BRPI0906478B1 - Anticorpo anti-nr10, seu uso e composição farmacêutica que o compreende - Google Patents

Anticorpo anti-nr10, seu uso e composição farmacêutica que o compreende Download PDF

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Taichi Kuramochi
Keiko Kasutani
Souhei Ohyama
Hiroyuki Tsunoda
Tomoyuki Igawa
Tatsuhiko Tachibana
Hirotake Shiraiwa
Keiko Esaki
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Abstract

anticorpo anti-nr10, seu uso e composição farmacêutica que o compreende a presente invenção refere-se a anticorpos anti-nr10 tendo uma atividade de neutralização eficaz contra nr10. os anticorpos anti-nr10 providos pela presente invenção são úteis como, por exemplo, agentes farmacêuticos para tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPO ANTI-NR10, SEU USO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE”.
Campo da Técnica
A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NR10 e a composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-NR10.
Antecedentes da técnica
Muitas citocinas são conhecidas como fatores humorais envolvidos no crescimento e diferenciação de vários tipos de células ou na ativação de funções de célula maduras diferenciadas. Células estimuladas por citocina produzem tipos diferentes de citocinas, desta maneira formando redes de citocinas múltiplas no corpo. Homeostase biológica é mantida por um equilíbrio delicado da regulagem mútua entre citocinas nessas redes. Muitas doenças inflamatórias são pensadas resultar de uma falha de tais redes de citocina. Então, terapia anticitocina baseada em anticorpo monoclonal está chamando muita atenção. Por exemplo, anticorpos anti-TNF e anticorpos de receptor anti-IL-6 foram demonstrados ser clinicamente altamente eficazes. Por outro lado, há muitos exemplos de falha onde quaisquer efeitos terapêuticos foram produzidos quando uma citocina única, tal como IL-4, foi bloqueada sozinha, devido à ativação de cursos compensatórios em condições patológicas reais.
Os presentes inventores foram bem sucedidos em isolar um novo receptor de citocina NR10 que era altamente homólogo a gp130, um receptor para transdução de sinal de IL-6 (Documento de Patente 1). NR10 forma um heterodímero com receptor M da oncostatina (OSMR) e funciona como um receptor de IL-31 (Documento de Não-patente). Com relação à IL-31, foi relatado que camundongos transgênicos superexpressando IL-31 desenvolveram espontaneamente dermatite prurítica (Documento de Patente 2).
Anticorpos que se ligam a NR10 e inibem a ligação entre NR10 e IL-31 podem ser eficazes no tratamento de doenças inflamatórias. Para uso clínico, anticorpos anti-R10 são requeridos ter baixa imunogenicidade. Ainda, a fim de obter efeitos terapêuticos altos, anticorpos com ligação a ou atiPetição 870190098904, de 03/10/2019, pág. 7/18 vidade de neutralização de NR10 fortes são desejados.
Os documentos da técnica anterior da presente invenção são descritos abaixo:
Documento de Patente 1: WOOO/75314
Documento de Patente 2: W003/060090
Documento de Não-patente 1: IL-31 está associada com células T de alojamento na pele positivas para antígeno de linfócito cutâneo em pacientes com dermatite atópica. J. Allergy Clin. Immunol, fevereiro 2006; 117(2):418-25.
Descrição da Invenção [Problemas a serem Resolvidos pela Invenção]
A presente invenção foi realizada em vista das circunstâncias descritas acima. Um objetivo da presente invenção é prover anticorpos antiNR10 e composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo antiNR10.
[Meios para Resolver o Problema]
Os presentes inventores realizaram estudos dedicados para atingir o objetivo descrito acima. Os presentes inventores foram bem sucedidos em obter anticorpos anti-NR10 tendo uma atividade de neutralização eficaz contra NR10. Ainda, os presentes inventores foram eficazes em humanizar os anticorpos enquanto mantendo sua atividade. Os presentes inventores também produziram com sucesso anticorpos com farmacocinética aperfeiçoada, atividade de ligação a antígeno aumentada, estabilidade aperfeiçoada e/ou risco reduzido de imunogenicidade. Esses anticorpos são úteis como agentes terapêuticos para doenças inflamatórias.
A presente invenção refere-se a anticorpos anti-NR10 e composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-NR10. Mais especificamente, a presente invenção inclui:
[1] um anticorpo que reconhece domínio 1 de NR10;
[2] o anticorpo de [1], o qual tem uma atividade de neutralização;
[3] o anticorpo de [1] ou [2], o qual é um anticorpo humanizado;
[4] um anticorpo anti-NR10, que é um de:
(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:3.
(2) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:4;
(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:5, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:7;
(4) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:8;
(5) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e (8) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7);
[5] um anticorpo anti-NR10 que é qualquer um de:
(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:9, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:11;
(2) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:12;
(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:13, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:15;
(4) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:16;
(5) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e (8) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7);
[6] um anticorpo anti-NR10 que é qualquer um de:
(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:19;
(2) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NQ:20;
(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:21, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:23;
(4) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:24;
(5) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e (8) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7);
[7] um anticorpo anti-NR10 que é qualquer um de:
(1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:26 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:27;
(2) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:28;
(3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:29, CDR2 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:30 e CDR3 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:31;
(4) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:32;
(5) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6); e (8) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (1) a (7);
[8] um anticorpo ou região variável de anticorpo que é qualquer um de:
(1) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H17);
(2) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H19);
(3) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H28, H42);
(4) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H30, H44);
(5) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197, CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H34, H46);
(6) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H57, H78);
(7) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H71, H92);
(8) uma região variável de cadeia longa compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 199 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H97, H98);
(9) uma região variável de cadeia curta compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 200, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L11);
(10) uma região variável de cadeia curta compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 201, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L12);
(11) uma região variável de cadeia curta compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
(12) uma região variável de cadeia curta compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 203, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L50);
(13) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (3) e a região variável de cadeia curta de (11);
(14) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (4) e a região variável de cadeia curta de (11);
(15) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (5) e a região variável de cadeia curta de (11);
(16) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (6) e a região variável de cadeia curta de (11);
(17) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (7) e a região variável de cadeia curta de (11);
(18) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (8) e a região variável de cadeia curta de (12);
(19) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (13) a (18), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (13) a (18); e (20) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um epítopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (13) a (18);
[9] um anticorpo ou região variável de anticorpo que é qualquer um de:
(1) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 204 (H17);
(2) uma região variável de cadeia longa compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 205 (H19);
(3) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 206 (H28);
(4) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207 (H30);
(5) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 208 (H34), (6) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209 (H42);
(7) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 210 (H44);
(8) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211 (H46);
(9) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 212 (H57);
(10) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 213 (H71);
(11) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 214 (H78);
(12) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 215 (H92);
(13) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 216 (H97);
(14) uma região variável de cadeia longa compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217 (H98);
(15) uma região variável de cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 218 (L11);
(16) uma região variável de cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 219 (L12);
(17) uma região variável de cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17);
(18) uma região variável de cadeia curta compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50);
(19) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (3) e a região variável de cadeia curta de (17) (H28L17);
(20) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (4) e a região variável de cadeia curta de (17) (H30L17);
(21) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (5) e a região variável de cadeia curta de (17) (H34L17);
(22) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (6) e a região variável de cadeia curta de (17) (H42L17);
(23) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (7) e a região variável de cadeia curta de (17) (H44L17);
(24) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (8) e a região variável de cadeia curta de (17) (H46L17);
(25) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (9) e a região variável de cadeia curta de (17) (H57L17);
(26) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (10) e a região variável de cadeia curta de (17) (H71L17);
(27) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (11) e a região variável de cadeia curta de (17) (H78L17);
(28) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (12) e a região variável de cadeia curta de (17) (H92L17);
(29) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (13) e a região variável de cadeia curta de (18) (H97L50);
(30) um anticorpo compreendendo a região variável de cadeia longa de (14) e a região variável de cadeia curta de (18) (H98L50), (31) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (19) a (30), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (19) a (30); e (32) um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (19) a (30);
[10] o anticorpo anti-NR10 de qualquer um de [4] a [9], o qual é um anticorpo humanizado;
[11] um anticorpo, cadeia longa de anticorpo ou cadeia curta de anticorpo, o qual é qualquer um de:
(1) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 222 (H17);
(2) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 223 (H19);
(3) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 224 (H28);
(4) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 225 (H30);
(5) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 226 (H34);
(6) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 227 (H42);
(7) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 228 (H44);
(8) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 229 (H46);
(9) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 230 (H57);
(10) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 231 (H71);
(11) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 232 (H78);
(12) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 233 (H92);
(13) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 234 (H97);
(14) uma cadeia longa compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 235 (H98);
(15) uma cadeia curta compreendendo uma sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 236 (L11);
(16) uma cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 237 (L12);
(17) uma cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17);
(18) uma cadeia curta compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 239 (L50);
(19) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (3) e a cadeia curta de (17) (H28L17);
(20) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (4) e a cadeia curta de (17) (H30L17);
(21) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (5) e a cadeia curta de (17) (H34L17);
(22) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (6) e a cadeia curta de (17) (H42L17);
(23) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (7) e a cadeia curta de (17) (H44L17);
(24) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (8) e a cadeia curta de (17) (H46L17);
(25) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (9) e a cadeia curta de (17) (H57L17);
(26) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (10) e a cadeia curta de (17) (H71L17);
(27) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (11) e a cadeia curta de (17) (H78L17);
(28) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (12) e a cadeia curta de (17) (H92L17);
(29) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (13) e a cadeia curta de (18) (H97L50);
(30) um anticorpo compreendendo a cadeia longa de (14) e a cadeia curta de (18) (H98L50);
(31) um anticorpo onde um ou mais aminoácidos são substituí- dos, deletados, adicionados e/ou inseridos no anticorpo de qualquer um de (19) a (30), o qual tem uma atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (19) a (30); e (32) um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelo anticorpo de qualquer um de (19) a (30);
[12] composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer um de [1] a [11];
[13] composição farmacêutica de [12], a qual é um agente para tratamento de uma doença inflamatória;
[14] Método para tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória, o qual compreende a etapa de administração do anticorpo de qualquer um de [1] a [11]; e [15] Uso do anticorpo de qualquer um de [1] a [11] na preparação de um agente terapêutico para uma doença inflamatória.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra as sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia longa de anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33.
A Figura 2 mostra as sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia curta de anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33.
A Figura 3 é um gráfico mostrando a inibição de crescimento de célula hNR10/hOSMR/BaF3 pelos sobrenadantes de cultura de hibridoma.
A Figura 4 é um gráfico mostrando a inibição de crescimento de célula cynNR10/cynOSMR/BaF3 pelos sobrenadantes de cultura de hibridoma.
A Figura 5 é um gráfico mostrando a avaliação da atividade de NS22 quimérico (BaF).
A Figura 6 é um gráfico mostrando a avaliação da atividade de NS22 quimérico (DU-145).
A Figura 7 é um gráfico mostrando a avaliação da competição de NS22 quimérico com IL-31.
A Figura 8 é um gráfico mostrando a atividade de ligação competitiva com NR10 de anticorpos anti-NR10.
A Figura 9 é um conjunto de gráficos mostrando a avaliação da competição de NS22 humanizado (HOLO) com IL-31.
A Figura 10 mostra o efeito da região constante de anticorpo anti-NR10 humanizado HOLO sobre a heterogeneidade avaliada por cromatografia de troca de cátion.
A Figura 11 é um conjunto de gráficos mostrando a avaliação da competição de mutantes do anticorpo anti-NR10 humanizado cujo ponto isoelétrico das regiões variáveis é diminuído sem perda significante da ligação com NR10, com IL-31.
A Figura 12 mostra o efeito da região constante de anticorpo de receptor anti-IL-6 sobre a heterogeneidade avaliada através de cromatografia de troca de cátion.
A Figura 13 mostra o efeito da região constante de anticorpo de receptor anti-IL-6 sobre o pico de desnaturação avaliado através de DSC.
A Figura 14 mostra o efeito da região constante nova M14 sobre a heterogeneidade em um anticorpo de receptor anti-IL-6, avaliada sob cromatografia de troca de cátion.
A Figura 15 mostra o efeito da região constante nova M58 sobre a heterogeneidade em um anticorpo de receptor anti-IL-6, avaliada através de cromatografia de troca de cátion.
A Figura 16 mostra o efeito da região constante nova M58 sobre o pico de desnaturação em um anticorpo de receptor anti-IL-6, avaliado através de DSC.
A Figura 17 mostra o resultado de ensaio da retenção de huPM1-lgG1 e huPM1-M58 no plasma de camundongos transgênicos FcRn humanos.
A Figura 18 mostra a atividade biológica de cada anticorpo avaliado usando BaF/NR10.
A Figura 19 mostra a análise de amostras termicamente aceleradas (linha pontilhada) e não-aceleradas (linha sólida) de cada anticorpo modificado através de cromatografia de troca de cátion para comparar a geração de produtos de degradação entre antes e depois da aceleração térmica. A seta indica a posição do pico de componente básico que foi alterado.
A Figura 20 é um grupo de gráficos mostrando a avaliação (BaF) da atividade de cada variante.
A Figura 21 é um gráfico mostrando a avaliação (BaF) da atividade de Ha401La402 e H0L0.
A Figura 22 é um gráfico mostrando a avaliação (BaF) da atividade deH17L11 e H0L0.
A Figura 23 é um gráfico mostrando a avaliação (BaF) da atividade de H19L12e H0L0.
A Figura 24 é um gráfico mostrando a atividade biológica de H0L12 e H0L17 avaliada usando BaF/NR10.
A Figura 25-1 é um conjunto de gráficos mostrando a avaliação (BaF) da atividade de cada variante.
A Figura 25-2 é uma continuação da Figura 25-1.
A Figura 26 é um diagrama esquemático para NR10-ECD do tipo selvagem e quimérico humano/camundongo.
A Figura 27 é um conjunto de fotografias mostrando a detecção do domínio de ligação através de Western blotting. A é uma fotografia mostrando o resultado de detecção usando um anticorpo NR10 anti-humano humanizado; B é uma fotografia mostrando o resultado de detecção usando um anticorpo NR10 anti-humano de camundongo; e C é uma fotografia mostrando o resultado de detecção usando anticorpo anti-Myc. Com o anticorpo NR10 anti-humano um antígeno de ligação foi detectado apenas em hhh, hhm e hmm mas não em mmm, mmh e mhm.
A Figura 28-1 mostra a sequência de aminoácido de cada variante de HO (SEQ ID NO:50).
A Figura 28-2 é uma continuação da Figura 28-1.
A Figura 28-3 é uma continuação da Figura 28-2.
A Figura 29-1 mostra a sequência de aminoácido de cada variante de L0 (SEQ ID NO:52).
A Figura 29-2 é uma continuação da Figura 29-1.
Modo de Realizar a Invenção
NR10
NR10 é uma proteína que forma um heterodímero com receptor M da oncostatina (OSMR) e funciona como um receptor de IL-31. NR10 é também conhecida como glm-r (J. Biol. Chem. 277, 16831-6, 2002), GPL (J. Biol. Chem. 278, 49850-9, 2003), IL31RA (Nat. Immunol. 5, 752-60, 2004) e similar. Então, NR10 na presente invenção também inclui proteínas chamadas por tais nomes.
Na presente invenção, NR10 (também referida como IL31RA, GPL ou glm-r) não é particularmente limitada em termos de sua origem, e inclui aquelas derivadas de humanos, camundongos, macacos e outros mamíferos. NR10 derivada de humanos, camundongos e macacos é preferida, e NR10 derivada de humano é particularmente preferida.
Há várias variantes de união conhecidas múltiplas de NR10 derivada de humano (WO 00/075314). Das variantes de união acima descritas, NR10.1 consiste em 662 aminoácidos e contém um domínio transmembrana. NR10.2 é uma proteína tipo receptor solúvel consistindo em 252 aminoácidos sem o domínio de transmembrana. Entretanto, variantes de união de NR10 conhecidas que funcionam como proteínas receptoras de transmembrana incluem NR10.3 e IL-31RAv3. A NR10 humana da presente invenção não é particularmente limitada, contanto que ela forme um heterodímero com receptor M da oncostatina (OSMR) e funcione como um receptor da IL-31. NR10 preferidas incluem NR10.3 (também referida como ILRAv4 (Nat. Immunol. 5, 752-60, 2004) e IL-31 RAv3. NR10.3 (IL31RAv4) consiste em 662 aminoácidos (WO 00/075314; Nat. Immunol. 5, 752-60, 2004) e IL31RAv3 consiste em 732 aminoácidos (No. Acesso GenBank: NM_139017). A sequência de aminoácido de IL31RAv4 é mostrada na SEQ ID NO:79 e a sequência de aminoácido de IL31RAv3 é mostrada na SEQ ID NQ:80. Entretanto, NR10 derivada de camundongo inclui proteínas compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:81. Ainda, NR10 derivada de macaco cinomólogo inclui proteínas compreendendo a sequência de aminoáci16 do de SEQ ID NO:66.
Anticorpos (sequências)
Modalidades preferidas do anticorpo anti-NR10 da presente invenção incluem os anticorpos anti-NR10 de qualquer um de (1) a (8) em (A) a (D) abaixo.
(A) NS18 (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:3 (HCDR3);
(2) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:4 (VH);
(3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:5 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:7 (LCDR3);
(4) anticorpos tendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:9 (VL);
(5) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) anticorpos onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epítopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
(B) NS22 (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:9 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:10 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:11 (HCDR3);
(2) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 12 (VH);
(3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (LCDR3);
(4) anticorpos tendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:16 (VL);
(5) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) anticorpos onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
Exemplos específicos de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos não são particularmente limitados e incluem, por exemplo, as modificações que seguem.
Substituição de He na posição 3 na CDR1 de cadeia longa de SEQ ID NO: 9 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Vai.
Substituição de Met na posição 4 na CDR1 de cadeia longa de SEQ ID NO: 9 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem lie.
Substituição de Met na posição 4 na CDR1 de cadeia longa de SEQ ID NO: 9 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Leu.
Substituição de He na posição 3 na CDR1 de cadeia longa de
SEQ ID NO: 9 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Ala.
Substituição de Leu na posição 1 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Glu.
Substituição de Asn na posição 3 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Gin na posição 13 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Lys na posição 14 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Gin.
Substituição de Lys na posição 16 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Gin.
Substituição de Gly na posição 17 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Lys e Gly nas posições 16 e 17, respectivamente, na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 16 com Gin e Gly na posição 17 com Asp.
Substituição de Lys, Lys e Gly nas posições 14, 16 e 17, respectivamente, na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 14 com Gin, Lys na posição 16 com Gin e Gly na posição 17 com Asp.
Substituição de Gin, Lys, Lyse Gly nas posições 13, 14, 16 e 17, respectivamente, na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Gin na posição 13 com Asp, Lys na posição 14 com Gin, Lys na posição 16 com Gin e Gly na posição 17 com Asp.
Substituição de Ser na posição 10 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Gin na posição 13 na CDR2 de cadeia longa de SEQ ID NO: 10 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Pro.
Substituição de Tyr na posição 3 na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Leu.
Substituição de Met na posição 10 na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Leu.
Substituição de Asp na posição 11 na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Glu.
Substituição de Tyr na posição 12 na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Thr e Ser.
Substituição de Met, Asp e Tyr nas posições 10, 11 e 12, respectivamente, na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Met na posição 10 com Leu, Asp na posição 11 com Glu e Tyr na posição 12 com Thr.
Substituição de Asp e Tyr nas posições 11 e 12, respectivamente, na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Asp na posição 11 com Glue, Tyr na posição 12 com Thr.
Substituição de Tyr, Asp e Tyr nas posições 3, 11 e 12, respectivamente, na CDR3 de cadeia longa de SEQ ID NO: 11 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Tyr na posição 3 com Leu, Asp na posição 11 com Glu e Tyr na posição 12 com Thr ou Ser.
Substituição de Arg na posição 1 na CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Gin.
Substituição de Asn na posição 5 CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Arg e Asn nas posições 1 e 5, respectivamente, na CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Arg na posição 1 com Gin e Asn na posição 5 com Asp.
Substituição de Ser na posição 8 CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Arg.
Substituição de Leu na posição 10 na CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Vai.
Substituição de Ser e Leu nas posições 8 e 10, respectivamente, CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Ser na posição 8 com Arg e Leu na posição 10 com Vai.
Substituição de Thr na posição 2 na CDR1 de cadeia curta de SEQ ID NO: 13 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Ala e Ser.
Substituição de Asn na posição 1 CDR2 de cadeia curta de SEQ ID NO: 14 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é par21 ticularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Lys na posição 3 na CDR2 de cadeia curta de SEQ ID NO: 14 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Gin.
Substituição de Leu na posição 5 na CDR2 de cadeia curta de SEQ ID NO: 14 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Glu.
Substituição de Lys na posição 7 na CDR2 de cadeia curta de SEQ ID NO: 14 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Gin e Asp.
Substituição de Lys, Leu e Lys nas posições 3, 5 e 7, respectivamente, na CDR2 de cadeia curta de SEQ ID NO: 14 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas exemplos preferidos incluem substituição de Lys na posição 3 com Gin, Leu na posição 5 com Glu e Lys na posição 7 com Gin.
Substituição de Glu na posição 5 CDR3 de cadeia curta de SEQ ID NO: 15 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Ser na posição 6 da CDR3 de cadeia curta de SEQ ID NO: 15 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Asp.
Substituição de Thr na posição 9 da CDR3 de cadeia curta de SEQ ID NO: 15 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado, mas seus exemplos preferidos incluem Phe.
Cada uma das substituições descritas acima pode ser feita sozinha ou substituições múltiplas podem ser feitas em combinação. Ainda, as substituições acima podem ser combinadas com outras substituições. Essas substituições podem melhorar a farmacocinética do anticorpo (retenção em plasma), aumentar a atividade de ligação a antígeno, melhorar a estabilidade e/ou reduzir o risco de imunogenicidade.
Na presente invenção, exemplos específicos das regiões variáveis tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo, regiões variáveis de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e regiões variáveis de cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:168. Além disso, exemplos dos anticorpos tendo uma combinação das substituições acima descritas incluem, por exemplo, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e uma região variável de cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168.
Além disso, exemplos específicos das regiões variáveis de cadeia longa ou cadeia curta tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo, as regiões variáveis que seguem:
(a) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H17);
(b) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 11 (H19);
(c) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H28, H42);
(d) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H30, H44);
(e) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 197 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H34, H46);
(f) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H57, H78);
(g) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO: 198 e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H71, H92);
(h) regiões variáveis de cadeia longa que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 19 9e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H97, H98);
(i) regiões variáveis de cadeia curta que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 200, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L11);
(j) regiões variáveis de cadeia curta que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 201, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L12);
(k) regiões variáveis de cadeia curta que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17); e (l) regiões variáveis de cadeia curta que compreendem CDR1 de SEQ ID NO: 203, CDR2 de SEQ ID NO: 170 e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L50).
Ainda, exemplos específicos dos anticorpos tendo uma combinação das substituições descritas acima incluem, por exemplo:
(i) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (c) e a região variável de cadeia curta de (k);
(ii) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (d) e a região variável de cadeia curta de (k);
(iii) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (e) e a região variável de cadeia curta de (k);
(iv) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (f) e a região variável de cadeia curta de (k);
(v) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (g) e a região variável de cadeia curta de (k); e (vi) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (h) e a região variável de cadeia curta de (I).
(ONS23 (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 (HC
DR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 (HCDR3);
(2) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:20 (VH);
(3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:21 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:23 (LCDR3);
(4) anticorpos tendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:24 (VL);
(5) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) anticorpos onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), o qual tem uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
(D)NS33 (1) anticorpos tendo uma região variável de cadeia longa que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:25 (HCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:26 (HCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:27 (HCDR3);
(2) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de SEQ ID NO:28 (VH);
(3) anticorpos tendo uma região variável de cadeia curta que compreende CDR1 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:29 (LCDR1), CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ:30 (LCDR2) e CDR3 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:31 (LCDR3);
(4) anticorpos tendo a região variável de cadeia curta de SEQ ID NO:32 (VL);
(5) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (1) e a região variável de cadeia curta de (3);
(6) anticorpos tendo a região variável de cadeia longa de (2) e a região variável de cadeia curta de (4);
(7) anticorpos onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (1) a (6), os quais têm uma atividade equivalente àquela dos anticorpos de qualquer um de (1) a (6); e (8) anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epítopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1) a (7).
