Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）］、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）（これらの両方とも参照することにより本明細書に組み込まれる））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。すなわち「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、通常９０〜９５％またはそれ以上）のフレームワーク領域である。構成軽鎖と重鎖が一緒になったフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置させ整列させるように作用する。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を引き起こす。
従って用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（通常マウスまたはラット）免疫グロブリンからの１つまたはそれ以上のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを示す。ＣＤＲを与える非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを与えるヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合はこれらはヒト免疫グロブリン定常領域と、実質的にすなわち少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％、またはそれ以上同一でなければならない。すなわちヒト化免疫グロブリンのすべての部分（おそらくＣＤＲ以外）は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖とヒト化重鎖免疫グロブリンとを含む抗体である。例えばキメラ抗体の全可変領域は非ヒトであるため、ヒト化抗体は上記で定義したような典型的なキメラ抗体は含まないであろう。
用語「遺伝的改変抗体」は、アミノ酸配列が天然の抗体の配列から変化している抗体を示す。抗体の生成における組換えＤＮＡ技術の適切性のため、天然の抗体に存在するアミノ酸の配列に制限される必要は無く、所望の特性を得るために抗体を再設計することができる。可能な変化は多くあり、例えば１つまたは数個のアミノ酸の変化から、可変領域または定常領域の完全な再設計まである。定常領域の変化は一般に、特性を改良または改変するために行われ、例えば補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能がある。可変領域の変化は、抗原結合特性を改良するために行われる。
抗体以外に、免疫グロブリンは種々の他の型［例えば１本鎖またはＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）2、ならびにダイアボディ、線状抗体、多価または多特異性ハイブリッド抗体（上記、および詳細には、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７，１０５（１９８７））］、および１本鎖［例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）、これは参照することにより本明細書に組み込まれる］で存在してもよい［一般的には、Ｈｏｏｄら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｂｅｎｊａｍｉｎ，ニューヨーク州、第２版（１９８４）、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒとＨｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ ３２３，１５−１６（１９８６）を参照のこと、これは参照することにより本明細書に組み込まれる］。
本明細書中で用いる場合、用語「１本鎖Ｆｖ」、「１本鎖抗体」、「Ｆｖ」、または「ｓｃＦｖ」は、重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含み、定常領域が欠如しているが単一のポリペプチド鎖内にある抗体フラグメントを示す。一般に１本鎖抗体は、ＶＨとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これは抗体結合を可能にする所望の構造を取ることを可能にする。１本鎖抗体はＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編、スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４）に詳細に記載され、また国際特許出願公報ＷＯ８８／０１６４９号、および米国特許第４，９４６，７７８号と５，２６０，２０３号も参照（これらの開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。具体的な実施態様において１本鎖抗体はまた、二重特異的および／またはヒト化されていてもよい。
「Ｆａｂフラグメント」は、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＣＨ１と可変領域を具備する。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１つの軽鎖と、ＣH1ドメインとＣH2ドメインの間により多くの定常領域を含有する１つの重鎖とを含有し、その結果２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）2分子を生成することができる。
「Ｆ（ａｂ’）2フラグメント」は、２つの軽鎖と、ＣH1ドメインとＣH2ドメインの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖とを含有し、その結果鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間で形成される。
不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量と長さは、近似値であることは理解されるであろう。かかる値が「約」Ｘまたは「ほぼ」Ｘとして表現される時、記載されたＸの値は±１０％まで正確であると理解される。
本明細書で引用されたすべての文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は一部は、ＩＬ−３１に対するアンタゴニストとして抗体を使用して、炎症一般、および皮膚炎やそう痒性疾患の症状を阻害するという発見に基づく。本発明は、本明細書でさらに詳細に説明されるように皮膚炎やそう痒性疾患の作用を阻害、緩和、予防、または最小にするためのモノクローナル抗体の使用を提供する。ある実施態様において皮膚炎はアトピー性皮膚炎である。別の実施態様において皮膚炎は結節性痒疹である。別の実施態様において皮膚炎は湿疹である。ＩＬ−３１は新に発見されたＴ細胞サイトカインであり、これはマウスで過剰発現されると皮膚炎様症状を引き起こす。Ｄｉｌｌｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：７５２−７６０，２００４も参照。皮膚ホーミングＴ細胞と表皮ケラチン細胞の両方とも、ヒトの皮膚疾患の病理に関与している。アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者と正常人の両方での、ＩＬ−３１のｍＲＮＡとタンパク質発現は皮膚ホーミングＣＬＡ＋Ｔ細胞集団に限定されており、一方免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＩＬ−３１の受容体（ＩＬ−３１ＲＡ）の分析は、正常人と比較して急性および慢性ＡＤ患者の皮膚生検試料の皮膚ケラチン細胞でＩＬ−３１ＲＡ発現レベルがわずかに高いことを示唆する。
ＩＬ−３１は、公開された米国特許出願（公開番号２００３０２２４４８７、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｉｎｄｙら、２００３も参照のこと。参照することにより本明細書に組み込まれる）中でＺｃｙｔｏ１７ｒｌｉｇとして既に記載されているサイトカインのＨＵＧＯ名である。Ｄｉｌｌｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（前述）も参照。ＩＬ−３１のヘテロダイマー受容体も２００３０２２４４８７に、オンコスタチンＭ（ＯｎｃｏｓｔａｔｉｎＭ）受容体ベータ（ＯＳＭＲベータ）とヘテロダイマーを形成するｚｃｙｔｏｒ１７（ＨＵＧＯ名、ＩＬ−３１ＲＡ）として記載されている。ＩＬ−３１は、活性化ヒト末梢血細胞（ｈＰＢＣ）から作製されたｃＤＮＡライブラリーから単離され、これはＣＤ３について選択された。ＣＤ３は、リンパ系起源の細胞（特にＴ細胞）にユニークな細胞表面マーカーである。ヒトＩＬ−３１のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列をそれぞれ配列番号１と配列番号２に示す。マウスＩＬ−３１のポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列をそれぞれ配列番号１０と配列番号１１に示す。本明細書中で用いる場合、用語「ＩＬ−３１」は、上記米国特許公開番号２００３０２２４４８７で使用されたＩＬ−３１を意味する。ＩＬ−３１の分泌シグナル配列は、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２３（Ａｌａ）を含んで成り、成熟ポリペプチドはアミノ酸残基２４（Ｓｅｒ）〜１６４（Ｔｈｒ）を含んで成る（配列番号２に示される）。さらに２９３Ｔ細胞からの精製ＩＬ−３１のＮ末端配列解析は、配列番号２に示すように残基２７（Ｌｅｕ）にＮ末端を示し、成熟ポリペプチドはアミノ酸残基２７（Ｌｅｕ）〜１６４（Ｔｈｒ）を含んでなることを示した（配列番号２に示される）。
ＩＬ−３１ＲＡ（ＩＬ−３１受容体）のポリペプチド配列を配列番号５に示し、オンコスタチンＭ（ＯｎｃｏｓｔａｔｉｎＭ）受容体ベータ（ＯＳＭＲベータ）のポリペプチド配列を配列番号７に示す。
ＩＬ−３１ＲＡとＯＳＭＲベータ受容体は、特に限定されないがＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、Ｌｉｆ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦを含むクラスＩサイトカイン受容体サブファミリーに属する（総説については、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５（２）：９５−１０６，１９９３中のＣｏｓｍａｎ、「Ｔｈｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」を参照）。ＩＬ−３１ＲＡサブユニットは、同一出願人によるＰＣＴ特許出願第ＵＳ０１／２０４８４号（ＷＩＰＯ公報第ＷＯ０２／００７２１号）に詳細に記載されている。ＩＬ−３１ＲＡサブユニットのｍＲＮＡの組織分布の分析により、活性化ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット、ＣＤ１４＋単球での発現、およびＣＤ１９＋Ｂ細胞での弱い発現が証明された。さらに休止または活性化単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ第ＴＩＢ−２０２０号）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ第ＣＲＬ−１５９３．２号）およびＨＬ６０（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ−２４０号）の両方に、ｍＲＮＡが存在した。
本明細書に記載のＩＬ−３１アンタゴニストによるシグナル伝達の阻害、中和、阻止は、当業者に公知の多くの方法により測定することができる。例えば増殖低下を測定する測定法には、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（ＡｃｃｕＭｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｌａｋｅ、オハイオ州）、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３，１９８３）；３，（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）５−３−カルボキシメトキシフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム；水酸化２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム；および塩化シアノジトリル−テトラゾリウム（これらはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、ワリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、ペンシルバニア州、から市販されている）のような色素の減少の測定法；有糸分裂誘発測定法、例えば3Ｈ−チミジン取り込みの測定；例えばナフタレンブラックまたはトリパンブルーを使用する色素排除測定法；ジアセチルフルオレセインを使用する色素取り込み；およびクロム放出がある。一般的には、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第３版、ウィレイ−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、１９９４を参照（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。上記以外に、ＩＬ−３１ＲＡと完全長ＯＳＭＲベータを発現するＢａＦ３細胞の例については、公表された米国特許公報第２００３０２２４４８７号（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｉｎｄｙら、２００３）を参照。
一般にサイトカインは４つのアルファヘリックス構造を有すると予測され、ヘリックスＡ、ＣおよびＤがリガンド−受容体相互作用において最も重要であり、このファミリーのメンバー中に高度に保存されている。配列番号２に示したヒトＩＬ−３１のアミノ酸配列、ヒトＩＬ−３１の整列、ヒトＩＬ−３、およびヒトサイトカインアミノ酸配列について、配列番号２に示すように、ＩＬ−３１ヘリックスＡはアミノ酸残基３８〜５２により；ヘリックスＢはアミノ酸残基８３〜９８により；ヘリックスＣはアミノ酸残基１０４〜１１７により；およびヘリックスＤはアミノ酸残基１３７〜１５２により規定されていると予測される。構造解析は、Ａ／Ｂループが長く、Ｂ／Ｃループが短く、Ｃ／Ｄループが長いことを示唆する。このループ構造は、上−上−下−下のヘリックス構造を与える。４−ヘリックス束構造に基づき、保存されているＩＬ−３１内のシステイン残基は、配列番号２のアミノ酸残基７２、１３３、および１４７に；および本明細書に記載の配列番号１１の７４、１３７、および１５１に対応する。一貫したシステインの配置は、４−ヘリックス束構造のさらなる確認となる。また残基４３の配列番号２に示すＧｌｕ残基が、ＩＬ−３１中に高度に保存されている。ＩＬ−３１のこれらのヘリックスは、同種の受容体によるＩＬ−３１シグナル伝達の作用を阻止するための本明細書に記載の抗体による阻害、緩和、または中和の特異的標的となるであろう。
ヒトおよびマウスＩＬ−３１の配列間の比較に基づき、アルファヘリックスＣとＤをコードすると予測される領域に、保存された残基が発見された。本明細書に記載されたヒトＩＬ−３１ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基、および配列をコードする対応するポリヌクレオチドを配列番号１に示す。ＩＬ−３１のこれらのヘリックスは、同種の受容体によるＩＬ−３１シグナル伝達の作用を阻止するための本明細書に記載の抗体による阻害、緩和、または中和の特異的標的となるであろう。
ヘリックスＤはヒトＩＬ−３１とマウスＩＬ−３１間で比較的保存されているが、ヘリックスＣが最もよく保存されている。両方の種とも優勢な酸性アミノ酸をこの領域内に有するが、その差が、ＩＬ−３１とその受容体であるＩＬ−３１ＲＡ（モノマー、ヘテロダイマー、またはマルチマー受容体を含む）との相互作用の種特異性の原因かも知れない。ＩＬ−３１のループＡ／ＢとヘリックスＢはわずかしか保存されておらず、ヘリックスＣからループＣ／ＤそしてヘリックスＤは種間で最も保存され、この領域の保存はこれが機能的に重要であることを示唆する。ヒトＩＬ−３１とマウスＩＬ−３１のＤヘリックスも保存されている。ＩＬ−３１ＲＡ受容体アンタゴニストは、ＩＬ−３１ヘリックスＤ内の変異により設計され得る。これらには、残基Ｔｈｒ１５６（配列番号２）からのタンパク質の末端切断、または受容体へのリガンドの結合を提供するがそのシグナル伝達活性を低下させる残基の保存がある。
本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡとＲＮＡとを含む）の調製法は当該分野で公知である。イソチオシアン酸グアニジウム抽出を使用して総ＲＮＡを調製し、次にＣｓＣｌ勾配で遠心分離して単離することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２−９４，１９７９）。総ＲＮＡからＡｖｉｖとＬｅｄｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：１４０８−１２，１９７２）を使用して、ポリ（Ａ）+ＲＮＡが調製される。ポリ（Ａ）+ＲＮＡから公知の方法を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が調製される。あるいはゲノムＤＮＡを単離してもよい。次に、ＩＬ−３１抗体をコードするポリヌクレオチドが同定され、例えばハイブリダイゼーションまたはＰＣＲにより単離される。
ＩＬ−３１のマウスオーソログのポリヌクレオチド配列は同定されており、配列番号３に示される。マウスＩＬ−３１の成熟配列は、配列番号４に示すようにおそらくＭｅｔ1で始まり、これは配列番号２に示すようにヒト配列のＭｅｔ1に対応する。組織解析は、マウスＩＬ−３１の発現が、睾丸、脳、ＣＤ９０＋細胞、前立腺細胞、唾液腺、および皮膚で見つかることを証明した。２９３Ｔ細胞からの精製ＩＬ−３１のさらなるＮ末端配列解析は、配列番号４に示すように残基３１（Ａｌａ）にＮ末端があり、成熟ポリペプチドはアミノ酸残基３１（Ａｌａ）〜１６３（Ｃｙｓ）を含んで成る（配列番号４に示す）ことを証明した。
配列番号２に示すようにＩＬ−３１タンパク質配列のホップ／ウッズ（Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ）親水性プロフィールを作製することができる（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３８２４−３８２８，１９８１；Ｈｏｐｐ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８８：１−１８，１９８６、およびＴｒｉｑｕｉｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：１５３−１６９，１９９８）。このプロフィールは、スライドする６残基窓（ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ ｗｉｎｄｏｗ）に基づく。埋もれたＧ、Ｓ、およびＴ残基と露出したＨ、Ｙ、およびＷ残基は無視された。例えばヒトＩＬ−３１では親水性領域は、配列番号２のアミノ酸残基５４〜５９、配列番号２のアミノ酸残基１２９〜１３４、配列番号２のアミノ酸残基５３〜５８、配列番号２のアミノ酸残基３５〜４０、および配列番号２のアミノ酸残基３３〜３８を含む。例えばマウスＩＬ−３１では親水性領域は、配列番号１１のアミノ酸残基３４〜３９、配列番号１１のアミノ酸残基４６〜５１、配列番号１１のアミノ酸残基１３１〜１３６、配列番号１１のアミノ酸残基１５８〜１６３、および配列番号１１のアミノ酸残基１５７〜１６２を含む。
ＩＬ−３１ポリペプチドのアミノ酸配列の修飾を計画する時は、全体の構造的および生物学的プロフィールを破壊しないように、親水性または疎水性を考慮すべきであることを当業者は理解するであろう。置換に特に関係するものは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅよりなる群、またはＭｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐよりなる群から選択される疎水性残基である。例えば置換が許容される残基には、配列番号２のＶａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ、またはＭｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ残基よりなる群がある。配列番号２と配列番号１１の位置の保存されたシステイン残基は、置換があまり許容されない。
本発明はまた、ＩＬ−３１ポリペプチドの機能性フラグメントに結合する抗体、およびかかる機能性フラグメントをコードする核酸分子を含む。本明細書に定義される「機能性」ＩＬ−３１またはそのフラグメントは、その増殖もしくは分化活性、特殊な細胞機能を誘導もしくは阻害する能力により、または抗ＩＬ−３１抗体もしくはＩＬ−３１ＲＡまたはこれらの受容体の抗体もしくはＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータヘテロダイマー（可溶性または固定化）に特異的に結合する能力により特徴付けられる。上記したようにＩＬ−３１は、配列番号２に示されるヘリックスＡ（アミノ酸残基３８〜５２）、ヘリックスＢ（アミノ酸残基８３〜９８）、ヘリックスＣ（アミノ酸残基１０４〜１１７）、およびヘリックスＤ（アミノ酸残基１３７〜１５２）を含む４−ヘリックス束構造により特徴付けられる。すなわち本発明は、（ａ）上記ヘリックスの１つまたはそれ以上を含むポリペプチド分子；および（ｂ）これらのヘリックスの１つまたはそれ以上のを含む機能性フラグメント、とを包含する融合タンパク質をさらに提供する。融合タンパク質の他のポリペプチド部分は、他の４−ヘリックス束サイトカイン（例えばＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＧＭ−ＣＳＦ）、または融合タンパク質の分泌を促進する変性したおよび／または無関係の分泌シグナルペプチドにより寄与され得る。
本発明はまた、本明細書に記載のＩＬ−３１ポリペプチドのエピトープ担持部分を含むポリペプチドフラグメントまたはペプチドに結合する抗体を提供する。かかるフラグメントもしくはペプチドは、全タンパク質を免疫原として使用した時、抗体応答を誘発するタンパク質の部分である「免疫学性エピトープ」を含み得る。免疫学性エピトープ担持ペプチドは、標準的方法を使用して同定することができる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（１９８３））。これらの機能性フラグメントへの抗体の結合は、その同族の受容体へのＩＬ−３１のシグナル伝達の阻害、阻止、中和、および／または低下を引き起こす。
これに対してポリペプチドフラグメントまたはペプチドは、抗体が特異的に結合できるタンパク質分子の領域である「抗原性エピトープ」を含み得る。いくつかのエピトープはアミノ酸の線状または連続的ストレッチからなり、かかるエピトープの抗原性は変性物質により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣することができる比較的短い合成ペプチドを使用して、タンパク質に対する抗体の産生を刺激することができることは当該分野で公知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０（１９８３）を参照）。従って本発明の抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドと結合する抗体（例えば中和抗体）を作製するのに有用である。ホップ／ウッズ（Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ）親水性プロフィールを使用して、最も大きな抗原性を有する領域を決定することができる（Ｈｏｐｐら、１９８１、本明細書中、およびＨｏｐｐら、１９８６、本明細書中）。例えばヒトＩＬ−３１では親水性領域は、配列番号２のアミノ酸残基５４〜５９、配列番号２のアミノ酸残基１２９〜１３４、配列番号２のアミノ酸残基５３〜５８、配列番号２のアミノ酸残基３５〜４０、および配列番号２のアミノ酸残基３３〜３８を含む。例えばマウスＩＬ−３１では親水性領域は、配列番号１１のアミノ酸残基３４〜３９、配列番号１１のアミノ酸残基４６〜５１、配列番号１１のアミノ酸残基１３１〜１３６、配列番号１１のアミノ酸残基１５８〜１６３、および配列番号１１のアミノ酸残基１５７〜１６２を含む。
抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは好ましくは、配列番号２または配列番号４の少なくとも４〜１０アミノ酸、少なくとも１０〜１４アミノ酸、または約１４〜約３０アミノ酸を含有する。かかるエピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは本明細書に記載のように、ＩＬ−３１ポリペプチドをフラグメント化することにより、または化学的ペプチド合成により産生することができる。さらにエピトープはランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択することができる（例えばＬａｎｅとＳｔｅｐｈｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５：２６８（１９９３）；およびＣｏｒｔｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：６１６（１９９６）参照）。エピトープを同定しエピトープを含む小ペプチドから抗体を産生する標準的方法が、例えばＭｏｌｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１０巻、Ｍａｎｓｏｎ（編）中の「Ｅｐｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ」、１０５〜１１６頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９２）；Ｐｒｉｃｅ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉａｔｉｏｎ」、ＲｉｔｔｅｒとＬａｄｙｍａｎ（編）中、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）、およびＣｏｌｉｇａｎら（編）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、９．３．１〜９．３．５頁、および９．４．１〜９．４．１１頁（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９７）に記載されている。
本明細書に記載の抗体の活性は、ＩＬ−３１ＲＡ受容体を発現する細胞の増殖および／またはそこへの結合を測定する種々のアッセイを使用して、増殖を阻害または低下させる能力により測定することができる。特に関係するのはＩＬ−３１依存性細胞の変化である。ＩＬ−３１依存性になるように設計された適当な細胞株には、ＩＬ−３依存性ＢａＦ３細胞株（ＰａｌａｃｉｏｓとＳｔｅｉｎｍｅｔｚ、Ｃｅｌｌ ４１：７２７−７３４，１９８５；Ｍａｔｈｅｙ−Ｐｒｅｖｏｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：４１３３−４１３５，１９８６）、ＦＤＣ−Ｐ１（Ｈａｐｅｌら、Ｂｌｏｏｄ ６４：７８６−７９０，１９８４）、およびＭＯ７ｅ（Ｋｉｓｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：２３５−２４０，１９９３）がある。公表された方法（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ． ８：３６３−３７５，１９８４；Ｄｅｘｔｅｒら、Ｂａｕｍら編、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，８ｔｈ Ａｎｎ．Ｍｔｇ．Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ． １９７９，１４５−１５６，１９８０））に従って、成長因子依存性細胞株を樹立することができる。
本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体の活性は、受容体結合に関連した細胞外酸性化速度またはプロトン排出と以後の生理学的細胞応答を測定するシリコンベースのバイオセンサーマイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）により測定することができる。装置の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリホルニア州）製のＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）マイクロフィジオメーター（Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）である。この方法により種々の細胞応答（例えば細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症応答、制御および受容体活性化など）を測定することができる。例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１９０６−１９１２，１９９２；Ｐｉｔｃｈｆｏｒｄ，Ｓ．ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２８：８４−１０８，１９９７；Ａｒｉｍｉｌｌｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． ２１２：４９−５９，１９９８；Ｖａｎ Ｌｉｅｆｄｅ，Ｉ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４６：８７−９５，１９９８を参照。
アンタゴニストもまた、リガンド−受容体相互作用の部位を解析するための研究試薬として有用である。アンタゴニストは、造血の制御に関与する細胞の拡張、増殖、活性化、および／または分化を阻害するのに有用である。ＩＬ−３１活性のインヒビター（ＩＬ−３１アンタゴニスト）には、抗ＩＬ−３１抗体、および可溶性ＩＬ−３１受容体、ならびに他のペプチド性および非ペプチド性物質（リボザイムを含む）がある。
ＩＬ−３１活性の阻害は、多くのアッセイ法により測定することができる。本明細書に開示したアッセイ以外に、受容体結合、ＩＬ−３１依存性細胞応答の刺激／阻害、またはＩＬ−３１ＲＡ受容体発現細胞の増殖を測定するように設計された種々のアッセイ内で、ＩＬ−３１活性の阻害について試料を試験することができる。
ＩＬ−３１結合ポリペプチドはまた、リガンドの精製に使用することができる。ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロースのビーズ、架橋アガロース、ガラス、セルロース性樹脂、シリカベースの樹脂、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下で安定な同様の物質上に固定される。固体支持体にポリペプチドを結合する方法は当該分野で公知であり、アミン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジド活性化がある。得られる媒体は一般にカラムの形で作製され、リガンドを含有する液体は１回またはそれ以上カラムを通過させてリガンドを受容体ポリペプチドに結合させる。次に塩濃縮、カオトロピック物質（塩酸グアニジン）、またはｐＨの変化を使用してリガンドを溶出して、リガンド−受容体結合を破壊させる。
リガンド結合受容体（または抗体、補体／抗補体対の１つのメンバー）またはその結合フラグメントを使用するアッセイ系、および市販のバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｓｅｎｘｏｒ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）が有利に使用される。かかる受容体、抗体、補体／抗補体対のメンバー、またはフラグメントは、受容体チップの表面上に固定化される。この装置の使用はＫａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．１４５：２２９−４０，１９９１、およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−６３，１９９３に開示されている。受容体、抗体、メンバーまたはフラグメントは、フローセル中で金フィルムに結合したデキストランファイバーに、アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して共有結合される。試験試料をセル中を通過させる。試料中にリガンド、エピトープ、または補体／抗補体対の反対のメンバーが存在すると、これはそれぞれ固定化受容体、抗体またはメンバーに結合し、媒体の屈折率の変化を引き起こし、これは金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。この系はオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）とオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の測定を可能にし、ここから結合親和性が計算され、結合の化学量論が評価される。あるいはリガンド／受容体結合を、ＳＥＬＤＩ（登録商標）技術を使用して分析することができる（Ｃｉｐｅｒｇｅｎ Ｉｎｃ．、パロアルト、カリホルニア州）。
ＩＬ−３１抗体は炎症促進性ＩＬ−３１の生物学的作用を阻止するのに使用することができ、本明細書に記載の種々の疾患において抗炎症性治療薬として有用である。抗原性のエピトープ担持ポリペプチドが、ＩＬ−３１ポリペプチド（例えば配列番号２）の少なくとも６個、好ましくは少なくとも９個、およびさらに好ましくは少なくとも１５〜約３０個の連続的アミノ酸残基の配列を含有することを当業者は理解するであろう。ＩＬ−３１ポリペプチドのより大きな部分（すなわちアミノ酸配列の３０〜１００残基から全長まで）を含むポリペプチドが含まれる。抗原または免疫原性エピトープはまた、本明細書に記載の結合したタグ、アジュバント、ビヒクル、および担体を含んでもよい。適当な抗原には、アミノ酸番号２４〜アミノ酸番号１６４の配列番号２によりコードされるＩＬ−３１ポリペプチド、またはその連続する９〜１４１個のアミノ酸フラグメントがある。他の適当な抗原には、完全長および成熟ＩＬ−３１、本明細書に記載の４−ヘリックス束構造のＩＬ−３１のヘリックスＡ〜Ｄ、および個々のもしくは複数のヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤがある。抗原として使用するのに好適なペプチドは、本明細書に記載のように疎水性プロットから当業者により予測されるような親水性ペプチドであり、例えば配列番号２のアミノ酸残基１１４〜１１９、１０１〜１０５、１２６〜１３１、１１３〜１１８、および１５８〜１６２；および配列番号１１のアミノ酸残基３４〜３９、４６〜５１、１３１〜１３６、１５８〜１６３、および１５７〜１６２である。さらに例えばＤＮＡＳＴＡＲ Ｐｒｏｔｅａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、マジソン、ウィスコンシン州）を使用してジェームズウルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）プロットにより予測されるようなＩＬ−３１抗原性エピトープは好適な抗原として機能し、当業者により容易に測定される。
これらの抗原を動物に接種して生成する免疫応答から、本明細書に記載のように抗体を単離し精製することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製し単離する方法は当該分野で公知である。例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｏｌｉｇａｎら（編）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９；およびＨｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｇ．Ｒ．編、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ボカラートン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、フロリダ州、１９８２を参照。
当業者には明らかなようにポリクローナル抗体は、種々の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、およびラット）にＩＬ−３１ポリペプチドまたはそのフラグメントを接種して作製することができる。例えばミョウバン（水酸化アルミニウム）またはフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバントを使用して、ＩＬ−３１ポリペプチドの免疫原性を増大させてもよい。免疫に有用なポリペプチドにはまた、融合ポリペプチド、例えばＩＬ−３１もしくはその一部と免疫グロブリンポリペプチドもしくはマルトース結合タンパク質との融合体がある。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合、かかる部分は免疫のために巨大分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、または破傷風トキソイド）に有利に連結または結合される。
抗体は以下の場合に特異的に結合していると考えられる：１）抗体が閾値レベルの結合活性を示す場合、および２）抗体が関連ポリペプチド分子と顕著な交差反応をしない場合。閾値レベルの結合は、本明細書の抗ＩＬ−３１抗体が対照（非ＩＬ−３１）ポリペプチドに対する結合親和性より少なくとも１０倍大きい親和性でＩＬ−３１ポリペプチド、ペプチド、またはエピトープに結合する場合に測定される。抗体は、１０6Ｍ-1またはそれ以上、好ましくは１０7Ｍ-1またはそれ以上、さらに好ましくは１０8Ｍ-1またはそれ以上、最も好ましくは１０9Ｍ-1またはそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を示すことが好ましい。抗体の結合親和性は、例えばスキャチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ５１：６６０−６７２，１９４９）により当業者が容易に測定することができる。
抗ＩＬ−３１抗体が関連ポリペプチド分子と顕著に交差反応するかどうかは、例えばＩＬ−３１ポリペプチドを検出するが既知の関連ポリペプチドは検出しない抗体により、標準物質ウェスタンブロット解析（Ａｕｓｕｂｅｌら、本明細書に記載）を使用して証明される。既知の関連ポリペプチドの例は、先行技術で開示されているもの、例えばタンパク質ファミリーの公知のオーソログやパラログ（ｐａｒａｌｏｇ）、および同様の既知のメンバーがある。非ヒトＩＬ−３１およびＩＬ−３１変異ポリペプチドを使用してスクリーニングを行うこともできる。さらに抗体を既知の関連ポリペプチド「に対してスクリーニング」して、ＩＬ−３１ポリペプチドに特異的に結合する集団を単離することができる。例えば、ＩＬ−３１に対して作製された抗体は不溶性マトリックスに接着された関連ポリペプチドに吸着され、ＩＬ−３１に特異的な抗体は適切な緩衝条件下でマトリックス中を通過する。スクリーニングにより、既知の密接に関連したポリペプチドと非交差反応性のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の単離が可能である（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｃｏｏｌｉｇａｎら（編）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５）。特異抗体のスクリーニングと単離は当該分野で公知である。「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｐａｕｌ（編）、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３；Ｇｅｔｚｏｆｆら、Ａｄｖ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：１−９８、１９８８；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、１９９６；Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：６７−１０１，１９８４を参照。特異的に結合する抗ＩＬ−３１抗体は後述の当該分野の多くの方法により検出することができる。
モノクローナル抗体は、例えばスプラーグドーレイラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）を、本明細書に列記した発現系から産生される、精製成熟組換えヒトＩＬ−３１ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸残基２７（Ｌｅｕ）から１６７（Ｔｈｒ））またはマウスオーソログで免疫することにより、調製することができる。各ラットに、まず完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）中の精製ヒト組換えＩＬ−３１タンパク質１００μｇを腹腔内（ＩＰ）注射し、次に不完全フロイントアジュバント中の精製組換えタンパク質５０μｇを２週間毎に追加免疫の腹腔内を注射する。３回目の追加免疫注射投与の７〜１０日後に、動物を放血させ、血清を採取する。
ヒトＩＬ−３１特異的ラット血清試料は、特異的抗体標的であるビオチン化ヒトＩＬ−３１に対する力価についてＥＬＩＳＡにより解析される。
２匹の高力価ラットから脾臓細胞およびリンパ節細胞が採取され、２つの別々の融合操作（４：１融合比の脾臓細胞対ミエローマ細胞、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）でＰＥＧ１５００を使用してＳＰ２／０（マウス）ミエローマ細胞に融合される。融合後の１０日間の増殖後、特異抗体産生ハイブリドーマプールがＥＬＩＳＡにより同定される。両方のＥＬＩＳＡプロトコールで陽性のハイブリドーマプールが、精製組換えＩＬ−３１の受容体結合活性を阻止するかまたは緩和する能力についてさらに分析される（「中和アッセイ」）。
