BRPI0712426A2

BRPI0712426A2 - prevenção ou medicamento para doença inflamatória.

Info

Publication number: BRPI0712426A2
Application number: BRPI0712426-0A
Authority: BR
Inventors: Masakazu Hasegawa; Hidetomo Kitamura; Hideki Adachi; Keiko Kasutani
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2012-07-17
Also published as: UA100116C2; CA2654623C; CL2007001665A1; ES2544888T3; TW200810778A; US9028821B2; SI2047863T1; US20150315280A1; RU2008152827A; JP5043008B2; NO20090093L; AR061317A1; KR20140097495A; EP2371393A1; KR20150091545A; CN103272232A; US9745378B2; AU2007255753B2; PE20080333A1; EP2047863A4

Abstract

PREVENçãO OU MEDICAMENTO PARA DOENçA INFLAMATóRIA. Os presentes inventores obtiveram, a partir de uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos, um clone BM095 que expressa um anticorpo neutralizante anti-NR 10 de camundongo que mostra uma forte atividade supressora da proliferação em um sistema de ensaio de proliferação de célula Ba/F3 dependente de IL-31. Quando este anticorpo neutralizante anti-NR 10 de camundongo foi administrado a camundongos NC/Nga, um modelo de dermatite atópica que é um modelo de camundongo de dermatite crónica que surge como um resultado de aplicações repetidas cloreto de picrila, um modelo de camundongo de artrite reumatóide, e um modelo de camundongo de osteoartrite, um efeito significativo da supressão dos sintomas foi observado. Isso revelou que o anticorpo neutralizante anti-NR 10 é de fato eficaz como um agente terapêutico para doenças inflamatórias. Além disso, os presentes inventores obtiveram com sucesso um anticorpo neutralizante anti-NR 10 de humano, fornecendo agentes terapêuticos extremamente úteis com aplicações clínicas práticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREVENÇÃO OU MEDICAMENTO PARA DOENÇA INFLAMATÓRIA"

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a novos agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, os quais compreendem antagonistas de NR 10 como ingredientes ativos. A presente invenção também se refere a métodos para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, os quais usam antagonistas de NR 10.

Técnica Anterior

Várias citocinas são conhecidas como fatores humorais envolvi- dos no crescimento e na diferenciação de vários tipos de células, ou na ati- vação de funções de células maduras diferenciadas. Células estimuladas por citocinas produzem tipos diferentes de citocinas, formando dessa maneira redes de múltiplas citocinas no corpo. A homeostase biológica é mantida por um balanço delicado da regulação mútua entre citocinas nessas redes. A- credita-se que várias doenças inflamatórias resultem de uma falha de tais redes de citocinas. Assim, a terapia anti-citocina baseada em anticorpo mo- noclonal está atraindo muita atenção. Por exemplo, anticorpos anti-TNF e anticorpos anti-receptor de IL-6 demonstraram ser altamente eficazes clini- camente. Por outro lado, existem vários exemplos de falhas onde nenhum efeito terapêutico foi produzido quando uma citocina única, tal como IL-4, foi bloqueada sozinha, devido à ativação de vias compensatórias em condições patológicas reais.

Os presentes inventores tiveram sucesso no isolamento de um novo receptor de citocina NR 10, que era altamente homólogo a gp130, um receptor para transdução de sinal de IL-6 (Documento de Patente 1). NR 10 forma um heterodímero com o receptor de oncostatina M (OSMR) e funciona como um receptor de IL-31 (Documento Não-Patente 1). Zymogenetics, Inc. relatou que camundongos transgênicos superexpressando IL-31 desenvolve- ram espontaneamente dermatite prurítica (Documento de Patente 2).

Entretanto, não pode ser afirmado que a expressão forçada de uma citocina em camundongos ou que um nível sangüíneo elevado de uma citocina em camundongos de um modelo patológico seja de fato a causa de uma doença. Não há informação se quaisquer efeitos terapêuticos são pro- duzidos quando um sinal é bloqueado por um anticorpo. Por exemplo, a dermatite prurítica se desenvolve em camundongos transgênicos nos quais IL-18 é superexpressa em queratinócitos. Além disso, a concentração san- güínea de IL-18 se eleva com a progressão de condições patológicas em camundongos modelo NC/Nga para dermatite atópica espontânea. Baseado nos achados acima, a superexpressão de IL-18 foi prevista ser a causa da doença. Na realidade, entretanto, a administração de anticorpos neutralizan- tes não produziu efeitos terapêuticos (Documento Não-Patente 2).

Conforme descrito acima, a inibição da função de uma citocina não produz necessariamente efeitos terapêuticos em doenças nas quais o nível de expressão de uma citocina está elevado. A previsão de doenças nas quais os efeitos terapêuticos são de fato produzidos é difícil de fazer basea- do no nível de expressão de uma citocina. Assim, é importante encontrar doenças nas quais a inibição da transdução de sinal de uma citocina alvo realmente produza efeitos terapêuticos.

Documentos da técnica anterior da presente invenção estão descritos abaixo.

Documento de Patente 1: WO 00/75314

Documento de Patente 2: WO 03/060090

Documento Não-Patente 1: IL-31 is associated with cutaneous Iymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis, J Al- lergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25

Documento Não-Patente 2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003.

Descrição da Invenção

[Problemas a serem solucionados pela invenção]

A presente invenção foi realizada considerando-se as circuns- tâncias descritas acima. Um objetivo da presente invenção é fornecer terapi- as anti-citocinas baseadas em antagonista de receptor de citocina para do- enças inflamatórias. Mais especificamente, o objetivo da presente invenção é descobrir doenças inflamatórias nas quais um efeito terapêutico pode ser obtido por anticorpos neutralizantes anti-NR 10 e fornecer novos métodos para tratar tais doenças. Outro objetivo da presente invenção é fornecer an- ticorpos neutralizantes anti-NR 10 humano que são clinicamente aplicáveis a humanos.

[Meios para Solucionar os Problemas]

Os presentes inventores conduziram estudos dedicados a solu- cionar os objetivos acima descritos. A presente invenção tentou avaliar a efi- cácia de fármaco de anticorpos neutralizantes anti-NR 10 de camundongo em modelos de camundongo para várias condições patológicas. Os resulta- dos demonstraram que os anticorpos neutralizantes produziram o efeito de suprimir acentuadamente os sintomas em camundongos modelo de dermati- te atópica usando camundongos NC/Nga e camundongos modelo para der- matite crônica, que foi desenvolvida pela aplicação repetida de cloreto de picrila. Isso provou que anticorpos neutralizantes eram realmente úteis como um agente terapêutico. Além disso, foi demonstrado que os anticorpos pro- duziam o efeito de supressão dos sintomas na artrite por colágeno, um mo- delo para reumatismo, e na artrite por colagenase, um modelo parar osteoar- trite. Estes resultados sugerem que o anticorpo neutralizante anti-NR 10 da presente invenção pode ser usado para prevenir ou tratar inflamação crôni- ca. Os presentes inventores também foram bem sucedidos na obtenção de anticorpos neutralizantes para NR 10 humano. Especificamente, a presente invenção fornece:

[1] um agente para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, em que o agente compreende um antagonista de NR 10 como um ingrediente ativo;

[2] o agente preventivo ou terapêutico de [1], em que o antagonista de NR 10 é um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10;

[3] o agente preventivo ou terapêutico de [2], em que o anticorpo é um anti- corpo monoclonal;

[4] o agente preventivo ou terapêutico de [2], em que o anticorpo é um anti- corpo monoclonal que tem atividade neutralizante de NR 10 humana; [5] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [2] a [4], em que o anticorpo é um anticorpo recombinante;

[6] o agente preventivo ou terapêutico de [5], em que o anticorpo recombi- nante é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano;

[7] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [2] a [6], em que o agente compreende como um ingrediente ativo um fragmento e/ou um frag- mento modificado do anticorpo com atividade neutralizante de NR 10;

[8] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [1] a [7], em que a doença inflamatória é dermatite atópica;

[9] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [1] a [7], em que a doença inflamatória é dermatite crônica;

[10] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [1] a [7], em que a doença inflamatória é reumatismo;

[11] o agente preventivo ou terapêutico de qualquer um de [1] a [7], em que a doença inflamatória é osteoartrite;

[12] um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10;

[13] o anticorpo de [12], que é um anticorpo monoclonal;

[14] o anticorpo de [12], em que NR 10 é NR 10 humana;

[15] o anticorpo de qualquer um de [12] to [14], que é um anticorpo recombi- nante;

[16] o anticorpo de [15], em que o anticorpo recombinante é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano;

[17] um fragmento e/ou um fragmento modificado do anticorpo de qualquer um de [12] a [16]

[18] um método para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, que com- preende a etapa de administrar um antagonista de NR 10 a um paciente com uma doença inflamatória; e

[19] uso de um antagonista de NR 10 para produzir um agente para prevenir ou tratar uma doença inflamatória.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 é um gráfico que mostra um resultado obtido pela ob- servação do efeito de supressão do crescimento celular de BM095 adiciona- do a um sistema de ensaio de crescimento celular usando células Ba/F3 de- pendentes de IL-31. O eixo horizontal indica concentrações estimadas de mlL-31 no sistema de ensaio e o eixo vertical indica as contagens celulares (OD450 (absorbância a 450 nm)). As quantidades adicionadas de BM095 (u- nidade: ng/ml) são mostradas na legenda. Foi observado um efeito de su- pressão do crescimento celular dependente da quantidade adicionada de BM095.

A Fig. 2 é um gráfico que mostra um efeito terapêutico produzido quando anticorpos anti-NR 10 foram administrados a camundongos em um modelo de dermatite atópica. Um efeito supressor de inflamação significativo foi visto no grupo tratado com anticorpo anti-NR 10 quando comparado com o grupo de controle negativo (grupo com veículo).

A Fig. 3 é um gráfico que mostra uma alteração seqüencial no peso corporal após anticorpos anti-NR 10 serem administrados a camun- dongos no modelo de dermatite atópica. A perda de peso foi observada no grupo tratado com um agente anti-inflamatório existente. Em contraste, ne- nhuma alteração de peso foi detectada no grupo tratado com anticorpo anti- NR 10. Assim, o anticorpo anti-NR 10 provou ser seguro.

A Fig. 4 é um gráfico que mostra um efeito terapêutico produzido quando anticorpos anti-NR 10 foram administrados a camundongos do mo- delo de dermatite crônica. Um efeito supressor de edema auricular significa- tivo foi encontrado no grupo tratado com o anticorpo anti-NR 10.

A Fig. 5 é uma fotografia que mostra a coloração imuno- histoquímica do pavilhão auricular de um camundongo do modelo de derma- tite crônica. Como no caso de humanos, a expressão de NR 10 de camun- dongo foi vista estar aumentada na epiderme espessada.

A Fig. 6 é um gráfico que mostra um efeito supressor de artrite produzido quando anticorpos anti-NR 10 foram administrados a camundon- gos em um modelo de artrite induzida por colágeno.

A Fig. 7 é um gráfico que mostra o relacionamento entre a área sob a curva (AUC) e a concentração de BM095 administrado ao modelo de artrite induzida por colagenase (osteoartrite). AUC significa a área sob a cur- va de transição da diferença entre os tamanhos das articulações dos joelhos direito e esquerdo definida como um valor que representa a o inchaço na articulação do joelho direito.

A Fig. 8 é um gráfico que mostra a correlação entre a concentra- ção de anticorpos neutralizantes de NR 10 humano (anticorpo purificado) e a atividade de supressão do crescimento celular na presença de IL-31. Os an- ticorpos 1, 2 e 3 exibiram acentuada atividade neutralizante de NR 10.

A Fig. 9 é um gráfico que mostra a correlação entre a concentra- ção de anticorpo quimérico NA633 contra NR 10 humano e a atividade de supressão do crescimento celular na presença de IL-31. NA633 exibiu acen- tuada atividade neutralizante de NR 10.

A Fig. 10 é um diagrama que compara as seqüências de amino- ácidos de NR 10 humano e NR 10 de um macaco cinomolgo. A seqüência com sublinhado duplo indica a região transmembrana.