Quaisquer regiões de estrutura (FR) (Framework Regions) podem ser usadas para os anticorpos descritos acima de (1) ou (3); no entanto, FRs derivadas de humano são preferivelmente usadas. Ainda, quaisquer regiões constantes podem ser usadas para os anticorpos descritos acima de (1) a (8); no entanto, regiões constantes derivadas de humano são preferivelmente usadas. Para os anticorpos da presente invenção, a sequência de aminoácido da FR ou região constante original pode ser usada sem modificação ou após ser modificada para uma sequência de aminoácido diferente através de substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.
A sequência de aminoácido da cadeia longa do NS18 descrito acima é mostrada na SEQ ID NO:34 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:33. Entretanto, a sequência de aminoácido da cadeia curta é mostrada na SEQ ID NO:36 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:35.
A sequência de aminoácido da cadeia longa do NS22 é mostrada na SEQ ID NO:38 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:37. Entretanto, a sequência de aminoácido da cadeia curta é mostrada na SEQ ID NQ:40 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:39.
A sequência de aminoácido da cadeia longa de NS23 é mostrada na SEQ ID NO:42 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:41. Entretanto, a sequência de aminoácido da cadeia curta é mostrada na SEQ ID NO:44 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:43.
A sequência de aminoácido da cadeia longa de N33 é mostrada na SEQ ID NO:46 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:45. Entretanto, a sequência de aminoácido da cadeia curta é mostrada na SEQ ID NO:48 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:47.
Na presente invenção, a atividade equivalente àquela do anticorpo de qualquer um de (1) a (6) significa que a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 (por exemplo, NR10 humana) é equivalente. Na presente invenção, o termo equivalente significa que a atividade não é necessariamente a mesma, mas pode ser aumentada ou reduzida contanto que a atividade seja retida. Anticorpos com uma atividade reduzida incluem, por exemplo, anticorpos tendo uma atividade que é 30% ou mais, preferivelmente 50% ou mais e mais preferivelmente 80% ou mais daquela do anticorpo original.
Os anticorpos de qualquer um de (1) a (6) mencionados acima podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido das regiões variáveis (sequências de CDR e/ou sequências de FR), contanto que a atividade de ligação e/ou neutralização a NR10 seja mantida. Métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica para preparar a sequência de aminoácido de um anticorpo que tem uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido e retêm atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 incluem métodos para introdução de mutações em proteínas. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem preparar mutantes funcionalmente equivalentes ao anticorpo tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 através da introdução de mutações apropriadas na sequência de aminoácido do anticorpo tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 usando mutagênese direcionada a sítio (HashimotoGotoh, T., Mizuno, T. Ogashara, Y. e Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, M.J. e Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W., Drutsa, V., Jansen, H.W., Kramer, B., Pflugfelder, M. e Fritz, H.J. (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotidedirected mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456^ Kramer, W. e Fritz, H.J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, T.A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) ou similar. Então, anticorpos que contêm uma ou mais mutações de aminoácido nas regiões variáveis e têm atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 estão também incluídos no anticorpo da presente invenção.
Quando um resíduo de aminoácido é alterado, o aminoácido é preferivelmente mutado para um aminoácido(s) diferente(s) que conserva(m) as propriedades da cadeia lateral do aminoácido. Exemplos de propriedades de cadeia lateral de aminoácido são: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, e T), aminoácidos contendo cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I e P), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo grupo hidroxila (S, T e Y), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo enxofre (C e M), aminoácidos contendo cadeias laterais contendo ácido carboxílico e amida (D, N, E e Q), aminoácidos contendo cadeias laterais básicas (R, K e H) e aminoácidos contendo cadeias laterais aromáticas (H, F, Y, e W) (aminoácidos são representados por códigos de uma letra em parênteses). Substituições de aminoácido dentro de cada grupo são chamadas substituições conservatives. Já é co nhecido que um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácido modificada onde um ou mais resíduos de aminoácido em uma dada sequência de aminoácido são deletados, adicionados e/ou substituídos com outros aminoácidos pode reter a atividade biológica original (Mark, D. F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. e Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. e outros, Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Tais mutantes têm uma identidade de aminoácido de pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente ainda 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%, com as regiões variáveis (por exemplo, sequências de CDR, sequências de FR ou regiões variáveis inteiras) da presente invenção. Aqui identidade de sequência é definida como a porcentagem de resíduos idênticos àqueles na sequência de aminoácido original da região variável de cadeia longa ou região variável de cadeia curta, determinada após a sequências serem alinhadas e lacunas serem apropriadamente introduzidas para maximizar a identidade de sequência conforme necessário. A identidade de sequências de aminoácido pode ser determinada através do método descrito abaixo.
Alternativamente, as sequências de aminoácido de regiões variáveis têm uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácido das regiões variáveis (sequências de CDR e/ou sequências de FR) e retêm atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 podem ser obtidas de ácidos nucleicos que hibridizam sob condições adstringentes para ácido nucleico composto da sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido das regiões variáveis. Condições de hibridização adstringentes para isolar um ácido nucleico que hibridiza sob condições adstringentes para um ácido nucleico que inclui a sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido das regiões variáveis incluem, por exemplo, as condições de uréia 6M, SDS 0,4%, SSC 0,5x e 37°C ou condições de hibridização com adstringências equivalentes a elas. Com condições mais adstringentes, por exemplo, as condições de uréia 6M, SDS 0,4%, SSC 0,1x e 42°C, isolamento de ácidos nucleicos com uma homologia muito maior pode ser esperado. As sequências dos ácidos nucleicos isolados podem ser determinadas através dos métodos conhecidos descritos abaixo. A homologia de sequência de nucleotídeo geral do ácido nucleico isolado é pelo menos 50% ou identidade de sequência maior, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais).
Os ácidos nucleicos que hibridizam sob condições adstringentes para um ácido nucleico composto da sequência de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácido das regiões variáveis podem também ser isolados usando, ao invés dos métodos descritos acima usando técnicas de hibridização, métodos de amplificação de gene tal como reação em cadeia da polimerase (PCR) usando primers sintetizados com base na informação de sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido das regiões variáveis.
Especificamente, a identidade de uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácido para outra pode ser determinada usando o algoritmo BLAST, de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 5873-7). Programas tais como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo (Altschul e outros, J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Para analisar sequências de nucleotídeo de acordo com BLASTN com base em BLAST, os parâmetros são ajustados, por exemplo, como pontuação=100 e comprimento de palavra=12. Por outro lado, parâmetros usados para a análise de sequências de aminoácido através de BLASTX com base em BLAST incluem, por exemplo, pontuação=50 e comprimento de palavra=3. Parâmetros padrão (default parameters) para cada programa são usados quando usando programas BLAST e Gapped BLAST. Técnicas específicas para tais análises são conhecidas na técnica (vide o website do National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov)·
A presente invenção também provê anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo que um epitopo ligado pelos anticorpos de qualquer um de (1)a(7).
Se um anticorpo reconhece o mesmo epitopo que aquele reconhecido por outro anticorpo pode ser confirmado pela competição entre os dois anticorpos contra o epitopo. Competição entre os anticorpos pode ser avaliada através de ensaios de ligação competitiva usando meios tais como ELISA, método de transferência de energia de fluorescência (FRET) e tecnologia de ensaio de microvolume fluorimétrico (FMAT(R)). A quantidade de anticorpos ligados a um antígeno indiretamente relaciona-se com a habilidade de ligação de anticorpos competidores candidatos (anticorpos de teste) que se ligam competitivamente com o mesmo epitopo. Em outras palavras, conforme a quantidade de ou a afinidade de anticorpos de teste contra o mesmo epitopo aumenta, a quantidade de anticorpos ligados ao antígeno diminui, e a quantidade de anticorpos de teste ligados ao antígeno aumenta. Especificamente, anticorpos apropriadamente marcados e anticorpos a serem avaliados são simultaneamente adicionados aos antígenos, e então os anticorpos ligados são detectados usando o marcador. A quantidade de anticorpos ligados ao antígeno pode ser facilmente determinada através de marcação dos anticorpos previamente. Esta marcação não é particularmente limitada, e o método de marcação é selecionado de acordo com a técnica de ensaio usada. O método de marcação inclui marcação fluorescente, radiomarcação, marcação enzimática e similar.
Por exemplo, anticorpos fluorescentemente marcados e anticorpos não-marcados ou anticorpos de teste são simultaneamente adicionados a células animais expressando NR10, e os anticorpos marcados são detectados através de tecnologia de ensaio de microvolume fluormétrico.
Aqui, o anticorpo que reconhece o mesmo epitopo refere-se a um anticorpo que pode reduzir a ligação do anticorpo marcado em pelo menos 50% em uma concentração que é geralmente 100 vezes maior, preferivelmente 80 vezes maior, mais preferivelmente 50 vezes maior, mais preferivelmente ainda 30 vezes maior e mais preferivelmente ainda 10 vezes maior do que uma concentração na qual o anticorpo não-marcado reduz a ligação do anticorpo marcado em 50% (IC50)·
Anticorpos que se ligam ao epitopo ao qual os anticorpos mostrados acima em qualquer um de (1) a (7) se ligam são úteis porque eles têm uma atividade de neutralização particularmente alta.
Os anticorpos mostrados em qualquer um de (1) a (8) acima são preferivelmente anticorpos humanizados, mas não são particularmente limitados a eles.
Ainda, a presente invenção provê genes codificando os anticorpos anti-NR10 de qualquer um de (1) a (8) de (A) a (D) acima. Os genes da presente invenção podem ser qualquer forma de genes, por exemplo, DNAs ou RNAs.
Anticorpos (humanizados)
Modalidades preferidas dos anticorpos da presente invenção incluem anticorpos humanizados que se ligam a NR10. Os anticorpos humanizados podem ser preparados através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica.
A região variável de anticorpo é tipicamente composta de três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (ComplementarityDetermining Regions) intercaladas por quatro estruturas principais (FRs). As CDRs substancialmente determinam a especificidade de ligação de anticorpo. As sequências de aminoácido de CDRs são altamente diversas. Em contraste, as sequências de aminoácido de FRs frequentemente exibem homologia alta entre anticorpos tendo especificidades de ligação diferentes. É então dito em geral que a especificidade de ligação de um anticorpo pode ser transplantada para um anticorpo diferente através de enxerto das CDRs.
Anticorpos humanizados são também referidos como anticorpos humanos remoldados, e eles são preparados através de transferência de CDRs de um anticorpo derivado de um mamífero não-humano tal como um camundongo para as CDRs de um anticorpo humano. Técnicas de recombinação genética gerais para sua preparação são também conhecidas (vide Publicação de Pedido de Patente Europeu N° 125023 e WO 96/02576).
Especificamente, por exemplo, quando as CDRs são derivadas de um anticorpo de camundongo, uma sequência de DNA planejada de ma neira que as CDRs do anticorpo de camundongo sejam ligadas com regiões de estrutura (FR) de anticorpo humano é sintetizada através de PCR usando, como primers, vários oligonucleotídeos que têm porções sobrepondo as extremidades de ambas as CDRs e FRs (vide o método descrito no WO 98/13388). O DNA resultante é então ligado a um DNA codificando uma região constante de anticorpo humano, inserido em um vetor de expressão e introduzido em uma célula hospedeiro para produzir o anticorpo (vide Publicação de Pedido de Patente Europeu N° EP 239400 e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 96/02576).
Regiões de estrutura de anticorpo humano a serem ligadas com CDRs são selecionadas de maneira que as CDRs formem um sítio de ligação de antígeno favorável. Se necessário, substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácido pode ser introduzida nas regiões de estrutura de regiões variáveis de anticorpo de maneira que CDRs do anticorpo humano remoldado formem um sítio de ligação de antígeno apropriado. Por exemplo, podem ser introduzidas mutações na sequência de aminoácido de FR através da aplicação do método de PCR que é usado para enxertar CDRs de camundongo em FRs humanas. Especificamente, mutações podem ser introduzidas em uma porção das sequências de nucleotídeo de primers que anelam para as FRs. As mutações são introduzidas em FRs sintetizadas por tais primers. A atividade de ligação a antígeno de anticorpos mutantes tendo substituições de aminoácido pode ser determinada e avaliada através do método descrito acima, e então sequências de FR mutantes tendo propriedades desejadas podem ser selecionadas (Sato, K. e outros, Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
Regiões constantes (C) de anticorpos humanos são usadas para esses anticorpos humanizados. Por exemplo, Cyl, Cy2, Cy3, Cy4, Cp, Cõ, Ca1, Ca2 e Cs são usadas para cadeias H; e Ck e CA são usadas par cadeias L. A sequência de aminoácido de Ck é mostrada na SEQ ID NO:58 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:57. A sequência de aminoácido de Cy1 é mostrada na SEQ ID NO:60 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:59. A sequência de aminoácido de Cy2 é mostrada na SEQ ID NO:62 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:61. A sequência de aminoácido de Cy4 é mostrada na SEQ ID NO:64 e a sequência de nucleotídeo codificando esta sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:63. Ainda, regiões C de anticorpo humano podem ser modificadas para melhorar a estabilidade de anticorpo ou produção de anticorpo. Regiões C de anticorpo modificadas incluem, por exemplo, as regiões C descritas aqui abaixo. Anticorpos humanos usados para humanização podem ser de qualquer isotipo tal como IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD; no entanto, IgG é preferivelmente usado na presente invenção. IgG que pode ser usado inclui lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 e similar.
Além disso, após um anticorpo humanizado ser preparado, aminoácidos na região variável (por exemplo, CDR e FR) e região constante do anticorpo humanizado podem ser deletados, adicionados, inseridos e/ou substituídos com outros aminoácidos. Os anticorpos da presente invenção também incluem tais anticorpos humanizados com substituições de aminoácido e similar.
A origem de CDRs de um anticorpo humanizado não é particularmente limitada, e pode ser qualquer animal. Por exemplo, é possível usar as sequências de anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de camelo e similares. Sequências de CDRs de anticorpos de camundongo são preferidas.
Em geral, é difícil humanizar anticorpos enquanto retendo as atividades de ligação e neutralização dos anticorpos originais. A presente invenção, no entanto, foi bem sucedida em obter anticorpos humanizados tendo as atividades de ligação e/ou neutralização equivalentes àquelas dos anticorpos de camundongo originais. Anticorpos humanizados são úteis quando administrados a humanos para propósitos terapêuticos, porque eles exibem imunogenicidade reduzida no corpo humano.
Exemplos preferidos dos anticorpos anti-NR10 humanizados da presente invenção incluem, por exemplo:
(a) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (HO-VH);
(b) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH);
(c) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (LO-VL);
(d) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (HO-VH) e uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (LO-VL); e (e) anticorpos humanizados que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 e uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
A região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ:50 (HO-VH), região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 e região variável de cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:52 (LO-VL) podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos pode ser feita em uma ou em ambas das CDRs e das FRs.
Então, outras modalidades preferidas do anticorpo anti-NR10 humanizado da presente invenção incluem, por exemplo:
(f) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (HO-VH);
(g) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH);
(h) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (LO-VL);
(i) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 (HO-VH) e uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (LO-VL);
(j) anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 (H1-VH) e uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52 (LO-VL);
Sem limitação particular, os anticorpos de qualquer um de (f) a (j) têm preferivelmente uma atividade similar àquela de anticorpos de qualquer um de (a) a (e).
A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos não é particularmente limitada, mas exemplos específicos incluem, por exemplo, as substituições de aminoácido descritas acima.
Mais especificamente, por exemplo, as substituições de aminoácido que seguem podem ser incluídas:
Substituição de He na posição 3 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Vai (SEQ ID NO: 173). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
173 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Met na posição 4 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com He (SEQ ID NO: 174). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
174 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Met na posição 4 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu (SEQ ID NO: 175). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
175 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de He na posição 3 de CDR1 (SEQ ID NO: 9) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Ala (SEQ ID NO: 176). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
176 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Leu na posição 1 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Glu (SEQ ID NO: 113). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 113 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Asn na posição 3 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Asp (SEQ ID NO: 114). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
114 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Gin na posição 13 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Asp (SEQ ID NO: 115). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
115 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Lys na posição 14 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Gin (SEQ ID NO: 116). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
116 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Lys na posição 16 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Gin (SEQ ID NO: 117). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
117 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Asp (SEQ ID NO: 118). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
118 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Gin e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 119). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 119 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Lys na posição 14, Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Gin, Gin e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 167). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 171 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Gin na posição 13, Lys na posição 14, Lys na posição 16 e Gly na posição 17 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Asp, Gin, Gin e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 172). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 172 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Ser na posição 10 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Asp (SEQ ID NO: 177). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 177 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de ami39 noácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Gin na posição 13 de CDR2 (SEQ ID NO: 10) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Pro (SEQ ID NO: 178). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
178 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Tyr na posição 3 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu (SEQ ID NO: 179). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
179 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Met na posição 10 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu (SEQ ID NO: 180). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
180 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Asp na posição 11 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Glu (SEQ ID NO: 181). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
181 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Thr (SEQ ID NO: 182). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia Ion ga onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
182 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Ser (SEQ ID NO: 183). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
183 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Met na posição 10, Asp na posição 11e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu, Glu, Thr, respectivamente (SEQ ID NO: 184). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 184 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Glu e Thr, respectivamente (SEQ ID NO: 185). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 185 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Tyr na posição 3, Asp na posição 11e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu, Glu e Thr, respectivamente (SEQ ID NO:
186). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é subs tituida com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 186 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Tyr na posição 3, Asp na posição 11 e Tyr na posição 12 de CDR3 (SEQ ID NO: 11) na região variável de cadeia longa de SEQ ID NO: 50 ou 112 com Leu, Glu e Ser, respectivamente (SEQ ID NO:
187) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 187 em uma região variável de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50 ou 112.
Substituição de Arg na posição 1 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Gin (SEQ ID NO:
121) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 121 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Asn na posição 5 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Asp (SEQ ID NO:
122) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 122 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Ser na posição 8 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Arg (SEQ ID NO:
188) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 188 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Leu na posição 10 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) da região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Vai (SEQ ID NO:
189). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 189 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Ser na posição 8 e Leu na posição 10 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) da região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Arg e Vai, respectivamente (SEQ ID NO: 190). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 190 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Thr na posição 2 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Ala (SEQ ID NO:
191) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 191 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Thr na posição 2 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Ser (SEQ ID NO:
192) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 192 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Asn na posição 1 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Asp (SEQ ID NO:
123). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é subs tituida com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 123 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Lys na posição 3 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Gin (SEQ ID NO:
124) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 124 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Leu na posição 5 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Glu (SEQ ID NO:
125) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 125 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Gin (SEQ ID NO:
126) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 126 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Asp (SEQ ID NO:
127) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 127 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Arg na posição 1 e Asn na posição 5 de CDR1 (SEQ ID NO: 13) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Gin e Asp, respectivamente (SEQ ID NO: 169). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 é substituída com CDR1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 169 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Lys na posição 3, Leu na posição 5 e Lys na posição 7 de CDR2 (SEQ ID NO: 14) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Gin, Glu e Gin, respectivamente (SEQ ID NO: 170). Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 é substituída com CDR2 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 170 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Glu na posição 5 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Asp (SEQ ID NO:
193) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 193 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Ser na posição 6 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Asp (SEQ ID NO:
194) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é substituída com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 194 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Substituição de Thr na posição 9 de CDR3 (SEQ ID NO: 15) na região variável de cadeia curta de SEQ ID NO: 52 com Phe (SEQ ID NO:
195) . Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia curta onde CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 é subs tituida com CDR3 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 195 em uma região variável de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52.
Ainda, as substituições outras que não aquelas descritas acima incluem uma substituição de Arg na posição 3 de FR2 de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:97 com outro aminoácido. O aminoácido após substituição não é particularmente limitado; mas seus exemplos preferidos incluem Gin. Quando Arg na posição 3 em SEQ ID NO:97 foi substituído com Gin, Ala na posição 5 pode ser substituído com Ser para produzir uma sequência de FR2 humana. A sequência de aminoácido onde Arg e Ala nas posições 3 e 5 na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:97 foram substituídos com Gin e Ser, respectivamente, é mostrada na SEQ ID NO: 120. Então, a presente invenção provê regiões variáveis de cadeia longa onde FR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:97 é substituída com FR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 em uma região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:50 ou 112.
Cada uma das substituições de aminoácido descritas acima pode ser usada sozinha ou em combinação com outras substituições de aminoácido descritas acima. Elas podem ser também combinadas com substituições de aminoácido outras que não aquelas descritas acima.
Exemplos específicos dos anticorpos onde as substituições descritas acima foram realizadas incluem, por exemplo, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167, anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168 e anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e uma região variável de cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 168.
Ainda, exemplos específicos das regiões variáveis de cadeia longa onde as substituições descritas acima foram realizadas incluem, por exemplo, as regiões variáveis de cadeia longa que seguem:
(1) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 204 (H17);
(2) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 205 (H19);
(3) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 206 (H28);
(4) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207 (H30);
(5) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 208 (H34);
(6) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209 (H42);
(7) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 210 (H44);
(8) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211 (H46);
(9) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 212 (H57);
(10) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 213 (H71);
(11) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 214 (H78);
(12) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 215 (H92);
(13) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 216 (H97); e (14) regiões variáveis de cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217 (H98).
Entretanto, exemplos específicos das regiões variáveis de cadeia curta onde as substituições descritas acima são realizadas incluem, por exemplo, as regiões variáveis de cadeia curta que seguem:
(15) regiões variáveis de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 218 (L11);
(16) regiões variáveis de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 219 (L12);
(17) regiões variáveis de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17); e (18) regiões variáveis de cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50).
Ainda, exemplos específicos dos anticorpos compreendendo as regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta descritas acima incluem, por exemplo, os anticorpos que seguem:
(19) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (3) e a região variável de cadeia curta de (17) (H28L17);
(20) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (4) e a região variável de cadeia curta de (17) (H30L17);
(21) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (5) e a região variável de cadeia curta de (17) (H34L17);
(22) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (6) e a região variável de cadeia curta de (17) (H42L17);
(23) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (7) e a região variável de cadeia curta de (17) (H44L17);
(24) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (8) e a região variável de cadeia curta de (17) (H46L17);
(25) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (9) e a região variável de cadeia curta de (17) (H57L17);
(26) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (10) e a região variável de cadeia curta de (17) (H71L17);
(27) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (11) e a região variável de cadeia curta de (17) (H78L17);
(28) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (12) e a região variável de cadeia curta de (17) (H92L17);
(29) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (13) e a região variável de cadeia curta de (18) (H97L50); e (30) anticorpos que compreendem a região variável de cadeia longa de (14) e a região variável de cadeia curta de (18) (H98L50).
A região constante usada para os anticorpos humanizados da presente invenção pode ser qualquer região constante derivada de um anticorpo humano. Exemplos preferidos de tais regiões constantes derivadas de anticorpos humanos incluem, por exemplo, regiões constantes derivadas de lgG1 ou lgG2. Além disso, regiões constantes onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na região constante derivada de um anticorpo humano podem ser também usadas.
As regiões constantes onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na região constante derivada de um anticorpo humano não são particularmente limitadas e incluem, por exemplo, as regiões constantes que seguem:
regiões constantes tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:128 (M58);
regiões constantes tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:129 (M14); e regiões constantes tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:62 (SKSC).
Exemplos específicos das cadeias longas ou anticorpos tendo as regiões constantes descritas acima incluem, por exemplo:
(1) cadeias longas que compreendem uma região variável tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 167 e uma região constante tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 128;
(2) cadeias longas onde CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 171 nas cadeias longas de (1) é substituída com CDR2 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:172;
(3) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (1) e uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152; e (4) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (2) e uma cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152.
Exemplos mais específicos dos anticorpos anti-NR10 humaniza49 dos da presente invenção incluem, por exemplo, os anticorpos que seguem:
(k) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (HO-VH + região constante);
(l) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante);
(m) anticorpos que compreendem uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (LO-VL + região constante);
(n) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:54 (HO-VH + região constante) e uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 (LO-VL + região constante); e (o) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante) e uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 (LO-VL + região constante).
A cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:54 (HO-VH + região constante) e a cadeia curta tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 (L0-VL+ região constante) podem ter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos pode ser realizada em uma ou ambas das regiões variáveis e constantes.
Então, a presente invenção provê:
(p) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO:54 (HO-VH + região constante);
(q) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:130 (H1-VH + região constante);
(r) anticorpos que compreendem uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 (LO-VL + região constante);
(s) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 (HO-VH + região constante) e uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 56 (LO-VL + região constante); e (t) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 130 (H1-VH + região constante) e uma cadeia curta tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:56 (LO-VL + região constante).