ＥＬＩＳＡのみまたはＥＬＩＳＡと「中和アッセイ」により陽性結果を与えるハイブリドーマプールは、少なくとも２回限界希釈法によりクローン化される。
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体は、組換えヒトＩＬ−３１と天然ヒトＩＬ−３１の定量的測定のためのＥＬＩＳＡでその有用性について解析される。抗体が選択され、定量的アッセイが開発される。
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体は、ＢａＦ３／ＭＰＬ−ＩＬ−３細胞上の精製組換えｈｕＩＬ−３１の受容体結合活性を阻止するかまたは緩和する能力について分析される（「中和アッセイ」）。この方法で多くの「中和」モノクローナル抗体が同定されている。記載したヒトＩＬ−３１に対する中和モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは次に、ブダペスト条約に従って元々の寄託物としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）特許物寄託機関に寄託することができる。
切断および精製ＩＬ−３１組換え融合タンパク質を用いてルイスラット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ギルバーツビル（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）、ペンシルバニア州）を免疫することにより、モノクローナル抗体を調製することができる。各ラットに、まず完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）中の精製ヒト組換え融合タンパク質１００μｇを腹腔内（ＩＰ）注射し、次に不完全フロイントアジュバント中の精製組換えタンパク質５０μｇを２週間毎に４週間追加免疫腹腔内注射する。最初の４週間の免疫後、不完全フロイント中のキャリアータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）に結合した切断した精製組換えタンパク質の５０μｇの追加免疫ＩＰ注射を２週間毎に４週間行う。４回目の追加免疫注射投与の７〜１０日後に、動物を放血させ、血清を採取した。ＩＬ−３１特異的ラット血清試料が、ＥＬＩＳＡにより特異抗体標的として精製組換え融合タンパク質ＩＬ−３１−Ｆｃそして非特異抗体標的として無関係の融合タンパク質の５００ｎｇ／ｍｌを使用して解析される。１匹またはそれ以上の高力価ラットから脾臓細胞を採取し、最適化したＰＥＧ介在融合プロトコール（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中のＳＰ２／０（マウス）ミエローマ細胞に融合させる。融合後の１２日間の増殖後、特異抗体産生ハイブリドーマプールがＥＬＩＳＡにより、特異抗体標的として精製ＩＬ−３１組換え融合タンパク質そして非特異抗体標的として無関係の融合タンパク質の各５００ｎｇ／ｍｌを使用して解析される。特異抗体標的のみに陽性のハイブリドーマプールが、ＢａＦ３／ＭＰＬ−ＩＬ−３１細胞上の組換えｈｕＩＬ−３１の受容体結合活性を阻止するかまたは低下させる能力（「中和アッセイ」）、および抗体標的としてＦＡＣＳ解析により結合する能力についてさらに分析される。ＥＬＩＳＡアッセイで特異的陽性結果を与え、ＦＡＣＳまたは「中和アッセイ」のいずれかで陽性結果を与えるハイブリドーマプールは、少なくとも２回限界希釈法によりクローン化される。
５つのラット抗マウスハイブリドーマを同様の方法で作製し、以下のクローン名を与えた：クローン２７１．９．４．２．６、コロニー２７１．２６．６．６．１、クローン２７１．３３．１．２．２、クローン２７１．３３．３．２．１、およびクローン２７１．３９．４．６．５。実施例１を参照。これらのクローンにより産生されたモノクローナル抗体は、区分け（ｂｉｎｎｉｎｇ）（すなわち、各抗体が任意の他の抗体の結合を阻害するかどうかを調べる）、相対的親和性、および中和を含む多くの方法で解析された。クローン２７１．３３．３．２．１は他の４つとは異なるエピトープに結合するため、モノクローナル抗体は２つの異なる区分に分類されるようである。これらのモノクローナル抗体の４つについての相対的結合親和性を実施例１４に示す。
モノクローナル抗体の結合親和性を作製することができる。ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ｆｃガンマ特異抗体（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））をＣＭ５ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）チップ上に固定化する。アッセイを最適化して、抗ラット捕捉表面上に各モノクローナル抗体を結合させ、次にモノクローナル抗体を介してＩＬ−３１の濃度シリーズを注入して結合（Ｋａ）と解離（Ｋｄ）とを調べる。各実験後、２０ｍＭ ＨＣｌを２回注入して表面を抗ラット抗体に再生する。それぞれについてデータを作製し、評価ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｃｏｒｅ、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン）を使用して、ＩＬ−３１タンパク質への抗ＩＬ−３１抗体結合の動力学を評価する。
マウス抗ヒトＩＬ−３１ ｍＡｂを以下のように作製することができる。６〜１２週齢のＩＬ−３１ノックアウトマウスを、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント（Ｓｉｇｍａ）で１：１（ｖ：ｖ）混合した２５〜５０μｇの可溶性ヒトＩＬ−３１−ｍｕＦｃタンパク質を、２週間毎のスケジュールで腹腔内注射して免疫する。３回目の免疫の７〜１０日後、後眼窩出血により血液試料を取り、血清を採取し、中和アッセイ（例えば本明細書に記載）でＩＬ−３１の結合を阻害する能力、およびＦＡＣＳ染色アッセイでＩＬ−３１トランスフェクト対非トランスフェクト２９３細胞を染色する能力について評価する。中和力価が横ばいになるまで上記したようにマウスを免疫し続け、血液試料を取り、評価した。この時最も高い中和力価を有するマウスに、ＰＢＳ中の可溶性ＩＬ−３１−Ｆｃタンパク質２５〜５０μｇを静脈内注射する。３日後、これらのマウスの脾臓とリンパ節を採取し、例えばマウスミエローマ（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３．３．１２．１１）細胞または当該分野の他の適切な細胞株を使用して当該分野で公知の標準的方法（例えば、Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３：１５４８−５０，１９７９；およびＬａｎｅ，Ｒ．Ｄ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：２２３−８，１９８５を参照）を使用して、ハイブリドーマ作製のために使用する。
融合の８〜１０日後のハイブリドーマ上清について、ＩＬ−３１−ｍｕＦｃタンパク質に結合する能力についてＥＬＩＳＡにより、ＨＲＰ−結合ヤギ抗マウスカッパおよび抗ラムダ軽鎖第２工程試薬を使用して、１次スクリーニングを行い、結合したマウス抗体を同定することができる。
推定抗ＩＬ−３１ ｍＡｂにより認識される標的分子であるＩＬ−３１が確かにＩＬ−３１であるという生化学的確認は、標準的免疫沈降法と次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはウェスタンブロット法（両方とも、非トランスフェクトＢａｆ３細胞に対してＩＬ−３１トランスフェクション細胞からの可溶性膜調製物を使用する）により行われる。ｍＡｂは、可溶性ＩＬ−３１−ｍｕＦｃタンパク質を特異的に免疫沈降またはウェスタンブロットさせる能力について試験される。
組織培養培地から精製されたモノクローナル抗体は、中和アッセイでＩＬ−３１がその受容体に結合する能力を阻止するかまたは阻害する能力について解析された。２０個の「中和」モノクローナル抗体がこの方法で同定された。最初のクローン化後にこれらのうちの１０個が「良好な中和物質」として同定された：クローン２９２．７２．３、クローン２９２．１１８．６、クローン２９２．６３．５、クローン２９２．６４．６、クローン２９２．８４．１、クローン２９２．１０９．４、クローン２９２．１２．３、クローン２９２．５１．５、クローン２９２．３９．５、およびクローン２９２．１０５．４。他の１０個は最初のクローン化後に以下のクローン名を有する：クローン２９４．３５．２、クローン２９４．１４６．５、クローン２９４．１５２．４、クローン２９４．１５４．４、クローン２９４．１５４．５、クローン２９４．３５．３、クローン２９４．７８．４、クローン２９４．１５５．６、クローン２９４．１５８．５、クローン２９４．１６３．２、およびクローン２９４．１４４．３。
２回目のクローン化により特定のモノクローナル抗体を採取し、再度中和アッセイでＩＬ−３１がその受容体に結合する能力を阻止するかまたは阻害する能力について解析した。「良好な中和物質」についての２回目のクローン化後のクローン名は以下の通りである：クローン２９２．１２．３．１、クローン２９２．６３．５．３、クローン２９２．７２．３．１、クローン２９２．８４．１．６、クローン２９２．１１８．６．４、クローン２９２．６４．６．５．５、クローン２９２．３９．５．３、クローン２９２．５１．５．２、クローン２９２．１０９．４．４、およびクローン２９２．１０５．４．１。他の１０個のうちの６個は以下のコロニー名を有する：クローン２９２．１５２．４．１、クローン２９４．１５８．５．２、クローン２９４．３２．２．６．３、クローン２９４．１４４．３．５、クローン２９４．１５４．５．３、クローン２９４．１６３．２．１。
上記のヒトＩＬ−３１に対する中和モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、ブダペスト条約に従って元々の寄託物としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）特許物寄託機関に寄託し、以下のＡＴＣＣ受け入れ番号を与えられた：クローン２９２．１２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名（ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−６８１５）；クローン２９２．７２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６）；クローン２９２．６３．５．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９）；クローン２９２．１１８．６．４（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０）；クローン２９２．１６３．２．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１）；クローン２９２．８４．１．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１）；クローン２９４．３５．２．６．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２）；クローン２９４．１５４．５．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５）；クローン２９４．１４４．３．５（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３）。
本明細書に記載のマウスＩＬ−３１に対する中和モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマをブダペスト条約に従って元々の寄託物としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）特許物寄託機関に寄託し、以下のＡＴＣＣ受け入れ番号を与えられた：クローン２７１．２６．６．６．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７４）。
これらのハイブリドーマクローンにより産生されたモノクローナル抗体は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、および１０％胎児クローンＩ血清（ハイクローンラボラトリーズ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を有する９０％イスコブ改変ダルベッコー培地の増殖培地中で培養することができる。２×１０5細胞／ｍｌで培養を開始して、１×１０5〜５×１０5細胞／ｍｌ、３７℃および５〜６％ＣＯで維持することにより、クローンを増殖させることができる。細胞は、以後の継代で無血清条件に適応させることができる。凍結した細胞は９０％血清、１０％ＤＭＳで保存し、液体窒素フリーザーの蒸気相中で保存される。
組織培養培地中のモノクローナル抗体は、精製組換えタンパク質ヒトＩＬ−３１の存在下で増殖させた時に受容体結合を阻止、阻害、防止するかまたは低下させる能力について解析される。例えばこれらのクローンにより産生されたモノクローナル抗体は、区分け（ｂｉｎｎｉｎｇ）（すなわち、各抗体が他の結合の結合を阻害するかどうかを調べる）、相対的親和性、および中和を含む多くの方法で解析された。１０個の良好な中和抗体が同じ区分（ｂｉｎ）に入り、他のモノクローナル抗体が３つの別々の区分に入るようである。さらに良好な中和抗体のうちの８個はＩｇＧ１イソタイプであり、他の２個はＩｇＧ２ａイソタイプである。
ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体をヤギ抗マウスＦｃ ｐＡｂを使用して捕捉し、ビオチン化ＩＬ３１の見かけの結合親和性（ＥＣ５０）を測定した。これらのアッセイ条件下で良好な中和物質は、最も低い匹敵するＥＣ５０値〜４ｎｇ／ｍｌ Ｂｔ−ＩＬ３１を有する。弱い中和物質の見かけの親和性は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜２３６ｎｇ／ｍｌ Ｂｔ−ＩＬ３１の範囲である。
本明細書に記載の方法により作製されるモノクローナル抗体は、種々の方法により中和性について試験することができる。例えば米国特許出願（公報第２００３０２２４４８７号、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｉｎｄｙら、２００３を参照）に記載のようなルシフェラーゼアッセイを使用することができる。さらに中和は、リガンドとモノクローナル抗体の存在下でケラチン細胞培養物からの炎症促進性ケモカイン（例えばＴＡＲＣおよびＭＤＣ）の産生の低下を測定して、試験することができる。中和はまた、本明細書に記載のインビボモデルにより測定することもできる。
ある実施態様において本発明の抗体は本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬもしくはＶＨドメインを含むフラグメントがある。抗原結合抗体フラグメント（１本鎖抗体を含む）は、可変領域のみを含むか、または以下のすべてもしくは一部と一緒でもよい：ヒンジ領域、ＣH1、ＣH2、およびＣH3ドメイン。また本発明には、可変領域とヒンジ領域、ＣH1、ＣH2、およびＣH3ドメインとの任意の組合せを含む抗原結合フラグメントも含まれる。
別の実施態様において本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的、またはそれ以上の多重特異的でもよい。多重特異的抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または本発明のポリペプチドと異種エピトープ（例えば異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的でもよい。例えばＰＣＴ公報ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；４，７１４，６８１号；４，９２５，６４８号；５，５７３，９２０号；５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照。
本発明はまた、上記抗体と機能的に同等な遺伝的改変抗体を含む。改良された安定性および／または治療効果を与える修飾抗体が好ましい。修飾抗体の例には、アミノ酸残基の保存的置換を有するもの、抗原結合有用性に大きな悪影響を与えないアミノ酸の１つまたはそれ以上の欠失もしくは付加を有するものがある。置換は、治療的有用性が維持される限りは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を変化または修飾することから、ある領域を完全に再設計することまでにわたる。本発明の抗体は、翻訳後修飾（例えばアセチル化およびリン酸化）するか、または合成的に修飾（例えば標識基の結合）することができる。
遺伝的改変抗体はまた抗ＩＬ−３１抗体から得られるキメラ抗体を含む。キメラ抗体は、マウスまたはラット由来の可変領域とヒト由来の定常領域とを含み、従ってキメラ抗体はヒト被験体に投与した時、より長い半減期とより小さな免疫原性を有する。キメラ抗体の作製法は当該分野で公知である。これらの抗体の可変領域はヒトＩｇＧの定常領域と連結して、所望のキメラ抗体を生成することができる。
本発明で使用される遺伝的改変抗ＩＬ−３１抗体は、本明細書に記載のヒト化抗体を含む。ヒト化抗体は、マウスドナー免疫グロブリンのＣＤＲと、ヒトアクセプター免疫グロブリンの重鎖および軽鎖フレームワークとからなる。ヒト化抗体の作製法は、米国特許第５，３０１，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６２号；および６，１８０，３７０号（それぞれ参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。これらの抗体のＣＤＲは次に、選択されたヒトフレームワーク（これらは当該分野で公知である）に移植されて所望のヒト化抗体を生成する。
本発明の抗体は、これらが認識するかまたは特異的に結合する本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して説明または特定される。エピトープまたはポリペプチド部分は本明細書に記載のように、例えばＮ末端およびＣ末端位置により、連続的アミノ酸残基のサイズにより特定されるか、または表および図にリストされる。本発明のエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体も排除される。従って本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み、その排除を可能にする。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号４のポリペプチド、に対するモノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。競合的阻害は当該分野で公知の方法により、例えば本明細書に記載の競合的結合アッセイを使用して測定することができる。好適な実施態様において抗体は、配列番号２または配列番号４のポリペプチドへの本発明のモノクローナル抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害する。
本発明はまた、競合的結合を測定するための当該分野で任意の公知の方法（例えば本明細書に記載のイムノアッセイ）により測定される本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好適な実施態様において抗体は、エピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害する。
共有結合が、抗体が抗イディオタイプ応答を生成することを妨害しないように、本発明の抗体には、抗体への任意のタイプの分子の共有結合により修飾される誘導体を含む。例えば特に限定されないが抗体誘導体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質への結合などにより修飾された抗体がある。多くの化学的修飾が任意の方法により行われ、特に限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の方法により行われる。さらに誘導体は１つまたはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
本発明の抗体はまた、哺乳動物（好ましくはヒト）においてその半減期（例えば血清半減期）が１５日より大きい、好ましくは２０日より大きい、２５日より大きい、３０日より大きい、３５日より大きい、４０日より大きい、４５日より大きい、２ヶ月より大きい、３ヶ月より大きい、４ヶ月より大きい、または５ヶ月より大きい抗体またはそのフラグメントを包含する。哺乳動物（好ましくはヒト）における本発明の抗体またはそのフラグメントの半減期の増大は、哺乳動物における当該抗体または抗体フラグメントのより高い血清力価を与え、従って当該抗体または抗体フラグメントの投与頻度を低下させ、および／または投与される当該抗体または抗体フラグメントの濃度を低下させる。
インビボの半減期が増大した抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の方法により作製することができる。例えばインビボ半減期が増大した抗体またはそのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体（例えば国際特許公報ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ０２／０６０９１９を参照、これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）との相互作用に関与することが確定しているアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失、または付加）することにより作製することができる。インビボ半減期が増大した抗体またはそのフラグメントは、当該抗体または抗体フラグメントに高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー分子を結合させることにより作製することができる。ＰＥＧは当該抗体または抗体フラグメントに、多官能性リンカー有りまたは無しで、抗体または抗体フラグメントのＮ末端もしくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合により、またはリジン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介して結合することができる。生物活性の喪失が最小である直鎖または分岐鎖のポリマー誘導体化が使用される。結合の程度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量スペクトル法により詳しく監視され、抗体へのＰＥＧ分子の適切な結合が確保される。未反応のＰＥＧは、例えばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧ結合体から分離することができる。
本発明により設計されるヒト化抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を与えない追加の保存的アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。保存的置換とは、ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；およびｐｈｅ，ｔｙｒのような企図された組合せである。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で公知である。一般にヒト化免疫グロブリン（ヒト化抗体を含む）は、遺伝子操作により構築される。既に記載されているほとんどのヒト化免疫グロブリン（Ｊｏｎｅｓら、前述；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、前述；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、前述）は、特定のヒト免疫グロブリン鎖のフレームワークと同一のフレームワーク、アクセプター、および非ヒトドナー免疫グロブリン鎖からのＣＤＲを含む。具体的には、ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有する抗原に結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。
本発明は、ヒト化免疫グロブリン鎖を含む抗体の親和性を増大させるために、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の限定された数のアミノ酸が、アクセプターよりもドナー中の位置のアミノ酸と同一であるように選択される基準を含む。
本発明の抗体は一部は、ヒト化抗体を産生する先行技術（例えばマウス抗体をＣＤＲ源として使用して）における親和性の喪失の２つの原因が以下であるモデルに基づいて作製される：
（１）マウスＣＤＲをヒトフレームワークと組合せると、ＣＤＲに近いフレームワーク内のアミノ酸はマウスではなくヒトである。理論に拘束されるつもりは無いが、これらの変化したアミノ酸はドナーであるマウス抗体中とは異なる静電力または疎水性力を生み出すため、これらのアミノ酸はＣＤＲをわずかに変形させ、この変形したＣＤＲは、ドナー抗体中のＣＤＲのようには有効な接触をしないことがある；および
（２）ＣＤＲに近いがその一部ではない（それでもフレームワークの一部である）元々のマウス抗体のアミノ酸は、親和性に寄与する抗原と接触する。抗体がヒト化される時すべてのフレームワークアミノ酸がヒトになるため、これらのアミノ酸は失われる。
これらの問題を避けるために、および所望の抗原に対して非常に強い親和性を有するヒト化抗体を産生するために、本発明はヒト化免疫グロブリンを設計するための１つまたはそれ以上の以下の原理を使用する。また所望の親和性または他の特性を達成するために、この基準は単独でまたは必要な場合は組合せて使用される。
原理は、アクセプターとして、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと極めて相同的な特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか、または多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを使用することである。例えばマウス重（または軽）鎖可変領域の配列をデータバンク（例えば、国立生物医学研究財団タンパク質同定リソース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）中のヒト重（軽）鎖可変領域の配列と比較すると、異なるヒト領域との相同性の程度は大きく変動し、典型的には約４０％から約６０〜７０％変動する。アクセプター免疫グロブリンとして、ドナー免疫グロブリンの重（または軽）鎖可変領域に最も相同的なヒト重（または軽）鎖可変領域の１つを選択することにより、ドナー免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンに行く時に変化するアミノ酸はより少なくなる。従っておよび再度理論に拘束されるつもりは無いが、コンフォメーションを変形させるＣＤＲの近くのアミノ酸の変化の可能性は小さくなると考えられる。さらにヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体の正確な全体的な形はドナー抗体の形により似てきて、これもＣＤＲを変形させる可能性を小さくする。
典型的には、少なくとも約１０〜２０個の異なるヒト重鎖の代表的コレクション中の３〜５個の最も相同的な重鎖可変領域の１つがアクセプターとして選択されて重鎖フレームワークが与えられ、軽鎖についても同様である。好ましくは１〜３個の最も相同的な可変領域の１つが使用されるであろう。選択されたアクセプター免疫グロブリン鎖は、最も好ましくはドナー免疫グロブリンに対してフレームワーク中で少なくとも約６５％の相同性を有する。
多くの場合、ヒト化軽鎖と重鎖が互いに好ましい接触をすることを確実にするために、アクセプター配列として同じヒト抗体からの軽鎖と重鎖を使用することが好ましいと考えられる。この場合ドナーの軽鎖と重鎖は、その完全な配列が既知のヒト抗体［例えば、Ｅｕ、Ｌａｙ、Ｐｏｍ、Ｗｏｌ、Ｓｉｅ、Ｇａｌ、ＯｕおよびＷＥＡ抗体（Ｋａｂａｔら、前述；まれに、ヒトの鎖の最後の数個のアミノ酸は未知であり、他のヒト抗体との相同性から推定しなければならない）］からの鎖に対してのみ比較される。軽鎖と重鎖可変領域配列を一緒にすると、ドナー軽鎖および重鎖可変領域配列に全体として最も相同的なヒト抗体が選択される。時に重鎖配列がより重視される場合がある。選択されたヒト抗体は次に、軽鎖および重鎖アクセプター配列を与える。実際は、ヒトＥｕ抗体がこの役割を果たすことがしばしばある。
いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法に従って、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。げっ歯動物配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列から得られる特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体について、同じフレームワークを使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
アクセプター免疫グロブリンがどのように選択されても、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の少数のアミノ酸を、アクセプターよりドナー中のこれらの位置のアミノ酸と同じであるように選択することにより、より高い親和性が達成される。ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、抗原結合性を改変、好ましくは改良するための、しばしばＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当該分野で公知の方法、例えば抗原結合に重要なフレームワーク領域を同定するためのＣＤＲとフレームワーク領域の相互作用のモデル化、および特定の位置の異常なフレームワーク領域を同定するための配列比較により、同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体は、当該分野で公知の種々の方法、例えばＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；５，５３０，１０１号；および５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。従ってかかる「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第５，５６５，３３２号）であり、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない数が非ヒト種の対応する配列により置換されている。
第２の原理は、ドナーからどのアミノ酸が選択されるかを以下のカテゴリーが規定するというものである。好ましくはこれらのカテゴリーの１つの多くのまたはすべてのアミノ酸位置で、ドナーのアミノ酸が実際に選択される。
カテゴリー１：ＣＤＲ中のアミノ酸の位置はＫａｂａｔら（前述）により規定される。
カテゴリー２：ヒトアクセプター免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が普通ではない場合（すなわち「まれ」、これは本明細書において、代表的データバンク中のヒト重鎖（それぞれ軽鎖）Ｖ領域配列の約２０％未満であるが、通常約１０％未満の位置に存在するアミノ酸を示す）、およびその位置のドナーアミノ酸がヒト配列について典型的である場合（すなわち、「一般的」、これは本明細書において、代表的データバンク中の約２５％以上であるが、通常約５０％以上の配列に存在するアミノ酸を示す）、アクセプターよりもドナーアミノ酸が選択される。この基準は、ヒトフレームワーク中の典型的ではないアミノ酸が抗体の構造を破壊しないことを確実にするのに有用である。さらに普通ではないアミノ酸をヒト抗体について典型的なドナー抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体の免疫原性が小さくされる。すべてのヒト軽鎖および重鎖可変領域配列はそれぞれ、互いに特に相同的でいくつかの決定的に重要な位置（Ｋａｂａｔら、前述）に同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」に分類される。ヒトアクセプター配列中のアミノ酸がヒト配列中で「まれ」であるかまたは「一般的」を決定する時、アクセプター配列と同じサブグループ中のヒト配列のみを考慮することが好ましい。
カテゴリー３：ヒト化免疫グロブリン鎖の１次配列中の３つのＣＤＲの１つまたはそれ以上のすぐ近くの位置で、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸が選択される。これらのアミノ酸は、ＣＤＲ中のアミノ酸と特に相互作用し易く、アクセプターから選択した場合は、ドナーＣＤＲを変形させ親和性を低下させる可能性が高い。さらに隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用し（Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：７４７−７５３（１９８６）、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）、ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元々の抗体中の親和性を与えるすべての抗原接触を維持するのに好ましい。
カテゴリー４：典型的には元々のドナー抗体の３次元モデルは、ＣＤＲの外にあるいくつかのアミノ酸はＣＤＲの近くで、ＣＤＲ中のアミノ酸と水素結合、ファンデアワールス力、疎水性相互作用などにより相互作用する高い確率を有することを示す。これらのアミノ酸位置で、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸ではなくドナー免疫グロブリンアミノ酸が選択される。この基準に従うアミノ酸は一般に、ＣＤＲ中のあるアミノ酸の３オングストローム単位以内に側鎖を有し、確立された化学的力（例えば上記したもの）に従ってＣＤＲ原子と相互作用できる原子を含有しなければならない。
水素結合を形成する原子の場合、核の間で３オングストロームが測定されるが、結合を形成しない原子については、ファンデアワールス表面の間で３オングストロームが測定される。従って後者の場合、原子が相互作用できると考えるためには、約６オングストローム（３＋ファンデアワールス半径の合計）以内になければならない。多くの場合核は４または５〜６オングストローム離れている。アミノ酸がＣＤＲと相互作用できるかどうかを測定するためには、重鎖ＣＤＲ２の最後の８つのアミノ酸をＣＤＲの一部と見なさないことが好ましく、これは構造の観点から、これらの８アミノ酸はよりフレームワークの一部として挙動するためである。
ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用することができ、従ってカテゴリー４に属するフレームワーク中のアミノ酸は、別の方法で区別される。各フレームワークアミノ酸の溶媒がアクセスできる表面積は２つの方法で計算される：（１）未変性の抗体中、および（２）そのＣＤＲが除去された抗体からなる仮想分子中。約１０平方オングストロームまたはそれ以上のこれらの数の間の大きな差は、フレームワークアミノ酸の溶媒へのアクセスが少なくとも一部はＣＤＲにより阻止され、従ってこのアミノ酸がＣＤＲと接触していることを示す。アミノ酸の溶媒がアクセスできる表面積は、抗体の３次元モデルに基づいて、当該分野で公知のアルゴリズム（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ． １６，５４８（１９８３）、およびＬｅｅとＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，３７９（１９７１）、両方とも参照することにより本明細書に組み込まれる）を使用して計算される。フレームワークアミノ酸はまた、時に他のフレームワークアミノ酸のコンフォメーションに影響を与え、これは次にＣＤＲと接触することにより、ＣＤＲと間接的に相互作用することがある。
フレームワーク中のいくつかの位置のアミノ酸は、多くの抗体のＣＤＲと、特に軽鎖の２、４８、６４および７１位と重鎖の２６〜３０、７１および９４位（番号付けはＫａｂａｔら、前述に従う）で相互作用することができることが知られており［ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６，９０１（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７（１９８９）、およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５，１７５（１９９０）、これらはすべて参照することにより本明細書に組み込まれる］、従ってこれらのアミノ酸は一般にカテゴリー４である。典型的には本発明のヒト化免疫グロブリンは、これら以外にカテゴリー４中にドナーアミノ酸（異なる場合）を含む。軽鎖の３５位と重鎖の９３および１０３位のアミノ酸もまた、ＣＤＲと相互作用する可能性がある。すべてのこれらの番号付けした位置では、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸（異なる時）がヒト化免疫グロブリン中にあるように選択することが好ましい。一方カテゴリー４中のいくつかの位置（例えば軽鎖の最初の５アミノ酸）はアクセプター免疫グロブリンから選択しても、ヒト化免疫グロブリンの親和性を阻止させない場合がある。ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（前述）は、Ｋａｂａｔら（前述）とは異なる方法でＣＤＲを規定する。特にＣＤＲ１は残基２６〜３２を含むと規定される。従ってＲｉｅｃｈｍａｎｎら（前述）は、ドナー免疫グロブリンからこれらのアミノ酸を選択した。
また、抗原に対する高い親和性や他の好適な生物学的性質を維持したまま抗体をヒト化することも重要である。この目標を達成するために、好適な方法ではヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する、親配列や種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製される。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な３次元コンフォメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べると、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわちその抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能になる。こうしてＦＲ残基を選択することができ、受容体配列と取り込み配列が一緒にされ、こうして所望の抗体の性質（例えば標的抗原に対する親和性の増大）が達成される。一般にＣＤＲ残基は、抗原結合に対して直接的にかつ最も大きく影響を与える。抗体のようなタンパク質のモデルを作製するためのコンピュータープログラムが一般に利用可能であり当業者に公知である（例えば、Ｌｅｖｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，７１６８−７１７５（１９８９）；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３５，５６４−５６８（１９８８）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，７５５−７５８（１９８６）を参照、これらはすべて参照することにより本明細書に組み込まれる）。これらは本発明の一部を構成するものではない。実際、すべての抗体は同様の構造を有するため、必要であれば他の抗体のおおまかなモデルとして、ブルークヘーブンタンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）から入手できる既知の抗体構造を使用することができる。市販のコンピュータープログラムを使用して、これらのモデルをコンピューター上に表示し、原子間の距離を計算し、異なるアミノ酸が相互作用する確率を推定することができる（Ｆｅｒｒｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，６，１３−２７（１９８８）を参照）：
ヒト化免疫グロブリン中のアミノ酸をいつドナーから取るかを記載する上記カテゴリー以外に、以下の場合は、ヒト化免疫グロブリン中のいくつかのアミノ酸は、ドナーからもアクセプターからも取られない。
カテゴリー５：上記したように、ドナー免疫グロブリン中のある位置のアミノ酸がヒト配列にとって「まれ」である場合、および上記したようにアクセプター免疫グロブリン中のその位置のアミノ酸もヒト配列にとって「まれ」である場合、ヒト化免疫グロブリン中のその位置のアミノ酸は、ヒト配列に「典型的な」いくつかのアミノ酸であるように選択される。好適な選択は、アクセプター配列と同じサブグループに属する既知のヒト配列中のその位置に最も頻繁に出現するアミノ酸である。
ヒト化抗体は一般に、ヒトの治療に使用するのにマウス抗体またはある場合にはキメラ抗体より少なくとも３つの可能な利点を有する：
（１）エフェクター部分はヒトであるため、これはヒト免疫系の他の部分とよりよく相互作用する（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）により標的細胞をより効率的に破壊する）。
（２）ヒト免疫系はヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を異物として認識せず、従ってかかる注入抗体に対する抗体応答は、完全に異物であるマウス抗体または部分的に異物であるキメラ抗体に対するより小さい。
（３）注入されたマウス抗体は、ヒト循環中の半減期が正常な抗体の半減期よりはるかに短いことが報告されている（Ｄ．Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，４５３４−４５３８（１９８７））。注入されたヒト化抗体はおそらく、天然に存在するヒト抗体により近い半減期を有し、より少量のより少ない投与回数が可能になる。