A Fig. 11 é um gráfico que mostra a atividade de supressão do crescimento celular do anticorpo quimérico NA633 na linhagem celular OS- MR/BaF humana /NR 10 de macaco cinomolgo estimulada por IL-31 huma- na. NA633 também mostrou atividade neutralizante de NR 10 de macaco cinomolgo.

A Fig. 12 é um gráfico que mostra a transição de alteração per- centual do peso corporal em camundongos do modelo de colite DSS.

A Fig. 13 é um gráfico que mostra a transição de alteração no espessamento do pavilhão auricular no modelo de dermatite de contato agu- da usando cloreto de picrila.

Melhor Modo de Executar a Invenção

A presente invenção refere-se a agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, que compreendem antagonistas de NR 10 como in- gredientes ativos. A presente invenção é baseada na descoberta dos presen- tes inventores de que antagonistas de NR 10 (por exemplo, anticorpos que neutralizam NR 10) suprimem significativamente os sintomas em camun- dongos modelo com dermatite atópica, dermatite crônica, reumatismo, oste- oartrite ou semelhantes.

NR 10 é uma proteína que forma um heterodímero com o recep- tor de oncostatina M (OSMR), e funciona como um receptor de IL-31. NR 10 também é conhecida por outros nomes, tais como glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003), e IL-31 RA (Nat Im- munol 5, 752-60, 2004). A NR 10 da presente invenção inclui proteínas cha- madas por tais nomes. A NR 10 da presente invenção também inclui NR 10 derivada de humanos, camundongos e outros mamíferos. NR 10 preferida inclui NR 10 derivada de humanos e de camundongos, mas não está limita- da a estes. Há muitas variantes de splicing conhecidas de NR 10 derivada de humano (WO 00/075314). Das variantes de splicing descritas acima, NR 10.1 consiste em 662 aminoácidos e compreende um domínio transmem- brana. NR 10.2 é uma proteína semelhante a um receptor solúvel que con- siste em 252 aminoácidos sem o domínio transmembrana. Entretanto, vari- antes de splicing de NR 10 conhecidas que funcionam como proteínas de receptor transmembrana incluem NR 10.3 e IL-31 RAv3. A NR 10 humana da presente invenção não é particularmente limitada, contanto que ela forme um heterodímero com o receptor de oncostatina M (OSMR) e funcione como um receptor de IL-31. NR 10 preferidas incluem NR 10.3 (também referida como ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) e IL-31 RAv3. NR 10.3 (IL- 31 RAv4) consiste em 662 aminoácidos (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004) e IL-31 RAv3 consiste em 732 aminoácidos (Acesso no Gen- Bank No: NM_139017). A seqüência de aminoácido de IL-31 RAv4 é mostra- da em SEQ ID NO: 6, e a seqüência de aminoácido de IL-31 RAv3 é mostra- da em SEQ ID NO: 7. Entretanto, NR 10 derivada de camundongo inclui pro- teínas que compreendem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5.

Os antagonistas de NR 10 da presente invenção referem-se a substâncias que se ligam a NR 10 e bloqueiam a transdução de sinal intra- celular baseada na ativação de NR 10, causando assim perda ou supressão das atividades fisiológicas das células. Neste documento, as atividades fisio- lógicas incluem, por exemplo, atividades de induzir ou suprimir a produção de substâncias fisiologicamente ativas (por exemplo, quimiocinas e citocinas inflamatórias), atividades de aumentar ou suprimir a secreção das substân- cias, atividade de crescimento, atividade indutora de crescimento, atividade de sobrevivência, atividade de diferenciação, atividade indutora de diferenci- ação, atividade transcricional, atividade de transporte pela membrana, ativi- dade de ligação, atividade proteolítica, atividade de fosforila- ção/defosforilação, atividade de redução da oxidação, atividade de transfe- rência, atividade nucleolítica, atividade de desidratação, atividade indutora de morte celular, e atividade indutora de apoptose, mas não são limitadas a isto.

A presença de atividade de antagonista pode ser determinada por métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, os compostos de teste são colocados em contato com NR 10 expresso sobre a superfície das células na presença de um ligante, e é determinado se é a transdução de sinal intracelular, que é um indicador da ativação de NR 10, é ou não gerada. Tal determinação pode ser feita, por exemplo, pelo método descrito no documento "Dillon SR, et al., Interleukin 31, uma citocina produ- zida por células T ativadas, induz dermatite em camundongos. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60". Acredita-se que compostos que inibem a transdução de sinal intracelular em resposta a estimulação do ligante sirvam como anta- gonistas de NR 10.

Os antagonistas da presente invenção podem ser compostos naturais ou artificiais. Compostos conhecidos podem ser usados como os antagonistas da presente invenção. Novos compostos determinados como tendo atividade de antagonista pelos métodos descritos acima também po- dem ser usados.

Em uma modalidade da presente invenção, os antagonistas de NR 10 incluem anticorpos que têm a atividade de neutralizar NR 10. Os "an- ticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10" da presente invenção referem-se a anticorpos que têm a atividade de suprimir atividades fisiológi- cas baseadas em NR 10. Os "anticorpos que atividade neutralizante de NR 10" da presente invenção podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais e, como uma modalidade preferida, inclui anticorpos monoclonais. Tais anticorpos monoclonais que têm atividade neutralizante de NR 10 podem ser obtidos, por exemplo, pelo seguinte procedimento: anti- corpos monoclonais anti-NR 10 são preparados pelo uso de um antígeno de NR 10 ou um fragmento deste que é derivado de um mamífero, tal como um humano ou um camundongo, por métodos conhecidos e, assim, os anticor- pos que têm atividade neutralizante de NR 10 são selecionados a partir dos anticorpos monoclonais anti-NR 10 assim obtidos. Especificamente, a imuni- zação é obtida por métodos de imunização convencionais usando como um antígeno sensibilizante um antígeno desejado ou células que expressam o antígeno desejado. Anticorpos monoclonais anti-NR 10 podem ser prepara- dos pela fusão de células imunes obtidas com células parentais conhecidas usando métodos de fusão celular convencional e examinando-as quanto a células que produzem anticorpos monoclonais (hibridomas) por métodos de rastreamento convencionais. Animais a serem imunizados incluem, por e- xemplo, mamíferos, tais como camundongos, ratos, coelhos, carneiros, ma- cacos, cabras, jumentos, vacas, cavalos e porcos. O antígeno pode ser pre- parado usando a seqüência conhecida do gene de NR 10 de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por métodos que usam baculovírus (por exemplo, WO 98/46777). Conforme descrito nos Exemplos aqui contidos abaixo, anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 podem ser se- lecionados, por exemplo, por testar o efeito de supressão de crescimento de uma linhagem celular dependente de IL-31 após o anticorpo candidato ser adicionado às células da linhagem celular dependente de IL-31. Anticorpos que suprimem o crescimento da linhagem celular dependente de IL-31 no método descrito acima são considerados como tendo atividade neutralizante de NR 10.

Hibridomas podem ser preparados, por exemplo, de acordo com o método de Milstein et al. (Kohler, G. & Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) ou semelhantes. Quando a imunogenicidade de um antíge- no é baixa, a imunização pode ser realizada após a ligação do antígeno com uma macromolécula que tem imunogenicidade, tal como albumina.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 incluem anticorpos monoclonais que têm a atividade de neutralizar NR 10 humana. Não há limitação particu- lar sobre o imunógeno para preparar anticorpos monoclonais com a ativida- de de neutralizar NR 10 humana, desde que ele permita a preparação de anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 humana. Por exemplo, é conhecida a existência de múltiplas variantes de NR 10 humana. Qualquer uma das variantes pode ser usada como imunógeno, desde que ela permita a preparação de anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 huma- no. Alternativamente, um fragmento de peptídeo de NR 10 ou uma seqüên- cia de NR 10 natural introduzida com mutações artificiais pode ser usada como o imunógeno sob as mesmas condições. NR 10.3 humano é um imu- nógeno preferido para preparar anticorpos da presente invenção com ativi- dade neutralizante de NR 10.

Neste documento, os anticorpos da presente invenção descritos acima não são particularmente limitados, contanto que eles tenham atividade neutralizante de NR 10. Os anticorpos também incluem anticorpos recombi- nantes tais como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticor- pos humanos. Os anticorpos quiméricos compreendem, por exemplo, as re- giões constantes da cadeia pesada e leve de um anticorpo humano e as re- giões variáveis da cadeia pesada e leve de um mamífero não humano, tal como um camundongo. Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos por métodos conhecidos. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos pela clonagem de um gene de anticorpo de hibridomas, inserindo-o num vetor apropriado e introduzindo o construto em hospedeiros (veja, por exemplo, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, cDNAs das regiões variáveis do anticorpo (re- giões V) são sintetizados a partir de mRNA de hibridomas usando transcrip- tase reversa. Uma vez que os DNAs que codificam as regiões V de um anti- corpo de interesse são obtidos, esses são ligados com DNAs que codificam as regiões constantes (regiões C) de um anticorpo humano desejado. Os construtos resultantes são inseridos em vetores de expressão. Alternativa- mente, os DNAs que codificam as regiões V do anticorpo podem ser inseri- dos em vetores de expressão que compreendem DNAs que codificam as regiões C de um anticorpo humano. Os DNAs são inseridos em vetores de expressão tal que eles são expressos sob a regulação de regiões regulató- rias de expressão, por exemplo, intensificadores e promotores. Na próxima etapa, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão para permitir a expressão de anticorpos quiméricos.

Um anticorpo humanizado, que também é chamado de anticorpo humano transformado, é obtido pela transferência de uma região de deter- minação de complementaridade (CDR) de um anticorpo de um mamífero não-humano tal como um camundongo, com a CDR de um anticorpo huma- no. Técnicas convencionais de recombinação genética para a preparação de tais anticorpos também são conhecidas. Especificamente, uma seqüência de DNA desenhada para ligar uma CDR de um anticorpo de camundongo com as regiões de arcabouço (FRs) de um anticorpo humano é sintetizada por PCR, usando vários nucleotídeos construídos para compreender porções superpostas em suas terminações. Um anticorpo humanizado pode ser obti- do por (1) ligação do DNA resultante a um DNA que codifica uma região constante de um anticorpo humano; (2) incorporação deste em um vetor de expressão; e (3) transfecção do vetor em um hospedeiro para produzir o an- ticorpo (veja Pedido de Patente Européia No. EP 239.400 e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 96/02576). FRs de anticorpo hu- mano que são ligadas através da CDR são selecionadas onde a CDR forme um sítio de ligação ao antígeno favorável. Conforme necessário, aminoáci- dos da região do arcabouço de uma região variável de anticorpo podem ser substituídos tal que a CDR de um anticorpo humano remodelado forme um sítio de ligação ao antígeno apropriado (Sato, K. et al, Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

Métodos para obter anticorpos humanos também são conheci- dos. Por exemplo, anticorpos humanos desejados com atividade de ligação de antígeno podem ser obtidos por (1) sensibilizar linfócitos humanos com antígenos de interesse ou células que expressam antígenos de interesse in vitro; e (2) fundir os linfócitos sensibilizados com células de mieloma humano tais como U266 (veja a publicação Kokoku de pedido de patente Japonês No. (JP-B) H01 -59878 (pedido de patente japonês examinado, aprovado pu- blicado para oposição)). Alternativamente, o anticorpo humano desejado também pode ser obtido por usar um antígeno desejado para imunizar um animal transgênico que compreende um repertório completo de genes de anticorpo humano (veja o Pedido de Patente Internacional Nos WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, e WO 96/33735).

Além disso, técnicas para se obter anticorpos humanos por sele- ção (panning) com uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos são co- nhecidas. Por exemplo, a região variável de um anticorpo humano é expres- sa como um anticorpo de cadeia única (scFv) sobre a superfície de um fago, usando um método de apresentação em fago, e os fagos que se ligam ao antígeno podem ser selecionados. Por analisar os genes de fagos selecio- nados, as seqüências de DNA que codificam as regiões variáveis de anticor- pos humanos que se ligam ao antígeno podem ser determinadas. Se as se- qüências de DNA de scFvs que se ligam ao antígeno forem identificadas, vetores de expressão apropriados que compreendem estas seqüências po- dem ser construídos para se obter anticorpos humanos. Tais métodos são bem conhecidos (veja WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388).

A seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve pode ser uma seqüência de aminoácido com uma substituição, deleção, adição, e/ou inserção de um ou mais amino- ácidos na seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve de um anticorpo que foi confirmado como tendo atividade neutralizante de NR 10, contanto que a atividade neutralizan- te de NR 10 seja mantida. Métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica para preparar a seqüência de aminoácido da região variável da ca- deia pesada ou da região variável da cadeia leve do anticorpo que tem ativi- dade neutralizante de NR 10, o qual compreende uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoá- cido da região variável da cadeia pesada ou na região variável da cadeia leve, incluem métodos conhecidos para introduzir mutações em proteínas. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem preparar mutantes funcio- nalmente equivalentes á região variável da cadeia pesada ou à região variá- vel da cadeia leve do anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 por introduzir mutações apropriadas na seqüência de aminoácido da região vari- ável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve do anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 usando mutagênese sítio-dirigida (Ha- shimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed muta- genesis. Gene 152, 271-275DZoller, MJ, e Smith, M.(1983) Oligonucleotide- directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflug- felder, M, & Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonu- cleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441- 9456DKramer W, & Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) ou semelhantes. Desta fo- ram, regiões variáveis da cadeia pesada ou regiões variáveis da cadeia leve que compreendem mutações em um ou mais aminoácidos na região variável da cadeia peada ou na região variável da cadeia leve do anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 também estão incluídos na região variável da cadeia pesada ou na região variável da cadeia leve da presente invenção.

Quando um resíduo de aminoácido é alterado, o aminoácido é preferivelmente mutado por um aminoácido diferente que conserva as pro- priedades da cadeia lateral do aminoácido. Exemplos de propriedades de cadeia lateral de aminoácido são: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, e V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, Η, K, S, e T), ami- noácidos que compreendem cadeias laterais alifáticas (G, A, V, L, I, e P), a- minoácidos que compreendem cadeias laterais contendo grupos hidroxila (S, T, e Y), aminoácidos que compreendem cadeias laterais contendo enxofre (C e M), aminoácidos que compreendem cadeias laterais contendo amida e ácido carboxílico (D, Ν, E, e Q), aminoácidos que compreendem cadeias laterais básicas (R, K, e H), e aminoácidos que compreendem cadeias late- rais aromáticas amino (H, F, Y1 e W) (os aminoácidos são representados por códigos de uma letra entre parênteses). Substituições de aminoácido dentro de cada grupo são chamadas substituições conservativas. Já é sabido que um polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácido modificada na qual um ou mais resíduos de aminoácido em uma dada seqüência de aminoácido são deletados, adicionados, e/ou substituídos por outros amino- ácidos pode reter a atividade biológica original (Mark, D. F. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA; (1984) 81:5662-6; Zollerl M. J. & Smith1 M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et ai, Science (1984) 224:1431-3; Dal- badie-McFarland, G. et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982) 79:6409-13). Tais mutantes compreendem uma seqüência de aminoácido que é pelo me- nos 70% idêntica à seqüência de aminoácido de uma região variável da ca- deia pesada ou região variável da cadeia leve da presente invenção, mais preferiveImente pelo menos 75%, ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivel- mente pelo menos 90%, e o mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica. Neste documento, identidade de seqüência é definida como a porcentagem de resíduos idênticos àqueles na seqüência de aminoácido original da região variável da cadeia pesada e o mais preferivelmente pelo menos 95% idênti- ca. Neste documento, a identidade de seqüência é definida como a porcen- tagem de resíduos idênticos àqueles na seqüência de aminoácido original da região variável da cadeia pesada ou na região variável da cadeia leve, de- terminado após as seqüências serem alinhadas e intervalos terem sido a- propriadamente introduzidos para maximizar a identidade de seqüência con- forme necessário. A identidade de seqüências de aminoácido pode ser de- terminada pelo método descrito acima.

Alternativamente, uma seqüência de aminoácido da região vari- ável da cadeia pesada ou região variável da cadeia leve que compreende uma substituição, deleção, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da re- gião variável da cadeia leve e que retém a atividade neutralizante de NR 10 pode ser obtida de ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a ácido nucleico que compreende a seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou região va- riável da cadeia leve. Condições de hibridização estringentes para isolar um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um ácido nucleico que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve incluem, por exemplo, as condições de uréia a 6M, SDS 0,4%, SSC 0,5x, e 37°C, ou condições de hibridização com estringências equiva- lentes a estas. Com condições mais estringentes, por exemplo, as condições de uréia a 6M, SDS 0,4%, SSC 0,1x, e 42°C isolamento de ácidos nucleicos com uma homologia muito maior pode ser esperada. As seqüências dos áci- dos nucleicos esperados pode ser determinada por métodos conhecidos descritos abaixo. A homologia global de seqüência de nucleotídeos do ácido nucleico isolado é de pelo menos 50% ou identidade de seqüência maior, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais (por exem- plo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais).

Um ácido nucleico que hibridiza sob condições estringentes a um ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeos que co- difica a seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve também pode ser isolado usando, ao invés dos métodos descritos acima, técnicas de hibridização, métodos de amplifi- cação gênica usando iniciadores sintetizados com base na informação da seqüência de nucleotídeo que codifica seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR).

Especificamente, a identidade de uma seqüência de nucleotídeo ou seqüência de aminoácido a outra pode ser determinada usando o algo- ritmo BLAST, por Karlin & Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90, 5873-7). Programas tais como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo (Altschul et aí., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Para analisar as seqüências de nucleotídeo de acordo com BLASTN baseado em BLAST, os parâmetros são ajustados, por exemplo, como escore = 100 e comprimento de palavra (wordlength) = 12. Por outro lado, os parâmetros usados para a análise das seqüências de aminoácido por BLASTX baseado em BLAST incluem, por exemplo, escore = 50 e comprimento de palavra = 3. Parâmetros predeterminados para cada programa são usados quando se usa os programas BLAST e Gapped BLAST. Técnicas específicas para tais análises são conhecidos na técnica (veja o site da internet do National Cen- ter for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Alternativamente, os anticorpos da presente invenção podem ser minicorpos. Tais minicorpos da presente invenção incluem fragmentos de anticorpo que não têm algumas porções de um anticorpo inteiro (por exem- plo, IgG inteira), e não são particularmente limitados contanto que eles rete- nham a atividade neutralizante de NR 10. Os minicorpos da presente inven- ção não são particularmente limitados, contanto que eles sejam porções de anticorpos inteiros. Os minicorpos compreendem preferivelmente uma região variável da cadeia pesada (VH) ou região variável da cadeia leve (VL). Mini- corpos particularmente preferidos compreendem tanto VH quanto VL.

Os minicorpos da presente invenção têm preferivelmente um peso molecular menor do que os anticorpos inteiros. Entretanto, os minicor- pos podem formar multímeros, por exemplo, dímeros, trímeros, ou tetrâme- ros, e assim seus pesos moleculares podem ser maiores do que aqueles dos anticorpos inteiros.

Os minicorpos da presente invenção incluem, por exemplo, anti- corpos de scFv. Anticorpos de ScFv são polipeptídeos de cadeia única cons- truídos por ligação de uma região variável da cadeia pesada ([VH]) e uma região variável da cadeia leve ([VL]) através de um ligante ou semelhante (Huston, J. S. et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, eds., Re- senburg & Moore, Springer Verlag, Nova lorque, pp. 269-315, (1994)). A or- dem da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve a serem ligadas juntas não é particularmente limitada, e elas podem ser dis- postas em qualquer ordem. Exemplos dos arranjos são listados abaixo.

[VH] ligante [VL]

[VL] ligante [VH]

A seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve pode compreender uma substituição, deleção, adição e/ou inserção. Além disso, a região variável da cadeia pesa- da e a região variável da cadeia leve também podem não ter algumas por- ções ou serem adicionadas com outros polipeptídeos, contanto que elas te- nham habilidade de ligação de antígeno quando ligadas juntas. Alternativa- mente, as regiões variáveis podem ser quimerizadas ou humanizadas.

Na presente invenção, ligantes que se ligam à região variável do anticorpo compreendem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser in- troduzidos usando manipulação genética, ou ligantes sintéticos (por exem- plo, ligantes descritos em "Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996").

Os ligantes preferidos na presente invenção são ligantes de pep- tídeo. Os comprimentos dos ligantes de peptídeo não são particularmente limitados e aqueles versados na técnica podem selecionar apropriadamente os comprimentos dependendo da finalidade. Comprimentos típicos são um a 100 aminoácidos, preferivelmente 3 a 50 aminoácidos, mais preferivelmente 5 a 30 aminoácidos, e particularmente preferivelmente 12 a 18 aminoácidos (por exemplo, 15 aminoácidos).

Seqüências de aminoácido de tais Iigantes de peptídeo incluem, por exemplo:

Ser

GIy.Ser

GIy.GIy.Ser

Ser.GIy.GIy

GIy.GIy.GIy.Ser (SEQ ID NO: 8) Ser GIy GIy GIy (SEQ ID NO: 9) GIy GIy GIy GIy Ser (SEQ ID NO: 10) Ser GIy GIy GIy GIy (SEQ ID NO: 11) GIy GIy GIy GIy GIy Ser (SEQ ID NO: 12) Ser GIy GIy GIy GIy GIy (SEQ ID NO: 13) Gly GIy GIy GIy GIy GIy Ser (SEQ ID NO: 14) Ser GIy GIy GIy GIy GIy GIy (SEQ ID NO: 15) (GIy GIy GIy GIy Ser (SEQ ID NO: 10))n (Ser GIy GIy GIy GIy (SEQ ID NO: 11))n

onde η é um número inteiro de 1 ou mais.

Ligantes sintéticos (agentes de reticulação química) incluem a- gentes de reticulação que são usados rotineiramente para reticular peptí- deos, por exemplo, N-hidroxi succinimida (NHS), disuccinimidil suberato (DSS), suberato de bis(succinimidil) (BS3)1 ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), ditiobis(succinimidil propionato) (DTSSP), etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS)1 etileno glicol bis(sulfosuccinimidil succina- to) (sulfo-EGS), disuccinimidil tartrato (DST), disulfosuccinimidil tartrato (sul- fo-DST), bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (BSOCOES), e bis[2- (succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Estes agentes reti- culadores são disponíveis comercialmente.

Anticorpos da presente invenção incluem anticorpos nos quais dois ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados à seqüência de a- minoácido de um anticorpo da presente invenção. Adicionalmente, proteínas de fusão que resultam de uma fusão entre um dos anticorpos acima e um segundo peptídeo ou proteína estão incluídas na presente invenção. As pro- teínas de fusão podem ser preparadas por ligar um polinucleotídeo que codi- fica um anticorpo da presente invenção e um polinucleotídeo que codifica um segundo peptídeo ou polipeptídeo em fase, inserindo-o em um vetor de ex- pressão, e expressar o construto de fusão em um hospedeiro. Algumas téc- nicas conhecidas daqueles versados na técnica são disponíveis para esta finalidade. O peptídeo ou polipeptídeo parceiro a ser fundido com um anti- corpo da presente invenção pode ser um peptídeo conhecido, por exemplo, FLAG (Ηορρ, Τ. Ρ. et ai, BioTechnoIogy 6, 1204-1210 (1988)), 6χ His que consiste em seis resíduos de His (histidina), 10x His, hemaglutinina de influ- enza (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento de VSV-GP, fragmento de p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, fragmento de antígeno T de SV40, Ick tag, fragmento de ^-tubulina, B-tag, fragmento de Proteína C. Outros poli- peptídeos parceiros a serem fundidos com os anticorpos da presente inven- ção incluem, por exemplo, GST (glutationa-S-transferase), HA (hemaglutini- na de influenza), região constante de imunoglobulina, L-galactosidase, e MBP (proteína de ligação de maltose). Um polinucleotídeo que codifica um destes peptídeos ou polipeptídeos disponíveis comercialmente pode ser fun- dido com polinucleotídeo que codifica um anticorpo da presente invenção. O polipeptídeo de fusão pode ser preparado por expressar o construto de fu- são.