Sem limitação particular, os anticorpos de qualquer um de (p) a (t) preferivelmente têm uma atividade similar àquela dos anticorpos de qualquer um de (k) a (o).
A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos não é particularmente limitada, mas seus exemplos específicos incluem, por exemplo, as substituições de aminoácido descritas acima.
Ainda, a sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia longa humanizada descrita acima (SEQ ID NQ:50) é mostrada na SEQ ID NO:49. A sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da região variável de cadeia curta humanizada (SEQ ID NO:52) é mostrada na SEQ ID NO:51. A sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da cadeia longa humanizada (SEQ ID NO:54) é mostrada na SEQ ID NO:53. A sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido da cadeia curta humanizada (SEQ ID NO:56) é mostrada na SEQ ID NO:55.
Além disso, a presente invenção provê anticorpos que reconhe cem o mesmo epitopo que o reconhecido pelos anticorpos de qualquer um de (a) a (t) acima. A ligação ao mesmo epitopo já é descrita acima.
Ainda, a presente invenção provê os anticorpos que seguem:
(u) anticorpos que compreendem uma cadeia longa tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 151;
(v) anticorpos que compreendem uma cadeia curta compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 152; e (w) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (u) e a cadeia curta de (v).
Além disso, a presente invenção provê as cadeias pesada e leve e anticorpos:
(1) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 222 (H17);
(2) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 223 (H19);
(3) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 224 (H28);
(4) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 225 (H30);
(5) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 226 (H34);
(6) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 227 (H42);
(7) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 228 (H44);
(8) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 229 (H46);
(9) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 230 (H57);
(10) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 231 (H71);
(11) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de
SEQ ID NO: 232 (H78);
(12) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 233 (H92);
(13) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 234 (H97);
(14) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 235 (H98);
(15) cadeias curtas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 236 (L11) (16) cadeias curtas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ
ID NO: 237 (L12);
(17) cadeias curtas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ
ID NO: 238 (L17);
(18) cadeias curtas tendo uma sequência de aminoácido de SEQ
ID NO: 239 (L50);
(19) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (3) e a cadeia curta de (17) (H28L17);
(20) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (4) e a cadeia curta de (17) (H30L17);
(21) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (5) e a cadeia curta de (17) (H34L17);
(22) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (6) e a cadeia curta de (17) (H42L17);
(23) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (7) e a cadeia curta de (17) (H44L17);
(24) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (8) e a cadeia curta de (17) (H46L17);
(25) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (9) e a cadeia curta de (17) (H57L17);
(26) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (10) e a cadeia curta de (17) (H71L17);
(27) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (11) e a cadeia curta de (17) (H78L17);
(28) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (12) e a cadeia curta de (17) (H92L17);
(29) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (13) e a cadeia curta de (18) (H97L50);
(30) anticorpos que compreendem a cadeia longa de (14) e a cadeia curta de (18) (H98L50);
(31) cadeias longas tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inse- ridos nas cadeias longas de qualquer um de (1) a (14);
(32) cadeias curtas tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inse- ridos nas cadeias curtas de qualquer um de (15) a (18);
(33) anticorpos tendo uma sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados e/ou inseridos nos anticorpos de qualquer um de (19) a (30); e (34) os anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo que o reconhecido pelos anticorpos de qualquer um de (19) a (33).
A substituição, deleção, adição e/ou inserção de aminoácidos é conforme acima descrito. Anticorpos que reconhecem o mesmo epitopo conforme reconhecido por um anticorpo são também descritos acima.
A presente invenção também provê genes codificando regiões variáveis, cadeias longas, cadeias curtas ou anticorpos da presente invenção.
A presente invenção também provê vetores carregando os genes descritos acima.
A presente invenção também provê células hospedeiro transformadas com os vetores descritos acima.
A presente invenção refere-se também a métodos para produção de regiões variáveis, cadeias longas, cadeias curtas ou anticorpos da presente invenção, os quais compreendem a etapa de cultura das células hospedeiro acima descritas.
Os vetores, células hospedeiro e cultura de células hospedeiro são descritos abaixo.
Anticorpos que reconhecem domínios
Modalidades preferidas do anticorpo anti-NR10 da presente invenção incluem anticorpos que reconhecem domínio 1 ou domínio 2. Na presente invenção, o domínio 1 refere-se à região de aminoácidos nas posições 21 a 120 (LPAKP para LENIA) na sequência de aminoácido de NR10 humana de SEQ ID NO:76, onde a numeração de aminoácido é baseada na sequência incluindo o peptideo de sinal. Ainda, na presente invenção, o domínio 2 refere-se à região de aminoácidos nas posições 121 a 227 (KTEPP a EEEAP) na sequência de aminoácido de NR10 humana de SEQ ID NO:76, onde a numeração de aminoácido é baseada na sequência incluindo o peptideo de sinal.
Tais anticorpos não são particularmente limitados: no entanto, em geral, eles têm uma atividade de neutralização, e preferivelmente são anticorpos humanizados.
Exemplos dos anticorpos preferidos na presente invenção incluem anticorpos que reconhecem domínio 1. Os anticorpos que reconhecem o domínio 1 têm uma atividade de neutralização forte, e então são particularmente úteis como agentes farmacêuticos.
Anticorpos (atividade de neutralização)
A presente invenção provê anticorpos anti-NR10 tendo uma atividade de neutralização.
Na presente invenção, a atividade de neutralização contra NR10 refere-se a uma atividade de inibição da ligação entre NR10 e seu ligante IL31, e preferivelmente uma atividade de supressão de uma atividade biológica baseada em NR10.
Anticorpos tendo uma atividade de neutralização de NR10 podem ser selecionados, por exemplo, adicionando anticorpos candidatos a uma linhagem de célula dependente de IL-31 e observando seu efeito de supressão de crescimento sobre a linhagem de célula. Neste método, anticorpos que suprimem o crescimento de linhagem de célula dependente de
IL-31 são determinados como anticorpos tendo uma atividade de neutralização contra NR 10.
Anticorpos (geral)
Os anticorpos da presente invenção não são limitados em termos de sua origem, e podem ser derivados de quaisquer animais tais como humanos, camundongos e ratos. Além disso, os anticorpos podem ser anticorpos recombinantes tais como anticorpos quiméricos e anticorpo humanizados. Conforme descrito acima, os anticorpos preferidos da presente invenção incluem anticorpos humanizados.
Os anticorpo quiméricos contêm, por exemplo, as regiões constantes de cadeias pesada e leve de um anticorpo humano e as regiões variáveis de cadeias pesada e leve de um anticorpo de um mamífero nãohumano, tal como camundongo. Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos através de métodos conhecidos. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos através de clonagem de um gene de anticorpo de hibridomas, sua inserção em um vetor apropriado e introdução do construto nos hospedeiros (vide, por exemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990). Especificamente, cDNAs das regiões variáveis de anticorpo (regiões V) são sintetizados a partir de mRNA de hibridomas usando transcriptase reversa. Uma vez DNAs codificando as regiões V de um anticorpo de interesse sendo obtidos, esses são ligados com DNAs codificando as regiões constantes (regiões C) de um anticorpo humano desejado. Os construtos resultantes são inseridos em vetores de expressão. Alternativamente, os DNAs codificando as regiões V de anticorpo podem ser inseridos em vetores de expressão compreendendo DNAs codificando as regiões C de um anticorpo humano. Os DNAs são inseridos em vetores de expressão de maneira que eles são expressos sob a regulagem das regiões reguladoras de expressão, por exemplo, aumentadoras e promotoras. Na etapa seguinte, células hospedeiro podem ser transformadas com os vetores de expressão para permitir expressão de anticorpos quiméricos.
Métodos para obtenção de anticorpos humanos são também conhecidos. Por exemplo, anticorpos humanos desejados com atividade de ligação a antígeno podem ser obtidos de (1) sensibilização de linfócitos humanos com antigenos de interesse ou células expressando antígenos de interesse in vitro', e (2) fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano tal como U266 (vide Publicação Kokoku do Pedido de Patente Japonês N° (JP-B) H01-59878 (examinado, pedido de patente Japonês aprovado publicado para oposição)). Alternativamente, o anticorpo humano desejado pode ser também obtido através de imunização de um animal transgênico tendo um repertório inteiro de genes de anticorpo humano com um antígeno desejado (vide Publicações de Pedido de Patente Internacional N°s WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 e WO 96/33735).
Ainda, técnicas para obter anticorpos humanos através de panning com uma biblioteca de fago de anticorpo humano são conhecidas. Por exemplo, a região variável de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia simples (scFv) sobre a superfície de um fago, usando um método de exibição de fago, e fagos que se ligam ao antígeno podem ser selecionados. Através na análise dos genes de fagos selecionados, as sequências de DNA codificando as regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam ao antígeno podem ser determinadas. Se as sequências de DNA de scFvs que se ligam ao antígeno forem identificadas, vetores de expressão apropriados compreendendo essas sequências podem ser construídos para obter anticorpos humanos. Tais métodos são bem conhecidos. Referência pode ser feita a WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388 e simlares.
Os anticorpos da presente invenção incluem não apenas anticorpos divalentes conforme representado por IgG, mas também anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes são representados por IgM, e anticorpos biespecíficos capazes de se ligar a antígenos diferentes, contanto que eles tenham uma atividade de ligação e/ou atividade de neutralização de NR10. Os anticorpos multivalentes da presente invenção incluem anticorpos multivalentes onde os sítios de ligação a antígeno são todos idênticos, e anticorpos multivalentes onde todos ou alguns dos sítios de ligação a antígeno são diferentes. Os anticorpos da presente invenção não são limitados a moléculas de anticorpo de comprimento integral, mas podem ser também anticorpos de peso molecular baixo ou produtos modificados dos mesmos, contanto que eles se liguem à proteína NR10.
Alternativamente, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos de peso molecular baixo. Tais anticorpos de peso molecular baixo são anticorpos incluindo fragmentos de anticorpo sem algumas porções de um anticorpo integral (por exemplo, IgG integral) e não são particularmente limitados contanto que eles retenham a atividade de ligação e/ou neutralização de NR10. Na presente invenção, os anticorpos de peso molecular baixo não são particularmente limitados, contanto que eles contenham uma porção de anticorpos integrais. Os anticorpos de peso molecular baixo contêm preferivelmente uma região variável de cadeia longa (VH) ou região variável de cadeia curta (VL). Anticorpos de peso molecular baixo particularmente preferidos contêm ambas as VH e VL. Ainda, exemplos preferidos dos anticorpos de peso molecular baixo da presente invenção incluem anticorpos de peso molecular baixo contendo CDRs de um anticorpo. As CDRs contidas nos anticorpos de peso molecular baixo podem incluir algumas ou todas as seis CDRs de um anticorpo.
Os anticorpos de peso molecular baixo da presente invenção têm preferivelmente um peso molecular menor do que os anticorpos integrais. No entanto, os anticorpos de peso molecular baixo podem formar multímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, trímeros ou tetrâmeros, e então seus pesos moleculares podem ser maiores do que aqueles de anticorpos integrais.
Exemplos específicos dos fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Entretanto, exemplos específicos dos anticorpos de peso molecular baixo incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, scFv (Fv de cadeia simples), diacorpos e sc(Fv)2 ((Fv)2 de cadeia simples). Multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâmeros e polímeros) desses anticorpos são também incluídos nos anticorpos de peso molecular baixo da presente invenção.
Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, através de tratamento de anticorpos com enzimas para produzir fragmentos de anticorpo. Enzimas conhecidas gerar fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, papaína, pepsina e plasmina. Alternativamente, um gene codificando tal fragmento de anticorpo pode ser construído, introduzido em um vetor de expressão e expresso em células hospedeiro apropriadas (vide, por exemplo, Co., M.S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, Μ. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology (1989)178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989)178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989)121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989)121, 663-669; Bird, R. e outros, T/BTECH(1991)9, 132137).
Enzimas digestivas clivam um sítio específico de um fragmento de anticorpo, dando fragmentos de anticorpo de estruturas específicas mostrados abaixo. Técnicas de engenharia genética podem ser aplicadas a tais fragmentos de anticorpo enzimaticamente obtidos para deletar uma porção arbitrária do anticorpo.
Fragmentos de anticorpo obtidos usando as enzimas digestivas descritas acima são como segue:
Digestão de papaína: F(ab)2 ou Fab
Digestão de pepsina: F(ab')2 ou Fab'
Digestão de plasmina: Facb
Os anticorpos de peso molecular baixo da presente invenção incluem fragmentos de anticorpo de sem uma região arbitrária, contanto que eles tenham uma atividade de ligação e/ou atividade de neutralização de NR10.
Diacorpo refere-se a um fragmento de anticorpo bivalente construído por fusão de gene (Holliger, P. e outros, Prod. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:6444-6448 (1993); EP 404.097; WO 93/11161, etc). Diacorpos são dímeros compostos de duas cadeias de polipeptídeo. Em cada uma das ca deias de polipeptídeo formando um dímero, uma VL e uma VH são geralmente ligadas por um ligante na mesma cadeia. Em geral, o ligante em um diacorpo é curto o suficiente de maneira que a VL e a VH não possam se ligar uma à outra. Especificamente, o número de resíduos de aminoácido constituindo o ligante é, por exemplo, cerca de cinco resíduos. Então, a VL e a VH codificadas no mesmo polipeptídeo não podem formar um fragmento de região variável de cadeia simples, e vão formar um dímero com outro fragmento de região variável de cadeia simples.
Anticorpos ScFv são polipeptídeos de cadeia simples produzidos através da ligação de uma região variável de cadeia longa ([VH]) e uma região variável de cadeia curta ([VL]) através de um ligante ou similar (Huston, J.S. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Pluckthun The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Vol. 113, eds., Resenburg e Moore, Springer Verlag, Nova York, pp. 269-315, (1994). A região V de cadeia H e a região V de cadeia L de scFv podem ser derivadas de qualquer anticorpo descrito aqui. O ligante de peptídeo para ligação às regiões V não é particularmente limitado. Por exemplo, um peptídeo de cadeia simples arbitrário contendo cerca de três a 25 resíduos pode ser usado como o ligante. Especificamente, é possível usar os ligantes de peptídeo ou similar descritos abaixo.
As regiões V de ambas as cadeias podem ser ligadas, por exemplo, através de PCR conforme acima descrito. Primeiro, dentre os DNAs que seguem, um DNA codificando uma sequência de aminoácido completa ou parcial desejada é usado como um molde para ligar as regiões V através de PCR:
Sequências de DNA codificando uma cadeia H ou região V de cadeia H de um anticorpo, e
Sequência de DNA codificando uma cadeia L ou região V de cadeia L de um anticorpo.
DNAs codificando as regiões V de cadeia H e cadeia L são amplificados através de PCR usando um par de primers tendo sequências correspondendo àquelas em ambas as extremidades do DNA a ser amplificado.
Então, um DNA codificando a porção de ligante de peptideo é preparado. O DNA de codificação de ligante de peptideo pode ser também sintetizado através de PCR. Aqui, sequências de nucleotídeo que podem ser ligadas aos produtos de amplificação de regiões V sintetizadas separadamente são adicionadas à extremidade 5'dos primers a serem usados. Então, PCR é realizado usando cada DNA de [DNA de região V de cadeia H] - [DNA de ligante de peptideo] - [DNA de região V de cadeia L] e montagem de primers de PCR.
Os primers de PCR de montagem são compostos de uma combinação de um iniciador que anela para a extremidade 5' do [DNA da região V da cadeia H] e um iniciador que anela para a extremidade 3' do [DNA da região V de cadeia L]. Em outras palavras, os primers de PCR de montagem são um conjunto de primers que podem ser usados para amplificar DNA codificando a sequência de comprimento integral de scFv a ser sintetizado. Entretanto, sequências de nucleotídeo que podem ser ligadas aos DNAs de região V foram adicionadas ao [DNA ligante de peptideo]. Então, esses DNAs são ligados juntos, e então o scFv integral é por fim gerado como um produto de amplificação pelos primers de PCR de montagem. Uma vez os DNAs de codificação de scFv sendo gerados, vetores de expressão carregando esses DNAs e células recombinantes transformadas com esses vetores de expressão podem ser obtidos através de métodos convencionais. Ainda, o scFv pode ser obtido através de cultura das células recombinantes resultantes para expressar os DNAs de codificação de scFv.
A ordem das regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta a serem ligadas não é particularmente limitada, e elas podem ser dispostas em qualquer ordem. Exemplos da disposição são listados abaixo.
[VH] ligante [VL] [VL] ligante [VH]
Sc(Fv)2 é um anticorpo de peso molecular baixo de cadeia simples produzido através de ligação de duas VHs e duas VLs usando ligantes e similar (Hudson e outros, J. Immunol. Methods. 1999; 231:177-189). Por exemplo, sc(Fv)2 pode ser produzido ligando scFvs através de um ligante.
Anticorpos onde duas VHs e duas VLs são dispostas na ordem VH-VL-VH-VL ([VH]ligante[VL]ligantep/H]ligante[VL]) do terminal N do polipeptídeo de cadeia simples são preferidos. No entanto, a ordem das duas VHs e duas VLs não é limitado à disposição acima, e elas podem ser dispostas em qualquer ordem. Exemplos da disposição são listados abaixo:
[VL] ligante [VH] ligante [VH] ligante [VL] [VH] ligante [VL] ligante [VL] ligante [VH] [VH] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VL] [VL] ligante [VL] ligante [VH] ligante [VH] [VL] ligante [VH] ligante [VL] ligante [VH]
A sequência de aminoácido da região variável de cadeia longa ou região variável de cadeia curta em um anticorpo de peso molecular baixo pode conter uma substituição, deleção, adição e/ou inserção. Ainda, a região variável de cadeia longa e a região variável de cadeia curta podem também não ter algumas porções ou ser adicionadas com outros polipeptídeos, contanto que elas tenham habilidade de ligação a antígeno quando ligadas. Alternativamente, as regiões variáveis podem ser quimerizadas ou humanizdas.
Na presente invenção, ligantes que se ligam a regiões variáveis do anticorpo incluem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos usando engenharia genética ou ligantes sintéticos, tais como aqueles revelados em Protein Engineering, 9(3), 299-306, 1996.
Os ligantes preferidos na presente invenção são ligantes de peptídeo. Os comprimentos dos ligantes de peptídeo não são particularmente limitados e aqueles versados na técnica podem selecionar apropriadamente os comprimentos dependendo do propósito. Comprimentos típicos são um a 100 aminoácidos, preferivelmente 3 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 5 a 30 aminoácidos e particularmente preferivelmente 12 a 18 aminoácidos (por exemplo, 15 aminoácidos).
Sequências de aminoácido de tais ligantes de peptídeo incluem, por exemplo:
Ser;
Gly-Ser;
Gly-Gly-Ser;
Ser-Gly-Gly;
Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 82);
Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 83);
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 84);
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85);
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 86);
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 87);
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 88); Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 89); (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 84))n; e (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 85))n, onde n é um inteiro de 1 ou maior.
A sequência de aminoácido de ligante de peptídeo pode ser apropriadamente selecionada por aqueles versados na técnica dependendo do propósito. Por exemplo, o n mencionado acima, que determina o comprimento do ligante de peptídeo, é geralmente 1 a 5, preferivelmente 1 a 3 e mais preferivelmente 1 ou 2.
Ligantes sintéticos (agentes de reticulação químicos) incluem agentes de reticulação que são rotineiramente usados para reticular peptídeos, por exemplo, N-hidroxi succinimida (NHS), dissucinimidil suberato (DSS), bis(sulfosuccinimidil)suberato (BSB), ditiobis(succinimidil propionato) (DPS), ditiobis(sulfossuccinimidil propionato) (DTSSP), etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etileno glicol bis(sulfossuccinimidil succinato) (sulfo-EGS), dissuccinimidil tartrato (DST), dissulfossuccinimidil tartrato (sulfo-DST), bis[2-(succinimidilcarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) e bis[2(sulfossuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSOCOES). Esses agentes de reticulação estão comercialmente disponíveis.
Quando quatro regiões variáveis de anticorpo são ligadas, três ligantes são geralmente requeridos. Tais ligante múltiplos podem ser iguais ou diferentes.
Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos onde um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados à sequência de aminoácido de um anticorpo da presente invenção. Ainda, proteínas de fusão que resultam de uma fusão entre um dos anticorpos acima e um segundo peptídeo ou proteína estão incluídas na presente invenção. As proteínas de fusão podem ser preparadas ligando um polinucleotídeo codificando um anticorpo da presente invenção e um polinucleotídeo codificando um segundo peptídeo ou polipeptídeo em estrutura, inserindo esses em um vetor de expressão e expressando o construto de fusão em um hospedeiro. Algumas técnicas conhecidas daqueles versados na técnica estão disponíveis para este propósito. O peptídeo ou polipeptídeo par a ser fundido com um anticorpo da presente invenção pode ser um peptídeo conhecido, por exemplo, FLAG (Hopp, T.P. e outros, BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His consistindo em seis resíduos His (histidina), 10x His, hemaglutinina de influenza (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento de ligação a antígeno SV40, tag Ick, fragmento de alfa-tubulina B-tag, fragmento de Proteína C. Outros polipeptídeos pares a serem fundidos com os anticorpos da presente invenção incluem, por exemplo, GST (glutationa-S-transferase), HA (hemaglutinina de influenza), região constante de imunoglobulina, β-galactosidase e MBP (proteína de ligação à maltose). Um polinucleotídeo codificando um desses peptídeos ou polipeptídeos comercialmente disponíveis pode ser fundido com um polinucleotídeo codificando um anticorpo da presente invenção. O polipeptídeo de fusão pode ser preparado expressando o construto de fusão.
Ainda, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos conjugados que são ligados a qualquer uma de várias moléculas incluindo substâncias poliméricas tais como polietileno glicol (PEG) e ácido hialurônico, substâncias radioativas, substâncias fluorescentes, substâncias quimioluminescentes, enzimas e toxinas. Tais anticorpos conjugados podem ser obtidos modificando quimicamente os anticorpos obtidos. Métodos para modificação de anticorpos foram estabelecidos neste campo (por exemplo, US 5057313 e US 5156840). Os anticorpos da presente invenção também in64 cluem tais anticorpos conjugados.
Ainda, os anticorpos usados na presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. O anticorpo biespecífico refere-se a um anticorpo que tem regiões variáveis reconhecendo epitopos diferentes na mesma molécula de anticorpo. Na presente invenção, os anticorpos biespecíficos podem reconhecer epitopos diferentes em uma molécula de NR10, ou reconhecer NR10 com um sítio de antígeno e uma substância diferente com outro sítio de ligação a antígeno.
Métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, ligando dois anticorpos que reconhecem antígenos diferentes. Anticorpos a serem ligados juntos podem ser moléculas pela metade cada uma das quais contém uma cadeia H e uma cadeia L, ou um quarto de moléculas que consistem em apenas uma cadeia H. Alternativamente, hibridomas produzindo anticorpos monoclonais diferentes podem ser fundidos para produzir uma célula fundida produtora de anticorpo biespecífico. Ainda, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de técnicas de engenharia genética.
Os anticorpos da presente invenção podem diferir em sequência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presença/ausência de cadeias de açúcar e conformação dependendo da célula ou hospedeiro produzindo o anticorpo ou o método de purificação conforme descrito abaixo. No entanto, um anticorpo resultante está incluído na presente invenção, contanto que ele seja funcionalmente equivalente a um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, quando um anticorpo da presente invenção é expresso em células procarióticas, por exemplo, E. coli, um resíduo metionina é adicionado ao terminal N da sequência de aminoácido de anticorpo original. Tais anticorpos estão incluídos na presente invenção.
Produção de anticorpo
Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais. Tais anticorpos monoclonais tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 podem ser obtidos, por exemplo, através do procedimento que segue: anticorpos monoclonais anti-NR10 são prepa rados usando como um antígeno NR10 ou um fragmento da mesma que é derivado de um mamífero tal como humano ou camundongo através de métodos conhecidos, e então anticorpos tendo atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 são selecionados dos anticorpos monoclonais anti-NR10 então obtidos. Especificamente, um antígeno ou célula selecionado expressando o antígeno desejado são usados como um antígeno de sensibilização para imunização de acordo com métodos de imunização convencionais. Anticorpos monoclonais anti-NR10 podem ser preparados fundindo as células imunes obtidas com células de origem conhecidas usando métodos de fusão de célula convencionais, e avaliação dos mesmos quanto a células de produção de anticorpo monoclonal (hibridomas) através de métodos de avaliação convencionais. Animais a serem imunizados incluem, por exemplo, mamíferos tais como camundongos, ratos, coelhos, ovelha, macacos, cabras, burros, vacas, cavalos e porcos. O antígeno pode ser preparado usando a sequência de gene de NR10 conhecida de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, através de métodos usando baculovírus (por exemplo, WO 98/46777).