ある態様において本発明は、アクセプターヒトフレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントに結合した所望の抗原（例えばＩＬ−３１）に結合することができるドナー免疫グロブリンからの重鎖および軽鎖ＣＤＲをコードする組換えＤＮＡセグメントを発現することにより産生される、ヒト化抗体の設計に関する。
ＤＮＡセグメントは典型的には、ヒト化免疫グロブリンコード配列（天然のまたは異種プロモーター領域を含む）に作用可能に結合した発現制御ＤＮＡ配列をさらに含む。発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトできるベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列を使用してもよい。ベクターがいったん適切な宿主中に取り込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、次に必要に応じて、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖ダイマー、または完全な抗体、結合フラグメント、または他の免疫グロブリン型が採取され精製される（Ｓ．Ｂｅｙｃｈｏｋ，「Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９７９）を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
ヒト定常領域ＤＮＡ配列は公知の方法に従って種々のヒト細胞から単離することができるが、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離される（Ｋａｂａｔら（前述）およびＷＰ８７／０２６７１を参照）。本発明の免疫グロブリンを産生するためのＣＤＲは、あらかじめ決められた抗原（例えばＩＬ−３１）に結合することができるモノクローナル抗体から同様に得られ、抗体を産生できる任意の便利な哺乳動物源（マウス、ラット、ウサギを含む）または他の脊椎動物で、公知の方法により産生される。定常領域とフレームワークＤＮＡ配列のための適当な供給源細胞および免疫グロブリン発現と分泌のための宿主細胞は、多くの供給元、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、第６版（１９８８）、ロックビル、メリーランド州、アメリカ合衆国、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）から得ることができる。
本明細書に具体的に記載されるヒト化免疫グロブリン以外に、天然の配列に対して「実質的に相同的な」他の修飾免疫グロブリンを、当業者に公知の種々の組換えＤＮＡ技術を使用して容易に設計し製造することができる。本発明のヒト化免疫グロブリンの基礎として、種々の異なるヒトフレームワーク領域を単一でまたは組合せで使用できる。一般に遺伝子の修飾は、種々の公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎとＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ ８，８１−９７（１９７９）およびＳ．Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８，７３１−７３４（１９８７）を参照、両方とも参照することにより本明細書に組み込まれる）を使用して容易に達成される。
本発明のヒト化抗体はフラグメントおよび完全な抗体を含む。典型的にはこれらのフラグメントは、これらが得られた完全な抗体と抗原結合について競合する。フラグメントは典型的には、少なくとも１０7 Ｍ-1、より典型的には１０8または１０9 Ｍ-1（すなわち、完全な抗体と同じ範囲内）の親和性で結合する。ヒト化抗体フラグメントには別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖがある。フラグメントは組換えＤＮＡ技術または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により産生される。
ヒト化抗体のさらなる詳細については、ヨーロッパ特許ＥＰ２３９，４００、ＥＰ５９２，１０６、およびＥＰ５１９，５９６；国際特許公報ＷＯ９１／０９９６７およびＷＯ９３／１７１０５；米国特許第５，２２５，５３９号、５，５３０，１０１号、５，５６５，３３２号、５，５８５，０８９号、５，７６６，８８６号、および６，４０７，２１３号；およびＰａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９ ４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５ ８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９ ９７３；Ｔａｎら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：１１１９ ２５；Ｃａｌｄａｓら、２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １３：３５３ ６０；Ｍｏｒｅａら、２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：２６７ ７９；Ｂａｃａら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：１０６７８ ８４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９：８９５ ９０４；Ｃｏｕｔｏら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５（２３増刊）：５９７３ｓ ５９７７ｓ；Ｃｏｕｔｏら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：１７１７ ２２；Ｓａｎｄｈｕ，１９９４，Ｇｅｎｅ １５０：４０９ １０；Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２３５：９５９ ７３；Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照。
抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。従来これらのフラグメントは完全な抗体のタンパク質分解的消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７（１９９２）、およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。しかしこれらのフラグメントは組換え宿主細胞から直接産生することができる。例えば抗体フラグメントは上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいはＦａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）2フラグメントを生成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））。他のアプローチではＦ（ａｂ’）2フラグメントは組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の方法は熟練者には明らかであろう。さらに１本鎖Ｆｖや抗体を産生するのに使用できる方法の例には、米国特許出願第４，９４６，７７８号および５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されているものがある。
本発明は、融合タンパク質を作製するために本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくは少なくとも１０、２０、または５０アミノ酸のポリペプチド）に組換え融合または化学結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）した抗体を包含する。すなわち本発明はまた、例えば化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、またはこれらのフラグメント）、またはラジオアイソトープ（すなわち放射結合体）のような細胞毒性剤に結合した、本明細書に記載の抗体を含む免疫結合体に関する。
本発明は、融合タンパク質を作製するために本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくは少なくとも１０、２０、または５０アミノ酸のポリペプチド）に組換え融合または化学結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）した抗体を包含する。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介してもよい。抗体は本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくは少なくとも１０、２０、または５０アミノ酸のポリペプチド）以外の抗原に特異的でもよい。例えば特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に本発明のポリペプチドを融合または結合させることにより、インビトロまたはインビボで特定の細胞タイプに本発明のポリペプチドを標的化するために、抗体を使用してもよい。本発明のポリペプチドに融合または結合される抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製法で使用される。例えばＨａｒｂｏｒら（前述）およびＰＣＴ公報ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ． ３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照。
本発明はさらに、異種ポリペプチド配列（例えば可変領域以外の抗体ドメイン）に融合もしくは結合した本発明のポリペプチドを含む組成物（例えば免疫原性または抗原性エピトープを含むもの）を含む。例えば本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域またはその部分に融合または結合される。例えば本発明のポリペプチド（そのフラグメントまたは変種を含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン、またはその部分（ＣH1、ＣH2、ＣH3、またはこれらの任意の組合せおよびその部分）と融合されてキメラポリペプチドを与える。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣH1ドメイン、ＣH2ドメイン、およびＣH3ドメイン、または全ドメインもしくはその部分の任意の組合せを含む。ポリペプチドはまた、上記抗体部分に融合または結合されてマルチマーを形成してもよい。例えば本発明のポリペプチドに融合した部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によりダイマーを形成することができる。ポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合することにより、より高次のマルチマー型を作製することができる。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合させる方法は当該分野で公知である。例えば米国特許第５，３３６，６０３号；５，６２２，９２９号；５，３５９，０４６号；５，３４９，０５３号；５，４４７，８５１号；５，１１２，９４６号；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）を参照（これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）。他の非限定例として、本発明のポリペプチドおよび／または抗体（これらのフラグメントまたは変種を含む）は、アルブミン［特に限定されないが、組換えヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントもしくは変種を含む（例えば１９９９年３月２日発行の米国特許第５，８７６，９６９号、ＥＰ特許０４１３６２２、および１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号を参照、これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）］に融合してもよい。本発明のポリペプチドおよび／または抗体（そのフラグメントまたは変種を含む）は、異種タンパク質（例えば免疫グロブリンＦｃポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮ末端またはＣ末端に融合してもよい。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた本発明に包含される。
上記したように本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ半減期を延長するためにまたはイムノアッセイで使用するために、当該分野で公知の方法を使用して上記抗体部分に融合または結合される。さらに本発明のポリペプチドは、精製を促進するために上記抗体部分に融合または結合される。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインと哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（例えば、ＥＰ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照）。ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナーに結合した抗原（例えばインスリン）について、免疫系への上皮バリアを通過する抗原の送達の増大が証明されている（例えばＰＣＴ公報ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ９９／０４８１３を参照）。ジスルフィド結合したダイマー構造（ＩｇＧによる）を有する抗体に融合または結合した本発明のポリペプチドもまた、他の分子を結合および中和するのに、モノマー性の分泌タンパク質もしくはタンパク質フラグメント単独より効率的である（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合融合タンパク質中のＦｃ部分は治療と診断に有効であり、従って例えば改良された薬物動態的性質を与えることができる（ＥＰＡ２３２，２６２）。あるいは融合タンパク質が発現、検出、および精製された後にＦｃ部分を欠失させることが好ましいであろう。例えば融合タンパク質を免疫の抗原として使用する場合、Ｆｃ部分は治療や診断を妨害することがある。例えば薬物発見において、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイのためにＦｃ部分に融合されている（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照）。このような方法にはまた、特に限定されないが２官能性結合物質の使用がある（例えば米国特許第５，７５６，０６５号；５，７１４，６３１号；５，６９６，２３９号；５，６５２，３６１号；５，５０５，９３１号；５，４８９，４２５号；５，４３５，９９０号；５，４２８，１３９号；５，３４２，６０４号；５，２７４，１１９号；４，９９４，５６０号；および５，８０８，００３号を参照；これらのそれぞれの内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
さらに本発明のポリペプチド（例えば抗体またはそのフラグメント）は、その精製を促進するために、ペプチドのようなマーカー配列に融合することができる。さらなる実施態様において本発明のポリペプチドをコードする核酸（特に限定されないが、免疫原性および／または抗原性エピトープをコードする核酸を含む）も、エピトープタグ（例えば血球凝集素タグ（「ＨＡ」またはフラグタグ）として目的の遺伝子と組換えを行って、発現されたポリペプチドの検出および精製を助けることができる。好適な実施態様においてマーカーアミノ酸配列はヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、９２５９ イートンアベニュー（Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ）、チャツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ）、カリホルニア州、９１３１１）で提供されるタグであり、これらの多くは市販されている。例えばＧｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載のように、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を与える。精製に有用な他のペプチドタグには、特に限定されないが「ＨＡ」タグ［これはインフルエンザ血球凝集素タンパク質（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））から得られるエピトープに対応する］、および「フラッグ（ｆｌａｇ）」タグがある。
本発明はさらに、診断薬または治療薬に結合した抗体またはそのフラグメントを包含する。抗体は診断的に、例えばある治療、診断、検出、および／または予防法の効力を測定するための臨床検査法の一部として、腫瘍の発生または進行を監視するために使用することができる。抗体を検出可能な物質に結合することにより検出を促進することができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性物質、陽電子放射断層撮影法で使用する陽電子放射金属、および非放射活性常磁性金属イオンがある。例えば本発明の診断薬として使用される抗体に結合できる金属イオンについては米国特許出願第４，７４１，９００号を参照。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり；適当な補欠分子族の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンがあり；適当な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンがあり；発光物質の例にはルミノールがあり；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンがあり；そして適当な放射活性物質の例には、125Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃがある。
さらに抗体またはそのフラグメントは、治療用成分、例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制薬または細胞破壊薬）、治療薬または放射活性金属イオンに結合される。細胞毒または細胞毒性剤には細胞に有害な物質がある。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、およびこれらの類似体または相同体がある。治療薬には、特に限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メソトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナム（II）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えばダウノルビシン（正式にはダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（正式にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ）、および有糸分裂阻害薬（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）がある。
本発明の結合体は、ある生物学的応答を修飾するために使用することができ、治療薬または薬物成分は古典的化学的治療薬に限定されるものではない。例えば薬物成分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでもよい。かかるタンパク質には、例えば毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベータ、血栓剤または抗血管形成剤、例えばアンギオスタチンもしくはエンドスタチン；または生物学的応答調節物質、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子がある。
抗原はまた固体支持体に結合され、これらはイムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用である。かかる固体支持体には、特に限定されないがガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンがある。
かかる治療用成分を抗体に結合させる方法は公知であり、例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）中のＡｒｎｏｎら、「癌治療における薬物の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体」；「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．１９８７）中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「薬剤送達のための抗体」；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）中のＴｈｏｒｐｅ、「癌治療における細胞毒性剤の抗体担体：総説」；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）中の「癌治療における放射能標識抗体の治療的使用の解析、結果、および将来展望」、およびＴｈｏｒｐｅら、「抗体−毒素結合体の調製と細胞毒性」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ． ６２：１１９−５８（１９８２）を参照。
あるいは、Ｓｅｇａｌの米国特許第４，６７６，９８０号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、抗体を２次抗体に結合させて抗体ヘテロ結合体を生成することができる。
治療用成分が結合したか結合していない抗体を単独でまたは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組合せて、治療薬として使用することができる。
別の実施態様において抗体は、腫瘍プレ標的化で使用するために「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合してもよく、ここで抗体−受容体結合体は患者に投与され、次に清澄化物質を使用して循環流から非結合結合体が除去され、次に細胞毒性剤（例えば放射性核種）に結合した「リガンド」（例えばアビジン）が投与される。
当業者に公知の種々の測定法を使用して、ＩＬ−３１タンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を検出することができる。測定法の例は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９８に詳細に記載されている。かかる測定法の代表的な例には：同時免疫電気泳動、放射免疫定量法、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害もしくは競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイがある。さらに抗体は、変異ＩＬ−３１タンパク質またはポリペプチドに対して野生型への結合について、スクリーニングすることができる。
ＩＬ−３１に対する抗体は、ＩＬ−３１を発現する細胞にタグ付けをするために；親和性精製によりＩＬ−３１を単離するために；ＩＬ−３１ポリペプチドの循環レベルを測定する診断測定法のために；基礎病理または疾患のマーカーとして可溶性ＩＬ−３１を検出または定量するために；ＦＡＣＳを使用する分析法において；発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗イディオタイプ抗体を作製するために；およびインビトロおよびインビボでＩＬ−３１抗体を阻止するための中和抗体またはアンタゴニストとして、使用される。適当な直接タグまたは標識物には、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などがあり；間接タグまたは標識物には、ビオチン−アビジンまたは中間体としての他の補体／抗補体対の使用がある。本明細書の抗体はまた、薬物、毒素、放射性核種などに直接または間接に結合され、これらの結合体はインビボ診断または治療用途で使用される。さらにＩＬ−３１に対する抗体またはそのフラグメントは、例えばウェスタンブロットまたは他の公知のアッセイで、変性ＩＬ−３１またはそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用される。
適当な検出可能な分子は直接または間接にポリペプチドまたは抗体に結合され、放射性核種、酵素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子などがある。適当な細胞毒性分子は直接または間接にポリペプチドまたは抗体に結合され、細菌もしくは植物毒素（例えば、ジフテリア毒素、サポニン、シュードモナス外毒素、リリン、アブリンなど）、ならびに治療用放射性核種、例えばヨード−１３１，レニウム−１８８またはイットリウム−９０がある（直接ポリペプチドまたは抗体に結合されるか、または間接にキレート成分を介して結合される）。ポリペプチドまたは抗体はまた、アドリアマイシンのような細胞毒性剤に結合してもよい。検出可能なまたは細胞毒性分子の間接的結合のために、検出可能なまたは細胞毒性分子は相補的／抗相補的対のメンバーに結合することができ、ここで他のメンバーはポリペプチドまたは抗体部分に結合される。これらの目的のために、ビオチン／ストレプトアビジンは相補的／抗相補的対の例である。
結合ポリペプチドはまたＩＬ−３１「アンタゴニスト」として作用して、インビトロおよびインビボでＩＬ−３１結合およびシグナル伝達を阻止する。これらの抗ＩＬ−３１結合ポリペプチドは、ＩＬ−３１活性またはタンパク質結合を阻害するのに有用であろう。
ポリペプチド−毒素融合タンパク質または抗体−毒素融合タンパク質は、標的化細胞または組織阻害もしくは除去（例えば癌細胞または組織を処理するために）に使用することができる。あるいはポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメインまたは受容体結合ドメイン、および標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを含む融合タンパク質が、検出可能な分子、細胞毒性分子または相補的分子を目的の細胞または組織タイプに向けるのに適している。ドメインのみの融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗相補的分子を検出可能な細胞毒性分子に結合することができる。かかるドメイン相補的分子融合タンパク質は、一般的な抗相補的−検出可能な／細胞毒性分子結合体の細胞／組織特異的送達の一般的標的化担体またはビヒクルである。
別の実施態様においてＩＬ−３１抗体−サイトカイン融合タンパク質は、標的組織（例えば、白血病、リンパ腫、肺癌、結腸癌、黒色腫、膵臓癌、卵巣癌、皮膚、血液、および骨髄の癌、またはＩＬ−３１受容体が発現される他の癌）のインビボ死滅のために使用することができる（一般的には、Ｈｏｒｎｉｃｋら、Ｂｌｏｏｄ ８９：４４３７−４７，１９９７を参照）。記載された融合タンパク質は、所望の作用部位に抗体を標的化することを可能にし、こうして抗体の局所的濃度を増大させる。適当なＩＬ−３１ポリペプチドまたは抗ＩＬ−３１抗体は、好ましくない細胞または組織（すなわち腫瘍または白血病）を標的とし、融合したサイトカインはエフェクター細胞による標的細胞溶解の改良を仲介した。この目的に適したサイトカインには、例えばインターロイキン２および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）がある。
さらに別の実施態様においてＩＬ−３１ポリペプチドまたは抗ＩＬ−３１抗体が血管細胞または組織を標的とする場合、かかるポリペプチドまたは抗体は放射性核種、特にベータ放射性核種と結合されて再狭窄を減少させる。
本発明のモノクローナル抗体は、当業者に公知のおよび本明細書に記載の種々のインビボモデル（特に限定されないが、ＮＣ／Ｎｇａモデル、Ｏｖａ皮膚モデル、慢性過敏症モデル、および慢性ハプテンモデルがある）により測定されるように、ＩＬ−３１リガンドを阻害、阻止、または中和する能力について測定することができる。
皮膚ホーミングＴ細胞と表皮ケラチン細胞の両方とも、ヒトの皮膚疾患の病理に関与するとされている。ＩＬ−３１ ｍＲＮＡとタンパク質発現は、ヒトの皮膚ホーミングＣＬＡ＋Ｔ細胞集団に限定される。従ってＩＬ−３１に対するアンタゴニスト（抗体または受容体アンタゴニストを含む）は、ＣＬＡ＋Ｔ細胞の発現を有する皮膚および表皮疾患を治療するのに有用であろう。かかる疾患には、例えばアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、薬物誘導性アレルギー反応、皮膚向性ウイルスおよびウイルス関連そう痒症、白斑、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、円形脱毛症、酒さ性ざ瘡、尋常性座瘡、結節性痒疹、および水疱性類天疱瘡がある。ＴＡＲＣやＭＤＣのようなケモカインマーカーは、ＩＬ−３１に対する中和モノクローナル抗体の作用を測定するのに有用である。実施例１５に示すように、本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体を用いる治療の阻害作用は、ＴＡＲＣとＭＤＣのレベルを追跡することにより測定される。
接触皮膚炎
アレルギー性接触皮膚炎は、皮膚と接触する抗原に対するＴ細胞性免疫応答として定義される。アレルゲン依存性Ｔ細胞応答は主に細胞のＣＬＡ＋Ｔ集団に限定されるため、皮膚炎の開始にＣＬＡ＋Ｔ細胞集団が関与していると考えられる（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ−Ｂａｂｉ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．：１８１，１９３５（１９９５）を参照）。最近のデータは、一般的な接触過敏症アレルゲンであるニッケルに応答して、記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）ＣＤ４＋ＣＬＡ＋のみ（ＣＤ８＋Ｔ細胞ではない）が増殖し１型（ＩＦＮ−）および２型（ＩＬ−５）サイトカインを産生することを見いだした。さらにニッケル特異的刺激後には、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ（記憶）またはＣＤ６９とともにＣＬＡを発現する細胞が増加し、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０を発現しＣＣＲ６は発現しない。Ｍｏｅｄ Ｈ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ５１，３２（２００４）を参照。
動物モデルでは、アレルギー性接触皮膚炎はＴ細胞依存性であり、アレルギー応答性Ｔ細胞はアレルゲン適用部位に遊走することが証明されている。一般的には、Ｅｎｇｅｍａｎ Ｔ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４，５２０７（２０００）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｔ．Ａ．とＫｕｐｐｅｒ Ｔ．Ｓ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０，１１７２（１９９３）；およびＧｏｒｂａｃｈｅｖ Ａ．Ｖ．とＦａｉｒｃｈｉｌｄ Ｒ．Ｌ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１，４５１（２００１）を参照。ＣＬＡ＋Ｔ細胞はＩＬ−３１を産生し、皮膚ケラチン細胞のＩＬ−３１刺激は炎症促進性ケモカイン（例えばＴＡＲＣおよびＭＤＣ）を誘導できるため、接触皮膚炎の病態生理にＩＬ−３１が関与しているかも知れない。接触過敏症のマウスモデルで中和ＩＬ−３１抗体を使用して。実施例８を参照。
すなわち、炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、中和、予防または阻止することにより接触過敏症の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
アトピー性皮膚炎
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は慢性の再発する炎症性皮膚疾患であり、発症数が過去１０年間に劇的に増加した。臨床的にはＡＤは、慢性の再発経過を示す非常にかゆみ性で、しばしばはく離班と丘疹により特徴付けられる。ＡＤの診断は、主に大きな臨床的知見と小さな臨床的知見に基づく。Ｈａｎｉｆｉｎ Ｊ．Ｍ．、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １３５，１５５１（１９９９）を参照。組織病理検査は、海綿状態、作用病変の過度の局所的錯角化症を示すが、過度の錯角化症を有する顕著な表皮肥厚、アカントーシス／顆粒層肥厚、およびリンパ球と豊富な肥満細胞による皮膚の血管周囲浸潤が、慢性病変の特徴である。
Ｔ細胞は組織の局所的免疫応答の開始で中心的役割を果たし、特に皮膚の脱制御された免疫応答の開始と維持において重要な役割を果たすことを証拠が示唆する。皮膚炎症性部位の浸潤性Ｔ細胞の約９０％が皮膚リンパ球関連Ａｇ（ＣＬＡ＋）を発現し、これは、内皮細胞上の誘導性接着分子であるＥ−セレクチンに結合する（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ−Ｂａｂｉ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １４，１３（２００４）の総説がある）。対照のヒトと比較してＡＤ患者中の循環ＣＬＡ＋Ｔ細胞の顕著な増加が記録されている（Ｔｅｒａｋｉ Ｙ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １４３，３７３（２０００）を参照）が、他の研究者は、ＡＤ患者の記憶ＣＬＡ＋Ｔ細胞がＣＬＡ−集団と比較して、アレルゲン抽出物に優先的に応答することを証明した（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ−Ｂａｂｉ，Ｌ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８１，１９３５（１９９５）を参照）。ヒトでは皮膚のアトピー性障害の病理発生が、ＩＬ−５やＩＬ−１３、９、１０のようなＴｈ−２型サイトカインの増加レベルを発現するＣＬＡ＋Ｔ細胞の増加に関連している。Ａｋｄｉｓ Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０，３５３３（２０００）；およびＨａｍｉｄ Ｑら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９８，２２５（１９９６）を参照。
ＮＣ／Ｎｇａマウスは６〜８週齢の頃に非特定病原体未感染（非ＳＰＦ）状態に収容すると、多くの点でヒトＡＤに似たＡＤ様病変（臨床経過と症状、組織病理、および免疫病理を含む）を自然発症する。これに対してＳＰＦ条件下で飼育したＮＣ／Ｎｇａマウスは皮膚病変を発症しない。しかし自発的皮膚病変および掻痒行動の発症は、粗イエダニ抗原の毎週の皮内注射により、ＳＰＦ施設に収容したＮＣ／Ｎｇａマウスで同期させることができる。Ｍａｔｓｕｏｋａ Ｈ．ら、Ａｌｌｅｒｇｙ ５８，１３９（２００３）を参照。従ってＮＣ／ＮｇａにおけるＡＤの出現は、ＡＤの治療のための新規治療薬の評価のために有用なモデルである。
自発性ＡＤのＮＣ／Ｎｇａモデル以外に、ＯＶＡを使用するマウスの皮膚感作もまた、感作マウスの皮膚において単球浸潤を有する抗原依存性皮膚および皮膚肥厚を誘導するためのモデルとして使用することができる。これは通常総ＩｇＥおよび特異的ＩｇＥの血清レベルの増大に一致するが、このモデルでは皮膚バリア機能不全またはそう痒症は通常発生しない。Ｓｐｅｒｇｅｌ Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． １０１：１６１４（１９９８）を参照。このプロトコールは、ＯＶＡを用いてＤＯ１１．１０ＯＶＡＴＣＲトランスジェニックマウスを感作することにより皮膚バリア脱制御とそう痒症を誘導するために修飾することができる。感作抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞の数を増やすと、皮膚の炎症レベルが増大して、目に見える引っ掻き行動や皮膚の苔癬化／はく離を誘導する。
ＮＣ／Ｎｇａ自発性ＡＤモデルとＯＶＡ皮膚ＤＯ１１．１０モデルの両方とも、ＡＤでのＩＬ−３１およびＩＬ−３１ＲＡの発現を調べるのに、ならびにＩＬ−３１の作用を阻害、緩和、または中和する本明細書に記載の抗体の能力を調べるのに使用される。本明細書の実施例９と１０を参照。ＮＣ／Ｎｇａインビボモデルを使用するある試験（実施例１０）では、ラット抗マウスＩＬ−３１抗体の投与が、引っ掻きの減少を示したが皮膚炎の減少はなかった。本明細書に記載の抗体は、皮膚炎およびそう痒性の疾患（アトピー性皮膚炎、結節性痒疹、および湿疹を含む）が引き起こす引っ掻きを阻害するのに有用である。引っ掻きを止めると皮膚炎の進行（この進行は引っ掻きに依存する）が停止するため、そう痒性の疾患（特に限定されないが、アトピー性皮膚炎、結節性痒疹、および湿疹を含む）を治療するのに、引っ掻きのみの阻害、減少、または予防が有効である。
本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体の阻害作用を測定するための追加のモデルが、Ｕｍｅｕｃｈｉ，Ｈら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５１８：１３３−１３９，２００５、およびＹｏｏ，Ｊ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２：５４１−５４９，２００５に記載されている。
すなわち、炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止して皮膚炎およびそう痒性の疾患（アトピー性皮膚炎、結節性痒疹、および湿疹を含む）の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
薬物誘導性遅延型皮膚アレルギー反応
薬物誘導性遅延型皮膚アレルギー反応は、非常に不均質であり多くの病理生物学的事象を反映する。Ｂｒｏｃｋｏｗら、Ａｌｌｅｒｇｙ ５７，４５（２００２）を参照。これらの反応に関与する免疫学的機構は抗体性または細胞性であることが証明されている。即時型薬物アレルギーでは、陽性の皮刺試験および／または２０分後の皮内試験によりＩｇＥ介在抗体応答を証明することができ、薬剤に対する非即時型反応は、最後の薬物摂取の１時間以上後に発生し、しばしばＴ細胞介在性である。非即時型Ｔ細胞介在遅延型反応は、例えばペニシリンに対する医薬品副作用を有する患者に発生する。ペニシリンに対する増殖性Ｔ細胞応答は、ペニシリンアレルギー患者からのＴ細胞の記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）ＣＬＡ＋亜集団に限定されており、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＬＡ−サブセットは増殖性応答を示さないことが証明されている。Ｂｌａｎｃａ Ｍ．、Ｌｅｙｖａ Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ Ｄｉｓ ３１，７５（２００３）を参照。遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応はマウスで人工的に再現することができ、ＤＴＨ応答の開始と持続に関与する因子の評価を可能にする。ＩＬ−３１中和抗体は、遅延型過敏症反応に有効であろう。実施例５１を参照。
中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）は、広範な水疱を有する表皮の広範なアポトーシスを特徴とする、非常にまれであるが極めて重症の薬物反応である。水疱に浸潤するリンパ球がＣＬＡ＋Ｔ細胞であり、表皮ケラチン細胞に対して細胞毒性を示すことが、研究により証明されている。Ｌｅｙｖａ Ｌ．ら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０５，１５７（２０００）、およびＮａｓｓｉｆ Ａ．、Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ Ａ．ら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１４，１２０９（２００４）を参照。ＴＥＮの動物モデルを樹立するために、マウスの表皮と毛包ケラチン細胞中のケラチン−５（Ｋ５）プロモーターの制御下でＯＶＡが発現されるトランスジェニックマウス系が作製されている。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｋ５−ＯＶＡマウス中に養子的（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ）に輸送されると、皮膚ドレイニングリンパ節中で活性化と増殖を受け、Ｋ５−ＯＶＡマウスの皮膚を標的にし、ＴＥＮを思わせる皮膚病変が出現する。Ａｚｕｋｉｚａｗａ Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３，１８７９（２００３）を参照。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することによりＴＥＮの臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
水疱性類天疱瘡
