KR20220091567A - 항-cd45 항체 및 이의 컨쥬게이트 - Google Patents

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마이클 쿠크
샬롯 맥도나
라훌 팔차우두리
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브래들리 알. 피어스
폴 프레드릭 위드붐
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Abstract

인간 CD45에 특이적으로 결합하는 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 및 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)가 개시된다. 상기 항체 및 ADC는 환자로부터 CD45+ 세포를 고갈시키는 방법을 포함하는 치료 방법에 유용하다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은, 예를 들어, CD45+ 암 세포 또는 자가면역 세포의 집단을 고갈시킴으로써 장애를 직접 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은 또한 이식 절차 전에 내인성 CD45+ 세포를 선택적으로 고갈시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식 요법을 위해 환자를 준비시키고 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 개선하는 데 사용될 수 있다.

Description

항-CD45 항체 및 이의 컨쥬게이트
관련 출원
본 출원은 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,137호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,194호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,207호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,288호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,601호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,283호; 2019년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 62/929,347호; 2019년 11월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 62/940,742호; 2020년 2월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/978,147호; 2020년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 63/015,348호; 2020년 6월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 63/046,046호; 2020년 6월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 63/046,164호; 및 2020년 9월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 63/084,903호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 우선권 출원 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2020년 10월 29일에 생성된 상기 ASCII 사본은 2020-10-29_M103034 1525WO_SL_ST25.txt로 명명되며, 크기는 233 킬로바이트이다.
발명의 분야
본원에는 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 항체 약물 컨쥬게이트가 설명된다. 또한, 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)의 투여에 의해 특히 혈액 질병, 대사 장애, 암, 및 자가면역 질병과 같은 다양한 병리를 앓고 있는 환자의 치료가 설명되며, 여기서 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 ADC는 표적 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 또는 다른 유형의 세포) 상의 CD45에 결합할 수 있다.
단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 C(PTPRC)로도 공지된 CD45는 인간에서 PTPRC 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다(Kaplan et al., PNAS 87:7000-7004 (1990)). CD45는 단백질 티로신 포스파타제(PTP) 패밀리의 구성원으로, 이는 세포 성장, 분화, 유사분열 주기 및 종양발생 형질전환을 포함하는 다양한 세포 과정을 조절하는 신호전달 분자를 포함한다. CD45는 세포 외 도메인, 단일 막횡단 세그먼트, 및 2개의 탠덤 세포질내 촉매 도메인을 함유하며, 따라서 수용체 유형 PTP 패밀리에 속한다. CD45는 분화된 조혈 세포(적혈구 및 형질 세포 제외) 상의 다양한 아이소형에 존재하는 타입 I 막횡단 단백질이다(Holmes, Immunology 117:145-55 (2006)). CD45는 T-세포 및 B-세포 항원 수용체 신호전달의 조절자인 것으로 나타났다. 이는 이의 세포 외 도메인(공동-자극의 한 형태)을 통해 항원 수용체 복합체의 성분과 직접 상호작용하거나, 이의 세포질 도메인을 통한 항원 수용체 신호전달에 필요한 다양한 Src 패밀리 키나제를 활성화시킴으로써 기능한다. CD45는 또한 JAK 키나제를 억제하며, 따라서 사이토카인 수용체 신호전달의 음성 조절인자로서 작용한다.
CD45는 조혈 기원인 HSC, 백혈구 및 파골세포를 포함하는 조혈 세포의 표면에 존재한다(Shivtiel et al., J Exp Med 205:2381 (2008)). 인간에서 CD45 내의 결실 돌연변이는 심각한 면역결핍과 관련이 있다. 이는 주로 항원 반응 동안 SFK 활성을 조절하는 데 전형적으로 풍부하고 필요한 T 세포 상의 CD45가 부재하기 때문이다. CD45-결핍(CD45-/-) 마우스 골수는 정상적인 수의 조혈 세포를 함유하지만, 가장 원시적인 HSC의 수는 감소하고, G-CSF에 반응한 이들의 동원은 손상된다. 부분적으로, 이러한 결합은 HSC에 대해 본질적이며; SFK 활성의 CD45-매개 하향조절 없이, 인테그린-매개 부착은 높고 HSC는 줄기 세포 니치(niche)에 남아있을 가능성이 더 높다. CD45-/- HSC는 또한 G-CSF-자극 동원 및 케모카인 CXCL12/SDF-1로의 귀소가 결핍되며, 이는 이식 후 세포 생착에 부정적인 영향을 미친다. 이들 결핍은 SFK 억제제를 보충함으로써 회복될 수 있으며, 이는 이러한 역할이 일반적으로 CD45에 의해 수행됨을 나타낸다. 마찬가지로, CD45-/- 수용자는 또한 정상적인 HSC의 결손된 생착 및 후속 동원을 나타내며, 이는 줄기 세포 니치 및 HSC에서의 CD45의 역할을 나타낸다(Shivtiel et al., J Exp Med 205:2381 (2008)).
의약 분야의 발전에도 불구하고, 특히 특정 혈액 세포의 질병, 대사 장애, 암 및 자가면역 질환과 같은 조혈 시스템의 병리를 치료하기 위한 요구가 남아 있다. 조혈 줄기 세포(HSC)는 유의한 치료 잠재성을 갖지만, 클리닉에서의 사용을 방해하는 한계는 숙주에서 HSC 이식의 생착을 보장하는 것과 관련된 어려움이었다. 특히, 내인성 HSC 상의 세포 표면 항원을 표적화하는 항체를 포함하는 조혈 줄기 세포 요법은 외인성 HSC 이식의 생착을 방해하는 원치 않는 면역자극 및 효과기 기능을 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, HSC 및 백혈구에서 CD45가 발현되므로, 이는 컨디셔닝 요법, 면역 재설정 및 질병 치료를 포함하는 요법의 표적을 제시한다.
세포생물학에서 CD45의 중요한 역할을 고려할 때, 항-CD45 항체 또는 이의 단편이 필요하다. 본원에는 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)가 설명된다. 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)는 조혈 줄기 세포(HSC)에 결합할 수 있으며, 예를 들어, HSC 이식을 위한 컨디셔닝 제제로서 유용하다. 특히, 본원에 설명된 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 ADC는, 예를 들어, 숙주 HSC, 면역 세포(예를 들어, 백혈구) 또는 질병-유발 세포를 특이적으로 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 설명된 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 이의 ADC는 백혈병 또는 림프종을 갖는 환자를 치료하거나, 다발경화증 및 피부경화증과 같은 자가면역 질병을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 설명된 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편, 및 ADC는 이식 후에 이들 세포의 다능성 및 조혈 기능성이 보존되도록 외인성 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구를 충족시킨다.
제1 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (b) SEQ ID NO:12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (c) SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (d) SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (e) SEQ ID NO:42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (f) SEQ ID NO:52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (g) SEQ ID NO:62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (h) SEQ ID NO:72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; (i) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (j) SEQ ID NO:92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:96에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:97에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원에는 SEQ ID NO:119에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:120에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:121에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:123에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (b) SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (c) SEQ ID NO:21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (d) SEQ ID NO:31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (e) SEQ ID NO:41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (f) SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (g) SEQ ID NO:61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (h) SEQ ID NO:71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (i) SEQ ID NO:81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 (j) SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
상기 언급된 양태의 일부 구현예에서, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 Fc 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역의 인간 IgG1 Fc 영역이다.
일부 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 불변 영역을 포함하는 온전한 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG이다. 특정 구현예에서, IgG는 IgG1 또는 IgG4이다.
상기 언급된 양태의 일부 구현예에서, 항체는 불변 영역을 포함하고, 여기서 불변 영역은 L234A, L235A, D265C, H310A 및 H435A(EU 인덱스에 따른 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 불변 영역은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 D265C(EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 분리된 항-CD45 항체는 불변 영역을 포함하고, 여기서 불변 영역은 (a) SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:9에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:10에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:19에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:20에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:29에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:30에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:39에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:40에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (e) SEQ ID NO:49에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:50에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (f) SEQ ID NO:59에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:60에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (g) SEQ ID NO:69에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (h) SEQ ID NO:79에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:80에 제시된 경쇄 아미노산 서열; (i) SEQ ID NO:89에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:90에 제시된 경쇄 아미노산 서열; 또는 (j) SEQ ID NO:99에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:100에 제시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 분리된 항-CD45 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CD45 단편 1(SEQ ID NO:114), CD45 단편 2(SEQ ID NO:115), CD45 단편 3(SEQ ID NO:116), CD45 단편 4(SEQ ID NO:117), 및/또는 CD45 단편 5(SEQ ID NO:118) 내에 위치한 에피토프에서 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 (a) CD45 단편 2 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프, 및 단편 4 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프; (b) CD45 단편 1 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프, 및 CD45 단편 3 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프; 또는 (c) CD45 단편 5 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 (a) 인간 CD45에서 405T, 407K, 419Y, 425K, 481R, 505R 및 509H(SEQ ID NO:113을 참조하여 넘버링됨)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기; 또는 (b) 인간 CD45에서 486R, 493Y 및 502T(SEQ ID NO:113을 참조하여 넘버링됨)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 분리된 항-CD45 항체 또는 항원 결합 부분은 인간 CD45에 특이적으로 결합하고, 시노몰구스 CD45와 교차 반응한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 분리된 항-CD45 항체 또는 항원 결합 부분은 생물층 간섭계(Bio-Layer Interferometry; BLI)에 의해 측정시 1x10-2 내지 1x10-3, 1x10-3 내지 1x10-4, 1x10-4 내지 1x10-5, 1x10-5 내지 1x10-6, 1x10-6 내지 1x10-7, 또는 1x10-7 내지 1x10-8의 해리 속도(KOFF)로 인간 CD45에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 분리된 항-CD45 항체 또는 항원 결합 부분은 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정시 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 인간 CD45에 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
또 다른 양태에서, 인간 환자에서 CD45+ 세포 집단을 고갈시키는 데 사용하기 위한 상기 언급된 양태 중 임의의 양태의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 상기 언급된 양태 중 임의의 양태의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인간 환자에게 투여함으로써 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD45+ 세포는 CD3+, CD19+, CD33+, CD34+ 또는 CD45+/B2M+이다. 다른 구현예에서, CD45+ 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 또 다른 구현예에서, CD45+ 세포는 HSC, T 세포, B 세포 및/또는 골수 세포이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, CD45+ 세포는 환자의 골수 및/또는 환자의 말초 혈액에서 고갈된다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 환자는 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 한다. 상기 양태의 일부 구현예에서, 상기 방법은 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 이식은 동종이형이다. 대안적 구현예에서, 이식은 자가이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 링커를 통해 세포독소에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공하며, 여기서 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 상기 언급된 양태 중 임의의 양태의 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 항체는 항체의 불변 도메인에서 시스테인 잔기에 의해 세포독소에 컨쥬게이션된다. 특정 구현예에서, 시스테인 잔기는 항체의 불변 영역에서 아미노산 치환에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, 아미노산 치환은 D265C 및/또는 V205C(EU 넘버링)이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, ADC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 세포독소는 RNA 중합효소 억제제, DNA 중격제, DNA 알킬화제, DNA 가교제, 단백질 합성을 방해하는 제제, 미세관 동역학을 방해하는 제제, 또는 유사분열 방추를 방해하는 제제이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 세포독소는 아마톡신, 안트라사이클린, 아우리스타틴, 칼리케아마이신, 데부가닌, 디프테리아 독소, 듀오카르마이신, 인돌리노벤조디아제핀(IGN), 인돌리노벤조디아제핀 이량체, 이리노테칸, 메이탄신, 메이탄시노이드, 슈도모나스 외독소 A, 피롤로벤조디아제핀(PBD), 피롤로벤조디아제핀 이량체, 사포린, 및 SN-38로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 세포독소는 RNA 중합효소 억제제이다. 특정 구현예에서, RNA 중합효소 억제제는 아마톡신이다.
일부 구현예에서, ADC는 화학식 Ab-Z-L-Am으로 표현되고, 여기서 Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, L은 링커이고, Z는 화학적 모이어티이고, Am은 아마톡신이다. 특정 구현예에서, Am-L-Z는 하기 화학식 (I)로 표현된다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H, RC 또는 RD이고;
R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RC는 -L-Z이고;
RD는 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
L은 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬렌, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌, 펩티드, 디펩티드, -(C=O)-, 디설파이드, 하이드라존, 또는 이들의 조합이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이고,
여기서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 포함한다.
일부 구현예에서, L-Z는 하기이다:
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
.
일부 구현예에서, ADC는 하기 중 하나로 표현된다:
Figure pct00004
상기 식에서, X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이다.
일부 구현예에서, ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00005
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
다른 구현예에서, ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00006
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
대안적 구현예에서, ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00007
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
다른 구현예에서, ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00008
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00009
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 세포독소는 피롤로벤조디아제핀(PBD)이다. 특정 구현예에서, 세포독소는 PBD 이량체이다. 특정 구현예에서, PBD 이량체는 하기로 표현된다:
Figure pct00010
상기 식에서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 부착 지점을 나타낸다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 링커는 펩티드, 올리고당류, -(CH2)p-, -(CH2CH2O)q-, -(C=O)(CH2)r-, -(C=O)(CH2CH2O)t-, -(NHCH2CH2)u-, -PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB 또는 Ala-PAB 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 p, q, r, t 및 u 각각은 각 발생에 대해 독립적으로 선택되는 1-12로부터의 정수이다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 링커는 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00011
상기 식에서, R1은 CH3 (Ala) 또는 (CH2)3NH(CO)NH2 (Cit)이다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 항-CD45 항체로의 컨쥬게이션 전이고 L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00012
.
특정 구현예에서, R1은 CH3이다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 항-CD45 항체로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 하기 구조를 갖는 테시린이다:
Figure pct00013
.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 ADC는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00014
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, S는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 존재하거나 이에 도입된 황 원자를 나타낸다.
본원에 개시된 ADC의 일부 구현예에서, 세포독소는 인돌리노벤조디아제핀(IGN)이다. 특정 구현예에서, 세포독소는 IGN 이량체 또는 IGN 유사이량체이다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기로 표현되는 IGN 유사이량체이다:
Figure pct00015
상기 식에서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 링커는 디펩티드, 디설파이드, C1-C12 알킬, C=O 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
.
일부 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 결합 부분으로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018
.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 설명된 ADC 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 유효량의 상기 설명된 항-CD45 ADC를 환자에게 투여함으로써 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법이 본원에 제공된다.
상기 양태의 일부 구현예에서, CD45+ 세포는 CD3+, CD19+, CD33+, CD34+ 또는 CD45+/B2M+이다. 특정 구현예에서, CD45+ 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 다른 구현예에서, CD45+ 세포는 HSC, T 세포, B 세포 및/또는 골수 세포이다.
상기 양태의 일부 구현예에서, CD45+ 세포는 환자의 골수 및/또는 환자의 말초 혈액에서 고갈된다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 환자는 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 한다.
상기 양태의 일부 구현예에서, 상기 방법은 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 환자가 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 받기 전에 상기 설명된 ADC를 환자에게 투여함으로써 조혈 줄기 세포(HSC) 이식을 필요로 하는 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키기에 충분한 양으로 상기 설명된 ADC를 인간 환자에게 투여하고; (b) 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 이후 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 이식은 동종이형이다. 다른 구현예에서, 이식은 자가이다.
일부 구현예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식은 ADC의 농도가 환자의 혈액으로부터 실질적으로 제거된 후에 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 조혈 줄기 세포 또는 이의 자손은 조혈 조직에 국소화될 수 있고/있거나 환자에게 조혈 줄기 세포의 이식 후에 조혈을 재확립할 수 있다.
일부 구현예에서, 환자에게 이식시, 조혈 줄기 세포는 거대핵세포, 트롬보사이트, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 골수모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 미세아교세포, 과립구, 단핵구, 파골세포, 항원-제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-림프구 및 B-림프구로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 집단의 회복을 발생시킨다.
일부 구현예에서, 환자는 혈액 질병, 대사 장애, 암 또는 자가면역 장애, 또는 중증 복합 면역결핍 질병(SCID)을 갖는다. 특정 구현예에서, 환자는 암을 갖는다. 특정 구현예에서, 암은 혈액 암이다. 특정 구현예에서, 혈액 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병 또는 다발골수종이다.
특정 구현예에서, 환자는 자가면역 장애를 갖는다. 특정 구현예에서, 자가면역 장애는 다발경화증, 타입 1 당뇨병 또는 피부경화증이다. 다른 구현예에서, 자가면역 장애는 다발경화증, 인간 전신 루푸스, 류마티스 관절염, 염증성 장 질병, 건선 치료, 타입 1 당뇨병, 급성 파종성 뇌척수염, 애디슨병, 전신탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 재생불량빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질병, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 난소염, 발로병, 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 샤가스병, 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 크론병, 반흔성 유사천포창, 복강 스프루-포진 피부염, 저온응집병, CREST 증후군, 데고스병, 원반모양 루푸스, 자율신경기능이상, 자궁내막증, 원발성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 화농땀샘염, 특발성 및/또는 급성 혈소판감소성 자반증, 특발성 폐 섬유증, IgA 신경병증, 간질성 방광염, 청소년 관절염, 가와사키병, 편평태선, 라임병, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 중증근무력증, 신경근긴장증, 간대성 근간대성 증후군, 시신경염, 오드 갑상선염, 보통천포창, 악성 빈혈, 다발연골염, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 담즙성 간경변증, 결절다발동맥염, 다분비성 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 무감마글로불린혈증, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스열, 사코이드증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 타카야수 동맥염, 측두동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 외음부통 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가로, 본 발명은 또한 하기 구현예를 포함한다:
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:23에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:33에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:34에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:36에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:38에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:35에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:42에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:46에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:47에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:48에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:45에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:52에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:53에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:56에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:57에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:58에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:55에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:62에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:63에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:64에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:66에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:65에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:72에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:74에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:76에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:85에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:92에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:93에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:94에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하고, SEQ ID NO:96에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR1, SEQ ID NO:97에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR2, SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 SEQ ID NO:100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체는 온전하다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 단편은 Fab, F(ab')2 및 scFv로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 항체 또는 이의 결합 단편이다.
다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 H435 또는 I235/H310/H435(EU 넘버링)인 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 H435A(EU 넘버링)인 H435 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, Fc 영역은 I235A/H310A/H435A(EU 넘버링)로 제시된 I235/H310/H435 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 IgG, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4이다.
또한, 항-CD45 항체(또는 항원 결합 단편)를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)가 본원에 설명되며, 여기서 항체(또는 CD45 결합 단편)는 링커를 통해 세포독소에 컨쥬게이션된다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 세포독소 RNA 중합효소 억제제에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함한다. 일 구현예에서, RNA 중합효소 억제제는 아마톡신이다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 하기 화학식 (IA)로 표현되는 아마톡신인 세포독소를 포함한다:
Figure pct00019
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H, RC 또는 RD이고;
R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RC는 -L-Z이고;
RD는 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
L은 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬렌, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이고,
여기서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00020
,
Figure pct00021
, 또는
Figure pct00022
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 아마니틴, 예를 들어, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 아마눌린산 및 프로아마눌린인 세포독소를 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 슈도모나스 외독소 A, 데부가닌, 디프테리아 독소, 사포린, 메이탄신, 메이탄시노이드, 아우리스타틴(예를 들어, MMAE 또는 MMAF), 안트라사이클린, 칼리케아마이신, 이리노테칸, SN-38, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노벤조디아제핀 및 인돌리노벤조디아제핀 이량체로 구성된 군으로부터 선택되는 세포독소를 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 벤조디아제핀 모이어티를 포함하는 세포독소를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD45 ADC는 피롤로벤조디아제핀("PBD")을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD45 ADC는 이돌리노벤조디아제핀("IGN")을 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 항체의 Fc 도메인 내의 시스테인 잔기에 의해 독소에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 시스테인 잔기는 항체의 Fc 도메인에서 아미노산 치환에 의해 도입된다. 일 구현예에서, 아미노산 치환은 D265C 및/또는 V205C(EU 넘버링)이다.
특정 구현예에서, 항-CD45 ADC는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는다.
또한, 본 발명에는 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 ADC, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 포함된다.
본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 및 ADC는 이식 전 동종이형 또는 자가 컨디셔닝 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 환자의 치료 방법에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 인간 환자에서 조혈 줄기 세포(HSC)의 집단을 고갈시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 유효량의 본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 또는 ADC를 환자에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식(동종이형 또는 자가)을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 환자는 환자에서 조혈 줄기 세포의 집단을 고갈시키기에 충분한 양의 본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 또는 ADC를 이전에 투여받았다. 특정 구현예에서, 조혈 줄기 세포는 CD45+ 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 또는 ADC는 혈액 질병, 대사 장애, 암, 또는 자가면역 질병, 또는 중증 복합 면역결핍 질병(SCID)을 갖는 인간 환자를 치료하는 데 사용된다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 또는 ADC는 인간 환자에서 백혈병을 치료하기 위해 인간 환자에게 투여된다.
다른 구현예에서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 환자는 환자에서 면역 세포의 집단을 고갈시키기에 충분한 양의 본원에 설명된 항-CD45 항체, 단편 또는 ADC를 이전에 투여받았다. 일 구현예에서, 면역 세포는 CD137+, CD2+ 또는 CD5+ 세포이다. 다른 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다.
도 1은 인간 CD45 또는 시노몰구스 CD45에 대한 결합에 대해 친화성 성숙된 항-CD45 항체 및 이들의 상응하는 모 항체(모 1-4)의 결합을 평가한 시험관 내 결합 검정의 결과를 그래픽으로 도시한다. 모 1은 본원에 설명된 Ab1에 해당한다. 결합은 정제된 인간 CD45 또는 시노몰구스 CD45 엑토도메인과 함께 인큐베이션된 지시된 정제된 IgG(센서-연관)의 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정되었다.
도 2는 REH 세포, 인간 PBMC 세포 및 시노몰구스("cyno") PBMC 세포에 대한 지시된 항-CD45 항체(Ab5 및 Ab7)의 결합을 평가하기 위한 시험관 내 세포 결합 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab5 및 Ab7의 Fc 변이체인 Ab5_D265C_LALA_H435A 및 A7_D265C_LALA_H435A가 본 연구에서 사용되었다. Fc-변형된 영역(D265C LALA H435A)을 갖는 비-표적화 동형 IgG가 대조군으로서 평가되었다.
도 3은 항-CD45 항체 Ab5를 사용한 CD45 에피토프 맵핑 연구의 결과를 도시한다. 표시된 Ab5-에피토프를 둘러싸고 있는 아미노산 서열(SEQ ID NO:115 및 SEQ ID NO:117)을 갖는 CD45 상의 Ab5 상호작용의 개략도가 도시된다. 접촉 잔기는 405T, 407K, 419Y, 425K, 481R, 505R 및 509H로 강조 표시되고, 잔기 번호는 SEQ ID NO:113으로 표시되는 인간 CD45 단편을 지칭한다.
도 4는 인간 CD34+ 골수 세포에서 Ab5로부터 작제된 항-CD45 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)의 내재화를 평가하는 시험관 내 내재화 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab5의 Fc 변이체인 Ab5 D265C.LALA.H435A가 아마톡신(아마톡신 1(AM1))에 컨쥬게이션되어 Ab5-AM1 D265C.LALA.H435A를 형성하였다. 항-CD45 ADC를 수용성이고, 밝고, 감광성이고, pH 반응성인 pHAb 염료에 컨쥬게이션시켰다. 내재화시, 컨쥬게이션된 항체는 산성 엔도좀/리소좀으로 이동할 수 있으며, 여기서 pHAb 염료는 563 nM에서 방출되고 흐름세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 0, 2, 24, 48 또는 72시간 동안 ADC의 포화 농도로 2시간 동안 얼음 상에서 인간 골수 CD34+ 세포가 인큐베이션되었다. 좌측 패널은 시간 경과에 따른 pHAb의 수준을 그래프로 도시한다. 형광단 표지된 항-IgG 분자를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 결합된 표면 hIgG1을 평가하였으며, 이로부터 표면 IgG의 백분율은 우측 패널에 도시된 바와 같이 시간 경과에 따라 계산되었다.
도 5a 및 5b는 Ab4 및 Ab5로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 CD45+ 세포주(Jurkat(급성 T 세포 백혈병 세포주, ATCC No. TIB-152), SKNO-1(급성 골수성 백혈병 세포주 JCRB1170), 및 REH-1(B 세포 비-호지킨 림프종 세포주, ATCC No. CRL-3004))를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 세포주 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab4 및 Ab5의 Fc 변이체인 Ab4 D265C.LALA.H435A 및 Ab5 D265C.LALA.H435A를 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2))에 컨쥬게이션시켜 Ab4-AM2 D265C.LALA.H435A("Ab4-AM2") 및 Ab5-AM1 D265C.LALA.H435A("Ab5-AM1")를 형성시켰다. 도 5a에서, SKNO1, Jurkat, REH(CD45+) 또는 REH(CD45-/-) 세포주는 Ab5-AM1 또는 대조군, 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM1")의 존재하에서 7일 동안 배양되었고, 세포 생존율은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 발광(y-축)에 의해 측정되었다. 도 5b에서, SKNO1, Jurkat 또는 REH(CD45+) 세포주는 Ab4-AM2 또는 대조군, 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM2")의 존재하에서 7일 동안 배양되었고, 세포 생존율은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 발광(y-축)을 기초로 하여 측정되었다.
도 6a-6c는 Ab2, Ab4 또는 Ab5로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 일차 인간 또는 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 조혈 줄기 세포(HSC)를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 일차 세포 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab2, Ab4 및 Ab5의 Fc 변이체인 Ab2 D265C.LALA.H435A, Ab4 D265C.LALA.H435A, Ab5 D265C.LALA.H435A는 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2))에 컨쥬게이션되어 Ab2-AM2 D265C.LALA.H435A("Ab2-AM2"), Ab4-AM2 D265C.LALA.H435A("Ab4-AM2") 및 Ab5-AM1 D265C.LALA.H435A("Ab5-AM1")를 형성하였다. 도 6a에서, 인간 PBMC는 CD45-AM 컨쥬게이트(Ab5-AM1) 또는 대조군인 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM1")의 존재하에서 7일 동안 배양되었고, 세포 생존력(y-축)은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 측정되었다. 도 76b 및 도 6c에서, 일차 인간 CD34+ 골수 세포는 항-CD45-ADC(도 6b에서 Ab5-AM1; 도 6c에서 Ab2-AM2 또는 Ab4-AM2) 또는 동형-AM과 함께 5일 동안 배양되었고, 살아 있는 CD34+CD90+ HSC 수(y-축)는 항체 농도(x-축)의 함수로서 흐름세포측정법에 의해 결정되었다.
도 7은 Ab2로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 비-자극(비-분열) 및 자극(분열) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 일차 세포 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab2의 Fc 변이체인 Ab2 D265C.LALA.H435A는 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션되어 Ab2-AM2 D265C.LALA.H435A("Ab2-AM2")를 형성하였다. 자극된 및 비-자극된 PBMC는 CD45-AM 컨쥬게이트(Ab2-AM2) 또는 대조군인 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM2")의 존재하에서 4일 동안 배양되었고, 세포 생존력(y-축)은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 측정되었다.
도 8은 Ab6로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 대식세포를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab6의 Fc 변이체인 Ab6 D265C.LALA.H435A는 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션되어 Ab6-AM1 D265C.LALA.H435A("Ab6-AM1")을 형성하였다. 대식세포는 CD45-AM 컨쥬게이트(Ab6-AM1) 또는 대조군인 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM1")의 존재하에서 6일 동안 배양되었고, 세포 생존율은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 발광(RLU; y-축)으로 측정되었다.
도 9는 인간 혈청(상단 패널) 또는 시노몰구스("cyno") 혈청(하단 패널)에서 Ab5로부터 작제된 항-CD45 ADC의 안정성을 평가하는 혈청 안정성 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab5의 Fc 변이체인 Ab5 D265C.LALA.H435A는 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션되어 Ab5-AM1 D265C.LALA.H435A("Ab5-AM1")을 형성하였다. 이러한 ADC가 혈청에서 안정적인지 결정하기 위해, ADC는 0 또는 72시간 동안 37℃에서 인간 또는 시노몰구스(cyno) 혈청에서 사전 인큐베이션되었고, 그 후 ADC는 REH 세포의 세포 사멸에 대해 평가되었다. REH 세포의 세포 생존율 백분율(y-축)은 혈청-처리된 ADC 농도(x-축)의 함수로서 Cell-titer Glo에 의해 평가되었다.