Hibridomas podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o método de Milstein e outros (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3-46) ou similares. Quando a imunogenicidade de um antígeno é baixa, imunização pode ser realizada após ligação do antígeno com uma macromolécula tendo imunogenicidade, tal como albumina.
Modalidades dos anticorpos da presente invenção que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 incluem anticorpos monoclonais que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Antígenos usados para preparar anticorpos monoclonais que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana não são particularmente limitados, contanto que eles permitam preparação de anticorpos que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Por exemplo, é conhecido que há várias variantes de NR10 humana, e qualquer variante pode ser usada como um imunógeno contanto que ela permita preparação de anticorpos que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização contra NR10 humana. Alternativamente, sob a mesma condição, um fragmento de peptideo de NR10 ou uma proteína onde mutações artificiais foram introduzidas na sequência de NR10 natural pode ser usado como um imunógeno. NR10.3 humana é um dos imunógenos preferidos na preparação de anticorpo que têm uma atividade de ligação e/ou neutralização de NR10 na presente invenção.
Ainda, a atividade de ligação e/ou neutralização de anticorpo contra NR10 pode ser medida, por exemplo, observando o efeito de supressão de crescimento da linhagem de célula dependente de IL-31 conforme descrito nos exemplos.
Entretanto, anticorpos monoclonais podem também ser obtidos através de imunização de DNA. Imunização de DNA é um método onde um DNA vetor construído de maneira que o gene codificando uma proteína de antígeno pode ser expresso em um animal a ser imunizado é administrado ao animal, e o imunógeno é expresso dentro do corpo do animal para prover imunoestimulação. Conforme comparado com métodos de imunização comuns baseados na administração de antígenos de proteína, a imunização com DNA é esperada ser vantajosa pelo fato que:
- elapermite imunoestimulação enquanto retendo a estrutura de uma proteína de membrana; e
- o imunógeno não precisa ser purificado.
Por outro lado, é difícil combinar imunização de DNA com um dispositivo de imunoestimulação tal como um adjuvante.
A fim de obter um anticorpo monoclonal através de imunização com DNA, primeiro, DNA codificando NR10 é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA codificando NR10 pode ser sintetizado através de métodos conhecidos tal como PCR. O DNA resultante é inserido em um vetor de expressão apropriado e administrado ao animal a ser imunizado. Vetores de expressão que podem ser usados incluem vetores de expressão comercialmente disponíveis tal como pcDNA3.1. O vetor pode ser administrado ao corpo vivo através de métodos convencionais. Por exemplo, imunização com DNA pode ser realizada introduzindo partículas de ouro revestidas com o vetor de expressão em células através de pistola de gene. Reforço usando células expressando NR10 após imunização com DNA é um método preferido para dar um anticorpo monoclonal.
Uma vez o mamífero sendo imunizado conforme descrito acima e o nível de soro de um anticorpo desejado ser confirmado ter aumentado, células imunes são coletadas do mamífero e submetidas à fusão celular. Células imunes preferidas são células do baço em particular.
Células de mieloma de mamífero são usadas para fusão com as células imunes acima. É preferido que células de mieloma tenham marcadores de seleção apropriados para avaliação. O marcador de seleção refere-se a um fenótipo que permite (ou não permite) sobrevivência sob condições de cultura particulares. Marcadores de seleção conhecidos incluem deficiência de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (daqui em diante abreviada como deficiência de HGPRT) e deficiência de timidina cinase (daqui em diante abreviada como deficiência de TK). Células deficientes em HGPRT ou TK exibem sensibilidade à hipoxantina-aminopteridina-timidina (daqui em diante abreviada como sensibilidade à HAT). No meio de seleção de HAT, células sensíveis a HAT não podem sintetizar DNA e então vão morrer. No entanto, quando fundidas com células normais, elas podem continuar a sintetizar DNA através da via selvagem das células normais e então podem crescer mesmo em meio de seleção de HAT.
Células deficientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas usando um meio contendo 6-tioguanina, 8-azaguanina (daqui em diante abreviada como 8AG) ou 5'-bromodesoxiuridina. Enquanto células normais são mortas devido à incorporação desses análogos de pirimidina em DNA, células sem essas enzimas podem sobreviver no meio de seleção porque elas não podem incorporar esses análogos de pirimidina. Outro marcador de seleção chamado resistência a G418 confere resistência a antibióticos 2desoxiestreptamina (análogos de gentamicina) devido ao gene de resistência à neomicina. Varias células de mieloma adequadas para fusão celular são conhecidas.
Fusão celular entre células imunes e células de mieloma pode ser essencialmente realizada de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
Mais especificamente, fusão celular pode ser realizada, por exemplo, em um meio de cultura comum na presença de um agente de promoção de fusão. O agente de promoção de fusão inclui, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, um agente auxiliar tal como dimetil sulfóxido pode ser também adicionado para melhorar eficiência de fusão.
As células imunes e células de mieloma podem ser usadas em uma razão arbitrariamente determinada. Por exemplo, a razão de células imunes para células de mieloma é preferivelmente de 1 a 10. Meios de cultura a serem usados para fusão celular incluem, por exemplo, meios que são adequados para o crescimento celular de linhagem de célula de mieloma, tal como RPMI 1640 e MEM e outros meios de cultura comuns usados para este tipo de cultura celular. Ainda, os meios de cultura podem ser também suplementados com suplemento de soro tal como soro fetal de bezerro (FCS) (Fetal Calf Serum).
Quantidades predeterminadas de células imunes e células de mieloma são misturadas bem no meio de cultura, e então misturadas com uma solução de PEG preaquecida para 37°C para produzir células fundidas (hibridomas). No método de fusão celular, por exemplo, PEG com peso molecular médio de cerca de 1.000-6.000, pode ser adicionado às células tipicamente em uma concentração de 30% a 60% (p/v). Então, adição sucessiva do meio de cultura apropriado listado acima e remoção de sobrenadante através de centrifugação são repetidas para eliminar o agente de fusão celular e, então, os que são desfavoráveis para o crescimento de hibridomas.
Os hibridomas resultantes podem ser avaliados usando um meio de seleção de acordo com o marcador de seleção possuído por células mieloma usadas na fusão celular. Por exemplo, células deficientes em HGPRT ou TK podem ser avaliadas através de cultura das mesmas em um meio de HAT (um meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Especifica mente, quando células de mieloma sensíveis a HAT são usadas em fusão celular, células fundidas com sucesso com células normais podem ser seletivamente cultivadas no meio de HAT. A cultura celular usando o meio de HAT acima é continuada por um período de tempo suficiente para permitir que todas as células exceto os hibridomas desejados (células não-fundidas) morram. Especificamente, em geral, os hibridomas desejados podem ser selecionados através de cultura das células por vários dias a várias semanas. Então, avaliação e clonagem simples de hibridomas que produzem um anticorpo de interesse podem ser realizadas geralmente limitando métodos de diluição. Alternativamente, anticorpos que reconhecem NR10 podem ser preparados através do método descrito no WO 03/104453.
Avaliação e clonagem simples de um anticorpo de interesse podem ser adequadamente realizadas através de métodos de avaliação conhecidos com base em reação antígeno-anticorpo. Por exemplo, um antígeno é ligado a um veículo tais como contas feitas de poliestireno ou similar e placas de microtitulação de 96 poços comercialmente disponíveis, e então reagido com o sobrenadante de cultura de hibridoma. Em seguida, o veículo é lavado e então reagido com um anticorpo secundário marcado com enzima ou similar. Quando o sobrenadante de cultura contém um anticorpo de interesse reativo ao antígeno de sensibilização, o anticorpo secundário se liga ao veículo através deste anticorpo. Finalmente, o anticorpo secundário ligado ao veículo é detectado para determinar se o sobrenadante de cultura contém o anticorpo de interesse. Hibridomas produzindo um anticorpo desejado capazes de ligação ao antígeno podem ser clonados através do método de diluição limitante ou similar. Não apenas o antígeno usado para imunização, mas também uma proteína NR10 substancialmente equivalente a ele, podem ser preferivelmente usados como um antígeno para este propósito. Por exemplo, uma linhagem de célula expressando NR10, o domínio extracelular de NR10 ou um oligopeptídeo composto de uma sequência de aminoácido parcial constituindo o domínio pode ser usado como o antígeno.
Em adição ao método acima descrito para preparação de hibridomas através de imunização de um animal não-humano com um antígeno, anticorpos de interesse podem ser também obtidos através de sensibilização de linfócitos humanos com um antígeno. Especificamente, primeiro, linfócitos humanos são sensibilizados com uma proteína NR10 in vitro. Então, os linfócitos sensibilizados são fundidos com um par de fusão apropriado. Por exemplo, células de mieloma derivadas de humano com a habilidade em se dividir permanentemente podem ser usadas como o par de fusão (vide Publicação Kokoku do Pedido de Patente Japonês No. (JP-B) H1-59878 (pedido de patente Japonês aprovado, examinado, publicado para oposição). Anticorpos obtidos através deste método são anticorpos humanos tendo uma atividade de ligação à proteína NR10.
A sequência de nucleotídeo codificando um anticorpo anti-NR10 obtido através do método descrito acima ou similar, e sua sequência de aminoácido, pode ser obtida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Aminoácidos contidos nas sequências de aminoácido descritas na presente invenção podem sofrer modificação pós-traducional (por exemplo, modificação de glutamina N-terminal em ácido piroglutâmico através de piroglutamilação é bem conhecida dos versados na técnica). Naturalmente, tais sequências com aminoácidos pós-traducionalmente modificados estão também incluídas nas sequências de aminoácido descritas na presente invenção.
Com base na sequência obtida do anticorpo anti-NR10, o anticorpo anti-NR10 pode ser preparado, por exemplo, através de técnicas de recombinação genética conhecidas dos versados na técnica. Especificamente, um polinucleotídeo codificando um anticorpo pode ser construído com base na sequência do anticorpo reconhecendo NR10, inserido em um vetor de expressão e então expresso em células hospedeiro apropriadas (vide, por exemplo, Co, M.S. e outros, J. Immunol. (1994)152, 2968-2976; Better, Μ. & Horwitz, A. H. Methods Enzymol. (1989)178, 476-496; Pluckthun, A. e Skerra, A. Methods Enzymol. (1989)178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1989)121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods Enzymol. (1989)121, 663-669; Bird, R. E. e Walter, B.W., Trends Biotechnol. (1991)9, 132-137).
Os vetores incluem vetores Μ13, vetores pUC, pBR322, pBlues cript e pCR-Script. Alternativamente, quando tendo como objetivo subclonar e excisar cDNA, os vetores incluem, por exemplo, pGEM-T, pDIRECT e pT7 em adição aos vetores descritos acima. Vetores de expressão são particularmente úteis quando usando vetores para produção dos anticorpos da presente invenção. Por exemplo, quando tendo como objetivo a expressão em E. coli tal como JM109, DH5a, HB101 e XL1-Blue, os vetores de expressão não apenas têm as características acima descritas que permitem amplificação de vetor em E. coli, mas também carregam um promotor que permite expressão eficiente em E. coli, por exemplo, promotor lacZ (Ward e outros, Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), promotor araB (Better e outros, Science (1988) 240, 1041-1043), promotor T7 ou similar. Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), QIAexpress system (Qiagen), pEGFP ou pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa RNA polimerase T7) em adição aos vetores descritos acima.
Os vetores podem conter sequências de sinal para secreção de anticorpo. Como uma sequência de sinal para secreção de anticorpo, uma sequência de sinal pelB (Lei, S. P. e outros, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada quando uma proteína é secretada no periplasma de E. coli. O vetor pode ser introduzido em células hospedeiro através de cloreto de cálcio ou métodos de eletroporação, por exemplo.
Em adição a vetores para E. coli, os vetores para produção dos anticorpos da presente invenção incluem vetores de expressão de mamífero (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18(17), p5322, pEF e pCDM8), vetores de expressão derivados de célula de inseto (por exemplo, o Bac-to-Bac baculovirus expression system (GibcoBRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de planta (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus (por exemplo, pHSV, pMV e pAdexLcw), vetores de expressão retrovirais (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão de levedura (por exemplo, Pichia Expression Kit (Invitrogen), pNV11 e SP-Q01) e vetores de expressão de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.
Quando tendo o objetivo de expressão em células animais tais como células CHO, COS e NIH3T3, os vetores devem ter um promotor essencial para expressão em células, por exemplo, promotor de SV40 (Mulligan e outros, Nature (1979) 277, 108), promotor de MMLV-LTR, promotor de EF1a (Mizushima e outros, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) e promotor de CMV, e mais preferivelmente eles têm um gene para seleção de células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a fármaco que permite avaliação usando um agente (neomicina, G418, ou similar). Vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV e pOP13, por exemplo.
Ainda, o método que segue pode ser usado para expressão de gene estável e amplificação de gene em células: células CHO deficientes em uma via de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor (por exemplo, pSV2-dhfr (Molecular Cloning, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)) que carrega urn gene de DHFR que compensa a deficiência, e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, o método que segue pode ser usado para expressão de gene transiente: células COS com um gene expressando antígeno de T de SV40 em seu cromossomo são transformadas com um vetor (pcD e similar) com uma origem de replicação de SV40. Origens de replicação derivadas de vírus polioma, adenovirus, vírus papiloma bovino (BPV) e similar podem ser usadas também. Para amplificar número de cópia de gene em células hospedeiro, os vetores de expressão podem carregar ainda marcadores de seleção tal como gene da aminoglicosídeo transferase (ΑΡΗ), gene da timidina cinase (TK), gene da xantina-guanina fosforribosiltransferase de E. coli (Ecogpt) e gene da di-hidrofolato redutase (dhfr).
Então, a presente invenção provê métodos para produção dos polipeptídeos da presente invenção ou polipeptídeos codificados por genes codificando os polipeptídeos da presente invenção, os quais compreendem a etapa de cultura de células hospedeiro contendo um vetor onde um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção foi introduzido.
Mais especificamente, a presente invenção provê métodos para produção dos polipeptídeos da presente invenção compreendendo as etapas de:
(a) cultura de uma célula hospedeiro contendo um vetor no qual um gene codificando o polipeptídeo da presente invenção foi introduzido; e (b) obtenção do polipeptídeo codificado pelo gene.
Os anticorpos da presente invenção obtidos através dos métodos descritos acima podem ser isolados de dentro de células hospedeiro ou de fora das células (o meio ou similar) e purificados para homogeneidade. Os anticorpos podem ser isolados e purificados através de métodos rotineiramente usados para isolamento e purificação de anticorpos, e o tipo de método não é limitado. Por exemplo, os anticorpos podem ser isolados e purificados selecionando e combinando apropriadamente cromatografia de coluna, filtragem, ultrafiltragem, retirada de sal, precipitação de solvente, extração de solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida, ponto isoelétrico, diálise, recristalização e similar.
As cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia por troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtragem em gel, cromatografia de fase reversa e cromatografia por adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Os métodos cromatográficos descritos acima podem ser conduzidos usando cromatografia líquida, por exemplo, HPLC e FPLC. Colunas que podem ser usadas para cromatografia por afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Colunas usando proteína A incluem, por exemplo, Hyper D, POROS e Sepharose FF (GE Amersham Bioscience). A presente invenção inclui anticorpos que são altamente purificados usando esses métodos de purificação.
A atividade de ligação a NR10 dos anticorpos obtidos pode ser determinada através de métodos conhecidos dos versados na técnica. Métodos para determinação da atividade de ligação a antígeno de um anticorpo incluem, por exemplo, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), EIA (imunoensaio de enzima), RIA (radioimunoensaio) e método de anticorpo fluorescente. Por exemplo, quando imunoensaio de enzima é usado, amos tras contendo anticorpo, tais como anticorpos purificados e sobrenadantes de cultura de células de produção de anticorpo, são adicionadas a placas revestidas com antígeno. Um anticorpo secundário marcado com uma enzima, tal como fosfatase alcalina, é adicionado e as placas são incubadas. Após lavagem, um substrato de enzima, tal como p-nitrofenil fosfato, é adicionado, e a absorbância é medida para avaliar a atividade de ligação a antígeno.
Composições farmacêuticas
A presente invenção também provê composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo mencionado acima como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção provê agentes terapêuticos para doenças inflamatórias que compreendem o anticorpo mencionado acima como um ingrediente ativo.
Na presente invenção, doença inflamatória refere-se a doenças com características patológicas envolvidas em reações citológicas e histológicas que acontecem em vasos sanguíneos afetados e tecidos adjacentes em resposta a uma lesão ou estimulação anormal causada por agentes físicos, químicos ou biológicos (Stedman's Medical Dictionary, 5a Ed., MEDICAL VIEW CO., 2005). Em geral, doenças inflamatórias incluem dermatite (dermatite atópica, dermatite crônica e similar), doença inflamatória do intestino (colite e similar), asma, artrite (artrite reumatóide, osteoartrite e similar), bronquite, doenças autoimunes th2, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, GVHD crônica, doença de Crohn, espondilite deformante, dor lombar, gota, inflamação após cirurgia ou lesão, inchaço, neuralgia, laringofaringite, cistite, hepatite (esteato-hepatite não-alcoólica, hepatite alcoólica e similar), hepatite B, hepatite C, arteriosclerose e prurido.
Exemplos preferidos de doenças inflamatórias que são objetivos da presente invenção incluem dermatite atópica, dermatite crônica, reumatismo, osteoartrite, asma crônica e prurido.
A expressão compreende(m) um anticorpo anti-NR10 como um ingrediente ativo significa compreendendo um anticorpo anti-NR10 como pelo menos um dos ingredientes ativos, e não limita a proporção do anticor po. Ainda, os agentes terapêuticos para doenças inflamatórias na presente invenção podem também compreender, em combinação com o anticorpo anti-NR10 mencionado acima, outros ingredientes que melhoram o tratamento de doenças inflamatórias.
Os agentes terapêuticos da presente invenção podem ser também usados para propósitos de prevenção.
O anticorpo anti-NR10 da presente invenção pode ser preparado como formulações de acordo com métodos padrão (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, USA). Ainda, eles podem conter veículos e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis se necessário. Por exemplo, eles podem conter tensoativos (por exemplo, PEG e Tween), excipientes, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico), agentes de coloração, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizadores, agentes de tamponamento (por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico e outros ácidos orgânicos), agentes de quelação (por exemplo, EDTA), agentes de suspensão, agentes de ionização, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, promotores de fluidez e corretores. No entanto, sem limitação a esses, os agentes para prevenção ou tratamento de doenças inflamatórias da presente invenção podem conter outros veículos geralmente usados. Tais veículos incluem especificamente ácido silícico anidro, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose de cálcio, carmelose de sódio, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilacetaldietilaminoacetato, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 60, sacarose, carboximetilcelulose, amido de milho e sal inorgânico. Os agentes podem também conter outros polipeptídeos de peso molecular baixo, proteínas tal como albumina do soro, gelatina e imunoglobulina e aminoácidos tal como glicerina, glutamina, asparagina, arginina e lisina. Quando o anticorpo antiNRIO é preparado como uma solução aquosa para injeção, o anticorpo antiNRIO pode ser dissolvido em uma solução isotônica contendo, por exemplo, solução salina fisiológica, dextrose ou outros adjuvantes. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio.
Ainda, agentes de solubilização apropriados, por exemplo, alcoóis (por exemplo, etanol), polialcoóis (por exemplo, propileno glicol e PEGs) e detergentes não-iônicos (polissorbato 80 e HCO-50) podem ser usados concomitantemente.
Se necessário, anticorpos anti-NR10 podem ser encapsulados em microcápsulas (microcápsulas feitas de hidroximetilcelulose, gelatina, polimetilmetacrilato e similar), e transformados em componentes de sistemas de liberação de fármaco coloidais (lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) (por exemplo, vide Remington's Pharmaceutical Science, 16a edição, Oslo Ed. (1980)). Além disso, métodos para fabricação de fármacos de liberação sustentada são conhecidos, e esses podem ser aplicados para anticorpos anti-NR10 (Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; Patente U.S. No. 3.773.919; Pedido de Patente Europeu (EP) No. 58.481; Sidman e outros, Biopolymers (1983) 22, 547-56; EP 133.988).
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas ou oralmente ou parenteralmente, mas são preferivelmente administradas parenteralmente. Especificamente, os agentes são administrados a pacientes através de injeção ou administração percutânea. Injeções incluem, por exemplo, injeções intravenosas, injeções intramusculares e injeções subcutâneas para administração sistêmica ou local. Os agentes podem ser dados a sítios onde inflamação deve ser suprimida ou áreas circundando os sítios através de infusão local, injeção intramuscular em particular. Os métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados de acordo com a idade e condição do paciente. A dose de administração única pode ser selecionada, da faixa de 0,0001 a 100 mg do ingrediente ativo por kg de peso do corpo. Alternativamente, por exemplo, quando os agentes são administrados a pacientes humanos, a dose de ingrediente ativo pode ser selecionada da faixa de 0,001 a 1.000 mg/kg de peso do corpo. A dose de administração única contém preferivelmente, por exemplo, cerca de 0,01 a 50 mg/kg de peso do corpo do anticorpo da presente invenção. No entanto, a dose de um agente para prevenção ou tratamento de doenças inflamatórias da presente invenção não é limitada a esses exemplos.
Todos os documentos da técnica anterior citados no presente relatório são aqui incorporados a título de referência.
Exemplos
Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com referência a exemplos, mas não deve ser considerada como sendo limitada aos mesmos.
Exemplo 1 - Preparação de hibridomas
1.1. Preparação de plasmídeos de NR10 humana e de macaco cinomóloqo para imunização com DNA
1.1.1 Preparação de vetores de expressão para hNR10 e cynNRIO
NR10 humana (sequência de nucleotídeo, SEQ ID NO:75; sequência de aminoácido, SEQ ID NO:76) foi inserida no vetor de expressão pMacll, que expressa uma proteína sob o controle do promotor da β-actina do camundongo (WO 2005/054467) para preparar um vetor de expressão para hNR10. Da mesma maneira, um vetor de expressão para cynNRIO foi construído a partir de NR10 de macaco cinomólogo (sequência de nucleotídeo, SEQ ID NO:65; sequência de aminoácido, SEQ ID NO:66).
1.1.2. Preparação de cartucho de DNA
A fim de usar o vetor de expressão de hNR10 ou cynNRIO em
1.1.1 para imunização com DNA de camundongos, o Helios Gene Gun Cartridge Kit (BIO-RAD) foi usado para produzir um cartucho de DNA para cada DNA que permite imunização com 1 pg de DNA de uma vez.
1.2. Preparação de hibridomas produzindo anticorpo de NR10 anti-humano 1.2.1. Preparação de hibridomas usando camundongos imunizados com NR10 humana ou de macaco cinomólogo
Dez camundongos Balb/c (fêmeas; seis semanas de vida no início da imunização; Charles River Laboratories, Japão) foram imunizados com a NR10 humana ou de macaco cinomólogo através do procedimento que segue. Para imunização primária, os camundongos foram imunizados com o cartucho de DNA preparado com o vetor de expressão de hNR10 u sando o Helios Gene Gun System (BIO-RAD). Uma semana depois, imunização secundária foi realizada através do Helios Gene Gun System (BIORAD) usando o cartucho de DNA preparado com o vetor de expressão de cynNRIO. A terceira imunização e as subsequentes foram realizadas em intervalos de uma semana usando os vetores de expressão de hNR10 e cynNRIO alternadamente. Após o título de anticorpo de soro contra NR10 humana ter sido confirmado ser elevado, uma proteína NR10 humana (domínio extracelular) (Exemplo de Referência 4) diluída com PBS(-) foi intravenosamente administrada a 10 pg/cabeça como a imunização final. Quatro dias após a imunização final, células de baço de camundongo foram fundidas com células P3X63Ag8U.1 de mieloma de camundongo (abreviadas como p3U1; ATCC CRL-1597) através de um método convencional usando PEG1500 (Roche Diagnostics). As células fundidas resultantes, isto é, hibridomas, foram cultivadas em RPM11640 suplementado com FBS 10% (daqui em diante abreviado como FBS 10%/RMPI1640).