Os anticorpos da presente invenção podem diferir na seqüência de aminoácido, peso molecular, ponto isoelétrico, presença/ausência de ca- deias de açúcar, e conformação dependendo da célula ou do hospedeiro que produz o anticorpo, ou do método de purificação. Entretanto, um anticorpo resultante está incluído na presente invenção, contanto que ele seja funcio- nalmente equivalente a um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, quando um anticorpo da presente invenção é expresso em células procarió- ticas, por exemplo, E. coli, um resíduo de metionina é adicionado à termina- ção N da seqüência de aminoácido do anticorpo original. Tais anticorpos es- tão incluídos na presente invenção.

O anticorpo da presente invenção pode ser preparado por méto- dos conhecidos daqueles versados na técnica. O anticorpo pode ser prepa- rado, por exemplo, por técnicas de recombinação genética conhecidas da- queles versados na técnica com base na seqüência de um anticorpo que reconhece NR 10. Especificamente, tal anticorpo pode ser preparado por construir um polinucleotídeo que codifica um anticorpo baseado na seqüên- cia de um anticorpo que reconhece NR 10, inserir o construto em um vetor de expressão, e então expressá-lo em células hospedeiras apropriadas (ve- ja, por exemplo, Co, M. S. et al, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, Μ. & Horwitz, Α. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun1 Α. & Skerra, Α., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. & Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Os vetores incluem vetores M13, vetores, PUC, vetores pBR322, pBluescript, e pCR-Script. Alternativamente, quando se pretende subclonar e cortar cDNA, os vetores incluem, por exemplo, pGEM-T, pDIRECT, e pT7, além dos vetores descritos acima. Vetores de expressão são particularmente úteis quando se usa vetores para produzir os anticorpos da presente inven- ção. Por exemplo, quando se pretende expressão em E. coli tal como JM109, DH5_, HB101, e XLI-Blue, os vetores de expressão não apenas têm as características descritas acima que permitem a amplificação do vetor em E. coli, mas também devem carregar um promotor que permite a ex- pressão eficaz em E. coli, por exemplo, o promotor de IacZ (Ward et al., Na- ture (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), o promotor de araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), o promotor de T7 ou semelhantes. Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Quiagen), pEGFP, ou pET (neste caso, o hospedeiro é preferivel- mente BL21 que expressa RNA polimerase de T7) além dos vetores descri- tos acima.

Os vetores podem compreender seqüências de sinal para a se- creção de anticorpo, como uma seqüência de sinal para a secreção de anti- corpo, uma seqüência de sinal de pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) pode ser usada quando uma proteína é secretada no periplasma de E. coli. O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras por cloreto de cálcio ou métodos de eletroporação, por exemplo.

Além dos vetores para E. coli, os vetores para produzir os anti- corpos da presente invenção incluem vetores de expressão de mamífero (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de inseto (por exemplo, o "sistema de expressão de baculovírus Bac-to- BAC" (Gibco-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de plantas (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de vírus de animais (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão re- trovirais (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão de levedura (por e- xemplo, o kit de expressão "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, e SP- Q01), e vetores de expressão de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.

Quando se pretende a expressão em células de animais, tais como células CHO, COS, e NIH3T3, os vetores devem ter um promotor es- sencial para expressão em células, por exemplo, promotor de SV40 (Mulli- gan et ai, Nature (1979) 277, 108), promotor de MMLV-LTR, promotor de EF1_ (Mizushima et ai, NucIeicAcids Res. (1990) 18, 5322), e promotor de CMV, e mais preferivelmente eles têm um gene para selecionar células transformadas (por exemplo, um gene de resistência a fármacos que permite a avaliação usando um agente (neomicina, G418, ou semelhantes). Vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pO- PRSV, e pOP13, por exemplo.

Além disso, o método a seguir pode ser usado para expressão gênica estável e amplificação gênica em células: células CHO deficientes em uma via de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor (por exemplo, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2a edição, Cold Spring Harbor Labo- ratory Press, 1989)) que carrega um gene de DHFR que compensa a defici- ência, e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, o método a seguir pode ser usado para expressão gênica transitória: células COS com um gene que expressa um antígeno T de SV40 no seu cromos- somo são transformadas com um vetor (pcD e semelhantes) com uma ori- gem de replicação de SV40. Origens de replicação derivadas de polioma vírus, adenovírus, vírus do papiloma bovino (BPV), e semelhantes também podem ser usados. Para amplificar o número de cópias do gene em células hospedeiras, os vetores de expressão podem ainda carregar marcadores de seleção tais como gene de aminoglicosídeo transferase (ΑΡΗ), gene da timi- dina quinase (TK), gene da xantina-guanina fosforribosiltransferase de E. coli (Ecogpt), e gene da diidrofolato redutase (dhfr).

Anticorpos desejados obtidos pelos métodos descritos acima podem ser isolados de dentro das células hospedeiras ou de fora das células (do meio, ou semelhantes), e purificadas para homogeneidade. Os anticor- pos podem ser isolados e purificados por métodos usados rotineiramente para isolar e purificar anticorpos, e o tipo de método não é limitado. Por e- xemplo, os anticorpos podem ser isolados e purificados por selecionar e combinar apropriadamente cromatografia de coluna, filtração, ultrafiltração, precipitação por sal (salting out), precipitação por solvente, extração com solvente, destilação, imunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilami- da-SDS, isoeletrofocalização, diálise, recristalização, e semelhantes.

As cromatografias incluem, por exemplo, cromatografia de afini- dade, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, filtração em gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia de adsorção (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et ai, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Os métodos cromatográficos descritos acima podem ser conduzidos usando cromatografia líquida, por exemplo, HPLC e FPLC. As colunas que podem ser usadas para cromatografia de afinidade incluem colunas de proteína A e colunas de proteína G. Colunas que usam proteína A incluem, por exemplo, Hyper D, POROS, e Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). A presente invenção compreende anticorpos que são altamente purificados usando es- tes métodos de purificação.

A presente invenção também fornece agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, as quais compreendem como ingredientes ati- vos fragmentos e/ou produtos de modificação de um anticorpo da presente invenção. Os fragmentos e/ou produtos de modificação de anticorpos da presente invenção incluem fragmentos de anticorpo que não têm algumas porções dos anticorpos da presente invenção (anticorpos inteiros (por exem- plo, IgG inteira), anticorpos recombinantes (por exemplo, anticorpos quiméri- cos, anticorpos humanizados, e anticorpos humanos) e minicorpos (por e- xemplo, anticorpos de scFv)), e não são particularmente limitados contanto que eles retenham a habilidade de se ligar aos seus antígenos. Os fragmen- tos de anticorpo da presente invenção não são particularmente limitados, contanto que eles sejam porções de anticorpos inteiros. Os fragmentos compreendem preferivelmente uma região variável da cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável da cadeia leve (VL). A seqüência de aminoácido da VH ou VL pode compreender substituições, deleções, adições e/ou inser- ções. A VH e/ou VL pode não ter algumas porções, contanto que a habilida- de de se ligar ao antígeno seja retida. Além disso, a região variável pode ser quimerizada ou humanizada. Especificamente, fragmentos de anticorpo in- cluem, por exemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv. Tais fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por construir genes que codificam os fragmen- tos de anticorpo, introduzi-los em vetores de expressão, e então expressá- los em células hospedeiras apropriadas (veja, por exemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. & Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. & Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser anti- corpos conjugados que são ligados a qualquer uma de várias moléculas, tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, substâncias fluores- centes, substâncias quimioluminescentes, enzimas e toxinas. Tais anticorpos conjugados podem ser obtidos por modificar quimicamente os anticorpos obtidos. Métodos para modificar anticorpos foram estabelecidos neste cam- po (por exemplo, US 5057313 e US 5156840). Os "anticorpos" da presente invenção também incluem tais anticorpos conjugados.

A atividade do anticorpo de se ligar a NR 10 pode ser determi- nada por métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Métodos para determinar a atividade de ligação do antígeno de um anticorpo incluem, por exemplo, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), EIA (imunoen- saio enzimático), RIA (radioimunoensaio), e método de anticorpo fluorescen- te. Por exemplo, quando o imunoensaio enzimático é usado, amostras con- tendo anticorpo, tais como anticorpos purificados e sobrenadantes de cultura de células produtoras de anticorpo, são adicionadas a placas revestidas com antígeno. Um anticorpo secundário marcado com uma enzima, tal como fos- fatase alcalina, é adicionado e as placas são incubadas. Após lavagem, um substrato enzimático, tal como fosfato de p-nitrofenila, é adicionado e as a absorbância é medida para avaliar a atividade de ligação ao antígeno.

Além disso, a atividade neutralizante de NR 10 de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, pelo método descrito nos Exemplos, o qual envolve testar o efeito de suprimir o crescimento da linhagem celular dependente de IL-31.

Os antagonistas de NR 10 ou anticorpos que têm atividade neu- tralizante de NR 10 da presente invenção podem ser usados nos agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias. Os presentes inventores pro- varam que a administração de anticorpos neutralizantes de NR 10 de ca- mundongo produziu efeitos terapêuticos acentuados em animais modelo pa- ra várias doenças inflamatórias. Além disso, a expressão de NR 10 humana foi relatada estando aumentada na epiderme espessada de pacientes com dermatite atópica (Documento não-patente 1). Os presentes inventores con- firmaram por coloração imuno-histoquimica que no caso de humanos, a ex- pressão de NR 10 de camundongo estava aumentada na epiderme espes- sada de pavilhões auriculares nos camundongos do modelo de dermatite crônica descritos acima (Exemplo 5). Estes achados sugerem que NR 10 está envolvida similarmente em doenças inflamatórias em todas as espécies de animais, e que, assim como anticorpos neutralizantes de NR 10 de ca- mundongo, anticorpos que neutralizam NR 10 humana são eficazes em pre- venir e tratar várias doenças inflamatórias. Além disso, assim como com os achados descritos neste Exemplo, também é esperado que antagonistas de NR 10 que não anticorpos também tenham efeitos terapêuticos sobre várias doenças inflamatórias.

Na presente invenção, doença inflamatória se refere a doenças com características patológicas envolvidas em reações citológicas e histoló- gicas que ocorrem em vasos sangüíneos afetados e tecidos adjacentes em resposta a uma injúria ou estimulação anormal causada por agentes físicos, químicos ou biológicos (Stedman's Medicai Dictionary1 5ã Ed., MEDICAL Vl- EW CO., 2005). Geralmente, doenças inflamatórias incluem dermatite (der- matite atópica, dermatite crônica, e semelhantes), doenças inflamatórias do intestino (colite e semelhantes), asma, artrite, (artrite reumatóide, osteoartrite e semelhantes), bronquite, doenças autoimunes de Th2, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia gravis, GVHD crônico, doença de Crohn, espondilite deformante, dor lombar, gota, inflamação após cirurgia ou injúria, inchaço, neuralgia, laringofaringite, cistite, hepatite, (esteato-hepatite não-alcoólica, hepatite alcoólica, e semelhantes), hepatite B, hepatite C e arteriosclerose.

Exemplos preferidos de doenças inflamatórias que são objetos da presente invenção incluem dermatite atópica, dermatite crônica, reuma- tismo, osteoartrite, e asma crônica.

Os presentes inventores descobriram que anticorpos antagonis- tas de NR 10 têm efeitos terapêuticos contra dermatite atópica, dermatite crônica, reumatismo, e osteoartrite. Por outro lado, foi revelado que anticor- pos antagonistas de NR 10 não produzem efeitos terapêuticos na dermatite de contato aguda, e em modelos de colite aguda por DSS.