水疱性類天疱瘡は、好中球や好酸球の皮膚浸潤を有する表皮下水疱として現れる表皮下障害である。診断は、表皮と真皮−表皮ジャンクションの特異的接着タンパク質に対する抗原特異的抗体の存在と特徴とする。Ｊｏｒｄｏｎ Ｒ．Ｅ．ら、ＪＡＭＡ ２００，７５１（１９６７）を参照。ＰＢＬと皮膚水泡Ｔ細胞の分析により水疱性類天疱瘡の病理発生におけるＴ細胞の役割を分析する研究により、ＩＬ−４やＩＬ−１３のようなＴｈ２様サイトカインの発現レベルが増大したＣＬＡ＋Ｔ細胞が優勢であることがわかった。Ｔｅｒａｋｉ Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１７，１０９７（２００１）を参照。全身性コルチコステロイドによる治療後の水疱性類天疱瘡患者では、ＣＬＡ＋（ＣＬＡ−ではない）ＩＬ−１３産生細胞の頻度が大幅に低下している。コルチコステロイド治療後のＣＬＡ＋細胞の減少は、臨床的改善により引き起こされる。Ｔｅｒａｋｉ（同節中）を参照。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することにより水疱性類天疱瘡の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
円形脱毛症
円形脱毛症（ＡＡ）は、リンパ球浸潤活性が継続しているため毛包活性が停止した毛包の組織限定自己免疫疾患である。ＡＡは体中のいたるところで完全に脱毛した部分ができ（実際の毛包の喪失は起きないが）、無毛状態さえ起きる。炎症の臨床的症状は存在しないが、疾患の活性部位からの皮膚生検試料はＣＤ８＋毛包内浸潤とともに主のＣＤ４＋細胞の毛包周囲リンパ球浸潤を示す。Ｋａｌｉｓｈ Ｒ．Ｓ．とＧｉｌｈａｒ Ａ． Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ． ８，１６４（２００３）を参照。
頭皮浸潤ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球はＣＬＡを発現し、ＡＡ患者の末梢血ではＣＬＡ＋ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球の割合が正常対照の割合よりはるかに高いことが研究により証明されている。さらに重症のまたは進行性ＡＡ患者は、疾患から回復している患者と比較してはるかに高いＣＬＡ陽性率を示し、ＣＬＡ＋細胞の割合の低下は良好な臨床経過と一致している。Ｙａｎｏ Ｓ．ら、Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ． ８２，８２（２００２）を参照。従ってこれらの研究は、ＣＬＡ＋リンパ球がＡＡにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。異種移植モデルは、ＡＡの病理発生において活性化Ｔ細胞が役割を果たす可能性のあることを示した。ＡＡ患者の病変の頭皮をヌードマウスに移植すると、移植片からの浸潤性リンパ球の喪失に一致して毛が再増殖し、活性化病変Ｔ細胞をＳＣＩＤマウスに移植するとＳＣＩＤマウス上のヒト頭皮外植片に毛の喪失が移る。Ｋａｌｉｓｈ Ｒ．Ｓ．とＧｉｌｈａｒ Ａ． Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ． ８，１６４（２００３）を参照。
種々の免疫調節療法がこの疾患の通常治療の一部であるが、これらの治療法のいずれもその効果が一定しない。Ｔａｎｇ Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １２９，４００（２００３）；Ｔａｎｇ Ｌ．ら（２００４）；およびＴａｎｇ Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ４８，１０１３（２００３）を参照。しかし妥当な動物モデルでのこれらの使用は、治療効果の分子的機構を解析する手段を与える。Ｓｈａｐｉｒｏ Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ． ４，２３９（１９９９）を；Ｔａｎｇ Ｌ．ら、「新しいビンに古いワイン：げっ歯動物モデルを使用して円形脱毛症の古い治療法を復活させる」（２００３）；およびＶｅｒｍ Ｄ．Ｄ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １４，３３２（２００４）を参照。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することにより円形脱毛症の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
酒さ性ざ瘡／尋常性ざ瘡
毛包脂腺の障害である尋常性ざ瘡は青年期の最も一般的な皮膚の問題である。毛包の角質化の異常がざ瘡病変を引き起こすと考えられている。酒さ性ざ瘡は、丘疹、膿疱、嚢胞、および広範な毛細血管拡張症の存在により尋常性ざ瘡とは区別されるが、面皰（稗粒腫）は存在しない。皮脂腺からの皮脂分泌の増加が、尋常性ざ瘡の病態生理の主要な原因である。他の皮脂腺機能もまたざ瘡の発生を引き起こし、これらには、皮脂性炎症促進性脂質；局所的に産生される異なるサイトカイン；腺周囲ペプチドと神経ペプチド、例えばコルチコトロピン放出ホルモン（これは皮脂細胞により産生される）；およびサブスタンスＰ（これはざ瘡患者の健康に見える腺の近傍の神経末端で発現される）がある。Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ Ｃ．Ｃ． Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２２，３６０（２００４）を参照。
尋常性ざ瘡と酒さ性ざ瘡の病態生理はまだ不明であるが、臨床的観察と組織病理的研究は、酒さ性ざ瘡と尋常性ざ瘡の病理発生において毛包脂腺毛包の炎症が中心的であることを示唆する。酒さ性ざ瘡病変に浸潤するＴ細胞サブセットの分析についての初期の研究は、ほとんどのＴ細胞がＣＤ４を発現することを示した。Ｒｕｆｌｉ Ｔ．とＢｕｃｈｎｅｒ Ｓ．Ａ． Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １６９，１（１９８４）を参照。
ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−３１を産生し、ＩＬ−３１発現についての皮膚のＩＨＣ分析は、ＩＬ−３１が皮脂腺と汗腺で発現されることを示唆する。表皮ケラチン細胞のＩＬ−３１刺激は、細胞浸潤を引き起こす可能性のあるケモカインの発現を誘導し、これはＩＬ−３１が皮膚の炎症促進応答に寄与していることを示唆する。Ｄｉｌｌｏｎ Ｓ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５，７５２（２００４）を参照。従ってＩＬ−３１は酒さ性ざ瘡と尋常性ざ瘡の病態生理に寄与している可能性がある。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することにより尋常性ざ瘡の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
結節性痒疹
結節性痒疹は、治療の困難な難治性そう痒症により引き起こされる苔癬化または擦過結節の破裂である。慢性にこすっていると苔癬化し、引っ掻いていると線状擦過を引き起こすが、かゆくひりひりする皮膚をつまんだり穴を空けたりする人は、顕著に厚くなった丘疹（結節性痒疹として知られている）を生成し易い。結節性痒疹はアトピー性皮膚炎に特異的ではないが、この結節を有する多くの患者はまたアトピー性反応を有し、これはアレルギー性鼻炎、喘息、または食物アレルギーとして現れる。Ｔ細胞は痒疹病変の浸潤細胞の大部分を占め、これらの病変はしばしばアトピー患者の最もかゆい皮膚病変である。
カプサイシン（小感覚皮膚神経中のサブスタンスＰのような神経ペプチドの枯渇による心因性そう痒症や疼痛の知覚を妨害する抗そう痒症アルカロイド）による結節性痒疹の局所的治療は、皮膚病変の清澄化を引き起こす有効で安全な処方であることが証明された。Ｓｔａｎｄｅｒ Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ４４，４７１（２００１）を参照。カプサイシン治療を使用するＮＣ／Ｎｇａマウスの痒み応答の研究は、皮膚炎病変の自発的発生がほとんど完全に予防されることを示した。さらに血清ＩｇＥレベルの増大は大きく抑制され、カプサイシン治療されたマウスの病変皮膚中の浸潤好酸球や肥満細胞数が低下した。Ｍｉｈａｒａ Ｋ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １５１，３３５（２００４）を参照。この群からの観察は、引っ掻きは種々の免疫学的応答を増強することにより皮膚炎の進展に寄与し、従って痒み感覚および／または痒み関連引っ掻き挙動の予防がＡＤの有効な治療法である可能性を示唆する。Ｍｉｈａｒａ Ｋ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １５１，３３５（２００４）を参照。すなわち本明細書に記載された抗ＩＬ−３１抗体は、ＮＣ／Ｎｇａマウスの引っ掻き量を低下させることが証明されているため、これらはＡＤ、結節性痒疹、および他のそう痒性疾患の作用を最小にするのに有用であろう。
マウスにＩＬ−３１を慢性に与えると、そう痒症と脱毛症を誘導し次に皮膚病変が出現して、ＩＬ−３１がかゆみを誘導することを示唆する。Ｄｉｌｏｎ Ｓ．Ｒ．ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５，７５２（２００４）を参照。痒み応答の誘導におけるＩＬ−３１の関与を２つの方法で試験した：（ｉ）ＩＬ−３１処理したマウスのカプサイシン処理、および（ii）Ｔａｃ１ノックアウトマウスのＩＬ−３１処理、これは、実施例５２の神経ペプチド発現の欠如のために、傷害受容痛が大幅に低下している。さらにＩＬ−３１処理マウスにおけるＩＬ−３１の中和がそう痒症と脱毛症を予防できるかどうかを、実施例１２で試験した。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することにより結節性痒疹の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
皮膚指向性ウイルスとウイルス関連そう痒症
末梢血中の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびヘルペス病変から回収したＨＳＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は高レベルのＣＬＡを発現するが、非皮膚指向性ヘルペスウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＬＡを発現しない。Ｋｏｅｌｌｅ Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． １１０，５３７（２００２）を参照。ＨＳＶ−２反応性ＣＤ４＋Ｔリンパ球もまたＣＬＡを発現するが、そのレベルはＣＤ８＋Ｔリンパ球についてすでに観察されたものより低い。Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １９１，２４３（２００５）を参照。そう痒症もまたヘルペスウイルス感染に関連している（Ｈｕｎｇ Ｋ．Ｙ．ら、Ｂｌｏｏｄ Ｐｕｒｉｆ． １６，１４７（１９９８）を参照）が、ＨＩＶのような他のウイルス疾患もまたそう痒症皮膚病変に関連している。重症の難治性のそう痒症（しばしば紅斑丘疹皮膚病変や高好酸球症に関連している）は、ある非アトピー性ＨＩＶ感染患者にしばしば観察される症状である。Ｓｉｎｇｈ Ｆ．とＲｕｄｉｋｏｆｆ Ｄ．、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ４，１７７（２００３）、およびＭｉｌａｚｚｏ Ｆ．、Ｐｉｃｏｎｉ Ｓ．ら、Ａｌｌｅｒｇｙ ５４，２６６（１９９９）を参照。
皮膚指向性ウイルスとそう痒症およびＣＬＡ＋Ｔ細胞との関連は、ＩＬ−３１産生Ｔ細胞がウイルス感染症の病態生理に関与していることを示唆する。
すなわち炎症および／または疾患に付随する引掻きを阻害、緩和、予防または阻止することにより皮膚指向性ウイルスに関連したそう痒症の臨床的結果を改善するために、本明細書に記載の抗体によるＩＬ−３１の中和が使用される。
さらに炎症は、侵入する物質から防衛する生物による防御応答である。炎症は、多くの細胞および体液性メディエーターが関与するカスケード事象である。一方では炎症応答の抑制は宿主を免疫無防備状態にするが、そのままにすると炎症が慢性炎症性疾患（例えば、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患などを含む）、敗血症ショック、および多臓器不全を含む重症の合併症に至ることがある。重要なことは、これらの多用な疾患が共通の炎症メディエーターを有することである。炎症を特徴とする疾患集団は、ヒトの罹患率と死亡率に大きな影響を与える。従って抗炎症性抗体および結合ポリペプチド（例えば本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体および結合ポリペプチド）が、膨大なヒトおよび動物の疾患（喘息やアレルギーから自己免疫および敗血症ショックまで）について決定的に重要な治療的可能性を有することは明らかである。従って本明細書に記載の抗炎症性抗ＩＬ−３１抗体や結合ポリペプチドは、本明細書に記載のＩＬ−３１アンタゴニストとして、特に関節炎、内毒素血症、炎症性腸疾患、乾癬、関連疾患などにおいて使用することができる。
１．関節炎
骨関節炎、リウマチ様関節炎、損傷の結果としての関節炎関節などを含む関節炎は、抗炎症性抗体や結合ポリペプチド（例えば本発明の抗ＩＬ−３１抗体および結合ポリペプチド）の治療的使用が有効な一般的な炎症症状である。例えばリウマチ様関節炎（ＲＡ）は、全身に影響を与える全身性疾患であり、関節炎の最も一般的な型の１つである。これは、関節の内側の膜の炎症（これは疼痛、こわばり、暖かさ、発赤および腫張を引き起こす）である。炎症性細胞は、骨や軟骨を消化する酵素を放出する。リウマチ様関節炎の結果として、腫張した関節裏層である滑膜は骨や軟骨に侵入して傷害させ、生理学的作用の中でも特に関節破壊と重い疼痛を引き起こす。関与する関節はその形とアラインメントを失い、疼痛と運動の喪失を引き起こす。
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は特に炎症と以後の組織傷害を特徴とする免疫性の疾患であり、重症の障害と高い死亡率に至る。リウマチの関節では種々のサイトカインが局所的に産生される。２つのプロトタイプの炎症促進性サイトカインであるＩＬ−１とＴＮＦアルファが滑膜炎症と進行性関節破壊に関与する機構における重要な役割を果たすことを多くの研究が証明している。実際ＲＡ患者にＴＮＦアルファとＩＬ−１インヒビターを投与すると、臨床的および生物学的炎症症状の劇的な改善と骨侵食と軟骨破壊の放射線的兆候の低下があった。しかしこれらの有望な結果にもかかわらず、相当の割合の患者はこれらの薬物に応答せず、関節炎の病態生理に他のメディエーターも関与していることを示唆する（Ｇａｂａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ． ２（２）：１３５−１４９，２００２を参照）。これらのメディエーターの１つはＩＬ−３１であり、従ってＩＬ−３１に結合またはこれを阻害する分子（例えばＩＬ−３１抗体または結合パートナー）は、リウマチ様関節炎および他の関節炎疾患の炎症を緩和するための有用な治療薬となる可能性がある。
当該分野においてリウマチ様関節炎のいくつかの動物モデルが知られている。例えばコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルでは、マウスはヒトリウマチ様関節炎によく似た慢性炎症性関節炎を発症する。ＣＩＡはＲＡと同様の免疫学的および病理的特徴を有するため、これはヒト抗炎症性化合物候補をスクリーニングするための理想的なモデルである。ＣＩＡモデルは、発症するのに免疫応答と炎症応答の両方に依存することがよく知られているマウスのモデルである。免疫応答は、抗原としてコラーゲンに応答したＢ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の相互作用を含み、抗コラーゲン抗体の産生を引き起こす。炎症期は、これらの抗体がマウスの未変性のコラーゲンと交差反応して補体カスケードを活性化した結果としての炎症のメディエーターからの組織応答の結果である。ＣＩＡモデルを使用する利点は、病理発生の基本的機構がわかっていることである。II型コラーゲン上の関連するＴ細胞とＢ細胞エピトープが同定されており、免疫性関節炎に関連する種々の免疫学的（例えば、遅延型過敏症および抗コラーゲン抗体）および炎症性（例えば、サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解性酵素）パラメータが測定されており、従ってＣＩＡモデルで試験化合物の効力を評価するのに使用することができる（Ｗｏｏｌｅｙ，Ｃｏｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍ． ３：４０７−１９９９；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８９：９７８４−７８８、１９９２；Ｍｙｅｒｓら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６１：１８６１−７８，１９９７；およびＷａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９２：８９５５−９５９，１９９５）。
疾患の症状を軽減し経過を変えるためのＩＬ−３１ＲＡの使用を評価するために、可溶性ＩＬ−３１ＲＡ含有ポリペプチド（本明細書に記載のヘテロダイマーおよびマルチマー受容体を含む）（例えばＩＬ−３１ＲＡ−Ｆｃ４または他のＩＬ−３１ＲＡ可溶性および融合タンパク質）をこれらのＣＩＡモデルマウスへの投与を使用した。免疫応答および炎症応答を調節する分子であるＩＬ−３１はＳＡＡ（リウマチ様関節炎の病理発生に関与する）の産生を誘導するため、ＩＬ−３１アンタゴニストはインビトロとインビボでＳＡＡ活性を低下させ、ＩＬ−３１アンタゴニスト（例えば抗ＩＬ−３１抗体または結合パートナー）、ＩＬ−３１ＲＡ含有ポリペプチド（本明細書に記載のヘテロダイマーおよびマルチマー受容体を含む）（例えばＩＬ−３１ＲＡ−Ｆｃ４または他のＩＬ−３１ＲＡ可溶性および融合タンパク質）の全身性または局所的投与は、ＲＡの炎症性応答を抑制する可能性がある。他の治療薬候補には、本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、または抗ＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどがある。
２．内毒素血症
内毒素血症は、感染性物質（例えば、細菌、および他の感染症物質）、敗血症、毒素ショック症候群に起因するか、または日和見感染した免疫無防備状態患者などで一般的に発症する重症の症状である。抗炎症性抗体および結合ポリペプチド（例えば本発明の抗ＩＬ−３１抗体および結合ポリペプチド）の治療的使用は、ヒトや動物の内毒素血症の予防と治療を助けるであろう。他の治療薬候補には、本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、またはＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどがあり、内毒素血症の炎症や病原性作用を緩和する有用な治療薬となるであろう。
リポ多糖（ＬＰＳ）誘導性内毒素血症は、感染症の病理作用を引き起こす多くの炎症促進メディエーターが関与し、げっ歯動物のＬＰＳ誘導性内毒素血症は、炎症促進剤または免疫調節剤候補の薬剤学的作用を研究するための広く使用され受け入れられているモデルである。グラム陰性菌中で産生されるＬＰＳは敗血症ショックの病理発生の主要な原因物質である（Ｇｌａｕｓｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３３８：７３２，１９９１）。実際、ＬＰＳを動物に一回注射することにより実験的にショック様状態を誘導することができる。ＬＰＳに応答する細胞により産生される分子は、直接または間接に病原体を標的とすることができる。これらの生物学的応答は侵入する病原体に対して宿主を防御するが、これらが有害なこともある。すなわち重症のグラム陰性菌感染症の結果として発生する本来の免疫を大きく刺激するとサイトカインや他の分子が過剰に産生され、致死的な症状である敗血症ショック症候群（これは、発熱、高血圧、播種性血管内凝固、および多臓器不全が特徴である）になる（Ｄｕｍｉｔｒｕら、Ｃｅｌｌ １０３：１０７１−１０８３，２０００）。
ＬＰＳのこれらの毒性作用は主にマクロファージ活性化に関連し、多くの炎症性メディエーターを放出させる。中和抗ＴＮＦ抗体の投与によるＬＰＳ毒性の防止により示されるように、これらのメディエーターのうちでＴＮＦが決定的に重要な役割を果たしているようである（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８６９，１９８５）。１μｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳをＣ５７Ｂｌ／６マウスに注射すると、注射の約２時間後に循環ＩＬ−６、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１、および急性期タンパク質（例えばＳＡＡ）が大幅に増加する。これらのメディエーターに対する受動免疫により死亡率を低下させることができるため、ＬＰＳの毒性はこれらのサイトカインにより仲介されるようである（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８６９，１９８５）。敗血症ショックの予防および／または治療のための可能な免疫介入法には、抗ＴＮＦモノクローナル抗体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＬＩＦ、ＩＬ−１０、およびＧ−ＣＳＦがある。ＬＰＳは、内毒素血症の病理に寄与する可能性のある炎症促進因子の産生を誘導するため、ＩＬ−３１活性、ＳＡＡまたは他の炎症促進因子を拮抗性ＩＬ−３１ポリペプチドにより中和することは、内毒素血症ショックで見られるような内毒素血症症状を緩和するのに使用することができる。他の治療薬候補には、本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、またはＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどがある。
３ 炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
アメリカ合衆国では約５００，０００人が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹っていて、これは結腸、直腸（潰瘍性結腸炎）または両方、小腸および大腸（クローン病）を冒す。これらの疾患の病理発生は不明であるが、患部組織の慢性炎症がある。治療薬候補には、本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、または抗ＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどがあり、ＩＢＤや関連疾患の炎症や病原性作用を緩和するための有用な治療薬となるであろう。
潰瘍性結腸炎（ＵＣ）は、大腸（一般的には結腸と呼ばれる）の炎症性疾患であり、結腸の粘膜または最も内側の裏層の炎症と潰瘍を特徴とする。この炎症はしばしば結腸を空にさせ下痢が起きる。症状は緩い便と、関連する腹部けいれん、発熱および体重減少である。ＵＣの正確な原因は不明であるが、最近の研究は、体が異物として認識する体内のタンパク質に対する体の自然の防御（「自己免疫反応」）が働いていることを示唆している。これらのタンパク質はおそらく消化管中の細菌タンパク質に似ており、これらが炎症性プロセスを扇動または刺激して結腸の裏層の破壊を開始するのであろう。結腸の裏層が破壊されると、潰瘍が粘液、膿、および血液を放出する。この疾患は通常直腸部位から始まり、最終的に大腸全体に拡大する。炎症が繰り返されて小腸壁が肥厚し、直腸が傷組織になる。結腸組織の死滅または敗血症は重症の疾患で発症する。潰瘍性結腸炎の症状は重症度が変化し、その発症はゆるやかまたは急速である。多くの要因（呼吸感染症またはストレスを含む）により発作が誘引される。
現在ＵＣのために利用できる治療法は無いが、治療は結腸裏層の異常炎症プロセスを抑制することが注目されている。この疾患を治療するのにコルチコステロイド免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、およびメソトレキセート）およびアミノサリチル酸塩を含む治療法が利用できる。しかしコルチコステロイドやアザチオプリンのような免疫抑制剤の長期使用は、重大な副作用（骨の非薄化、白内障、感染、および肝臓と骨髄作用を含む）を引き起こすことがある。現在の治療法がうまくいかない患者では手術が選択肢になる。手術は、結腸全体および直腸の除去を含む。
慢性潰瘍性結腸炎を部分的に模倣できるいくつかの動物モデルがある。最も広く使用されているモデルは２，４，６−トリニトロベンスルホン酸／エタノール（ＴＮＢＳ）誘導結腸炎モデルであり、結腸の慢性炎症と潰瘍を誘導する。直腸内点滴注入によりＴＮＢＳを感受性のマウスの結腸に導入すると、結腸粘膜でＴ細胞性免疫応答が誘導され、この場合結腸の壁全体へのＴ細胞とマクロファージの濃い浸潤を特徴とする大きな粘膜炎症を引き起こす。さらにこの組織病理像は、進行性の体重減少（衰弱）、血性下痢、直腸脱、および大腸壁肥厚の臨床像を伴う（Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：５１−６２，２０００）。
他の結腸炎モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を使用し、これは血性下痢、体重減少、結腸の短縮、および好中球浸潤を有する粘膜潰瘍として現れる急性結腸炎を誘導する。ＤＳＳ誘導性結腸炎は、組織学的には粘膜固有層への炎症性細胞の浸潤が特徴であり、リンパ球肥厚、局所的陰窩傷害、および上皮潰瘍を有する。これらの変化は、上皮へのＤＳＳの毒性作用、粘膜固有層細胞の食作用、およびＴＮＦアルファとＩＦＮガンマの産生により現れると考えられる。ＤＳＳの一般的使用にもかかわらず、ヒト疾患との関連におけるＤＳＳの機構についてのいくつかの問題は未解決のままである。ＤＳＳはＳＣＩＤマウスのようなＴ細胞欠損動物で観察されるため、Ｔ細胞非依存性モデルと見なされる。
これらのＴＮＢＳまたはＤＳＳモデルへの抗ＩＬ−３１抗体または結合パートナー、可溶性ＩＬ−３１ＲＡ含有ポリペプチド（ヘテロダイマーおよびマルチマー受容体を含む）、例えばＩＬ−３１ＲＡ−Ｆｃ４または他のＩＬ−３１ＲＡ可溶性および融合タンパク質の投与は、消化管疾患の症状を軽減しその経過を変化させるためのＩＬ−３１アンタゴニストの使用を評価するのに使用することができる。ＩＬ−３１は結腸炎の炎症性応答において役割を果たし、ＩＬ−３１アンタゴニストを投与することによるＩＬ−３１活性の中和は、ＩＢＤの治療アプローチ候補である。他の治療薬候補には、本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、または抗ＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどがある。
４．乾癬
乾癬は、７００万人以上のアメリカ人が罹っている慢性の皮膚症状である。乾癬は、新しい皮膚細胞が異常に増殖して、皮膚の炎症、腫張、およびうろこ状の斑を生成させて、ここで古い皮膚が急速に剥がれる時に起きる。最も一般的な型である斑状乾癬は、銀白色のうろこがかぶさった炎症皮膚班（病変）が特徴である。乾癬は数個の班に限定されるかまたは皮膚の中程度から広範な部位まで関与し、最も一般的には頭皮、膝、肘、および胴体に現れる。これは肉眼でよく見えるが、乾癬は感染症ではない。この疾患の病理発生は患部組織の慢性炎症を含む。本発明のＩＬ−３１ＲＡポリペプチドである可溶性ヘテロダイマーとマルチマー受容体ポリペプチド、または抗ＩＬ−３１抗体もしくは結合パートナーなどは、乾癬、他の炎症性皮膚疾患、皮膚および粘膜アレルギー、および関連疾患の炎症や病原性作用を緩和するための有用な治療薬となり得る。
乾癬は、大きな不快感を引き起こす皮膚のＴ細胞性炎症性疾患である。これは治療法が無く、すべての年齢の人が罹る疾患である。乾癬はヨーロッパと北アメリカの人口の約２パーセントが罹っている。軽い乾癬患者はしばしば局所治療薬でその疾患を調節しているが、世界中で１００万人を超える患者は紫外線療法または免疫抑制療法を必要とする。残念ながら紫外線照射の危険性や多くの治療法の毒性が、これらの長期使用を制限している。さらに患者は通常乾癬が再発し、ある場合には
ＩＬ−３１は、重要な免疫学的機能を有することが知られており免疫系において役割を果たす細胞を含有する組織から単離された。ＩＬ−３１はＣＤ３＋選択された活性化末梢血細胞で発現され、Ｔ細胞活性化後にＩＬ−３１発現が増大することが証明されている。さらに実施例セクションに記載される実験の結果は、本発明のポリペプチドが、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および／または単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の前駆体の分化したものに対して影響を与えることを示唆する。造血前駆体の増殖を刺激しかつ成熟細胞を活性化する因子が一般に知られているが、増殖と活性化にはまた追加の成長因子が必要である。例えばＮＫ前駆体のコロニー形成にはＩＬ−７とスチール因子（Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）（ｃ−ｋｉｔリガンド）が必要であることが証明されている。ＩＬ−１５＋ＩＬ−２をＩＬ−７およびスチール因子（Ｓｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）と組合せるとより有効であった（Ｍｒｏｚｅｋら、Ｂｌｏｏｄ ８７：２６３２−２６４０，１９９６）。しかしＮＫ細胞および／またはＮＫ前駆体の特異的サブセットの増殖には、未同定のサイトカインが必要であるかも知れない（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ ７６：２４５１−２４３８，１９９０）。同様にＩＬ−３１は単独でまたは他のサイトカインと協同してもしくは相乗的に作用して、単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞の成長、増殖、拡大、および分化の修飾を増強させる。
本発明は、単球／マクロファージの活性化または分化を阻害する方法を提供する。単球は不完全に分化した細胞であり種々の組織に遊走して、そこで成熟してマクロファージになる。マクロファージは抗原をリンパ球に提示することにより免疫応答において重要な役割を果たし、多くのサイトカインを分泌することによりリンパ球に対する補助細胞としての補助的役割を果たす。マクロファージは、細胞外分子をインターナライズし活性化されると、細胞内微生物や腫瘍細胞を死滅させる能力が増大する。活性化マクロファージはまた、急性または局所的炎症の刺激に関与している。
あるサイトカインの受容体の組織分布は、そのサイトカインの可能な作用部位を強く示唆する。ＩＬ−３１ＲＡの発現は単球とＢ細胞中で起き、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されると発現が劇的に増加する。さらに２つの単球細胞株であるＴＨＰ−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６：１７１−１７６、１９８０）とＵ９３７（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １７：５６５−５７７、１９７６）もまたＩＬ−３１ＲＡ発現が陽性であった。
ＯＳＭＲの発現は非常に広いことが報告されている（Ｍｏｓｌｅｙら、ＪＢＣ ２７１：３２６３５−３２６４３，１９９６）。ＩＬ−３１ＲＡとＯＳＭ受容体のこの分布は、免疫応答における可溶性ＩＬ−３１の役割（特に活性化時のＴ細胞の拡張）を支持し、または特に免疫系の単球／マクロファージアームにおける役割を支持する。
すなわち本発明の具体例は、炎症性および免疫疾患または症状、例えば膵臓炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、膵臓炎、グレーブス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸および小腸癌、憩室症、自己免疫疾患、敗血症、臓器移植もしくは骨髄移植；外傷、手術または感染による炎症；アミロイドーシス；脾腫；移植片対宿主反応病；および炎症の阻害、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞もしくはリンパ系細胞、マクロファージ、Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞、ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞を含む）の増殖の低下、病原体もしくは抗原に対する免疫応答の抑制、におけるアンタゴニストとしての可溶性ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲヘテロダイマーの使用に関する。さらに活性化免疫細胞（例えば活性化ＣＤ４＋細胞およびＣＤ１９＋細胞）におけるＩＬ−３１ＲＡ発現の存在は、ＩＬ−３１ＲＡ受容体が、外来侵入者（例えば微生物および細胞破片）に対する体の免疫防御反応に関与し、炎症と癌生成中の免疫応答において役割を果たすことを示した。従ってＩＬ−３１ＲＡ受容体機能に対して作用性または拮抗性の本発明の抗体および結合パートナー（例えばＩＬ−３１）は、免疫応答および炎症を緩和するのに使用することができる。
ＩＬ−３１は、免疫系の抑制、例えばリウマチ様関節炎、多発性硬化症、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病などを含む自己免疫疾患の治療に有用である。免疫抑制はまた、組織または臓器移植および移植片の拒絶を小さくするために、そしてＴ細胞、Ｂ細胞または単球特異的白血病もしくはリンパ腫、および冒された細胞タイプの増殖を阻害することにより他の癌を治療するために使用することができる。さらにＩＬ−３１は単球、マクロファージ、および活性化Ｔ細胞を検出し、特に単球が増大しているか活性化されている症状におけるかかる自己免疫疾患の診断を助けるために使用することができる。
ＩＬ−３１ポリペプチド、ペプチド、抗体などもまた、ＩＬ−３１の循環レベルを検出するための診断系内で使用することができる。関連する実施態様において、抗体またはＩＬ−３１ポリペプチドに特異的に結合する他の物質を、循環ＩＬ−３１ポリペプチドを検出するのに使用することができる。リガンドであるポリペプチドレベルの増大または低下は、癌を含む疾患の病状を示すものである。ＩＬ−３１ポリペプチドは病理プロセスに寄与し、基礎疾患の間接的マーカーになることがある。
さらにＩＬ−３１のアンタゴニストが有用であることを当業者は理解するであろう。例えばアテローム性動脈硬化症病変において、最初の異常は単球／マクロファージの内皮細胞への局在化である。これらの病変は、ＩＬ−３１のアンタゴニストを使用して予防することができる。抗ＩＬ−３１抗体（例えばＩＬ−３１中和亜）、ＩＬ−３１ＲＡ可溶性受容体、ヘテロダイマーとマルチマー、およびＩＬ−３１結合パートナーもまた、ＩＬ−３１に対するアンタゴニストとして使用することができる。さらに単芽球性白血病は、マクロファージの生物学的生成物の放出を反映する種々の臨床的異常（例えば血清や尿中の高レベルのリゾチームおよび高熱を含む）に関連している。さらにこのような白血病は、単球細胞の異常な増大を示す。これらの作用はおそらく、例えば本明細書に記載のようなＩＬ−３１のアンタゴニストにより防止される。さらに抗ＩＬ−３１は、白血病単球細胞の死滅を指令するために本明細書に記載の分子（例えば毒性成分やサイトカイン）に結合することができる。
ＩＬ−３１はＴ細胞、マクロファージおよび単球特異的に発現され、これらの疾患には単球細胞の異常（例えば細胞増殖、機能、局在化、および活性化）が関与するため、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体は、このような単球細胞の異常を検出し、疾患の存在を示すための診断薬として使用することができる。そのような方法は、患者から生体試料（例えば血液、唾液、または生検試料）を採取し、これを正常な対照試料と比較することを含む。組織学的、細胞学的、フローサイトメトリー的、生化学的、および他の方法を使用して、患者試料中のＩＬ−３１またはＩＬ−３１を発現する細胞（すなわち単球）の相対レベルもしくは局在化を測定して、正常対照と比較することができる。ＩＬ−３１発現レベル（増加または減少）の変化または単球の数もしくは局在化の変化（細胞が通常存在する組織中での単球の増加または浸潤）を対照と比較すると、疾患を示唆するであろう。このような診断法はまた、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体に結合した放射性、蛍光性、および比色測定用タグを使用することを含む。このような方法は当該分野で公知であり、本明細書に開示されている。
ＩＬ−３１は活性化単核細胞中で発現されることが証明されており、炎症の制御に関与する。従って炎症を緩和する能力について本発明のポリペプチドを測定し使用するか、または炎症のマーカーとして使用することができる。ＩＬ−３１の炎症促進性および抗炎症性を測定する方法は当該分野で公知であり、本明細書に記載されている。さらにこれは、急性期反応物（例えば、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、α１−アンチトリプシン、およびハプトグロビン）の産生をアップレギュレートするのに関与し、ＩＬ−３１ＲＡ受容体リガンドの発現は、炎症応答に関与するリポ多糖（ＬＰＳ）のインビボ注射により増加する（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０１４４−１０１４９，２０００）。ＳＡＡのような急性期タンパク質の産生は、炎症が有効である短期生存機構と見なされるが、急性期タンパク質の長期間の維持が慢性炎症になり、ヒトの健康に有害となる。総説については、Ｕｈｌａｒ，ＣＭとＷｈｉｔｅｈｅａｄ，ＡＳ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６５：５０１−５２３，１９９９とＢａｕｍａｎｎ Ｈ．とＧａｕｌｄｉｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １５：７４−８０、１９９４を参照。さらに急性期タンパク質ＳＡＡは、いくつかの慢性炎症性疾患の病理発生に関与し、アテローム性動脈硬化症やリウマチ様関節炎に関与し、アミロイドーシスで沈着するアミロイドＡタンパク質の前駆体である（Ｕｈｌａｒ，ＣＭとＷｈｉｔｅｈｅａｄ、前述）。すなわちＩＬ−３１のようなリガンドが炎症促進分子として作用しＳＡＡの産生を誘導する場合、炎症性疾患およびリガンドにより誘導される急性期応答タンパク質が引き起こす他の疾患を治療するのにアンタゴニストが有用であろう。そのようなアンタゴニストは本発明により提供される。例えば炎症を緩和する方法は、炎症を有する哺乳動物に炎症を緩和するのに充分な量のＩＬ−３１または抗ＩＬ−３１抗体（例えば中和抗体）の組成物を投与することを含む。さらに炎症を有する哺乳動物の炎症応答を抑制する方法は：（１）血清アミロイドＡタンパク質のレベルを測定し；（２）本明細書に記載のＩＬ−３１ポリペプチドまたは抗ＩＬ−３１抗体を許容される薬剤担体中に含む組成物を投与し；（３）血清アミロイドＡタンパク質の投与後のレベルを測定し；（４）工程（１）の血清アミロイドＡタンパク質のレベルを工程（３）の血清アミロイドＡタンパク質のレベルと比較する方法を含み、ここで血清アミロイドＡタンパク質レベルの増加の欠如または低下は炎症応答の抑制を示す。
ＩＬ−３１と同様に、ＩＬ−３１ＲＡ受容体ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの組織分布の解析では単核細胞と前立腺細胞中で最も高く、活性化単球、活性化ＣＤ４＋、活性化ＣＤ８＋、および活性化ＣＤ３＋細胞中で増大していることを示した。従ってＩＬ−３１ＲＡ受容体はまた、炎症応答および免疫応答を誘導するのに関与している。すなわち本発明の具体例は、膵臓炎、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、膵臓癌、膵臓炎、グレーブス病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、結腸および小腸癌、憩室症、自己免疫疾患、敗血症、臓器移植もしくは骨髄移植；外傷、手術または感染による炎症；アミロイドーシス；脾腫；移植片対宿主反応病；および炎症の阻害、免疫抑制、造血細胞、免疫細胞、炎症細胞もしくはリンパ系細胞、マクロファージ、Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞、ＣＤ４＋とＣＤ８＋細胞を含む）の増殖の低下、病原体もしくは抗原に対する免疫応答の抑制、におけるアンタゴニストとしてのＩＬ−３１抗体、およびＩＬ−３１、ならびに可溶性ＩＬ−３１ＲＡ受容体ヘテロダイマーの使用に関する。さらに活性化免疫細胞（例えば活性化ＣＤ３＋、単球、ＣＤ４＋およびＣＤ１９＋細胞）におけるＩＬ−３１ＲＡ受容体の存在とＩＬ−３１発現は、ＩＬ−３１ＲＡ受容体が、外来侵入者（例えば微生物および細胞破片）に対する体の免疫防御反応に関与し、炎症と癌生成中の免疫応答において役割を果たすことを示した。従ってＩＬ−３１ＲＡ受容体機能に対して作用性または拮抗性の本発明のＩＬ−３１およびＩＬ−３１抗体は、免疫応答および炎症を修飾するのに使用することができる。
ＩＬ−３１ＲＡ受容体ポリペプチドに結合するＩＬ−３１ポリペプチドおよびその抗体は、以下をするのに有用である。
１）急性炎症、外傷の結果としての炎症、組織損傷、手術、敗血症または感染、および炎症性疾患、例えば喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性結腸炎、脾腫、リウマチ様関節炎、再発性作用炎症エピソード（例えば結核）の治療、およびアミロイドーシスおよびアテローム性動脈硬化症、キャッスルマン病、喘息、および急性期応答の誘導が関連する他の疾患の治療において、ＩＬ−３１ＲＡ含有受容体を介するシグナル伝達を拮抗または阻止するために、