도 10a-10e는 Ab2, Ab3, Ab5 및 Ab7로부터 작제된 짧은 반감기 항-CD45 ADC가 인간화된 NSG 마우스에서 인간 HSC 및 면역 세포를 선택적으로 고갈시킨다는 것을 제시하는 생체 내 세포 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab2 D265C.LALA.H435A, Ab3 D265C.LALA.H435A, Ab5 D265C.LALA.H435A 및 Ab7 D265C.LALA.H435A(Ab2, Ab3, Ab5 및 Ab7의 Fc 변이체)는 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션되어 Ab2 D265C.LALA.H435A-AM2("Ab2-AM2"), Ab3 D265C.LALA.H435A-AM2("Ab3-AM2"), Ab5 D265C.LALA.H435A-AM1("Ab5-AM1") 및 Ab7 D265C.LALA.H435A-AM1("Ab7-AM1")을 형성하였다. PBS 처리된 마우스는 대조군으로서 평가되었다. 도 10a는 항-CD45-ADC(Ab2-AM2, Ab3-AM2, AbA-AM2)의 투여 후 14일에 마우스에서 기준선에 비한 인간 CD3+ T-세포, CD19+ B-세포 및 CD33+ 골수 세포의 백분율을 제시한다. 도 10b는 항-CD45-ADC(Ab2-AM2 또는 Ab3-AM2)의 투여 후 0, 7 및 14일에 말초 혈액에서 인간 CD45+ 세포의 백분율을 제시한다. 도 10c는 항-CD45-ADC(Ab2-AM2 또는 Ab3-AM2)의 투여 후 14일에 인간화된 NSG 마우스의 골수에서 인간 CD45 세포(좌측 패널) 및 인간 HSC(우측 패널)의 절대 수를 제시한다. 도 10d는 항-CD45 ADC(Ab2-AM2 및 Ab3-AM2)의 투여 후 14일에 인간화된 NSG 마우스의 골수에서 HSC(CD34+ 세포, CD34+ CD38- 및 CD34+ CD117+ 세포)의 백분율 및 절대 수를 그래프로 도시한다. 도 10e는 항-CD45-ADC(Ab5-AM1 또는 Ab7-AM1)의 투여 후 14일에 인간화 NSG 마우스의 말초 혈액에서 인간 CD45 세포의 백분율(기준선에 비함), 골수에서 인간 CD45 세포의 절대 수, 및 골수에서 HSC(CD34+ CD38- 세포)의 절대 수를 그래프로 도시한다.
도 11a 및 11b는 Ab4, Ab5 및 Ab7로부터 작제된 짧은 반감기 항-CD45-아마톡신 ADC가 생체 내에서 비-인간 영장류 HSC 및 면역 세포를 효과적으로 고갈시킨다는 것을 제시하는 생체 내 세포 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시한다. Ab4 D265C.LALA.H435A, Ab5 D265C.LALA.H435A 및 Ab7 D265C.LALA.H435A(Ab4, Ab5 및 Ab7의 Fc 변이체)는 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션되어 Ab4 D265C.LALA.H435A-AM2("Ab4-AM1"), Ab5 D265C.LALA.H435A-AM1("Ab5-AM1") 및 Ab7 D265C.LALA.H435A-AM1("Ab7-AM1")을 형성하였다. 도 11a는 항-CD45 ADC(0.5 mg/kg 또는 2 mg/kg의 Ab5-AM1 또는 Ab7-AM1)의 투여 후 72시간에 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액에서 림프 세포의 절대 수를 그래프로 도시한다. 도 11b는 항-CD45 ADC(1 mg/kg의 Ab4-AM1 또는 0.5 또는 2 mg/kg의 Ab5-AM1)의 투여 후 7일에 시노몰구스 원숭이의 골수에서 백혈구, HSC 및 림프구의 수준을 그래프로 도시한다.
도 12는 Ab4로부터 작제된 짧은 반감기 항-CD45 ADC의 시노몰구스 마카쿠에서 약동학적 분석의 결과를 그래프로 도시한다. Ab4의 Fc 변이체인 Ab4 D265C.LALA.H435A는 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션되어 Ab4 D265C.LALA.H435A-AM1("Ab4-AM1") 및 Ab4 D265C.LALA.H435A-AM2("Ab4-AM2")를 형성하였다. 각각의 ADC의 평균 혈장 약물 농도(y-축)는 시간(x-축) 경과에 따라 모니터링되었다.
도 13은 막 및 세포질 단백질의 혼합물에 대한 실시예 15의 모 클론 A, B 및 C로부터 유래된 인간화 클론의 결합을 평가하는 다중특이적 시약(PSR) 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 14는 인간 PBMC 세포 및 시노몰구스("cyno") PBMC 세포에 대한 항-CD45 항체 AbA, AbB 및 AbC(실시예 15에서 확인됨)의 결합을 평가하기 위한 시험관 내 세포 결합 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 15는 실시예 15에서 확인된 항-CD45 항체 AbA를 사용한 CD45 에피토프 맵핑 연구의 결과를 도시한다. 표시된 AbA 에피토프를 둘러싸는 아미노산 서열(SEQ ID NO:117)을 갖는 CD45 상의 AbA 상호작용 부위의 개략도가 도시된다. 접촉 잔기는 486R, 493Y 및 502T로 강조 표시되고, 잔기 번호는 SEQ ID NO:113에 의해 표시되는 인간 CD45 단편을 지칭한다.
도 16은 인간 CD34+ 골수 세포에서 AbA로부터 작제된 항-CD45 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)의 내재화를 평가하는 시험관 내 내재화 검정의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A는 아마톡신(아마톡신 1)에 컨쥬게이션되어 항-CD45 ADC인 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1을 형성하였다. 항-CD45 ADC를 수용성이고, 밝고, 감광성이고, pH 반응성인 pHAb 염료에 컨쥬게이션시켰다. 내재화시, 컨쥬게이션된 항체는 산성 엔도좀/리소좀으로 이동할 수 있으며, 여기서 pHAb 염료는 563 nM에서 방출되고 흐름세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 0, 2, 24, 48 또는 72시간 동안 ADC의 포화 농도로 2시간 동안 얼음 상에서 인간 골수 CD34+ 세포가 인큐베이션되었다. 좌측 패널은 시간 경과에 따른 pHAb의 수준을 그래프로 도시한다. 형광단 표지된 항-IgG 분자를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 결합된 표면 hIgG1을 평가하였으며, 이로부터 표면 IgG의 백분율은 우측 패널에 도시된 바와 같이 시간 경과에 따라 계산되었다.
도 17a 및 17b는 AbA로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 일차 인간 또는 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 일차 세포 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A는 2개의 아마톡신, 즉, 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2) 중 하나에 컨쥬게이션되어 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 또는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2를 형성하였다. 인간 PBMC는 지시된 CD45-AM 컨쥬게이트(AbA_D265C_LALA-H435A-AM1(도 17a) 또는 AbA_D265C_LALA-H435A-AM2(도 17b)) 또는 대조군인 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM1" 또는 "동형-AM2")의 존재하에서 7일 동안 배양되었고, 세포 생존력(y-축)은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 측정되었다.
도 18은 AbA로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 인간 조혈 줄기 세포(HSC)를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 일차 세포 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A 및 AbA_D265C_LALA_IHH는 아마톡신 1(AM1), 아마톡신 2(AM2) 또는 PBD에 컨쥬게이션되어 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1, AbA_D265C_LALA_H435A-AM2 또는 AbA_D265C_LALA_IHH-PBD를 형성하였다. 일차 인간 CD34+ 골수 세포는 지시된 ADC(AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 및 AbA_D265C_LALA_IHH-PBD) 또는 동형 대조군의 존재하에서 5일 동안 배양되었다. 살아 있는 CD34+CD90+ HSC 수(y-축)는 항체 농도(x-축)의 함수로서 흐름세포측정법에 의해 결정되었다.
도 19는 AbA로부터 작제된 항-CD45 ADC가 시험관 내에서 대식세포를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 제시하는 시험관 내 사멸 검정의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A는 아마톡신(AM1)에 컨쥬게이션되어 CD45 ADC인 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1을 형성하였다. 대식세포는 ADC(AbA_D265C_LALA_H435A-AM1) 또는 대조군인 비-표적화 동형 일치된-ADC("동형-AM1")의 존재하에서 6일 동안 배양되었고, 세포 생존율은 항체 농도(x-축)의 함수로서 Celltiter Glo에 의해 발광(RLU; y-축)으로 측정되었다.
도 20은 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(AbA-PBD)로 처리된 인간화된 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 말초 혈액에서 인간 세포의 고갈이 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형 대조군-PBD("Iso-PBD") 또는 CD45-PBD(AbA-PBD)가 투여되었다. 말초 혈액은 지시된 시점에 수집되었고, 총 인간 조혈 세포 함량(hβ2M+), 골수 세포 함량(CD33+), B 세포 함량(CD19+) 및 T 세포 함량(CD3+)에 대해 평가되었다. 결과는 기준선으로 표준화된 고갈 백분율로 표시된다.
도 21은 항-CD45-ADC(AbA-PBD)로 처리된 인간화된 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 골수에서 인간 세포의 고갈이 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형-PBD 또는 CD45-PBD가 투여되었다. BM 샘플은 처리 후 14일에 수집되었고, 인간 전구 세포/HSC 함량에 대해 평가되었다. 결과는 인간 세포의 백분율 및 절대 수/대퇴골로 제시된다.
도 22는 항-CD45-ADC(AbA-PBD)로 처리된 인간화 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 인간 CD45+ 세포, 이중-양성(DP) 흉선세포, 성숙 CD4+ 단일-양성(SP) 흉선세포 또는 성숙 CD8+ 단일-양성(SP) 흉선세포의 고갈이 처리 후 14일에 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형-PBD 또는 CD45-PBD가 투여되었다.
도 23은 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(AbA-IGN)로 처리된 인간화된 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 말초 혈액에서 인간 세포의 고갈이 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형 대조군-IGN("Iso-IGN") 또는 CD45-IGN(AbA-IGN)이 투여되었다. 말초 혈액은 지시된 시점에 수집되었고, 총 인간 조혈 세포 함량(hβ2M+), 골수 세포 함량(CD33+), B 세포 함량(CD19+) 및 T 세포 함량(CD3+)에 대해 평가되었다. 결과는 기준선으로 표준화된 고갈 백분율로 표시된다.
도 24는 CD45-IGN으로 처리된 인간화된 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 골수에서 인간 세포의 고갈이 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형-IGN 또는 CD45-IGN이 투여되었다. BM 샘플은 처리 후 14일에 수집되었고, 인간 전구 세포/HSC 함량에 대해 평가되었다. 결과는 인간 세포의 백분율 및 절대 수/대퇴골로 제시된다.
도 25는 AbA-IGN으로 처리된 인간화 NSG 마우스에서 생체 내 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 인간 CD45+ 세포, 이중-양성(DP) 흉선세포, 성숙 CD4+ 단일-양성(SP) 흉선세포 또는 성숙 CD8+ 단일-양성(SP) 흉선세포의 고갈이 평가되었다. hNSG 마우스에 지시된 단일 용량의 비히클(PBS), 동형-IGN 또는 AbA-IGN이 투여되었다.
도 26은 AbA로부터 작제된 항-CD45-아마톡신 ADC가 생체 내에서 비-인간 영장류 HSC 및 면역 세포를 효과적으로 고갈시켰음을 제시하는 생체 내 세포 고갈 검정의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A(Fc 영역의 변형은 반감기를 감소시키기 위해 도입되었음)는 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션되어 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1("CD45 ADC-AM1") 또는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2("CD45 ADC-AM2")를 형성하였다. 시노몰구스 원숭이의 골수에서 백혈구, HSC 및 면역 세포(B-세포, T-세포 및 골수 세포)의 수준은 지시된 ADC의 단일 1 mg/kg 주사의 투여 후 지시된 시간(6일, 14일, 20일 및 28일)에서 측정되었다.
도 27은 AbA로부터 작제된 항-CD45 ADC의 시노몰구스 마카쿠에서 약동학적 분석의 결과를 그래프로 도시한다. AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A(Fc 영역의 변형이 반감기를 감소시키기 위해 도입되었음)는 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션되어 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1("CD45 ADC-AM1") 또는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2("CD45 ADC-AM2")를 형성하였다. 각각의 ADC의 평균 혈장 약물 농도(y-축)는 시간(x-축) 경과에 따라 모니터링되었다.
도 28은 AbA-AM ADC의 단일 용량이 환자-유래 종양에 대해 세포환원성이고 치료되지 않은 질병 및 불응성 질병을 모방하기 위해 모델 패널에 걸쳐 치료 표준을 넘어서는 생존을 연장한다는 것을 도시한다. 무한증식화된 세포주(REH-Luc)의 세포주 유래 ALL 모델과 함께 AML[AML #1(치료 나이브 환자로부터 유래됨), AML #2(동종이형 HSCT 후 과하게 전처리된 재발 불응성 환자로부터 유래됨)] 및 T-ALL(DHAP 화학요법 후 진행중인 환자로부터 유래됨)의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 면역 결핍 마우스(NSG-SGM3 또는 NSG)에 전신 접종되었다. PDX의 말초 종양 부담(n=3-5/그룹), 및 CDX 마우스가 말초 혈액에서 또는 REH-luc 모델(n=10/그룹)에 대해 이식 후 5일에 2-16% 모세포에 도달한 경우에 치료가 시작되었다. 항-CD45-ADC(1, 3, 6 또는 10 mg/kg)의 단일 용량은 비히클(PBS) 또는 동형-AM(6 또는 10 mg/kg)과 비교되었고, Ara-c(30 mg/kg QDx5, IV), 덱사메타손(5 mg/kg Q3Dx9, IP) 또는 독소루비신(3 mg/kg QWx3, IV)의 임상적으로 검증된 치료 표준 요법과 동등하였다. 연구 과정에 걸친 종양 부담이 제시된다.
도 29a-29c는 짧은 반감기 CD45-ADC(AbA-AM)가 REH-루시페라제 ALL 이종이식 모델에서 중앙값 생존을 증가시킨다는 것을 제시하는 생체 내 뮤린 연구의 결과를 그래프로 도시한다. 도 29a는 표시된 처리 그룹에서 마우스에 대한 이식 후 일수의 함수로서 생존 백분율을 그래프로 도시한다. 도 29b는 지시된 처리 그룹에서 연구의 시간 경과에 걸친 REH-루시페라제에서의 발광 수준(평균±SEM)을 그래프로 도시한다. 도 29c는 모든 처리 그룹에 대해 이식 후 22-23일에 포착된 대표적인 생물발광 신호 유사 컬러 이미지이다.
도 30a 및 30b는 짧은 반감기 CD45-ADC(AbA-AM)가 T-ALL PDX 모델에서 종양 성장 지연을 발생시키는 말초 백혈병 세포를 감소시킨다는 것을 제시하는 생체 내 뮤린 연구의 결과를 그래프로 도시한다. 도 30a는 표시된 처리 그룹에서 마우스에 대한 이식 후 일수의 함수로서 생존 백분율을 그래프로 도시한다. 도 30b는 지시된 각각의 처리 그룹에서 마우스에 대한 이식 후 일수의 함수로서 말초 혈액에서 종양 부담 백분율(hCD45+)을 그래프로 도시한다.
도 31a-31d는 짧은 반감기 CD45-DC(AbA-AM)가 2개의 환자 유래 AML 모델에서 인간 백혈병 세포를 효과적으로 고갈시킨다는 것을 제시하는 생체 내 뮤린 연구의 결과를 그래프로 도시한다. 도 31a 및 31b는 지시된 처리 그룹에서 PDX 모델 AML #1 마우스(도 31a) 또는 PDX 모델 AML #2 마우스(도 31b)에 대한 이식 후 일수의 함수로서 생존 백분율을 그래프로 도시한다. 각각의 도 31a 및 31b의 삽입물은 질병에 걸린 마우스로부터의 비장세포에 대한 CD117 및 CD45 세포 표면 발현을 평가하기 위한 각각의 AML PDX 모델의 흐름세포측정법 분석을 도시한다. 도 31c 및 31d는 각각의 지시된 처리 그룹에서 PDX 모델 AML #1 마우스(도 31c) 및 PDX 모델 AML #2 마우스(도 31d)에 대한 이식 후 일수의 함수로서 말초 혈액에서의 종양 부담 백분율(hCD45+)을 그래프로 도시한다.
도 32는 항-CD45 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab7의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 다중 서열 정렬을 도시한다. 각각의 가변 영역의 CDR은 굵은 글씨로 표시된다.
예를 들어, 인간 CD45와 비-인간 영장류 CD45 사이에서 교차 반응하기 때문에 유용한 신규 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 및 컨쥬게이트(예를 들어, 항체 약물 컨쥬게이트; ADC)가 본원에 개시된다. 추가로, 본원에 설명된 항-CD45 항체 및 이의 단편은 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 백혈병 및 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CD45+ 세포의 고갈이 유익한 상태를 갖는 환자뿐만 아니라 다발경화증 및 피부경화증과 같은 자가면역 질병을 갖는 환자를 치료하기 위해 항-CD45 항체, 이의 단편 및 항-CD45 ADC가 사용될 수 있다. 또한, 본원에 포함된 항-조혈 세포 항체(항-CD45 항체)는 조혈 줄기 세포 요법에 유용하다. 예를 들어, 본원의 항체 또는 ADC는 환자가 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 받기 위해 준비되는 컨디셔닝 절차에 유용하다. 상기 절차는 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 촉진한다. 본원에 설명된 방법에 따르면, 환자는 CD45(예를 들어, 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 성숙 면역 세포(예를 들어, T 세포)에 의해 발현된 CD45)에 결합할 수 있는 항-CD45 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 환자로의 투여에 의해 조혈 줄기 세포 이식 요법을 위해 컨디셔닝될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 항-CD45 항체는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 형성하기 위해 세포독소에 공유적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 조혈 줄기 세포 이식 요법을 필요로 하는 환자에게 CD45에 결합할 수 있는 ADC의 투여는, 예를 들어, 내인성 조혈 줄기 세포를 선택적으로 고갈시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진할 수 있고, 이에 의해 외인성 조혈 줄기 세포 이식에 의해 채워진 빈 공간을 생성할 수 있다.
이어지는 섹션은 독특한 특성, 예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 CD45 둘 모두와의 교차 반응성을 갖는 신규한 항-CD45 항체 및 이의 단편을 제공한다. 다음 섹션은 또한 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진하기 위해 암 또는 자가면역 질병을 앓고 있는 환자, 또는 조혈 줄기 세포 이식 요법이 필요한 환자와 같은 환자에 투여될 수 있는 항-CD45 항체 또는 이의 컨쥬게이트뿐만 아니라 상기 치료제를 환자에 투여(예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식 전)하는 방법의 설명을 제공한다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "약"은 설명된 값보다 위 또는 아래의 5% 이내인 값을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "약 100 nM"은 95-105 nM의 범위를 나타낸다.
이식과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "동종이형"은 공여자로부터 수용자에게 이식되는 이식(예를 들어, 세포, 조직 또는 장기 이식)을 정의하는 데 사용되며, 여기서 수용자는 공여자에 비해 동일 종의 상이한 개체이다.
이식과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "자가"는 공여자 및 수용자가 동일한 개체, 즉, 동일한 대상체인 이식을 지칭한다.
이식과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "이종성"은 공여자 및 수용자가 상이한 종인 이식을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 조혈 기원이고 면역 반응에서 역할을 하는 세포를 포함하는 것으로 의도되지만 이에 제한되지는 않는다. 면역 세포는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 자연 살해 세포는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 일 구현예에서, 자연 살해 세포는 NK-92 세포와 같은 세포주를 포함한다. NK 세포주의 추가 예는 NKG, YT, NK-YS, HANK-1, YTS 세포 및 NKL 세포를 포함한다. 면역 세포는 동종이형 또는 자가일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 이와 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 항체는 항원 결합 영역을 함유하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 언급되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 언급되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포)와 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체 단편은, 예를 들어, Fab, F(ab')2, scFv, 디아바디, 트리아바디, 어피바디, 나노바디, 압타머 또는 도메인 항체일 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 단편"에 포함된 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 함유하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함하는 dAb; (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(예를 들어, 문헌[Ward et al., Nature 341:544-546, 1989] 참조); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb; (viii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (ix) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 분리된 CDR의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되나, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988] 참조)을 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조되는 것을 가능하게 하는 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 획득될 수 있고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기술, 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단, 또는 특정 경우에, 당 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성 절차에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 "온전한" 또는 "전장" 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 폴리펩티드 및 2개의 경쇄(L) 폴리펩티드를 갖는 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 독소는 본원에 설명된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 갖는 온전한 항-CD45 항체에 컨쥬게이션될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 이용 가능하거나 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하며, 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 본 발명의 개시에 유용한 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당 분야에 공지된 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "IgG Fc 도메인"은 IgG 분자의 파파인 분해에 의해 획득된 결정화 가능한 단편과 관련되는 면역글로불린, 예를 들어, IgG 분자의 부분을 지칭한다. Fc 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결된 IgG 분자의 2개 중쇄의 C-말단 절반을 포함한다. 이는 항원 결합 활성을 갖지 않지만 FcRn 수용체를 포함하는 보체 및 Fc 수용체에 대한 탄수화물 모이어티 및 결합 부위를 함유한다(하기 참조). 예를 들어, Fc 도메인은 전체 제2 불변 도메인 CH2(IgG1의 EU 위치 231-340의 잔기) 및 제3 불변 도메인 CH3(인간 IgG1의 EU 위치 341-447의 잔기)를 함유한다. 본원에서 사용되는 Fc 도메인은 "하부 힌지 영역"(IgG1의 EU 위치 233-239의 잔기)을 포함한다.
Fc는 분리된 상기 영역, 또는 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질의 맥락에서 상기 영역을 지칭할 수 있다. EU 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하나 이에 제한되지는 않는 Fc 도메인의 다수의 위치에서 다형성이 관찰되었으며, 이에 따라 본 출원에 제시된 서열과 당 분야에 공지된 서열 사이의 약간의 차이가 존재할 수 있다. 따라서, "야생형 IgG Fc 도메인" 또는 "WT IgG Fc 도메인"은 임의의 천연 발생 IgG 영역(즉, 임의의 대립유전자)을 지칭한다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄의 서열은 다수의 서열 데이터베이스, 예를 들어, 각각 등록 번호 P01857(IGHG1_HUMAN), P01859(IGHG2_HUMAN), P01860(IGHG3_HUMAN) 및 P01861(IGHG1_HUMAN)로 Uniprot 데이터베이스(www.uniprot.org)에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 Fc 영역" 또는 "변이체 Fc 영역"은 Fc 도메인 내의 임의의 위치에 도입된 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 변형을 포함하는 IgG Fc 도메인을 지칭한다. 특정 양태에서, 변이체 IgG Fc 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하지 않는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 Fc 감마 R 및/또는 C1q에 대한 결합 친화성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 또한, Fc 결합 상호작용은 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 효과기 기능 및 다운스트림 신호전달 이벤트에 필수적이다. 따라서, 특정 양태에서, 변이체 Fc 도메인(예를 들어, 항체, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트)을 포함하는 항체는 달리 동일한 아미노산을 갖지만 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는, 예를 들어, Fc 영역의 상응하는 위치에 천연 발생 아미노산 잔기를 함유하는 변형되지 않은 Fc 영역과 같은 변형을 포함하는 상응하는 항체에 비해 적어도 하나 이상의 Fc 리간드(예를 들어, Fc 감마 Rs)에 대한 변경된 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
변이체 Fc 도메인은 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. Fc 영역과 관련하여 본원에서 논의된 모든 아미노산 치환에 대해, 넘버링은 항상 케이뱃(Kabat)에서와 같이 EU 인덱스를 따른다. 따라서, 예를 들어, D265C는 모 Fc 도메인에 비해 EU 위치 265의 아스파르트산(D)이 시스테인(C)으로 치환된 Fc 변이체이다. 치환이 제공되는 순서는 임의적임을 주목한다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 감마 수용체" 또는 "Fc 감마 R"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 Fc감마R 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 지칭한다. 인간에서, 이러한 패밀리는 Fc감마RI(CD64), 예를 들어, 아이소형 Fc감마RIa, Fc감마RIb 및 Fc감마RIc; Fc감마RII(CD32), 예를 들어, 아이소형 Fc감마RIIa(동종이형 H131 및 R131을 포함함), Fc감마RIIb(Fc감마RIIb-1 및 Fc감마RIIb-2를 포함함) 및 Fc감마RIIc; 및 Fc감마RIII(CD16), 예를 들어, 아이소형 Fc감마RIIIa(동종이형 V158 및 F158을 포함함) 및 Fc감마RIIIb(동종이형 Fc감마RIIIb-NA1 및 Fc감마RIIIb-NA2를 포함함)뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 인간 Fc감마Rs 또는 Fc감마R 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Fc감마R은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 Fc감마R은 Fc감마RI(CD64), Fc감마RII(CD32), Fc감마RIII(CD16) 및 Fc감마RIII-2(CD16-2)뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 마우스 Fc감마Rs 또는 Fc감마R 아이소형 또는 동종이형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 기능"은 Fc 도메인과 Fc 수용체의 상호작용으로부터 발생하는 생화학적 사건을 지칭한다. 효과기 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 "효과기 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 효과기 기능을 매개하는 면역계의 세포를 의미한다. 효과기 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 감마-델타 T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "침묵", "침묵된" 또는 "침묵하는"은 Fc 감마 수용체(FcγR)에 대한 변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체의 결합에 비해 FcγR에 대한 감소된 결합(예를 들어, BLI에 의해 측정된 FcγR에 대한 변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체의 결합에 비해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%만큼의 FcγR에 대한 결합에서의 감소)을 갖는 본원에 설명된 변형된 Fc 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, Fc 침묵된 항체는 FcγR에 대한 검출 가능한 결합을 갖지 않는다. FcγR에 대한 변형된 Fc 영역을 갖는 항체의 결합은 당 분야에 공지된 다양한 기술, 비제한적인 예로, 평형화 방법(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008; 또는 방사면역측정법(RIA)) 또는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 다른 메커니즘의 동역학 기반 검정(예를 들어, BIACORE.RTM. 분석 또는 Octet™ 분석(forteBIO)), 및 다른 방법, 예를 들어, 간접 결합 검정, 경쟁적 결합 검정, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)를 사용하여 결정될 수 있다. 이들 및 다른 방법은 검사되는 하나 이상의 성분에 대한 표지를 이용하고/하거나 발색성, 형광성, 발광성 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화성 및 동역학에 대한 상세한 설명은 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘 문헌[Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾을 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재하에 표지된 항원과 관심 항체의 인큐베이션, 및 표지된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사성 면역 검정이다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화성 및 결합 오프-레이트는 스캐처드 플롯 분석에 의해 데이터로부터 결정될 수 있다. 이차 항체와의 경쟁은 또한 방사성 면역 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 경우, 항원은 증가하는 양의 표지되지 않은 제2 항체의 존재하에 표지된 화합물에 컨쥬게이션된 관심 항체와 함께 인큐베이션된다.
본원에서 사용되는 용어 "변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 동일한 항체"는 언급된 아미노산 치환이 결여되지만, 그렇지 않으면 비교되는 Fc 변형된 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체(예를 들어, D265C, H435A)를 지칭한다.
용어 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 항체가 특정 세포독성 세포(예를 들어, 주로 NK 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 세포독성 형태를 지칭하며, 이는 이들 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 "표적 세포"에 특이적으로 결합하고 후속적으로 세포독소로 표적 세포를 사멸시키는 것을 가능하게 한다(Hogarth et al., Nature review Drug Discovery 2012, 11:313). 항체 및 이의 단편에 더하여, 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 Fc 도메인, 예를 들어, Fc 융합 단백질 및 Fc 컨쥬게이트 단백질을 포함하는 다른 폴리펩티드는 세포-매개 세포독성에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다.