1.2.2. Seleção de hibridomas
No dia seguinte à fusão, as células fundidas foram suspensas em um meio semissólido (StemCells) e cultivadas quanto a seleção bem como colonização de hibridomas.
Após nove ou dez dias de fusão, colônias de hibridoma foram selecionadas e cada colônia foi semeada em cada poço de placas de 96 poços contendo o meio de seleção HAT (FBS 10%/RPMI1640, 2% em volume de concentrado 50x de HAT (Dainippon Pharmaceutical) e 5% em volume de BM-Condimed H1 (Roche Diagnostics). Após três ou quatro horas de cultura, o sobrenadante de cultura foi coletado de cada poço para determinar a concentração de IgG de camundongo no sobrenadante. Os sobrenadantes de cultura onde IgG de camundongo foi detectado foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando uma linhagem de célula dependente de IL-31 humana (células hNR10/hOSMR/BaF3; Exemplo de Referência 2) e vários clones tendo uma atividade de neutralização de NR10 forte foram obtidos (Figura 3). Os clones que suprimem o crescimento induzido por IL-31 de células de uma maneira dependente da concentração e suprimem o cres cimento de células (células cynNR10/cynOSMR/BaF3; Exemplo de Referência 2)induzido por IL-31 em macaco cinomólogo de uma maneira dependente da concentração foram obtidos (Figura 4).
Exemplo 2 - Preparação de anticorpos quiméricos
Preparação de vetores de expressão para anticorpos quiméricos
RNAs totais foram extraídos dos hibridomas usando RNeasy Mini Kits (QIAGEN), e os cDNAs foram sintetizados a partir deles usando SMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences). Genes de região variável de anticorpo foram isolados através de PCR usando polimerase de DNA PrimerSTAR HS (TaKaRa), 10x Universal Primer A Mix junta do SMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Bioscience) e iniciadores projetados para cada região constante de anticorpo (cadeia H, mlgG1-rnot; cadeia L, mlgK-rnot). A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA isolado foi determinada com ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer ou ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystem), usando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo. As sequências de aminoácido determinadas das regiões variáveis de cadeia H e cadeia L nos anticorpos de camundongo NS18, NS22, NS23 e NS33 foram mostradas nas figuras 1 e 2, respectivamente.
Cada um dos fragmentos de cadeias H e L resultantes foi submetido à PCR usando PrimerSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa) e os conjuntos de iniciador mostrados na Tabela 1. Os fragmentos amplificados resultantes foram ligados com a região constante (humana y1 ou y2 e κ humana, respectivamente), e então inseridos em um vetor de expressão de célula animal. A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA foi determinada com ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer ou ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems), usando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo.
Tabela 1
Sequência (5’ —*3’ ) SEQ ID NO:
mIgG1-rnot TAATAGCGGCCGCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG 9 O
mlgK-rnot TAATAGCGGCCGCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCT 9 1
mNS18H-feco GACGAATTCCACCATGGGATGGAGCTGGATCTT 9 2
mNS18L-feco GACGAATTCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGT 9 3
mNS33H-feco GACGAATTCCACCATGGAATGTAACTGGATACT 9 4
mNS33L-feco GACGAATTCCACCATGGATTTTCTGGTGCAGAT 9 5
Iniciador avançado Iniciador reverso
NS18 Cadeia H mNS18H-feco mIG1-rnot
NS18 Cadeia L mNS18L-feco mlGK-rnot
NS22 Cadeia H Mns18H-feco mIG1-rnot
NS22 Cadeia L mNS18L-feco mlGK-rnot
NS23 Cadeia H nflS18H-feco mIG1-rnot
NS23 Cadeia L mNS18L-feco mlGK-rnot
NS33 cadeia H nflS33H-feco mIG1-rnot
NS33 Cadeia L mNS33L-feco mIGK-rnot
Preparação de anticorpos quiméricos
Linhagem de célula de câncer de rim embriônica humana HEK293H (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) suplementado com soro fetal de bezerro 10% (Invitrogen) e 10 ml de células foram semeados em placas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING) em uma densidade celular de 6 x 105 células/ml. As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%) por um dia inteiro e uma noite inteira. Então, o meio foi removido através de aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adicionados. Meio CHO-S-SFMII foi adicionado à mistura de DNA de plasmídeo preparada (13,8 pg no total) para um volume de 700 μΙ. Esta foi misturada com 20,7 μΙ de 1 μg/ml de polietilenoimina (Polyscience Inc.) e deixada descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. A solução foi adicionada às células em cada placa. As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%) por quatro a cinco horas. Então, 6,9 ml de meio CHO-S-SFMI (Invitrogen) foram adicionados, e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 por três a quatro dias. Os sobrenadantes de cultura foram coletados e então centrifugados (aprox. 2000 g, cinco minutos, temperatura ambiente) para remover as células. Os sobrenadantes foram filtrados em filtro de 0,22 pm MILLEX®
GV (Millipore). Cada amostra foi armazenada a 4°C até uso. Anticorpos foram purificados dos sobrenadantes usando Protein G Sepharose (Amersham Biosciences). Os anticorpos purificados foram concentrados com Amicon Ultra 15 (Millipore) e então o solvente foi substituído com PBS(-) contendo NaN3 a 0,05% usando colunas PD-10 Desalting (Amersham Biosciences. A absorbância a 280 nm foi medida com Espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop) e as concentrações foram determinadas através do método de Pace e outros (Protein Science (1995) 4:2411-2423).
Avaliação da atividade de NS22 quimérico
A atividade de neutralização de hlL-31 foi avaliada usando a linhagem de célula hNR10/hOSMR/BaF3, que cresce de uma maneira dependente da dose de hlL-31, conforme descrito abaixo.
Células hNR10/hOSMR/BaF3 foram preparadas a 1,5 x 105 células/ml usando meio RPMI1640 (GIBCO) contendo FBS a 10% (MOREGATE) e Penicilina-Estreptomicina 1% (Invitrogen). hlL-31 (R&D Systems) foi adicionada a uma alíquota das células para uma concentração final de 4 ng/ml (IL-31 (+); conc. final: 2 ng/ml). A suspensão de célula restante foi usada como IL-31 (-). O NS22 purificado foi ajustado para 2 pg/ml usando o meio, e oito diluições seriais foram preparadas em uma razão de diluição comum de 3 (conc. final: 1 pg/ml ou menos). 50 pl cada da suspensão celular e da diluição de NSS quimérico (γ1, κ humano) foram adicionados a cada poço de placas de fundo plano de 96 poços (CORNING), e as células foram cultivadas em incubadora de CO2 5% a 37°C por dois dias. Após cultura, 20 μΙ de uma mistura de quantidades iguais de Cell Counting Kit-8 (Dojindo) e PBS foram adicionados a cada poço, e a absorbância (450 nm/620 nm) foi medida (TECAN, SUNRISE CLASSIC). Após a reação ter sido deixada continuar por duas horas em uma incubadora de CO2 a 5% a 37°C, a absorbância foi medida novamente. A atividade de neutralização de NS22 foi apresentada como uma taxa de inibição usando um valor obtido subtraindo o valor de 0 hora do valor de 2 horas. O resultado mostrou que NS22 suprimiu o crescimento induzido por IL-31 da linhagem de célula hNR10/hOSMR/BaF3 de uma maneira dependente da dose. Isto demonstra que NS22 tem uma ativi82 dade de neutralização contra a sinalização de IL-31 humana (Figura 5).
A atividade de neutralização de IL-31 foi avaliada conforme descrito abaixo usando a linhagem de célula DU145 (linhagem de célula de câncer de próstata humana), onde a produção de IL-6 é induzida quanto da estimulação de IL-31.
Células DU145 foram preparadas a 2,5 χ 105 células/ml em MEM (Invitrogen) contendo FBS 10% (MOREGATE), 2 mmols/l de Lglutamina (Invitrogen) e 1 mmol/l de piruvato de sódio (SIGMA) e alíquotas de 200 μΙ foram despejadas em cada poço de placas de 48 poços (CORNING). As células foram incubadas a 37°C sob CO2 a 5% da noite para o dia. NSS22 quimérico purificado (γ1, K humano) foi diluído para 100 pg/ml com MEM contendo FBS 10%, 2 mmoles/l de L-glutamina e piruvato de sódio. Usando esta solução, seis diluições seriais foram preparadas em uma razão de diluição comum de 5. Cada diluição foi combinada com 100 ng/ml de interleucina-31 humana (R&D systems) em uma razão de 1:1 e uma alíquota de 50 μΙ foi adicionada a cada poço. Após dois dias de cultura a 37°C sob CO2 5%, a concentração de IL-6 no sobrenadante de cultura foi determinada usando DuoSet ELISA Development kit (R&D Systems). A atividade de neutralização de NS22 foi avaliada através da determinação da taxa de inibição (%). Especificamente, supondo a concentração de IL-6 na ausência de IL-31 (A) como a atividade inibidora máxima (inibição de 100%) e a concentração de IL-6 na presença de IL-31 sem NS22 (B) como nenhuma atividade inibidora (0% de inibição), a concentração de IL-6 na presença de IL-31 e NS22 (C) foi determinada de acordo com a fórmula que segue.
Taxa de inibição (%) = (B-C)/(B-A) x 100
O resultado mostrou que NS22 suprimiu a produção de IL-6 induzida por IL-31 na linhagem de célula DU145 de uma maneira dependente da concentração e então demonstrou que NS22 tinha uma atividade de neutralização contra a sinalização de IL-31 humana (Figura 6).
Avaliação de competição de anticorpo anti-NR10 quimérico com IL-31
IL-31 humana (R&D Systems) foi marcada com FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye (Applied Biosystems). 100 μΙ de hlL-31 preparado a 0,5 mg/ml usando tampão de fosfato de sódio 50 mM (pH 8,0) foram misturados com 5,25 μΙ de 25 nmols de FMAT Blue dissolvidos em DMSO (Junsei). Após vórtex, a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. A reação de conjugação de FMAT Blue com hlL-31 foi terminada adicionando 5 μΙ de Tris-HCI 1M (pH 7,4) e 1,1 μΙ de Tween-20 a 10% e então hlL-31 marcada com FMAT Blue e FMAT Blue não-reagido foram separados através de filtragem em gel usando coluna Superdex 75 (GE Healthcare, 17-0771-01)com solução de desenvolvimento Tween-20 a 0,1%/PBS.
Os anticorpos foram avaliados quanto à atividade de inibição de ligação de IL-31/NR10 usando células CHO expressando hNR10 conforme descrito abaixo.
NS22 e NA633 (a região constante de cada um é γ1,κ) foram diluídos em uma concentração apropriada usando tampão de ensaio (HEPES a 10 mM, NaCI a 140 mM, CaCI2 a 2,5 mM, MgCI2 a 3 mM, FBS a 2%, NaN3 a 0,01%), e então várias diluições seriais foram preparadas em uma razão de diluição comum de 2. As diluições foram adicionadas a 40 μΙ/poço a placas (Placas FMAT de 96 poços; Applied Biosystems). Então, hlL-31 marcada como FMAT Blue foi diluída 400 vezes com Tampão de ensaio e adicionada a 20 μΙ/poço. Finalmente, as suspensões celulares ajustadas para 2,5 x 105 células/ml usando Tampão de ensaio foram adicionadas a 40 μΙ/poço (final 1 x 104 células/poço). Duas horas após adição de células, a fluorescência (FL1) foi determinada usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems). O resultado mostrou que NS22 inibiu a ligação de hlL-31/hNR10 de uma maneira dependente da dose, e demonstrou que sua atividade era superior àquela de NA633 (Figura 7).
Exemplo 3 - Competição de anticorpo anti-NR10 contra NR10
O anticorpo NS22 purificado de um sobrenadante de cultura de hibridoma foi marcado com FMAT Blue (Applied Biosystems, 4328853). 170 μΙ de NS22 preparado a 1 mg/ml em PBS foram misturados com 17 μΙ de solução de NaHCOs a 1M e 3,4 μΙ de FMAT Blue (17 nmols) dissolvidos em DMSO. Após vórtex, a mistura foi deixada descansar em temperatura ambi ente por 30 minutos. A reação de conjugação de FMAT Blue com NS22 foi terminada adicionando 8 pl de Tris-HCI a 1M (pH 7,4) e 1,9 μΙ de Tween-20 a 1% e então NS22 marcada com FMAT Blue (FMAT Blue-NS22) e FMAT Blue não-reagido foram separados através de filtragem em gel usando coluna Superdex 75 (GE Healthcare, 17-0771-01) com solução de desenvolvimento Tween-20 a 0,01%/PBS.
Cada anticorpo foi examinado quanto à inibição da ligação de FMAT Blue-NS22 preparado a células CHO expressando hNR10 (Exemplo de Referência 3) usando o 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems, 4342920). Os anticorpos anti-NR10 quiméricos (a região constante de cada um é γ1, κ) foram adicionados em várias concentrações a cada poço contendo 7500 células e 8,8 x 10'2 pg/ml de FMAT Blue-NS22. As células foram deixadas descansar no escuro por quatro horas, e então o sinal de fluorescência de FMAT Blue ligado às células foi medido. A reação foi realizada em Hepes 10 mM-KOH contendo CaCI2 a 2,5 mM, MgCI2 a 3 mM, NaCl a 140 mM, FBS a 2% e NaNO3 a 0,01%. O resultado é mostrado na Figura
8. O valor de fluorescência FL1, que representa a ligação de FMAT BlueNS22 a células expressando NR10, foi reduzido com o aumento na concentração de anticorpo NS22 ou NS23. Por outro lado, FL1 foi dificilmente reduzido com o aumento na concentração de anticorpo NA633 (exemplo de referência 6) (Figura 8).
Exemplo 4 - Humanizacão de anticorpo NS22 Seleção de cada sequência de estrutura principal
As regiões variáveis de anticorpo NS22 de camundongo foram comparadas com sequências de linha germinativa humana. Sequências de FR usadas para humanização são sumarizadas na Tabela 2. CDRs e FRs foram determinadas com base na numeração Kabat. As sequências de região variável de cadeia H composta de FR1, FR2, FR3_1 e FR4 e compostas de FR1, FR2, FR3 2 e FR4, que são listadas na Tabela 2, são designadas H0-VH (SEQ ID NO:50) e H1-VH (SEQ ID NO:112, respectivamente). Entretanto, a sequência de cadeia L composta de FR1, FR2, FR3 e FR4 é chamada L0 (SEQ ID NO:52).
Preparação de região variável para NS22 H0L0 humanizado
Oligo DNAs sintéticos foram projetados para cada uma das cadeias H e L para construir as regiões variáveis de NS22 humanizado onde as CDRs de NS22 são enxertadas nas FRs usadas para humanização. Os respectivos oligo DNAs sintéticos foram misturados, e então submetidos à PCR de montagem para construir um gene codificando a região variável de NS22 humanizado. A PCR de montagem foi realizada usando KOD-Plus (TOYOBO) de acordo com as condições que seguem. Uma mistura de reação contendo 10 pmol de DNAs oligo sintéticos e o Tampão de PCR, dNTPs, MgSO4 e KOD-Plus anexos foi aquecida a 94°C por cinco minutos. A mistura foi então submetida a dois ciclos de PCR de 94°C por dois minutos, 55°C por dois minutos e 68°C por dois minutos. Então, 10 pmol de cada iniciador onde um sítio de restrição e sequências Kozak tinham sido adicionados na extremidade 5' da região variável e um iniciador onde um sítio de restrição tinha sido adicionado à extremidade 3' da região variável foram adicionados e submetidos a 35 ciclos de PCR de 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 68°C por um minuto para dar um fragmento amplificado. O fragmento amplificado resultante foi clonado em vetor TOPO TA Cloning (TOYOBO), e sua sequência de nucleotídeo foi determinada através de sequenciamento. As regiões variáveis construídas foram combinadas com as regiões constantes para preparar H0-SKSC (SEQ ID NO:54) e L0 (SEQ ID NO:56). O construto resultante foi inserido em um vetor de expressão capaz de expressar o gene inserido em células animais. A sequência de nucleotídeo de cada fragmento de DNA foi determinada usando BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) com ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer ou ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) de acordo com o método descrito no manual de instruções anexo.
Preparação de região variável para NS22 H1 humanizado
H1-SKSC (SEQ ID NO: 130) foi gerado substituindo a glutamina (E) na posição 73 na numeração Kabat em FR3 de H0-SKSC (SEQ ID NO:54) com lisina (K). O mutante foi preparado usando QuikChange SiteDirected Mutagenesis Kit (Stratagene) comercialmente disponível de acordo com o manual de instruções anexo.
Expressão de anticorpo convertido em IqG
Expressão de anticorpo foi realizada através do método descrito abaixo. Linhagem de célula HEK293H derivada de célula de câncer renal fetal humana (Invitrogen) foi suspensa em DMEM (Invitrogen) contendo soro fetal de bezerro 10% (Invitrogen) e 10 ml de células em uma densidade de 56 x 105 células/ml foram semeados em placas para células aderentes (10 cm de diâmetro; CORNING). As células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (37°C, CO2 a 5%) por um dia inteiro e uma noite inteira. Então, o meio foi removido através de aspiração e 6,9 ml de meio CHO-S-SFMII (Invitrogen) foram adicionados às células. A mistura de DNA de plasmídeo preparada (13,8 pg no total) foi misturada com 20,7 pl de 1 pg/ml de polietilenoimina (Polysciences Inc.) e 690 pl de meio CHO-S-SFMII e deixada ficar em temperatura ambiente por 10 minutos. A mistura foi adicionada às células em cada placa e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 (CO2 a 5%, 37°C) por quatro a cinco horas. Então, 6,9 ml de meio CHO-SSFMII (Invitrogen) foram adicionados, e as células foram incubadas em uma incubadora de CO2 por três dias. O sobrenadante da cultura foi coletado e centrifugado (aprox. 2000 g, cinco minutos, temperatura ambiente) para remover as células. O sobrenadante foi então esterilizado através de filtragem através de um filtro de 0,22 pm MILLEX®-GV (Millipore). Cada amostra foi armazenada a 4°C até uso.
Purificação de anticorpo convertido em IqG pl de rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences) suspensos em TBS foram adicionados ao sobrenadante de cultura obtido e misturados através de inversão a 4°C por 4 horas ou mais. A solução foi transferida para copo de filtro de 0,22 pm de Ultrafree®-MC (Millipore). Após três lavagens com 500 pl de TBS, resina rProtein A Sepharose® foi suspensa em 100 pl de solução aquosa de acetato de sódio 50 mM (pH 3,3) e deixada por três minutos para eluir o anticorpo. A solução foi imediatamente neutralizada adicionando 6,7 pl de Tris-HCI a 1,5 M (pH 7,8). A eluição foi realizada duas vezes e 200 pl de anticorpo purificado foram obtidos. 2 pl da solução contendo anticorpo foram submetidos a ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop)(Thermo Scientific NanoDrop® 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific)) ou 50 μΙ foram submetidos a Spectrophotometer DU-600 (BECKMAN) para medir a absorbância a 280 nm, e a concentração de anticorpo foi calculada através do método de Pace e outros (Protein Science (1995)4:2411-2423).
Medição de competição com IL-31 usando FMAT
Os anticorpos foram avaliados quanto à atividade de inibição de ligação de IL-31/NR10 usando células CHO expressando hNR10 conforme descrito abaixo. O anticorpo NS22 quimérico e NS22 H0L0 (cadeia H, H0SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, L0/SEQ ID NO:56) foram diluídos em uma concentração apropriada usando Tampão de ensaio (HEPES a 10 mM, NaCI a 140 mM, CaCI2 a 2,5 mM, MgCI2 a 3 mM, FBS a 2%, NaN3 a 0,01%, pH 7,4) e mais oito diluições seriais foram preparadas em uma razão de diluição comum de 2. As diluições foram adicionadas a 40 μΙ/poço a placas (Placas FMAT de 96 poços, Applied Biosystems). Então, hlL-31 marcada com FMAT Blue foi diluída 400 vezes com Tampão de ensaio e adicionada a 20 μΙ/poço. Finalmente, uma suspensão celular ajustada para 2,5 x 105 células/ml usando Tampão de Ensaio foi adicionada a 40 μΙ/poço (final 1 x 104 células/poço). Duas horas após adição de células, a fluorescência (FI1) foi medida usando 8200 Cellular Detection System (Applied Biosystems).
O resultado mostrou que, conforme mostrado na Figura 9, anticorpos NS22 humanizados HOLO (cadeia H, H0-SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, L0/SEQ ID NO:56) e H1L0 (Cadeia H, H1-SKSC/SEQ ID NO:130; cadeia L, L0/SEQ ID NO:56) exibiram uma atividade de competição comparável àquela do anticorpo quimérico, sugerindo que ambos os HOLO e H1L0 são anticorpos receptores anti-IL-31. Ainda, é considerado que as FRs usadas para HOLO e H1L0 podem ser usadas para humanização.
Desta maneira, todas as mutações nas CDRs descritas nos Exemplos a seguir podem ser introduzidas em ambos os HO e H1.
Tabela 2
HO Linha germinativa Sequência de FR humano
FR1 Linh‘ hVH_1_46(N°de Acesso X92343) germinativa ·“ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO:96)
FR2 eXinrfv. : hVH 1 46 (N· de Acesso X92343) WRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 97)
FR3_1 XL·» hVH_1_69 (N· de Acesso L22582) RVT1TADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 98)
FR3_2 Linh* hVH 1 69 (n» de Acesso Z27506) germinativa -- RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 131)
FR4 Linha : iii< germinativa 1 WGQGTLVTVSS (SEQIDNO:99)
LO Linha germinativa Sequência de FR humano
FR1 XL·» hVK_1_39 (n· de Acesso X59315) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 100)
FR2 XU/hVKJ-39 (Ν’ de Acesso X59315) WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 101)
FR3 X^/hVtU» (N’deAcesso χ59315) GVPSRFSGSGSGTDFTLT1SSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 102)
FR4 Linha : ||/J germinativa FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 103)
Exemplo 5 - Efeito de redução de heteroqeneidade de regiões constantes novas M14 e M58 em anticorpo receptor anti-IL31 humanizado
Conforme mostrado nos Exemplos de Referência 7 a 9, foi demonstrado que a conversão da região constante de lgG2 para M14 ou M58 no anticorpo huPM1, um anticorpo receptor anti-IL-6 humanizado, poderia reduzir a heterogeneidade derivada da região de dobradiça de lgG2 sem perda de estabilidade. Então, anticorpos receptores anti-IL-31 foram também testados para avaliar se a heterogeneidade pode ser reduzida convertendo suas regiões constantes do lgG2 do tipo selvagem em M14 ou M58.
H0-M14, H0-M58, H0-lgG1 e H0-lgG2, que foram gerados combinando lgG1 (SEQ ID NO:60), lgG2 (SEQ ID NO: 132), M14 (SEQ ID NO: 129) e M58 (SEQ ID NO: 128) gerados nos Exemplos de Referência 8 e 9, com região variável de cadeia H HO (HO-VH/SEQ ID NO:50) de anticorpo receptor anti-IL-31 humanizado gerado no Exemplo 4, foram usados como cadeias H e LO (LO/SEQ ID NO:56) produzido no Exemplo 4 foi usado como uma cadeia L para gerar H0L0-lgG1 (cadeia H, H0-lgG1/SEQ ID NO: 133; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56), H0L0-lgG2 (cadeia H, H0-lgG2/SEQ ID NO:134; cadeia L, LO/SEQ iD NO:56), H0L0-M14 (cadeia H, H0-M14/SEQ ID
NO: 135; cadeia L, LO-SEQ ID NO:56) e H0L0-M58 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56). Cada anticorpo foi expresso e purificado através do método descrito no Exemplo 4.
A heterogeneidade foi avaliada através de cromatografia de troca de cátion. Os anticorpos preparados foram avaliados quanto à heterogeneidade usando coluna ProPac WCX-10 (Dionex), acetato de sódio a 20 mM (pH 5,0) como fase móvel A e acetato de sódio a 20 mM/NaCI a 1M (pH 5,0) como fase móvel B, com taxa de fluxo e gradiente apropriados. O resultado de avaliação através de cromatografia de troca de cátion (IEC) é mostrado na Figura 10.
Conforme mostrado na Figura 10, a heterogeneidade foi aumentada convertendo a região constante de lgG1 em lgG2 no anticorpo receptor anti-IL-31 e a heterogeneidade pode ser reduzida através de conversão da região constante em M14 ou M58 em qualquer anticorpo.