２）免疫細胞中のシグナル伝達を防止または阻止するために自己免疫疾患、例えばＩＤＤＭ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、およびＩＢＤの治療においてＩＬ−３１ＲＡ受容体を介するシグナル伝達を拮抗または阻止するために（Ｈｕｇｅｓ Ｃら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：３３１９−３３２５，１９９４）。あるいは不要な免疫細胞を枯渇させて自己免疫疾患を治療するために、ＩＬ−３１に対する抗体、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をアンタゴニストとして使用することもできる。喘息、アレルギーおよび他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するためにまたは邪魔な細胞を枯渇させるため、例えば抗ＩＬ−３１抗体、可溶性ＩＬ−３１ＲＡ受容体可溶性受容体、またはＩＬ−３１ＲＡ／ＣＲＦ２−４ヘテロダイマーに対するモノクローナル抗体を用いて治療される。本発明のポリペプチドおよび抗体を使用してＩＬ−３１ＲＡを介するシグナル伝達を阻止または阻害することは、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患に有利である。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌に有利である。ＩＬ−３１ＲＡは癌のモノクローナル抗体療法の標的として作用し、拮抗性のモノクローナル抗体が癌増殖を阻害し免疫性死滅を標的とする（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＰとＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６：１０１５−１０１６，１９９８）。可溶性ＩＬ−３１ＲＡ受容体モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、およびマルチマーに対するモノクローナル抗体もまた、神経障害、例えば糸球体硬化症、膜性神経症、アミロイドーシス（これは特に腎臓を冒す）、腎性動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の繊維増殖性疾患、ならびにＳＬＥ、ＩＤＤＭ、II型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、腎腫瘍および他の疾患が引き起こす腎機能不全を治療するのに有用である。
３）ＩＤＤＭ、ＭＳ、ＳＬＥ、重症筋無力症、リウマチ様関節炎、およびＩＢＤのような自己免疫疾患の治療において、ＩＬ−３１ＲＡ受容体を介するシグナル伝達を作動または開始するために。ＩＬ−３１はリンパ球または他の免疫細胞にシグナルを与えて、分化させるか、増殖を変化させるか、または自己免疫を緩和するサイトカインもしくは細胞表面タンパク質の産生を変化させる。具体的にはサイトカイン分泌の交互パターンに対するＴヘルパー細胞の応答を調節すると、自己免疫応答からそらせて疾患を緩和させる（Ｓｍｉｔｈ ＪＡら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：４８４１−４８４９，１９９８）。同様にＩＬ−３１は、喘息、アレルギー、およびアトピー性疾患に関与する免疫細胞にシグナルを与え、枯渇させ、およびそらせるのに使用される。ＩＬ−３１ＲＡ受容体を介するシグナル伝達はまた、膵臓、腎臓、下垂体、および神経細胞の疾患にも有効である。ＩＤＤＭ、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および膵臓癌に有効である。ＩＬ−３１ＲＡは膵臓癌のモノクローナル抗体治療の標的となり、シグナル伝達ｍＡｂが癌増殖を阻害し免疫性死滅を標的化する（Ｔｕｔｔ，ＡＬら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：３１７５−３１８５，１９９８）。同様に本発明のＩＬ−３１ＲＡ含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体（例えば中和抗体）を用いて、Ｔ細胞特異的白血病、リンパ腫、形質細胞悪液質（例えば多発性骨髄腫）および癌が治療される。
本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体、可溶性ＩＬ−３１ＲＡ受容体モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、およびマルチマーポリペプチドは、自己免疫疾患、アトピー性疾患、ＮＩＤＤＭ、膵臓炎、および腎機能不全の治療におけるＩＬ−３１ＲＡ受容体リガンド活性を中和／阻止するのに使用することができる。
抗ＩＬ−３１抗体および可溶性ＩＬ−３１ＲＡ含有受容体は、ＩＬ−３１のアンタゴニストとして有用である。かかる拮抗作用は、その天然のリガンドの直接中和または結合により行われる。ＩＬ−３１を体内の異なる組織、臓器、および細胞に輸送するために拮抗的使用以外に、可溶性受容体はＩＬ−３１に結合し担体または担体タンパク質として作用する。従って可溶性受容体は、特定の部位（例えば、組織、特異的免疫細胞、単球、または腫瘍）に可溶性受容体−リガンド複合体を向かわせる分子、ポリペプチド、または化学成分に融合または結合することができる。例えば急性感染またはある癌には、炎症および局所的急性期応答タンパク質の誘導が有効である。すなわち本明細書に記載の可溶性受容体または本発明の抗体は、炎症促進ＩＬ−３１リガンドの作用を特異的に指令するのに使用することができる。Ｃｏｓｍａｎ，Ｄ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ５：９５−１０６，１９９３；およびＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，Ｒ．Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ９：４９７−５１３，２０００を参照。
一般に投与されるＩＬ−３１ポリペプチド（またはＩＬ−３１ＲＡ類似体または融合タンパク質）の量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および過去の病歴に依存して変動する。典型的には約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤の量／患者の体重）の範囲の用量のＩＬ−３１ポリペプチドを受容者に与えることが好ましいが、状況によりそれより少ない量または多い量が投与される。当業者は、かかる投与量およびその調整を当該分野で公知の方法を使用して容易に決定することができる。
被験体へのＩＬ−３１ポリペプチドの投与は、局所的、吸入、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸内、くも膜下、局所的カテーテルによる潅流、または直接病変内注入でもよい。注入により治療用タンパク質を投与する時は、投与は連続注入または単回もしくは多回大型丸薬投与でもよい。
追加の投与経路には、経口、粘膜、肺、および経皮がある。経口投与は、ポリエステル微小球、ゼイン微小球、プロテイノイド微小球、ポリシアノアクリレート微小球、および脂質ベースの系に適している（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＳａｎｄｅｒｓとＨｅｎｄｒｅｎ（編）、２５５〜２８８頁（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）中のＤｉＢａｓｅとＭｏｒｒｅｌ、「マイクロカプセル化タンパク質の経口投与」を参照）。鼻内投与の実行性はインスリン投与のような方法により例示される（例えば、ＨｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅとＩｌｌｕｍ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ． ３５：１９９（１９９９）を参照）。ＩＬ−３１を含有する乾燥または液体粒子を調製し、乾燥粉末ディスエンサー、液体エアゾル発生器、またはネブライザーを使用して吸入することができる（例えば、ＰｅｔｉｔとＧｏｍｂｏｔｚ，ＴＩＢＴＥＣＨ １６：３４３（１９９８）；Ｐａｔｔｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ． ３５：２３５（１９９９））。このアプローチは、ＡＥＲＸ糖尿病管理システムに（これはエアゾル化インスリンを肺に送るハンディ―タイプの電子吸入器である）より例示される。低周波数超音波を使用して４８，０００ｋＤａという大きなタンパク質が皮膚を通して治療濃度で投与されることが研究で証明されており、これは経皮投与の実効性を例示する（Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：８５０（１９９５））。エリスロポエチンを使用する経皮投与は、ＩＬ−３１結合活性を有する分子を投与するための別の手段となる（Ｐｏｔｔｓら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：２１３（１９９７））。
ＩＬ−３１結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む医薬組成物は公知の方法により製剤化して、薬剤として有用な組成物を調製することができ、ここで治療用タンパク質は医薬として許容される担体と混合される。受容患者により投与が許容される場合、組成物は「医薬として許容される担体」と言われる。無菌のリン酸緩衝化生理食塩水は医薬として許容される担体の１つの例である。他の適当な担体は当業者に公知である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）を参照。
治療目的に、ＩＬ−３１結合活性を有する分子と医薬として許容される担体が治療的有効量で患者に投与される。ＩＬ−３１結合活性を有するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと医薬として許容される担体との組合せは、投与される量が生理学的に意味がある場合「治療的有効量」で投与されると言われる。ある物質の存在が受容患者の生理に検知可能な変化を引き起こす場合、生理学的意味がある。例えば炎症を治療するのに使用される物質は、その存在が炎症応答の少なくとも一部を緩和する場合、生理学的に意味がある。
ＩＬ−３１（またはＩＬ−３１類似体もしくは融合タンパク質）を含む医薬組成物は、液体型、エアゾル型、または固体型で提供することができる。注射溶液、エアゾル剤、液滴、トポロジカル溶液、および経口懸濁液により例示される。固体型の例には、カプセル剤、錠剤、および制御放出型がある。後者の型は、ミニ浸透圧ポンプおよびインプラントにより例示される（Ｂｒｅｍｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：２３９（１９９７）；ＲａｎａｄｅとＨｏｌｌｉｎｇｅｒ（編）、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、９５〜１２３頁（シーアールシー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９５）中のＲａｎａｄｅ、「薬剤送達におけるインプラント」；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＳａｎｄｅｒｓとＨｅｎｄｒｅｎ（編）、２３９〜２５４頁（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７中のＢｒｅｍｅｒら、「注入ポンプによるタンパク質送達」；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＳａｎｄｅｒｓとＨｅｎｄｒｅｎ（編）、９３〜１１７頁（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７中のＹｅｗｅｙら、「制御放出注入可能インプラントからのタンパク質の送達」）。他の固体型には、クリーム剤、ペースト剤、他のトポロジカル投与剤などがある。
本明細書に開示の抗ＩＬ−３１抗体はまた免疫リポソームとして調製される。抗体を含有するリポソームは当該分野で公知の方法により調製され、例えばＥｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号と４，５４４，５４５号に記載されている。循環時間が延長されたリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは規定の孔径のフィルターから抽出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のようにジスルフィド交換反応によりリポソームに結合することができる。リポソーム内に化学療法剤（例えばドキソルビシン）を随時含有させてもよい。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９）１４８４（１９８９）を参照。
抗体の治療用調製物は、所望の程度の純度を有する抗体に随時の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ’ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合して、凍結乾燥調製物または水溶液の形で保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量と濃度で受容者に非毒性なものであり、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸の緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；糖、例えばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩生成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｕ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばツイーン（登録商標）、プルロニックス（Pluronics）（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。
本明細書の調製物はまた、治療される具体的な適応症の必要に応じて２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、ＩＬ−３１に結合する抗体をある調製物中にさらに与えることが好ましい。あるいは組成物はさらに、化学療法剤またはサイトカインを含有してもよい。このような分子は、目的に有効な量で混合物中に適切に存在する。
活性成分はまた、コアセルベート化法または界面重合法により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬剤送達システム（例えばリポソーム、アルブミン微小球、微小エマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕捉されてもよい。このような方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌ろ過膜でろ過することにより容易に達成される。
持続放出調製物を調製してもよい。持続放出調製物の適当な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスがあり、このマトリックスは成型物、例えばフィルムまたはマイクロカプセルでもよい。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸グリコール酸共重合体、例えばルプロンデポ（Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ）（登録商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドからなる注射用微小球）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、いくつかのヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。封入された抗体は長期間体内に留まるが、これらは３７℃で水分に暴露されるため変性または凝集し、生物活性が喪失し免疫原性が変化する可能性がある。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な方法を工夫することができる。例えば凝集機構がチオ−ジスルフィド結合交換による分子内Ｓ−Ｓ結合形成によることがわかれば、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液を凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、そして具体的なポリマーマトリックス組成物を開発することにより行われる。
リポソームは、静脈内、腹腔内、くも膜下、筋肉内、皮下、または経口投与、吸入、または鼻内投与により、被験体に治療用ポリペプチドを投与する１つの手段を与える。リポソームは、水性コンパートメントを囲む１つまたはそれ以上の脂質二重層からなる微小胞である（一般的には、Ｂａｋｋｅｒ−Ｗｏｕｎｄｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １２（増刊１）：Ｓ６１（１９９３）、Ｋｉｎ，Ｄｒｕｇｓ ４６：６１８（１９９３）、およびＲａｎａｄｅとＨｏｌｌｉｎｇｅｒ（編）、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、３〜２４頁（シーアールシー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９５）中のＲａｎａｄｅ、「リポソームを担体として使用する部位特異的薬剤送達」を参照）。リポソームは組成が細胞膜に似ており、その結果リポソームは安全に投与され生体分解性である。調製法に依存して、リポソームはユニラメラまたはマルチラメラであり、直径が０．０２μｍ〜１０μｍ以上の大きさで変動する。リポソーム中に種々の物質を封入することができる：疎水性物質は二重層中で分配され、親水性物質は内部の水性スペース内で分配される（例えば、Ｍａｃｈｙら、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ、１９８７）、およびＯｓｔｒｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ． ４６：１５７６（１９８９）を参照）。さらに、リポソームの大きさ、二重層の数、脂質組成、ならびにリポソームの荷電と表面特性を変化させることにより、封入された物質の治療的利用可能性を制御することができる。
リポソームは実質的にすべてのタイプの細胞に吸着し、次に封入された物質をゆっくり放出することができる。あるいは吸収されたリポソームは食作用性の細胞によりエンドサイトーシスを受ける。エンドサイトーシスの後に、リポソーム脂質のリソソーム内分解と封入物質の放出が起きる（Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ４４６：３６８（１９８５））。静脈内投与後、小さなリポソーム（０．１〜１．０μｍ）は典型的には、主に肝臓や脾臓中に存在する網内系の細胞により取り込まれ、ここで３．０μｍより大きいリポソームは肺に沈着される。網内系の細胞による小さいリポソームの選択的取り込みは、化学療法剤をマクロファージや肝臓の腫瘍に送達するのに使用されている。
網内系は、リポソーム粒子の大量投与による飽和または薬理学的手段による選択的マクロファージ不活性化を含むいくつかの方法により回避することができる（Ｃｌａｓｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８０２：４２８（１９８４））。さらにリポソーム膜への糖脂質またはポリエチレングリコール誘導体化リン脂質の取り込みが、網内系による取り込みの顕著な低下を引き起こすことが証明されている（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６８：１３３（１９９１）；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１５０：９（１９９３））。
リポソームはまた、リン脂質組成を変化させることにより、または受容体またはリガンドをリポソーム内に挿入することにより、特定の細胞または臓器を標的にするように調製することができる。例えば高含量の非イオン性界面活性剤を用いて調製されたリポソームは肝臓を標的にするように使用することができる（Ｈａｙａｋａｗａら、日本特許０４−２４４，０１８号；Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． １６：９６０（１９９３））。これらの調製物は、ダイズホスファチジルコリン、α−トコフェロール、およびエトキシ化硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−６０）をメタノール中で混合して、真空下で混合物を濃縮し、次に混合物を水で復元することにより調製される。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とダイズ由来ステリルグルコシド混合物（ＳＧ）とコレステロール（Ｃｈ）とのリポソーム調製物もまた、肝臓を標的にすることが証明されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． ２０：８８１（１９９７））。
あるいは種々の標的化リガンド（例えば抗体、抗体フラグメント、炭水化物、ビタミン、及び輸送タンパク質）をリポソームの表面に結合することができる。例えばリポソームは分岐型ガラクトシル脂質誘導体を用いて修飾してアシアロ糖タンパク質（ガラクトース）受容体（これは肝細胞の表面でのみ発現される）を標的にすることができる（ＫａｔｏとＳｕｇｉｙａｍａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １４：２８７（１９９７）；Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． ２０：２５９（１９９７））。同様にＷｕら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：７７２（１９９８）は、アシアロフェツインでリポソームを標識するとリポソーム半減期が短くなり、肝細胞によるアシアロフェツイン標識リポソームの取り込みが大幅に増大することを証明した。一方分岐型ガラクトシル脂質誘導体を含むリポソームの肝臓内蓄積は、アシアロフェツインの前注入により阻害することができる（Ｍｕｒａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． ２０：２５９（１９９７））。ポリアコニチル化（ｐｏｌｙａｃｏｎｉｔｙｌａｔｅｄ）ヒト血清アルブミンＬＰＳは、リポソームを肝細胞に標的化するための別のアプローチである（Ｋａｍｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１１６８１（１９９７））。さらにＧｅｈｏら、米国特許第４，６０３，０４４号は、肝細胞指令リポソーム小胞送達系を記載し、これは肝臓の特殊化代謝細胞に関連する肝胆道受容体に対する特異性を有する。
ＩＬ−３１結合活性を有するポリペプチドは、標準的タンパク質マイクロカプセル化法を使用してリポソーム内に封入することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ３１：１０９９（１９８１）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０：１８５３（１９９０）、およびＣｏｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６３：９５（１９９１）、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、第２版、第III巻、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（編）、３１７頁（シーアールシー・プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３）中のＡｌｖｉｎｇら、「免疫学的研究におけるリポソームの調製と使用」、Ｗａｓｓｅｆら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４９：１２４（１９８７）を参照）。上記したように治療的に有用なリポソームは種々の化合物を含有する。例えばリポソームはポリ（エチレングリコール）の脂質誘導体を含有してもよい（Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１５０：９（１９９３））。
高レベルの治療用タンパク質を維持するために、分解性ポリマー微小球が設計されている。微小球は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、非生体分解性酢酸エチルビニルポリマーのような分解性ポリマーから調製され、ここでタンパク質はポリマー内に捕捉される（ＧｏｍｂｏｔｚとＰｅｔｔｉｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：３３２（１９９５）；「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＲａｎａｄｅとＨｏｌｌｉｎｇｅｒ（編）、５１〜９３頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）中のＲａｎａｄｅ、「薬剤送達におけるポリマーの役割」；「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、ＳａｎｄｅｒｓとＨｅｎｄｒｅｎ（編）、４５〜９２頁（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）中のＲｏｓｋｏｓとＭａｓｋｉｅｗｉｃｚ、「タンパク質送達における分解性制御放出系」；Ｂａｒｔｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１６１（１９９８）；ＰｕｔｎｅｙとＢｕｒｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１５３（１９９８）；Ｐｕｔｎｅｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：５４８（１９９８））。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）被覆ナノ粒子はまた、治療用タンパク質の静脈内投与のための担体を与える（例えば、Ｇｒｅｆら、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１６７（１９９７）を参照）。
他の剤形も当業者により工夫され、例えばＡｎｓｅｌとＰｏｐｏｖｉｃｈ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、第５版（ＬｅａとＦｅｂｉｇｅｒ １９９０）、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）、およびＲａｎａｄｅとＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）に記載されている。
例えば医薬組成物は、ＩＬ−３１ポリペプチドまたはＩＬ−３１アンタゴニスト（例えばＩＬ−３１ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメント）を含有する容器を含むキットとして供給される。治療用ポリペプチドは、単回または多回投与用の注射溶液の形で、または注射前に復元される無菌粉末の形で提供される。あるいはこのようなキットは、治療用ポリペプチドの投与のための乾燥粉末ディスペンサー、液体エアゾル剤発生器、またはネブライザーを含んでよい。
ある態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；およびｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。ある実施態様においてこの抗体は、ＩＬ−３１（配列番号２）とＩＬ−３１ＲＡ（配列番号５）との相互作用を中和する。他の実施態様において抗体は、（ａ）マウスモノクローナル抗体、（ｂ）（ａ）から得られるヒト化抗体、または（ｃ）抗体フラグメント、または（ｄ）ヒトモノクローナル抗体である。他の実施態様において抗体はさらに、放射性核種、酵素、基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、または毒素を含む。他の実施態様において抗体はさらに、ＰＥＧ化を含む。他の実施態様において抗体は中和抗体を含む。他の実施態様において哺乳動物への抗体の投与は、ポリペプチドの炎症促進活性を阻害、予防、緩和、または阻止する。他の実施態様において哺乳動物への抗体の投与は、ポリペプチドの炎症促進活性に関連する引っ掻きおよび皮膚炎を阻害、予防、緩和、または阻止する。
他の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；およびｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
他の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；およびｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
他の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；およびｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
他の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、ＡＴＣＣ特許物寄託名を有するアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；およびｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
他の態様において、配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供され、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７４を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。ある実施態様において抗体は中和抗体である。ある実施態様において哺乳動物への抗体の投与は、ポリペプチドの炎症促進活性を阻害、予防、緩和、または阻止する。ある実施態様において哺乳動物への抗体の投与は、ポリペプチドの炎症促進活性に関連する引っ掻きと皮膚炎を阻害、予防、緩和、または阻止する。
別の態様において本発明は、炎症が緩和される本明細書に記載のある量のＩＬ−３１抗体を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の炎症を緩和する方法を提供する。
別の態様において本発明は、炎症が緩和するように哺乳動物にＩＬ−３１のアンタゴニストを投与することを含む、ＩＬ−３１が役割を果たす炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、ここで当該アンタゴニストは、（ｉ）ＩＬ−３１ＲＡのもしくはポリペプチドのポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチド、または（ii）ＩＬ−３１ＲＡのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを含み、ＩＬ−３１の炎症活性が緩和されることを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において疾患はそう痒症を含む炎症性疾患である。ある実施態様において疾患はアトピー性皮膚炎である。ある実施態様において疾患は結節性痒疹である。
別の態様において本発明は、そう痒症が緩和するように哺乳動物にＩＬ−３１のアンタゴニストを投与することを含む、ＩＬ−３１が役割を果たす哺乳動物のそう痒症の作用を緩和、阻害、または予防する方法であって、ここで該アンタゴニストは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドもしくは当該ポリペプチドのポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチドを含み、ＩＬ−３１のそう痒活性が緩和されることを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において哺乳動物の疾患はアトピー性皮膚炎である。ある実施態様において哺乳動物の疾患は皮膚炎である。ある実施態様において抗体は本明細書に記載されたものである。
別の態様において本発明は、哺乳動物の痒みが緩和するように哺乳動物にＩＬ−３１のアンタゴニストを投与することを含む、ＩＬ−３１が役割を果たす哺乳動物のそう痒症の作用を緩和、阻害、または予防する方法であって、ここで当該アンタゴニストは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドもしくは当該ポリペプチドのポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチドを含み、ＩＬ−３１の引っ掻き活性が緩和されることを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において哺乳動物の疾患はアトピー性皮膚炎である。ある実施態様において哺乳動物の疾患は皮膚炎である。ある実施態様において抗体は本明細書に記載されたものである。
別の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、ａ）クローン２９２．１２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５）；ｂ）クローン２９２．６３．５．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９）；ｃ）クローン２９２．７２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６）；ｄ）クローン２９２．８４．１．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１）；およびｅ）クローン２９２．１１８．６．４（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０）から選択されるハイブリドーマクローン名番号により産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
別の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、ａ）クローン２９４．３５．２．６．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２）；ｂ）クローン２９４．１４４．３．５（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３）；ｃ）クローン２９４．１５４．５．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５）；およびｄ）クローン２９２．１６３．２．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１）から選択されるハイブリドーマクローン名番号により産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
別の態様において本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合に競合することができるモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を提供し、ここでポリペプチドは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；およびｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる。
別の態様においてハイブリドーマが提供され、ここでハイブリドーマはアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；およびｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有する。
別の態様において本発明は、ＩＬ−３１ポリペプチドに対する抗体を産生する方法であって、（ａ）９〜１４１アミノ酸からなるポリペプチド（ここでポリペプチドはアミノ酸番号２４（Ｓｅｒ）からアミノ酸番号１６４（Ｔｈｒ）までの配列番号２中のアミノ酸残基の連続的配列と同一である）；上記で開示したポリペプチド；（ｃ）アミノ酸番号３８〜５２からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｄ）アミノ酸番号８３〜９８からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｅ）アミノ酸番号１０４〜１１７からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｆ）アミノ酸番号１３７〜１５２からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｇ）アミノ酸番号３８〜１５２からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｈ）アミノ酸番号２４〜１６４からの配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）アミノ酸番号３８〜５２からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｄ）アミノ酸番号８５〜９８からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｅ）アミノ酸番号１０４〜１１８からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｆ）アミノ酸番号１４１〜１５７からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｇ）アミノ酸番号３８〜１５７からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｈ）アミノ酸番号２４〜１６３からの配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉ）配列番号２または配列番号１１のホップ／ウッズ（Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ）親水性プロフィール（このプロフィールはスライドする６残基ウィンドウに基づき、埋まったＧ、Ｓ、およびＴ残基と露出したＨ、Ｙ、およびＷ残基は無視される）に従う抗原性エピトープを含むポリペプチド、よりなる群から選択されるポリペプチドを動物に接種し（ポリペプチドは動物の免疫応答を誘発して抗体を産生させる）；そして抗体を動物から単離することを特徴とする方法を提供する。
別の態様において本発明は、上記方法により産生される抗体（例えば中和抗体）であって、配列番号２または配列番号１１のポリペプチドに結合する抗体を提供する。ある実施態様において上記で開示した抗体は配列番号２または配列番号１１に示すポリペプチドに特異的に結合する。
別の態様において本発明は、生体試料中のＩＬ−３１の存在を検出する方法であって、（ａ）生体試料に上記抗体または抗体フラグメントを接触させる工程（ここで接触は抗体または抗体フラグメントの生体試料への結合を可能にする条件下で行われる）と、（ｂ）結合した抗体または結合した抗体フラグメントの任意のものを検出する工程とを含む方法を提供する。
別の態様において本発明は、癌細胞を死滅させる方法であって、患者から癌細胞を含有する組織もしくは生体試料をエクスビボで得て、またはインビボで癌細胞を同定し；本明細書に開示した方法によりポリペプチドを産生し；医薬として許容されるビヒクル中でポリペプチドを調製し；そして患者にポリペプチドを投与するかまたは癌細胞にポリペプチドを暴露させることを含んでなり、ここでポリペプチドは細胞を死滅させることを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において癌細胞を死滅させる方法は上記で開示したものであり、ここでポリペプチドはさらに毒素に結合される。ある実施態様において抗体は上記で開示したものであり、ここで抗体は、（ａ）ポリクローナル抗体、（ｂ）マウスモノクローナル抗体、（ｃ）（ｂ）から得られるヒト化抗体、（ｄ）抗体フラグメント、および（ｅ）ヒトモノクローナル抗体よりなる群から選択される。
別の態様において本発明は、（ａ）配列番号２に示す残基３８（Ｖａｌ）〜１５２（Ｌｅｕ）からのポリペプチド；（ｂ）配列番号２に示す残基２７（Ｌｅｕ）〜１６４（Ｔｈｒ）からのポリペプチド；（ｃ）配列番号２に示す残基２４（Ｔｈｒ）〜１６４（Ｔｈｒ）からのポリペプチド；および（ｄ）配列番号２に示す残基１（Ｍｅｔ）〜１６４（Ｔｈｒ）からのポリペプチドよりなる群から選択されるアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを提供する。別の実施態様において抗体は上記で開示したものであり、抗体はさらに、放射性核種、酵素、基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、または毒素を含む。
別の態様において本発明は、造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法であって、可溶性サイトカイン受容体の非存在下で培養した骨髄または末梢血細胞と比較して、骨髄または末梢血細胞中の造血細胞の増殖または分化を低下させるのに充分な量の本明細書に開示された抗体を含む組成物とともに、骨髄または末梢血細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。ある実施態様において造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法は本明細書に開示されたものであり、ここで造血細胞と造血細胞前駆体はリンパ系細胞である。ある実施態様において造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法は本明細書に開示されたものであり、ここでリンパ系細胞はマクロファージまたはＴ細胞である。
別の態様において本発明は、炎症を緩和するのに充分な量の本明細書に開示された抗体の組成物を炎症を有する哺乳動物に投与することを含んでなる、ＩＬ−３１誘導性炎症を緩和する方法を提供する。