간단하게 하기 위해, Fc 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 활성으로 인한 세포-매개 세포독성은 또한 본원에서 ADCC 활성으로 지칭된다. ADCC에 의한 표적 세포의 용해를 매개하는 본 발명의 개시의 임의의 특정 폴리펩티드의 능력이 검정될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위해, 관심 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 면역 효과기 세포와 조합하여 표적 세포에 첨가하여 표적 세포의 세포용해를 발생시킨다. 세포용해는 일반적으로 용해된 세포로부터 표지(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포 내 단백질)의 방출에 의해 검출된다. 상기 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 시험관 내 ADCC 검정의 특정 예는 문헌[Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351 (1987); Wilkinson et al., J. Immunol. Methods 258:183 (2001); Patel et al., J. Immunol. Methods 184:29 (1995)]에 설명되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 항체의 ADCC 활성은 생체 내, 예를 들어, 문헌[Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "컨디션" 및 "컨디셔닝"은 환자가 이식, 예를 들어, 조혈 줄기 세포를 함유하는 이식을 받기 위해 준비되는 과정을 지칭한다. 상기 절차는 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 촉진한다(예를 들어, 컨디셔닝 절차 및 후속 조혈 줄기 세포 이식 후 환자로부터 분리된 혈액 샘플 내의 생존 가능한 조혈 줄기 세포의 양의 지속적인 증가로부터 추론됨). 본원에 설명된 방법에 따르면, 환자는 조혈 줄기 세포에 의해 발현된 CD45에 결합할 수 있는 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여함으로써 조혈 줄기 세포 이식 요법을 위해 컨디셔닝될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 항체는 약물-항체 컨쥬게이트를 형성하기 위해 세포독소에 공유적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 조혈 줄기 세포 이식 요법을 필요로 하는 환자에게 상기 항원에 결합할 수 있는 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC의 투여는, 예를 들어, 내인성 조혈 줄기 세포를 선택적으로 고갈시키고 이에 의해 외인성 조혈 줄기 세포 이식에 의해 채워진 빈 공간을 생성시킴으로써 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 환자에서 질병 또는 장애의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 개선시키거나, 감소시키는 맥락에서 원하는 결과를 달성하기에 충분한 치료제, 예를 들어, 항-CD45 ADC의 양을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 ADC의 치료적 유효량은 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 감소시키거나 고갈시키기에 충분한 양이다. 다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 ADC의 치료적 유효량은 조혈 줄기 세포 이식을 받기 위해 환자를 컨디셔닝하기에 충분한 양이다. 상기 구현예에서, 치료적 유효량은, 예를 들어, 환자로부터 내인성 조혈 줄기 세포를 선택적으로 고갈시키기에 충분한 양, 및/또는 환자에서 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 촉진하기에 충분한 양일 수 있다. 다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 ADC의 치료적 유효량은 인간 환자에서 자가면역 질병 또는 암에 영향을 미치기에 충분한 양이다.
본원에서 사용되는 용어 "반감기"는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에서 체내 항체 약물의 혈장 농도가 절반 또는 50%만큼 감소되는 데 걸리는 시간을 지칭한다. 혈청 농도의 이러한 50% 감소는 순환하는 약물의 양을 반영한다.
본원에서 사용되는 어구 "혈액으로부터 실질적으로 청소된"은 환자로부터 분리된 혈액 샘플에서 치료제의 농도가 통상적인 수단에 의해 검출될 수 없는 정도인 경우(예를 들어, 치료제를 검출하는 데 사용되는 장치 또는 검정의 노이즈 임계값 이상으로 치료제가 검출될 수 없는 경우) 환자로의 치료제(예를 들어, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 투여 후 시점을 지칭한다. 당 분야에 공지된 다양한 기술, 예를 들어, 당 분야에 공지되거나 본원에 설명된 ELISA-기반 검출 검정을 사용하여 항체, 또는 항체 단편을 검출할 수 있다. 항체 또는 항체 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있는 추가 검정은 당 분야에 공지된 것들 중에서 면역침전 기술 및 면역블롯 검정을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "특정 결합" 또는 "특이적 결합"은 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조(에피토프)를 인식하고 이에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 자유의 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다. 예를 들어, 항체가 표지되는 경우 상응하는 표지되지 않은 항체에 의해 이의 표적으로부터 떨어져 경쟁될 수 있는 경우 항체는 표적에 "특이적으로 결합"한다. 일 구현예에서, 항체는, 항체가 적어도 약 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M 또는 그 미만(미만은 10-12 미만, 예를 들어, 10-13의 수를 의미함)의 표적에 대한 KD를 갖는 경우, 표적, 예를 들어, CD45에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CD45에 특이적으로 결합하는" 또는 "CD45에 특이적으로 결합한다"는 CD45에 결합하고 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같은 1.0 x 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, KD(M)는 표준 생물층 간섭계(BLI)에 따라 결정된다. 일 구현예에서, Koff(1/s)는 표준 생물층 간섭계(BLI)에 따라 결정된다. 그러나, 항체는 서열에서 관련된 2개 이상의 항원에 특이적으로 결합할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항체는 CD45의 인간 및 비-인간(예를 들어, 마우스, 시노몰구스 또는 비-인간 영장류) 오솔로그 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간 CD45에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 CD45(및 가능하게는 하나 이상의 비-인간 종, 예를 들어, 시노몰구스로부터의 CD45)에 결합하지만 비-CD45 단백질에 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 항체는 1x10-7 M 이하의 KD, 5x10-8 M 이하의 KD, 3x10-8 M 이하의 KD, 1x10-8 M 이하의 KD 또는 5x10-9 M 이하의 KD로 인간 CD45에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체가 불변 영역을 함유하는 구현예에서, 불변 영역은 마찬가지로 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 유전자 재배열 동안 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 인간 항체는 인간 세포(예를 들어, 재조합 발현에 의함)에서 또는 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자를 발현할 수 있는 비-인간 동물 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 의해 도입될 수 있다. 인간 항체가 단일쇄 항체인 경우, 이는 고유한 인간 항체에서 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv는 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 연결시키는 링커 펩티드, 예를 들어, 2 내지 약 8개의 글리신 또는 다른 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법 또는 효모 디스플레이 방법을 포함하는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 1998/24893호; WO 1992/01047호; WO 1996/34096호; WO 1996/33735호; 미국 특허 번호 5,413,923호; 5,625,126호; 5,633,425호; 5,569,825호; 5,661,016호; 5,545,806호; 5,814,318호; 5,885,793호; 5,916,771호; 및 5,939,598호 참조).
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 가변 영역 서열이 래트 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
비-인간(예를 들어, 뮤린 또는 래트) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 함유하는 면역글로불린이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 전부 또는 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것을 포함할 수 있다. 항체 인간화 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7]; 미국 특허 번호 5,530,101호; 5,585,089호; 5,693,761호; 5,693,762호; 및 6,180,370호(Queen et al.); EP239400호; PCT 공보 WO 91/09967호; 미국 특허 번호 5,225,539호; EP592106호; EP519596호; 문헌[Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973]; 및 미국 특허 번호 5,565,332호를 참조한다.
또한 본원에 설명된 SEQ ID NO에 제시된 서열의 "보존적 서열 변형"이 제공된다. 보존적 서열 변형은 본원에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 이의 인지체 항원(예를 들어, CD45)에 대한 결합을 폐지하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 상기 보존적 서열 변형은 보존적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 아미노산 첨가 및 결실을 포함한다. 예를 들어, 변형은 부위-특이적 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같은 당 분야에 공지된 표준 기술에 의해 본원에 설명된 SEQ ID NO로 도입될 수 있다. 보존적 서열 변형은 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 항-CD73 항체에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).
본원에서 사용되는 용어 "생착 잠재성"은 상기 세포가 자연적으로 순환하거나 또는 이식에 의해 제공되는지에 관계 없이 조혈 줄기 및 전구 세포가 조직을 다시 채우는 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 상기 용어는 세포의 조직 귀소 및 관심 조직 내의 세포의 콜로니화와 같이 생착을 둘러싸거나 이로 이어지는 모든 사건을 포함한다. 생착 효율 또는 생착 속도는 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 임상적으로 허용되는 파라미터를 사용하여 평가되거나 정량화될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 경쟁적 재증식 단위(CRU)의 평가; 줄기 세포가 귀소되거나, 콜로니화되거나, 이식된 조직(들)에서의 마커의 혼입 또는 발현; 또는 질병 진행, 조혈 줄기 및 전구 세포의 생존 또는 수용자의 생존을 통한 대상체의 진행의 평가를 포함할 수 있다. 생착은 또한 이식 후 기간 동안 말초 혈액에서 백혈구 수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 생착은 또한 골수 흡인물 샘플에서 공여자 세포에 의한 골수 세포의 회복을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 세포"("HSC")는 자가 재생하고 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 그물적혈구, 적혈구), 트롬보사이트(예를 들어, 거대핵모세포, 혈소판 생성 거대핵세포, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B 세포 및 T 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 계통을 포함하는 성숙 혈액 세포로 분화하는 능력을 갖는 미성숙 혈액 세포를 지칭한다. 상기 세포는 CD34+ 세포를 포함할 수 있다. CD34+ 세포는 CD34 세포 표면 마커를 발현하는 미성숙 세포이다. 인간에서, CD34+ 세포는 상기 정의된 줄기 세포 특성을 갖는 세포의 아집단을 포함하는 것으로 생각되는 반면, 마우스에서는 HSC가 CD34-이다. 또한, HSC는 또한 장기 재증식 HSC(LT-HSC) 및 단기 재증식 HSC(ST-HSC)를 지칭한다. LT-HSC 및 ST-HSC는 기증적 잠재성 및 세포 표면 마커 발현에 기초하여 분화된다. 예를 들어, 인간 HSC는 CD34+, CD38-, CD45RA-, CD90+, CD49F+ 및 lin-(CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11B, CD19, CD20, CD56, CD235A를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)이다. 마우스에서, 골수 LT-HSC는 CD34-, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamfl/CD150+, CD48- 및 lin- (Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL7ra를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)인 반면, ST-HSC는 CD34+, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamfl/CD150+, 및 lin- (Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL7ra를 포함하는 성숙 계통 마커에 대해 음성)이다. 또한, ST-HSC는 항상성 조건하에서 LT-HSC보다 덜 정지하고 더 증식한다. 그러나, LT-HSC는 더 큰 자가-재생 잠재성(즉, 성인기 전체에 걸쳐 생존하고, 연속적인 수용자를 통해 연속적으로 이식될 수 있음)을 갖는 반면, ST-HSC는 제한된 자가-재생(즉, 제한된 기간 동안만 생존하고, 연속 이식 잠재성을 갖지 않음)을 갖는다. 이들 HSC 중 임의의 것이 본원에 설명된 방법에 사용될 수 있다. ST-HSC는 고도로 증식하고 따라서 분화된 자손을 더 빨리 생성할 수 있기 때문에 특히 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "조혈 줄기 세포 기능적 잠재성"은 1) 다능성(이는 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 그물적혈구, 적혈구), 트롬보사이트(예를 들어, 거대핵모세포, 혈소판 생성 거대핵세포, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, T 세포 및 B 세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 혈액 계통으로 분화하는 능력을 지칭함), 2) 자가-재생(모 세포와 동등한 잠재성을 갖는 딸 세포를 발생시키는 조혈 줄기 세포의 능력을 지칭하며, 추가로 이러한 능력은 고갈 없이 개인의 일생에 걸쳐 반복적으로 발생할 수 있음), 3) 조혈 줄기 세포 또는 이의 자손이 이식 수용자에게 재도입되고, 여기서 이들이 조혈 줄기 세포 니치로 귀소하고 생산적이고 지속적인 조혈을 재확립하는 능력을 포함하는 조혈 줄기 세포의 기능적 특성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 설명된 바와 같은 특정 질병 또는 질환에 대한 치료를 받는 유기체, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 언급된 대상체 또는 환자는 인간 대상체이다.
본원에서 사용되는 용어 "수용자"는 조혈 줄기 세포 집단을 함유하는 이식과 같은 이식을 받는 환자를 지칭한다. 수용자에게 투여되는 이식된 세포는, 예를 들어, 자가, 동계 또는 동종이형 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료하다" 또는 "치료"는 대안적 치료 양식의 부산물인 장기간의 생존, 더 적은 이환율 및/또는 부작용 감소와 같은 질병의 임의의 결과의 임의의 개선을 지칭하며; 당 분야에서 용이하게 인식되는 바와 같이, 질병의 완전한 근절이 바람직하지만 치료 작용에 대한 요건은 아니다. 예를 들어, 치료는 질병 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고, 질병 증상 및/또는 상기 증상의 근본 원인을 제거하고, 질병 증상 및/또는 이의 근본 원인의 빈도 또는 가능성을 감소시키고, 질병에 의해 직접적 또는 간접적으로 야기된 손상을 개선하거나 교정하는 것을 지칭할 수 있다. 이롭거나 원하는 임상 결과는 본원에 설명된 바와 같은 항체 컨디셔닝 요법 및 후속 조혈 줄기 세포 이식 요법 후에 환자에서 외인성 조혈 세포의 생착을 촉진하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가적인 이로운 결과는 컨디셔닝 요법 및 환자로의 외인성 조혈 줄기 세포 이식편의 후속 투여 후 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 하는 환자에서 조혈 줄기 세포의 세포 수 또는 상대 농도의 증가를 포함한다. 본원에 설명된 요법의 이로운 결과는 또한 컨디셔닝 요법 및 후속 조혈 줄기 세포 이식 요법 후 거대핵세포, 트롬보사이트, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 골수모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 미세아교 세포, 과립구, 단핵구, 파골세포, 항원 제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-림프구 또는 B-림프구와 같은 조혈 계통의 하나 이상의 세포의 세포 수 또는 상대 농도에서의 증가를 포함할 수 있다. 추가의 이로운 결과는 암세포(예를 들어, CD45+ 백혈병 세포) 또는 자가면역 세포(예를 들어, CD45+ 자가면역 림프구, 예를 들어, 자가 항원과 교차 반응하는 T-세포 수용체를 발현하는 CD45+ T-세포)의 집단과 같은 질병 유발 세포 집단의 양에서의 감소를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법이 장애를 예방하는 것에 관한 한, 용어 "예방하다"는 질병 상태가 완전히 차단될 것을 요구하지 않는 것으로 이해된다. 오히려, 본원에서 사용되는 용어 예방은 본 발명의 화합물의 투여가 질병의 발병 전에 발생할 수 있도록 장애에 민감한 집단을 확인하는 숙련된 기술자의 능력을 지칭한다. 상기 용어는 질병 상태를 완전히 피한다는 것을 의미하지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조혈 줄기 세포 이식을 "필요로 하는" 환자는 하나 이상의 혈액 세포 유형에서 결함 또는 결핍을 나타내는 환자뿐만 아니라 본원에 설명된 줄기 세포 장애, 자가면역 질병, 암 또는 다른 병리를 갖는 환자를 포함한다. 조혈 줄기 세포는 일반적으로 1) 다능성을 나타내며, 이에 따라 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 그물적혈구, 적혈구), 트롬보사이트(예를 들어, 거대핵모세포, 혈소판 생성 거대핵세포, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 혈액 계통으로 분화할 수 있고, 2) 자가-재생을 나타내고, 이에 따라 모 세포와 동등한 잠재성을 갖는 딸 세포를 발생시킬 수 있고, 3) 이식 수용자에게 재도입되고 여기서 이들이 조혈 줄기 세포 니치로 귀소하고 생산적이고 지속적인 조혈을 재확립하는 능력을 나타낸다. 따라서, 조혈 줄기 세포는 생체 내에서 결손되거나 결핍된 세포 집단을 재구성하기 위해 조혈 계통의 하나 이상의 세포 유형에 있어서 결손 또는 결핍 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 암을 앓고 있을 수 있고, 결핍은 암성 세포 집단을 선택적으로 또는 비특이적으로 고갈시키는 화학요법제 또는 다른 약제의 투여에 의해 야기될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 환자는 낫적혈구빈혈, 지중해 빈혈, 판코니 빈혈, 재생불량성 빈혈 및 비스코트-올드리치 증후군과 같은 혈색소병증(예를 들어, 비-악성 혈색소병증)을 앓고 있을 수 있다. 대상체는 아데노신 데아미나제 중증 복합 면역결핍(ADA SCID), HIV/AIDS, 이염색백색질장애, 다이아몬드-블랙판 빈혈 및 슈바크만-다이아몬드 증후군을 앓고 있는 대상체일 수 있다. 대상체는 유전성 혈액 장애(예를 들어, 낫적혈구빈혈) 또는 자가면역 장애를 갖거나 이에 의해 영향을 받을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 대상체는 신경모세포종 또는 혈액 암과 같은 악성종양을 갖거나 이에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 백혈병, 림프종 또는 골수종을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 다발골수종, 미만성 거대 B-세포 림프종 또는 비-호지킨 림프종을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 골수형성이상 증후군을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 공피증, 다발경화증, 궤양성 결장염, 크론병, 타입 1 당뇨병 또는 본원에 설명된 또 다른 자가면역 병리와 같은 자가면역 질병을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 키메라 항원 수용체 T-세포(CART) 요법을 필요로 한다. 일부 구현예에서, 대상체는 대사 축적병을 갖거나 이에 의해 달리 영향을 받는다. 대상체는 글리코겐 축적병, 점액다당류증, 고셔병, 헐러병, 스핑고리피드증, 이염색백색질장애, 또는 본원에 개시된 치료 또는 요법으로부터 이익을 얻을 수 있고 중증 복합 면역결핍, 비스코트-올드리치 증후군, 과 면역글로불린 M(IgM) 증후군, 체디악-히가시 병, 유전성 림프조직구증, 골화석증, 불완전 골형성, 축적병, 중증성 지중해 빈혈, 낫적혈구병, 전신경화증, 전신 홍반 루푸스, 다발경화증, 청소년 류마티스 관절염 및 개시내용 전체가 조혈 줄기 세포 이식 요법에 의해치료될 수 있는 병리에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌["Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease," ASH Education Book, 1:319-338 (2000)]에 설명된 질병 또는 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 다른 질병 또는 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 대사 장애를 앓고 있거나 이에 의해 달리 영향을 받을 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 조혈 줄기 세포 이식을 "필요로 하는" 환자는 상기 병리 중 하나를 앓고 있거나 앓고 있지 않지만, 그럼에도 불구하고 거대핵세포, 트롬보사이트, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 근모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 미세아교세포, 과립구, 단핵구, 파골세포, 항원-제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-림프구 및 B-림프구와 같은 조혈 계통 내의 하나 이상의 내인성 세포 유형의 감소된 수준(예를 들어, 달리 건강한 대상체의 것에 비함)을 나타내는 환자일 수 있다. 당업자는 하나 이상의 상기 세포 유형 또는 다른 혈액 세포 유형의 수준이, 예를 들어, 당 분야에 공지된 다른 절차 중에서 흐름세포측정법 및 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법에 의해 달리 건강한 대상체에 대해 감소되는지를 용이하게 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 어구 "줄기 세포 장애"는 광범위하게 대상체의 표적 조직을 컨디셔닝하고/하거나 표적 조직에서 내인성 줄기 세포 집단을 제거하고/하거나(예를 들어, 대상체의 골수 조직으로부터 내인성 조혈 줄기 또는 전구 세포 집단을 제거) 대상체의 표적 조직에서 줄기 세포를 생착시키거나 이식함으로써 치료되거나 치유될 수 있는 임의의 질병, 장애 또는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 타입 I 당뇨병은 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치유되는 것으로 나타났으며, 본원에 설명된 조성물 및 방법에 따른 컨디셔닝으로부터 이익을 얻을 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 추가 장애는 낫적혈구빈혈, 지중해 빈혈, 판코니 빈혈, 재생불량성 빈혈, 비스코트-올드리치 증후군, ADA SCID, HIV/AIDS, 이염색백색질장애, 다이아몬드-블랙판 빈혈 및 슈바크만-다이아몬드 증후군을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 설명된 환자 컨디셔닝 및/또는 조혈 줄기 세포 이식 방법을 사용하여 치료될 수 있는 추가 질병은 유전성 혈액 장애(예를 들어, 낫적혈구빈혈) 및 자가면역 장애, 예를 들어, 피부경화증, 다발경화증, 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. 본원에 설명된 컨디셔닝 및/또는 이식 방법을 사용하여 치료될 수 있는 추가 질병은 악성종양, 예를 들어, 신경모세포종 또는 혈액 암, 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. 예를 들어, 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 다발골수종, 미만성 거대 B-세포 림프종 또는 비-호지킨 림프종일 수 있다. 본원에 설명된 컨디셔닝 및/또는 이식 방법을 사용하여 치료할 수 있는 추가 질병은 골수형성이상 증후군을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 대사 축적병을 갖거나 이에 의해 달리 영향을 받는다. 예를 들어, 대상체는 글리코겐 축적병, 점액다당류증, 고셔병, 헐러병, 스핑고리피드증, 이염색백색질장애, 또는 본원에 개시된 치료 또는 요법으로부터 이익을 얻을 수 있고 중증 복합 면역결핍, 비스코트-올드리치 증후군, 과 면역글로불린 M(IgM) 증후군, 체디악-히가시 병, 유전성 림프조직구증, 골화석증, 불완전 골형성, 축적병, 중증성 지중해 빈혈, 낫적혈구병, 전신경화증, 전신 홍반 루푸스, 다발경화증, 청소년 류마티스 관절염 및 개시내용 전체가 조혈 줄기 세포 이식 요법에 의해치료될 수 있는 병리에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌["Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease," ASH Education Book, 1:319-338 (2000)]에 설명된 질병 또는 장애를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 다른 질병 또는 장애로 구성된 군으로부터 선택되는 대사 장애를 앓고 있거나 이에 의해 달리 영향을 받을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 플라스미드, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 바이러스 또는 다른 적합한 레플리콘과 같은 핵산 벡터를 포함한다. 본원에 설명된 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 예를 들어, 단백질의 발현 및/또는 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 포유동물 세포의 유전체로의 통합에 사용되는 추가 서열 요소를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 단편의 발현에 사용될 수 있는 특정 벡터는 유전자 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 영역과 같은 조절 서열을 함유하는 플라스미드를 포함한다. 항체 및 항체 단편의 발현을 위한 다른 유용한 벡터는 이들 유전자의 번역 속도를 향상시키거나 유전자 전사로부터 발생하는 mRNA의 안정성 또는 핵 방출을 개선시키는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이들 서열 요소는, 예를 들어, 발현 벡터 상에 운반되는 유전자의 효율적인 전사를 지시하기 위해 5' 및 3' 비번역 영역 및 아데닐중합체형성 신호 부위를 포함할 수 있다. 본원에 설명된 발현 벡터는 또한 상기 벡터를 함유하는 세포의 선택을 위한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 적합한 마커의 예는 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신 및 노르세오트리신과 같은 항생제에 대한 내성을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "컨쥬게이트" 또는 "항체 약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"는 전체적으로 상호 교환적으로 사용되는 세포독소 또는 독소에 연결된 항체를 지칭한다. 일 구현예에서, ADC는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 한 분자의 반응성 작용기와 본원에 설명된 세포독소와 같은 또 다른 분자의 적절하게 반응성인 작용기의 화학적 결합에 의해 형성된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 컨쥬게이트에 사용될 수 있는 세포독소의 비제한적인 예는 작은 유기 분자(예를 들어, MW 1500Da 이하), 생체분자(예를 들어, 단백질), 약물 충전 나노입자 또는 방사성핵종을 포함한다. 컨쥬게이트는 서로 결합된 2개의 분자 사이, 예를 들어, 항체와 독소 사이에 링커를 포함할 수 있다. 컨쥬게이트의 형성에 사용될 수 있는 링커의 예는 D-아미노산과 같은 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산을 함유하는 것과 같은 펩티드-함유 링커를 포함한다. 링커는 본원에 설명되고 당 분야에 공지된 다양한 전략을 사용하여 제조될 수 있다. 그 안의 반응성 성분에 따라, 링커는, 예를 들어, 효소적 가수분해, 광분해, 산성 조건하에서의 가수분해, 염기성 조건하에서의 가수분해, 산화, 디설파이드 환원, 친핵성 절단 또는 유기금속 절단에 의해 절단될 수 있다(예를 들어, 문헌[Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012] 참조).
함께 컨쥬게이션되는 적어도 2개의 분자의 의미에서 사용되는 경우 용어 "컨쥬게이트", "~에 컨쥬게이션된" 또는 "~와 컨쥬게이션된"은 제2 분자, 예를 들어, 독소에 연결되거나 이와 조합된 하나의 분자, 예를 들어, 항체를 지칭한다. 항-CD45 항체 및 이의 단편은 독소, 표지화 제제(예를 들어, 플루오레세인 또는 비오틴), 약물-로딩된 나노입자를 포함하는 다른 분자에 컨쥬게이션될 수 있다. 컨쥬게이션된 분자는 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해 컨쥬게이션될 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 단편은 단백질 독소에 컨쥬게이션되어 단백질 융합체, 예를 들어, scFv-독소 키메라를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 컨쥬게이션된 분자는 컨쥬게이션된 분자와 관련된 제1 상호작용 모이어티(예를 들어, 비오틴) 및 제2 상호작용 모이어티(예를 들어, 스트렙타비딘)의 비-공유 상호작용을 통해 커플링될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약물 대 항체 비" 또는 "DAR"은 컨쥬게이트의 항체에 부착된 약물, 예를 들어, 아마톡신의 수를 지칭한다. ADC의 DAR은 1 내지 8의 범위일 수 있지만, 항체 상의 연결 부위의 수에 따라 더 높은 부하가 또한 가능하다. 특정 구현예에서, 컨쥬게이트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 DAR을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "미세관-결합제"는 세포에서 유사분열 및 사이기 세포 기능에 필수적인 미세관 네트워크를 파괴함으로써 작용하는 화합물을 지칭한다. 미세관-결합제의 예는 메이탄신, 메이탄시노이드 및 이들의 유도체, 예를 들어, 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 것들, 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈블라스틴, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 및 비노렐빈, 탁산, 예를 들어, 도세탁셀 및 파클리탁셀, 마크롤리드, 예를 들어, 디스코더몰리드, 코히친, 및 에포틸론, 및 이들의 유도체, 예를 들어, 에포틸론 B 또는 이들의 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아마톡신"은 아마니타 팔로이데스(Amanita phalloides) 버섯 또는 이의 유도체, 예를 들어, RNA 중합효소 II 활성을 억제할 수 있는 이의 변이체 또는 유도체에 의해 생성된 펩티드의 아마톡신 패밀리의 구성원을 지칭한다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 아마톡신은 본원에 설명된 화합물, 예를 들어, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 아마눌린산 또는 프로아마눌린을 포함한다. 본원에 설명된 바와 같이, 아마톡신은, 예를 들어, 링커 모이어티(L)를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 컨쥬게이션(이에 따라 ADC를 형성함)될 수 있다. 아마톡신 컨쥬게이션의 예시적 방법 및 상기 과정에 유용한 링커는 하기 설명된다. 조성물 및 방법에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 컨쥬게이션에 유용한 예시적인 링커-함유 아마톡신이 또한 본원에 설명된다.
본원에서 사용되는 용어 "아실"은 -C(=O)R을 지칭하며, 여기서 R은 본원에서 정의된 바와 같은 수소("알데하이드"), C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, C3-C7 카르보사이클릴, C6-C20 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 또는 5-10원 헤테로사이클릴이다. 비제한적인 예는 포르밀, 아세틸, 프로파노일, 벤조일 및 아크릴로일을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "C1-C12 알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 C1-C12 알킬 기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸 및 -n-헥실을 포함하나 이에 제한되지는 않는 반면; 분지형 C1-C12 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸 및 2-메틸부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. C1-C12 알킬 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 정상, 2차 또는 3차 탄소 원자를 함유하는 C2-C12 탄화수소를 지칭한다. 예로는 에틸렌 또는 비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, tert-부틸레닐, 헥세닐 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알케닐 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "알키닐"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 정상, 2차 또는 3차 탄소 원자를 함유하는 C2-C12 탄화수소를 지칭한다. 예로는 아세틸렌계 및 프로파길, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알키닐 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "아릴"은 C6-C20 카르보사이클릭 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아릴 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 아릴 라디칼로 대체된 무고리 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 아릴알킬 기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하며, 예를 들어, 아릴알킬 기의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함하는 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자이다. 알카릴 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬"은 모노- 또는 바이사이클릭일 수 있는 포화된 카르보사이클릭 라디칼을 지칭한다. 사이클로알킬 기는 모노사이클로서 3 내지 7개의 탄소 원자 또는 바이사이클로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 모노사이클릭 사이클로알킬 기의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 포함한다. 사이클로알킬 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "사이클로알케닐"은 모노- 또는 바이사이클릭일 수 있는 불포화된 카르보사이클릭 라디칼을 지칭한다. 사이클로알케닐 기는 모노사이클로서 3 내지 6개의 탄소 원자 또는 바이사이클로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 고리를 포함한다. 모노사이클릭 사이클로알케닐 기의 예는 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐 및 1-사이클로헥스-3-에닐을 포함한다. 사이클로알케닐 기는 비치환되거나 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "헤테로아르알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 헤테로아릴 라디칼로 대체된 무고리 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 헤테로아릴알킬 기는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하며, 예를 들어, 헤테로아릴알킬 기의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함하는 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자이다. 헤테로아릴알킬 기의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7개의 고리 구성원(2 내지 6개의 탄소 원자)을 갖는 모노사이클 또는 7 내지 10개의 고리 구성원(4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 바이사이클, 예를 들어, 바이사이클로[4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴" 및 "헤테로사이클로알킬"은 각각 하나 이상의 고리 원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소 및 황인 방향족 또는 비-방향족 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼은 2 내지 20개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬은 3 내지 7개의 고리 구성원(2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클 또는 7 내지 10개의 고리 구성원(4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 바이사이클, 예를 들어, 바이사이클로[4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 비치환되거나 치환될 수 있다.
헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬 기는 문헌[Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), 특히 챕터 1, 3, 4, 6, 7 및 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 13, 14, 16, 19 및 28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 설명되어 있다.
헤테로아릴 기의 예는 비제한적인 예로서 피리딜, 티아졸릴, 테트라하이드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카르바졸릴, 카르바졸릴, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴 및 이사티노일을 포함한다.