Exemplo 6 - Efeito do aperfeiçoamento farmacocinético de região constante nova M58 em anticorpos receptores anti-IL-31
Conforme mostrado no Exemplo de Referência 9, conversão da região constante de lgG1 em M58 em anticorpo receptor anti-IL-6 huPM1 foi constatada melhorar sua atividade de ligação a FcRn e a farmacocinética em camundongos transgênicos FcRn humanos. Então, anticorpos receptores anti-IL-31 foram também testados para avaliar se a conversão da região constante em M58 melhora sua farmacocinética.
H0L0-lgG1 (cadeia H: H0-lgG1/SEQ ID NO: 133; cadeia L: LO/SEQ ID NO:56) e H0L0-M58 (cadeia H: H0-M58/SEQ ID NO:136; cadeia L LO/SEQ ID NO:56) preparados conforme descrito nos Exemplo 4 e 5 foram avaliados quanto à atividade de ligação a FcRn humano através do método descrito no Exemplo de Referência 9. O resultado é mostrado na Tabela 3. Tabela 3
KD(/zM)
H0L0-IgG1 1.07
H0L0-M58 0.91
Conforme mostrado na Tabela 3, conversão da região constante de lgG1 em M58 também melhorou a atividade de ligação a FcRn humano do anticorpo receptor anti-IL-31 HOLO como no anticorpo receptor anti-IL-6 hPM1. Isto sugere que conversão da região constante de lgG1 em M58 pode melhorar a farmacocinética de anticorpo receptor anti-lL-31 em humano. Exemplo 7 - Identificação de sítios de mutação reduzindo o ponto isoelétrico Produção de mutantes
Cada mutante foi produzido através do método descrito no Exemplo 4 ou através de PCR de montagem. No método usando PCR de montagem, oligo DNAs foram sintetizados com base em sequências avançadas e reversas incluindo um sítio alterado. Oligo DNA avançado incluindo um sítio alterado e oligo DNA reverso se ligando ao vetor onde os genes a serem alterados foram inseridos foram combinados, e oligo DNA reverso incluindo um sítio alterado e oligo DNA avançado se ligando ao vetor onde o gene a ser alterado foi inserido, foram combinados. PCR foi realizada usando PrimerSTAR (Takara) para produzir fragmentos de extremidade 5' e extremidade 3' incluindo o sítio alterado. Os dois fragmentos foram montados através de PCR de montagem para produzir cada mutante. O mutante produzido foi inserido em um vetor de expressão capaz de expressar o gene de inserção em células animais. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão resultante foi determinada através de um método conhecido pelo versado na técnica. Anticorpos foram produzidos e purificados através do método descrito no Exemplo 4.
Identificação de sítios de mutação
Para melhorar a farmacocinética de H0L0 (cadeia H, H0SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56), sítios alterados capazes de reduzir o ponto isoelétrico da região variável foram examinados. Avaliação de sítios mutantes nas regiões variáveis previstas do modelo de estrutura tridimensional revelou sítios de mutação que diminuiríam o ponto isoelétrico das regiões variáveis sem reduzir significantemente sua ligação a NR10. Esses são sumarizados na Tabela 4 (Hp5-VH/SEQ ID NO: 137, Hp7VH/SEQ ID NO: 138, Hp8-VH/SEQ ID NO: 139, Hp6-VH/SEQ ID NO: 140, Hp9-VH/SEQ ID NO: 141, Hp1-VH/SEQ ID NO: 142, Hp13-VH/SEQ ID NO:
143, Lp1-VL/SEQ ID NO: 144, Lp2-VUSEQ ID NO: 145, Lp3-VL/SEQ ID NO: 146, Lp4-VL/SEQ ID NO: 147, Lp7-VL7SEQ ID NO: 148, Lp5-VL/SEQ ID NO: 149, Lp6-VL/SEQ ID NO: 150).
Cada variante foi produzida e purificada através do método des5 crito no Exemplo 4.
Cada variante foi testada quanto à atividade de inibição de ligação de hlL-31/hNR10 usando FMAT. O teste foi realizado de acordo com o método conforme descrito no Exemplo 4. Conforme mostrado na Figura 11, a atividade de competição de cada variante não foi muito reduzida compara10 do com aquela de HOLO.
Tabela 4
Nome Tipo Sequência Sitio de mutação de HO (No. kabat) Sequência de H0 Aminoácido Sequência após mutação após mutação
Hp5 FR2 WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 97) 38 40 R *A Q S WVQQSPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 120)
Hp7 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 50 L E EINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 113)
Hp8 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 52 N D LIDPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 114)
Hp6 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 61 Q D LINPYNGGTSYNDKFKG (SEQ ID NO:115)
Hp9 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 62 K Q LINPYNGGTSYNQQFKG (SEQ ID NO: 116)
Hp1 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 64 K Q LINPYNGGTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 117)
Hp13 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 10) 64 65 K G Q D LINPYNGGTSYNQKFQD (SEQ ID NO:119)
Nome Tipo Sequência de LO Sítio de mutação Sequência Aminoácido após mutaçã Sequência o após mutação
(No. kabat) de L0
Lp1 CDR1 RTSENIYSFLA (SEQ ID NO: 13) 24 R Q QTSENIYSFLA (SEQ ID NO: 121)
Lp2 CDR1 RTSENIYSFLA (SEQ ID NO: 13) 28 N D RTSEDIYSFLA (SEQ ID NO: 122)
Lp3 CDR2 NAKTLAK (SEQ ID NO: 14) 50 N D DAKTLAK (SEQ ID NO: 123)
Lp4 CDR2 NAKTLAK (SEQ ID NO: 14) 52 K Q NAQTLAK (SEQ ID NO:124)
Lp7 CDR2 NAKTLAK (SEQ ID NO: 14) 54 L E NAKTEAK (SEQ ID NO: 125)
Lp5 CDR2 NAKTLAK (SEQ ID NO: 14) 56 K Q NAKTLAQ (SEQ ID NO: 126)
Lp6 CDR2 NAKTLAK (SEQ ID NO: 14) 56 K D NAKTLAD (SEQ ID NO: 127)
Asterisco (*) na Tabela 4 acima indica um sítio que não era rele92 vante para o ponto isoelétrico, mas alterado para conversão em uma sequência humana.
Exemplos de anticorpos NS22 humanizados cujo ponto isoelétrico foi reduzido combinando essas alterações incluem Hp3Lp15 (cadeia H: Hp3-SKSC/SEQ ID NO: 151; cadeia L: Lp15/SEQ ID NO: 152). Afinidade para NR10, ponto isoelétrico e retenção de plasma em camundongos foram comparados entre Hp3Lp15 e H0L0.
Medição de afinidade
A afinidade de cada anticorpo para NR10 foi determinada através do método descrito no Exemplo de Referência 10.
O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 5. A afinidade de Hp3Lp15 foi mostrada ser quase a mesma que aquela de H0L0. Tabela 5
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
HOLD Hp3Lp15 3.7E+05 4.2E+05 1.2E-03 1.6E-03 3.3E-09 3.9E-09
Medição de ponto isoelétrico
Cada anticorpo foi analisado através de foco isoelétrico para avaliar mudanças no ponto isoelétrico de todo o anticorpo devido às alterações de aminoácido em sua região variável. Foco isoelétrico foi realizado através do método que segue.
Gel Phast-Gel Dry IEF (Amersham Biosciences) foi inchado em Phastsystem Cassete (Amersham Bioscience) por cerca de 30 minutos usando a solução de inchamento mostrada abaixo.
Água MilliQ 1,5 ml
Pharmalyte 5-8 para IEF (Amersham Bioscience) 100 pl
Eletroforese foi realizada em PhastSystem (Amersham Biosciences) usando o gel inchado de acordo com o programa indicado abaixo. As amostras foram carregadas no gel na Etapa 2. Calibration Kit para pl (Amersham Biosciences) foi usado como um marcador de pl.
Etapa 1: 2000 V 2,5 mA 3.5 W 15°C 75 Vh
Etapa 2: 200 V 2,5 mA 3.5 W 15°C 15 Vh
Etapa 3: 2000 V 2,5 mA 3.5 W 15°C 410 Vh
Após eletroforese, o gel foi fixado com 20% de TCA e então tingido de prata usando o Silver Staining Kit, Protein (Amersham Biosciences), de acordo com o protocolo anexo ao kit. Após fingimento, o ponto isoelétrico da amostra (o anticorpo inteiro) foi calculado a partir dos pontos isoelétricos conhecidos dos marcadores de pl.
O resultado da medição do ponto isoelétrico através de foco isoelétrico mostrou que o ponto isoelétrico de H0L0 era cerca de 7,8, e o ponto isoelétrico de Hp3Lp15 era cerca de 5,5, mostrando que o ponto isoelétrico de Hp3Lp14 foi menor em cerca de 2,3 comparado com H0L0. Quando o ponto isoelétrico teórico da região variável VHA/L foi calculado pela GENETYX (GENETYX CORPORATION), os pontos isoelétricos teóricos das regiões variáveis de H0L0 e Hp3Lp15 foram 7,76 e 4,63, respectivamente. Então, o ponto isoelétrico teórico de Hp3Lp15 foi diminuído em 3,13 comparado com H0L0.
Avaliação de farmacocinética de anticorpo com ponto isoelétrico reduzido usando camundongos
A fim de avaliar a retenção no plasma de Hp3Lp15, um anticorpo modificado com ponto isoelétrico reduzido, a retenção no plasma de H0L0 e Hp3Lp15 foi comparado em camundongos normais. Uma dose única de H0L0 ou Hp3Lp15 foi intravenosamente administrada a 1 mg/kg a camundongos (C57BL/6J, Charles River Japão, Inc.) para comparar a via de tempo da concentração no plasma. As concentrações no plasma foram determinadas através de ELISA. Concentrações apropriadas de uma amostra de calibragem e amostras de plasma de teste foram despejadas em imunoplacas (Nunc-lmmuno Plate, MaxiSorp (Nalge Nunc International)) revestidas com anticorpo IgG anti-humano (Fc-específico) (Sigma). As amostras foram deixadas descansar em temperatura ambiente por uma hora. Após reação com IgG Anti-Humano de Cabra-ALP (Sigma) em temperatura ambiente por uma hora, reação de desenvolvimento de cor foi realizada usando BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories) como um substrato. A absorbância a 650 nm foi medida com uma leitora de microplaca. As concentrações no plasma foram determinadas com base na absorbância da curva de calibragem usando o software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Parâmetros farmacocinéticos (AUC e liberação sistêmica (CL)) foram calculados a partir dos dados de curso de tempo obtidos da concentração no plasma usando o software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight). Os parâmetros são mostrados na Tabela 6. AUC e a liberação de Hp3Lp15 após a administração intravenosa foram aumentadas em cerca de 14% e reduzidas em cerca de 12%, respectivamente, comparado com H0L0. Então, foi demonstrado que Hp3Lp15, onde o ponto isoelétrico de HOLO tinha sido reduzido, tinha farmacocinética aperfeiçoada.
Tabela 6
AUC(pg-d/kg) CL(ml/d/kg)
Mean SD Mean SD
HOLO 281.8 13.1 3.6 0.2
Hp3Lp15 321.1 26.1 3.1 0.3
Exemplo 8 - Efeito de combinações de região variável e região constante sobre a atividade biológica
A fim de avaliar os efeitos de regiões constantes diferentes sobre a atividade biológica, as variantes que seguem foram produzidas.
SKSC (SEQ ID NO:62) e M58 (SEQ ID NO:128), regiões constantes preparadas nos Exemplos de Referência 7 e 9, foram combinadas com Hp3 (Hp3-VH/SEQ ID NO: 167), uma região variável preparada no Exemplo 7, para produzir Hp3-M58 (SEQ ID NO:240) e Hp3-SKSC (SEQ ID NO:151) como cadeias H. As cadeias H preparadas foram combinadas com Lp15 (Lp15/SEQ ID NO: 152), uma cadeia preparada no Exemplo 7, para produzir Hp3Lp-15-SKSC (cadeia H, Hp3-SKSC/SEQ ID NO:151; cadeia L, Lp15/SEQ ID NO: 152) e Hp3Lp15-M58 (cadeia H, Hp3-M58/SEQ ID NO:240; cadeia L, Lp15/SEQ ID NO: 152). Cada anticorpo foi expresso e purificado através do método descrito no Exemplo 4.
Os anticorpos produzidos conforme acima descrito, H0L0-SKSC (cadeia H, HO-SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56) preparado usando a região constante SKSC (SEQ ID NO:62) descrito no Exemplo de Referência 7 e H0L0-M58 (cadeia Η, H0-M58 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56) e H0L0-lgG2 (cadeia H, H0-lgG2/SEQ ID NO: 134; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56) preparados no Exemplo 5, foram avaliados quanto à atividade biológica através do método descrito no Exemplo 2 usando BaF/NR10. O resultado é sumarizado na Figura 18.
Conforme mostrado na Figura 18, nenhuma diferença significante na atividade biológica foi detectada entre as regiões constantes. Uma vez que a atividade biológica não foi afetada quando combinando as duas regiões variáveis HO e Hp3 com cada região constante, combinação de regiões variáveis criadas no futuro com qualquer região constante não resultaria em alteração na atividade biológica.
Exemplo 9 - Identificação de sítios de mutação suprimindo degradação através de estudo de aceleração térmica
Anticorpos usados para agentes farmacêuticos têm heterogeneidade embora eles sejam anticorpos monoclonais obtidos de clones derivados de células de produção de anticorpo simples. Tal heterogeneidade de anticorpo é conhecida resultar de modificação tal como oxidação ou desaminação, e ser aumentada durante armazenamento a longo prazo ou quando da exposição a condições de estresse, tal como estresse de calor ou estresse de luz (vide Heterogeneity of Monoclonal Antibodies, Journal of Parmaceutical Sciences, Vol. 97, No. 7, 2426-2447). No entanto, quando um anticorpo é desenvolvido como um agente farmacêutico, propriedades físicas da proteína, particularmente homogeneidade e estabilidade, são muito importantes. Então, é desejado que a heterogeneidade de substâncias desejadas/relacionadas seja reduzida e a substância seja composta de uma substância simples o máximo possível. Neste contexto, o experimento descrito abaixo foi conduzido para avaliar a heterogeneidade do anticorpo sob condições de estresse e reduzir a heterogeneidade.
Para avaliar produtos de degradação, uma amostra acelerada de HOLO (cadeia H, HO-SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56) foi preparada através do método descrito abaixo. A amostra acelerada e a a mostra não acelerada preparadas (inicial) foram analisadas através de cromatografia de troca de cátion usando o método descrito abaixo.
- Método para preparação de amostras aceleradas
Tampão: PBS
Concentração de anticorpo: 0,2 a 1,0 mg/ml
Temperatura de aceleração: 60°C
Período de aceleração: um dia
- Método para análise através de cromatografia de troca de cátion
Coluna: ProPac WCX-10, 4 x 250 mm (Dionex)
Fase móvel: (A) 25 mmol/l de MES/NaOH, pH 6,1 (B) 25 mmol/l de MES/NaOH, 250 mmol/l de NaCI, pH 6,1
Taxa de fluxo: 0,5 ml/min
Temperatura da coluna: 40°C
Gradiente: %B 0 a 0 (0-5 min) —> 0 a 30 (5-80 min)
Detecção: 280 nm
Os cromatogramas resultantes para amostras de H0-L0 antes e após aceleração são mostrados na Figura 19. A amostra de HOLO após aceleração tinha uma tendência em mostrar um pico básico maior.
Então, avaliação foi realizada para reduzir este pico. Como resultado, Ha355, Ha356, Ha360 e Ha362 foram encontradas. Essas variantes de cadeia H foram combinadas com L0 para produzir Ha355L0 (cadeia H, Ha355-SKSC/SEQ ID NO: 242; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), Ha356L0 (cadeia H, Ha356-SKSC/SEQ ID NO: 243; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56), Ha360L0 (cadeia H, Ha360-SKSC/SEQ ID NO: 244; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56) e Ha362L0 (cadeia H, Ha362-SKSC/SEQ ID NO: 245; cadeia L, L0/SEQ ID NO: 56). A sequência de cada variante é mostrada na Tabela 7.
Tabela 7
Nome Tipo
Sequência de Sítio de mutação Sequência de Aminoácido após Sequência após
HO (No. de kabat) HO mutação mutação
Ha355 CDR3 DGYDDGPYTMDY (SEQ ID NO: 265) 100d 101 102 M D Y L E T DGYDDGPYTLET (SEQ ID NO: 266)
Ha356 CDR3 DGYDDGPYTMDY 101 D E DGYDDGPYTMET
(SEQ ID NO: 265) 102 Y T (SEQ ID NO: 267)
Ha360 CDR3 DGYDDGPYTMDY 97 Y L DGLDDGPYTMET
(SEQ ID NO: 265) 101 D E (SEQ ID NO: 268)
102 Y T
Ha362 CDR3 DGYDDGPYTMDY 97 Y L DGLDDGPYTMES
(SEQ ID NO: 265) 101 D E (SEQ ID NO: 269)
102 Y S
Cada um dos anticorpos identificados foi expresso e purificado através do método descrito no Exemplo 4. Como com HOLO, uma amostra acelerada de cada anticorpo preparado foi preparada, e analisada através de cromatografia de troca de cátion. O resultado é mostrado na Figura 19.
O resultado mostrou que a geração do pico básico aumentou após aceleração ser reduzida no anticorpo modificado contendo uma substituição de ácido aspártico com ácido glutâmico na posição 101 na cadeia H, comparado com HOLO. Os anticorpos modificados foram avaliados quanto à atividade biológica através do método descrito no Exemplo 2 usando BaF/NR10. O resultado é mostrado na Figura 20. Conforme mostrado na Figura 20, as atividades biológicas dos anticorpos modificados eram comparáveis a ou mais fortes do que aquelas de H0L0. Essas constatações demonstraram que as modificações de Ha355, Ha356, Ha360 e Ha362 suprimiram a geração de produtos de degradação através de aceleração, e então são eficazes em melhorar a estabilidade de anticorpo.
Exemplo 10 - Identificação de sítios de mutação aumentando a afinidade
Uma biblioteca onde mutações foram introduzidas em sequências de CDR foi construída e examinada para melhorar a afinidade de H0L0 para NR10. Como um resultado de avaliação da biblioteca onde mutações foram introduzidas em CDRs, mutações que melhoram a afinidade para NR10 foram encontradas As mutações são mostradas na TqmGÍS S. Cadd uma das variantes de cadeia H Ha101-SKSC (SEQ ID NO:246), Ha10398
SKSC (SEQ ID NO:247), Hal11-SKSC (SEQ ID NO:248), Ha204-SKSC (SEQ ID NO:249) e Ha219-SKSC (SEQ ID NO:250) foi combinada com LO (LO/SEQ ID NO:56); e cada uma das cadeias L modificadas La134 (SEQ ID NO:251), La130 (SEQ ID NO:252), La303 (SEQ ID NO:253) e La328 (SEQ 5 ID NO:245) foi combinada com HO (HO-SKSC/SEQ ID NO:54) para construir um anticorpo. Cada variante foi produzida e purificada através do método descrito no Exemplo 4.
A afinidade de cada anticorpo para NR10 foi avaliada usando Biacore. O resultado é mostrado na Tabela 9. O ensaio foi realizado usando o método descrito no Exemplo de Referência 10. Conforme mostrado na Tabela 9, o valor KD para cada variante foi constatado ser melhorado comparado com aquele de H0L0 (cadeia H, HO-SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L,
LO/SEQ ID NO:56).
Tabela 8
Nome Tipo Sequência de Sitio de mutação HO (No. Kabat) Sequência de HO Aminoácido após Sequência após
mutação mutação
Ha101 CDR1 GYIMN (SEQ ID NO: 270) 33 I V GYVMN (SEQ ID NO: 272)
Ha103 CDR1 GYIMN (SEQ ID NO:270) 34 M I GYIIN (SEQ ID NO.273)
Ha111 CDR1 GYIMN (SEQ ID NO:270) 34 M L GYILN (SEQ ID NO: 274)
Ha204 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 271) 58 S D LINPYNGGTDYNQKFKG (SEQ ID NO:275)
Ha219 CDR2 LINPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 271) 61 Q P LINPYNGGTSYNPKFKG (SEQ ID NO: 276)
Nome Tipo Sequência de Sítio de mutação LO (No. Kabat) Sequência de LO Aminoácido após mutação Sequência após mutação
La134 CDR1 RTSENIYSFLA 31 S R RTSENIYRFLA
(SEQ ID NO: 277) (SEQ ID NO:279)
La130 CDR1 RTSENIYSFLA 31 S R RTSENIYRFVA
(SEQ ID NO:277) 33 L V (SEQ ID NO:280)
Ls303 CDR3 QHHYESPLT 93 E D QHHYDSPLT
(SEQ ID NO: 278) (SEQ ID NO:281)
La328 CDR3 QHHYESPLT 94 s D QHHYEDPLT
(SEQ ID NO: 278) (SEQ ID NO:282)
La326 CDR3 QHHYESPLT 97 T F QHHYESPLF
(SEQ ID NO: 278) (SEO ID NO-283)
Tabela 9
Nome ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 1-9E+05 6.2E-04 3.2E-09
Ha101L0 2.0E+05 3.1E-04 1.5E-09
Ha103L0 2.2E+05 5.3E-04 2.4E-09
Ha111L0 2.6E+05 5.6E-04 2.1E-09
Ha204L0 3.7E+05 4.8E-04 1.3E-09
Ha219L0 3.2E+05 9.6E-04 3.0E-09
Nome ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 1.5E+05 7.4E-04 5.1E-09
H0La134 2.5E+05 4.4E-04 1.8E-09
H0La130 2.6E+05 4.0E-04 1.5E-09
H0La303 2.2E+05 4.6E-04 2ΊΕ-09
H0La328 1.8E+05 5.2E-04 2.9E-09
H0La326 1.4E+05 5.2E-04 3.7E-09
Exemplos de combinações dessas mutações de melhora de afi5 nidade com as mutações de diminuição de ponto isoelétrico geradas no Exemplo 7 incluem, por exemplo, Ha401La402 (cadeia H, H401-SKSC/SEQ ID NO:255; cadeia L, La402/SEQ ID NO:256) e H17L11 (cadeia Η, H17M58/SEQ ID NO:22; cadeia L, L11/SEQ ID NO:236). Cada variante foi produzida e purificada através do método descrito no Exemplo 4.
Ha401La402 (cadeia H, Ha401-SKSC/SEQ ID NO:255; cadeia L,
La402/SEQ ID NO:256) foi avaliada quanto à sua afinidade para NR10 e sua atividade biológica através do método descrito no exemplo de referência 10 e o método usando BaF/NR10 conforme descrito no exemplo 2, respectivamente, e elas foram comparadas com aquelas de H0L0 (cadeia H, H015 SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, LO-SEQ ID NO:56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 10, e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na Figura 21. Ambas a afinidade e a atividade biológica foram constatadas ser melhoradas comparado com aquelas de HOLO (cadeia H, HO-SKSC/SEQ ID NO:54; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56).
100
Tabela 10__________________________________________________ ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 2.9E+05 9.1E-04 3.2E-09
Ha401La402 5.8E+05 2.9E-04 5.0E-10
Além disso, H17L11 (cadeia H, H17-M58/SEQ ID NO:222; cadeia L, L11/SEQ ID NO:236) foi avaliado quanto à sua afinidade com NR10 e sua atividade biológica através do método descrito no exemplo 7 e o método usando BaF/NR10 conforme descrito no exemplo 2, respectivamente, e eles foram comparados com aqueles de HOLO (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO:56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na tabela 11, e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na Figura 22. Ambas a afinidade e atividade biológica foram verificadas ser melhoradas comparado com aquelas de HOLO (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L0/SEQ ID NO:56).
Tabela 11 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 1.4E+05 6.9E-04 4.8E-09
H17L11 4.3E+05 2.6E-04 6.2E-10
Exemplo 11 - Identificação de sítios de mutação reduzindo risco de imunoqenicidade
Redução de risco de imunoqenicidade em CDR1 de cadeia H
Epitopos de célula T presentes na sequência de região variável de HOLO foram analisados usando TEPITOPE (Methods 2004; 34(4):46875). Como resultado, CDR1 da cadeia H foi prevista ter muitos epitopos de célula T que ligam-se a HLA (isto é, têm sequências com um risco de imunogenicidade alto). Então, análise TEPITOPE foi realizada para examinar substituições que reduziríam o risco de imunogenicidade da CDR1 da cadeia H. Como resultado, o risco de imunogenicidade foi constatado ser muito reduzido substituindo isoleucina na posição 33 em numeração kabat com alanina (A) (Tabela 12). Então, esta alteração foi adicionada a H17 gerado no Exemplo 10 para produzir H19 (H19-M58/SEQ ID NO:223). Ο H19 gerado foi combinado com L12 para produzir H19L12 (cadeia H, H19-M58/SEQ ID
101
NO:223; cadeia L, L12/SEQ ID NO:237). Cada variante foi produzida e purificada através do método descrito no exemplo 4.