別の態様において本発明は、炎症を有する哺乳動物の炎症性応答を抑制する方法であって、（１）炎症性分子のレベルを測定し；（２）医薬として許容されるビヒクル中の本明細書に開示の抗体を含む組成物を投与し；（３）炎症性分子の投与後のレベルを測定し；（４）工程（１）の炎症性分子のレベルを工程（３）の炎症性分子のレベルと比較することを含んでなり、ここで炎症性分子レベルの増大の欠如または低下は炎症応答が抑制されていることを示すことを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において抗体は上記で開示したものであり、抗体はさらに、放射性核種、酵素、基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、または毒素を含む。
別の態様において本発明は、造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法であって、可溶性サイトカイン受容体の非存在下で培養した骨髄または末梢血細胞と比較して、骨髄または末梢血細胞中の造血細胞の増殖または分化を低下させるのに充分な量の本明細書に開示された抗体を含む組成物とともに、骨髄または末梢血細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。ある実施態様において造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法は本明細書に開示されたものであり、ここで造血細胞と造血細胞前駆体はリンパ系細胞である。ある実施態様において造血細胞および造血細胞前駆体のＩＬ−３１誘導性増殖または分化を阻害する方法は本明細書に開示されたものであり、ここでリンパ系細胞はマクロファージまたはＴ細胞である。
別の態様において本発明は、炎症を緩和するのに充分な量の本明細書に開示された抗体の組成物を炎症を有する哺乳動物に投与することを含んでなる、ＩＬ−３１誘導性炎症を緩和する方法を提供する。
別の態様において本発明は、炎症を有する哺乳動物の炎症性応答を抑制する方法であって、（１）炎症性分子のレベルを測定し；（２）医薬として許容されるビヒクル中の本明細書に開示の抗体を含む組成物を投与し；（３）炎症性分子の投与後のレベルを測定し；（４）工程（１）の炎症性分子のレベルを工程（３）の炎症性分子のレベルと比較することを含んでなり、ここで炎症性分子レベルの増大の欠如または低下は炎症応答が抑制されていることを示すことを特徴とする方法を提供する。
別の態様において本発明は、炎症が緩和するように哺乳動物にＩＬ−３１のアンタゴニストを投与することを含む、ＩＬ−３１が役割を果たす炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法であって、アンタゴニストは、ＩＬ−３１のポリペプチド（配列番号２）またはポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体または結合ポリペプチドよりなる群から選択されることを特徴とする方法を提供する。ある実施態様において炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法は上記で開示したものであり、疾患は慢性炎症性疾患である。別の実施態様において炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法は上記で開示したものであり、疾患は炎症性腸疾患、潰瘍性結腸炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、湿疹、および乾癬よりなる群から選択される。ある実施態様において炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法は上記で開示したものであり、疾患は急性炎症性疾患である。別の実施態様において炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法は上記で開示したものであり、疾患は内毒素血症、敗血症、毒素ショック症候群、および炎症性疾患よりなる群から選択される急性炎症性疾患である。ある実施態様において炎症性疾患に罹った哺乳動物を治療する方法は上記で開示したものであり、抗体はさらに、放射性核種、酵素、基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、または毒素を含む。
別の態様において本発明は、患者の炎症を検出する方法であって、患者から組織もしくは生体試料を得て；抗体が組織もしくは生体試料中の相補的ポリペプチドと結合する条件下で、本明細書に開示された抗体とともに組織もしくは生体試料をインキュベートし；組織もしくは生体試料中で結合した抗体を視覚化し；そして、患者からの組織もしくは生体試料中の結合した抗体のレベルを正常対照の組織もしくは生体試料と比較することを含んでなり、ここで正常対照の組織もしくは生体試料に対して患者の組織もしくは生体試料に結合した抗体のレベルの増大は患者の炎症を示すことを特徴とする方法を提供する。
別の態様において本発明は、患者の炎症を検出する方法であって、患者から組織もしくは生体試料を得て；配列番号１の少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドまたは配列番号１の相補体を含むポリヌクレオチドを標識し；ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする条件下で組織もしくは生体試料をインキュベートし；組織もしくは生体試料中の標識されたポリヌクレオチドを視覚化し；そして、患者からの組織もしくは生体試料中の標識ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのレベルを正常対照の組織もしくは生体試料と比較することを含んでなり、ここで正常対照の組織もしくは生体試料に対して患者の組織もしくは生体試料中の標識されたポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの増大は患者の炎症を示すことを特徴とする方法を提供する。
本発明は以下の非限定例によりさらに例示される。
実施例１
ラット抗マウスＩＬ−３１ ｍＡｂの作製
Ａ．ラットの免疫と血清スクリーニング
４匹の３ヶ月齢の雌スプラーグドーレイラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、マサチューセッツ州）をＩＬ−３１で免疫した。ラットをまず、製造業者の説明書に従って完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）と組合せた配列ＥＹＭＰＭＥ（配列番号７）（以後ｍＩＬ３１−ＣＥＥと呼ぶ）からなるペプチドとＣ末端で融合した約２９０μｇの精製組換えマウスＩＬ−３１（ＢＨＫ細胞で産生）を腹腔内注射して免疫した。最初の免疫後、各ラットにさらに不完全フロイントアジュバント中の１５０μｇのｍＩＬ３１−ＣＥＥを腹腔内経路で２週間毎に６週間投与した。３回目と４回目の免疫後、眼窩後神経叢を介して採血し、血液から血清を分離して、溶液中のｍＩＬ−３１−ＣＥＥに結合し、マウスＩＬ−３１ＲＡでトランスフェクトした細胞株上のｍＩＬ−３１−ＣＥＥの刺激活性を阻害（中和により測定）する能力について分析した。
抗血清中のラット抗マウスＩＬ−３１抗体がｍＩＬ−３１−ＣＥＥに結合する能力を「捕捉」型ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。このアッセイでは９６ウェルのポリスチレンＥＬＩＳＡプレートをまず、０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中の５００ｎｇ／ｍｌ濃度の１００μｌ／ウェルのヤギ抗ラットＩｇＧ、Ｆｃ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に非結合抗体を吸引し、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−ツイーン（０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、０．００７２Ｍ Ｎａ２ＨＰ４、０．００１５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ｖ／ｖポリソルベート２０，ｐＨ７．２）で２回洗浄した。ウェルを２００μｌ／ウェルのスーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）で室温（ＲＴ）で５分間ブロックし、スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）をプレートから払い落とし、このブロックを１回繰り返し、次にプレートをＰＢＳ−ツイーンで２回洗浄した。１：１０００から初めて１：１，０００，０００まで血清の連続１０倍希釈液（ＰＢＳ−ツイーン＋１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％ｖ／ｖプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）２００、ｐＨ７．２＝希釈緩衝液中）を調製した。血清中のラットＩｇＧを分子のＦｃ部分を介してアッセイプレートに結合させるために、各希釈の三重試料をアッセイプレートに移した（１００μｌ／ウェル）。正常なラット血清を陰性対照とした。室温で１時間インキュベート後ウェルを吸引し、プレートを上記のように２回洗浄した。次に５００ｎｇ／ｍｌ濃度のビオチン化ｍＩＬ−３１−ＣＥＥ（ビオチン：タンパク質のモル比１２：１）をウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。室温で１時間インキュベート後、非結合ビオチン化ｍＩＬ−３１−ＣＥＥをウェルから吸引し、プレートを２回洗浄した。５００ｎｇ／ｍｌ濃度の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を各ウェルに加え（１００μｌ／ウェル）、プレートを室温で１時間インキュベートした。非結合ＨＲＰ−ＳＡを除去後、プレートを５回洗浄し、１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）を各ウェルに加え、プレートを室温で５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの４５０ｍｍ ＴＭＢ停止試薬（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）を添加して発色を停止させ、ウェルの吸光度値をモレキュラーデバイシーズスペクトラ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ）ＭＡＸ３４０装置で４５０ｎｍで読んだ。
抗血清中のラット抗マウスＩＬ−３１抗体がその同種の受容体を介してマウスＩＬ−３１の刺激活性を阻害（中和により測定）する能力を、ｍＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータトランスフェクトＢａｆ３細胞株をルシフェラーゼレポーター系とともに使用（Ｂａｆ３／ＫＺ１３４／ｍｃｙｔｏｒ１７／ｍＯＳＭＲベータ）し、マウスＩＬ−３１により細胞の刺激を介して活性化される細胞ベースの中和アッセイを使用して評価した。このアッセイのために、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１×ペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリホルニア州）中の各抗血清の１：２５０希釈液をまず調製し、次にそれぞれを１：３２０００まで連続２倍希釈した。各希釈の抗血清を、アッセイ緩衝液中４ｎｇ／ｍｌに希釈した等量のｍＩＬ−３１−ＣＥＥにウェル中の総量が１００μｌになるように加えた。抗体／サイトカイン混合物を室温で０．５時間インキュベートし、次に標的細胞を増殖培地から洗浄し、３００，０００細胞／ｍｌの濃度に調整し、抗体／サイトカイン混合物（１００μｌ／ウェル）に加えた。２ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−３１を含有し抗血清を含有しないアッセイ培地を陰性対照として、アッセイで達成される最大刺激とした。３７℃、５％ＣＯ２で１６〜２４時間インキュベート後、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を注意深く払い落とし、２５μｌの１×細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１０分間静かに振盪させて細胞を完全に溶解させ、次に細胞溶解物を無地の９６ウェルプレート（コーニング／コスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ）３９１７、アクトン（Ａｃｔｏｎ）、マサチューセッツ州）に移した。各ウェルに４０μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。次にルミノメーターで５秒の積分間隔を使用して、ウェルをルシフェラーゼ活性（ＳＴＡＴ受容体構築体のＩＬ−３１活性化を示す）について評価した。
「捕捉」ＥＬＩＳＡアッセイと細胞ベースの中和アッセイともに、４匹すべてのラットがｍＩＬ−３１に対する有意な抗体応答があるが、１匹のラットは明らかに他のラットより強い応答を生じることを示した。一般に「捕捉」ＥＬＩＳＡにより測定した応答は、細胞ベースの中和アッセイで見られた応答と密接に一致し、ＩｇＧクラス抗体は主にｍＩＬ−３１の阻害に関与していることを示唆する。
Ｂ．融合
最後の腹腔内免疫の４週間後に、最も大きなｍＩＬ−３１中和力価を有するラットを、ＰＢＳ中約１５０μｇのｍＩＬ−３１−ＣＥＥを静脈内注射により最後に１回免疫した。５日後このラットの脾臓とリンパ節を採取し、単一細胞懸濁物に調製し、Ｓｐ２／０マウス骨髄腫細胞株（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２６９−２７０，１９７６）に４：１のリンパ球：骨髄腫細胞比でＰＥＧ１５００を用いて当該分野で公知の標準的方法を使用して融合させた（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ｄ．１９８８、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州）。融合混合物をフィーダー層としてのＢＡＬＢ／ｃ胸腺細胞と組合せて一連の９６ウェル平底プレートに入れた（Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．とＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．、１９８０，「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｂ．Ｂ．ＭｉｓｃｈｅｌｌとＳ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ編、３５１〜３７２頁、フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、サンフランシスコ）。４日後に融合プレートのウェルに培地と胸腺細胞を７０％交換し、再度２日後に培地のみを加えた。融合体を蒔いた８日後にウェルを測定した。
Ｃ．融合体のスクリーニング
上記のｍＩＬ−３１の「捕捉」ＥＬＩＳＡを１次スクリーニングとして使用したが、ただしハイブリドーマ上清は希釈せずに試験し、培養プレートからアッセイプレート上にレプリカプレーティングを行った。約１７０個の陽性ウェルを同定した。次にこれらのそれぞれのウェルといくつかの陰性ウェルからの上清を、前記した細胞ベースの中和アッセイでｍＩＬ−３１を阻害する能力について評価した。それぞれをアッセイ培地で１：８の最終希釈で試験した。後者の希釈ではハイブリドーマ上清中の非特異的刺激成分は充分に減少し、観察された刺激指数への寄与は最小になった。上清の大部分はｍＩＬ−３１をある程度中和するようであり、これらのうち約１０個は基本的に完全な中和を示し、残りは、別の約１０個があるとしてもほとんど無い中和活性を有するまで、連続的阻害を示した。約１５０の「捕捉」ＥＬＩＳＡ陽性ウェル中のハイブリドーマ細胞は、２４ウェルプレート中での培養物までうまく拡張された。２４ウェル培養物の密度が約４〜６×１０5細胞／ｍｌの時、上清（約１．５ｍｌ）を個々に採取し、各ウェルについて保存し、各ウェルの細胞を低温保存した。
２４ウェル上清のそれぞれを、融合体スクリーニングで使用した「捕捉」ＥＬＩＳＡと細胞ベースのＩＬ−３１中和アッセイの両方で再分析した。さらに、これらの上清はまた、ＩＬ−３１分子のＣ末端に融合したＥＹＭＰＭＥ（配列番号７）タグを用いて構築しＢＨＫ細胞で産生したＩＬ−３１のヒト相同物を使用する「捕捉」ＥＬＩＳＡで試験した。結果は、拡張後に大部分のマスターウェル上清は溶液中のマウスＩＬ−３１を認識する能力を保持することを示した。これらの「捕捉」アッセイ陽性細胞のうちで、ｍＩＬ−３１阻害活性は約２０個の上清について完全〜ほぼ完全であり、１０〜１５個の上清については実質的に阻害無しであった。ヒトＩＬ−３−ＣＥＥへの交差反応が捕捉アッセイで観察されず、ラット抗ｍＩＬ−３１抗体のいずれもヒトＩＬ−３１相同物と交差反応せず、またはｍＩＬ−３１−ＣＥＥ分子のＣ末端に融合したＣＥＥタグを認識しないことを示している。
Ｄ．中和抗ｍＩＬ−３１ ｍＡｂを産生するハイブリドーマの選択とクローン化
目的の中和モノクローナル抗体を産生するクローン化ハイブリドーマを単離するために、上位１０個のＩＬ−３１中和マスターウェルの内の７個（２７１．５．７、２７１．９．４、２７１．２６．６、２７１．２７．４、２７１．３３．１、２７１．３３．３、および２７１．３９．４）をクローン化した。標準的低濃度希釈（ウェル当たり１個未満の細胞）アプローチを使用して、９６ウェルマイクロタイター細胞培養プレート中で胸腺細胞の存在下で細胞をクローン化し、単一の増殖巣についてウェルを顕微鏡観察し次にアッセイを行って単一クローン性を評価した。プレートに蒔いた６日後、プレート上のすべてのウェルをｍＩＬ−３１特異的ＩｇＧについて「捕捉」ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。特異的ｍＡｂについて陽性でありかつハイブリドーマ増殖の単一のコロニーのみを有するウェルに由来する６〜１０ウェルからの上清を各クローン化セットから採取し、「捕捉」ＥＬＩＳＡで種々の希釈でおよび細胞ベースの中和アッセイで再スクリーニングして「最適な」中和ｍＡｂ産生クローンを同定した。これらの試験の結果は、適切な中和ｍＡｂ産生ハイブリドーマクローンが、２７１．９．４、２７１．２６．６、２７１．３３．１、２７１．３３．３、および２７１．３９．４のセットでのみ得られることを示した。これらのセットのそれぞれの「最適の」クローンを再クローン化し、サブクローンを記載のようにスクリーニングして、最終ハイブリドーマ株２７１．９．４．２．６、２７１．２６．６．６．１、２７１．３３．１．２．２、２７１．３３．３．２．１、および２７１．３９．４．６．５を得た。これらのハイブリドーマのそれぞれにより産生されるｍＡｂのラットＩｇＧイソタイプを、ビオチン化マウス抗ラットＩｇＧイソタイプ特異的モノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡを使用して測定した。すべての５つのモノクローナル抗体はＩｇＧ１サブクラスに属していた。ハイブリドーマ２７１．２６．６．６．１は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナサアース（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州）特許物寄託機関に元々の寄託物としてブダペスト条約に従って寄託し、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＰＴＡ−６８７４を与えられた。
完全にクローン化した抗マウスＩＬ−３１ ｍＡｂ産生ハイブリドーマのそれぞれを、ハイブリドーマ無血清培地（ハイブリドーマ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での増殖に適応させた。ハイブリドーマ−ＳＦＭ中で増殖させた高細胞密度培養物の上清を遠心分離して細胞と細胞破片を除去し、０．２μｍフィルターでろ過し、ｍＡｂをプロテインＧクロマトグラフィーにより当該分野で公知の標準的方法を使用して精製した。
Ｅ．ｍＡｂのインビトロ特異的中和活性をランク付け
５個のラット抗マウスＩＬ−３１ ｍＡｂのそれぞれのインビトロ特異的中和活性をランク付けするために、各精製ｍＡｂを上記した細胞ベースの中和アッセイで再試験したが、ただしｍＩＬ−３１はまず細胞に加え、次にこの混合物を抗体に加えた。ｍＩＬ−３１−ＣＥＥに対する中和活性以外にｍＡｂはまた、他の型のマウスＩＬ−３１（ｃ１０８ｓｍＩＬ−３１と呼ぶ）（１０８位のシステイン残基はセリン残基に変換されている）に対しても評価した。後者の物質は、ＣＥＥペプチド無しで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生した。各型のｍＩＬ−３１を最終濃度を１および５ｎｇ／ｍｌで使用した。ｍＡｂをアッセイ培地で２０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、アッセイ混合物中１０μｇ／ｍｌ〜０．００００１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で連続１０倍希釈して二重測定で試験した。ソフトマックス（Ｓｏｆｔｍａｘ）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＩＣ５０値を測定した。結果を表１に示し、これは、ｍＡｂ ２７１．２６．６．６．１、２７１．３３．１．２．２および２７１．３９．４．６．５が最も強力な中和ｍＡｂであり、このインビトロ試験で同様の力価であったことを示す。興味深いことにｍＡｂ ２７１．３３．３．２．１はｍＩＬ−３１のｃ１０８ｓｍＩＬ−３１に対して他のｍＡｂよりはるかに有効性が低く、この抗体は他の４つのｍＡｂとは異なる特異性を有する可能性が高いというエピトープ結合試験の結論を支持している。このｍＡｂがまたｍＩＬ−３１−ＣＥＥと比較してｍＩＬ−３１のｃ１０８ｓｍＩＬ−３１に対して有効性が遙かに低いという事実は、２７１．３３．３．２．１により認識されるエピトープが部分的にＩＬ−３１分子上のグリコシル化部位を含むことを示唆している。
Figure 2008541704
実施例２
マウス抗ヒトＩＬ−３ ｍＡｂの作製
Ａ．マウスの免疫と血清スクリーニング
２群（各群５匹）の６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトＩＬ−３１で免疫した。第１群のマウスは、配列ＥＹＭＰＭＥ（配列番号７）（以後ＩＬ−３１−ＣＥＥと呼ぶ）からなるペプチドとＣ末端で融合した精製組換えヒトＩＬ−３１をリビ（Ｒｉｂｉ）アジュバントとともに製造業者の説明書に従って腹腔内注射して免疫した。このタンパク質はＢＨＫ細胞で産生された。同様に第２群のマウスを、精製した組換え変異型ヒトＩＬ−３１（１０８位のシステイン残基はセリン残基に変換されている）（以後ｃ１０８ｓＩＬ−３１と呼ぶ）で免疫した。この物質はＣ−ＥＥペプチドの無い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された。すべてのマウスに５０μｇのタンパク質を２週間毎に１０週間投与した。３回目と４回目の免疫の７〜１０日後、眼窩後神経叢を介して採血し、血液から血清を分離して、ヒトＩＬ−ＲＡでトランスフェクトした細胞株への結合を阻害し、次にヒトＩＬ−３１の刺激活性を阻害する能力について分析した。
個々の血清がヒトＩＬ−３１を阻害する能力を、ＩＬ−３１−ＣＥＥまたはｃ１０８ｓＩＬ−３１およびＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ細胞（実施例３と４を参照）を使用するルシフェラーゼベースの中和アッセイを使用して以下の変更を加えて評価した。個々の抗血清を、９６ウェルの平底白色ポリスチレンプレート（コーニングコスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ）３９１７）でアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）中の抗血清の１：２５０希釈から出発して連続４倍希釈して、二重測定で力価測定した。このアッセイでマウス血清のわずかの刺激作用を標準化するために、最初の１：２５０希釈を除くすべての希釈はアッセイ緩衝液＋０．２％正常ＢＡＬＢ／ｃマウス血清で行った。各ウェル中の希釈した抗血清の容量は１００μｌであった。細胞をアッセイ緩衝液中で１．５回洗浄し、３×１０６／ｍｌ濃度に調整し、ＩＬ−３１−ＣＥＥ（１００ｐｇ／ｍｌ）またはｃ１０８ｓＩＬ−３１（３０ｐｇ／ｍｌ）と混合し、次に混合物をプレートに加えた（１００μｌ／ウェル）。総アッセイ容量は、３０，０００個の細胞、最終濃度５０ｐｇ／ｍｌ（ＩＬ−３１−ＣＥＥ）もしくは１５ｐｇ／ｍｌ（ｃ１０８ｓＩＬ−３１）のＩＬ−３１、および最終希釈率が１：５００、１：２０００、１：８０００、１：３２０００、１：１２８０００、１：５１２０００、１：２０４８０００、および１：８１９２０００の抗血清からなる２００μｌ／ウェルであった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１６〜２４時間インキュベートし、次に１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を注意深く払い落とし、各ウェルに２５μｌの１×細胞溶解緩衝液を加えた。プレートを静かに１０分間振盪して細胞を溶解させ、次に４０μｌのルシフェラーゼを各ウェルに加えた。次にルミノメーターで４秒の積分間隔を使用して、ウェルをルシフェラーゼ活性（ＳＴＡＴ受容体構築体のＩＬ−３１活性化を示す）について評価した。
このアッセイでは一般にＩＬ−３１−ＣＥＥで免疫したマウスの抗血清は、ＩＬ−３１−ＣＥＥとｃ１０８ｓＩＬ−３１の両方の刺激活性を有効に阻害し、逆も真であった。このため、ＩＬ−３１−ＣＥＥのみを使用してさらなる中和アッセイを行った。
ＩＬ−３１と同種の受容体との相互作用を非常に有効に中和できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することを目的として、一連の３つの融合体について、最も強い中和力価を有するマウスを使用した。
Ｂ．融合
融合２９１
最初の融合はＩＬ−３１−ＣＥＥで免疫した１匹のマウスとｃ１０８ｓＩＬ−３１で免疫した１匹のマウスからのリンパ節細胞を使用した。これらの各動物をＰＢＳで希釈した１５μｇの各免疫原で６回免疫し、最後の免疫の３週間後に血管内注射して投与した。３日後これらのマウスの脾臓とリンパ節を採取し、一緒にし、単一細胞懸濁物に調製し（全部で４．６９×１０8細胞）、次にマウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２３：１５４８−５０，１９７９）（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３．３．１２．１１）のクローンに、２．３：１のリンパ球：骨髄腫細胞比で３ｍｌのＰＥＧ１５００を用いて当該分野で公知の標準的方法（Ｌａｎｅ，Ｒ．Ｄ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． ８１：２２３−８，１９８５）を使用して２分５５秒間融合させた。融合混合物を一連の９６ウェル平底プレートに入れ、４日後に７０％の培地を交換し、６日後に測定した。
融合２９２
２回目の融合は、ＩＬ−３１−ＣＥＥで免疫した１匹のマウスのリンパ球を使用した。上記の５回の腹腔内免疫以外に、最後の腹腔内注射後の３週間後にＰＢＳ中の１５μｇのＩＬ−３１−ＣＥＥを血管内注射し、最初の血管内免疫の３週間後に同様の注射を行った。３日後、これらのマウスの脾臓とリンパ節を処理し（全部で２．２７×１０8細胞）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３．３．１２．１１に、２：１のリンパ球：骨髄腫細胞比で１．８ｍｌのＰＥＧ１５００を用いて上記のように２分５５秒間融合させた。融合混合物を一連の９６ウェル平底プレートに入れ、４日後に７０％の培地を交換し、５日後に測定した。
融合２９４
最後の融合は、ｃ１０８ｓＩＬ−３１のみで免疫した１匹のマウスのリンパ球を使用した。上記のこの抗原による５回の腹腔内免疫以外に、最後の腹腔内注射後の６週間後にＰＢＳ中の１５μｇのｃ１０８ｓＩＬ−３１を血管内注射し、最初の血管内免疫の２週間後に再度注射した。３日後脾臓とリンパ節を処理し（全部で１．５８６×１０８細胞）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３．３．１２．１１に、２：１のリンパ球：骨髄腫細胞比で１．５ｍｌのＰＥＧ１５００を用いて上記のように２分５５秒間融合させた。融合混合物を一連の９６ウェル平底プレートに入れ、４日および６日後の２回７０％の培地を交換し、最後の交換の３日後に測定した。
Ｃ．融合体のスクリーニング
すべての３つの融合体を上記の細胞ベースのＩＬ−３１中和アッセイを使用して２つの変更を加えてスクリーニングした。まずアッセイプレート中で希釈抗血清の代わりに、融合プレートの各ウェルからの１００μｌの上清をアッセイプレートにレプリカプレートに蒔いた。次にアッセイ混合物中のＩＬ−３１−ＣＥＥの最終濃度は１５０ｐｇ／ｍｌであった。
中和アッセイ以外に、ランダムに選択した各融合からのいくつかのプレートを、あらかじめポリスチレンＥＬＩＳＡプレートに吸着させておいたＩＬ−３１−ＣＥＥに結合するＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。このアッセイの目的は、ＩＬ−３１をわずかに中和するかまたはこのサイトカインをまったく中和しない抗ＩＬ−３１抗体を産生するハイブリドーマを含有するマスターウェルを同定することであった。このアッセイでは９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートのウェルをまず、０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中２００ｎｇ／ｍｌの濃度の５０μｌ／ウェルのＩＬ３１−ＣＥＥで被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に非結合抗原を吸引し、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−ツイーン（０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、０．００７２Ｍ Ｎａ２ＨＰ４、０．００１５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ｖ／ｖポリソルベート２０，ｐＨ７．２）で２回洗浄した。ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳ−ツイーン＋１％ＢＳＡで室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。次にブロッキング溶液をプレートから払い落とし、融合プレートの各ウェルから５０μｌの調整培地をアッセイプレートのウェルにレプリカプレートに蒔いた。プレートを室温で１時間インキュベート後、非結合抗体を吸引し、プレートを３００μｌ／ウェルのＰＢＳ−ツイーンで２回洗浄した。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ−ツイーン＋１％ＢＳＡで１：５０００希釈し、アッセイプレートのウェルに加えた（１００μｌ／ウェル）。プレートを室温で１時間インキュベート後、非結合の第２工程抗体をウェルから吸引し、プレートを５回洗浄した。次に１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）を各ウェルに加え、プレートを室温で５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの４５０ｍｍ ＴＭＢ停止試薬（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）を添加して発色を停止させ、ウェルの吸光度値をモレキュラーデバイシーズスペクトラ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａ）ＭＡＸ３４０装置で４５０ｎｍで読んだ。
中和アッセイの結果は、融合２９１と２９２のそれぞれ５２ウェルと１３９ウェルが、ＩＬ−３１刺激活性を少なくとも４０％阻害する抗体を含有することを示した。陽性のより厳密な定義が融合２９４に適用され、ここで１３１ウェルがＩＬ−３１抗体の少なくとも７０％を阻害する抗体を含有することが観察された。ＩＬ−３１−ＣＥＥに結合したｍＡｂを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイの結果は、多くのケースでＩＬ−３１−ＣＥＥに結合したＩｇＧ抗体をマスターウェルが含有していた場合は、これはまた細胞ベースの中和アッセイでＩＬ−３１−ＣＥＥを阻害する抗体を含有した。しかしいくつかのウェルでは、ＥＬＩＳＡアッセイで陽性であるが細胞ベースの中和アッセイでは比較的弱い阻害能力を示すウェルがあり、これらは後述するように後の分析のために取っておいた。
陽性のマスターウェル中で増殖しているハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートに拡張した。２４ウェル培養物の密度が約４〜６×１０５細胞／ｍｌの時、上清（約１．５ｍｌ）を個々に集め、各ウェルについて保存し各ウェルからの細胞を低温保存した。
Ｄ．強力なＩＬ−３１中和ｍＡｂを産生するハイブリドーマを単離するためのマスターウェルの選択とクローン化
新しい２４ウェル上清のそれぞれを、融合体スクリーニングで使用した細胞ベースのＩＬ−３１中和アッセイを使用してＩＬ−３１中和能力について再分析した。各上清を希釈せずに二重で測定した。結果は、拡張後に大部分のマスターウェル上清が、元々のマスタースクリーニングで観察されたものと同等またはそれ以上の阻害活性を保持することを示した。どの新しいマスターウェル上清が最も強い阻害能力を有するかをより詳細に調べるために、このアッセイでＩＬ−３１−ＣＥＥの約９０％またはそれ以上の阻害を示した上清を、細胞ベースの中和アッセイの上清の希釈物を試験することにより再分析した。上清はアッセイプレート上で融合培地に連続３倍希釈して、以下の希釈（原液、１：３、１：９、１：２７、１：８１、および１：２４３）の各ウェル中で１００μｌを得て、融合体スクリーニングについて上記したようにアッセイを行った。このアッセイは、最も強い阻害性の上清を明らかに確定したが、上清中の抗ＩＬ−３１抗体の濃度は不明であるため、どれが最も高い比活性を有するかを決定することはできなかった。
特異抗体濃度の問題を解決するために、上記した直接ＥＬＩＳＡアッセイでＩＬ−３１−ＣＥＥについて連続２倍または４倍希釈を使用して、各上清を力価測定フォーマットで試験した。データをマイクロソフトエクセルにプロットした後、アッセイで観察された最大光学密度（ＯＤ）の半分を与える上清の希釈を決定し、次にこれは上清中の抗ＩＬ−３１抗体の相対濃度のある指標を与えた。
中和アッセイからのデータをＥＬＩＳＡアッセイのデータと組合せて、各上清について相対的比活性を確立し、最も高い抗ＩＬ−３１特異抗体を含有する２０個のマスターウェルを同定した。興味深いことに、すべての最も強力なＩＬ−３１中和マスターウェルは融合２９２から得られた。これらのマスターウェルの中和データでは、未希釈と１：３希釈の各上清について最大のＩＬ−３１阻害が達成されたが、絶対的な中和の程度は、わずかに低いルシフェラーゼ単位カウントに反映されるようにいくつかの上清についてわずかに強いことが観察された。コード配列、「完全な」ＩＬ−３１中和のわずかに異なる程度であると解釈された。この観察結果と各マスターウェルの相対的中和比活性を組合せると、２０個の最も強い中和比活性のリストは最良の１０個まで縮小された。これらは、２９２．１２、２９２．３９、２９２．５１、２９２．６３、２９２．６４、２９２．７２、２９２．８４、２９２．１０５、２９２．１０９、および２９２．１１８である。
目的の中和ｍＡｂを産生するクローン化ハイブリドーマを単離するために、これらの上位１０個の各ＩＬ−３１中和マスターウェル中の細胞をクローン化した。標準的低濃度希釈（ウェル当たり１個未満の細胞）アプローチを使用して、９６ウェルマイクロタイター細胞培養プレート中で細胞をクローン化し、単一クローン性を単一の増殖巣についてウェルを顕微鏡観察し次にアッセイを行って評価した。クローン化培地は、ＨＡＴ成分が欠如した融合培地からなった（ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣ１血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ハイブリドーマクローン化因子（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）。プレートに蒔いた６〜８日後、すべてのウェル中の上清をＩＬ−３１−ＣＥＥ結合プレート上でＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。上清が特異的ｍＡｂについて強く陽性であり単一コロニーのハイブリドーマ増殖のみがあると思われた各セット中の４〜６ウェルからの細胞を２４ウェル培養物に拡張し、得られた上清をＩＬ−３１−ＣＥＥ結合プレート上のＥＬＩＳＡと細胞ベースのＩＬ−３１中和アッセイにより再試験した。これらの結果に基づき、各セットにおける見かけの最も強い中和クローンを、上記したように再クローン化しＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。増殖陽性ウェルの９５％またはそれ以上が特異的ｍＡｂについても陽性であったため、さらなるサブクローン化は不要と見なされ、ハイブリドーマはクローン性であると判定した。１つのマスターウェル（２９２．６４）についてのみ、生じるクローンのうち特異的ｍＡｂの所望の陽性率を達成するために２回目のラウンドのサブクローン化が必要であった。上清が特異的ｍＡｂについて強く陽性であり単一コロニーのハイブリドーマ増殖のみがあると思われた各セット中の５〜６ウェルからの細胞を２４ウェル培養物に拡張した。細胞密度が適切であった時、細胞を培地に分けて、各ハイブリドーマクローンをハイブリドーマクローン化因子が欠如した培地（ＩＭＤＭ、１０％ ＦＣ１血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン）中での増殖に適応させた。適応後、各セットのサブクローンから上清を採取し、ＩＬ−３１−ＣＥＥ結合プレートでＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。上清採取時の細胞密度についての力価に基づいて、「最適な」最終クローンを選択して以下の群の最終クローンを選択した：２９２．１２．３．１；２９２．３９．５．３；２９２．５１．５．２；２９２．６３．５．３；２９２．６４．６．５．５；２９２．７２．３．１；２９２．８４．１．６；２９２．１０５．４．１；２９２．１０９．４．４；および２９２．１１８．６．４。
これらの各ハイブリドーマにより産生されるｍＡｂのマウスＩｇＧイソタイプを、マウスモノクローナル抗体イソストリップテスト（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩｓｏＳｔｒｉｐ ｔｅｓｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。ＩｇＧ２ａサブクラスに属していた２９２．７２．３．１と２９２．８４．１．６とを除いて、すべてのｍＡｂはＩｇＧ１サブクラスに属することがわかった。
Ｅ．強力なＩＬ−３１中和ｍＡｂのインビトロの特異的中和活性のランク付け
１０個の強力なマウス抗ヒトＩＬ−３１ ｍＡｂのインビトロの特異的中和活性をランク付けするために、１回目のラウンドの各クローンからの検討された上清を前述の細胞ベースの中和アッセイで再試験した。まず各上清中のＩｇＧの量をプロテインＧカラムのＨＰＬＣ分析により既知濃度のｍＡｂを使用して測定した。次に各上清を、検討された上清を作製するのに使用した同じ培地でＩｇＧ濃度を１μｇ／ｍｌに希釈した。次に希釈した上清を培地で１０倍連続希釈により１μｇ／ｍｌ〜０．０００１μｇ／ｍｌの濃度範囲を得て、既に記載した細胞ベースの中和アッセイでＩＬ−３１−ＣＥＥの最終濃度を３００ｐｇ／ｍｌ（１８．２７ｐＭ）に設定して三重測定で試験した。アッセイの結果を表２に示し、ｍＡｂを最も強力なものから最も弱いものの順で記載した。ｍＡｂ２９２．８４．１と２９２．１２．３が最も強力な中和物質であり、次がｍＡｂ２９２．７２．３と２９２．６３．５であり、これらは前の２つの約半分の強さであった。残りのｍＡｂは最も強いｍＡｂの約６〜９倍弱いことが証明された。
Figure 2008541704
上記結果に基づき、ブダペスト条約に従って元々の寄託物としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）特許物寄託機関に寄託すべき特異的中和能力の異なるレベルの代表としてハイブリドーマ２９２．８４．１．６、２９２．１２．３．１、２９２．７２．３．１、２９２．６３．５．３、および２９２．１１８．６．４を選択し、以下のＡＴＣＣ受け入れ番号を与えられた：クローン２９２．１２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名（ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）ＰＴＡ−６８１５）；クローン２９２．７２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６）；クローン２９２．６３．５．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９）；クローン２９２．１１８．６．４（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０）；およびクローン２９２．８４．１．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１）。
Ｆ．ＩＬ−３１中和ｍＡｂの産生が少ないハイブリドーマを単離するためのマスターウェルの選択とクローン化
抗ヒトＩＬ−３１ｍＡｂの作製において関係するのは、異なる液体中のＩＬ−３１の量を定量するためのサンドイッチアッセイフォーマットで使用できるｍＡｂの対であった。このような対のｍＡｂは典型的には、標的分子上の異なるエピトープに対する特異性を有し、この分子に対する結合について交差競合しないことが好ましい。かかるｍＡｂ対の候補を単離するために、２つのこのような異なる機能性抗体は非重複（空間的に離れた）エピトープに結合していると見なして、たとえあったとしても非常に小さい中和能力を有するものを、優れたＩＬ−３１中和抗体と組合せる方策を選択した。