헤테로사이클로알킬의 예는 비제한적인 예로서 디하이드로피리딜, 테트라하이드로피리딜(피페리딜), 테트라하이드로티오페닐, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 비스-테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 피페라지닐, 퀴누클리디닐 및 모르폴리닐을 포함한다.
비제한적인 예로서, 탄소 결합 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5 또는 6, 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4 또는 5, 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에서 결합된다. 더욱 더 전형적으로, 탄소 결합 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
비제한적인 예로서, 질소 결합 헤테로아릴 및 헤테로사이클로알킬은 이지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸 또는 베타-카르볼린의 위치 9에서 결합된다. 더욱 더 전형적으로, 질소 결합 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴 및 1-피페리디닐을 포함한다.
본원에서 사용되며 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴 등 중 임의의 것에 적용되는 "치환된"은 하나 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체됨을 의미한다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, NH2, -NHR, -N(R)2, -N+(R)3, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N3, -NC(=O)H, -NC(=O)R, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)NH2, -C(=O)N(R)2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NH2, -S(=O)2N(R)2, -S(=O)R, -OP(=O)(OH)2, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2H, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NH2, -C(=O)N(R)2, -C(=S)NH2, -C(=S)N(R)2, -C(=NH)NH2 및 -C(=NR)N(R)2를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 X는 F, Cl, Br 및 I로부터 각각의 경우에 대해 독립적으로 선택되고; 각각의 R은 C1-C12 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로아릴, 보호 기 및 프로드러그 모이어티로부터 각각의 경우에 대해 독립적으로 선택된다. 기가 "선택적으로 치환된" 것으로 설명되는 경우, 상기 기는 각각의 경우에 독립적으로 상기 치환기 중 하나 이상으로 치환될 수 있다.
특정 라디칼 명명 규칙은 문맥에 따라 모노-라디칼 또는 디-라디칼을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환기가 분자의 나머지 부분에 대한 2개의 부착 지점을 필요로 하는 경우, 치환기는 디-라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 부착 지점을 필요로 하는 알킬로 확인된 치환기는 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등과 같은 디-라디칼을 포함한다. 다른 라디칼 명명 규칙은 라디칼이 "알킬렌", "알케닐렌", "아릴렌", "헤테로사이클로알킬렌" 등과 같은 디-라디칼임을 명확하게 나타낸다.
치환기가 디-라디칼(즉, 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착 지점을 가짐)로 묘사될 때마다, 치환기는 달리 지시되지 않는 한 임의의 방향 구성으로 부착될 수 있음이 이해되어야 한다.
"이성질현상"은 동일한 분자식을 갖지만 원자의 결합 순서 또는 공간에서 원자의 배열이 상이한 화합물을 의미한다. 공간에서 원자의 배열이 상이한 이성질체는 "입체 이성질체"로 언급된다. 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체는 "부분입체 이성질체"로 언급되고, 서로 중첩되지 않는 거울상인 입체 이성질체는 "거울상 이성질체" 또는 때때로 "광학 이성질체"로 언급된다.
4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 언급된다. "키랄 이성질체"는 적어도 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물을 의미한다. 하나 초과의 키랄 중심을 갖는 화합물은 개별 부분입체 이성질체로서 또는 "부분입체 이성질체 혼합물"로 언급되는 부분입체 이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 하나의 키랄 중심이 존재하는 경우, 입체 이성질체는 상기 키랄 중심의 절대 배열(R 또는 S)을 특징으로 할 수 있다. 절대 배열은 키랄 중심에 부착된 치환기의 공간 배열을 지칭한다. 고려 중인 키랄 중심에 부착된 치환기는 문헌[Sequence Rule of Cahn, Ingold and Prelog. (Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116)]에 따라 순위가 매겨진다. 동일한 양의 반대 키랄성의 개별 거울상 이성질체 형태를 함유하는 혼합물은 "라세미 혼합물"로 언급된다.
본 설명 및 청구범위에 개시된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있고, 각 화합물의 상이한 부분입체 이성질체 및/또는 거울상 이성질체가 존재할 수 있다. 본 설명 및 청구범위에서 임의의 화합물의 설명은 달리 언급되지 않는 한 모든 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 이들의 혼합물을 포함하는 것을 의미한다. 또한, 본 설명 및 청구범위에서 임의의 화합물의 설명은 달리 언급되지 않는 한 개별 거울상 이성질체뿐만 아니라 거울상 이성질체의 임의의 혼합물, 라세미체 또는 기타 모두를 포함하는 것을 의미한다. 화합물의 구조가 특정 거울상 이성질체로 묘사되는 경우, 본 출원의 개시는 상기 특정 거울상 이성질체로 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 개시의 각각의 구조식의 거울상 이성질체, 광학 이성질체 및 부분입체 이성질체가 본원에서 고려된다. 본 명세서에서, 화합물의 구조식은 일부 경우에 편의상 특정 이성질체를 나타내지만, 본 발명의 개시는 기하 이성질체, 비대칭 탄소 기반의 광학 이성질체, 입체 이성질체, 호변 이성질체 등과 같은 모든 이성질체를 포함하며, 모든 이성질체가 동일한 수준의 활성을 갖는 것은 아닐 수 있음이 이해된다. 화합물은 상이한 호변 이성질체 형태로 발생할 수 있다. 본 발명의 개시에 따른 화합물은 달리 언급되지 않는 한 모든 호변 이성질체 형태를 포함하는 것을 의미한다. 화합물의 구조가 특정 호변 이성질체로 묘사되는 경우, 본 출원의 개시는 상기 특정 호변 이성질체로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
상기 설명된 임의의 화학식의 화합물은 화합물 자체뿐만 아니라 적용 가능한 경우 이들의 염 및 용매화물을 포함한다. 예를 들어, 음이온과 본 발명의 개시의 화합물 상의 양성으로 하전된 기(예를 들어, 아미노) 사이에 염이 형성될 수 있다. 적합한 음이온은 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 바이설페이트, 설파메이트, 니트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로아세테이트, 글루타메이트, 글루쿠로네이트, 글루타레이트, 말레이트, 말레에이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 토실레이트, 살리실레이트, 락테이트, 나프탈렌설포네이트 및 아세테이트(예를 들어, 트리플루오로아세테이트)를 포함한다. 용어 "약학적으로 허용되는 음이온"은 약학적으로 허용되는 염을 형성하기에 적합한 음이온을 지칭한다. 마찬가지로, 염은 또한 양이온과 본 발명의 개시의 화합물 상의 음성으로 하전된 기(예를 들어, 카르복실레이트) 사이에 형성될 수 있다. 적합한 양이온은 소듐 이온, 포타슘 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 암모늄 양이온, 예를 들어, 테트라메틸암모늄 이온을 포함한다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민 및 트로메타민 뿐만아니라 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산으로부터 유래된 것이다. 본 발명의 개시의 화합물은 또한 4차 질소 원자를 함유하는 염을 포함한다. 적합한 무기 음이온의 예는 염산, 브롬화수소산, 요요드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 인의 무기산으로부터 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 유기 음이온의 예는 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캄포르설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루셉톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 뮤신산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산 및 발레르산의 유기산으로부터 유래되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 중합체 유기 음이온의 예는 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스와 같은 중합체 산으로부터 유도된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 본 발명의 개시의 화합물, 예를 들어, 화합물의 염은 수화 또는 비수화(무수) 형태로 또는 다른 용매 분자와의 용매화물로서 존재할 수 있다. 수화물의 비제한적인 예는 일수화물, 이수화물 등을 포함한다. 용매화물의 비제한적인 예는 에탄올 용매화물, 아세톤 용매화물 등을 포함한다. "용매화물"은 화학량론적 또는 비화학량론적 양의 용매를 함유하는 용매 첨가 형태를 의미한다. 일부 화합물은 결정질 고체 상태에서 고정된 몰비의 용매 분자를 포획하여 용매화물을 형성하는 경향을 갖는다. 용매가 물인 경우, 형성된 용매화물은 수화물이고; 용매가 알콜인 경우, 형성된 용매화물은 알콜레이트이다. 수화물은 물이 이의 분자 상태를 H2O로 유지하는 물질의 한 분자와 하나 이상의 물 분자의 조합에 의해 형성된다. 수화물은, 예를 들어, 일수화물, 이수화물, 삼수화물 등을 지칭한다.
또한, 본원에 개시된 화합물로 표시되는 화합물 또는 이의 염에 대해 결정 다형성이 존재할 수 있다. 임의의 결정 형태, 결정 형태 혼합물 또는 이의 무수물 또는 수화물이 본 발명의 개시의 범위 내에 포함된다는 것이 주목된다.
항-CD45 항체
예를 들어, (i) CD45+ 세포를 특징으로 하는 암 및 자가면역 질병을 치료하고, (ii) 이식 요법이 필요한 환자에서 이식된 조혈 줄기 세포의 생착을 촉진하기 위해 치료제 단독으로서 또는 컨쥬게이트(ADC)로서 사용될 수 있는 CD45에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에서 고려된다. 이들 치료 활성은, 예를 들어, 세포, 예를 들어, 암 세포, 자가면역 세포, 또는 조혈 줄기 세포의 표면 상에서 발현된 CD45에 결합하는 분리된 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC의 결합 및 이후 세포 사멸 유도에 의해 야기될 수 있다. 내인성 조혈 줄기 세포의 고갈은 이식된 조혈 줄기 세포가 귀소할 수 있는 니치(niche)를 제공할 수 있고, 이어서 생산적인 조혈을 확립할 수 있다. 이러한 방식으로, 이식된 조혈 줄기 세포는 본원에 설명된 줄기 세포 장애를 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자에서 성공적으로 생착될 수 있다. 추가로, HSC 이식과 조합하여 이를 필요로 하는 환자에서 백혈구의 고갈은 환자의 면역계를 재설정할 수 있고, 이에 의해, 예를 들어, 자가면역 질병의 환자를 치료할 수 있다.
백혈구 공통 항원 및 수용체-타입 티로신-단백질 포스파타제 C로도 공지된 CD45는 T 및 B 세포 항원 수용체-매개 신호전달에 필수적인 조혈 세포-특이적 막횡단 단백질 티로신 포스파타제이다. CD45는 큰 세포 외 도메인, 및 세포질 도메인을 함유하는 포스파타제를 포함한다. CD45는 자극의 특성 및 관련된 세포 유형에 따라 양성 및 음성 조절자 둘 모두의 역할을 할 수 있다. CD45 유전자에서 가능한 많은 수의 순열이 있지만, 전통적으로 인간에서 단지 6개의 아이소형이 확인된다. 아이소형은 RA, RO, RB, RAB, RBC 및 RABC이다(Hermiston et al. 2003 "CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune cells." Annu Rev Immunol. 2:107-137.). CD45RA는 나이브 T 세포에서 발현되고, CD45RO는 활성화 및 기억 T 세포, 일부 B 세포 서브셋, 활성화된 단핵구/대식세포 및 과립구에서 발현된다. CD45RB는 말초 B 세포, 나이브 T 세포, 흉선세포, 약하게 대식세포 및 수지상 세포에서 발현된다. CD45RABC의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:112로서 제공된다. CD45RA의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:107로서 제공된다. CD45RO의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:108로서 제공된다. CD45RB의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:109로서 제공된다. CD45RAB의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:110으로서 제공된다. SEQ ID NO:RBC의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO:111로서 제공된다.
하기 설명된 바와 같이, 특정 구현예에서, 신규한 항-인간 CD45(hCD45) 항체는 완전한 인간 항체를 디스플레이하는 효모 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되었다. 인간 CD45(모든 아이소형)에 결합하고, 비-인간 영장류로부터의 CD45(예를 들어, 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45)와 교차 반응하는 7개의 인간 항체(지정된 항체 1(Ab1), 항체 2(Ab2), 항체 3(Ab3), 항체 4(Ab4), 항체 5(Ab5), 항체 6(Ab6) 및 항체 7(Ab7))가 스크리닝에서 확인되었다.
다른 구현예에서, 인간화 및 친화성 성숙된 항체는 3개의 래트 항-CD45 항체로부터 제조되었다. 이러한 방식으로, 인간 CD45(모든 아이소형)에 결합하고, 비-인간 영장류로부터의 CD45(예를 들어, 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45)와 교차 반응하는 3개의 추가 항체(항체 A(AbA), 항체 B(AbB) 및 항체 C(AbC)로 지정됨)가 확인되었다. 확인된 항체는 본원에 설명된 바와 같이 진단 및 치료 특징을 갖는다.
따라서, 인간 CD45에 특이적으로 결합하고, 비-인간 영장류로부터의 CD45와 교차 반응하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 CD45(SEQ ID NO:112) 및 시노몰구스 CD45(SEQ ID NO:145) 및/또는 레서스 CD45(SEQ ID NO:146)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정시 약 100 nM 이하, 예를 들어, 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 인간 CD45에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정시 약 100 nM 이하, 예를 들어, 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 시노몰구스 CD45에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정시 약 100 nM 이하, 예를 들어, 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 레서스 CD45에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 완전한 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 탈면역화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
인간 CD45의 세포 외 영역은 뮤신-유사 도메인 및 4개의 피브로넥틴-유사 도메인(d1, d2, d3 및 d4)을 포함한다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab7은 d3 및 d4 피브로넥틴-유사 도메인 내에 위치한 인간 CD45의 잔기와 상호작용하는 것으로 생각된다. 특히, 이들 항체는 SEQ ID NO:115에 제시된 인간 CD45의 단편, 및 SEQ ID NO:117에 제시된 인간 CD45의 단편과 상호작용할 수 있다. 본원에 설명된 가교 연구는 항체가 인간 CD45, 시노몰구스 CD45 및 레서스 CD45 사이에 보존된 하나 이상의 CD45 아미노산 잔기와 특이적으로 상호작용할 수 있음을 시사한다. 이들 잔기는 405T, 407K, 419Y, 425K 및 505R(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)을 포함한다. 또한, 이들 항체는 인간 CD45에서 잔기 481R 및/또는 509H(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)와 상호작용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, d3 및/또는 d4 피브로넥틴-유사 도메인에 위치한 에피토프에서 인간 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD45 단편 2(SEQ ID NO:115) 및/또는 CD45 단편 4(SEQ ID NO:117) 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프에서 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD45 단편 1(SEQ ID NO:114) 및/또는 CD45 단편 3(SEQ ID NO:116) 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프에서 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 인간 CD45, 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45 사이에서 보존된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD45에서 405T, 407K, 419Y, 425K 및 505R(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)의 아미노산 잔기 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 5개 모두에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD45에서 405T, 407K, 419Y, 425K, 481R, 및 505R, 509H(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)의 아미노산 잔기 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개에 결합할 수 있다. 인간 CD45(SEQ ID NO:112)에 대한 결합에 대해 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및/또는 Ab7과 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 시노몰구스 CD45(SEQ ID NO:145) 및/또는 레서스 CD45(SEQ ID NO:146)에 대한 결합에 대해 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및/또는 Ab7과 경쟁할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 완전한 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 탈면역화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 설명된 항체 AbA는 또한 CD45의 d4 피브로넥틴-유사 도메인에 결합하지만, CD45에 대한 결합에 대해 Ab1-Ab7 중 어느 것과도 경쟁하지 않는 것으로 생각된다. 본원에 설명된 에피토프 맵핑 실험은 AbA가 Ab1-Ab7에 비해 분자의 반대쪽 면에서 d4 피브로넥틴-유사 도메인에 결합함을 시사한다. 특히, 이러한 항체는 SEQ ID NO:118에 제시된 인간 CD45의 단편과 상호작용하는 것으로 생각된다. 본원에 설명된 가교 연구는 AbA가 인간 CD45, 시노몰구스 CD45 및 레서스 CD45 사이에 보존된 하나 이상의 CD45 아미노산 잔기와 특이적으로 상호작용할 수 있음을 시사한다. 이들 잔기는 493Y 및 502T(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)를 포함한다. 또한, 이 항체는 인간 CD45의 잔기 486R(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)과 상호작용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, d4 피브로넥틴-유사 도메인에 위치한 에피토프에서 인간 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD45 단편 5(SEQ ID NO:118) 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프에서 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 인간 CD45, 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45 사이에서 보존된 적어도 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에서 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD45에서 493Y 및 502T(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)의 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘 모두에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 CD45에서 486R, 493Y 및 502T(SEQ ID NO:113에 제시된 hCD45의 단편을 참조하여 넘버링됨)의 아미노산 잔기 중 1개 이상, 2개 이상 또는 3개에 결합할 수 있다. 또한, 인간 CD45(SEQ ID NO:112)에 대한 결합에 대해 AbA와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 시노몰구스 CD45(SEQ ID NO:145) 및/또는 레서스 CD45(SEQ ID NO:146)에 대한 결합에 대해 AbA와 경쟁할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 완전한 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 탈면역화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
다른 구현예에서, AbB와 동일한 인간 CD45의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45와 교차-반응한다. 또한, 인간 CD45(SEQ ID NO:112)에 대한 결합에 대해 AbB와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 시노몰구스 CD45(SEQ ID NO:145) 및/또는 레서스 CD45(SEQ ID NO:146)에 대한 결합에 대해 AbB와 경쟁할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 완전한 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 탈면역화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
다른 구현예에서, AbC와 동일한 인간 CD45의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 시노몰구스 CD45 및/또는 레서스 CD45와 교차-반응한다. 또한, 인간 CD45(SEQ ID NO:112)에 대한 결합에 대해 AbC와 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한 시노몰구스 CD45(SEQ ID NO:145) 및/또는 레서스 CD45(SEQ ID NO:146)에 대한 결합에 대해 AbC와 경쟁할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 완전한 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 다른 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체는 탈면역화된 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다.
항-CD45 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 및 AbC의 다양한 결합 영역의 아미노산 서열이 표 27에 설명되어 있다. 다양한 양태에서, 본 발명은 표 27에 설명된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 표 27에 설명된 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 표 27에 설명된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 본원에 제공된 항체 및 이의 항원 결합 부분의 추가 특징은 하기에 설명된다.
Ab1
항체 1(Ab1)은 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab1의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab1에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab1의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab1의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab1의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2(VH CDR1); SEQ ID NO:3(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:4(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab1의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab1의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6(VL CDR1); SEQ ID NO:7(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:8(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 2 내지 4 및 6 내지 8)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab1과 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:1을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:1의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:1과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:1과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:1과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:1과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab1과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab1 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:5를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:5의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:5와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:5와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:5와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:5와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab1과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab1 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab1의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab1의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃(Kabat)에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab1의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab1의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:9를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:9의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:9와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:9와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:9와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:9와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab1과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab1 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:10을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:10의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:10과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:10과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:10과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:10과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab1과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab1 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab1의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab1의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab2
항체 2(Ab2)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab2의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab2에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab2의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab2의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:11에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab2의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12(VH CDR1); SEQ ID NO:13(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:14(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab2의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab2의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16(VL CDR1); SEQ ID NO:17(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:18(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 12 내지 14 및 16 내지 18)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab2와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:11을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:11의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:11과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:11과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:11과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:11과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab2와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab2 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:15를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:15의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:15와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:15와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:15와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:15와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab2와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab2 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab2의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab2의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab2의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab2의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:19를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:19의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:19와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:19와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:19와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:19와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab2와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab2 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:20을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:20의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:20과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:20과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:20과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:20과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab2와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab2 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab2의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab2의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab3
항체 3(Ab3)은 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab3의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab3에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab3의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab3의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab3의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22(VH CDR1); SEQ ID NO:23(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:24(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab3의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab3의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:26(VL CDR1); SEQ ID NO:27(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:28(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 22 내지 24 및 26 내지 28)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab3과 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:21을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:21의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:21과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:21과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:21과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:21과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab3과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab3 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:25를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:25의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:25와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:25와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:25와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:25와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab3와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab3 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab3의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab3의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab3의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab3의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:29를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:29의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:29와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:29와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:29와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:29와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab3와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab3 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:30을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:30의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:30과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:30과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:30과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:30과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab3와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab3 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab3의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab3의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab4
항체 4(Ab4)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab4의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab4에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab4의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab4의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:31에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab4의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:32(VH CDR1); SEQ ID NO:33(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:34(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab4의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:35에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab4의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36(VL CDR1); SEQ ID NO:37(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:38(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 32 내지 34 및 36 내지 38)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab4와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:31을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:31의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:31과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:31과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:31과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:31과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab4와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab4 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:35를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:35의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:35와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:35와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:35와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:35와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab4와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab4 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab4의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab4의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab4의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab4의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:39를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:39의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:39와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:39와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:39와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:39와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab4와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab4 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:40을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:40의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:40과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:40과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:40과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:40과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab4와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab4 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab4의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab4의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab5
항체 5(Ab5)는 인간 CD45, 시노(cyno) CD45 및 레서스(rhesus) CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab5의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab5에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab5의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab5의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab5의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:42(VH CDR1); SEQ ID NO:43(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:44(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab5의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:45에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab5의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:46(VL CDR1); SEQ ID NO:47(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:48(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 42 내지 44 및 46 내지 48)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab5와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:41을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:41의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:41과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:41과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:41과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:41과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab5와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab5 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:45을 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:45의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:45와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:45와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:45와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:45와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab5와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab5 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab5의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab5의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab5의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab5의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:49를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:9의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:49와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:49와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:49와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:49와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab5와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab5 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:50을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:50의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:50과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:50과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:50과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:50과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab5와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab5 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab5의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab5의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab6
항체 6(Ab6)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab6의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab6에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab6의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab6의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:51에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab6의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:52(VH CDR1); SEQ ID NO:53(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:54(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab6의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab6의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56(VL CDR1); SEQ ID NO:57(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:58(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 52 내지 54 및 56 내지 58)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab6와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:51을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:51의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:51과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:51과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:51과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:51과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab6와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab6 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:55을 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:55의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:55와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:55와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:55와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:55와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab6와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab6 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab6의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab6의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab6의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab6의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:59를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:59의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:59와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:59와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:59와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:59와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab6와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab6 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:60을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:60의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:60과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:60과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:60과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:60과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab6와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab6 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab6의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab6의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
Ab7
항체 7(Ab7)은 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 Ab7의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 Ab7에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 Ab7의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. Ab7의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:61에 제시되어 있다(표 27 참조). Ab7의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:62(VH CDR1); SEQ ID NO:63(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:64(VH CDR3)에 제시되어 있다. Ab7의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:65에 설명되어 있다(표 27 참조). Ab7의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:66(VL CDR1); SEQ ID NO:67(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:68(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 62 내지 64 및 66 내지 68)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab7과 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:61을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:61의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:61과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:61과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:61과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:61과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab7과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab7 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:65을 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:65의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:65와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:65와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:65와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:65와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab7과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab7 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
Ab7의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, Ab7의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab7의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, Ab7의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:69에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:69를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:69의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:69와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:69와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:69와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:69와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab7과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab7 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:70을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:70의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:70과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:70과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:70과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:70과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, Ab7과 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 Ab7 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, Ab7의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, Ab7의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
AbA
항체 A(AbA)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 AbA의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 AbA에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 AbA의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. AbA의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:71에 제시되어 있다(표 27 참조). AbA의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:72(VH CDR1); SEQ ID NO:73(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:74(VH CDR3)에 제시되어 있다. AbA의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:75에 설명되어 있다(표 27 참조). AbA의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:76(VL CDR1); SEQ ID NO:77(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:78(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 72 내지 74 및 76 내지 78)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, AbA와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:71을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:71의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:71과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:71과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:71과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:71과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbA와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbA 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:75를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:75의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:75와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:75와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:75와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:75와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbA와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbA 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
AbA의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, AbA의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbA의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbA의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:79에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:79를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:79의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:79와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:79와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:79와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:79와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbA와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbA 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:80을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:80의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:80과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:80과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:80과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:80과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbA와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbA 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, AbA의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, AbA의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
AbB
항체 B(AbB)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 AbB의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 AbB에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 AbB의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. AbB의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:81에 제시되어 있다(표 27 참조). AbB의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:82(VH CDR1); SEQ ID NO:83(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:84(VH CDR3)에 제시되어 있다. AbB의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:85에 설명되어 있다(표 27 참조). AbB의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:86(VL CDR1); SEQ ID NO:87(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:88(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 82 내지 84 및 86 내지 88)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, AbB와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:81을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:81의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:81과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:81과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:81과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:81과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbB와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbB 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:85를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:85의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:85와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:85와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:85와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:85와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbB와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbB 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
AbB의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, AbB의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbB의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbB의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:89에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:89를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:89의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:89와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:89와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:89와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:89와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbB와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbB 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:90을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:90의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:90과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:90과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:90과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:90과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbB와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbB 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, AbB의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, AbB의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
AbC
항체 C(AbC)는 인간 CD45, 시노 CD45 및 레서스 CD45와 교차 반응하고, 인간 CD45의 다양한 아이소형에 결합할 수 있다.
항-CD45 AbC의 다양한 결합 영역에 대한 아미노산 서열은 표 27에 설명되어 있다. 본 발명에는, 예를 들어, 표 27에 제시된 CDR을 포함하는 AbC에 기초한 항-CD45 항체가 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 AbC의 것들에 상응하는 항원 결합 영역, 예를 들어, CDR 및/또는 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. AbC의 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:91에 제시되어 있다(표 27 참조). AbC의 VH CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:92(VH CDR1); SEQ ID NO:93(VH CDR2) 및 SEQ ID NO:94(VH CDR3)에 제시되어 있다. AbC의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 SEQ ID NO:95에 설명되어 있다(표 27 참조). AbC의 VL CDR 도메인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:96(VL CDR1); SEQ ID NO:97(VL CDR2) 및 SEQ ID NO:98(VL CDR3)에 제시되어 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는 SEQ ID NO:96에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:97에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항-CD45 항체는 본원에 설명된 CDR(SEQ ID NO: 92 내지 94 및 96 내지 98)을 포함하며, 여기서 CDR은 항체의 CD45 특이성(즉, AbC와 유사한 특이성)을 유지하면서 보존적 아미노산 치환(또는 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에는 SEQ ID NO:991에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:91을 포함하는 HC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:91의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:91과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:91과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:91과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:91과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbC와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbC 중쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:95를 포함하는 LC 가변 도메인 또는 SEQ ID NO:95의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 가변 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:95와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:95와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:95와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:95와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 가변 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbC와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbC 경쇄 가변 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
AbC의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 전장 항체, 이중특이적 항체, 이중 가변 도메인 항체, 다중 사슬 또는 단일 사슬 항체, 및/또는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv), scFv(단일 사슬 Fv), 서로바디(대리물 경쇄 작제물을 포함함), 단일 도메인 항체, 낙타화된 항체 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 결합 단편의 형태일 수 있다. 이들은 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 동형일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-45 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다.
일부 구현예에서, AbC의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역 또는 인간 IgG4 불변 영역이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 변형된 불변 영역일 수 있다. 예시적인 불변 영역 치환 및/또는 변형은 본원에 설명되고, 다음 위치 중 하나 이상에서의 치환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 234, 235, 265 및 435(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbC의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 다음 치환 중 하나 이상을 함유하는 IgG1 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다: L234A, L235A, D265C 및 H435A(케이뱃에 따른 EU 인덱스). 일부 구현예에서, AbC의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:99를 포함하는 HC 도메인 또는 SEQ ID NO:99의 변이체를 포함하는 변형된 중쇄(HC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:99와 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:99와 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:99와 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:99와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 중쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbC와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbC 중쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO:100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:100을 포함하는 LC 도메인 또는 SEQ ID NO:100의 변이체를 포함하는 변형된 경쇄(LC) 영역을 포함하며, 상기 변이체는 (i) 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:100과 상이하고/하거나; (ii) 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:100과 상이하고/하거나; (iii) 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 또는 3-5개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실에서 SEQ ID NO:100과 상이하고/하거나; (iv) SEQ ID NO:100과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 (i)-(iv) 중 어느 하나에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있고; 변형된 경쇄 영역은 항체의 CD45 특이성(즉, AbC와 유사한 특이성)을 유지하거나, 또 다른 AbC 경쇄 영역의 생물학적 활성에 비해 향상된 생물학적 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, AbC의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는 본원에 설명된 바와 같이 항체-약물 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 또한, AbC의 CDR 영역 및/또는 가변 영역을 포함하는 항체는, 예를 들어, 대상체에서 CD45+ 세포의 고갈을 위해 본원에 설명된 방법에서 사용될 수 있다.