Os agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias da pre- sente invenção compreendem como um ingrediente ativo um antagonista de NR 10 ou um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 descrito acima. A expressão "compreende um antagonista de NR 10 como um ingre- diente ativo" significa compreendendo um antagonista de NR 10 como pelo menos um dos ingredientes ativos, e não limita os conteúdos. Além disso, os agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias da presente invenção podem compreender também, em combinação com um antagonista de NR 10, outros ingredientes que aumentam a prevenção ou tratamento da doen- ça inflamatória.

O antagonista de NR 10 da presente invenção pode ser formula- do de acordo com métodos usuais (veja, por exemplo, Remington's Pharma- ceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, EUA). Além disso, eles podem compreender veículos e/ou aditivos farmacêutica- mente aceitáveis se necessário. Por exemplo, eles podem conter tensoativos (por exemplo, PEG e Tween), excipientes, antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico), agentes corantes, agentes flavorizantes, conservantes, estabili- zantes, agentes tamponantes (por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, e outros ácidos orgânicos), agentes quelantes (por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, e outros ácidos orgânicos), agentes quelantes (por exemplo, EDTA), agentes de suspensão, agentes isotonizantes, aglutinantes, desinte- grantes, lubrificantes, promotores de fluidez, e corretores (corrigents). Entre- tanto, os veículos que podem estar compreendidos nos agentes para preve- nir ou tratar doenças inflamatórias da presente invenção não são limitados a esta lista. De fato, outros veículos comumente usados tais como ácido salicí- Iico anidro fraco, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose de cálcio, carmelose de sódio, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilacetaldietilaminoacetato, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, óleo de rícino polioxietileno hidrogenado 60, sacarose, carboximetilcelulose, amido de milho, sal inorgânico, e etc. podem ser compreendidos apropriadamente. As composições também podem com- preender outros polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas tais como albumina sérica, gelatina, e imunoglobulina, e aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina, e lisina. Quando a composição é preparada como uma solução aquosa para injeção, antagonistas de NR 10 podem ser dissolvidos em uma solução isotônica que compreende, por exemplo, salina fisiológica, dextrose, e outros adjuvantes. Os adjuvantes podem incluir, por exemplo. D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Além disso, agentes solubilizantes apropriados, por exemplo, alcoóis (por exemplo, eta- nol), polialcoóis (por exemplo, propileno glicóis e PEGs), e detergentes não- iônicos (polissorbato 80 e HCO-50) podem ser usados concomitantemente.

Se necessário, antagonistas de NR 10 podem ser encapsulados em microcápsulas feitas de hidroxicelulose, gelatina, polimetilmetacrilato, e semelhantes), e transformadas em componentes de sistemas de liberação de fármacos coloidais (lipossomas, microesferas de albumina, microemul- sões, nano-partículas, e nano-cápsulas) (por exemplo, veja "Remington's Pharmaceutical Science 16^ edição" &, Oslo Ed. (1980)). Além disso, méto- dos para fazer fármacos de liberação sustentada são conhecidos, e estes podem aplicados para antagonistas de NR 10 (Langer et al, J. Biomed. Ma- ter. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; Paten- te US No. 3,773,919; Pedido de Patente Europeu (EP) No. 58,481; Sidman et ai, Biopolímeros (1983) 22, 547-56; EP 133.988).

Os agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias da pre- sente invenção podem ser administrados oralmente ou parenteralmente, mas são preferivelmente administrados parenteralmente. Especificamente, os agentes são administrados aos pacientes por injeção, ou administração percutânea. Injeções incluem, por exemplo, injeções intravenosas, injeções intramusculares, e injeções subcutâneas, para administração sistêmica ou local. Os agentes podem ser dados a locais onde a inflamação deve ser su- primida, ou áreas circundando os locais por infusão local, injeção intramus- cular em particular. Os métodos de administração podem ser apropriada- mente selecionados de acordo com a idade e condição do paciente. A dose de administração única pode ser selecionada, por exemplo, de dentro da faixa de 0,0001 a 100 mg do ingrediente ativo por kg de peso corporal. Alter- nativamente, quando os agentes são administrados a pacientes humanos, a dose o ingrediente ativo pode ser selecionada de dentro da faixa de 0,001 a 1.000 mg/kg de peso corporal. A administração em dose única compreende preferivelmente, por exemplo, antagonista de NR 10 em cerca de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal. Entretanto, a dose de um agente para prevenir ou tratar doenças inflamatórias da presente invenção não está limitada a estes exemplos.

A presente invenção também fornece anticorpos que têm ativi- dade neutralizante de NR 10 (incluindo fragmentos de anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10, e/ou produtos de modificação destes; a mesma definição é usada por toda a descrição abaixo). Os anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 da presente invenção são úteis como ingredientes ativos nos agentes descritos acima para prevenir ou tratar do- enças inflamatórias. Os anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 da presente invenção podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais, mas são preferivelmente anticorpos monoclonais. Tais anticorpos monoclonais que têm atividade neutralizante de NR 10 podem ser obtidos pelos métodos descritos acima. Os anticorpos monoclonais da presente invenção têm a ati- vidade de neutralizar NR 10 derivado de mamíferos ou fragmentos destes, preferivelmente têm a atividade de neutralizar NR 10 derivado de humanos ou camundongos, ou fragmentos destes, e mais preferivelmente a atividade de NR 10 derivado de humanos ou fragmentos destes. NR 10 de humano ou um fragmento de peptídeo deste pode ser usado como um imunógeno para preparar anticorpos monoclonais que têm a atividade de neutralizar NR 10 humano. Alternativamente, os anticorpos que têm atividade neutralizante de NR 10 da presente invenção podem ser anticorpos recombinantes. Anticor- pos recombinantes que têm atividade neutralizante de NR 10 da presente invenção incluem, mas não são limitados, a anticorpos quiméricos, anticor- pos humanizados, anticorpos humanos, e minicorpos.

Na presente invenção, os anticorpos que têm atividade neutrali- zante de NR 10 incluem, por exemplo, anticorpos anti-NR 10 de camundon- go que compreendem uma região variável da cadeia pesada que compreen- de a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e uma região variável da cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.

A presente invenção também inclui anticorpos monoclonais que têm a atividade de neutralização de NR 10 humano. Os anticorpos monoclo- nais que têm atividade de neutralizar NR 10 humano da presente invenção podem ser obtidos por preparar anticorpos monoclonais usando NR 10 hu- mana ou um fragmento de peptídeo desta como um imunógeno, e então se- lecionar a partir dos anticorpos monoclonais anti-NR 10 de humano, anticor- pos que tenham a atividade de neutralizar NR 10 humana, com base no sis- tema de ensaio descrito acima usando a linhagem celular dependente de IL- 31.

Na presente invenção, os anticorpos que têm atividade de neu- tralizar NR 10 humana incluem os anticorpos descritos em qualquer um de:

(a) anticorpos que têm uma região variável da cadeia pesada que compreende CDR1, CDR2, e CDR3 que consistem nas seqüências de aminoácido de SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, respectivamente.

(b) anticorpos que têm a região variável da cadeia leve que compreende CDR1, CDR2, e CDR3 que consistem nas seqüências de ami- noácido de SEQ ID NOs: 21, 22, e 23, respectivamente;

(c) anticorpos que têm a região variável da cadeia pesada de (a) e a região variável da cadeia leve de (b); e

(d) anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo reconhecido pelos anticorpos de qualquer um de (a) a (c).

Se um anticorpo reconhece o mesmo epítopo que aquele reco- nhecido por outro anticorpo pode ser confirmado pela competição entre os dois anticorpos contra o epítopo. A competição entre os anticorpos pode ser avaliada por ensaios de ligação competitiva usando meios tais como ELISA, método de transferência de energia (FRET), e tecnologia de ensaio de mi- crovolume fluorimétrico (FMAT(R)). A quantidade dos anticorpos ligados a um antígeno se correlacionada indiretamente com a habilidade de ligação de anticorpos competidores candidatos (anticorpos de teste) que se ligam com- petitivamente ao mesmo epítopo. Em outras palavras, conforme a quantida- de ou a afinidade dos anticorpos de teste ao mesmo epítopo aumenta, a quantidade de anticorpos ligados ao antígeno diminui, e a quantidade de anticorpos de teste ligados ao antígeno aumenta. Especificamente, anticor- pos apropriadamente marcados e anticorpos a serem avaliados são adicio- nados simultaneamente aos antígenos, e assim os anticorpos ligados são detectados usando o marcador. A quantidade de anticorpos ligados ao antí- geno pode ser facilmente determinada por marcar os anticorpos antecipa- damente. Este marcador não é particularmente limitado, e o método de mar- cação é selecionado de acordo com a técnica de ensaio usada. O método de marcação inclui marcação fluorescente, radio ma reação, marcação enzimáti- ca, e semelhantes.

Por exemplo, anticorpos marcados fluorescentemente e anticor- pos não marcados ou anticorpos de teste são adicionados simultaneamente a células animais que expressam NR 10, e os anticorpos marcados são de- tectados por tecnologia de ensaio de microvolume fluorimétrico.

IC5O é a concentração na qual a quantidade de anticorpos mar- cados ao epítopo é reduzida para 50% pela ligação de anticorpos não- marcados. Neste documento, anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo são anticorpos que podem reduzir a quantidade de anticorpos marcados ao epítopo para pelo menos 50% quando a concentração dos anticorpos de teste é dez vezes maior do que a IC50 dos anticorpos não-marcados.

Anticorpos que têm a atividade de neutralizar NR 10 humana que são usados na presente invenção preferivelmente têm ainda atividade de ligação a NR 10 de macaco cinomolgo, e mais preferivelmente têm a ati- vidade de neutralizar NR 10 de macaco cinomolgo. A NR 10 de macaco ci- nomolgo que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 pode ser usada em medidas da atividade de neutralização ou ligação a NR 10 de macaco cinomolgo.

A presente invenção também fornece os métodos terapêuticos descritos abaixo. A interpretação de NR 10, antagonistas, anticorpos mono- clonais, anticorpos recombinantes, doenças inflamatórias, e outros nos mé- todos são descritas acima.

(1) um método para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, o qual compreende a etapa de administrar um antagonista de NR 10 a um paciente com uma doença inflamatória;

(2) o método de (1), no qual o antagonista de NR 10 é um anti- corpo que tem a atividade de se ligar a NR 10;

(3) o método de (2), no qual o anticorpo é um anticorpo mono- clonal;

(4) o método de (2), no qual o anticorpo é um anticorpo mono- clonal que se liga a NR 10 humana;

(5) o método de qualquer um de (2) a (4), no qual o anticorpo é um anticorpo recombinante;

(6) o método de (5), no qual o anticorpo recombinante é um anti- corpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano;

(7) o método de qualquer um de (2) a (6), no qual um fragmento de um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 e/ou um produto modificado deste estão incluídos como um ingrediente ativo;

(8) o método de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença in- flamatória é dermatite atópica;

(9) o método de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença in- flamatória é dermatite crônica;

(10) o método de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença inflamatória é reumatismo; e

(11) o método de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença in- flamatória é osteoartrite.

A presente invenção também fornece as invenções descritas abaixo. A explicação de NR 10, antagonistas, anticorpos monoclonais, anti- corpos recombinantes, doenças inflamatórias e outros nos métodos são descritas acima.

(1) uso de um antagonista de NR 10 para produzir um agente para prevenir ou tratar uma doença inflamatória;

(2) o uso de (1), no qual o antagonista de NR 10 é um anticorpo que tem a atividade de se ligar a NR 10;

(3) o uso de (2), no qual o anticorpo é um anticorpo monoclonal;

(4) o uso de (2), no qual o anticorpo é um anticorpo monoclonal que se liga a NR 10 humana;

(5) o uso de qualquer um de (2) a (4), no qual o anticorpo é um anticorpo recombinante;

(6) o uso de (5), no qual o anticorpo recombinante é um anticor- po quimérico, anticorpo humanizado, ou anticorpo humano;

(7) o uso de qualquer um de (2) a (6), no qual um fragmento de um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10 e/ou um produto de modificação deste são incluídos como um ingrediente ativo;

(8) o uso de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença inflama- tória é dermatite atópica;

(9) o uso de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença inflama- tória é dermatite crônica; (10) o uso de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença infla- matória é reumatismo; e

(11)o uso de qualquer um de (1) a (7), no qual a doença infla- matória é osteoartrite.