融合体スクリーニングについてすでに記載したように、各融合からのいくつかのプレートを、ＩＬ−３１−ＣＥＥ結合プレートのＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、抗ＩＬ−３１抗体陽性マスターウェル上清を同定した。ＥＬＩＳＡの結果を細胞ベースの中和アッセイの結果と比較すると、ＩＬ−３１−ＣＥＥによく結合するが細胞ベースの中和アッセイでこの分子をあまり中和しない抗体を含有するマスターウェルの存在が証明された。より強力な中和マスターウェルで行われたように、これらのマスターウェル中に増殖するハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートの培養物に拡張した。２４ウェル培養物の密度が約４〜６×１０5細胞／ｍｌになった時、上清（約１．５ｍｌ）を個々に採取し、各ウェルについて保存し、各ウェルの細胞を低温保存した。
これらの新しい上清を、細胞ベースの中和アッセイ（上清原液から出発して最終の１：２４３希釈までの連続３倍希釈）、ならびにラット抗マウスＩＬ−３１ｍＡｂの開発で使用したものと同様の「捕捉」型ＥＬＩＳＡを使用して試験した［ただし、以下の差がある；１）プレート被覆抗体としてヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（１μｇ／ｍｌ）、２）ＰＢＳ−ツイーン＋１％ ＢＳＡで１時間、１回ブロックしたプレート、３）ウェルに加えた各上清の単一の力価測定（上清原液から出発して最終の１：２１８７希釈までの連続３倍希釈）、および４）ビオチン化ＩＬ−３１−ＣＥＥの添加（ビオチン：タンパク質の３：１モル比）、２００ｎｇ／ｍｌ］。このアッセイは、溶液中のＩＬ−３１−ＣＥＥに結合する抗体の能力（サンドイッチ型ＥＬＩＳＡのための良好な抗体に必須の性質）を評価するため、プレート結合ＩＬ−３１−ＣＥＥへの抗体の結合より適切であった。実際、プレート結合ＩＬ−３１−ＣＥＥによく結合した抗体を含有する多くのマスターウェル上清は、溶液中の分子をあまり認識しないことが観察された。
どのウェルが適切な抗体分泌ハイブリドーマをクローン化するかを選択するために、その上清が中和アッセイでＩＬ−３１−ＣＥＥを余り中和せず（５０％未満であるが好ましくはわずかに１〜２０％）かつ溶液中のＩＬ−３１−ＣＥＥに比較的よく結合した（原液濃度の上清でＯＤが２．０より大きいことにより示される）１０個のウェルを同定した（２９１．７８、２９２．１５２、２９２．１５４、２９４．３５、２９４．１４４、２９４．１４６、２９４．１５４、２９４．１５５、２９４．１５８および２９４．１６３）。クローン化、クローンのスクリーニング、および最適な１回目のクローンの選択は、強力な中和ウェルについて上記したように行った。
さらにサブクローン化するハイブリドーマの数を減らすために、選択された１回目の各クローンからの検討された上清を用いて２つの新しいアッセイを行った。最初の評価は、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）３０００表面プラズモン共鳴装置を使用してエピトープ特異性（「区分け（ｂｉｎｎｉｎｇ）」に基づいてｍＡｂをグループ分けする試みであった。良好な中和性ｍＡｂ上清の１つ（２９２．６４．６）と１０個の弱中和性の１回目のクローン上清を互いに試験し、４つの明らかな「区分（ｂｉｎ）」が確定された。区分１は良好な中和抗体のみからなった。区分２は、２９２．１５２．４、２９２．１５４．４、２９４．３５．２、２９４．１４６．５、および２９４．１５４．５からなる。区分３は２９１．７８．４、２９４．１５５．６、２９４．１５８．５、および２９４．１６３．２を含んだ。区分４は２９４．１４４．３のみを含んだ。第２のアッセイは「捕捉」型ＥＬＩＳＡの今回のみの繰り返しであり、元々のマスター２４ウェル上清と比較して上清中の特異抗体濃度が高いため、より完全な力価測定曲線が得られ、ＩＬ−３１−ＣＥＥに結合する抗体についてＥＣ５０の測定が可能になった。結果を表３（区分け結果と、細胞ベースの中和アッセイのＩＬ−３１−ＣＥＥ活性の阻害％とともに）に示し、これは、種々のｍＡｂについてＥＣ５０値（および推論により、ＩＬ−３１−ＣＥＥに対するｍＡｂの親和性）の範囲が広いことを示した。
Figure 2008541704
１）良好な中和ｍＡｂ（２９２．６４．６）とは異なるエピトープ区分、および２）捕捉型アッセイの低ＥＣ５０で示される最も高い親和性、のｍＡｂを産生するハイブリドーマの選択を重視して、より強力な中和ｍＡｂについて上記したように１回目のクローンのみ（２９４．３５．２、２９４．１４４．３、２９４．１５４．５、および２９４．１６３．２）を最終クローン状態にした。このさらなるサブクローン化の試みにより、以下の群の最終クローンが選択された：２９４．３５．２．６．３；２９４．１４４．３．５；２９４．１５４．５．６；および２９４．１６３．２．１。
これらの各ハイブリドーマにより産生されるｍＡｂのマウスＩｇＧイソタイプを、マウスモノクローナル抗体イソストリップテスト（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩｓｏＳｔｒｉｐ ｔｅｓｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。すべての４つのｍＡｂはＩｇＧ１サブクラスに属していた。４つのハイブリドーマのそれぞれの試料を、ブダペスト条約に従って元々の寄託物としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）特許物寄託機関に寄託して、以下のＡＴＣＣ受け入れ番号を与えられた：クローン２９４．１６３．２．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１）；クローン２９４．３５．２．６．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２）；クローン２９４．１５４．５．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５）；およびクローン２９４．１４４．３．５（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３）。
Ｇ．マウス抗ヒトＩＬ−３１ ｍＡｂのマウスＩＬ−３１との交差反応
上位１０個の強力な中和性ｍＡｂならびに１０個のあまり強力ではない中和性ｍＡｂからの１回目のクローン上清を、ｍＩＬ−３１−ＣＥＥ結合プレートのＥＬＩＳＡによりマウスＩＬ−３１を認識する能力について試験した。いずれのｍＡｂでも交差反応は見られず、ｍＡｂはヒトＩＬ−３１に対して特異性を有するらしいことを示した。さらにこれらの結果は、いずれの抗体も、これらの試験で使用したヒトおよびマウスＩＬ−３１組換え分子の両方のＣ末端に共通のＣＥＥペプチドタグを認識しない（元々のマスターウェル上清では測定されなかった）ことを示した。
実施例３
ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ受容体ルシフェラーゼアッセイ
修飾ｃ−ｆｏｓ Ｓｉｓ誘導性要素（ｍ６７ＳＩＥまたはｈＳＩＥ）（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１７３９−１７４４，１９９３）、ｐ２１ ＷＡＦ１遺伝子からのｐ２１ ＳＩＥ１（Ｃｈｉｎ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：７１９−７２２，１９９６）、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｎｅｙ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １１：３７４５−３７５５，１９９１）、およびＦｃｇＲＩ遺伝子のＳＴＡＴ誘導性要素（Ｓｅｉｄｅｌ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３０４１−３０４５，１９９５）を含む、４つの遺伝子からのＳＴＡＴ転写因子結合要素を含有する相補的オリゴヌクレオチドを用いてＫＺ１３４プラスミドを構築した。これらのオリゴヌクレオチドはＡｓｐ７１８−ＸｈｏＩ適合末端を含有し、標準的方法を使用して連結して、同じ酵素を用いて消化しネオマイシン選択マーカーを含有するｃ−ｆｏｓプロモーターを用いて受容体ホタルルシフェラーゼレポーターベクターとした（Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：６２２９−６２３２，１９９８）。ＫＺ１３４プラスミドを使用して、標準的トランスフェクション法および選択法を使用してＢａＦ３細胞を安定にトランスフェクトし、ＢａＦ３／ＫＺ１３４細胞株を作製した。
完全長ＩＬ−３１ＲＡまたはＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ受容体を発現する安定なＢａＦ３／ＫＺ１３４指示細胞株を構築した。クローンを希釈し、プレートに蒔き、標準的方法を使用して選択した。ヒトＩＬ−３１調整培地または精製ＩＬ−３１タンパク質をインデューサーとして使用してルシフェラーゼアッセイ（後述のＢを参照）によりクローンをスクリーニングした。最も高いルシフェラーゼ応答（ＳＴＡＴルシフェラーゼにより）と最も低いバックグランドとを有するクローンを選択した。安定なトランスフェクション細胞株を選択した。この細胞株を、細胞株にトランスフェクトされた受容体に依存して、ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡまたはＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータと呼んだ。
同様に、本明細書に記載の方法を使用してＢＨＫ細胞株も構築し、本明細書に記載のルシフェラーゼアッセイで使用した。この細胞株を、細胞株にトランスフェクトされた受容体に依存して、ＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡまたはＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータと呼んだ。
ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡとＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ細胞とを遠心分離し、ｍＩＬ−３１非含培地で洗浄した。細胞を遠心分離し３回洗浄してｍＩＬ−３１の除去を確実にした。次に細胞を血球計算機で計測した。細胞を９６ウェルフォーマットで約３０，０００細胞／ウェルで、ウェル当たり１００μｌの容量でｍＩＬ−３１非含培地を使用してプレートに蒔いた。以後のアッセイで対照として使用するために非トランスフェクトＢａＦ３／ＫＺ１３４細胞について同じ方法を使用した。ＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡまたはＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータは９６ウェルフォーマットで１５，０００細胞／ウェルで１００μｌ培地でプレートに蒔いた。親のＢＨＫ／ＫＺ１３４細胞を対照として使用した。
ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ、ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ、ＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡまたはＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ細胞のＳＴＡＴ活性化を、調整培地または精製タンパク質を使用して評価する。１００μｌの希釈調整培地またはタンパク質を、ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ、ＢａＦ３／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ、ＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡまたはＢＨＫ／ＫＺ１３４／ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲベータ細胞に加える。調整培地を使用するアッセイは、対照としての非トランスフェクトＢａＦ３／ＫＺ１３４またはＢＨＫ／ＫＺ１３４細胞について平行して行う。総アッセイ容量は２００μｌである。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートし、ここでＢａＦ３細胞を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレットにし、培地を吸引し、２５μｌの溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加える。ＢＨＫ細胞株については、細胞が接着性であるため、遠心分離工程は不要である。室温で１０分後、プレートを５秒間の積分で４０μｌのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えてルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ、モデルＲＳ）で読んでＳＴＡＴレポーター構築体の活性化について測定する。
実施例４
アデノウイルスＳＴＡＴ／ＳＲＥ受容体遺伝子を用いる一過性感染によるヒト形質転換上皮細胞株のルシフェラーゼアッセイ
ＩＬ−３１活性の阻害、低下、および／または中和は、ルシフェラーゼアッセイにより測定することができる。例えばヒト形質転換細胞は、各細胞タイプについて記載されているように９６ウェル平底プレートで１０，０００細胞／ウェルで普通の増殖培地に接種することができる。翌日細胞をアデノウイルスレポーター構築体ＫＺ１３６で感染多重度５０００で感染させる。ＫＺ１３６レポーターは、血清応答要素以外にＳＴＡＴ要素を含有する。総量は２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、および１×インスリン−トランスフェリン−セレンサプリメント（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補足したＤＭＥＭ（以後無血清培地と呼ぶ）を使用して１００μｌ／ウェルである。細胞を一晩培養する。
翌日培地を除去し１００μｌの誘導培地と交換する。誘導培地は、無血清培地で１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、および１．５６ｎｇ／ｍｌに希釈したヒトＩＬ−３１である。２０％ＦＢＳの陽性対照を使用してアッセイの妥当性を検証し、アデノウイルスによる感染がうまくいっていることを確認する。細胞を５時間誘導し、ここで培地を吸引する。次に細胞を５０μｌ／ウェルのＰＢＳで洗浄し、次に３０μｌ／ウェルの１×細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させ、不透明な白色の９６ウェルプレートに移す。次にルミノメーターで５秒の積分間隔を使用して４０μｌ／ウェルのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）注入により、プレートを読む。
実施例５
ＩＬ−３１抗体によるサイトカイン産生の阻害
ＩＬ−３１はＤＵ１４５（疾患のおよび正常な細胞株）中のＩＬ−６産生を刺激し；ならびにＡ５４９細胞株（疾患のおよび正常な細胞株）を刺激してＩＬ−８産生を刺激し、Ｕ２ＯＳ細胞株（疾患のおよび正常な細胞株）中のＩＬ−８産生を低下させることが証明されている。公開されている米国特許出願を参照（公開番号２００３０２２４４８７、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｉｎｄｙら、２００３）。従って本明細書に記載のＩＬ−３１モノクローナル抗体の活性は、これらのヒト疾患状態上皮細胞株のＩＬ−３１活性の阻害、低下、および／または中和により測定することができる。
Ａ．ヒトＩＬ−３１を用いるヒト疾患状態上皮細胞株によるサイトカイン産生の阻害
細胞を４．５×１０5細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に蒔き、各増殖培地で培養する。細胞を試験試薬で培養する：１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３１（抗体刺激有りと無し）、１０ｎｇ／ｍｌインターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）、１０ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）、１０ｎｇ／ｍｌＩＬ−１ベータ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）、または１００μｇ／ｍｌ リポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ）。２４時間と４８時間に上清を採取し、サイトカインについて測定する；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１（マクロファージ化学走化性タンパク質−１）およびＴＮＦａ。バイオソースインターナショナル（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）、カリホルニア州）のマルチプレックス抗体ビーズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｅａｄ）キットを使用して、試料中のサイトカインを測定する。アッセイをルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）−１００装置（ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、オースチン、テキサス州）で読み、マスタープレックス（ＭａｓｔｅｒＰｌｅｘ）ソフトウェア（ＭｉｒａｉＢｉｏ、アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ）、カリホルニア州）を使用してデータを解析する。２４時間試料の各細胞株のサイトカイン産生（ｐｇ／ｍｌ）を測定する。
Ｂ．ヒトＩＬ−３１で培養した正常ヒト上皮細胞株によるサイトカイン産生の阻害
細胞を１×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔き、試験試薬で培養する：１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３１（抗体刺激有りと無し）、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦａ、１０ｎｇ／ｍｌ ＯＳＭ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮａ、１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦｂ、または１０ｎｇ／ｍｌリンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔｃｔｉｎ）。２４時間と４８時間に上清を採取し、サイトカインについて測定する：ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、およびエオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）。サイトカインは既に記載したように測定する。４８時間試料の各細胞株のサイトカイン産生（ｐｇ／ｍｌ）を測定する。
Ｃ．ＩＬ−３１およびＩＦＮガンマと同時培養したヒト疾患状態上皮細胞株によるサイトカイン産生の阻害
細胞を２×１０5細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔き、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮガンマ±１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３１と同時培養する。２４時間と４８時間に上清を採取し、ＩＬ−８とＭＣＰ−１に対して測定する。２４時間試料の各細胞株のサイトカイン産生（ｐｇ／ｍｌ）を測定する。
実施例６
形質転換骨髄内皮細胞（ＴＲＢＭＥＣ）単層へのＵ９３７単球接着に対するＩＬ−３１の作用の阻害
ＩＬ−３１は内皮細胞単層へのＵ９３７細胞の基底への接着に影響を与えることが証明されている。特にＩＬ−３１はＴＮＦアルファと相乗作用をして、Ｕ９３７接着をさらに増強する。公開されている米国特許出願を参照（公開番号２００３０２２４４８７、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｉｎｄｙら、２００３）。すなわち本明細書に記載の抗ＩＬ−３１抗体によるＩＬ−３１の阻害は、以下のアッセイにより測定することができる。
形質転換骨髄内皮細胞（ＴＲＢＭＥＣ）を微小血管増殖サプリメント（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＭＶＧＳ）（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を補足したＭ１３１培地（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に２５，０００／ウェルの密度で９６ウェル組織クラスター（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に接種する。コンフルエンスになった時（２４時間後）、細胞を、１％胎児牛血清（ハイクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を補足したＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替える。ヒト組換えＩＬ−３１（試験試薬）を、抗体刺激有りおよび無しで種々の濃度（０．４〜１０ｎｇ／ｍｌ）で加えて、接着を引き起こす免疫細胞−内皮細胞相互作用へのタンパク質の影響を試験する。いくつかのウェルには、ＩＬ−３１以外に既知の炎症促進性サイトカインである０．３ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて、炎症性条件下での内皮細胞に及ぼすタンパク質の影響を試験する。０．３ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファのみを陽性対照として使用し、使用した濃度はこの系で最大ＴＮＦアルファ作用の約７０％であり、すなわちこれは内皮細胞へのＵ９３７（ヒト単球様細胞株）の最大接着を引き起こさない。このため、この構成は、ＴＮＦアルファ作用のアップレギュレーションとダウンレギュレーションの両方を検出することができる。ＴＮＦアルファ有りおよび無しの両方の接着基礎レベルを、試験試薬の影響を評価するためのベースラインとして使用する。
内皮細胞を試験試薬とともに一晩インキュベート後、Ｕ９３７細胞を５μＭのカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）−ＡＭ蛍光マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、１％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド無し）に細胞を懸濁し、洗浄したＴＲＢＭＥＣ単層上に１００，０００細胞／ウェルで蒔く。３０分後に、非接着Ｕ９３７を除去するために暖かいＲＰＭＩ１６４０（フェノールレッド無し）でウェルを３回洗浄の前と後に、４８５／５３８ｎｍの励起／発光波長で蛍光レベルを測定（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダー、サイトフルオル（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）アプリケーション）する。洗浄前（合計）および洗浄後（接着特異的）蛍光レベルを使用して、接着パーセントを決定する（真の接着／真の合計×１００＝％接着）。
実施例７
ＩＬ−３１バイオアッセイプロトコール
ｈｚＣＹＴＯＲ１７（ＩＬ−３１ＲＡ）、ｈＯＳＭＲＢ、およびＫＺ１３４でトランスフェクトしたＢＡＦ３細胞を５×１０5と１×１０6細胞／ｍｌに増殖させる。アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびペン／ストレプ（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（すべてＧｉｂｃｏ）で細胞を洗浄し、アッセイ培地に３×１０5細胞／ｍｌで再懸濁する。９６ウェルの不透明プレートでｈＩＬ−３１標準物質を二重測定でアッセイ培地中６００ｐｇ／ｍｌから９．３８ｐｇ／ｍｌまで１００μｌ／ウェルで１：２連続希釈で力価測定する。品質管理標準物質を二重測定でプレートに１００μｌ中３５０ｐｇ／ｍｌおよび３５ｐｇ／ｍｌ加える。試験試料はしばしば１：２または１：４に希釈され、二重測定で試料ウェルに加えられる。１００μｌの洗浄したＢＡＦ３細胞を各ウェルに最終濃度３×１０4細胞／ウェルで加える。プレートを５％ＣＯ2インキュベーター中で＋３７℃で１６〜２４時間インキュベートする。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を払い落とし、２５μｌ／ウェルの溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加える。１０分後プレートをルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で読む。ルミノメーターは４０μｌ／ウェルのルシフェラーゼ基質ミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、燐光を４秒間積分する。燐光値をスプレッドシートに取り出し、解析し、１ｍｌ容量の１０6細胞当たりのＩＬ−３１のピコグラムに変換する。
実施例８
インビボの接触過敏症の開始と感知へのＩＬ−３１の関与
方法Ｉ
アセトン：オリーブ油（４：１）に溶解した２５μｌの０．５％ＤＮＦＢ（２，４−ジニトロ−フルオロベンゼン、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を、ピペッターを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスの毛を剃った背中の真ん中に塗布する。ビヒクル対照群には２５μｌのアセトン：オリーブ油のみを投与する。５日後、吸入チャンバー中でイソフルオランでマウスを麻酔し、実験動物と対照動物の両方の耳介をエンジニアのマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で測定してベースライン測定値を得る。次にアセトン：オリーブ油（４：１）に溶解した１０μｌの０．２５％ＤＮＦＢをすべてのマウスの各耳の両側に適用してマウスを抗原刺激する。２４時間および４８時間後、右耳（抗原刺激）と左耳（非抗原刺激）との差として接触過敏症を測定する。すべての測定はエンジニアのマイクロメーターを使用して行う。実験を受けたことが無いマウスの抗原刺激した耳と抗原刺激しない耳の腫張の差によりバックグランド値を測定する。
屠殺前にＦＡＣＳおよび／またはＥＬＩＳＡ分析のための全血と血清を採取し、組織学的分析のために耳を採取する。
方法II（Ｔｈ２応答を誘導する）
１、２および８日目にアセトン／フタル酸ジブチル（ＭＳＤＳ）の１：１溶液中の１００μｌの０．５％ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を、ピペッターを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスの毛を剃った背中の真ん中に塗布する。１３日目に吸入チャンバー中でイソフルオランでマウスを麻酔し、実験動物と対照動物の両方の耳介をエンジニアのマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で測定してベースライン測定値を得る。次に２５μｌの０．５％ＦＩＴＣ（１：１のアセトン／フタル酸ジブチル中）を各耳の背表面に適用してマウスを抗原刺激する。２４時間および４８時間後、右耳（抗原刺激）と左耳（非抗原刺激）との差として接触過敏症を測定する。すべての測定はエンジニアのマイクロメーターを使用して行う。実験を受けたことが無いマウスの抗原刺激した耳と抗原刺激しない耳の腫張の差によりバックグランド値を測定する。屠殺前にＦＡＣＳおよび／またはＥＬＩＳＡ分析のための全血と血清を採取し、組織学的分析のために耳を採取する。
方法III（Ｔｈ１応答を誘導する）
２５μｌの２％オキサザロン（４：１のアセトン／オリーブ油中）を、ピペッターを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスの毛を剃った背中の真ん中に塗布する。７日目に吸入チャンバー中でイソフルオランでマウスを麻酔し、実験動物と対照動物の両方の耳介をエンジニアのマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で測定してベースライン測定値を得る。次に８μｌのオキサザロンを各耳の背表面に適用してマウスを抗原刺激する。２４時間および４８時間後、右耳（抗原刺激）と左耳（非抗原刺激）との差として接触過敏症を測定する。すべての測定はエンジニアのマイクロメーターを使用して行う。実験を受けたことが無いマウスの抗原刺激した耳と抗原刺激しない耳の腫張の差によりバックグランド値を測定する。屠殺前にＦＡＣＳおよび／またはＥＬＩＳＡ分析のための全血と血清を採取し、組織学的分析のために耳を採取する。
実験の感作期と抗原刺激期の両方でＩＬ−３１に対する本明細書に記載の抗体を使用して、接触過敏症の開始と持続におけるＩＬ−３１の関与を試験する。
実施例９
インビボのアトピー性皮膚炎におけるＩＬ−３１の関与
方法Ｉ（ＮＣ／Ｎｇａマウスの感作）
ＮＣ／Ｎｇａマウスをシーアールエルジャパン（ＣＲＬ Ｊａｐａｎ）から購入した。到着時マウスは４週齢であり、ＳＰＦ隔離状態に４週間置いて馴化させた。抗原感作の開始時のマウスは約１０〜１１週齢であった。約１０μｇのヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｅｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ）（Ｄｐ）（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、特注）抽出物を、マウスが皮膚病変を発症するまで週に３回で５〜６週間、首筋に皮内注射した。対照動物には１０μｌのＰＢＳを週に３回皮内注射した。Ｄｐ抽出物はＭａｔｓｕｏｋａと共同研究者による方法に従って調製した。Ｍａｔｓｕｏｋａら、Ａｌｌｅｒｇｙ：５８，１３９（２００３）。簡単に説明すると、凍結乾燥して効力の弱まった５９５ｍｇのＤｐ抽出物を１２ｍｌの無菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に溶解した。Ｄｐを５０ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブでシェーキングロッカー上で３０分間混合した。抽出物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、１ｍｌのクリオバイアル管に分注し、−２０℃で保存した。
方法II（ＤＯ１１．１０マウスの感作）
ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウスは室内コロニーから飼育し、抗原感作の開始時は９．５〜１４週齢であった。経皮感作の２４時間前にイソフルオランでマウスを麻酔し、電子バリカンでマウスの胴体全体（背中と腹）の毛を剃った。次に背中にエラスチン手術テープ（ジョンソンアンドジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）を用いて、マウスをテープで裸にした。１ｃｍ２の無菌ガーゼパッチを５００μｇのオバルブミン（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）３２４６７）または無菌ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で湿らせ、デュオダームエキストラシンドレシング（ＤｕｏＤｅｒｍ Ｅｘｔｒａ Ｔｈｉｎ Ｄｒｅｓｓｉｎｇ）（コンバテク（ＣｏｎｖａＴｅｃ）１８７９３２）でマウスの左の背中に接着させた。次にパッチとドレシングをエラスチン手術テープのボディーラップで覆い、マウスがパッチをはずしたり壊したりできないようにした。パッチは７日間装着し、取り外した。次の経皮感作前２週間、マウスを休息させた。マウスに感作を１週間に全部で３回行った。
結果
イエダニ（ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ）感作ＮＣ／Ｎｇａ動物とＯＶＡ感作ＤＯ１１．１０動物からの病変および非病変皮膚中のＩＬ−３１ＲＡ発現の免疫組織化学分析は、ＩＬ−３１ＲＡがマウスの表皮ケラチン細胞により発現されるが、抗原感作動物とＰＢＳ感作動物の間に発現レベルの有意な差は見つからないことを証明した。
実施例１０
ラット抗マウスＩＬ−３１抗体の投与による痒みの阻止
別のＮＣ／Ｎｇａマウス試験では、オスのＮＣ／Ｎｇａマウス（ＳＬＣ、東京）（４週齢）を、すでに軽〜中程度の皮膚炎を発症しているＮＣ／Ｎｇａマウスに接触させた。７週目にマウスを３群に分け、以下の処理を行った。７週間にわたって５日目毎に、１つの群のマウスに１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−３１ラット抗マウス注射を行った；１つの群にはマウス血清アルブミン注射を行い；第３の群には何の処理もしなかった。マウスを週に２回、皮膚病変の重症度を臨床的に評価した。具体的には、皮膚への影響（０＝影響無し；１＝背中に影響；２＝背中と顔；３＝背中、顔、および耳）と病変の重症度（０＝正常な皮膚；２＝うろこ状で乾燥；２＝結節性病変；３＝血性病変）。さらに引っ掻きを評価した。後ろ足を使用するマウスの引っ掻きは自動検出し、マイクロアクト（ＭｃｒｏＡｃｔ）（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、東京、日本）を使用して客観的に評価した。小さなテフロン被覆磁石を、ケタラール／キシラジン麻酔下でマウスの両方の後ろ足の背部に皮下移植した。磁石を有するマウスは、円形コイルに囲まれた観察チャンバーに入れた。磁石の動きによりコイル中で誘導された電流を増幅し記録した。解析プログラムは以下の設定を使用して引っ掻きイベントを記録する：閾値（Ｖ）０．１；イベントギャップ（秒）０．２；最大フレグ（Ｆｒｅｇ）（ＨＺ）２０．０；最小フレグ（Ｆｒｅｇ）２．０；および最小持続（秒）１．５．注：ＮＣ／Ｎｇａマウスモデルでは、長期持続（＜１．５秒）挙動はマウス中の皮膚特異的痒み感に関係し、短期持続（０．３〜１．５秒）引っ掻き挙動は関係しない。測定した全体の主要な終点は，マウスの引っ掻き、皮膚炎、および体重である。
結果：
全期間を取ると、ラット抗マウスＩＬ−３１抗体による処理は主要な終点に達しなかった。しかしさらに解析すると、２２〜４３日の期間に抗ＩＬ−３１抗体処理による引っ掻きの大きな低下が明らかになった。この期間に、全期間と同様に、抗ＩＬ−３１抗体による処理はアトピー性皮膚炎様病変の出現に影響を与えず、疾患動物の体重増加の正常化しなかったが、これはおそらく臨床症状の出現が遅かったためまたは処理の停止時の中和自己抗体のためであろう。この実験では、抗体による処理が開始された時、皮膚炎ではなく引っ掻き行動はほとんどの動物ですでに増大していた。
実施例１１
インビボのＤＴＨへのＩＬ−３１の関与
方法
ＤＴＨ応答を生成するために、０日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、５０〜１００μｌ総量）中の１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）を尾の基部に皮下免疫してマウスを抗原で感作した。１週間後、吸入チャンバー中でイソフルオランでマウスを麻酔し、実験動物と対照動物の両方の耳介をエンジニアのマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で測定してベースライン測定値を得た。マウスに総量１０μｌでＰＢＳ中の１０μｇのＯＶＡを左の耳の耳介に皮内に、静脈に当たらないように皮膚のすぐ下に抗原刺激した。対照としてマウスの右耳の耳介に１０μｌのＰＢＳを投与した。ある場合には、耳にＯＶＡを皮内注射した別の対照群を、反応を阻害する陽性対照として局所的コルチコステロイドで処理する。抗原刺激の２４時間および４８時間後に、マウスを麻酔し、耳の厚さを測定する。結果は以下のように表す：特異的な耳の腫張＝実験耳についての（２４時間測定値−０時間測定値）−陰性対照耳についての（２４時間測定値−０時間測定値）。ＤＴＨの証明である硬化は感作抗原の注射後１８時間までに検出可能になり、２４〜４８時間で最大になる。触知可能な硬化の開始の遅れが応答を「遅延型」と名付けた理由である。
結果
ＩＬ−３１トランスジェニックマウスをＤＴＨについて試験したが、非抗原刺激ＩＬ−３１トランスジェニック動物の耳の厚さの増加のために、野生型対照と比較してＩＬ−３１ Ｔｇ動物でＤＴＨの統計的に有意な差は測定されなかった。ＤＴＨ応答でＩＬ−３１受容体ノックアウト動物も試験したが、受容体ノックアウトと野生型動物の間にＤＴＨ応答の有意差は観察されなかった。
実施例１２
痒み応答の誘導におけるＩＬ−３１の関与
方法Ｉ（ＩＬ−３１処理マウスのカプサイシン処理）
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ動物（ＣＲＬ）を麻酔し、長期作用性鎮痛薬である０．１ｍｇ／ｋｇの塩酸ブプラノルフィンを皮下注射し、次に食塩水中の１０％エタノール＋１０％ツイーン８０中の４ｍｇ／ｍｌの０．２５ｍｌのカプサイシン溶液を首筋に皮下注射した。神経毒処理後、動物を少なくとも３０分麻酔した。４８時間後、２０μｇ／日のＩＬ−３１の１４日間連続投与のために、１４日間浸透圧ポンプを皮下移植した。以下の基準を使用してマウスを脱毛症とそう痒症について６日間追跡した：０＝引っ掻き無し、動物は正常に見える、１＝小さい領域の外皮が薄くなる、引っ掻きが認められる、２＝わずかな脱毛（小さいパッチ）、引っ掻き、３＝中程度の脱毛、引っ掻き、そして４＝重症の脱毛、過剰の引っ掻き。
結果は、非カプサイシン処理マウスは３日間のＩＬ−３１投与後に平均引っ掻き／脱毛スコアは２．６２５であり、カプサイシン処理マウスは有意に低いスコアの１であった。すなわちＩＬ−３１投与の前にカプサイシンで処理したマウスは、６日間の実験にわたって引っ掻きと脱毛の発生の遅れを示し、引っ掻きと脱毛の強度は低スコアであった。これらのデータは、ＩＬ−３１が、ＩＬ−３１に誘導されるアルカリホスファターゼとそう痒症に寄与するある神経成分を誘導することを示唆する。従ってＩＬ−３１の中和は、痒みを含む皮膚障害の患者において、痒み従って皮膚炎の頻度と強度を低下させる可能性がある。
方法II
Ｔａｃ１遺伝子にホモ接合性のヌル（ｎｕｌｌ）であるマウスは、検出可能なサブスタンスＰまたはニューロキニンＡを発現しない。これらのマウスは中程度〜強い刺激に対して侵害受容の疼痛応答が低下しており、従って疼痛／痒み処理および炎症性疾患状態へのタキキニンペプチドの寄与を研究するための有用な手段である。１２週齢のＴａｃ１ノックアウトマウスに、１μｇ／日のＩＬ−３１タンパク質を送達する１４日間浸透圧ポンプを移植し、毎日脱毛症とそう痒症について以下の基準を使用して追跡した：０＝引っ掻き無し、動物は正常に見える、１＝小さい領域の外皮が薄くなる、引っ掻きが認められる、２＝わずかな脱毛（小さいパッチ）、引っ掻き、３＝中程度の脱毛、引っ掻き、そして４＝重症の脱毛、過剰の引っ掻き。
この試験の結果は、Ｔａｃ１欠損マウスが野生型対照マウスと比較して、ＩＬ−３１誘導引っ掻き／脱毛に対して感受性が低いことを示す。野生型マウスの１００％（１０／１０）がＩＬ−３１処理の６日目までに引っ掻きと脱毛の証拠を示したが、同じ時点でわずかに３３．３％（２／６）のＴａｃ１欠損マウスが引っ掻きと脱毛の兆候を示した。これらのデータは、ＩＬ−３１処理マウスで引っ掻き／脱毛表現型に寄与する神経成分をＩＬ−３１が誘導し、ＩＬ−３１の中和が皮膚炎における引っ掻きの頻度と強度を低下させることを示す。
方法III（ＩＬ−３１中和抗体の投与）
約８〜１２週齢の正常なメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＲＬ）に、１μｇ／日のｍＩＬ−３１を送達する１４日間浸透圧ポンプ（アルゼット（Ａｌｚｅｔ）、＃２００２）を皮下移植した。ＩＬ−３１投与の前に、何群かのマウスにラット抗マウスＩＬ−３１モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／マウス）を１週目から出発して週に２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。対照群のマウスに同じ投与スケジュールでビヒクル（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）の腹腔内注射を行った。以下の基準を使用してマウスを脱毛症とそう痒症について毎日スコアを付けた：０＝引っ掻き無し、動物は正常に見える、１＝小さい領域の外皮が薄くなる、引っ掻きが認められる、２＝わずかな脱毛（小さいパッチ）、引っ掻き、３＝中程度の脱毛、引っ掻き、そして４＝重症の脱毛、過剰の引っ掻き。
すべての実験でラット抗ｍＩＬ−３１ ｍＡｂで処理したマウスは症状の出現が約５〜７日間遅れ、脱毛症とそう痒症について全体のスコアが低かった。すべての群のｍＡｂ処理したマウス（投与頻度または濃度に無関係に）は、試験の１３日までに対照マウスと同様の脱毛症とそう痒症を発現した。これらのデータは、ＩＬ−３１の中和がＩＬ−３１に誘導される引っ掻き／脱毛の発症を遅らせることができることを示唆する。
実施例１３
マウス抗ヒトＩＬ−３１ ｍＡｂの性状解析
（組換え）ヒトインターロイキン３１（ＩＬ−３１）に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する２１個のクローンハイブリドーマのパネルを単離した。強く中和性のｍＡｂを産生する１０個のハイブリドーマを単離した。これらを競合結合試験に基づいて２つのサブ区分に割り当てた。弱中和性ｍＡｂを産生する１１個のハイブリドーマを単離した。これらを競合結合試験に基づいて４つの追加区分に割り当てた。１つのｍＡｂはウェスタンブロットで充分機能し、また免疫組織化学でも充分機能した。競合的アンタゴニストとして使用するのに適した３つのｍＡｂが同定された。サンドイッチイムノアッセイに適したｍＡｂも同定された。
Ａ．ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるエピトープ区分け（ｂｉｎｎｉｎｇ）