컨센서스 CDR
Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab7의 CDR의 아미노산 서열의 비교가 도 32로 제공된다. 이들 항체는 인간 CD45 상의 동일한 에피토프에 결합하고, 이들의 CDR 영역에서 특정 컨센서스 잔기를 공유한다. 컨센서스 중쇄 아미노산 CDR 서열은 SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 및 SEQ ID NO:121에 제시되며; 컨센서스 경쇄 아미노산 CDR 서열은 SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:123 및 SEQ ID NO:124에 제시된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:119에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:120에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:121에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:123에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 항체는 SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106 중 어느 하나에 제시된 것으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역, 및/또는 SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
Fc-변형 항체
CD45에 결합할 수 잇고, Fc 침묵을 허용하는 Fc 변형을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에 고려되며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이를 필요로 하는 환자에서 치료제로서 단독으로 또는 CD45를 발현하는 세포를 고갈시키기 위한 ADC로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HSC 및 백혈구를 포함하는 특정 세포 유형을 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에서 고려되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HSC 이식을 위해 환자를 컨디셔닝하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 환자에서 HSC 및 백혈구를 고갈시키고 환자에게 HSC 이식을 투여함으로써 환자의 면역계를 재설정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 환자로부터 질병을 유발하는 CD45+ 세포를 제거함으로써 암 및 자가면역 질병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CD45 양성 세포와 관련된 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, CD45와 같은 조혈 줄기 세포에 의해 발현되는 항원에 결합할 수 있고, Fc 침묵을 허용하는 Fc 변형을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본원에서 고려되며, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 (i) CD45+ 조혈 줄기 세포를 특징으로 하는 암 및 자가면역 질병을 치료하고; (ii) 이식 요법을 필요로 하는 환자에서 이식된 조혈 줄기 세포의 생착을 촉진하기 위해 치료제로서 단독으로 또는 ADC로서 사용될 수 있다. 이들 치료 활성은, 예를 들어, 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포 또는 성숙 면역 세포(예를 들어, T 세포)), 예를 들어, 암 세포, 자가면역 세포, 또는 조혈 줄기 세포에 의해 발현되는 것에 결합하는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합에 의해 야기될 수 있으며 후속적으로 세포 사멸을 유도한다. 내인성 조혈 줄기 세포의 고갈은 이식된 조혈 줄기 세포가 귀소할 수 있는 니치를 제공할 수 있고, 이어서 생산적인 조혈을 확립할 수 있다. 이러한 방식으로, 이식된 조혈 줄기 세포는 본원에 설명된 줄기 세포 장애를 앓고 있는 인간 환자와 같은 환자에서 성공적으로 생착될 수 있다. 본원에서 고려되는 Fc-변형된 항체 및 ADC는 내인성 조혈 줄기 세포의 선택적 고갈을 허용할 뿐만 아니라 외인성 조혈 줄기 세포 이식에 대한 감소된 세포독성 효과를 가지며, 이에 따라 조혈 줄기 세포 생착편의 생착을 추가로 촉진한다.
본원에 설명된 항체 또는 결합 단편은 또한 항체 및/또는 단편의 특성을 변경시키는 변형 및/또는 돌연변이, 예를 들어, 반감기를 증가시키거나 감소시키거나, ADCC를 증가시키거나 감소시키는 것들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산을 포함하는 항체가 제공된다. 방사성 표지된 항체는 진단 및 치료 목적(방사성 표지된 분자에 대한 컨쥬게이션이 또 다른 가능한 특징임) 둘 모두에 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 비제한적인 예는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 및 125I, 131I, 및 186Re를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방사성 표지된 아미노산 및 관련 펩티드 유도체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))] 및 미국 특허 번호 4,681,581호, 미국 특허 번호 4,735,210호, 미국 특허 번호 5,101,827호, 미국 특허 번호 5,102,990호(U.S. RE35,500호), 미국 특허 번호 5,648,471호 및 미국 특허 번호 5,697,902호 참조). 예를 들어, 방사성 동위원소는 클로라민 T 방법에 의해 컨쥬게이션될 수 있다.
일 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 결합 단편은 변형된 Fc 영역을 포함하며, 여기서 상기 변형된 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하여 상기 분자는 Fc감마R(FcγR)에 대한 변경된 친화성 또는 결합을 갖는다. Fc 영역 내의 특정 아미노산 위치는 결정학 연구를 통해 FcγR과 직접 접촉하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 아미노산 234-239(힌지 영역), 아미노산 265-269(B/C 루프), 아미노산 297-299(C'/E 루프) 및 아미노산 327-332(F/G) 루프. (문헌[Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273] 참조). 본원에 설명된 항체는 구조적 및 결정학적 분석에 기초하여 FcγR과 직접 접촉하는 적어도 하나의 잔기의 변형을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항-CD45 항체(또는 이의 단편)의 Fc 영역은 참조로서 본원에 명시적으로 포함되는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)]에서와 같이 EU 인덱스에 따른 아미노산 265에서 아미노산 치환을 포함한다. "케이뱃(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 넘버링을 지칭한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265C 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체(또는 이의 단편)의 Fc 영역은 케이뱃에서와 같이 EU 인덱스에 따른 아미노산 234에 아미노산 치환을 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 D265, V205, H435, I253 및/또는 H310의 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이들 위치에서의 특정 돌연변이는 D265C, V205C, H435A, I253A 및/또는 H310A를 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 L234A 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD45 항체(또는 이의 단편)의 Fc 영역은 케이뱃에서와 같이 EU 인덱스에 따른 아미노산 235에 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 L235A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 영역은 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 추가 구현예에서, Fc 영역은 D265C, L234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 또 다른 추가 구현예에서, Fc 영역은 D265C, L234A, L235A 및 H435A 돌연변이를 포함한다. 추가 구현예에서, Fc 영역은 D265C 및 H435A 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 항-CD45 항체는 다음 변형 또는 변형의 조합 중 하나를 포함하는 Fc 영역을 포함한다: D265A, D265C, D265C / H435A, D265C / LALA, D265C / LALA / H435A, D265C / N297G, D265C / N297G / H435A, D265C (IgG2*), D265C (IgG2) / H435A, D265C / N297Q / H435A, D265C / N297Q, EPLVLAdelG / H435A, N297A, N297G 또는 N297Q (케이뱃에 따른 EU 인덱스).
변형된 Fc 영역과 Fc 감마 수용체 사이의 결합 또는 친화성은 당 분야에 공지된 다양한 기술, 비제한적인 예로, 평형화 방법(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008; 또는 방사면역측정법(RIA)) 또는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 다른 메커니즘의 동역학 기반 검정(예를 들어, BIACORE.RTM. 분석 또는 OctetTM 분석(forteBIO)), 및 다른 방법, 예를 들어, 간접 결합 검정, 경쟁적 결합 검정, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)를 사용하여 결정될 수 있다. 이들 및 다른 방법은 검사되는 하나 이상의 성분에 대한 표지를 이용하고/하거나 발색성, 형광성, 발광성 또는 동위원소 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 검출 방법을 사용할 수 있다. 결합 친화성 및 동역학에 대한 상세한 설명은 항체-면역원 상호작용에 초점을 맞춘 문헌[Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 찾을 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재하에 표지된 항원과 관심 항체의 인큐베이션, 및 표지된 항원에 결합된 항체의 검출을 포함하는 방사성 면역 검정이다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화성 및 결합 오프-레이트는 스캐처드 플롯 분석에 의해 데이터로부터 결정될 수 있다. 이차 항체와의 경쟁은 또한 방사성 면역 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 경우, 항원은 증가하는 양의 표지되지 않은 제2 항체의 존재하에 표지된 화합물에 컨쥬게이션된 관심 항체와 함께 인큐베이션된다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 변형을 갖는 항체(예를 들어, D265C, L234A, L235A 및/또는 H435A)는 Fc 감마 수용체에 대한 변형되지 않은 Fc 영역을 포함하는 동일항체의 결합에 비해 Fc 감마 수용체에 대한 결합에서 적어도 70% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 90% 감소, 적어도 95% 감소, 적어도 98% 감소, 적어도 99% 감소 또는 약 100% 감소를 갖는다(예를 들어, 생물층 간섭계(BLI)에 의해 평가됨).
Fc 감마 수용체와의 Fc 영역 결합 상호작용은 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 효과기 기능 및 다운스트림 신호전달 이벤트에 필수적이다. 따라서, 특정 양태에서, 변형된 Fc 영역(예를 들어, L234A, L235A 및/또는 D265C 돌연변이를 포함함)을 포함하는 항체는 실질적으로 감소되거나 폐지된 효과기 기능을 갖는다. 효과기 기능은, 예를 들어, 관심 항체에 대한 반응으로 세포 반응(예를 들어, 비만 세포 탈과립 또는 사이토카인 방출)을 측정함으로써 당 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 예를 들어, 당 분야의 표준 방법을 사용하여, Fc-변형된 항체는, 예를 들어, 인간 말초 혈액 단핵 세포에 의해 비만 세포 탈과립을 촉발하는 능력 또는 사이토카인 방출을 촉발하는 능력에 대해 검정될 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, Fc 영역은(예를 들어, 변형되지 않은 Fc 영역을 갖는 항체에 비해) 반감기를 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 짧은 반감기를 갖는 항체는 항체가 단기 치료제로서 기능할 것으로 예상되는 특정 경우, 예를 들어, 항체가 투여된 후 HSC가 투여되는 본원에 설명된 컨디셔닝 단계에서 유리할 수 있다. 전형적으로, 항체는 또한 일반적으로 표적 항원(예를 들어, CD45)을 발현하지만 내인성 줄기 세포와 달리 항-CD45 항체의 표적이 아닌 HSC의 전달 전에 실질적으로 청소될 것이다. 일 구현예에서, Fc 영역은 위치 435에서 돌연변이(케이뱃에 따른 EU 인덱스)를 포함한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 H435A 돌연변이이다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체는 (예를 들어, 인간에서) 24시간 이하, 23시간 이하, 22시간 이하, 21시간 이하, 20시간 이하, 19시간 이하, 18시간 이하, 17시간 이하, 16시간 이하, 15시간 이하, 14시간 이하, 13시간 이하, 12시간 이하 또는 11시간 이하의 반감기를 갖는다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체는 (예를 들어, 인간에서) 약 1-2시간, 약 1-3시간, 약 1-5시간, 약 1-10시간, 약 5-10시간, 약 5-15시간, 약 10-15시간, 약 10-20시간, 약 15-20시간, 약 15-25시간 또는 약 20-25시간의 반감기를 갖는다.
일부 양태에서, Fc 영역은 감소된 반감기를 부여하고 항체의 효과기 기능을 감소시키는 2개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 반감기의 감소를 발생시키는 돌연변이 및 FcγR과 직접 접촉할 수 있는 적어도 하나의 잔기의 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 구조적 및 결정학적 분석에 기초함). 일 구현예에서, Fc 영역은 H435A 돌연변이, L234A 돌연변이 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 H435A 돌연변이 및 D265C 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 H435A 돌연변이, L234A 돌연변이, L235A 돌연변이 및 D265C 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 Fc 도메인에서 시스테인 잔기에 의해 세포독소(예를 들어, 아마톡신)에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 Fc 도메인에서 돌연변이에 의해 도입된다. 예를 들어, 시스테인 잔기는 Cys118, Cys239 및 Cys265로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 항-CD45 항체(또는 이의 단편)의 Fc 영역은 케이뱃에서와 같이 EU 인덱스에 따른 아미노산 265에 아미노산 치환을 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265C 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265C 및 H435A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265C, L234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. 일 구현예에서, Fc 영역은 D265C, L234A, L235A 및 H435A 돌연변이를 포함한다.
특히, Fc 아미노산 위치는 달리 명시되지 않는 한 EU 넘버링 인덱스를 참조한다.
상기 간행물 각각의 개시내용은 항-CD45 항체에 관한 것이므로 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 항체 및 항원 결합 단편은 상기 설명된 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라 상기 설명된 비-인간 항체 및 항원 결합 단편의 변이체, 및, 예를 들어, 경쟁적 항원 결합 검정에 의해 평가시 살기 설명된 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
본원의 임의의 Fc 변형을 포함하도록 항체를 조작하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이들 방법은 항체 또는 항체의 적어도 불변 영역을 인코딩하는 제조된 DNA 분자의 부위 특이적(또는 올리고뉴클레오티드 매개) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 부위 특이적 돌연변이유발은 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Carter et al., Nucleic Acids Res., 13:4431-4443 (1985) 및 Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1987)] 참조). PCR 돌연변이유발은 또한 시작 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 제조하기에 적합하다. 문헌[Higuchi, in PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); 및 Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)]을 참조한다. 서열 변이체를 제조하기 위한 또 다른 방법인 카세트 돌연변이유발은 문헌[Wells et al., Gene, 34:315-323 (1985)]에 설명된 기술에 기초한다.
특정 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 결합 단편은 표지에 컨쥬게이션될 수 있다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들어, 형광성, 발색성, 전자-밀도, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예를 들어, 효소 또는 리간드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제(U.S. 4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, 3-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 산화효소, 예를 들어, 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소와 커플링된 요산분해효소 및 잔틴 산화효소, 예를 들어, HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
또한, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 mRNA)가 본원에 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄를 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 경쇄를 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, AbA, AbB 또는 AbC의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 본원에 제공된다.
항체 중쇄 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산은 항체 경쇄 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산과 동일한 핵산 분자(예를 들어, 발현 벡터)에 존재할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 서열은 별개의 핵산 분자(예를 들어, 별개의 발현 벡터)에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:
(a) SEQ ID NO:125에 제시된 핵산 서열;
(b) SEQ ID NO:126에 제시된 핵산 서열;
(c) SEQ ID NO:127에 제시된 핵산 서열;
(d) SEQ ID NO:128에 제시된 핵산 서열;
(e) SEQ ID NO:129에 제시된 핵산 서열;
(f) SEQ ID NO:130에 제시된 핵산 서열;
(g) SEQ ID NO:131에 제시된 핵산 서열;
(h) SEQ ID NO:132에 제시된 핵산 서열;
(i) SEQ ID NO:133에 제시된 핵산 서열;
(j) SEQ ID NO:134에 제시된 핵산 서열;
(k) SEQ ID NO:135에 제시된 핵산 서열;
(l) SEQ ID NO:136에 제시된 핵산 서열;
(m) SEQ ID NO:137에 제시된 핵산 서열;
(n) SEQ ID NO:138에 제시된 핵산 서열;
(o) SEQ ID NO:139에 제시된 핵산 서열;
(p) SEQ ID NO:140에 제시된 핵산 서열;
(q) SEQ ID NO:141에 제시된 핵산 서열;
(r) SEQ ID NO:142에 제시된 핵산 서열;
(s) SEQ ID NO:143에 제시된 핵산 서열; 및/또는
(t) SEQ ID NO:144에 제시된 핵산 서열;
여기서, 분리된 핵산은 항-CD45 항체 또는 이의 일부를 인코딩한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다:
(a) SEQ ID NO:150에 제시된 핵산 서열;
(b) SEQ ID NO:151에 제시된 핵산 서열;
(c) SEQ ID NO:152에 제시된 핵산 서열;
(d) SEQ ID NO:153에 제시된 핵산 서열;
(e) SEQ ID NO:154에 제시된 핵산 서열;
(f) SEQ ID NO:155에 제시된 핵산 서열;
(g) SEQ ID NO:156에 제시된 핵산 서열;
(h) SEQ ID NO:157에 제시된 핵산 서열;
(i) SEQ ID NO:158에 제시된 핵산 서열;
(j) SEQ ID NO:159에 제시된 핵산 서열;
(k) SEQ ID NO:160에 제시된 핵산 서열; 및/또는
(l) SEQ ID NO:161에 제시된 핵산 서열;
여기서, 분리된 핵산은 항-CD45 항체 또는 이의 일부를 인코딩한다.
항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567호에 설명된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체를 인코딩하는 분리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음으로 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-CLL-1 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-CD45항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 상기 설명된 바와 같이 항체를 인코딩하는 핵산이 분리되고, 숙주 세포서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리되고 시퀀싱될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 설명된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237호, 5,789,199호 및 5,840,523호를 참조한다. (또한, E. 콜리에서의 항체 단편의 발현을 설명하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 분리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
척추동물 세포가 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
일 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 SEQ ID No와 적어도 95%, 96%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 영역을 포함한다. 대안적으로, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 SEQ ID No와 적어도 95%, 96%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 본원에 개시된 가변 영역의 프레임워크 영역을 갖는 본원에 개시된 SEQ ID No를 포함하는 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
항체를 확인하는 방법
예를 들어, 환자에서 CD45+ 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있는 신규한 항-CD45 항체가 본원에 제공된다. 이들 항체는, 예를 들어, 줄기 세포 이식을 위한 컨디셔닝 방법에 유용할 수 있다. 본원에 제공된 개시내용에 비추어, 다른 항-CD45 항체가 확인될 수 있다.
조혈 줄기에 의해 발현된 CD45에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편 라이브러리의 고 처리량 스크리닝을 위한 방법을 사용하여 암, 자가면역 질병을 치료하고, 본원에 설명된 바와 같은 조혈 줄기 세포 요법을 필요로 하는 환자(예를 들어, 인간 환자)를 컨디셔닝하기에 유용한 항-CD45 항체를 확인할 수 있다. 상기 방법은 본원에 설명된 항-CD45 항체의 개선된 버전을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유동물 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 cDNA 디스플레이와 같은 당 분야에 공지된 시험관 내 디스플레이 기술을 포함한다.
생물학적으로 관련된 분자에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 분리하기 위한 파지 디스플레이의 사용은, 예를 들어, 각각의 개시내용이 시험관 내 디스플레이 기술에 관한 것으로 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Felici et al., Biotechnol. Annual Rev. 1:149-183, 1995; Katz, Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45, 1997; 및 Hoogenboom et al., Immunotechnology 4:1-20, 1998]에서 검토되었다. 각각의 개시내용이 항원 결합 분자의 발견에 관한 것으로 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Kay, Perspect. Drug Discovery Des. 2:251-268, 1995 및 Kay et al., Mol. Divers. 1:139-140, 1996]에 설명된 바와 같이 세포 표면 항원에 결합하는 폴리펩티드를 선택하기 위해 무작위 조합 펩티드 라이브러리가 작제되었다. 다량체 단백질과 같은 단백질은 기능성 분자로서 성공적으로 파지 디스플레이되었다(예를 들어, 각각의 개시내용이 항원 결합 분자의 발현을 위한 시험관 내 디스플레이 기술의 사용에 관한 것으로 본원에 참조로서 포함되는 EP 0349578; EP 4527839; 및 EP 0589877, 뿐만 아니라 문헌[Chiswell and McCafferty, Trends Biotechnol. 10:80-84 1992] 참조). 또한, 기능적 항체 단편, 예를 들어, Fab 및 scFv 단편은 시험관 내 디스플레이 형식으로 발현되었다(예를 들어, 각각의 개시내용이 항원 결합 분자의 발견을 위한 시험관 내 디스플레이 플랫폼에 관한 것으로 본원에 참조로서 포함되는 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552- 554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982, 1991; 및 Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991] 참조). 인간 항-CD45 항체는 또한, 예를 들어, HuMAb-Mouse® 또는 XenoMouse™에서 생성될 수 있다. 이들 기술은 특히 조혈 줄기 세포에 의해 발현된 CD45에 결합할 수 있는 항체들, 항체 또는 단편의 친화성을 확인하고 개선하는 데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 조혈 줄기 세포 이식 요법을 필요로 하는 환자(예를 들어, 인간 환자)에서 내인성 조혈 줄기 세포를 고갈시키는 데 사용될 수 있다.
시험관 내 디스플레이 기술에 추가하여, 전산 모델링 기술을 사용하여 조혈 줄기 세포에 의해 발현된 항원(예를 들어, CD45)에 결합할 수 있는 항체를 설계하고 확인할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 모델링 기술을 사용하여, 당업자는 항원의 세포 외 에피토프와 같은 조혈 줄기 세포에 의해 발현되는 항원(예를 들어, CD45) 상의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 분자에 대해 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 인 실리코(in silico)로 스크리닝할 수 있다.
조혈 줄기 세포에 의해 발현되고, 예를 들어, 수용체-매개 세포내이입에 의해 세포에 의해 내재화되는 CD45에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 확인하기 위해 추가 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 설명된 시험관 내 디스플레이 기술은 CD45에 결합하고 후속적으로 내재화되는 항체 또는 항체 단편을 스크리닝하도록 적합화될 수 있다. 파지 디스플레이는 이러한 스크리닝 패러다임과 함께 사용될 수 있는 하나의 상기 기술을 나타낸다. 조혈 줄기 세포에 의해 내재화될 수 잇는 항-CD45 항체 또는 항체 단편을 확인하기 위해, 당업자는 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Williams et al., Leukemia 19:1432-1438, 2005]에 설명된 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 당 분야에 공지된 돌연변이유발 방법을 사용하여, 무작위화된 아미노산 카세트(예를 들어, CDR 또는 이의 등가 영역 또는 항체 또는 항체 단편 중 하나 이상 또는 모두)를 함유하는 항체, 항체 단편, 예를 들어, 특히 scFv 단편, Fab 단편, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 10Fn3 도메인, 또는 리간드를 인코딩하는 재조합 파지 라이브러리가 생성될 수 있다. 프레임워크 영역, 힌지, Fc 도메인, 및 항체 또는 항체 단편의 다른 영역은, 예를 들어, 인간 점라인 항체 서열 또는 인간 점라인 항체에 비해 단지 작은 변이를 나타내는 서열에 의해 인간에서 비-면역원성이 되도록 설계될 수 있다.
본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 파지 입자에 공유적으로 결합된 무작위화된 항체 또는 항체 단편을 함유하는 파지 라이브러리는, 예를 들어, 먼저 비-특이적 단백질 결합을 나타내는 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 파지 및 Fc 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 파지를 제거하기 위해 파지 라이브러리와 차단제(예를 들어, 우유 단백질, 소 혈청 알부민 및/또는 IgG)를 인큐베이션한 후, 파지 라이브러리와 CD45를 발현하는 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포의 집단을 인큐베이션함으로써 CD45와 함께 인큐베이션될 수 있다. 파지 라이브러리는 항-CD45 항체 또는 항체 단편이 인지체 세포-표면 항원에 결합하고, 후속적으로 조혈 줄기 세포에 의해 내재화되기에 충분한 시간(예를 들어, 4℃에서 30분 내지 6시간, 예를 들어, 4℃에서 1시간) 동안 조혈 줄기 세포와 인큐베이션될 수 있다. 조혈 줄기 세포에 대한 결합 및 이에 의한 내재화를 허용하기 위해 CD45에 대해 충분한 친화성을 나타내지 않는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 파지는 후속적으로, 예를 들어, pH 2.8의 저온(4℃) 0.1 M 글리신 완충제로 세포를 세척함으로써 제거될 수 있다. 조혈 줄기 세포에 의해 내재화된 항체 또는 항체 단편에 결합된 파지는, 예를 들어, 세포를 용해시키고 세포 배양 배지로부터 내재화된 파지를 회수함으로써 확인될 수 있다. 이후, 파지는, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 2xYT 배지에서 회수된 파지와 함께 박테리아 세포를 인큐베이션함으로써 박테리아 세포에서 증폭될 수 있다. 이러한 배지로부터 회수된 파지는 이후, 예를 들어, 파지 유전체 내에 삽입된 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 유전자(들)의 핵산 서열을 결정함으로써 특성규명될 수 있다. 인코딩된 항체 또는 항체 단편은 이후 화학적 합성(예를 들어, 항체 단편, 예를 들어, scFv 단편) 또는 재조합 발현(예를 들어, 전장 항체)에 의해 새로 제조될 수 있다.
제조된 항체 또는 항체 단편의 내재화 능력은, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방사성 핵종 내재화 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 시험관 내 디스플레이 기술을 사용하여 확인된 항-CD45 항체 또는 항체 단편은 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 77As, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 212Bi, 213Bi 또는 225Ac와 같은 방사성 동위원소의 혼입에 의해 기능화될 수 있다. 예를 들어, 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At와 같은 방사성 할로겐은 친전자성 할로겐 시약(예를 들어, Iodination Beads, Thermo Fisher Scientific, Inc., Cambridge, MA)을 함유하는 폴리스티렌 비드와 같은 비드를 사용하여 항체 또는 항체 단편에 혼입될 수 있다. 방사선 표지된 항체, 이의 단편 또는 ADC는 내재화를 허용하기에 충분한 시간 동안(예를 들어, 4℃에서 30분 내지 6시간, 예를 들어, 4℃에서 1시간) 조혈 줄기 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이후, 세포는 세척되어 내재화되지 않은 항체 또는 이의 단편을 제거할 수 있다(예를 들어, pH 2.8의 저온(4℃) 0.1 M 글리신 완충제를 사용함). 내재화된 항체 또는 항체 단편은 회수된 세척 완충제의 방출된 방사선(예를 들어, γ-방사선)과 비교하여 생성된 조혈 줄기 세포의 방출된 방사선(예를 들어, γ-방사선)을 검출함으로써 확인될 수 있다. 상기 내재화 검정은 또한 ADC를 특성규명하는 데 사용될 수 있다.
항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567호에 설명된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체를 인코딩하는 분리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 구현예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음으로 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항-CLL-1 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서 상기 제공된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 것을 포함한다.
항-CD45항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 상기 설명된 바와 같이 항체를 인코딩하는 핵산이 분리되고, 숙주 세포서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 잇는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리되고 시퀀싱될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 설명된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237호, 5,789,199호 및 5,840,523호를 참조한다. (또한, E. 콜리에서의 항체 단편의 발현을 설명하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254]을 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 분리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
척추동물 세포가 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들어, 문헌[Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0와 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
항체 약물 컨쥬게이트(ADC)
본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 세포독소에 컨쥬게이션(연결)될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포독성 분자는 본원에 개시된 바와 같은 세포 내재화 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 컨쥬게이션되어, 항체 또는 이의 단편의 세포 흡수 후, 세포독소가 이의 세포 내 표적에 접근하여 조혈 세포 사멸을 매개할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 설명된 VH 및 VL 가변 영역(또는 본원에 설명된 경쇄 및 중쇄 CDR 세트를 포함하는 가변 영역)을 포함하는 항-CD45 scFv는 독소에 컨쥬게이션되어 scFv 독소를 형성한다.
세포독소
다양한 세포독소는 본원에 설명된 요법에 사용하기 위해 링커를 통해 항-CD45 항체에 컨쥬게이션될 수 있다. 특히, 항-CD45 ADC는 세포독성 모이어티(또는 세포독소)에 컨쥬게이션된(즉, 링커에 의해 공유적으로 부착된) 항-CD45 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 포함한다. 다양한 구현예에서, 세포독성 모이어티는 컨쥬게이트에 결합되는 경우 감소된 또는 세포독성을 나타내거나 세포독성을 나타내지 않지만, 링커로부터의 절단 후에 세포독성을 재개한다. 다양한 구현예에서, 세포독성 모이어티는 링커로부터의 절단 없이 세포독성을 유지한다. 일부 구현예에서, 세포독성 분자는 본원에 개시된 바와 같은 세포 내재화 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 컨쥬게이션되어, 항체 또는 이의 단편의 세포 흡수 후, 세포독소가 이의 세포 내 표적에 접근하여, 예를 들어, T 세포 사멸을 매개할 수 있다.
따라서, 본 발명의 ADC는 하기 일반식을 가질 수 있다:
Ab-(Z-L-D)n
상기 식에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(Ab)은 링커(L)에, 화학적 모이어티(Z)를 통해 세포독성 모이어티("약물", D 또는 "Cy")에 컨쥬게이션(공유적으로 결합)된다.
따라서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 약 1 내지 약 20의 범위일 수 있는 항체 당 세포독소의 평균 수를 나타내는 정수 n으로 표시된 바와 같이 다수의 약물 모이어티에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 4이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 컨쥬게이션 반응으로부터 ADC의 제조에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 수는 질량분광법, ELISA 검정 및 HPLC와 같은 통상적인 수단에 의해 특성규명될 수 있다. n에 대한 ADC의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. 일부 예에서, n이 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성규명은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항-CD45 ADC의 경우, 이들은 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 시스테인 티올인 경우, 항체는 단지 하나 또는 여러 개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있거나, 링커가 부착될 수 있는 단지 하나 또는 여러 개의 충분히 반응성인 티올 기를 가질 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 자유 및 반응성 시스테인 티올 기를 함유하지 않으며; 주로, 항체의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는 반응성 시스테인 티올 기를 생성하기 위해 부분적 또는 전체 환원 조건하에 디티오트레이톨(DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀(TCEP)과 같은 환원제로 환원될 수 있다. 특정 구현예에서, 더 높은 약물 로딩(DAR), 예를 들어, n>5는 특정 항체-약물 컨쥬게이트의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성의 손실을 유발할 수 있다.
특정 구현예에서, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 컨쥬게이션 반응 동안 항체에 컨쥬게이션된다. 항체는, 예를 들어, 하기 논의되는 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 함유할 수 있다. 가장 반응성인 리신 기만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 리신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성 기를 나타내기 위해 변성 조건에 적용된다.