Todos os documentos da técnica anterior citados aqui estão in- corporados por referência neste documento.

Exemplos

Neste documento abaixo, a presente invenção será descrita es- pecificamente com relação aos Exemplos, mas não deve ser interpretada 1como sendo limitada a isto.

[Exemplo 1] Estabelecimento da linhagem celular Ba/F3 que expressa NR 10 e OSMR

Um cDNA de NR 10 humana (SEQ ID NO: 1 de WO 0075314) foi inserido no vetor de expressão pC0S1 (Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996) para produzir pCosNR 10.3. Um cDNA de receptor de oncostatina M (OSMR, No. de Acesso GenBank NM003999) foi isolado de uma biblioteca placentária humana por PCR e então o vetor de expressão pCosl-hOSMR foi similarmente construído. Por eletroporação, 10 pg de ca- da um dos vetores foram simultaneamente introduzidos em células da Iinha- gem celular Ba/F3 derivada de células pro-B dependentes de IL-3 de ca- mundongo (BioRad Gene Pulser; 960 pF e 0,33 kV). Após a introdução, IL- 31 humana foi adicionada e as células foram cultivadas. Assim, uma linha- gem celular que proliferou de uma forma dependente de IL-31 foi obtida. Da mesma maneira, uma linhagem celular dependente de IL-31 de camundongo também foi preparada a partir de células Ba/F3 que foram feitas para ex- pressar os genes de NR 10 e OSMR de camundongo.

Em ambas as linhagens celulares, a ED50 foi encontrada ser de vários ng/ml. Assim, linhagens celulares bem proliferativas foram obtidas. A linhagem celular humana dependente de IL-31 não exibiu resposta a IL-31 de camundongo e o crescimento foi suprimido mediante a adição de proteína NR 10 humana (domínio extracelular). A linhagem celular dependente de IL- 31 de camundongo não exibiu resposta a IL-31 humana e o crescimento não foi suprimido pela proteína NR 10 de camundongo adicionada (domínio ex- tracelular).

[Exemplo 2] Preparação de proteína NR 10 (domínio extracelular)

O domínio extracelular sozinho foi amplificado por PCR usando cDNA de NR 10 como um modelo, uma seqüência de FLAG tag foi ligada na terminação C e foi inserida no vetor de expressão pCXND3 (WO 2005/005636) (pCXND3-NR 10-flag). 10 μg desse vetor linear foram introdu- zidos em células da linhagem celular DG44 de ovário de hamster chinês por eletroporação (BioRad Gene Pulserll; 25 pF e 1,5 kV). Uma linhagem celular com alta expressão foi obtida. Uma amostra purificada foi preparada a partir de um sobrenadante de uma cultura em larga escala da linhagem celular por coluna de anticorpo anti-FLAG (SIGMA) e filtração em gel e usada nos expe- rimentos descritos abaixo. NR 10 de camundongo (domínio extracelular) com seqüência FLAG tag ligada à terminação C foi similarmente preparada.

[Exemplo 3] Isolamento de scFv que tem atividade neutralizante anti-NR 10 de camundongo e preparação de BM095 como uma IgG quimerizada

Especificamente, os presentes inventores tentaram limitar os clones candidatos a partir de uma biblioteca de fago de anticorpo humano por seleção (panning) usando proteína NR 10 biotinilada de camundongo (domínio extracelular). ScFv secretório foi purificado a partir dos clones e adicionado a um sistema de ensaio de crescimento celular usando células Ba/F3 dependentes de IL-31 descritas no Exemplo 1. Como resultado, o clo- ne BM095 que exibe forte atividade supressora de crescimento foi obtido com sucesso.

Usando PCR, a seqüência da região variável da cadeia H huma- na (VH) de BM095 foi ligada a região constante (após CH1) de lgG2a de camundongo e a seqüência da região variável da cadeia L humana (VL) de BM095 foi ligada à região constante da cadeia λ de camundongo, para cons- truir um vetor de expressão. A seqüência de aminoácidos de VH é mostrada em SEQ ID NO:1 e a seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO:2. A seqüência de aminoácidos de VL é mostrada em SEQ ID NO:3 e a seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO:4. Os vetores de expressão lineares respectivos foram introduzidos simultaneamente na li- nhagem celular DG44 e então uma linhagem celular expressando IgG qui- merizada em um nível alto foi selecionada. Uma amostra purificada foi obtida do sobrenadante de uma cultura em larga escala dessa linhagem celular usando uma coluna de proteína A (rProtein A Sepharose Fast Flow1 GE A- mersham Biosciences) e cromatografia de coluna por troca de cátion (SP- TOYOPEARL 650M, TOSOH). Além disso, pirogênio foi removido usando resina ActiCIean Etox (Sterogen) para reduzir a concentração abaixo do Iimi- te de detecção. A amostra foi usada nos experimentos com animais descri- tos abaixo. O resultado obtido pela adição de BM095 ao sistema de ensaio descrito acima é mostrado na Fig.1.

[Exemplo 4] Avaliação da eficácia de fármaco em um modelo de dermatite atópica usando camundongos NC/Nga

Um modelo de dermatite foi produzido pela aplicação repetida de cloreto de picrila (PiCI) em intervalos semanais. Especificamente, 4 dias a- pós a sensibilização com PiCI 5% (150 μl) no abdômen e pata, a indução de dermatite foi obtida pela aplicação repetida de PiCI 0,8% (150 μl) sobre o dorso e pavilhão auricular em intervalos semanais. Os sintomas resultantes foram observados duas vezes por semana além do terceiro ao sexto período semanal e cinco ocorrências ((1) prurido, (2) vermelhidão e sangramento, (3) edema, (4) injúria e dano tecidual e (5) incrustação e ressecamento) foram pontuados independentemente em uma escala de 0 a 3. O anticorpo foi ad- ministrado a 10 mg/kg nas cavidades peritoneais no dia antes da sensibiliza- ção e a cada indução, 6 vezes no total (grupo de BM095) ou no dia anterior a cada indução após a terceira semana, três vezes no total (grupo V/B). Co- mo controle positivo, 1 mg/kg de dexametasona foi administrado oralmente todos os dias após a terceira semana (grupo DEX). Cada grupo continha 10 camundongos machos NC/Nga.

Como mostrado na Fig. 2, um efeito supressor significativo foi encontrado no grupo tratado com anticorpo quando comparado com o grupo administrado com veículo-solvente. Além disso, como visto na Fig. 2, embora tenha sido vista perda de peso significativa no grupo DEX, não houve altera- ção de peso no grupo administrado com anticorpo. Isso sugere que o anti- corpo é um agente muito seguro.

[Exemplo 5] Avaliação de eficácia de fármaco usando um modelo de derma- tite crônica criado por aplicação repetida de cloreto de picrila

Camundongos BALB/c fêmeas com seis semanas de idade fo- ram sensibilizados pela aplicação de 20 μl de cloreto de picrila 0,5% (solu- ção de acetona/óleo de oliva (1:4 v/v) sobre suas orelhas direitas. A indução foi obtida pela aplicação repetida de 20 μl de cloreto de picrila 0,25% (aceto- na/óleo de oliva (1:4 v/v)) sobre suas orelhas direitas a cada dois dias desde o oitavo dia após a sensibilização. 10 mg/kg de BM095 foram administrados nas cavidades peritoneais uma vez por semana desde o dia anterior à sen- sibilização no grupo para avaliação do efeito preventivo de BM095 ou desde o 20° dia após o início da indução no grupo para avaliação do efeito terapêu- tico de BM095. O edema do pavilhão auricular foi avaliado medindo seqüen- cialmente a espessura da orelha direita usando um calibrador de espessura.

Como resultado, um efeito supressor significativo foi encontrado no grupo administrado com anticorpo, como visto na Fig. 4. A expressão de NR 10 humana foi relatada estar aumentada na epiderme espessada de pa- cientes com dermatite atópica (Documento Não-Patente 1). Pavilhões auri- culares dos camundongos do modelo de dermatite crônica descritos acima foram corados imuno-histoquimicamente. Como no caso de humanos, a ex- pressão de NR 10 de camundongo foi observada estar aumentada na epi- derme espessada (Fig. 5; BM095 no qual a região constante foi substituída por aquela de IgG humana foi preparado no Exemplo 3 e usado na colora- ção imuno-histoquímica. Porções coradas em marrom são sítios de expres- são de NR 10). Esses achados sugerem que NR 10 está similarmente en- volvida nas doenças inflamatórias em humanos e em camundongos.

[Exemplo 6] Avaliação de eficácia de fármacos usando modelo de artrite induzida por colágeno (reumatismo)

Preparação de camundongos modelo e avaliação da eficácia de fármacos foram obtidas pelo procedimento descrito abaixo. 140 μl de gel de colágeno, o qual foi preparado por combinar quantidades iguais de Adjuvante Completo H37Ra e 0,3% de colágeno tipo II derivado de articulação de bovinos, foram administrados intracutaneamente a camundongos DBA/1JN de 9 semanas de idade na ponta da cauda (Dia 0; sensibilização). Após três semanas, o gel de colágeno preparado pelo mes- mo procedimento foi administrado intracutaneamente no dorso para induzir o início da artrite (Dia 21; indução). De acordo com os pesos corporais dois dias antes da sensibilização (Dia -2), 16 camundongos foram divididos em dois grupos, cada um incluindo 8 camundongos, para estabelecer um grupo administrado com meio e um grupo administrado com BM095. Usando como um meio 20 mmol/l de tampão de acetato (pH 5,5) (200 mmol/l de NaCI) dilu- ído 6 vezes com PBS, a substância de teste BM095 foi administrada intrave- nosamente aos 8 camundongos do grupo administrado com BM095 na dose de 10 mg/ kg de peso no dia antes da administração (Dia 1). Entretanto, o mesmo volume do meio por unidade de peso corporal foi administrada aos 8 camundongos no grupo administrado com meio como um grupo de controle no Dia 1. O edema nos quatro membros foi observado e avaliado por esco- res (em escala de 0 a 4 para cada membro: escore total 16) desde o dia an- tes da indução (Dia 20) em intervalos de 2 a 3 dias.

Como um resultado, o escore para edema nos quatros membros foi visto diminuir após o Dia 20 no grupo administrado com BM095 como vis- to na Fig. 6. Isso sugere que BM095 tem o efeito de suprimir o início da artri- te.

[Exemplo 7] Avaliação da eficácia de fármacos usando modelo de artrite in- duzida por colagenase (osteoartrite)

Preparação de camundongos modelo e avaliação da eficácia de fármacos foram obtidas pelo procedimento descrito abaixo.

Um meio de controle (tampão de acetato a 20 mmol/l (pH 5,5) diluído 6 vezes com PBS, NaCl a 200 mmol/l (n=5)), BM095 a 2 mg/kg (n=5), e 20 mg/kg BM095 (n=6) foram administrados (5 ml/kg) intravenosamente nas veias caudais de machos de 8 semanas de idade C57BL/6J Jcl (CLEA Japan Inc.). A seguir, 6 μl de solução de colagenase a 1,5% (Tipo II; Sigma) filtrada através de filtro de 0,45 μm (MILLIPORE) foram administrados nas cavidades das articulações do joelho sob anestesia com inalação de 3% de isoflurano (Am J Pathol 1989; 135(6): 1001-14).

Os comprimentos das articulações direita e esquerda foram de- terminados usando compassos de calibre (Mitsutoyo CO.) imediatamente antes da administração de colagenase e 3, 7, e 14 dias após a administra- ção de colagenase para calcular a diferença entre a direita e esquerda. A diferença foi definida como um valor representativo para o edema da articu- lação do joelho direito. A área sob a curva (AUC) de transição desta diferen- ça foi determinada com base na regra trapezoidal, e definida como um indi- cador de eficácia do fármaco. O teste de t-Student foi conduzido para a AUC do grupo de controle do meio e do grupo administrado com CNP usando um programa de análise estatística (SAS Institute Inc.) (uma diferença significa- tiva é assumida quando p<0,05). Como um resultado, a AUC do grupo admi- nistrado com BM095 foi significativamente menor do que aquela do grupo do controle com meio, como visto na Fig. 7. Este resultado demonstra que BM095 suprime artrite no modelo de osteoartrite.