材料：捕捉抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃγ特異的（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＃１１５−００５−０７１）である；ブロッキング抗体はポリクローナルＩｇＧ Ｆｃフラグメント（ジャクソンラブズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）である；抗原：ＣＥＥ親和性タグを有するＢＨＫで産生したｒＩＬ−３１：ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）１０００；ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５ ＮＨＳ活性化チップ（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、ＰＮ ＢＲ−１０００−１４）。
方法：ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）１０００（登録商標）システムで試験を行った。操作法をプログラムするためにビオログ（ＢＩＡｌｏｇｕｅ）ｖ１．２を使用した。ヤギ抗マウスＦｃ抗体をリジン残基を介してビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）ＣＭ５チップに共有結合的に固定化して、試験のための活性結合表面を作製した。２１個のマウス抗ｈｕＩＬ−３１ ｍＡｂクローン調整培地上清のそれぞれをまずヤギ抗マウスＦｃ表面に注入して、試験すべき１次ｍＡｂが好適な配向で抗マウス抗体表面に結合するようにした。次に残りの結合部位を無関係のポリクローナルＩｇＧ Ｆｃフラグメントの注入によりブロックした。次に抗原（ｒＩｌ３１）を注入し、１次抗体表面に捕捉させた。次に２１個のマウス抗ｈｕＩＬ−３１ ｍＡｂクローン調整培地上清の１つを注入して、２次抗体の結合を試験した。１次および２次ｍＡｂが抗原上の同じ結合部位について競合した場合、２次ｍＡｂは結合しなかった。２つのｍＡｂが抗原上の同じ結合部位について競合しなかった場合は、第２ｍＡｂが結合した。
各上清をｍＡｂの全セットと組合せて１次ｍＡｂとして試験した。１次ｍＡｂまたは抗原が存在しない場合は２次ｍＡｂの応答が無いことを証明するために、対照サイクルを行った。自身について試験した各ｍＡｂを陰性対照として使用して、バックグランドシグナルのレベルを確立した。データをビオエバルエーション（ＢｉｏＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）３．２ＲＣＩソフトウェアを使用して編集し、次にエクセル（Ｅｘｃｅｌ）（登録商標）に入力してデータ処理した。モノクローナル抗体対を試験する各サイクルの間に、ヤギ抗マウスＦｃ表面を５０ｍＭ ＨＣｌで２×３０秒洗浄して再生した。
強中和性ｍＡｂ（１０）と弱中和性ｍＡｂ（１１）とを２つの別のパネルで試験したが、弱中和性ｍＡｂを試験する時は、強中和性ｍＡｂの代表としてハイブリドーマ２９２．６４．６からのｍＡｂを含めた。さらに最初の２つの区分けパネルについてのエピトープ区分の相対的親和性測定値と中和データを再調査した後、強中和性ｍＡｂと弱中和性ｍＡｂの両方を含む８つの「選択された」ｍＡｂについて第３のパネルの区分けを行った。
結果：強中和性ｍＡｂと弱中和性ｍＡｂの両方の分析のために、モノクローナル抗体対を試験する３つのパネルを完成させた。第１のパネルはすべての強中和性ｍＡｂを互いに試験し、第２のパネルはすべての弱中和性ｍＡｂ（およびハイブリドーマ２９２．６４．６からの代表的強中和性ｍＡｂ）を互いに試験した。第３のパネルは、さらなる評価のために選択された強中和性ｍＡｂと弱中和性ｍＡｂの両方のサブセットの対合を明白に評価するために完成させた。
異なるｍＡｂ対について測定した絶対応答（ＲＵ）の変化以外に、対の配向が変化した時（すなわち１次ｍＡｂ対２次ｍＡｂとして使用した対の１つのｍＡｂ）、いくつかのｍＡｂ対は異なって挙動した。このような挙動はしばしば観察され、一般に重複エピトープを有する関係するｍＡｂが原因である。
最初の２つの完成したパネルの分析から、全部で４つの異なる区分が得られた。第１のパネルについてすべての強中和性抗体は一緒に単一の区分を規定するように分類された（区分１：２９２．１２．３、２９２．３９．５、２９２．５１．５、２９２．６３．５、２９２．６４．６、２９２．７２．３、２９２．８４．１、２９２．１０５．４、２９２．１０９．４、２９２．１１８．６）。第２のパネルでは弱中和性抗体を、区分＃１の１つの代表（２９２．６４．６）とは明確に異なる３つの追加の主要な区分に分類した（区分２：２９４．３５．２、２９４．１４６．５、２９２．１５２．４、２９４．１５４．５；区分３：２９４．３５．３、２９１．７８．４、２９４．１５８．５、２９４．１５５．６、２９４．１６３．２；区分４：２９４．１４４．３）。さらにパネル２で評価された多くのｍＡｂ対の多くは、ｍＡｂを試験した配向に依存して応答の明確な非対称性を示し、結合部位にある程度の重複が存在することを示す。区分３からの２つのｍＡｂ（２９４．３５．３と２９１．７８．４）は、２次ｍＡｂとして試験した時区分２のｍＡｂとの競合の証拠を示した。パネル２ではまた、強中和性抗体２９２．６４．６（区分１）は、１次抗体として試験した時区分３のｍＡｂとの競合を示した。
最初に２つのビニングパネルの完了後、さらなる評価のために最も強い中和性ｍＡｂと最も高い親和性の弱中和性ｍＡｂの群を選択し、互いにパネル３で試験した。第３のパネルの結果は、強中和性抗体が一緒に区分けされ、弱中和性抗体が確立された複数の区分に分離されることを示す前の試験と完全に一致した。さらに第３のパネルは、区分２からの２つのｍＡｂ（２９４．３５．２と２９２．１５４．４）の結合で部分的に重複し、ｍＡｂのサブセットは区分１に割り当てられる（２９２．１２．３、２９２．７２．３、２９２．８４）ことを示した。こうして、サブ区分１Ａと１Ｂは区分１に割り当てられた。パネル３では、ハイブリドーマ２９２．１６３．２（区分３）と２９２．１４４．３（区分４）からのｍＡｂは単独に区分けされた。
Ｂ．マイクロタイタープレート（無標識競合ＥＬＩＳＡ）エピトープ区分け
材料：捕捉抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）１１５−００５−０７１である；ブロッキング抗体はマウスＩｇＧ１（ザイモジェネティクス（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ））である；ハイブリドーマからの調整培地上清をこの試験のために使用した；抗原は、スルホ−ＮＨＳ−ビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を使用してビオチン化したＣＥＥ親和性タグを有するＢＨＫで産生したｒＩＬ３１である；ヌンクマキシソーブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）９６ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）；ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０、１％ＢＳＡ）；ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）；ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）。
方法：この方法は、Ｎａｇａｔａら（２００４）が記載した無標識競合ＥＬＩＳＡ（ＬＦＣ−ＥＬＩＳＡ）に似ている。エピトープ区分けのためのこの方法はビオチン化ｒＩＬ３１を使用した。マイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０、１％ＢＳＡ）で希釈した１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−γ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ＃１１５−００５−０７１）を用いて１００μｌ／ウェルで被覆した。この被覆抗体を周囲温度で３時間結合後、各ｍＡｂ含有調整培地をＥＬＩＳＡ Ｂで希釈して約０．５μｇ／ｍｌ濃度のｍＡｂを得て、ヤギ抗マウスＩｇＧ被覆プレートに４℃で一晩結合させた（ｍＡｂ＃１）。平行して第２のセットの調整培地（ｍＡｂ＃２）をポリスチレン試験管で希釈してＥＬＩＳＡ Ｂ中約０．５μｇ／ｍｌのｍＡｂを得て、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｒＩＬ３１抗原と混合し、４℃で一晩インキュベートした。ｍＡｂ＃１を被覆抗体とインキュベート後、プレートを無関係の抗体でブロックして、プレート上の非占有結合部位を飽和させた。ｍＡｂ＃２−ビオチン−ｒＩＬ３１混合物をプレートに加え、結合させた。アッセイ（非競合）の対照として５０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ｒＩＬ３１を、固定化ｍＡｂ＃１を含有するウェルに直接（ｍＡｂ＃２とのプレインキュベート無しで）加えた。ビオチン化−ＩＬ３１−ｍＡｂ＃２複合体とインキュベート後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を０．５μｇ／ｍｌでプレートに加えた。プレートをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）で発色させ、個々のウェルの吸光度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓスペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）３４０、サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリホルニア州）で４５０ｎｍで測定した。ｍＡｂ＃１がｍＡｂ＃２とは異なるエピトープを認識した場合、ビオチン化−ｒＩＬ３１−ｍＡｂ＃２複合体はプレートに結合し高吸光度読み値を与えた。ｍＡｂ＃１がｍＡｂ＃２上の同じエピトープを認識した場合、ビオチン化−ｒＩＬ３１−ｍＡｂ＃２複合体はプレートに結合せず、低い吸光度読み値が得られた。
結果：２１個のｍＡｂの完全なパネルを、一連の６つの９６ウェルマイクロタイタープレートで自身に対して同時に試験した。４５０ｎｍでの吸光度値（Ａ４５０ｎｍ）を各組合せと配向について記録し編集した。すべての場合で自己−自己組合せについて低い吸光度値が得られた。自己−自己対照以外に、５０ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−３１−ビオチンの陽性対照（競合するｍＡｂ＃２無し）を、すべてのプレートで各１次ｍＡｂを使用して試験した。各１次ｍＡｂについて２つの陽性対照試料を得て、二重測定試料の値は似ていた。１１個の弱中和性ｍＡｂ（区分２、３または４から）のうちの９個について陽性対照ウェル（ｍＡｂ＃２無し）から得られた吸光度値は、残りのｍＡｂについての対照試料について測定した吸光度値より低かった。これはおそらく、これらのｍＡｂの低い親和性（高いＥＣ５０）のためである。結果の解釈を容易にするために、吸光度値を標準化してある並びのｍＡｂの組合せ（捕捉ｍＡｂ（ｍＡｂ＃１）は一定にした）について測定した最大吸光度に１００％の値を割り当てた。標準化した値は２つの異なる群に分類された：値の大きいクラスターは競合に一致して３２％より小さい値になり、値の第２の大きいクラスターは競合が無いために３２％を超えた。２つの異なるカテゴリー（非競合と競合）の１つへｍＡｂの各組合せと配向を割り当てるために、３２％閾値を使用した。分類したデータを使用して、ヒエラルキークラスターアルゴリズムに基づいて区分けを自動で行った。ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する区分け実験で観察されたように、いくつかのｍＡｂ対は１次ｍＡｂとしてどのｍＡｂを使用したかにより異なって分類された。両方の配向で競合を必要とする高厳密性レベルを使用して、ｍＡｂを１次区分に割り当てた。次に１つの配向でのみ競合を必要とする低厳密性基準を使用して、挙動のわずかな差に基づいてｍＡｂをサブ区分に割り当てた。標準化データを高厳密性基準に基づいて５つの１次区分割り当てに従って分類した。さらにｍＡｂの組合せと配向をカラーコード（競合は白、非競合は黒）して相互作用を視覚化し、ｍＡｂをサブ区分に割り当てた。
競合ＥＬＩＳＡによる区分けの結果は、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する試験の結果に基く区分割り当てに一致する。厳密性区分け基準を使用して、以下の区分が定義された：
区分＃１（強中和性ｍＡｂのすべてを含む）：２９２．７２．３、２９２．６４．６、２９２．６３．５、２９２．５１．５、２９２．３９．５、２９２．１２．３、２９２．１１８．６、２９２．１０９．４、２９２．１０５．４、２９２．８４．１
区分＃２：２９４．３５．２、２９４．１５４．５、２９４．１４６．５、２９２．１５４．４、２９２．１５２．４
区分＃３：２９４．３５．３、２９４．１６３．２、２９４．１５８．５、２９４．１５５．６
区分＃４：２９４．１４４．３
区分＃５：２９１．７８．４
区分＃１に注目すると、区分＃１中のハイブリドーマの３つ（２９２．７２．３、２９２．１２．３、２９２．８４．１）からのｍＡｂは、２次ｍＡｂ（ｍＡｂ＃２）として使用した時、区分＃２からのｍＡｂの３つとの競合を示した。この挙動に基づいて区分＃１を２つのサブ区分（＃１Ａと＃１Ｂ）に分類し、区分＃１Ｂは結合について区分２のｍＡｂと競合するｍＡｂを含有した。区分＃１Ａは、２９２．６４．６、２９２．６３．５、２９２．５１．５、２９２．３９．５、２９２．１１８．６、２９２．１０９．４、２９２．１０５．４を含有する。区分＃１Ｂは、２９２．７２．３、２９２．１２．３、および２９２．８４．１を含有する。
区分＃２に注目すると、３つの異なる相互作用が明らかであり、これを使用して区分＃２と３つのサブ区分を分類した。区分＃２Ａはハイブリドーマ２９４．１４６．５からのｍＡｂを含有し、これは区分＃１と＃２の両方からのすべてのｍＡｂと競合する。区分＃２Ｂはハイブリドーマ２９４．３５．２と２９４．１５４．４からのｍＡｂを含有し、これは区分＃１からの（２次）ｍＡｂと競合する。区分＃２Ｃは、ハイブリドーマ２９２．１５４．４と２９２．１５２．４からのｍＡｂを含有し、２次ｍＡｂとして使用すると区分＃４からのｍＡｂと競合する。
区分＃３、＃４および＃５に注目すると：区分＃３のｍＡｂ（ハイブリドーマ２９４．３５．３、２９４．１６３．２．１、および２９４．１５５．６から）は、２次ｍＡｂとして使用すると、区分＃４と＃５の両方からのｍＡｂと競合する。区分＃４（ハイブリドーマ２９４．１４４．３．５から）と＃５のｍＡｂは、主にサブ区分＃２Ｃ中のｍＡｂとの相互作用（およびウェスタンブロットでのハイブリドーマ２９４．１４４．３からのｍＡｂのユニークな結合性）により区別される。
２１個のｍＡｂの完全パネルをＬＦＣ−ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して同時に試験すると、区分１とサブ区分＃１Ａと＃１Ｂが明確に同定された。ｍＡｂの完全なパネルを同時に試験すると区分＃２と＃３の部分的重複も同定され、区分＃２は３つのサブ区分に分類された。ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）データに基づく区分割り当てとの１つの大きな差は、ＬＦＣ−ＥＬＩＳＡデータを用いて厳密性基準を使用した時、ハイブリドーマ２９１．７８．４と２９４．１４４．３からのｍＡｂが２つの異なる区分へ割り当てられたことである。ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）試験に基づいて、ハイブリドーマ２９１．７８．４からのｍＡｂは区分＃３に割り当てられていた。
Ｃ．プレートベースの親和性測定
材料：捕捉ポリクローナル抗体はヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）、ペンシルバニア州、＃１１５−００５−０７１）である；ブロッキングポリクローナル抗体は抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、＃２０９−００５−０８２）である；ハイブリドーマからの調整培地上清をこの試験のために使用した；抗原は、スルホ−ＮＨＳ−ビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を使用してビオチン化したＣＥＥ親和性タグを有するＢＨＫで産生したｒＩＬ３１である；ヌンクマキシソーブ（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）９６ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ニューヨーク州）；ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０、１％ＢＳＡ）；ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）；ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）。
方法：この方法はＨｅｙｎｉｎｇｅｎ（１９８６）が記載した方法に似ている。マイクロタイタープレートを、ＥＬＩＳＡ Ｂ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０、１％ＢＳＡ）で希釈した１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−γ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ＃１１５−００５−０７１）を用いて１００μｌ／ウェルで被覆した。この被覆抗体を周囲温度で３時間結合後、各モノクローナル抗体含有上清をＥＬＩＳＡ Ｂで希釈して約１μｇ／ｍｌ濃度のｍＡｂを得て、プレートに周囲温度で１時間結合させた。ビオチン化ｒＩＬ３１抗原の連続希釈物をＥＬＩＳＡ Ｂで５００ｎｇ／ｍｌ〜０ｎｇ／ｍｌまで調製し、ウェルに加えた。ビオチン化抗原と混合しインキュベート後、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）をプレートに加えた。プレートをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オウィングズミルズ（Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ）、メリーランド州）で発色させ、個々のウェルの吸光度を４５０ｎｍでプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓスペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）３４０、サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、カリホルニア州）で測定した。二重測定点を平均化し、データを４パラメータフィットで解析した。４パラメータフィットの「Ｃ」値は、見かけのＥＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）として報告され、アッセイで半分最大応答を産生するビオチン−ｒＩＬ３１濃度である。
結果：すべての２１個のｍＡｂについて実験曲線から４パラメータフィットが得られた。半分最大応答を与えるビオチン−ｒＩＬ３１の濃度（ＥＣ５０）は３．３〜２３６ｎｇ／ｍｌの範囲であり、１０個の強中和性ｍＡｂは低い同等のＥＣ５０値（３．３〜４．４ｎｇ／ｍｌ）を示した。
材料：抗原は、ＣＥＥ親和性タグを有するＢＨＫで産生したｒＩＬ３１である；４〜１２％ ヌページ（ＮｕＰＡＧＥ）ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリホルニア州）；非還元性試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリホルニア州）；分子量標準物質はシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である；１×ＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ウェスタンＡ緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）、０．２５％ゼラチン）；０．２μｍニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）；ｒＩＬ３１に特異的な親和性精製ウサギｐＡｂ（ザイモジェネティクス（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ））；ロバ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ルミライトプラス（Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ）化学発光試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム、ドイツ）；ルミ−イマージャー（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（マンハイム−ベーリンガー（Ｍａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））。
方法：ウェスタンブロットで変性および変性／還元ｒＩＬ３１を検出するｍＡｂの能力をこの試験で調べた。ｒＩＬ３１抗原を還元性または非還元性緩衝液と混合し、７０℃で１０分間加熱し、次に１００ｎｇ／レーンで４〜１２％ヌページ（ＮｕＰＡＧＥ）ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリホルニア州）にのせた。分子量標準物質はシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、電気泳動は１×ＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。ゲル中のタンパク質バンドを０．２μｍニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）Ａ緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、０．０５％イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）、０．２５％ゼラチン）中の２．５％脱脂乾燥ミルクで一晩ブロックした。ニトロセルロース膜を約０．１μｇ／ｍｌ ｍＡｂの各モノクローナル抗体とプローブ結合させた。次にブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）に結合した２次抗体とプローブ結合させた。陽性対照として、別々のウェスタンブロットを、ＩＬ−３１に特異的な０．１μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗体（ザイモジェネティクス（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ））および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した２次抗体（ロバ抗ウサギＩｇ−ＨＲＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）とプローブ結合させた。ウェスタンブロット上のバンドをルミライトプラス（Ｌｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ）試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム、ドイツ）を用いて検出し、化学発光をルミ−イマージャー（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ（マンハイム−ベーリンガー（Ｍａｎｎｈｅｉｍ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））で記録した。
結果：抗ＩＬ３１ｍＡｂのウェスタンブロット解析は、２１個のハイブリドーマのうちの３つのみからのｍＡｂが変性ｒＩＬ３１抗原を検出することを証明した。最も強いシグナルは、ハイブリドーマ２９４．１４４．３により産生されるｍＡｂから得られた。このｍＡｂはまた、非還元／変性ｒＩＬ３１より還元／変性ｒＩＬ３１をより強く検出した。このｍＡｂで観察されたシグナルの強度はポリクローナル抗体対照で得られたものに似ていた。ハイブリドーマ２９４．１４４．３からのｍＡｂが、評価した他のモノクローナル抗体とは別の区分に属することは注目すべきである。２つの他のハイブリドーマ（２９２．８４．１と２９２．６４．６）からのモノクローナル抗体は非還元／変性ｒＩＬ３１を非常に弱く検出したが還元／変性ｒＩＬ３１は検出しなかった。この弱いシグナルはスキャンしたブロットで再現されなかった。これらのモノクローナル抗体の両方とも区分＃１からの中和抗体である。
実施例１４
ラット抗マウスモノクローナル抗体のＩＬ−３１リガンドへの相対的結合親和性
ＩＬ−３１リガンドに対する４つのラット抗Ｍｓ−ＩＬ−３１リガンドｍＡｂの相対的結合親和性を以下のように測定した。クローン２７１．２６．６．６．１、クローン２７１．３３．３．２．１、クローン２７１．３３．１．２．２、およびクローン２７１．３９．４．６．５を測定した。ヤギ抗ラットＩｇＧ−Ｆｃγ特異的抗体（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））をＣＭ５ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）チップ上に固定化した。予備試験後、各ｍＡｂが抗ラット捕捉表面に結合するようにアッセイを最適化し、次にｍＡｂに対するＩＬ−３１リガンドの濃度シリーズを注入して結合と解離を調べた。各実験後に、３０ｍＭ ＨＣｌを２回注入して、表面を固定化抗ラット抗体に再生した。各ｍＡｂについてデータを作製し、評価ソフトウェアを使用して相対的動力学値を規定した。
ｍＡｂ−抗原結合曲線の評価により作製した相対的動力学データを表４に示す。
Figure 2008541704
実施例１５
ＡＤマウスモデルにおける抗ＩＬ−３１抗体に応答したＴＡＲＣとＭＤＣの低下
方法Ｉ
６週齢のＮＣ／Ｎｇａマウス（ＣＲＬジャパン）を、週に３回５０μｇのイエダニ抽出物（ヤケヒョウヒダニ（Ｄ． ｐｅｔｅｒｏｎｙｓｓｉｕｓ）、（Ｉｎｄｏｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で背中に皮内感作し、ＡＤ様病変についてスコアをつけた。５週間の感作後マウスを安楽死させて、右耳を切除し、ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ（ギブコインビトロゲン（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を補足した４８ウェル培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１つのウェルに入れた。プレートを５％ＣＯ２加湿制御孵卵器に入れた。２４時間後上清を採取し、次に分析するまで−２０℃に凍結した。
方法II
１２週齢のメスＮＣ／Ｎｇａマウス（ＣＲＬジャパン）を、週に３回１０μｇのＳＥＢ（トキシンテクノロジー（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））で耳と背中に皮内感作した。マウスをＡＤ様病変についてスコアをつけた。５週間の感作後マウスを安楽死させて、各マウスの注入した耳から６ｍｍの生検パンチを取り、ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳを補足した４８ウェル培養ディッシュの１つのウェルに入れた。プレートを５％ＣＯ２加湿制御孵卵器に入れた。２４時間後上清を採取し、次に分析するまで−２０℃に凍結した。
感作の１〜２週間後から開始して毎週２回、両方の試験のマウスの群を１０ｍｇ／ｋｇのラット抗マウスＩＬ−３１モノクローナル抗体またはビヒクルで処理した。
２４時間上清試料のＴＡＲＣとＭＤＣ濃度を従来のＥＬＩＳＡ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。
ＴＡＲＣとＭＤＣ濃度は、両方の試験で対照マウスと比較して抗ＩＬ−３１処理マウスからの耳上清で低かったが、これらの結果はＡＮＯＶＡにより解析すると、おそらく試料サイズが小さかったために統計的有意性はなかった。両方の実験のデータを合わせ解析すると、処理群間で統計的有意差があった。
実施例１６
ＩＬ−３１中和抗体の投与
約８〜１２週齢の正常なメスＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＲＬ）に、１μｇ／日のｍＩＬ−３１を投与する１４日間浸透圧ポンプ（アルゼット（Ａｌｚｅｔ）、＃２００２）を皮下移植した。ＩＬ−３１投与の１週前から開始して週に２回、ラット抗マウスＩＬ−３１モノクローナル抗体１０ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／マウス）をマウスの群に腹腔内注射した。マウスの対照群に同じ投与スケジュールでビヒクル（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）を腹腔内注射した。以下の基準を使用してマウスを毎日脱毛症とそう痒症についてスコアをつけた：０＝引っ掻き無し、動物は正常に見える、１＝小さい領域の外皮が薄くなる、引っ掻きが認められる、２＝わずかな脱毛（小さいパッチ）、引っ掻き、３＝中程度の脱毛、引っ掻き、そして４＝重症の脱毛、過剰の引っ掻き。
すべての実験で、ラット抗ｍＩＬ−３１で処理したマウスは発症が約５〜７日遅れ、脱毛症とそう痒症について低い全体スコアを有した。すべての群のｍＡｂ処理マウス（投与頻度または濃度に無関係に）は試験の１３日までに、対照マウスと同様の脱毛症とそう痒症を示した。これらのデータは、ＩＬ−３１の中和が、ＩＬ−３１により誘導された引っ掻き／脱毛の発症を遅らせることができることを示唆する。
以上より、本発明の具体例を例示目的に本明細書で説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく種々の修飾が可能であることは理解されるであろう。従って本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (34)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；
    ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；
    ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；
    ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；
    ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；
    ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；
    ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；および
    ｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  2. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；
    ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；
    ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；
    ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；および
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  3. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；
    ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；および
    ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  4. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；および
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  5. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；および
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  6. 配列番号１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７４を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  7. 抗体が、ＩＬ−３１（配列番号２）とＩＬ−３１ＲＡ（配列番号５）との相互作用を中和する、請求項１〜６に記載の抗体。
  8. 抗体が、（ａ）マウスモノクローナル抗体、（ｂ）（ａ）から得られるヒト化抗体、または（ｃ）抗体フラグメント、または（ｄ）ヒトモノクローナル抗体である、請求項１〜６に記載の抗体。
  9. 抗体が、放射性核種、酵素、基質、補助因子、蛍光マーカー、化学発光マーカー、ペプチドタグ、磁性粒子、または毒素をさらに含む、請求項１〜６に記載の抗体。
  10. 抗体がＰＥＧ化をさらに含む、請求項１〜６に記載の抗体。
  11. 抗体が中和抗体である、請求項１〜６に記載の抗体。
  12. 哺乳動物への抗体の投与が、ポリペプチドの炎症促進活性を阻害、予防、緩和、または阻止する、請求項１〜６３に記載の抗体。
  13. 哺乳動物への抗体の投与が、ポリペプチドの炎症促進活性に関連する引っ掻きおよび皮膚炎を阻害、予防、緩和、または阻止する、請求項１〜６３に記載の抗体。
  14. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  15. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  16. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  17. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  18. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  19. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  20. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  21. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  22. ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  23. 請求項１のＩＬ−３１抗体を哺乳動物に投与することを含み、それにより炎症が緩和される、哺乳動物の炎症を緩和する方法。
  24. ＩＬ−３１が役割を果たす炎症性疾患にかかった哺乳動物を治療する方法であって、
    炎症が緩和するようにＩＬ−３１のアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで当該アンタゴニストは（ｉ）ＩＬ−３１ＲＡのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチド、または（ii）ＩＬ−３１ＲＡのポリペプチドもしくはポリペプチドフラグメントを含み、且つ
    ＩＬ−３１の炎症活性が緩和される、前記方法。
  25. ＩＬ−３１が役割を果たす哺乳動物のそう痒症の作用を緩和、阻害、または予防する方法であって、
    そう痒症が緩和するようにＩＬ−３１のアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで当該アンタゴニストは（ｉ）配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくは当該ポリペプチドのポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチドを含み、且つ
    ＩＬ−３１のそう痒活性が緩和される、前記方法。
  26. ＩＬ−３１が役割を果たす哺乳動物のそう痒症の作用を緩和、阻害、または予防する方法であって、
    哺乳動物のそう痒症の緩和があるようにＩＬ−３１のアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、
    ここで当該アンタゴニストは（ｉ）配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくは当該ポリペプチドのポリペプチドフラグメントに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、もしくは結合ポリペプチドを含み、且つ
    ＩＬ−３１の引っ掻き活性が緩和される、前記方法。
  27. 疾患がそう痒症を含む炎症性疾患である、請求項２３〜２６に記載の方法。
  28. 疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項２３〜２６に記載の方法。
  29. 疾患が結節性痒疹である、請求項２３〜２６に記載の方法。
  30. 抗体が請求項１〜６の抗体である、請求項２３〜２６に記載の方法。
  31. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが
    ａ）クローン２９２．１２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５）；
    ｂ）クローン２９２．６３．５．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９）；
    ｃ）クローン２９２．７２．３．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６）；
    ｄ）クローン２９２．８４．１．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１）；および
    ｅ）クローン２９２．１１８．６．４（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０）
    から選択されるハイブリドーマクローン名番号により産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  32. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが
    ａ）クローン２９４．３５．２．６．３（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２）；
    ｂ）クローン２９４．１４４．３．５（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３）；
    ｃ）クローン２９４．１５４．５．６（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５）；および
    ｄ）クローン２９４．１６３．２．１（ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１）
    から選択されるハイブリドーマクローン名番号により産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  33. 配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドへの結合について競合することができるモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体であって、当該ポリペプチドが、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；
    ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；
    ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；
    ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；
    ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；
    ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；
    ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；および
    ｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に結合することができる、前記抗体。
  34. アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された、
    ａ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１５；
    ｂ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８１６；
    ｃ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８２９；
    ｄ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３０；
    ｅ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８３１；
    ｆ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７１；
    ｇ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７２；
    ｈ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７５；および
    ｉ）ＡＴＣＣ特許物寄託名ＰＴＡ−６８７３
    から選択されるＡＴＣＣ特許物寄託名を有するハイブリドーマ。
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