ADC의 로딩(약물/항체 비)은, 예를 들어, (i) 항체에 비한 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 과량을 제한하거나, (ii) 컨쥬게이션 반응 시간 또는 온도를 제한하거나, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건에 의하거나, (iv) 시스테인 잔기의 수 및 위치가 링커-약물 부착의 수 및/또는 위치의 제어를 위해 변형되도록 항체의 아미노산 서열을 재조합 기술에 의해 조작함에 의해 상이한 방식으로 제어될 수 있다.
본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 세포독소는 당 분야에 공지된 다른 것들 중에서 DNA-중격제(예를 들어, 안트라사이클린), 유사분율 방추 장치를 파괴할 수 있는 제제(예를 들어, 빈카 알칼로이드, 메이탄신, 메이탄시노이드 및 이들의 유도체), RNA 중합효소 억제제(예를 들어, 아마톡신, 예를 들어, α-아마니틴 및 이들의 유도체), 및 단백질 생합성을 방해할 수 있는 제제(예를 들어, rRNA N-글리코시다제 활성을 나타내는 제제, 예를 들어, 사포린 및 리신 A-사슬)를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포독소는 미세관-결합제(예를 들어, 메이탄신 또는 메이탄시노이드), 아마톡신, 슈도모나스 외독소 A, 데부가닌, 디프테리아 독소, 사포린, 아우리스타틴, 안트라사이클린, 칼리케아마이신, 이리노테칸, SN-38, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노벤조디아제핀, 인돌리노벤조디아제핀 이량체, 또는 이들의 변이체, 또는 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 또 다른 세포독성 화합물이다.
일부 구현예에서, 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독소는 RNA 중합효소 억제제이다. 일부 구현예에서, RNA 중합효소 억제제는 아마톡신 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독소는 아마톡신 또는 이의 유도체, 예를 들어, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 아마눌린산, 프로아마눌린 또는 이들의 유도체이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항-CD45 ADC에 사용될 수 있는 세포독소에 관한 추가 세부사항은 하기에 설명된다.
아마톡신
일부 구현예에서, 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독소는 RNA 중합효소 억제제인 아마톡신 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체-약물 컨쥬게이트의 세포독소는 아마톡신 또는 이의 유도체, 예를 들어, α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아미드, 아마눌린, 아마눌린산, 프로아마눌린 또는 이들의 유도체이다.
하기 화학식 IV로 표현되는 예시적인 아마톡신의 구조; 예는 또한, 예를 들어, 문헌[Zanotti et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 450-459]에 개시되어 있다.
Figure pct00025
.
하기 표는 추가적인 아마톡신 구조를 제공한다:
Figure pct00026
본원에 설명된 조성물, 예를 들어, 항-CD45 ADC 및 방법과 함께 유용한 아마톡신은 하기 화학식 (V)에 따른 화합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00027
상기 식에서,
R1은 H, OH 또는 ORA이고;
R2는 H, OH 또는 ORB이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2 또는 ORD이고;
R9은 H, OH 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 아마톡신은 하기 화학식 (VA)에 따른 화합물을 포함한다:
Figure pct00028
상기 식에서, R4, R5, X 및 R8은 각각 상기 정의된 바와 같다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 아마톡신은 하기 화학식 (VB)에 따른 화합물을 포함한다:
Figure pct00029
상기 식에서,
R1은 H, OH 또는 ORA이고;
R2는 H, OH 또는 ORB이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2 또는 ORD이고;
R9은 H, OH 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 아마톡신은 또한 하기 화학식 (VC)에 따른 화합물을 포함한다:
Figure pct00030
상기 식에서,
R1은 H, OH 또는 ORA이고;
R2는 H, OH 또는 ORB이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORD 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2 또는 ORD이고;
R9은 H, OH 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이다.
본원에 설명된 컨쥬게이트에 사용될 수 있는 아마톡신의 추가 예는 내용이 본원에 참조로서 포함되는 WO 2020/216927호에 설명된 것들을 포함한다. 일 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 아마톡신에 컨쥬게이션되며, 여기서 ADC는 하기 화학식 (VI)의 구조 또는 이의 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00031
상기 식에서,
Q는 S이고;
L은 링커이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티이고;
Ab는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 구현예에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 링커는 절단 불가능한 링커이다. 일 구현예에서, L은 -(CH2)n- 단위를 포함하고, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일 구현예에서, L은 -(CH2)n-이고, 여기서 n은 6이다. 일 구현예에서, Ab-Z-L로 함께 취해진 Ab, Z 및 L은 하기 화학식으로 표현된다:
Figure pct00032
상기 식에서, S는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 시스테인 잔기의 황 원자이다.
일 구현예에서, ADC는 아마톡신에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함하고, ADC는 하기 화학식 (VII)에 따른 구조 또는 이의 입체이성질체를 갖는다:
Figure pct00033
.
일 구현예에서, ADC는 아마톡신에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함하고, ADC는 하기 화학식 (VIIA)에 따른 구조를 갖는다:
Figure pct00034
.
일 구현예에서, ADC는 아마톡신에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함하고, ADC는 하기 화학식 (VIIB)에 따른 구조를 갖는다:
Figure pct00035
.
아마톡신을 제조하는 합성 방법은 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 9,676,702호에 설명되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학식 Ab-Z-L-Am로 표현되는 컨쥬게이트를 형성하기 위해 아마톡신에 결합될 수 있으며, 여기서 Ab는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, L은 링커이고, Z는 화학적 모이어티이고, Am은 아마톡신이다. 아마톡신 또는 이의 유도체 상의 많은 위치는 연결 모이어티 L 및 이에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 공유 결합하는 위치로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (I)로 표현된다:
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H, RC 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RC는 -L-Z이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
L은 링커, 예를 들어, 선택적으로 치환되는 알킬렌(예를 들어, C1-C6 알킬렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬렌(C1-C6 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환되는 알케닐렌(예를 들어, C2-C6 알케닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐렌), 선택적으로 치환되는 알키닐렌(예를 들어, C2-C6 알키닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐렌), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌, 펩티드, 디펩티드, -(C=O)-, 디설파이드, 하이드라존 또는 이들의 조합이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 표적 항원(예를 들어, CD45)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이다.
일부 구현예에서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 함유한다.
일부 구현예에서, L-Z는 하기이다:
Figure pct00036
상기 식에서, S는 표적 항원(예를 들어, 시스테인 잔기의 -SH 기로부터)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기를 나타내는 황 원자이다.
일부 구현예에서, 컨쥬게이트는 화학식 III, IIIA 또는 IIIB 중 하나로 표현된다:
Figure pct00037
상기 식에서, X는 S, SO 또는 SO2이고, Ab는 Ab 부착 지점을 나타내기 위해 제시된다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab는 하기이다:
Figure pct00038
상기 식에서, Ab는 Ab 부착 지점을 나타내기 위해 제시된다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab는 하기이다:
Figure pct00039
상기 식에서, Ab는 Ab 부착 지점을 나타내기 위해 제시된다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab는 하기이다:
Figure pct00040
상기 식에서, Ab는 Ab 부착 지점을 나타내기 위해 제시된다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab 전구체, Am-L-Z'은 하기이다:
Figure pct00041
상기 식에서, 말레이미드는 항체의 시스테인에서 발견되는 티올 기와 반응한다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab 전구체, Am-L-Z'은 하기이다:
Figure pct00042
상기 식에서, 말레이미드는 항체의 시스테인에서 발견되는 티올 기와 반응한다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 하기 화학식 (IA)로 표현된다:
Figure pct00043
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H, RC 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RC는 -L-Z이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
L은 링커, 예를 들어, 선택적으로 치환되는 알킬렌(예를 들어, C1-C6 알킬렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬렌(C1-C6 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환되는 알케닐렌(예를 들어, C2-C6 알케닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐렌), 선택적으로 치환되는 알키닐렌(예를 들어, C2-C6 알키닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐렌), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌, 펩티드, 디펩티드, -(C=O)-, 디설파이드, 하이드라존 또는 이들의 조합이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이고;
상기 식에서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 함유한다.
일부 구현예에서, L-Z는 하기이다:
Figure pct00044
.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 하기 화학식 (IB)로 표현된다:
Figure pct00045
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
R3는 H, RC 또는 RD이고;
R4는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
RC는 -L-Z이고;
RD는 선택적으로 치환되는 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬(예를 들어, C1-C6 헤테로알킬), 선택적으로 치환되는 알케닐(예를 들어, C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐), 선택적으로 치환되는 알키닐(예를 들어, C2-C6 알키닐), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
L은 링커, 예를 들어, 선택적으로 치환되는 알킬렌(예를 들어, C1-C6 알킬렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알킬렌(C1-C6 헤테로알킬렌), 선택적으로 치환되는 알케닐렌(예를 들어, C2-C6 알케닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알케닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알케닐렌), 선택적으로 치환되는 알키닐렌(예를 들어, C2-C6 알키닐렌), 선택적으로 치환되는 헤테로알키닐렌(예를 들어, C2-C6 헤테로알키닐렌), 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌, 펩티드, 디펩티드, -(C=O)-, 디설파이드, 하이드라존 또는 이들의 조합이고;
Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이고;
상기 식에서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 함유한다.
일부 구현예에서, L-Z는 하기이다:
Figure pct00046
.
일부 구현예에서, RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 하기 화학식의 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성한다:
Figure pct00047
상기 식에서, Y는 -(C=O)-, -(C=S)-, -(C=NRE)- 또는 -(CRERE')-이고;
RE 및 RE'은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬렌-RC, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬렌-RC, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐렌-RC, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐렌-RC, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐렌-RC, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐렌-RC, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌-RC, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌-RC, 선택적으로 치환되는 아릴렌-RC 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌-RC이다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현된다:
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 하기를 형성하고;
Figure pct00048
R3는 H 또는 RC이고;
R4는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R5는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R6는 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R7은 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
R8은 OH, NH2, ORC 또는 NHRC이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC 및 RD는 각각 상기 정의된 바와 같다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현된다:
상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 하기를 형성하고;
Figure pct00049
R3는 H 또는 RC이고;
R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, OH, ORC, RC 또는 ORD이고;
R6 및 R7은 각각 H이고;
R8은 OH, NH2, ORC 또는 NHRC이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC는 상기 정의된 바와 같다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현되고,
상기 식에서, R1은 H, OH 또는 ORA이고;
R2는 H, OH 또는 ORB이고;
RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 하기를 형성하고;
Figure pct00050
R3, R4, R6 및 R7은 각각 H이고;
R5는 ORC이고;
R8은 OH 또는 NH2이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC는 상기 정의된 바와 같다. 상기 아마톡신 컨쥬게이트는, 예를 들어, 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0002298호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현된다:
상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 OH이고;
R3는 RC이고;
R4, R6 및 R7은 각각 H이고;
R5는 H, OH 또는 OC1-C6 알킬이고;
R8은 OH 또는 NH2이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC는 상기 정의된 바와 같다. 상기 아마톡신 컨쥬게이트는, 예를 들어, 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0294865호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현된다:
상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 OH이고;
R3, R6 및 R7은 각각 H이고;
R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, OH, ORC 또는 RC이고;
R8은 OH 또는 NH2이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC는 상기 정의된 바와 같다. 상기 아마톡신 컨쥬게이트는, 예를 들어, 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0218220호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 화학식 (IA) 또는 화학식 (IB)로 표현된다:
상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 OH이고;
R3, R6 및 R7은 각각 H이고;
R4 및 R5는 각각 독립적으로 H 또는 OH이고;
R8은 OH, NH2, ORC 또는 NHRC이고;
R9은 H 또는 OH이고;
X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
상기 식에서, RC는 상기 정의된 바와 같다. 상기 아마톡신 컨쥬게이트는, 예를 들어, 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 9,233,173호 및 9,399,681호뿐만 아니라 US 2016/0089450호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab 전구체 Am-L-Z'은 하기이다:
Figure pct00051
.
본원에 개시된 조성물 및 방법에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 컨쥬게이션에 사용될 수 있는 추가의 아마톡신은, 예를 들어, 개시 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO 2016/142049호; WO 2016/071856호; WO 2017/149077호; WO 2018/115466호; 및 WO 2017/046658호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, Am-L-Z는 하기 화학식 (II), 화학식 (IIA) 또는 화학식 (IIB)로 표현된다:
Figure pct00052
상기 식에서, X는 S, SO 또는 SO2이고; R1은 H 또는 링커에 존재하는 반응성 치환기 Z'와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성되는 화학적 모이어티 Z를 통해 항체 또는 항원 결합 단편에 공유적으로 결합된 링커; R2는 H 또는 링커에 존재하는 반응성 치환기 Z'와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성되는 화학적 모이어티 Z를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유적으로 결합된 링커이고; 여기서, R1이 H인 경우, R2는 링커이고, R2가 H인 경우, R1은 링커이다.
일부 구현예에서, R1은 링커이고, R2는 H이고, 함께 L-Z로서 링커 및 화학적 모이어티는 하기이다:
Figure pct00053
.
일부 구현예에서, R1은 링커이고, R2는 H이고, 함께 L-Z로서 링커 및 화학적 모이어티는 하기이다:
Figure pct00054
.
일 구현예에서, Am-L-Z-Ab는 하기이다:
Figure pct00055
.
일 구현예에서, Am-L-Z-Ab는 하기이다:
Figure pct00056
.
일부 구현예에서, Am-L-Z-Ab 전구체 Am-L-Z'은 하기 중 하나이다:
Figure pct00057
상기 식에서, 말레이미드는 항체의 시스테인에서 발견되는 티올 기와 반응하여 컨쥬게이트 Am-L-Z-Ab를 형성한다.
일부 구현예에서, 세포독소는 α-아마니틴이다. 일부 구현예에서, α-아마니틴은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, α-아마니틴은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 α-아마니틴에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 α-아마니틴-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -((C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00058
또는
Figure pct00059
.
일부 구현예에서, 세포독소는 β-아마니틴이다. 일부 구현예에서, β-아마니틴은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, β-아마니틴은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 β-아마니틴에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 β-아마니틴-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00060
또는
Figure pct00061
.
일부 구현예에서, 세포독소는 γ-아마니틴이다. 일부 구현예에서, γ-아마니틴은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, γ-아마니틴은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 γ-아마니틴에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 γ-아마니틴-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00062
또는
Figure pct00063
.
일부 구현예에서, 세포독소는 ε-아마니틴이다. 일부 구현예에서, ε-아마니틴은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, ε-아마니틴은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 ε-아마니틴에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 ε-아마니틴-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00064
또는
Figure pct00065
.
일부 구현예에서, 세포독소는 아마닌이다. 일부 구현예에서, 아마닌은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 아마닌은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 아마닌에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 아마닌-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00066
또는
Figure pct00067
.
일부 구현예에서, 세포독소는 아마닌아미드이다. 일부 구현예에서, 아마닌아미드는 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 아마닌아미드는 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나에서 화학식 V의 아마닌아미드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00068
또는
Figure pct00069
.
일부 구현예에서, 세포독소는 아마눌린이다. 일부 구현예에서, 아마눌린은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 아마눌린은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 아마눌린에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 아마눌린-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00070
또는
Figure pct00071
.
일부 구현예에서, 세포독소는 아마눌린산이다. 일부 구현예에서, 아마눌린산은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 아마눌린산은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 아마눌린산에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 아마눌린산-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00072
또는
Figure pct00073
.
일부 구현예에서, 세포독소는 프로아마눌린이다. 일부 구현예에서, 프로아마눌린은 링커 L을 통해 항-CD45 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 프로아마눌린은 화학식 V의 화합물이다. 링커 L은 여러 가능한 위치 중 어느 하나(예를 들어, R1-R9에서 임의의 것)에서 화학식 V의 프로아마눌린에 부착되어 화학식 I, IA, IB, II, IIA 또는 IIB의 프로아마눌린-링커 컨쥬게이트를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 파라-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Cit-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 모이어티 PAB-Ala-Val을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)n- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(CH2)n- 단위를 포함하며, 여기서 n은 2-6의 정수이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, 링커는 -PAB-Cit-Val-(C=O)(CH2)n-이다. 일부 구현예에서, L-Z로 함께 취해진 링커 L 및 화학적 모이어티 Z는 하기와 같다:
Figure pct00074
또는
Figure pct00075
.
아마톡신을 제조하는 합성 방법은 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 9,676,702호에 설명되어 있다.
본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 항체 및 항원 결합 단편은 당 업계에 공지되거나 본원에 설명된 컨쥬게이션 기술을 사용하여 아마톡신, 예를 들어, α-아마니틴 또는 이의 변이체에 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원, 예를 들어, 아마톡신, 예를 들어, α-아마니틴 및 이의 변이체뿐만 아니라 공유 컨쥬게이션에 사용될 수 있는 공유 링커을 인식하고 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편(항-CD45 항체는 개시내용이 해당되는 참조로서 본원에 포함되는 US 2015/0218220호에 설명된 바와 같은 아마톡신, 예를 들어, α-아마니틴 또는 이의 변이체에 커플링될 수 있음).
아우리스타틴
본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 아우리스타틴인 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다(미국 특허 번호 5,635,483호; 5,780,588호). 아우리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해 및 핵 및 세포 분열을 방해하고(Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), 항암(미국 특허 번호 5,663,149호) 및 항진균 활성(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 항-유사분열 제제이다(미국 특허 번호 5,635,483호; 5,780,588호). 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카르복시) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO 02/088172호).
예시적인 아우리스타틴 구현예는 개시 전체내용이 참조로서 명시적으로 포함되는 2004년 3월 28일에 발표된 문헌[Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623]에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE이고, 여기서 물결선은 항체-링커 컨쥬게이트의 링커에 대한 공유 부착 지점(본원에 개시된 바와 같은 -L-Z-Ab 또는 -L-Z')을 나타낸다:
Figure pct00076
.
또 다른 예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAF이고, 여기서 물결선은 US 2005/0238649호에 개시된 바와 같이 항체-링커 컨쥬게이트의 링커에 대한 공유 부착 지점(본원에 개시된 바와 같은 -L-Z-Ab 또는 -L-Z')을 나타낸다:
Figure pct00077
.
아우리스타틴은 미국 특허 번호 5,635,483호; 미국 특허 번호 5,780,588호; 문헌[Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; 및 Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784]의 방법에 따라 제조될 수 있다.
메이탄시노이드
본원에 설명된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 미세관 결합제인 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 미세관 결합제는 메이탄신, 메이탄시노이드 또는 메이탄시노이드 유사체이다. 메이탄시노이드는 미세관에 결합하고 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동 아프리카 관목인 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 처음 분리되었다(미국 특허 번호 3,896,111호). 이후, 특정 미생물은 또한 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다(미국 특허 번호 4,151,042호). 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,137,230호; 4,248,870호; 4,256,746호; 4,260,608호; 4,265,814호; 4,294,757호; 4,307,016호; 4,308,268호; 4,308,269호; 4,309,428호; 4,313,946호; 4,315,929호; 4,317,821호; 4,322,348호; 4,331,598호; 4,361,650호; 4,364,866호; 4,424,219호; 4,450,254호; 4,362,663호; 및 4,371,533호에 개시되어 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티는 이들이 (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화에 의해 제조하기에 비교적 접근 가능하고, (ii) 비-디설파이드 링커를 통한 항체로의 컨쥬게이션에 적합한 작용기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 세포주에 대해 효과적이기 때문에 항체 약물 컨쥬게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다.
적합한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀의 에스테르, 합성 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 유사체 및 유도체를 포함한다. 미세관 형성을 억제하고, 메이탄시노이드, 메이탄시놀, 및 메이탄시놀 유사체 및 유도체와 같이 포유동물 세포에 매우 독성이 있는 임의의 세포독소가 본원에 포함된다.
적합한 메이탄시놀 에스테르의 예는 변형된 방향족 고리를 갖는 것들 및 다른 위치에서 변형을 갖는 것들을 포함한다. 상기 적합한 메이탄시노이드는 각각의 개시내용이 메이탄시노이드 및 이의 유도체에 관한 것으로 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 4,137,230호; 4,151,042호; 4,248,870호; 4,256,746호; 4,260,608호; 4,265,814호; 4,294,757호; 4,307,016호; 4,308,268호; 4,308,269호; 4,309,428호; 4,313,946호; 4,315,929호; 4,317,821호; 4,322,348호; 4,331,598호; 4,361,650호; 4,362,663호; 4,364,866호; 4,424,219호; 4,450,254호; 4,322,348호; 4,362,663호; 4,371,533호; 5,208,020호; 5,416,064호; 5,475,092호; 5,585,499호; 5,846,545호; 6,333,410호; 7,276,497호; 및 7,473,796호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 세포독성제로서 공식적으로 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신으로 언급되는 티올-함유 메이탄시노이드(DM1)을 사용한다. DM1은 하기 구조식으로 표현된다:
Figure pct00078
.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성제로서 티올-함유 메이탄시노이드 N2'-데아세틸-N2'(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(예를 들어, DM4)을 사용한다. DM4는 하기 구조식으로 표현된다:
Figure pct00079
.
입체 장애 티올 결합을 함유하는 측쇄를 포함하는 또 다른 메이탄시노이드는 하기 구조식으로 표현되는 N2'-데아세틸-N-2'(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3으로 언급됨)이다:
Figure pct00080
.
미국 특허 번호 5,208,020호 및 7,276,497호에 교시된 각각의 메이탄시노이드는 또한 본 발명의 개시의 컨쥬게이트에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 5,208,020호 및 7,276,697호의 전체 개시내용은 본원에 참조로서 포함된다.
마이탄시노이드 상의 많은 위치는 연결 모이어티 및 이에 따라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 공유 결합하는 위치로서 작용할 수 있다(본원에 설명된 바와 같이 -L-Z-Ab 또는 -L-Z'). 예를 들어, 하이드록실 기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록시로 변형된 C-15 위치 및 하이드록시 기를 갖는 C-20 위치가 모두 유용할 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, C-3 위치는 링커 모이어티를 공유 결합하는 위치로 작용하고, 일부 특정 구현예에서, 마이탄시놀의 C-3 위치는 연결 모이어티를 공유 결합하는 위치로 작용한다. 예를 들어, 개시내용이 참조로서 본원에 명시적으로 포함되는 미국 특허 번호 5,208,020호, 6,441,163호, 및 EP 특허 번호 0425235 B1호; 문헌[Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 및 미국 2005/0169933 A1호에 개시된 것을 포함하는 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하기 위한 당 분야에 공지된 많은 연결 기가 존재한다. 추가 연결 기는 본원에 설명되고 예시된다.
본 발명은 또한 메이탄시노이드 및 컨쥬게이트의 다양한 이성질체 및 혼합물을 포함한다. 본 발명의 특정 화합물 및 컨쥬게이트는 다양한 입체 이성질체, 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 상기 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 생성하기 위한 여러 설명이 각각의 전체내용이 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,208,020호; 5,416,064호; 6,333,410호; 6,441,163호; 6,716,821호; 및 7,368,565호에 제공된다.
안트라사이클린
다른 구현예에서, 본원에 설명된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 안트라사이클린 분자인 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 연구는 안트라사이클린이 1) 약물 분자를 세포의 DNA로 개재시킴으로써 DNA-의존성 핵산 합성을 억제함; 2) 세포에 손상을 야기시키기 위해 이후에 세포 거대분자와 반응하는 자유 라디칼의 약물에 의한 생성; 또는 3) 약물 분자와 세포막의 상호작용을 포함하는 다수의 상이한 메커니즘에 의해 세포를 사멸시키도록 작동할 수 있음을 시사하였다[예를 들어, 문헌[C. Peterson et al.," Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp.97-102] 참조]. 이들의 세포독성 잠재성 때문에 안트라사이클린은 백혈병, 유방 암종, 폐 암종, 난소 샘암종 및 육종과 같은 다수의 암의 치료에 사용되어 왔다[예를 들어, 문헌[P.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11] 참조]. 일반적으로 사용되는 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 다우노마이신을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포독소는 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 이다루비신으로 구성된 군으로부터 선택되는 안트라사이클린이다. 안트라사이클린의 대표적인 예는 다우노루비신(세루비딘; Bedford Laboratories), 독소루비신(아드리아마이신; Bedford Laboratories; 독소루비신 하이드로클로라이드, 하이드록시-다우노루비신, 및 루벡스로도 언급됨), 에피루비신(엘렌스; Pfizer) 및 이다루비신(이다마이신; Pfizer Inc.)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
안트라사이클린 유사체인 독소루비신(ADRIAMYCIN)은 전사를 위해 DNA를 푸는 효소 국소이성화효소 II의 개재 및 진행 억제에 의해 DNA와 상호작용하는 것으로 생각된다. 독소루비신은 복제를 위해 DNA 사슬을 끊은 후 국소이성화효소 II 복합체를 안정화시켜 DNA 이중 나선이 재밀봉되는 것을 방지하여 복제 과정을 중단시킨다. 독소루비신 및 다우노루비신(DAUNOMYCIN)은 원형 세포독성 천연 생성물 안트라사이클린 화학요법제이다(Sessa et al., (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7:75-79).
본원에서 사용하기에 적합한 안트라사이클린의 한 가지 비제한적인 예는 PNU-159682("PNU")이다. PNU는 모(parent) 네모루비신에 비해 3000배 초과의 세포독성을 나타낸다(Quintieri et al., Clinical Cancer Research 2005, 11, 1608-1617). PNU는 하기 구조식으로 표현된다:
Figure pct00081
.
PNU와 같은 안트라사이클린 상의 다중 위치는 연결 모이어티 및 이에 따라 본원에 설명된 바와 같은 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 공유 결합하는 위치로 작용할 수 있다. 예를 들어, 링커는 하이드록시메틸 케톤 측쇄에 대한 변형을 통해 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 PNU 유도체이다:
Figure pct00082
상기 식에서, 물결선은 본원에 설명된 바와 같은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 PNU 유도체이다:
Figure pct00083
상기 식에서, 물결선은 본원에 설명된 바와 같은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
벤조디아제핀
다른 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 설명된 바와 같은 PBD 또는 IGN과 같은 벤조디아제핀 모이어티를 포함하는 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다.
피롤로벤조디아제핀(PBD)
일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 피롤로벤조디아제핀("PBD")인 세포독소 또는 PBD를 포함하는 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. PBD는 특정 방선균에 의해 생성되는 천연 생성물이며, 서열 선택성 DNA 알킬화 화합물인 것으로 나타났다. PBD 세포독소는 안트라마이신, 이량체성 PBD, 및, 예를 들어, 문헌[Hartley, JA (2011). "The development of pyrrolobenzodiazepines as antitumor agents" Expert Opin. Inv. Drug, 20(6), 733-744; and Antonow, D. and Thurston, D.E. (2011) "Synthesis of DNA-interactive pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines (PBDs)". Chem. Rev. 111: 2815-2864]에 개시된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
PBD는 하기 일반 구조를 갖는다:
Figure pct00084
.
이들은 치환기의 수, 유형 및 위치에서, 이들의 방향족("A") 고리 및 피롤로("C") 고리 둘 모두에서, C 고리의 포화도에서 상이하다. 디아제핀 B-고리에서, N10-C11 위치에 이민(N=C), 카르비놀아민(NH-CH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NH-CH(OMe))가 있다. 이러한 위치는 DNA 알킬화를 담당하는 친전자성 모이어티이다. 공지된 모든 천연 생성물 PBD는 키랄 C11a 위치에서 (S)-구성을 가지며, 이는 C 고리에서 A 고리를 향해 관찰하는 경우 이들에게 우선성을 제공한다. 이는 B-형태 DNA의 작은 홈을 갖는 등나선성에 대한 적절한 3차원 형상을 제공하여 결합 부위에 단단히 고정되게 한다(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). 작은 홈에 부가물을 형성하는 PBD의 능력은 이들이 DNA 처리를 방해하여 항종양 활성을 유발할 수 있게 한다.
이들 분자의 생물학적 활성은 가요성 알킬렌 링커를 통해 이들의 C8-하이드록실 작용기를 통해 함께 2개의 PBD 유닛을 연결시킴으로써 강화될 수 있다는 것이 이전에 개시되었다(Bose, D. S., et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 4939-4941 (1992); Thurston, D. E., et al., J. Org. Chem., 61, 8141-8147 (1996)). PBD 이량체는 생물학적 활성을 주로 담당하는 것으로 생각되는 팔린드롬 5'-Pu-GATC-Py-3' 가닥 간 가교와 같은 서열 선택적 DNA 병변을 형성하는 것으로 생각된다(Smellie, M., et al., Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003); Martin, C., et al., Biochemistry, 44, 4135-4147). 유리한 이량체성 피롤로벤조디아제핀 화합물은 문헌[Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797-798; "화합물 1", 및 Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174; "화합물 4a")]에 설명되었다. SG2000으로도 공지된 이러한 화합물은 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00085
.