[Exemplo 8] Preparação de anticorpo neutralizante anti-NR 10 humana

Camundongos foram imunizados com proteína NR 10 humana (domínio extracelular) {descrita no Exemplo 2}, e hibridomas foram prepara- dos por métodos convencionais. Os sobrenadantes da cultura dos hibrido- mas foram testados quanto a atividade neutralizante usando a linhagem ce- lular dependente de IL-31 humana descrita no Exemplo 1. Múltiplos clones que exibem forte atividade neutralizante de NR 10 foram obtidos (Fig. 8).

[Exemplo 9] Preparação de anticorpo quimérico humano

A seqüência de aminoácido da região variável da cadeia pesada de NA633, que exibiu a atividade mais forte entre os anticorpos neutralizan- tes, é mostrada em SEQ ID NO: 16, e a seqüência de aminoácido da região variável da cadeia leve é mostrada em SEQ ID NO: 17. Além disso, as se- qüências de aminoácido de CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável da ca- deia pesada de NA633 são mostradas em SEQ ID NOs: 18, 19, e 20, res- pectivamente; e as seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável da cadeia leve são mostradas em SEQ ID NOs: 21, 22, e 23, respectivamente.

Alem disso, um anticorpo quimérico que compreende a região variável de camundongo descrita acima e a região constante humana (ca- deia H do tipo IgGI; cadeia L tipo κ) foi preparada por um método conven- cional, e a atividade de neutralização foi determinada. Como mostrado na Fig. 9, o anticorpo quimérico NA633 exibiu forte atividade neutralizante em baixas concentrações.

[Exemplo 10] Isolamento de NR 10 de macaco cinomolgo

Os inventores tentaram isolar o gene de NR 10 de macaco ci- nomolgo, porque a reatividade cruzada e a atividade neutralizante a NR 10 de macaco cinomolgo foram tidas como importantes na avaliação da segu- rança na etapa pré-clínica. Os iniciadores foram desenhados com base na informação genômica de macaco Rhesus descrita e semelhantes, e o gene NR 10 foi amplificado com sucesso a partir de órgãos de macacos cinomol- gos por PCR. Um alinhamento das seqüências de aminoácido de NR 10 humana e NR 10 de macaco cinomolgo isolada é mostrado na Fig. 10. A se- qüência de aminoácido de NR 10 de macaco cinomolgo é mostrada em SEQ ID NO: 24. Uma linhagem celular em proliferação de uma foram dependente de IL-31 humana foi estabelecida por introduzir o gene de NR 10 de macaco cinomolgo junto com o gene de OSMR humano em células Ba/F3, conforme descrito no Exemplo 1. A atividade neutralizante do anticorpo quimérico NA633 descrito no Exemplo 9 foi testada usando esta linhagem celular. O resultado demonstrou que o anticorpo também exibiu forte atividade neutrali- zante em macaco cinomolgo (Fig. 11).

[Exemplo de Referência 1] Eficácia farmacológica de BM095 em colite indu- zida por dextran sulfato de sódio (DSS)

O modelo de colite induzida por DSS (J Immunol (2003) 171:5507-5513), que foi relatado como um modelo patológico para doença inflamatória do intestino (IBD) foi preparado para avaliar o efeito de BM095, um anticorpo neutralizante anti-NR 10. Uma solução aquosa de Sal Sódio de Dextran Sulfato (Wako Pure Chemical Industries) a 5% (p/v) foi preparada usando água destilada filtrada e esterilizada com filtro de 0,22 μιτι (Millipore). Camundongos machos Balb/cAnN Crj de 6 semanas de idade (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN) foram deixados beber livremente a solução das garrafas de água por 7 dias. Os pesos corporais foram medidos, e as alterações percentuais no peso em relação aos pesos no primeiro dia da administração de DSS foram usadas como um índice para a eficácia do fár- maco.

Usando este modelo, o anticorpo neutralizante anti-NR 10 de camundongo BM095 foi administrado intravenosamente em uma dose de 10 mg/kg no dia antes da administração de DSS e o peso resultante foi avaliado (n=10) para testar se a condição patológica foi melhorada pela sinalização de IL-31 neutralizante. O grupo (grupo de veículo; n=10) no qual um veículo (uma mistura de tampão de acetato [20 mmol/L de acetato de sódio e 20 mmol/L de cloreto de sódio] e salina tamponada com fosfato [PBS; GIBCO], as quais foram misturadas em uma proporção de volume de 1:5) foi adminis- trado intravenosamente no dia antes da administração de DSS, foi usado como um grupo de controle com veículo. Além disso, o decorrer da alteração percentual do peso em camundongos Balb/cAnN Crj do mesmo sexo e idade (n=1) que aqueles no grupo administrado com DSS também foi investigado para saber o curso de tempo da alteração percentual do peso em camun- dongos normais.

O curso do peso é mostrado na Fig. 12. A administração de DSS reduziu a alteração percentual do peso no grupo Veículo. O curso da altera- ção percentual do peso no grupo administrado com BM095 foi similar àquela no grupo Veículo. Entretanto, quatro e cinco dias após a administração de DSS, a alteração percentual do peso foi significativamente reduzida no grupo de BM095 quando comparado ao grupo Veículo. Estes resultados mostraram que a administração de BM095 não produziu efeito terapêutico sobre colite do modelo.

Foi relatado que a expressão de IL-31 RA está aumentada neste modelo (WO 2004/003140). Os resultados experimentais descritos cima de- monstram que anticorpos que neutralizam a molécula não produzem efeitos terapêuticos sobre colite neste modelo.

[Exemplo de Referência 2] Eficácia farmacológica de BM095 no modelo de dermatite de contato aguda induzida por cloreto de picrila

Para avaliar o efeito do anticorpo neutralizante anti-NR 10 de camundongo BM095, uma Dermatite relatada como um modelo de dermatite aguda de contato (Clin Immunol (2003) 108: 257-262) foi desenvolvida. Esta Dermatite é um resultado de uma reação de hipersensibilidade retardada devido a sensibilização e indução pela aplicação de cloreto de picrila. 50 μΙ_ de uma solução de cloreto de picrila a 7% (Nacalai Tesque, Inc.; etanol: ace- tona = 3:1 (v/v)) foram aplicados sobre a pele abdominal para sensibilizar camundongos fêmeas Balb/cAnN Crj de 8 semanas de idade (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN), e após 5 dias, 20 pL de solução de cloreto de picrila a 1% (acetona: oliva = 1:4 (v/v)) foram aplicados sobre a pele dos pavilhões auriculares do lado direito para fazer surgir uma dermatite de con- tato (Indução). 20 pLde um veículo (acetona: oliva = 1:4 (v/v)) foram aplica- dos sobre pele dos pavilhões auriculares do lado esquerdo dos mesmos ca- mundongos como um controle para avaliar o efeito do veículo sobre a es- pessura do pavilhão auricular. (Grupo positivo; n=6). A espessura das ore- lhas direita e esquerda foram medidas usando um calibrador de espessura Dial Thickness Gauge (OZAKI MFG.) imediatamente antes da indução e 24, 48, e 72 horas após a indução, e a alteração na espessura do pavilhão auri- cular em relação à espessura imediatamente antes da indução foi usada como um índice para a eficácia do fármaco.

O grupo (grupo Negativo; n=6) no qual uma mistura de etanol: acetona (3:1 (v/v)) sem cloreto de picrila foi aplicada na pele abdominal no momento da sensibilização, e após 5 dias, 20 pL de solução de cloreto de picrila a 1% foram aplicados sobre a pele do pavilhão auricular direito e 20 pL de um veículo (acetona: oliva = 1:4 (v/v)) foram aplicados sobre a pele do pavilhão auricular esquerdo foi usado como um grupo de controle para avali- ar o estabelecimento das condições patológicas.

O grupo (grupo BM095; n=6), no qual a dermatite aguda de con- tato foi induzida pelo mesmo método que aquele usado para o grupo Positi- vo descrito acima e a seguir BM095 foi administrado intravenosamente a 10 mg/kg nos dias antes da sensibilização e indução, e o grupo (grupo Veículo; η = 5) no qual no mesmo momento foi administrado um veículo (tampão de acetato [acetato de sódio a 20 mmol/L e cloreto de sódio a 20 mmol/L] e sa- lina fisiológica tamponada com fosfato [PBS; GIBCO], os quais foram combi- nados em uma proporção de volume de 1:5), foi usado para avaliar o efeito da administração de anticorpos anti-NR 10 sobre as condições patológicas no sistema modelo.

As alterações na espessura dos pavilhões auriculares até 72 horas após a indução são mostradas na Fig. 13. O pavilhão auricular foi visto significativamente espessado no grupo Positivo em cada ponto de tempo de 24, 48, e 72 horas após a indução quando comparado com o grupo Negati- vo, sugerindo estabelecimento das condições patológicas. A transição da espessura dos pavilhões auriculares no grupo BM095 foi semelhante ao grupo Veículo, e assim, nenhuma supressão significativa foi descoberta.

Os resultados descritos acima demonstram que a administração de BM095 não produziu efeito terapêutico sobre a dermatite de contato agu- da observada neste modelo.

Aplicabilidade Industrial

A presente invenção fornece novos agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias. Os agentes para prevenir ou tratar doenças in- flamatórias fornecidos pela presente invenção compreendem como um in- grediente ativo um antagonista de NR 10, mais preferivelmente, um anticor- po que tem atividade neutralizante de NR 10.

Terapia anti-citocina baseada em anticorpo monoclonal está a- traindo muita atenção recentemente. Em várias condições patológicas reais, entretanto, tem sido difícil produzir efeitos terapêuticos por bloquear uma única citocina, porque vias compensatórias são ativadas. Além disso, foi difí- cil estimar em que tipo de doenças os efeitos terapêuticos poderiam ser ob- tidos por bloquear a citocina alvo. Sob a circunstância descrita acima, os presente inventores descobriram que anticorpos neutralizantes anti-NR 10 poderiam suprimir significativamente os sintomas em camundongos modelo com dermatite atópica, dermatite crônica, reumatismo, osteoartrite, ou seme- lhantes.