O anticorpo foi avaliado quanto à afinidade para NR10 e a atividade biológica através do método descrito no exemplo de referência 10 e o método usando BaF/NR10 conforme descrito no exemplo 2, respectivamente, e eles foram comparados com aqueles de H0L0 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na tabela 13, e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na Figura 23. Ambas a afinidade e a atividade biológica foram mostradas ser quase iguais àquelas de HOLO.
Tabela 12
Nome Tipo Sítio de mutação Sequência Sequência H0 (No kabat) Ho Aminoádido após mutação Sequência após mutação
H19 CDR1 GYIMN 33 I (SEQ ID NO: 270) A GYAMN (SEQ ID NO: 284)
Tabela 13 _____________________________________________ ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 1.8E+05 8.7E-04 4.8E-09
H19L12 2.3E+05 1.2E-03 5.1E-09
Redução de risco de imunogenicidade em CDR1 de cadeia L
Treonina (T) presente na posição 25 da numeração kabat em CDR1 da cadeia L corresponde à alanina (A) ou serina (S) na sequência de linha germinativa. Então, é previsto que o risco de imunogenicidade seja reduzido substituindo treonina (T) na posição 25 com alanina (A) ou serina (S) (Tabela 14). Dessa maneira, a substituição acima foi adicionada a L12 para produzir L17 (SEQ ID NO:238). O L17 produzido foi combinado com HO para produzir H0L17 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO:136; cadeia L, L17/SEQ ID NO:238). Cada variante foi produzida e purificada através do método descrito no exemplo 4.
Cada variante foi avaliada quanto à afinidade com NR10 e a atividade biológica através do método descrito no exemplo de referência 10 e o método usando BaF/NR10 conforme descrito no exemplo 2, respectivamente, e eles foram comparados com aqueles de HOLO (cadeia H, H0-M58/SEQ
102
ID NO:136; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56) e H0L12 (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, L12/SEQ ID NO:237). Uma vez que L12 contém uma sequência que melhora a afinidade, ele exibe afinidade cerca de duas vezes maior do que HOLO. O resultado de medição de afinidade é mostrado na Tabela 15, e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada na Figura 24. Ambas a afinidade e a atividade biológica foram mostradas ser quase iguais àquelas de H0L12.
Tabela 14
Nome Tipo Sequência lo Sítio de mutação (N° kabat) Sequência L0 Aminoádido após mutação Sequência após mutação
Ld-1 CDR1 RTSENIYSFLA 25 T A RASENIYSFLA
(SEQ ID NO:277) (SEQ ID NO: 285)
Ld-2 CDR1 RTSENIYSFLA 25 T S RSSENIYSFLA
(SEQ ID NO: 277) (SEQ ID NO: 286)
OR
Tabela 15
ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 1.6E+05 7.8E-04 4.8E-09
H0L12 3.8E+05 7.4E-04 2.0E-09
H0L17 3.9E+05 8.1E-04 2.1E-09
Exemplo 12 - Preparação de anticorpo NS22 completamente humanizado
Regiões variáveis de variantes de NS22 foram preparadas combinando as mutações múltiplas que reduzem o pl, aumentam a afinidade, suprimem a degradação de cadeia H e reduzem o risco de imunogenicidade, todas encontradas nos exemplos acima, em HO (H0-M58/SEQ ID NO: 136), H1 (H1-M58/SEQ ID NO:257) ou L0 (LO/SEQ ID NO:56) e submetidas a vários procedimentos de avaliação. Como resultado, H28L17 (cadeia Η, H28M58/SEQ ID NO: 224; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H30L17 (cadeia H, H30-M58/SEQ ID NO: 225; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H34L17 (cadeia H, H34-M58/SEQ ID NO: 226, cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H42L17 (cadeia H, H42-M58/SEQ ID NO: 227; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H44L17 (cadeia H, H44-M58/SEQ ID NO: 228; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H46L17 (cadeia H, H46-M58/SEQ ID NO: 229; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H57L17 (cadeia H, H57-M58/SEQ ID NO: 230; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H71L17 (cadeia H, H71-M58/SEQ ID NO: 231; cadeia L, L17/SEQ
103
ID NO: 238), H78L17 (cadeia H, H78-M58/SEQ ID NO: 232; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H92L17 (cadeia H, H92-M58/SEQ ID NO: 233; cadeia L, L17/SEQ ID NO: 238), H97L50 (cadeia H, H97-M58/SEQ ID NO: 234; cadeia L, L50/SEQ ID NO: 239)e H98L50 (cadeia H, H98-M58/SEQ ID NO:
235; cadeia L, L50/SEQ ID NO: 239) encontradas. Cada variante foi produzida e purificada através do método descrito no exemplo 4.
Cada variante foi avaliada quanto à afinidade com NR10 e a atividade biológica através do método descrito no exemplo de referência 10 e o método usando BaF/NR10 conforme descrito no exemplo 2, respectivamen10 te, e elas foram comparadas com aquelas de HOLO (cadeia H, H0-M58/SEQ ID NO: 136; cadeia L, LO/SEQ ID NO:56). O resultado de medição de afinidade é mostrado na tabela 16 e a atividade biológica determinada usando BaF/NR10 é mostrada nas Figuras 25-1 e 25-2. Ambas a afinidade e a atividade biológica de cada anticorpo foram mostradas ser quase iguais a ou 15 maiores do que aqueles de HOLO.
Tabela 16
Amostra ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HOLO 2.1E+05 8.8E-04 4.2E-09
H28L17 6.4E+05 3.3E-04 5.2E-10
H30L17 6.8E+05 5.7E-04 8.3E-10
H34L17 3.4E+05 1.2E-03 3.6E-09
H42L17 5.7E+05 3.7E-04 6.5E-10
H44L17 6.1E+05 7.2E-04 1.2E-09
H46L17 2.9E+05 1.3E-03 4.6E-09
H57L17 7.1E+05 5.5E-04 7.7E-10
H71L17 3.7E+05 1.2E-03 3.3E-09
H78L17 6.1E+05 7.0E-04 1.1E-09
H92L17 3.1E+05 1.3E-03 4.1E-09
H97L50 3.6E+05 1.3E-03 3.5E-09
H98L50 2.9E+05 1.3E-03 4.6E-09
104
Exemplo 13 - Análise do domínio de ligação de anticorpo de neutralização anti-NR10 (1) preparação de antígenos do tipo selvagem e guiméricos humanos/camundongo
Os genes codificando domínios extracelulares do tipo selvagem humanos e do tipo selvagem e domínios quiméricos extracelulares de NR10 (hhh (SEQ ID NO: 258), mmm (SEQ ID NO: 259), hhm (SEQ ID NO: 260), mmh (SEQ ID NO: 261), hmm (SEQ ID NO: 262), mhm (SEQ ID NO: 263)e mhh (SEQ ID NO: 264)), foram fundidos a tag His e tag Myc (HHHHHHEQKLISEEDL/SEQ ID NO: 287) em seus terminais C, inseridos em um vetor de expressão animal e transientemente expressos usando FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen®). Diagramas esquemáticos para NR10-ECDs do tipo selvagem e quiméricos humanos/camundongo são mostrados na Figura 26.
Os antígenos do tipo selvagem e quiméricos humanos/camundongo (hhh, mmm, hhm, mmh, hmm, mhme mhh) foram purificados de sobrenadantes de cultura através de cromatografia de coluna Superflow Ni-NTA. Especificamente, 1 ml de Superflow Ni-NTA (QIAGEN) foi carregado em Poly-Prep Empty Column (BioRad) e 30 ml de cada sobrenadante de cultura foram adicionados a ele. Após lavagem com D-PBS (solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco) contendo cloreto de sódio a 150 mM e imidazol a 20 mM, a coluna foi eluída com D-PBS contendo cloreto de sódio a 150 mM e imidazol a 250 mM. As frações eluídas foram trocadas de tampão com D-PBS e concentradas usando Amicon-Ultra (Millipore) com um corte de peso molecular de 10K.
(2) Detecção de antígeno de ligação através de Western blotting
Cada um dos antígenos do tipo selvagem e quimérico humano/camundongo preparados sofreu eletroforação a 0,5 pg/faixa em três géis de poliacrilamida a 4 a 20% (Daiichi Pure Chemical Co.). As proteínas foram eletrotransferidas para membranas PVDF (Millipore) em um aparelho de blotting semisseco, e as membranas foram bloqueadas com TBS contendo leite desnatado a 5%. Uma membrana foi incubada com 5 pg/ml de
105
H44M58L17 (sistema de detecção para anticorpo NR10 anti-humano humanizado); outra com 5 pg/ml de ND41 (sistema de detecção para anticorpo anti-NR10 anti-humano de camundongo); e a outra com anticorpo anti-Myc (Santa Cruz, N° Cat. sc-789) 500 vezes diluído com TBS contendo leite desnatado a 5% (sistema de detecção para tag de Myc) em temperatura ambiente por uma hora.
Após lavagem três vezes com TBS contendo Tween® 20 a 0,05%, os anticorpos secundários foram incubados com as membranas. IgGy anti-humano de cabra marcado com fosfatase alcalina (BIOSOURCE, N° Cat. AHI0305) foi usado para detectar anticorpo NR10 anti-humano humanizado; IgG anti-camundongo de cabra marcado com fosfatase alcalina (Santa Cruz, N° Cat. sc-2008) foi usado para detectar anticorpo NR10 antihumano de camundongo; e IgG anticoelho de cabra marcado com fosfatase alcalina (Santa Cruz, N° Cat. sc.2057) foi usado para detectar tag de Myc. A reação foi realizada à temperatura ambiente por uma hora. Após lavagem quatro vezes com TBS contendo Tween® 20 a 0,05% por três minutos, desenvolvimento de cor foi realizado usando substrato de fosfatase BCIP/NBT, 1-Component System (KPL). TBS (solução salina tamponada com Tris) usada aqui foi preparada dissolvendo um pacote de TBS (solução salina tamponada Tris) em pó (TaKaRa) em 1 L de água destilada. O resultado é mostrado na Figura 27.
Quando o anticorpo humanizado ou anticorpo de camundongo foi usado, a ligação foi detectada apenas para hhh, hhm e hmm, que são domínios extracelulares de NR10.
Exemplo de Referência 1 - Isolamento de genes de NR10, OSMR e IL-31 de macaco cinomólogo
Uma vez gue a reatividade cruzada e a atividade de neutralização em macacos cinomólogos foram consideradas importantes para avaliação de segurança em um estágio pré-clínico, os genes de NR10 e OSMR de macaco cinomólogo foram isolados. Iniciadores foram projetados com base em informação publicada de genoma de macacos Rhesus e outros, e os genes de NR10 e OSMR foram amplificados com sucesso através de PCR de
106 cDNA pancreático de macaco cinomólogo. As sequências dos genes de NR10, OSMR e IL-31 de macaco cinomólogo isolados são mostradas nas SEQ ID NOs:65, 69 e 67, respectivamente, e as sequências de aminoácido de NR10, OSMR e IL-31 de macaco cinomólogo são mostradas nas SEQ ID NOs: 66, 70 e 68, respectivamente.
Exemplo de Referência 2 - Estabelecimento de linhagens de célula Ba/F3 expressando NR10 e OSMR
O cDNA de NR10 humana de comprimento integral (SEQ ID NO:75) foi inserido no vetor de expressão pCOS1 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 228, p. 838-45, 1996) e o vetor resultante foi chamado pCosNR10.3. Um cDNA de receptor M da oncostatina (OSMR, N° de acesso GenBank NM003999) foi isolado através de PCR de uma biblioteca de placenta humana, e o vetor de expressão pCosl-hOSMR foi construído da mesma maneira. 10 pg de cada um dos vetores foram simultaneamente introduzidos em linhagem de célula Ba/F3 derivada de célula pro-B dependente de IL-3 de camundongo através de eletroporação (BioRad Gene Pulser, 960 pF, 0,33 kV). Após introdução, IL-31 humana (R&D System) foi adicionada, e as células foram cultivadas para obter uma linhagem de célula (célula hNR10/hOSMR/BaF3) que prolifera de uma maneira dependente de IL-31. Ainda, o gene de IL-31 de macaco cinomólogo (SEQ ID NO:67) foi inserido em um vetor de expressão de célula de mamífero e introduzido em linhagem de célula CHO DG44. O sobrenadante de cultura resultante foi obtido como IL-31 de macaco cinomólogo. Como com hNR10/hQSMR/BaF3, os genes de NR10 e OSMR de macaco cinomólogo de comprimento integral foram inseridos no vetor de expressão pCOS1 e expressos em células Ba/F3, e a linhagem de célula dependente de IL-31 de macaco cinomólogo (célula cynNR10/cynOSMR/BaF3) foi estabelecida usando o sobrenadante de cultura descrito acima.
Exemplo de Referência 3 - Estabelecimento de linhagens de célula CHO expressando NR10
Os genes para NR10 humana sem domínio citoplásmico (SEQ ID NO:73) e NR10 de macaco cinomólogo sem domínio citoplásmico (SEQ
107
ID NO:71) foram, cada um, inseridos em um vetor de expressão de célula de mamífero. Os vetores resultantes foram linearizados com uma enzima de restrição, e então introduzidos em linhagem de célula CHO DG44 através de eletroporação (BioRad Gene Pulser, 25 pF, 1,5 kV). Após seleção de fármaco, células expressando NR10 foram selecionadas e estabelecidas através de análise FCM usando anticorpo de NR10 anti-humano. A sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo de gene de NR10 humana sem domínio citoplásmico (SEQ ID NO:73) é mostrada na SEQ ID NO:74, e a sequência de aminoácido codificada pela sequência de nucleotídeo de gene de NR10 de macaco cinomólogo sem domínio citoplásmico (SEQ ID NO:71) é mostrada na SEQ ID NO:72.
Exemplo de Referência 4 - Preparação de proteína NR10 (domínio extracelular)
O cDNA de NR10 humana foi usado como um molde para amplificar apenas o domínio extracelular através de PCR. A região amplificada foi então fundida a uma sequência de tag FLAG no terminal C e inserida em um vetor de expressão de célula de mamífero. Dez pg do vetor linearizado foram introduzidos em linhagem de célula de ovário de hamster Chinês GD44 através de eletroporação (BioRad Gene Pulserll, 25 pF, 1,5 kV). Uma linhagem de célula mostrando expressão de nível alto foi obtida. O sobrenadante da linhagem de célula cultivada em uma escala grande foi purificado usando coluna de anticorpo anti-FLAG (Sigma) e filtragem em gel para obter NR10 solúvel. A sequência de nucleotídeo de NR10 solúvel é mostrada na SEQ ID NO:77, e a sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO:78. Exemplo de Referência 5 - Preparação de anticorpos de NR10 anti-humanos
Os camundongos foram imunizados com proteína NR10 humana (domínio extracelular) (descrita no exemplo de referência 4), e hibridomas foram preparados através de um método convencional. Os sobrenadantes de cultura desses hibridomas foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando a linhagem de célula dependente de IL-31 humana (célula hNR10/hQSMR/BaF3) descrita no exemplo de referência 2 e então NA633 que tinha uma atividade de neutralização de NR10 foi obtido.
108
Além disso, imunização com DNA foi realizada através de pistola de gene acionada por gás He usando um vetor de expressão de mamífero carregando o gene de NR10 humana de comprimento integral (SEQ ID NO:75) e hibridomas foram preparados através de um método convencional. Os sobrenadantes da cultura desses hibridomas foram avaliados quanto à atividade de neutralização usando a linhagem de célula dependente de IL-31 humana (célula hNR10/hQSMR/BaF3) descrita no exemplo de referência 2, e então ND41 que tem uma atividade de neutralização de NR10 foi obtido. Exemplo de Referência 6 - Preparação de anticorpo quimérico humano
As sequências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia longa e cadeia curta de NA633 são mostradas nas SEQ ID NQs:104 e 108, respectivamente. As sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia longa de NA633 são mostradas nas SEQ ID NOs:105, 106 e 107, respectivamente, enquanto aquelas de CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia curta são mostradas nas SEQ ID NOs:109, 110 e 111, respectivamente. Ainda, um anticorpo quimérico entre essas regiões variáveis de camundongo e região constante humana (cadeia Η; γ1; cadeia L, k) foi produzido através de um método convencional. Exemplo de Referência 7 - Preparação de huPM1-SKSC em que a heterogeneidade de lqG2 do tipo selvagem é reduzida sem perda de estabilidade
Uma vez que o anticorpo NS22 é um anticorpo de neutralização de NR10, sua ligação a receptor Fcy pode ser desfavorável em consideração da imunogenicidade e efeitos adversos. Um método possível para redução da ligação a receptor Fcy é selecionar lgG2 ou lgG4 ao invés de lgG1 como o isotipo da região constante (Ann. Hematol. 1998 junho; 76(6):231-48). Do ponto de vista de receptor Fcy I e retenção em plasma, lgG2 foi considerado mais desejável do que lgG4 (Nat. Biotechnol. dezembro de 2007; 25(12):1369-72). Entretanto, quando um anticorpo é desenvolvido como um agente farmacêutico, propriedades da proteína, particularmente homogeneidade e estabilidade, são altamente importantes. O isotipo lgG2 foi relatado ter heterogeneidade muito alta resultante das ligações de dissulfeto na região de dobradiça (J. Biol. Chem. 2008, 6 de junho; 283(23):16206-15). Não é
109 fácil e seria mais oneroso fabricá-lo como um agente farmacêutico em uma grande escala enquanto mantendo diferença na heterogeneidade de substâncias desejadas/relacionadas entre produtos resultantes do acima. Dessa maneira, quando anticorpos de isotipo lgG2 são desenvolvidos como agentes farmacêuticos, é preferido reduzir a heterogeneidade resultante de ligações de dissulfeto, sem diminuir a estabilidade.
A fim de reduzir a heterogeneidade do lgG2 do tipo selvagem, cisteínas na região de dobradiça e domínio CH1 de lgG2 foram substituídos. Como um resultado de exame de várias variantes, SKSC (SEQ ID NO:62), que é uma região constante obtida através da alteração da cisteína na posição 131 e arginina na posição 133 na numeração EU (Sequences of proteins of immunological interest, Publicação NIH, N° 91-3242) dentro do domínio CH1 de cadeia H da sequência de região constante de lgG2 do tipo selvagem em serina e lisina, respectivamente, e alteração da cisteína na posição de numeração EU 219 na dobradiça superior da cadeia H para serina podería reduzir a heterogeneidade sem diminuir a estabilidade. Entretanto, outros métodos possíveis para diminuição da heterogeneidade são alterar apenas cisteína na posição de numeração EU 219 na dobradiça superior da cadeia H para serina, e alterar apenas cisteína na posição de numeração EU 220 em serina. Então, a região constante SC (SEQ ID NO: 153) onde cisteína na posição de numeração EU 219 em lgG2 foi alterada para serina, e região constante CS (SEQ ID NO: 154) onde cisteína na posição de numeração EU 220 em lgG2 foi alterada para serina, foram produzidas.
huPM1-SC (SEQ ID NO:157), huPM1-CS (SEQ ID NO:158), huPM1-lgG1 (SEQ ID NO:159), huPM1-lgG2 (SEQ ID NO:160) e huPM1SKSC (SEQ ID NO:161), que foram preparados combinando as regiões constantes produzidas como acima, lgG1 (SEQ ID NO:60) e lgG2 (SEQ ID NO: 132) com a região variável do anticorpo receptor anti-IL-6 humanizado (região variável de cadeia H, huPM1-VH/SEQ ID NO: 155; região variável de cadeia L huPM1-VL/SEQ ID NO:156) (Cancer Res. 15 de fevereiro de 1003; 53(4):851-6), foram usados como uma cadeia H, e huPM1-L (SEQ ID NO: 162) foi usado como uma cadeia L, para produzir cada anticorpo. Cada
110 anticorpo foi expresso e purificado através do método descrito no Exemplo 4.
Os anticorpos foram comparados uns com os outros em termos da heterogeneidade. A heterogeneidade de huPM1-lgG1, huPM1-lgG2, huPM1-SC, huPM1-CS e huPM1-SKSC foi avaliada através de cromatografia de troca de cátion. A cromatografia foi realizada usando uma coluna ProPac WCX-10 (Dionex), acetato de sódio a 20 mM (pH 5,0) como fase móvel A e acetato de sódio a 20 mM/NaCI a 1M (pH 5,0) como fase móvel B, com taxa de fluxo e gradiente apropriados. O resultado de avaliação através de cromatografia de troca de cátion é mostrado na Figura 12.
Conforme mostrado na Figura 12, conversão da região constante de lgG1 em lgG2 aumentou a heterogeneidade. Em contraste, a heterogeneidade foi acentuadamente reduzida convertendo a região constante em SKSC. Embora a região constante SC tenha resultado em redução considerável da heterogeneidade como em SKSC, regiões constantes CS não melhoraram suficientemente a heterogeneidade.
Quando um anticorpo é desenvolvido como um agente farmacêutico, é geralmente desejado que o anticorpo tenha estabilidade alta em adição à baixa heterogeneidade para a produção de preparações estáveis. Então, para avaliar a estabilidade, a temperatura de ponto médio de desnaturação térmica (valor Tm) foi determinada através de calorimetria de varredura diferencial (DSC) (VP-DSC; Microcal). A temperatura de ponto médio de desnaturação térmica (valor Tm) serve como um indicador de estabilidade. A fim de preparar preparações estáveis como agentes farmacêuticos, uma temperatura de ponto médio de desnaturação térmica maior (valor Tm) é preferido (J. Pharm. Sei., abril de 2008; 97(4):1414-26). Então, huPM1lgG1, huPM1-lgG2, huPM1-SC, huPM1-CS e huPM1-SKSC foram dializados contra uma solução de acetato de sódio a 20 mM/NaCI a 150 mM (pH 6,0) (EasySEP; TOMY) e medição de DSC foi realizada usando cerca de 0,1 mg/ml de proteína em uma taxa de aquecimento de 1°C/min entre 40 e 100°C. As curvas de desnaturação obtidas através de DSC são mostradas na Figura 13. Os valores Tm dos domínios Fab são listados na Tabela 17 abaixo.
111
Tabela 17
Nome Tm/°C
huPMl-IgGl 94.8
huPMl-IgG2 93.9
huPMl-SC 86. 7
huPMl-CS 86.4
huPMl-SKSC 93.7
Os valores de Tm de huPM1-lgG1 e huPM1-lgG2 eram quase os mesmos, a saber, cerca de 94°C (lgG2 era menor de cerca de 1°C). Entretanto, valores Tm de huPM1-SC e huPM1-CS eram de cerca de 86°C, que era significantemente menor do que aqueles de huPM1-lgG1 e huPM1-lgG2. Por outro lado, o valor Tm de huPM1-SKSC era de cerca de 94°C e quase o mesmo que huPM1-lgG1 e huPM1-lgG2. Uma vez que a estabilidade de huPM1-SC e huPM1-CS era notavelmente menor do que aquele de lgG2, huPM1-SKSC onde cisteína no domínio CH1 foi também alterada para serina pode ser mais preferida no desenvolvimento de agentes farmacêuticos. A diminuição significante em valor Tm de huPM1-SC e huPM1-CS comparado com lgG2 pode ser devido ao padrão de ligação de dissulfeto huPM1-SC e huPM1-CS que é diferente daquele de lgG2.
Além disso, comparação das curvas de desnaturação de DSC mostrou que o pico de desnaturação para o domínio Fab era afinado em huPM1-lgG1 e huPM1-SKSC, enquanto ele era mais amplo em huPM1-SC e huPM1-CS do que os dois acima, e huPM1-lgG2 deu um pico com ressalto no lado de temperatura menor do pico de desnaturação do domínio Fab. O pico de desnaturação em DSC geralmente fica afinado no caso de um componente único, mas pode alargar quando dois ou mais componentes com valores Tm diferentes (a saber, heterogeneidade) estão presentes. Então, foi sugerido que huPM1-lgG2, huPM1-SC e huPM1-CS continham dois ou mais componentes, e a heterogeneidade de igG2 natural não íoi reduzida em huPM1-SC e huPM1-CS. Esta constatação sugere que cisteínas presentes
112 em ambos a região de dobradiça e o domínio CH1 estão envolvidos na heterogeneidade de lgG2 natural, e é necessário alterar não apenas cisteína na região de dobradiça, mas também aquela no domínio CH1 para diminuir a heterogeneidade em DSC. Ainda, conforme acima descrito, é apenas possível atingir estabilidade equivalente àquela de lgG2 natural alterando não apenas cisteína na região de dobradiça, mas também aquela no domínio CH1.