일반적으로, 피롤리딘 알켄 모이어티에 대한 변형은 연결 모이어티 및 이에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편(본원에 설명된 바와 같이 각각 -L-Z' 및 -L-Z-Ab)을 공유 결합시키는 핸들을 제공한다. 대안적으로, 링커는 위치 N10에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 피롤로벤조디아제핀 이량체이다:
Figure pct00086
상기 식에서, n은 2 내지 5의 정수이다. n이 3인 이러한 화학식의 화합물은 DSB-120으로 공지되어 있다(Bose et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4939-4941).
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 피롤로벤조디아제핀 이량체이다:
Figure pct00087
상기 식에서, n은 2 내지 5의 정수이다. n이 3인 이러한 화학식의 화합물은 SJG-136으로 공지되어 있다(Gregson et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 737 - 748). n이 5인 이러한 화학식의 화합물은 DRG-16으로 공지되어 있다(Gregson et al., Med. Chem. 2004;47:1161-1174).
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 피롤로벤조디아제핀 이량체이다:
Figure pct00088
상기 식에서, 물결선은 본원에 설명된 바와 같은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다. 이러한 PBD에 기초한 ADC는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sutherland et al., Blood 2013 122:1455-1463]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 PBD 이량체이다:
Figure pct00089
상기 식에서, n은 3 또는 5이고, 물결선은 본원에 설명된 바와 같은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 구조식으로 표현되는 PBD 이량체이다:
Figure pct00090
상기 식에서, 물결선은 본원에 설명된 바와 같은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
특정 구현예에서, 세포독소는 PBD 이량체일 수 있으며, 이는 본원에 각각 설명된 바와 같이 링커 및 반응성 모이어티 Z'과 함께 취해지는 경우 하기 구조로 표현될 수 있다:
Figure pct00091
.
이러한 특정 세포독소-링커 컨쥬게이트는 테시린(SG3249)으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 개시 전체내용이 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Howard et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7(11), 983-987]에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 항체로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00092
.
이러한 특정 세포독소-링커 컨쥬게이트는 탈리린으로 공지되어 있으며, 예를 들어, 개시 전체내용이 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Mantaj et al., Angewandte Chemie International Edition English 2017,56, 462-488]에서 ADC 바다스툭시맙 탈리린(SGN-CD33A)과 관련하여 설명되었다.
인돌리노벤조디아제핀(IGN)
일부 구현예에서, 본원에 설명된 바와 같은 CD45에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인돌리노벤조디아제핀("IGN")인 세포독소 또는 IGN을 포함하는 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 구현예에서, IGN 세포독소는 인돌리노벤조디아제핀 이량체 또는 인돌리노벤조디아제핀 유사이량체이다.
인돌리노벤조디아제핀 이량체는 암세포에 대한 높은 시험관 내 효능(낮은 pM 범위 IC50 값)을 갖는 비교적 새로운 화학적 부류의 세포독소를 나타낸다. PBD 이량체 SJG-136과 유사하게, IGN 이량체는 DNA의 작은 홈에 결합하고, 이량체에서 2개의 이민 작용기를 통해 구아닌 잔기에 공유 결합하여 DNA의 가교를 발생시킨다. IGN 이량체(IGN 6; PBD 모이어티의 메틸렌 기를 페닐 고리로 대체함)는 아마도 DNA IGN을 사용한 부가물 형성의 더 빠른 속도로 인해 SJG-136에 비해 시험관 내에서 약 10배 더 높은 효능을 나타내었다(예를 들어, 문헌[Miller et al., "A New Class of Antibody-Drug Conjugates with Potent DNA Alkylating Activity" Mol. Cancer Ther. 2016, 15(8), 1870-1878] 참조). 대조적으로, IGN 유사이량체는 단일 반응성 인돌리노벤조디아제핀 이민을 포함하며; 이량체성 세포독소에서 제2 인돌리노벤조디아제핀은 환원된(아민) 형태로 존재한다. 따라서, IGN 유사이량체는 이량체에 존재하는 단일 이민 모이어티를 통해 DNA를 알킬화하고, DNA를 가교시키지 않는다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 화학식의 구조를 갖는 IGN 유사이량체이다:
Figure pct00093
상기 식에서, 물결선은 링커의 부착 지점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 항체로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00094
.
이러한 세포독소-링커 컨쥬게이트는 본원에서 DGN549로 지칭되고, ADC IMGN632에 존재하며, 이들 둘 모두는, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2017004026호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 세포독소는 하기 화학식의 구조를 갖는 인돌리노벤조디아제핀 유사이량체이다:
Figure pct00095
상기 식에서, 물결선은 링커의 부착 지점을 나타낸다. 이러한 IGN 유사이량체 세포독소는, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 20170080102호에 개시된 DGN462로서 본원에서 지칭된다.
일부 구현예에서, 항체로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z로 함께 취해진 화학적 모이어티 Z를 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00096
상기 식에서, 물결선은 항체(예를 들어, 항-CD45 항체 또는 이의 단편)에 대한 부착 지점을 나타낸다. 이러한 세포독소-링커 컨쥬게이트는, 예를 들어, 본원에 참조로서 이전에 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 20170080102호에 개시된 ADC IMGN779에 존재한다.
칼리케아마이신
다른 구현예에서, 본원에 설명된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 엔다이인 항종양 항생제(예를 들어, 칼리케아마이신, 오조가마이신)인 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. 칼리케아마이신 계열의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 이중 가닥 DNA 파손을 생성할 수 있다. 칼리케아마이신 계열의 컨쥬게이트의 제조에 대해서는, 미국 특허 번호 5,712,374호; 5,714,586호; 5,739,116호; 5,767,285호; 5,770,701호; 5,770,710호; 5,773,001호; 및 5,877,296호(모두 American Cyanamid Company)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는, 예를 들어, 문헌[Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)], 및 American Cyanamid의 상기 언급된 미국 특허에 개시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 칼리케아마이신은 γ1로 지정되며, 이는 본원에서 단순히 감마로 지칭되고, 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00097
.
일부 구현예에서, 칼리케아마이신은 감마-칼리케아마이신 유도체 또는 N-아세틸 감마-칼리케아마이신 유도체이다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는, 예를 들어, 문헌[Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)], 및 상기 언급된 미국 특허에 개시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 칼리케아마이신은 적절한 티올과 반응하여 디설파이드를 형성할 수 있는 동시에 링커를 통해 본원에 설명된 바와 같은 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 칼리케아마이신 유도체를 부착시키는 데 유용한 작용기를 도입하는 메틸트리설파이드 모이어티를 함유한다. 칼리케아마이신 계열의 컨쥬게이트의 제조에 대해서는, 미국 특허 번호 5,712,374호; 5,714,586호; 5,739,116호; 5,767,285호; 5,770,701호; 5,770,710호; 5,773,001호; 및 5,877,296호(모두 American Cyanamid Company)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체는, 예를 들어, 문헌[Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998)], 및 American Cyanamid의 상기 언급된 미국 특허에 개시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 ADC의 세포독소는 하기 화학식으로 표현되는 칼리케아마이신 디설파이드 유도체이다:
Figure pct00098
상기 식에서, 물결선은 링커의 부착 지점을 나타낸다.
리보솜 비활성화 단백질(RIP)
일부 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 이의 단편에 컨쥬게이션된 세포독소는 리보솜-비활성화 단백질(RIP)이다. 리보솜 비활성화 단백질은 일반적으로 비가역적으로 리보솜에 작용하는 단백질 합성 억제제이다. RIP는 식물뿐만 아니라 박테리아에서 발견된다. RIP의 예는 사포린, 리신, 아브린, 젤로닌, 슈도모나스 외독소(또는 외독소 A), 트리코산틴, 루핀, 아글루티닌 및 디프테리아 독소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 항-CD45 항체 컨쥬게이트 및 방법에 사용될 수 있는 RIP의 또 다른 예는 시가 독소(Stx) 또는 시가-유사 독소(SLT)이다. 시가 독소(Stx)는 시겔라 디센테리에 1(Shigella dysenteriae 1) 및 에스케리키아 콜리의 일부 혈청군(혈청형 O157:H7, 및 O104:H4를 포함함)(E. 콜리에서 Stx1으로 언급됨)에서 발견된 강력한 박테리아 독소이다. Stx1에 추가하여, 일부 E. 콜리 균주는 Stx/Stx1과 동일한 작용 방식을 갖지만 항원적으로 구별되는 두 번째 유형의 Stx(Stx2)를 생성한다. SLT는 에스케리키아 콜리에 의해 생성된 유사하거나 동일한 독소에 대한 역사적 용어이다. 각각의 독소의 아형이 확인되었기 때문에, 각 그룹에 대한 원형 독소는 이제 Stx1a 또는 Stx2a로 지정된다. Stx1a 및 Stx2a는 다양한 세포 유형에 대한 세포독성의 차이를 나타내고, 수용체 유사체 또는 모방체와 유사하게 결합하고, 차별적 케모카인 반응을 유도하고, 몇 가지 독특한 구조적 특징을 갖는다.
시가 독소 패밀리의 구성원은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 천연 발생 단백질 독소의 패밀리의 임의의 구성원, 특히 S. 디센테리에 및 E. 콜리로부터 분리된 독소를 지칭한다(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). 예를 들어, 시가 독소 패밀리는 S. 디센테리에 혈청형 1으로부터 분리된 진정한 시가 독소(Stx), 장 출혈성 E. 콜리의 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 1 변이체(SLT1 또는 Stx1 또는 SLT-1 또는 Slt-I), 또는 장 출혈성 E. 콜리의 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 변이체(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2)를 포함한다. SLT1은 Stx와 단 하나의 잔기만 상이하며, 둘 모두는 베로사이토톡신 또는 베로톡신(VT)로 지칭되었다(O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). SLT1 및 SLT2 변이체는 아미노산 서열 수준에서 서로 단지 약 53-60%만 유사하다고 보고되었지만, 이들은 시가 독소 패밀리의 구성원에게 공통적인 효소 활성 및 세포독성 메커니즘을 공유한다(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
시가 독소 패밀리의 구성원은 일반적으로 A 서브유닛 및 B 서브유닛의 2개의 서브유닛을 갖는다. 독소의 B 서브유닛은 당지질 글로보트리아오실세라미드(Gb3)로 공지된 세포막의 성분에 결합한다. 서브유닛 B의 Gb3에 대한 결합은 좁은 관형 막 함입의 유도를 야기하고, 이는 세포로의 박테리아 흡수를 위한 내부 막 세관의 형성을 유도한다. 시가 독소(비-포어 형성 독소)는 골지 네트워크 및 ER을 통해 세포질로 전달된다. 골지 독소에서 ER로 트래피킹된다. 시가 독소는 리신의 것과 유사한 메커니즘에 의해 표적 세포 내에서 단백질 합성을 억제하는 작용을 한다(Sandvig and van Deurs (2000) EMBO J 19(220:5943). 세포에 진입한 후, 독소의 A 서브유닛은 리보솜의 60S 서브유닛의 28S RNA로부터 특정 아데닌 핵염기를 절단하여 단백질 합성을 중단시킨다(Donohue-Rolfe et al. (2010) Reviews of Infectious Diseases 13 Suppl. 4(7): S293-297).
본원에서 사용되는 바와 같이, 시가 패밀리 독소에 대한 언급은 구조적으로 및 기능적으로 관련된 천연 발생 단백질 독소(예를 들어, S. 디센테리에 및 E. 콜리로부터 분리된 독소)의 시가 독소 패밀리의 임의의 구성원을 지칭한다. 예를 들어, 시가 독소 패밀리는 S. 디센테리에 혈청형 1으로부터 분리된 진정한 시가 독소(Stx), 장 출혈성 E. 콜리의 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 1 변이체(SLT1 또는 Stx1 또는 SLT-1 또는 Slt-I), 또는 장 출혈성 E. 콜리의 혈청형으로부터 분리된 시가-유사 독소 2 변이체(SLT2 또는 Stx2 또는 SLT-2)를 포함한다. 본원에서 사용되는 "시가 패밀리 독소로부터의 서브유닛 A" 또는 "시가 패밀리 독소 서브유닛 A"는 시가 독소 또는 시가-유사 독소를 포함하는 시가 독소 패밀리의 임의의 구성원으로부터의 서브유닛 A를 지칭한다.
일 구현예에서, 항-CD45 ADC는 시가 패밀리 독소 서브유닛 A, 또는 세포독성 활성, 즉, 리보솜 억제 활성을 갖는 시가 패밀리 독소 서브유닛 A의 일부에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체를 포함한다. 시가 독소 서브유닛 A 세포독성 활성은, 예를 들어, 리보솜 비활성화, 단백질 합성 억제, N-글리코시다제 활성, 폴리뉴클레오티드:아데노신 글리코시다제 활성, RNAse 활성, 및 DNAse 활성을 포함한다. 시가 독소 효과기 활성에 대한 검정의 비제한적인 예는 단백질 합성 억제 활성, 퓨린제거 활성, 세포 성장의 억제, 세포독성, 수퍼코일 DNA 이완 활성 및 뉴클레아제 활성을 측정한다.
특정 구현예에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 리보솜 억제 활성을 갖는 시가 패밀리 독소 A 서브유닛 또는 이의 단편에 컨쥬게이션된다. 시가 패밀리 독소 서브유닛 A의 예는 하기에 제공되는 아미노산 서열인 시가-유사 독소 1 서브유닛 A(SLT-1A)이다.
Figure pct00099
시가 패밀리 독소 서브유닛 A의 또 다른 예는 하기에 제공되는 아미노산 서열인 시가 독소 서브유닛 A(StxA)이다.
Figure pct00100
시가 패밀리 독소 서브유닛 A의 또 다른 예는 하기에 제공되는 아미노산 서열인 시가-유사 독소 2 서브유닛 A(SLT-2A)이다.
Figure pct00101
특정 환경에서, 천연 발생 시가 패밀리 독소 서브유닛 A는 성숙한 시가 패밀리 독소 A 서브유닛을 생성하기 위해 제거되고 숙련된 작업자가 인지할 수 있는 아미노-말단에 약 22개 아미노산의 신호 서열을 함유하는 전구체 형태를 포함할 수 있다. 시가 패밀리 독소 서브유닛 A의 세포독성 단편 또는 트렁케이션된 버전은 또한 본원에 개시된 ADC 및 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 시가 패밀리 독소 서브유닛 A는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 아미노산 잔기만큼(그러나 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 유지하는 것 이하만큼) 천연 발생 시가 독소 A 서브유닛과 상이하다. 일부 구현예에서, 시가 패밀리 독소 서브유닛 A는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40개 이상의 아미노산 잔기만큼(그러나 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 유지하는 것 이하만큼) 천연 발생 시가 패밀리 독소 A 서브유닛과 상이하다. 따라서, 시가 독소 패밀리의 구성원의 A 서브유닛으로부터 유래된 폴리펩티드 영역은 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성이 천연 발생 시가 패밀리 독소 서브유닛에 대해 유지되는 한 원래 서열로부터 첨가, 결실, 트렁케이션 또는 다른 변경을 포함할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 시가 패밀리 독소 서브유닛 A는 SLT-1A(SEQ ID NO:147), StxA(SEQ ID NO:148) 및/또는 SLT-2A(SEQ ID NO:149)와 같은 천연 발생 시가 패밀리 독소 서브유닛 A와 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.7%의 전체 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이를 필수적 요소로 하여 구성(consists essentially of)된다.
적합한 시가 독소 및 세포독소로서 적합한 RIP은, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 US20180057544호에 개시되어 있다.
특정 구현예에서, 본원에 설명된 VH 및 VL 가변 영역(또는 본원에 설명된 경쇄 및 중쇄 CDR 세트를 포함하는 가변 영역)을 포함하는 항-CD45 scFv는 독소에 컨쥬게이션되어 scFv 독소를 형성한다. 상기 독소의 예는 상기 설명된 바와 같이 시가 독소이다.
추가 세포독소
다른 구현예에서, 본원에 설명된 항체 및 이의 항원 결합 단편은 상기 본원에 개시된 세포독소 이외에 또는 이에 추가하여 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 추가의 세포독소는 특히 5-에티닐우라실, 아비라테론, 아실풀벤, 아데시페놀, 아도젤레신, 알데스류킨, 알트레타민, 암바무스틴, 아미독스, 아미포스틴, 아미노레불린산, 암루비신, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 안드로그라폴리드, 혈관형성 억제제, 안타렐릭스, 항-등쪽 형태형성 단백질-1, 항안드로겐, 전립선 암종, 항에스트로겐, 안티네오플라스톤, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 아피디콜린 글리시네이트, 아폽토시스 유전자 조절제, 아폽토시스 조절제, 아푸린산, 아술라크린, 아타메스탄, 아트리무스틴, 악시나스타틴 1, 악시나스타틴 2, 악시나스타틴 3, 아자세트론, 아자톡신, 아자티로신, 박카틴 III 유도체, 발라놀, 바티마스타트, BCR/ABL 길항제, 벤조클로린스, 벤조일스타우로스포린, 베타 락탐 유도체, 베타-알레틴, 베타클라마이신 B, 베툴린산, bFGF 억제제, 비칼루타미드, 비산트렌, 비스아지리디닐스퍼민, 비스나피드, 비스트라텐 A, 비젤레신, 브레플레이트, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 브로피리민, 부도티탄, 부티오닌 설폭시민, 칼시포트리올, 칼포스틴 C, 캄프토테신 유도체(예를 들어, 10-하이드록시-캄프토테신), 카페시타빈, 카르복사미드-아미노-트리아졸, 카르복시아미도트리아졸, 카르젤레신, 카세인 키나제 억제제, 카스타노스퍼민, 세크로핀 B, 세트로렐릭스, 클로린스, 클로로퀴녹살린 설폰아미드, 시카프로스트, 시스-포르피린, 클라드리빈, 클로미펜 및 이의 유사체, 클로트리마졸, 콜리스마이신 A, 콜리스마이신 B, 콤브레타스타틴 A4, 콤브레타스타틴 유사체, 코나게닌, 크람베스시딘 816, 크리스나톨, 크립토피신 8, 크립토피신 A 유도체, 쿠라신 A, 사이클로펜탄트라퀴논, 사이클로플라탐, 사이페마이신, 시타라빈 옥포스페이트, 세포용해 인자, 사이토스타틴, 다클릭시맙, 데시타빈, 데하이드로디뎀닌 B, 2'데옥시코포르마이신(DCF), 데슬로렐린, 덱시포스파미드, 덱스라족산, 덱스베라파밀, 디아지쿠온, 디뎀닌 B, 디독스, 디에틸노르스퍼민, 디하이드로-5-아자시티딘, 디하이드로탁솔, 디옥사마이신, 디페닐 스피로무스틴, 디스코더몰리드, 도코사놀, 돌라세트론, 독시플루리딘, 드롤록시펜, 드로나비놀, 듀오카르마이신 SA, 엡셀렌, 에코무스틴, 에델포신, 에드레콜로맙, 에플로르니틴, 엘레멘, 에미테푸르, 에포틸론, 에피틸론, 에프리스테리드, 에스트라무스틴 및 이의 유사체, 에토포시드, 에토포시드 4'-포스페이트(에토포포스로도 언급됨), 엑세메스탄, 파드로졸, 파자라빈, 펜레티니드, 필그라스팀, 피나스테리드, 플라보피리돌, 플레젤라스틴, 플루아스테론, 플루다라빈, 플루오로다우노루니신 하이드로클로라이드, 포르페니멕스, 포르메스탄, 포스트리에신, 포테무스틴, 가돌리늄 텍사피린, 갈륨 니트레이트, 갈로시타빈, 가니렐릭스, 젤라티나제 억제제, 젬시타빈, 글루타티온 억제제, 헵설팜, 호모해링토닌(HHT), 하이페리신, 이반드론산, 이독시펜, 이드라만톤, 일모포신, 일로마스타트, 이미다조아크리돈, 이미퀴모드, 면역자극 펩티드, 이오벤구안, 요오도독소루비신, 이포메아놀, 이리노테칸, 이로플라크트, 이르소글라딘, 이소벤가졸, 자스플라키놀리드, 카할랄리드 F, 라멜라린-N 트리아세테이트, 란레오티드, 레이나마이신, 레노그라스팀, 렌티난 설페이트, 렙토스타틴, 레트로졸, 친지질성 백금 화합물, 리쏘클리나미드 7, 로바플라틴, 로메트렉솔, 로니다민, 로속산트론, 록소리빈, 루르토테칸, 루테튬 텍사피린, 리소필린, 마소프로콜, 마스핀, 기질 금속단백분해효소 억제제, 메노가릴, 르네르바론, 메테렐린, 메티오니나제, 메토클로프라미드, MIF 억제제, 이페프리스톤, 밀테포신, 미리모스팀, 미트라신, 미토구아존, 미토락톨, 미토마이신 및 이의 유사체, 미토나피드, 미톡산트론, 모파로텐, 몰그라모스팀, 마이카페록시드 B, 미리아포론, N-아세틸디날린, N-치환된 벤자미드, 나파렐린, 나그레스팁, 나파빈, 나프테르핀, 나르토그라스팀, 네다플라틴, 네모루비신, 네리드론산, 닐루타미드, 니사마이신, 니트룰린, 옥트레오티드, 오키세논, 오나프리스톤, 온단세트론, 오라신, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, 옥사우노마이신, 파클리탁셀 및 이의 유사체, 팔라우아민, 팔미토일리족신, 파미드론산, 파낙시트리올, 파노미펜, 파라박틴, 파젤리프틴, 페가스파르가세, 펠데신, 펜토산 폴리설페이트 소듐, 펜토스타틴, 펜트로졸, 퍼플루브론, 퍼포스파미드, 페나지노마이신, 피시바닐, 피라루비신, 피리트렉심, 포도필로톡신, 포르피로마이신, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제, 랄티트렉세드, 리족신, 로글레티미드, 로히투킨, 루비기논 B1, 루복실, 사핑골, 사인토핀, 사르코피톨 A, 사르그라모스팀, 소부족산, 소너민, 스파르포스산, 스피카마이신 D, 스피로무스틴, 스티피아미드, 설피노신, 탈리무스틴, 테가푸르, 테모졸로미드, 테니포시드, 탈리블라스틴, 티오코랄린, 티라파자민, 토포테칸, 토프센틴, 트리시리빈, 트리메트렉세이트, 베라민, 비노렐빈, 빈잘틴, 보로졸, 제니플라틴 및 질라스코르브를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커
본원에서 사용되는 용어 "링커"는 각각 본원에 설명된 바와 같은 항-CD45 항체를 세포독소에 공유적으로 부착시켜 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 형성하는 공유 결합 또는 원자 사슬을 포함하는 2가 화학적 모이어티를 의미한다. 적합한 링커는 2개의 반응성 말단을 가지며, 하나는 항체에 대한 컨쥬게이션을 위한 것이고 다른 하나는 세포독소에 대한 컨쥬게이션을 위한 것이다. 링커의 항체 컨쥬게이션 반응성 말단(반응성 모이어티, Z')은 전형적으로 항체 상의 시스테인 티올 또는 리신 아민기를 통해 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 부위이고, 따라서 전형적으로 티올-반응성 기, 예를 들어, 이중 결합(말레이미드에서와 같이) 또는 이탈기, 예를 들어, 클로로, 브로모, 요오도, 또는 R-설파닐 기, 또는 아민-반응성 기, 예를 들어, 카르복실기인 반면; 링커의 항체 컨쥬게이션 반응성 말단은 전형적으로 세포독소 상의 염기성 아민 또는 카르복실 기와의 아미드 결합의 형성을 통해 세포독소에 컨쥬게이션될 수 있는 부위이고, 따라서 전형적으로 카르복실 또는 염기성 아민 기이다. 용어 "링커"가 컨쥬게이션된 형태의 링커를 설명하는 데 사용되는 경우, 반응성 말단 중 하나 또는 둘 모두는 부재(예를 들어, 화학적 모이어티 Z로 전환된 반응성 모이어티 Z')하거나 불완전(예를 들어, 카르복실산의 카르보닐로만 존재함)할 것인데, 이는 링커 및/또는 세포독소 사이 및 링커 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 사이의 결합의 형성 때문이다. 상기 컨쥬게이션 반응은 하기에 추가로 설명된다.
세포독성 분자에 설명된 항체 또는 항체 단편을 컨쥬게이션시키기 위해 다양한 링커가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 링커의 절단이 세포 내 환경에서 항체로부터 약물 단위를 방출하도록 세포 내 조건하에서 절단될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 링커 단위는 절단될 수 없으며, 약물은, 예를 들어, 항체 분해에 의해 방출된다. 본 발명의 ADC에 유용한 링커는 바람직하게는 세포 외에서 안정하고, ADC 분자의 응집을 방지하고, ADC를 수성 매질 및 단량체 상태에서 자유롭게 가용성으로 유지시킨다. 세포로의 수성 또는 전달 전에, ADC는 바람직하게는 안정하고 온전하게 유지되며, 즉, 항체는 약물 모이어티에 연결된 상태로 유지된다. 링커는 표적 세포 외부에서 안정하고, 세포 내부에서 일부 효과적인 속도로 절단될 수 있다. 효과적인 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지하고; (ii) 컨쥬게이트 또는 약물 모이어티의 세포 내 전달을 허용하고; (iii) 컨쥬게이트가 이의 표적화된 부위에 전달되거나 수송될 때까지 안정하고 온전하게, 즉, 절단되지 않은 상태로 유지되고; (iv) 세포독성 모이어티의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포증식억제 효과를 유지할 것이다. ADC의 안정성은 질량분광법, HPLC 및 분리/분석 기술 LC/MS와 같은 표준 분석 기술에 의해 측정될 수 있다. 항체 및 약물 모이어티의 공유 부착은 링커가 2개의 반응성 작용기, 즉, 반응성 의미에서 2가를 가질 것을 요구한다. 펩티드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐 및 리포터 그룹과 같은 2개 이상의 기능적 또는 생물학적 활성 모이어티를 부착시키는 데 유용한 2가 링커 시약이 공지되어 있으며, 방법이 이들의 결과로서 발생된 컨쥬게이트에 대해 설명되었다(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p. 234-242).
적합한 절단 가능한 링커는, 예를 들어, 효소적 가수분해, 광분해, 산성 조건하에서의 가수분해, 염기성 조건하에서의 가수분해, 산화, 디설파이드 환원, 친핵성 절단 또는 유기금속 절단에 의해 절단될 수 있는 것들을 포함한다(예를 들어, 개시내용이 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012] 참조). 적합한 절단 가능한 링커는, 예를 들어, 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르 또는 디펩티드와 같은 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
산성 조건하에서 가수분해 가능한 링커는, 예를 들어, 하이드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트산 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등을 포함한다. (예를 들어, 각각의 개시내용 전체가 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,122,368호; 5,824,805호; 5,622,929호; 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661] 참조). 상기 링커는 혈액에서의 것과 같은 중성 pH 조건에서 비교적 안정하지만, 리소좀의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다.
환원 조건하에서 절단 가능한 링커는, 예를 들어, 디설파이드를 포함한다. 예를 들어, SATA(N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT(N-숙시이미딜-옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성될 수 있는 것들을 포함하는 다양한 디설파이드 링커가 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 각각의 개시내용 전체가 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987] 및 또는 미국 특허 번호 4,880,935호 참조).
효소적 가수분해에 민감한 링커는, 예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포 내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티드-함유 링커일 수 있다. 치료제의 세포 내 단백질분해 방출을 사용하는 한 가지 이점은 제제가 컨쥬게이션되는 경우 전형적으로 약화되고 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 예시적인 아미노산 링커는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드를 포함한다. 적합한 펩티드의 예는 발린, 알라닌, 시트룰린(Cit), 페닐알라닌, 리신, 류신 및 글리신과 같은 아미노산을 함유하는 것들을 포함한다. 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기는 천연 발생하는 것들뿐만 아니라 시트룰린과 같은 미량 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체를 포함한다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit) 및 알라닌-페닐알라닌(af 또는 ala-phe)을 포함한다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, 또는 Phe-Lys, Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Arg, 또는 Trp-Cit와 같은 디펩티드를 포함한다. Val-Cit 또는 Phe-Lys와 같은 디펩티드를 함유하는 링커는, 예를 들어, 개시내용 전체가 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,214,345호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 링커는 Val-Ala 및 Val-Cit로부터 선택된 디펩티드를 포함한다.