Os presentes inventores também foram bem sucedidos em pre- parar anticorpos neutralizantes de NR 10 humana. Agentes para prevenir ou tratar doenças inflamatórias, as quais compreendem como um ingrediente ativo anticorpos neutralizantes de NR 10, são altamente úteis para aplicação clínica a humanos.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120> PREVENTIVE OR REMEDY FOR INFLAMMATORY DISEASE

<130> C1-A0606P

<150> JP 2006-160096

<151> 2006-06-08

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo

<400> 1

Gln Val Gln

1

Ser Val Lys

Tyr Met His 35

Gly Trp Ile 50

Gln Gly Arg 65

Met Glu Leu

sapiens

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

5 10 15

Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

40 45

Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

55 60

Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

70 75 80

Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Val Val Pro Ala Ala Met Ser Phe Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 2

<211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagaggac 300 gtagtaccag ctgctatgtc attctactac ggtatggacg tctggggccg aggaaccctg 360 gtcaccgtct cgagt 375

<210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Thr Asp Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Asp His 85 90 95

Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105

<210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4

ctgcctgtgc tgactcagcc cccctcggtg tcagtggccc caggacagac ggccaggatt 60

acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa actgtgtact ggtaccagca ggagccaggc 120 caggcccctg tgttggtcgt ctatgatgat accgaccggc ccgcaggaat ccctgagcgc 180 ttctctggcg ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta ctgatcatgg ggttttcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggt 327

<210> 5

<211> 716 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5

Met Trp Thr Leu Ala Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser 1 5 10 15

Leu Ala Val Leu Pro Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr

20 25 30

Phe Asp Arg Asn Leu Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn

35 40 45

Asp Thr Ser Tyr Ile Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn

50 55 60

Tyr Ser Asp Asn Ala Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys

65 70 75 80

Ala Met Pro Pro Asp Ile Cys Ser Val Glu Val Gln Ala Gln Asn Gly

85 90 95

Asp Gly Lys Val Lys Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile 100 105 HO

Ala Lys Thr Glu Pro Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn

115 120 125

Arg Met Phe Gln Ile Gln Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe

130 135 140

Pro Leu Val Cys Met Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp 145 150 155 160

Thr Glu Val Asn Phe Glu Asn Cys Lys Gln Val Cys Asn Leu Thr Gly

165 170 175

Leu Gln Ala Phe Thr Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn

180 185 190

Asp Ser Arg Tyr Trp Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr

195 200 205

Met Glu Glu Val Pro His Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro

210 215 220

Ala Asp Met Asn Gly Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala 225 230 235 240

Arg Gly Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gln Tyr

245 250 255

Phe Ala Glu Asn Ser Thr Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr

260 265 270

Gln Gln Tyr Glu Leu Leu Leu Met Ser Gln Ala His Ser Val Ser Val

275 280 285

Thr Ser Phe Asn Ser Leu Gly Lys Ser Gln Glu Ala Ile Leu Arg Ile

290 295 300

Pro Asp Val His Glu Lys Thr Phe Gln Tyr Ile Lys Ser Met Lys Ala 305 310 315 320

Tyr Ile Ala Glu Pro Leu Leu Val Val Asn Trp Gln Ser Ser Ile Pro

325 330 335

Ala Val Asp Thr Trp Ile Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser

340 345 350

Lys Phe Pro Ala Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Val Thr Asn Trp 355 360 365

Thr Ile Glu Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Xle Ser

370 375 380

Val Tyr Pro Val Leu Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln 385 390 395 400

Ala Tyr Ala Lys Glu Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val

405 410 415

Glu Asn Ile Gly Leu Arg Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro

420 425 430

Lys Ser Ala Arg Asn Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gln

435 440 445

Ala Glu Gly Gly Lys Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu

450 455 460

Gln Cys Asp Leu Glu Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp 465 470 475 480

Val Met Ala Ser Thr Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn

485 490 495

Phe Lys Thr Leu Ser Ile Ser Val Phe Glu Ile Val Leu Leu Thr Ser

500 505 510

Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ser Ile Lys Thr Val Thr Phe

515 520 525

Gly Leu Arg Lys Pro Asn Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val

530 535 540

Pro Asn Pro Ala Glu Ser Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe 545 550 555 560

Lys Lys Ser Asn Met Lys Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asp Thr Glu Asp

565 570 575

Val Val Leu Lys Pro Cys Pro Val Pro Ala Asp Leu Ile Asp Lys Leu

580 585 590

Val Val Asn Phe Glu Asn Phe Leu Glu Val Val Leu Thr Glu Glu Ala

595 600 605

Gly Lys Gly Gln Ala Ser Ile Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr Val 610 615 620

Thr Ser Pro Ser Arg Pro Asp Gly Pro Pro Gly Lys Ser Phe Lys Glu 625 630 635 640

Pro Ser Val Leu Thr Glu Val Ala Ser Glu Asp Ser His Ser Thr Cys

645 650 655

Ser Arg Met Ala Asp Glu Ala Tyr Ser Glu Leu Ala Arg Gln Pro Ser

660 665 670

Ser Ser Cys Gln Ser Pro Gly Leu Ser Pro Pro Arg Glu Asp Gln Ala

675 680 685

Gln Asn Pro Tyr Leu Lys Asn Ser Val Thr Thr Arg Glu Phe Leu Val

690 695 700

His Glu Asn Ile Pro Glu His Ser Lys Gly Glu Val 705 710 715

<210> 6 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp 1 5 10 15

Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg

35 40 45

Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr

50 55 60

Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80

Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe

85 90 95

Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu 100 105 110 Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg

115 120 125

Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys

130 135 140

Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro 145 150 155 160

Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg

165 170 175

Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg

180 185 190

Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr

195 200 205

Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp

210 215 220

Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240

Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly

245 250 255

Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val

260 265 270

Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn

275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu

290 295 300

His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu

325 330 335

Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp

340 345 350

Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser

370 375 380

Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys 385 390 395 400

Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His

405 410 415

Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly

420 425 430

Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys

435 440 445

Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly

450 455 460

Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480

Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser

485 490 495

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser

500 505 510

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe

515 520 525

Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu

530 535 540

Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn 545 550 555 560

Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser

565 570 575

Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu

580 585 590

Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro

595 600 605

Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn 610 615 620 Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly 625 630 635 640

Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser

645 650 655

Ser Cys Pro Thr Ser Ile 660

<210> 7 <211> 732 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220>

<221> TRANSMEM <222> (520) . . (543) <400> 7

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15

Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr

35 40 45

Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys

50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile

85 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr

100 105 110

Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe 115 120 125

Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp

130 135 140

Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160

Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala

165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln

180 185 190

Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser

195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu

210 215 220

Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240

Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly

245 250 255

Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro

260 265 270

Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln

275 280 285

Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser

290 295 300

Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320

Ile Gln Glu Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val

325 330 335

Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val

340 345 350

Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr

355 360 365

Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln 370 375 380

Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400

Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala

405 410 415

Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile

420 425 430

Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly

450 455 460

Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly 465 470 475 480

Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala

485 490 495

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr

500 505 510

Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly

515 520 525

Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys

530 535 540

Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro 545 550 555 560

Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys

565 570 575

Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile

580 585 590

Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu

595 600 605

Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala

610 615 620

Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640

Thr Cys Pro Phe Arg Pro Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu Glu

645 650 655

Leu Pro Val Ser Pro Glu Ile Pro Pro Arg Lys Ser Gln Tyr Leu Arg

660 665 670

Ser Arg Met Pro Glu Gly Thr Arg Pro Glu Ala Lys Glu Gln Leu Leu

675 680 685

Phe Ser Gly Gln Ser Leu Val Pro Asp His Leu Cys Glu Glu Gly Ala

690 695 700

Pro Asn Pro Tyr Leu Lys Asn Ser Val Thr Ala Arg Glu Phe Leu Val 705 710 715 720

Ser Glu Lys Leu Pro Glu His Thr Lys Gly Glu Val 725 730

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> An artificially synthesized peptide seguence <400> 8 Gly Gly Gly Ser 1

<210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 9 Ser Gly Gly Gly 1

<210> 10 <211> 5

<212> PRT

<213> Artificial <22 0>

<223> An artificially synthesized peptide sequence

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> An artificially synthesized peptide sequence

<400> 11

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> An artificially synthesized peptide sequence

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 13

Ser Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 14

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 15

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5

<210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Asp Val Gln Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser 50

Lys Ser Arg Val Ser 65

Leu Gln Leu Asn Ser 85

Ala Pro Met Ile Thr 100

Thr Thr Val Thr Val

115 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

Asp Ile Val Met Thr 1 5

Asp Arg Val Ser Leu 20

Leu His Trp Tyr Gln 35

Lys Tyr Ala Ser Gln 50

Ser Gly Ser Gly Ser 65

Glu Asp Val Gly Val 85

Thr Phe Gly Gly Gly 100

<210> 18 <211> 6 <212> PRT

Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

55 60

Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 70 75 80

Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

90 95

Thr Asp Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 105 110

Ser Ser

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

10 15

Ser Cys Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asp Phe

25 30

Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

40 45

Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

55 60

Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp

90 95

Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 <213> Mus musculus <400> 18

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5

<210> 19

<211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Met Ile Thr Thr Asp Trp Phe Phe Asp Val 15 10

<210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21

Arg Ala Ser His Asp Ile Ser Asp Phe Leu His

1 5 10

<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 22

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 24

<211> 735

<212> PRT

<213> Cynomolgus

<400> 24

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Phe Pro Leu Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15

Gly Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr

35 40 45

Ser Tyr Thr Gln Tyr Thr Ala Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Lys Lys

50 55 60

His Asp Asn Cys Thr Thr Ser Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80

Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile

85 90 95

Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser Asp Met Thr

100 105 110

Cys Trp Arg Leu Glu Asp Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Glu Ile Phe

115 120 125

Ser Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Arg Ile Glu Trp

130 135 140

Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Ala Leu 145 150 155 160 Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala

165 170 175

Lys Asn Arg Lys Asp Thr Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Met Gly Leu Gln

180 185 190

Ala Phe Thr Glu Tyr Val Val Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser

195 200 205

Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu

210 215 220

Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Thr Glu 225 230 235 240

Val Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly

245 250 255

Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Phe Pro

260 265 270

Glu Asn Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Val Asn Thr Thr Asn Gln Gln

275 280 285

Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Tyr Trp Val Ser Met Ile Ser

290 295 300

Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Thr Thr Leu Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320

Ile Gln Glu Lys Ser Phe Arg Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Leu

325 330 335

Ala Glu Asp Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val

340 345 350

Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Met Asp Ser Glu His Pro

355 360 365

Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln

370 375 380

Gln Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400

Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala 405 410 415 Lys Glu Gly Ile Pro Ser Lys Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile

420 425 430

Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly

450 455 460

Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly 465 470 475 480

Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Thr Val Arg Val Met Ala

485 490 495

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Ile Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr

500 505 510

Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly

515 520 525

Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys

530 535 540

Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Ser Val Pro Asn Pro 545 550 555 560

Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp Arg Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys

565 570 575

Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile

580 585 590

Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Ser

595 600 605

Val Val Asn Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Met Phe Thr Asp Glu Ala

610 615 620

Arg Thr Gly Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Glu Tyr Val 625 630 635 640

Thr His Pro Phe Arg Ala Asp Cys Pro Leu Gly Lys Ser Phe Glu Glu

645 650 655

Leu Pro Val Ser Pro Glu Ile Pro Pro Arg Lys Ser Gln Tyr Leu Arg 660 665 670 Ser Arg Met Pro Glu Gly Thr Cys 675 680

Val Ser Gly Gln Ser Leu Glu Ser

690 695

Ala Ala Ala Pro Asn Pro Tyr Leu 705 710

Phe Leu Val Ser Gln Lys Leu Pro 725

Leu Glu Ala Glu Glu Gln Leu Leu 685

Leu Ala Pro Asp His Val Arg Glu 700

Lys Asn Ser Val Thr Thr Arg Glu 715 720

Glu His Thr Lys Gly Glu Val 730 735

Claims

1. Um agente para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, em que o agente compreende um antagonista de NR 10 como um ingredien- te ativo.

2. O agente preventivo ou terapêutico da reivindicação 1 em que o antagonista de NR 10 é um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10.

3. O agente preventivo ou terapêutico da reivindicação 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

4. O agente preventivo ou terapêutico da reivindicação 2, ], em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal que tem atividade neutralizante de NR 10 humana.

5. O agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das rei- vindicações 2 a 4, em que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

6. O agente preventivo ou terapêutico da reivindicação 5, em que o anticorpo recombinante é um anticorpo quimérico, um anticorpo hu- manizado ou um anticorpo humano.

7. O agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das rei- vindicações 2 a 6, em que o agente compreende como um ingrediente ativo um fragmento e/ou um fragmento modificado do anticorpo com atividade neutralizante de NR 10.

8. O agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, em que a doença inflamatória é dermatite atópica.

9. O agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, em que a doença inflamatória é dermatite crônica.

10. O agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a doença inflamatória é reumatismo.

11. 0 agente preventivo ou terapêutico de qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, em que a doença inflamatória é osteoartrite.

12. Um anticorpo que tem atividade neutralizante de NR 10.

13. O anticorpo da reivindicação 12, que é um anticorpo mono- clonal.

14. O anticorpo da reivindicação 12, em que NR 10 é NR 10 hu- mana.

15. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 12 a 14, que é um anticorpo recombinante.

16. O anticorpo da reivindicação 15, em que o anticorpo recom- binante é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticor- po humano.

17. Um fragmento e/ou um fragmento modificado do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 12 a 16.

18. Um método para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, que compreende a etapa de administrar um antagonista de NR 10 a um pa- ciente com uma doença inflamatória.

19. Uso de um antagonista de NR 10 para produzir um agente para prevenir ou tratar uma doença inflamatória.