Conforme acima descrito, como para as regiões constantes onde a heterogeneidade resultante da região de dobradiça de lgG2 foi reduzida, foi constatado que SC e SC, que são regiões constantes onde apenas cisteína na região de dobradiça foi substituída com serina, podem ser insuficientes do ponto de vista de heterogeneidade e estabilidade, e que é apenas possível reduzir significantemente a heterogeneidade enquanto mantendo a estabilidade comparável com lgG2 substituindo adicionalmente cisteína na posição 131 de numeração EU no domínio CH1 com serina. Tais regiões constantes incluem SKSC.
Exemplo de Referência 8 - Produção e avaliação de região constante de ligação a receptor não-Fcy M14, otimizada
No domínio de ligação ao receptor Fcy da região constante de lgG2, os resíduos nas posições 233, 234, 235 e 236 da numeração EU são do tipo não-ligação, enquanto os resíduos nas posições 327, 330 e 331 de numeração EU são diferentes daqueles de lgG4, que são do tipo nãoligação. Então, é necessário alterar os aminoácidos nas posições 327, 330 e 331 de numeração EU para a sequência de lgG4 (G2Aa em Eur. J. Immunol. agosto de 1999; 29(8):2613-24). No entanto, uma vez que o aminoácido na posição 339 de numeração EU é alanina em lgG4 enquanto ele é treonina em lgG2, pequena alteração nos aminoácidos nas posições 327, 330 e 331 de numeração EU para a sequência lgG4 vai gerar uma nova sequência de peptídeo de 9 aminoácidos de ocorrência não-natural que podería ser um peptídeo de epitopo de célula T, dessa maneira causando um risco de imunogenicidade. Então, foi constatado que a ocorrência da sequência de peptídeo nova podería ser prevenida alterando treonina na posição 339 de nu
113 meração EU em lgG2 para alanina, em adição às alterações descritas acima. Em adição às mutações descritas acima, metionina na posição 397 de numeração EU foi mutada em valina para melhorar a estabilidade de lgG2 sob condição ácida. Ainda, em SKSC (SEQ ID NO:62) produzido no exemplo de referência 7, onde a heterogeneidade resultante das ligações de dissulfeto na região de dobradiça foi aperfeiçoada, introdução de mutações nas posições 131 e 133 vai gerar uma nova sequência de peptídeo de 9 aminoácidos de ocorrência não-natural que podería ser um peptídeo de epitopo de célula T, dessa maneira causando um risco de imunogenicidade. Então, a sequência de peptídeo em torno das posições 131 a 139 foi convertida para o mesmo que lgG2 através de mutação de ácido glutâmico na posição 137 de numeração EU em glicina e mutação de serina na posição 138 de numeração EU em glicina. A sequência de região constante M14 (SEQ ID NO: 129) foi produzida introduzindo todas as mutações acima.
A expressão e a purificação de huPM1-M14, preparado usando huPM1-M14 como uma cadeia H e huPM1-L (SEQ ID NO:162) como uma cadeia L, foram realizadas através do método descrito no exemplo de referência 7. Os huPM1-M14 (SEQ ID NO:163), huPM1-lgG1 e huPM1-lgG2 foram avaliados quanto à heterogeneidade usando cromatografia de troca de cátion através do método descrito no exemplo de referência 7.
Conforme mostrado na Figura 14, a heterogeneidade foi também reduzida em huPM1-M14 como em huPM1-SKSC.
Exemplo de Referência 9 - Preparação de huPM1-M58 com heteroqeneidade de terminal C de cadeia H reduzida e farmacocinética aperfeiçoada Preparação de molécula de huPM1-M58 huPM1 é um anticorpo de lgG1. Para a heterogeneidade na sequência de terminal C da cadeia H de anticorpo de lgG1, a deleção do resíduo lisina de terminal Cea amidação do grupo amino determinai C devido à deleção dos dois aminoácidos de terminais C, glicina e lisina, foram relatadas (Anal. Biochem. 1 de janeiro de 2007;360(1 ):75-83). Também em huPM1, embora o componente principal seja uma sequência onde lisina de terminal C codificada pela sequência de nucleotídeo tenha sido deletada a
114 través de modificação pós-traducional, há também um componente em menor quantidade onde a lisina permanece e um componente em menor quantidade onde o grupo amino de terminal C é amidado devido à deleção de ambas a glicina e a lisina, que contribui para heterogeneidade. Produção de um agente farmacêutico em grande escala enquanto mantendo a diferença na heterogeneidade de substâncias desejadas/relacionadas entre produtos não é fácil, mas resulta bastante em aumento de custo, e é então desejado que a substância seja composta de uma única substância o máximo possível. Quando um anticorpo é desenvolvido como um agente farmacêutico, redução da heterogeneidade é desejada. Então, é desejado que o terminal C da cadeia H não tenha nenhuma heterogeneidade quando desenvolvido como agentes farmacêuticos. É também desejável prolongar a meia-vida no plasma do anticorpo a fim de reduzir a dose de anticorpo.
Então, as alterações descritas abaixo foram introduzidas para preparar uma região constante nova onde a heterogeneidade no terminal C da cadeia H foi reduzida, a farmacocinética foi aperfeiçoada comparada com huPM1-lgG1 e a heterogeneidade derivada de lgG2 do tipo selvagem foi também reduzida sem perda de estabilidade.
Especificamente, em huPM1-SKSC, que tem alta estabilidade e onde a heterogeneidade acima mencionada relacionada a anticorpos com regiões constantes do isotipo lgG2 é reduzida, ácido glutâmico na posição 137 da numeração EU foi substituído com glicina; serina na posição 138 com glicina; histidina na posição 268 com glutamina; arginina na posição 355 com glutamina; e glutamina na posição 419 com ácido glutâmico. Em adição às substituições acima, glicina e lisina nas posições 446 e 447 foram deletadas para reduzir a heterogeneidade do terminal C da cadeia H, dessa maneira obtendo huPM1-M58 (SEQ ID NO:164). huPM1-M58 preparado usando huPM1-M58 como uma cadeia H e huPM1-L (SEQ ID NO:162) como uma cadeia L foi expresso e purificado através do método descrito no exemplo 4.
Os huPM1-M58, huPM1-lgG1 e huPM1-lgG2 foram avaliados quanto à heterogeneidade e estabilidade através dos métodos descritos no exemplo 5 usando cromatografia de troca de cátion e DSC, respectivamente.
115
O resultado de DSC é mostrado na tabela 18. Conforme mostrado nas figuras 13 e 16, huPM1-M58 foi constatado reduzir a heterogeneidade sem perda de estabilidade como em huPM1-SKSC.
Tabela 18 ______________________
Nome Tm/t
huPMl-IgGl 94.8
huPMl-IgG2 93.9
huPMl-SKSC 93.7
huPMl-M58 93.7
Avaliação de huPM1-M58 quanto à retenção no plasma
A retenção prolongada (eliminação lenta) de molécula de IgG em plasma é devido à função de FcRn, que é conhecido como um receptor de salvação de molécula de IgG (Nat. Rev. Immunol, setembro de 2007;7(9): 715-25). Quando incorporado a endossomas através de pinocitose, moléculas de IgG ligam-se a FcRn expresso em endossomas sob as condições ácidas dentro do endossoma (aproximadamente pH 6,0). Enquanto moléculas IgG que não são ligadas a FcRn são transferidas para e degradadas em lisossomas, aquelas ligadas a FcRN são translocadas para a superfície celular e então liberadas de FcRn no plasma novamente sob as condições neutras em plasma (aproximadamente pH 7,4).
Anticorpos tipo IgG são conhecidos incluir isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. As meias-vidas no plasma desses isotipos em seres humanos são relatadas ser de cerca de 36 dias para lgG1 e lgG2; de cerca de 29 dias para lgG3; e 16 dias para lgG4 (Nat. Biotechnol. Dezembro 2007;25(12): 1369-72). Então, a retenção de lgG1 e lgG2 em plasma é acreditada ser a mais longa. Em geral, os isotipos de anticorpos usados como agentes farmacêuticos são lgG1, lgG2 e lgG4. Métodos relatados para aperfeiçoamento da farmacocinética desses anticorpos IgG incluem métodos para aperfeiçoamento ria atividade de linacãn acima descrita nara FcRn humano através
--- — Γ --------- I — · -......— - - — da alteração da sequência de região constante de IgG (J. Biol. Chem. Janei
116 ro de 2007;282(3): 1709-17; J. Immunol. 1 de janeiro de 2006; 176(1 ):34656).
Há diferenças entre espécie entre FcRn de camundongo e FcRn humano (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 5 de dezembro de 2006; 103(49): 1870914). Dessa maneira, para prever a retenção de anticorpos IgG tendo uma sequência de região constante alterada em plasma humano, pode ser desejável avaliar a ligação a FcRn humano e a retenção no plasma em camundongos transgênicos FcRn humano (Jnt. Immunol, dezembro de 2006; 18(12): 1759-69).
Avaliação da ligação a FcRn humano
FcRn é um complexo de FcRn e 32-microglobulina. Iniciadores de oligo-DNA foram preparados com base na sequência de gene de FcRn humano publicada (J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381). Um fragmento de DNA codificando o gene inteiro foi preparado através de PCR usando cDNA humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como um molde e os iniciadores preparados. Usando o fragmento de DNA obtido como um molde, um fragmento de DNA codificando o domínio extracelular contendo a região de sinal (Met10-Leu290) foi amplificado através de PCR e inserido em um vetor de expressão de célula animal (a sequência de aminoácido de FcRn humano/SEQ ID NO: 165). Da mesma maneira, iniciadores de oligo-DNA foram preparados com base na sequência do gene de β2microglobulina humano publicada (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)). Um fragmento de DNA codificando o gene inteiro foi preparado através de PCR usando cDNA humano (Hu-Placenta MarathonReady cDNA, CLONTECH) como um molde e os iniciadores preparados. Usando o fragmento de DNA obtido como um molde, um fragmento de DNA codificando a β2-microglobulina inteira contendo a região de sinal (Met1Met119) foi amplificado através de PCR e inserido em um vetor de expressão de célula animal (a sequência de aminoácido de 02-microglobulina humana/SEQ ID NO: 166).
FcRn humano solúvel foi expresso através do procedimento que segue. Os plasmídeos preparados para FcRn humano e β2-Γηΐοπ^ΙοΡυϋη3
117 foram introduzidos na linhagem de célula derivada de câncer de rim embriônico HEK293H (Invitrogen) usando soro fetal de bezerro a 10% (Invitrogen) através de lipofecção. O sobrenadante de cultura resultante foi coletado e purificado usando IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Bioscience) através do método descrito em J. Immunol. 1 de novembro de 2002; 169(9):5171-80. Então purificação adicional foi realizada usando HiTrap Q HP (GE Healthcare).
A ligação a FcRn humano foi avaliada usando Biacore 3000. Um anticorpo foi ligado a proteína L ou anticorpo de cadeia kappa de IgG antihumano de coelho em um sensor chip, FcRn humano foi adicionado como um analito para interação com o anticorpo, e a afinidade (KD) foi calculada a partir da quantidade de FcRn humano ligado. Especificamente, a proteína L foi imobilizada no sensor chip CM5 (BIACORE) através do método de acoplamento de amina usando tampão de fosfato de Na a 50 mM (pH 6,0) contendo NaCI a 150 mM como o tampão de atividade. Então, um anticorpo foi diluído com o tampão de atividade contendo Tween-20 0,02% e injetado e deixado ligar-se ao chip. FcRn humano foi então injetado para avaliar a atividade de ligação do anticorpo ao FcRn humano.
A afinidade foi calculada usando software BIAevaluation. O sensorgrama obtido foi usado para calcular a quantidade de hFcRn ligado ao anticorpo imediatamente antes do final da injeção de FcRn humano. Isto foi ajustado pelo método de afinidade de estado uniforme para calcular a afinidade de FcRn humano com o anticorpo.
Avaliação previsiva de retenção no plasma de huPM1-lqG1 e huPM1-M58 em ser humano usando FcRn humano
As atividades de ligação de huPM1-lgG1 e huPM1-M58 a FcRn humano foram avaliadas usando BIAcore. Conforme mostrado na Tabela 19, a atividade de ligação de huPM1-M58 foi maior do que aquela de huPM1lgG1 em cerca de 1,4 vez.
118
Tabela 19 _____________________KD(zzM) huPMl-IgGl 1.62 huPMl~M58 1. 17
Avaliação da retenção no plasma em camundonqos transqênicos com FcRn humano
A farmacocinética em camundongos transgênicos FcRn (276 +/+ camundongos linhagem Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn; Jackson Laboratories) foi avaliada através do procedimento a seguir. Um anticorpo foi intravenosamente administrado uma vez em uma dose de 1 mg/kg a camundongos, e sangue foi coletado em pontos de tempo apropriados. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 15.000 rpm por 15 minutos a 4°C para obter plasma. O plasma separado foi armazenado em um freezer a -20°C ou menos até o uso. A concentração no plasma foi determinada através de ELISA. Avaliação previsiva da retenção no plasma de huPM1-lqG1 e huPM1-M58 em ser humano usando camundonqos transqênicos com FcRn humano
A retenção no plasma de huPM1-lgG1 e huPM1-M58 em camundongos transgênicos FcRn humano foi avaliada. Conforme mostrado na Figura 17, o resultado demonstrou que a farmacocinética de huPM1-M58 foi melhorada comparado com huPM1-lgG1. Foi sugerido que a atividade de ligação a FcRn humano estava relacionada à retenção no plasma em camundongos transgênicos FcRn humano.
Exemplo de Referência 10 - Medição da afinidade em reação antíqenoanticorpo usando Biacore
Análise cinética da reação antígeno-anticorpo foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare Bioscience). A interação antígenoanticorpo foi medida imobilizando rec-Proteína A (daqui em diante Proteína A) (ZYMED) em um sensor chip, capturando um anticorpo na Proteína A imobilizada e então reagindo o antígeno como um analito. Várias concentrações de rhNRIO foram usadas como o antígeno. Os parâmetros cinéticos, constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissocia
119 ção kd (1/s), foram calculados a partir dos sensorgramas obtidos através da medição. Então, KD (M) foi determinada com base nas constantes de taxa. Cada parâmetro foi determinado usando Biacore T100 Evaluation Software versão 1.1 (GE Healthcare Biosciences).
Imobilização de Proteína A em sensor chip
Proteína A foi imobilizada sobre todas as células de fluxo de sensor chip CM5 (GE Healthcare Biosciences) através do método de acoplamento de amina. O experimento foi realizado usando HBS-EP+ (HEPES a 10 mM, NaCl a 0,15M, EDTA a 3 mM, Tensoativo P20 a 0,05% v/v) como um tampão de atividade em uma taxa de fluxo de 10 pL/min. Os grupos carboxila de carboximetil dextrano no sensor chip foram ativados com 100 pL de uma mistura 1:1 de 75 mg/ml de EDC cloridrato de (N-etil-N'-(3dimetilaminopropil)carbodi-imida) e 11,5 mg/ml de NHS (Nhidroxissuccinimida) e Proteína A preparada a 50 pg/ml usando tampão de acetato a 10 mM (pH 4,5) foi deixada fluir para reação. Então, 100 pL de cloridrato de etanolamina a 1M (pH 8,5) foram deixados fluir para inativar os grupos ativos não-reagidos. Por fim, cerca de 4000 a 5000 RU foram imobilizadas. O experimento foi realizado a 25°C todas as vezes.
Medição de afinidade em reação antíqeno-anticorpo entre rhNRIO e anticorpo capturado em Proteína A
O tampão de atividade usado foi HBS-EP+. Cada anticorpo foi preparado a 0,25 pg/ml ou preparado de maneira que cerca de 100 RU se liguem à Proteína A. rhNRIO usado como um analito foi preparado a 0, 38,5, 77,0 e 154 nM ou a 0, 19,25 e 77,01 nM usando HBS-EP+. Na medição, primeiro, a solução de anticorpo foi capturada em Proteína A, e uma solução de analito foi reagida em uma taxa de fluxo de 20 pL/min por três minutos. Então, a solução foi mudada para HBS-EP+, e a fase de dissociação foi medida por cinco minutos. Após medição da fase de dissociação, o sensor chip foi regenerado lavando com glicina a 10 mM-HCI (pH 1,5). Os sensorgramas obtidos foram cineticamente analisados usando o software de análise de dados específico da Biacore, Biacore T100 Evaluation Software versão 1.1. Aplicabilidade Industrial
120
Os anticorpos anti-NR10 obtidos pelos presentes inventores exibem uma atividade de neutralização eficaz contra NR10 e são úteis como, por exemplo, agentes terapêuticos para doenças inflamatórias.

Claims (7)

    REIVINDICAÇÕES
  1. (1) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 228 (H44) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H44L17);
    (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 210 (H44) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H44L17);
    (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO: 197, e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H30, H44) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
    1. Anticorpo anti-NR10, caracterizado pelo fato de que é qualquer um dentre:
  2. (2) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 225 (H30) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H30L17);
    (2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 207 (H30) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H30L17);
    2. Anticorpo anti-NR10 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é qualquer um dentre:
    (2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 196, CDR2 de SEQ ID NO: 197, e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H28, H42) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
  3. (3) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compre
    Petição 870190098904, de 03/10/2019, pág. 10/18 endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 227 (H42) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H42L17);
    3. Anticorpo anti-NR10 de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humanizado.
    (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 209 (H42) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H42L17);
    (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO:
    197, CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H34, H46) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
  4. (4) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 224 (H28) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H28L17);
    4. Anticorpo anti-NR10 de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é qualquer um dentre:
    (4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 206 (H28) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H28L17);
    (4) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO:
    198, e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H57, H78) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17);
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-NR10 como definido em qualquer uma das rei-
    10 vindicações 1 a 4.
    5 endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 234 (H97) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 239 (L50) (H97L50).
    (5) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 229 (H46) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H46L17);
    (5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 211 (H46) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H46L17);
    (5) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 176, CDR2 de SEQ ID NO:
    198, e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H71, H92) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 202, CDR2 de SEQ ID NO: 170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L17); e (6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 9, CDR2 de SEQ ID NO:
    199, e CDR3 de SEQ ID NO: 184 (H97, H98) e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1 de SEQ ID NO: 203, CDR2 de SEQ ID NO:
    Petição 870190098904, de 03/10/2019, pág. 8/18
    170, e CDR3 de SEQ ID NO: 193 (L50).
  6. 6. Anticorpo anti-NR10 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença inflamatória.
    (6) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 226 (H34) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H34L17);
    (7) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 232 (H78) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H78L17);
    (8) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 230 (H57) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H57L17);
    (9) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 233 (H92) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H92L17);
    (10) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 231 (H71) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 238 (L17) (H71L17);
    (11) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compre
    Petição 870190098904, de 03/10/2019, pág. 11/18 endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 235 (H98) e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 239 (L50) (H98L50); e (12) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compre-
    (6) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 208 (H34) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H34L17);
    (7) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 214 (H78) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H78L17);
    (8) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia
    Petição 870190098904, de 03/10/2019, pág. 9/18 pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 212 (H57) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H57L17);
    (9) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 215 (H92) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H92L17);
    (10) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 213 (H71) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 220 (L17) (H71L17);
    (11) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 217 (H98) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50) (H98L50); e (12) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 216 (H97) e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 221 (L50) (H97L50).
  7. 7. Uso do anticorpo anti-NR10 como definido em qualquer uma 15 das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença inflamatória.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101479381B (zh) 2006-03-31 2015-04-29 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
CN101500608A (zh) 2006-06-08 2009-08-05 中外制药株式会社 炎性疾病的预防或治疗药
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
TWI563002B (en) 2007-09-26 2016-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region mutant
EP3674317A1 (en) 2009-03-19 2020-07-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
SG11201404354UA (en) * 2012-02-17 2014-10-30 Seattle Genetics Inc ANTIBODIES TO INTEGRIN αVβ6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER
WO2014208645A1 (ja) * 2013-06-28 2014-12-31 中外製薬株式会社 そう痒を伴う疾患に罹患した患者のｉｌ－３１アンタゴニストによる治療に対する応答を予測する方法
US10544227B2 (en) 2015-04-14 2020-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
KR20240033097A (ko) 2015-04-14 2024-03-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-31 안타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는 아토피성 피부염의 예방용 및/또는 치료용 의약 조성물
CA3004288A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Nobuyuki Tanaka Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
PL234632B1 (pl) 2016-03-02 2020-03-31 Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk Przeciwciała oddziałujące z komórkami psich chłoniaków typu B i ich zastosowania
JP2021512917A (ja) 2018-02-09 2021-05-20 ガルデルマ ホールディング エスエー 中等度から重度の掻破痕を有するアトピー性皮膚炎の治療におけるネモリズマブ
WO2019225568A1 (ja) 2018-05-21 2019-11-28 中外製薬株式会社 ガラス容器に封入された凍結乾燥製剤
US11236157B2 (en) 2019-01-28 2022-02-01 Galderma Holding SA Treatment of skin lesions and pruritus in prurigo nodularis patients
KR102655024B1 (ko) 2019-04-02 2024-04-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 특이적인 외래 유전자의 도입 방법
EP4062933A4 (en) 2019-11-20 2023-12-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PHARMACEUTICAL PREPARATION COMPRISING AN ANTIBODY
CN116096411A (zh) * 2020-09-01 2023-05-09 中外制药株式会社 含有作为活性成分的il-31拮抗剂的用于预防和/或治疗透析瘙痒的药物组合物
US20220411518A1 (en) 2021-04-07 2022-12-29 Galderma Holding S.A. Treatments for prurigo nodularis
WO2023031770A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Galderma Holding SA Treatments for atopic dermatitis
US20240141050A1 (en) 2022-09-02 2024-05-02 Galderma Holding S.A. Treatments for prurigo nodularis

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US5156840A (en) 1982-03-09 1992-10-20 Cytogen Corporation Amine-containing porphyrin derivatives
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
EP0656941B1 (en) 1992-03-24 2005-06-01 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
EP0671951A4 (en) * 1992-12-01 1997-05-21 Protein Design Labs Inc HUMANIZED ANTIBODIES REACTING WITH L-SELECTIN.
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
US5876950A (en) * 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
JP3946256B2 (ja) * 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
KR100847441B1 (ko) 1996-09-26 2008-07-21 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
DE60043728D1 (de) 1999-06-02 2010-03-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Neues hämopoietin rezeptorprotein nr10
EP1961811B1 (en) 2002-01-18 2010-08-25 ZymoGenetics, Inc. Cytokine ligand for the treatment of asthma and airway hyper-responsiveness
JP3991280B2 (ja) 2002-06-05 2007-10-17 中外製薬株式会社 抗体作製方法
AU2004223837C1 (en) * 2003-03-24 2012-03-15 Zymogenetics, Inc. Anti-IL-22RA antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
CA2548185A1 (en) 2003-12-03 2005-06-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expression systems using mammalian .beta.-actin promoter
RU2481356C2 (ru) * 2004-12-28 2013-05-10 Иннейт Фарма Моноклональные антитела против nkg2a
EP1858924A1 (en) * 2005-02-14 2007-11-28 ZymoGenetics, Inc. Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist
PE20061323A1 (es) * 2005-04-29 2007-02-09 Rinat Neuroscience Corp Anticuerpos dirigidos contra el peptido amiloide beta y metodos que utilizan los mismos
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
CN101500608A (zh) * 2006-06-08 2009-08-05 中外制药株式会社 炎性疾病的预防或治疗药
ATE494306T1 (de) * 2007-02-14 2011-01-15 Vaccinex Inc Humanisierte anti-cd100-antikörper
PT2059534E (pt) * 2007-02-23 2012-07-17 Schering Corp Anticorpos anti-il-23p19 fabricados por engenharia genética
EP2206775B1 (en) * 2007-09-26 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il-6 receptor antibody
US9096651B2 (en) * 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
TWI563002B (en) * 2007-09-26 2016-12-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region mutant
ES2834741T3 (es) * 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
MY185647A (en) * 2007-12-05 2021-05-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Therapeutic agent for pruritus

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