세포독성 분자에 본원에 설명된 항체 또는 항체 단편을 컨쥬게이션시키기에 적합한 링커는 1,6-제거 과정에 의해 세포독소를 방출할 수 있는 것들을 포함한다. 이러한 제거 공정이 가능한 화학적 모이어티는 개시내용 전체가 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Jain et al., Pharm. Res. 32:3526-3540, 2015]에 설명된 바와 같은 p-아미노벤질(PAB) 기, 6-말레이미도헥산산, pH-민감성 탄산염, 및 다른 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는, 예를 들어, 문헌[Carl et al., J. Med. Chem. (1981) 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26:638-644]; US 6214345호; US20030130189호; US20030096743호; US6759509호; US20040052793호; US6218519호; US6835807호; US6268488호; US20040018194호; W098/13059호; US20040052793호; US6677435호; US5621002호; US20040121940호; W02004/032828호에 개시된 상기 언급된 PAB 또는 PABC(파라-아미노벤질옥시카르보닐)와 같은 "자기-희생" 기를 포함한다. 이러한 공정이 가능한 다른 상기 화학적 모이어티("자기-희생 링커")는 메틸렌 카르바메이트 및 헤테로아릴 기, 예를 들어, 아미노티아졸, 아미노이미다졸, 아미노피리미딘 등을 포함한다. 상기 헤테로사이클릭 자기-희생 기를 함유하는 링커는, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20160303254호 및 20150079114호, 및 미국 특허 번호 7,754,681호; 문헌[Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237; US 2005/0256030; de Groot et al (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830]; 및 US 7223837호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 디펩티드는 자기-희생 링커와 조합하여 사용된다.
본원에서 사용하기에 적합한 링커는 각각이 선택적으로 치환될 수 있는 C1-C6 알킬렌, C1-C6 헤테로알킬렌, C2-C6 알케닐렌, C2-C6 헤테로알케닐렌, C2-C6 알키닐렌, C2-C6 헤테로알키닐렌, C3-C6 사이클로알킬렌, 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 기를 포함할 수 있다. 상기 기의 비제한적인 예는 (CH2)p, (CH2CH2O)p 및 -(C=O)(CH2)p- 유닛을 포함하며, 여기서 p는 각 경우에 대해 독립적으로 선택되는 1-6의 정수이다.
적합한 링커는 용해도 향상 특성을 갖는 기를 함유할 수 있다. 예를 들어, (CH2CH2O)p 단위(폴리에틸렌 글리콜, PEG)를 포함하는 링커는 아미노, 설폰산, 포스폰산 또는 인산 잔기로 치환된 알킬 사슬과 같이 용해도를 향상시킬 수 있다. 상기 모이어티를 포함하는 링커는, 예를 들어, 각각의 개시내용 전체가 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,236,319호 및 9,504,756호에 개시되어 있다. 추가의 용해도 향상 기는, 예를 들어, 하기 구조를 갖는 아실 및 카르바모일 설파미드 기를 포함한다:
Figure pct00102
상기 식에서, a는 0 또는 1이고;
R10은 수소, C1-C24 알킬 기, C3-C24 사이클로알킬 기, C1-C24 (헤테로)아릴 기, C1-C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C1-C24 (헤테로)아릴알킬 기, C1-C24 알킬 기, C3-C24 사이클로알킬 기, C2-C24 (헤테로)아릴 기, C3-C24 알킬(헤테로)아릴 기 및 C3-C24 (헤테로)아릴알킬 기로 구성된 군으로부터 선택되며, 이들 각각은 O, S 및 NR11R12로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자에 의해 선택적으로 치환되고/되거나 중단될 수 있으며, 여기서 R11 및 R12는 수소 및 C1-C4 알킬 기로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되거나; R10은 세포독소이고, 여기서 세포독소는 스페이서 모이어티를 통해 N에 선택적으로 연결된다. 상기 기를 함유하는 링커는, 예를 들어, 개시내용 전체가 세포독소 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 공유 컨쥬게이션에 적합한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 9,636,421호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0298145호에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 링커는 하이드라진, 디설파이드, 티오에테르, 디펩티드, p-아미노벤질(PAB) 기, 헤테로사이클릭 자기-희생 기, 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐, 선택적으로 치환되는 C3-C6 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴, 용해도 향상 기, 아실, -(C=O)-, 또는 -(CH2CH2O)p- 기 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 p는 1-6의 정수이다. 당업자는 열거된 기 중 하나 이상이 2가(디라디칼) 종, 예를 들어, C1-C6 알킬렌 등의 형태로 존재할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, 링커 L은 모이어티 *-L1L2-**를 포함하며, 여기서
L1은 부재하거나 -(CH2)mNR13C(=O)-, -(CH2)mNR13-, -(CH2)mX3(CH2)m-,
Figure pct00103
이고;
L2는 부재하거나 -(CH2)m-, -NR13(CH2)m-, -(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -X4, -(CH2)mNR13C(=O)X4, - (CH2)mNR13C(=O)-, -((CH2)mO)n(CH2)m-, -((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, - NR13((CH2)mO)nX3(CH2)m-, -NR13((CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, -X1X2C(=O)(CH2)m-, - (CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mNR13(CH2)m-, -(CH2)mNR13C(=O)(CH2)mX3(CH2)m-, - (CH2)mC(=O)NR13(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)-, - (CH2)mNR13(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, - (CH2)mC(=O)NR13(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m-, - (CH2)mO)n(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m(O(CH2)m)n-, - (CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)mNR13(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mNR13C(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX3(CH2)m-, - (CH2)mX3((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)-, - (CH2)mC(=O)NR13(CH2)mO)n(CH2)mX3(CH2)m-, - (CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)n-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -((CH2)mO)n(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m-, -(CH2)mNR13C(=O)(CH2)mNR13C(=O)(CH2) -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR13-, -(CH2)mC(=O)NR13-, -(CH2)mX3-, -C(R13)2(CH2)m-, -(CH2)mC(R13)2NR13-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mNR13-, - (CH2)mC(=O)NR13(CH2)mNR13C(=O)NR13-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)-, - C(R13)2(CH2)mNR13C(=O)(CH2)m-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mC(R13)2NR13-, - C(R13)2(CH2)mX3(CH2)m-, -(CH2)mX3(CH2)mC(R13)2NR13-, -C(R13)2(CH2)mOC(=O)NR13(CH2)m-, -(CH2)mNR13C(=O)O(CH2)mC(R13)2NR13-, -(CH2)mX3(CH2)mNR13-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nNR13-, -(CH2)mNR13-, -(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m(O(CH2)m)nNR13 -, -(CH2)m(O(CH2)m)nNR13-, -(CH2CH2O)n(CH2)m-, -(CH2)m(OCH2CH2)n; -(CH2)mO(CH2)m-, -(CH2)mS(=O)2-, - (CH2)mC(=O)NR13(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX3(CH2)mS(=O)2-, -(CH2)mX2X1C(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)X2X1C(=O)-, -(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1C(=O)-, - (CH2)mX3(CH2)mX2X1C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)m(O(CH2)m)nX2X1 C(=O)-, - (CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mNR13C(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR13(CH2)mC(=O)-, -(CH2)mX3(CH2)mC(=O)NR13(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)mC(=O)X2X1C(=O)NR13(CH2)m-, -(CH2)mX3(O(CH2)m)nC(=O)-, -(CH2)mNR13C(=O)((CH2)mO)n(CH2)m-, -(CH2)m(O(CH2)m)nC(=O)NR13(CH2)m-, -(CH2)mNR13C(=O)NR13(CH2)m- 또는 -(CH2)mX3(CH2)mNR13C(=O)-이고;
여기서,
X1은
Figure pct00104
이고;
X2는
Figure pct00105
이고;
X3는
Figure pct00106
이고;
X4는
Figure pct00107
이고;
상기 식에서,
R13은 H 및 C1-C6 알킬로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되고;
m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 각각의 경우에 대해 독립적으로 선택되고;
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14로부터 각각의 경우에 대해 독립적으로 선택되고;
여기서, 단일 별포(*)는 세포독소(예를 들어, 아마톡신)에 대한 부착 지점을 나타내고, 이중 별표(**)는 반응성 치환기 Z' 또는 화학적 모이어티 Z에 대한 부착 지점을 나타내며, 단, L1 및 L2는 둘 모두 부재하는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 링커는 p-아미노벤질 기(PAB)를 포함한다. 일 구현예에서, p-아미노벤질 기는 링커에서 세포독성 약물과 프로테아제 절단 부위 사이에 배치된다. 일 구현예에서, p-아미노벤질 기는 p-아미노벤질옥시카르보닐 단위의 일부이다. 일 구현예에서, p-아미노벤질 기는 p-아미노벤질아미도 단위의 일부이다.
일부 구현예에서, 링커는 PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB 또는 Ala-PAB를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 펩티드, 올리고당류, -(CH2)p-, -(CH2CH2O)p-, PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB 또는 Ala-PAB 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 -((CH2)n을 포함하며, 여기서 n은 6이다. 일부 구현예에서, L-Z는 하기이다:
Figure pct00108
상기 식에서, S는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기를 나타내는 황 원자이다.
일부 구현예에서, 링커는 -(C=O)(CH2)p- 단위를 포함하며, n은 1-6의 정수이다.
일 특정 구현예에서, 링커는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00109
상기 식에서, 물결선은 세포독소 및 반응성 모이어티 Z'에 대한 부착 지점을 나타낸다. 또 다른 특정 구현예에서, 링커는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00110
상기 식에서, 물결선은 세포독소 및 반응성 모이어티 Z'에 대한 부착 지점을 나타낸다. 상기 PAB-디펩티드-프로피오닐 링커는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 특허 출원 공개 번호 WO2017/149077호에 개시되어 있다. 또한, WO2017/149077호에 개시된 세포독소는 본원에 참조로서 포함된다.
특정 구현예에서, ADC의 링커는 말레이미도카프로일-Val-Ala-파라-아미노벤질(mc-Val-Ala-PAB)이다.
특정 구현예에서, ADC의 링커는 말레이미도카프로일-Val-Cit-파라-아미노벤질(mc-vc-PAB)이다.
일부 구현예에서, 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00111
.
일부 구현예에서, 링커는 MCC(4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카르복실레이트)를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 ((CH2)mO)n(CH2)m- 기(여기서, n 및 m은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택됨); 및 헤테로아릴 기(여기서, 헤테로아릴 기는 트리아졸임)를 포함한다. 일부 구현예에서, ((CH2)mO)n(CH2)m- 기 및 트리아졸은 함께 하기를 포함한다:
Figure pct00112
상기 식에서, n은 1 내지 10이고, 물결선은 추가 링커 성분, 화학적 모이어티 Z 또는 아마톡신에 대한 부착 지점을 나타낸다. 본원에 설명된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 다른 링커는 본원에 참조로서 포함되는 US 2019/0144504호에 설명되어 있다.
본원에 개시된 임의의 하나 이상의 화학적 기, 모이어티 및 특징은 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 세포독소의 컨쥬게이션에 유용한 링커를 형성하기 위해 다수의 방식으로 조합될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 추가 링커는, 예를 들어, 개시내용 전체가 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0218220호에 설명되어 있다.
특정 구현예에서, 링커의 전구체인 중간체는 적절한 조건하에서 약물 모이어티와 반응한다. 특정 구현예에서, 반응성 기는 약물 및/또는 중간체 또는 링커에 사용된다. 약물과 중간체 사이의 반응 생성물, 또는 유도체화된 약물은 후속적으로 적절한 조건하에서 항체 또는 항원 결합 단편과 반응한다. 대안적으로, 링커 또는 중간체는 먼저 항체 또는 유도체화된 항체와 반응한 후 약물 또는 유도체화된 약물과 반응할 수 있다. 상기 컨쥬게이션 반응은 이제 더 완전하게 설명될 것이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 링커 또는 약물-링커 컨쥬게이트의 공유 부착을 위해 다수의 상이한 반응이 이용 가능하다. 항체 분자 상의 적합한 부착 지점은 리신의 아민 기, 글루탐산 및 아스파르트산의 자유 카르복실산 기, 시스테인의 설프하이드릴 기, 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 비특이적 공유 부착은 화합물 상의 카르복시(또는 아미노) 기를 항체 모이어티 상의 아미노(또는 카르복시) 기에 연결시키기 위해 카르보디이미드 반응을 사용하여 수행될 수 있다. 추가로, 디알데하이드 또는 이미도에스테르와 같은 이기능성 제제는 또한 화합물 상의 아미노 기를 항체 모이어티 상의 아미노 기에 연결시키는 데 사용될 수 있다. 결합제에 대한 약물의 부착에 또한 이용 가능한 것은 쉬프 염기 반응이다. 이러한 방법은 글리콜 또는 하이드록시 기를 함유하는 약물의 과옥소산염 산화를 포함하고, 따라서 이후에 결합제와 반응되는 알데하이드를 형성한다. 부착은 결합제의 아미노 기를 갖는 쉬프 염기의 형성을 통해 발생한다. 이소티오시아네이트는 또한 약물을 결합제에 공유 부착시키기 위한 커플링제로 사용될 수 있다. 다른 기술은 당업자에게 공지되어 있으며 본 발명의 개시의 범위 내에 있다.
본원에 설명된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 컨쥬게이션에 유용한 링커는 하기 표 1에 도시된 바와 같은 커플링 반응에 의해 형성된 화학적 모이어티 Z를 함유하는 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 곡선은 각각 항체 또는 항원 결합 단편 및 세포독성 분자에 대한 부착 지점을 나타낸다.
표 1. 항체-약물 컨쥬게이트의 형성에서 커플링 반응에 의해 형성된 예시적인 화학적 모이어티 Z
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
당업자는 링커에 부착된 반응성 치환기 Z' 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 반응성 치환기가 공유 커플링 반응에 관여하여 화학적 모이어티 Z를 생성하는 것을 인지할 것이며, 반응성 모이어티 Z'를 인지할 것이다. 따라서, 본원에 설명된 방법과 함께 유용한 항체-약물 컨쥬게이트는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 반응성 치환기와의 반응에 적합한 본원에 설명된 바와 같은 링커 또는 세포독소-링커 컨쥬게이트(링커 또는 세포독소-링커 컨쥬게이트는 반응성 치환기 Z'를 포함함)의 반응에 의해 화학적 모이어티 Z를 형성시킴으로써 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, Z'은 -NR13C(=O)CH=CH2, -N3, -SH, -S(=O)2(CH=CH2), -(CH2)2S(=O)2(CH=CH2), -NR13S(=O)2(CH=CH2), -NR13C(=O)CH2R14, -NR13C(=O)CH2Br, -NR13C(=O)CH2I, -NHC(=O)CH2Br, -NHC(=O)CH2I, -ONH2, -C(O)NHNH2, -CO2H, -NH2, -NH(C=O), -NC(=S),
Figure pct00117
Figure pct00118
이고,
상기 식에서,
R13은 H 및 C1-C6 알킬로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되고;
R14은 -S(CH2)nCHR15NHC(=O)R13이고;
R15은 R13 또는 -C(=O)OR13이고;
R16은 H, C1-C6 알킬, F, Cl 및 -OH로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되고;
R17은 H, C1-C6 알킬, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 및 -OH로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되고;
R18은 H, C1-C6 알킬, F, -C(=O)OH로 치환된 벤질옥시, -C(=O)OH로 치환된 벤질, -C(=O)OH로 치환된 C1-C4 알콕시, 및 -C(=O)OH로 치환된 C1-C4 알킬로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택된다.
링커 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 적합하게 반응성인 치환기의 예는 친핵체/친전자체 쌍(예를 들어, 티올/할로알킬 쌍, 아민/카르보닐 쌍, 또는 티올/α,β-비치환된 카르보닐 쌍 등), 디엔/친디엔체 쌍(예를 들어, 특히 아지드/알킨 쌍, 또는 디엔/α,β-불포화 카르보닐 쌍) 등을 포함한다. 화학적 모이어티 Z를 형성하기 위한 반응성 치환기 사이의 커플링 반응은 티올 알킬화, 하이드록시 알킬화, 아민 알킬화, 아민 또는 하이드록실아민 축합, 하이드라진 형성, 아미드화, 에스테르화, 디설파이드 형성, 고리화첨가(예를 들어, 특히 [4+2] 딜스-알더 고리화첨가, [3+2] 휘스겐 고리화첨가), 친핵성 방향족 치환, 친전자성 방향족 치환, 및 당 분야에 공지되거나 본원에 설명된 다른 반응성 양상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 링커는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 친핵성 작용기와의 반응을 위한 친전자성 작용기를 함유한다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재할 수 있는 반응성 치환기는 (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어, 리신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어, 시스테인, 및 (iv) 항체가 당화된 당 하이드록실 또는 아미노 기와 같은 친핵성 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재할 수 있는 반응성 치환기는 세린, 트레오닌 및 티로신 잔기의 하이드록실 모이어티; 리신 잔기의 아미노 모이어티; 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 카르복실 모이어티; 및 시스테인 잔기의 티올 모이어티뿐만 아니라 비-천연 발생 아미노산의 프로파길, 아지도, 할로아릴(예를 들어, 플루오로아릴), 할로헤테로아릴(예를 들어, 플루오로헤테로아릴), 할로알킬, 및 할로헤테로알킬 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기는 아민 또는 티올 모이어티를 포함한다. 특정 항체는 환원 가능한 사슬 간 디설파이드, 즉, 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 DTT(디티오트레이톨)와 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 컨쥬게이션에 대해 반응성이 될 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는 리신과 2-이미노티올란(트라우트 시약)의 반응을 통해 항체에 도입되어 아민의 티올로의 전환을 발생시킬 수 있다. 반응성 티올 기는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 시스테인 잔기를 도입(예를 들어, 하나 이상의 비-고유 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함)시킴으로써 항체(또는 이의 단편)에 도입될 수 있다. 미국 특허 번호 7,521,541호에는 반응성 시스테인 아미노산의 도입에 의해 항체를 조작하는 것이 교시되어 있다.
일부 구현예에서, 링커에 부착된 반응성 모이어티 Z'은 항체 상에 존재하는 친전자성 기와 반응성인 친핵성 기이다. 항체 상의 유용한 친전자성 기는 알데하이드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 친핵성 기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드록실, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, z는 아민 및 티올 모이어티와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 친핵성 치환기와 반응성 친전자성 치환기 Z' 사이의 반응의 생성물이다. 예를 들어, Z'은 특히 마이클 수용체(예를 들어, 말레이미드), 활성화된 에스테르, 전자-결핍 카르보닐 화합물, 및 알데하이드일 수 있다.
예를 들어, ADC의 합성에 적합한 링커는 말레이미드 또는 할로알킬 기와 같은 반응성 치환기 Z'를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들은, 예를 들어, 개시내용이 화학적 컨쥬게이션을 위한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Liu et al., 18:690-697, 1979]에 설명된 특히 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-L-카르복실레이트(SMCC), N-숙신이미딜 요오도아세테이트(SIA), 설포-SMCC, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(MBS), 설포-MBS, 및 숙신이미딜 요오도아세테이트와 같은 시약에 의해 링커에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커 L에 부착된 반응성 치환기 Z'은 말레이미드, 아지드 또는 알킨이다. 말레이미드-함유 링커의 예는 절단할 수 없는 말레이미도카프로일-기반 링커이며, 이는 아우리스타틴과 같은 미세관-파괴 제제의 컨쥬게이션에 특히 유용하다. 상기 링커는 개시내용이 화학적 컨쥬게이션을 위한 링커에 관한 것으로 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17:14-24, 2006]에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 반응성 치환기 Z'은 -(C=O)- 또는 -NH(C=O)-이고, 따라서 링커는 각각 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 아미노 기와 -(C=O)- 또는 -NH(C=O)- 기의 반응으로부터 생성되는 아미드 또는 우레아 모이어티에 의해 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 반응성 치환기는 각각이 선택적으로 치환될 수 있는 N-말레이미딜 기, 할로겐화 N-알킬아미도 기, 설포닐옥시 N-알킬아미도 기, 카르보네이트 기, 설포닐 할라이드 기, 티올 기 또는 이의 유도체, 내부 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 알키닐 기, (헤테로)사이클로알키닐 기, 바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일 기, 내부 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 알케닐 기, 사이클로알케닐 기, 테트라지닐 기, 아지도 기, 포스핀 기, 니트릴 옥사이드 기, 니트론 기, 니트릴 이민 기, 디아조 기, 케톤 기, (O-알킬)하이드록실아미노 기, 하이드라진 기, 할로겐화 N-말레이미딜 기, 1,1-비스 (설포닐메틸)메틸카르보닐 기 또는 이의 제거 유도체, 카르보닐 할라이드 기, 또는 알렌아미드 기이다. 일부 구현예에서, 반응성 치환기는 사이클로알켄 기, 사이클로알킨 기 또는 선택적으로 치환되는 (헤테로)사이클로알키닐 기를 포함한다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편 상의 반응성 잔기와의 반응에 적합한 반응성 치환기 Z'를 함유하는 아마톡신-링커 컨쥬게이트의 비제한적인 예는 7'C-(4-(6-(말레이미도)헥사노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(6-(말레이미도)헥산아미도)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥사노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르보닐)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥사노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(3-카르복시프로판아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(2-브로모아세트아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(3-(피리딘-2-일디설파닐)프로판아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(4-(말레이미도)부탄아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(말레이미도)아세틸)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(3-(말레이미도)프로파노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(4-(말레이미도)부타노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(3-((6-(말레이미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(3-((6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(3-((4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)메틸)피롤리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(3-((6-((4-(말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(4-(2-(아미노옥시)아세트아미도)부탄아미도)에틸)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(4-(2-(아미노옥시)아세트아미도)부타노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)헥사노일)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-((4-(6-(말레이미도)헥산아미도)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(6-(말레이미도)헥사노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; (R)-7'C-((3-((6-(말레이미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; (S)-7'C-((3-((6-(말레이미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)-S-메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)-R-메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)-S-메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)-R-메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(3-카르복시프로판아미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥사노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥사노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(말레이미도)아세틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(3-(말레이미도)프로파노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(4-(말레이미도)부타노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(2-(말레이미도)아세트아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(4-(말레이미도)부탄아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(말레이미도)헥산아미도)메틸)아제티딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)아제티딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)메틸)아제티딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-(2-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)에틸)아제티딘-1yl)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)아제티딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-(((2-(6-(말레이미도)-N-메틸헥산아미도)에틸)(메틸)아미노)메틸)-아마톡신; 7'C-(((4-(6-(말레이미도)-N-메틸헥산아미도)부틸(메틸)아미노)메틸)-아마톡신; 7'C-((2-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)아지리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((2-(2-(6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)에틸)아지리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(6-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)헥산아미도)헥사노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(1-(아미노옥시)-2-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3-아자헵타데칸-17-오일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(2-(아미노옥시)아세트아미도)아세틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(3-(2-(아미노옥시)아세트아미도)프로파노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(4-(2-(아미노옥시)아세트아미도)부타노일)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)헥산아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(2-(2-(아미노옥시)아세트아미도)아세트아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(4-(2-(아미노옥시)아세트아미도)부탄아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(20-(아미노옥시)-4,19-디옥소-6,9,12,15-테트라옥사-3,18-디아자이코실)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-(((2-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)-N-메틸헥산아미도)에틸)(메틸)아미노)메틸)-아마톡신; 7'C-(((4-(6-(2-(아미노옥시)아세트아미도)-N-메틸헥산아미도)부틸)(메틸)아미노)메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)메틸)피롤리딘-1-일)-S-메틸)-아마톡신; 7'C-((3-((6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥산아미도)-R-메틸)피롤리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(2-브로모아세트아미도)에틸)피페라진-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(2-브로모아세트아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 7'C-((4-(2-(3-(피리딘e-2-일디설파닐)프로판아미도)에틸)피페리딘-1-일)메틸)-아마톡신; 6'O-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥실)-아마톡신; 6'O-(5-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)펜틸)-아마톡신; 6'O-(2-((6-(말레이미도)헥실)옥시)-2-옥소에틸)-아마톡신; 6'O-((6-(말레이미도)헥실)카르바모일)-아마톡신; 6'O-((6-(4-((말레이미도)메틸)사이클로헥산카르복사미도)헥실)카르바모일)-아마톡신; 6'O-(6-(2-브로모아세트아미도)헥실)-아마톡신; 7'C-(4-(6-(아지도)헥산아미도)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(헥스-5-이노일아미노)피페리딘-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(말레이미도)헥산아미도)에틸)피페라진-1-일)-아마톡신; 7'C-(4-(2-(6-(6-(말레이미도)헥산아미도)헥산아미도)에틸)피페라진-1-일)-아마톡신; 6'O-(6-(6-(11,12-디데하이드로-5,6-디하이드로-디벤즈[b,f]아조신-5-일)-6-옥소헥산아미도)헥실)-아마톡신; 6'O-(6-(헥스-5-이노일아미노)헥실)-아마톡신; 6'O-(6-(2-(아미노옥시)아세틸아미도)헥실)-아마톡신; 6'O-((6-아미노옥시)헥실)-아마톡신; 및 6'O-(6-(2-요오도아세트아미도)헥실)-아마톡신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 화학적 모이어티 Z는 표 1로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 화학적 모이어티 Z는 하기이다:
Figure pct00119
상기 식에서, S는 CD45(예를 들어, 시스테인 잔기의 -SH 기로부터)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기를 나타내는 황 원자이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 컨쥬게이션 전의 링커-반응성 치환기 기 구조 L-Z'은 하기이다:
Figure pct00120
또는
Figure pct00121
.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 아마톡신은 하기 화학식을 갖는 링커-반응성 모이어티 -L-Z'에 컨쥬게이션된다:
Figure pct00122
.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 아마톡신은 하기 화학식을 갖는 링커-반응성 모이어티 -L-Z'에 컨쥬게이션된다:
Figure pct00123
.
특히, 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 유용한 상기 링커 모이어티 및 아마톡신-링커 컨쥬게이트는, 예를 들어, 각각의 개시내용 전체가 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0218220호 및 특허 출원 공개 번호 WO2017/149077호에 설명되어 있다.
항체-약물 컨쥬게이트의 제조
본원에 개시된 ADC에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에 개시된 바와 같은 링커 L 및 화학적 모이어티 Z를 통해 하나 이상의 세포독성 약물 모이어티(D), 예를 들어, 항체 당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티에 컨쥬게이션된다. 본 발명의 개시의 ADC는 (1) 상기 본원에 설명된 바와 같은 Ab-Z-L을 형성하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 반응성 치환기와 2가 링커 시약의 반응 후 약물 모이어티 D와의 반응; 또는 (2) D-L-Z'을 형성하기 위한 약물 모이어티의 반응성 치환기와 2가 링커 시약의 반응 후 상기 본원에 설명된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 반응성 치환기와의 반응을 포함하는 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 여러 경로에 의해 제조될 수 있다. ADC를 제조하기 위한 추가 방법은 본원에 설명되어 있다.
또 다른 측면에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 설프하이드릴 기를 도입하도록 화학적으로 변형될 수 있는 하나 이상의 리신 잔기를 갖는다. 이후, ADC는 상기 본원에 설명된 바와 같이 설프하이드릴 기의 황 원자를 통한 컨쥬게이션에 의해 형성된다. 리신을 변형시키기 위해 사용될 수 있는 시약은 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA) 및 2-이미노티올란 하이드로클로라이드(트라우트 시약)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 설프하이드릴 기를 갖도록 화학적으로 변형될 수 있는 하나 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다. 이후, ADC는 상기 본원에 설명된 바와 같이 설프하이드릴 기의 황 원자를 통한 컨쥬게이션에 의해 형성된다.
또 다른 양태에서, 항-CD45 항체는 산화되어 알데하이드(-CHO) 기를 제공할 수 있는 하나 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다(예를 들어, 문헌[Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55] 참조). 이후, ADC는 상기 본원에 설명된 바와 같이 상응하는 알데하이드를 통한 컨쥬게이션에 의해 형성된다. 세포독소의 부착 또는 회합을 위한 단백질의 변형을 위한 다른 프로토콜은 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002)]에 설명되어 있다.
항체, 면역글로불린 또는 이의 단편과 같은 세포-표적화 단백질에 대한 링커-약물 모이어티의 컨쥬게이션을 위한 방법은, 예를 들어, 모두의 전체내용이 참조로서 본원에 명백히 포함되는 미국 특허 번호 5,208,020호; 미국 특허 번호 6,441,163호; WO2005037992호; WO2005081711호; 및 WO2006/034488호에서 발견된다.
대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 컨쥬게이트의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 인코딩하는 영역에 의해 분리된 컨쥬게이트의 두 부분을 인코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
본원에 설명된 ADC는 다양한 투여 형태로 환자(예를 들어, 면역 질병 또는 암을 앓고 있는 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 ADC는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 수용액과 같은 수용액의 형태로 면역 질병 또는 암을 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용하기에 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 점도 개질제를 포함한다. 수용액은 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 멸균될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은 항-CD45 ADC를 포함하는 약학적 제형은 상기 ADC를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 세륨 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치료적 용도
CD45는 조혈 및 면역계 전반에 걸쳐 광범위하게 발현되는 중요한 세포 표면 분자이다. 백혈병 및 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CD45+ 세포의 고갈이 유익한 상태를 갖는 환자뿐만 아니라 다발경화증 및 피부경화증과 같은 자가면역 질병을 갖는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있는 항-CD45 항체 및 항-CD45 ADC가 본원에 설명된다. 또한, 이식 후 이들 세포의 다능성 및 조혈 기능성이 보존되도록 외인성 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진하기 위한 조성물 및 방법이 현재 필요하다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은 이러한 난제인 문제에 대한 해법을 추가로 제공한다.
CD45를 본원에 설명된 항-CD45 항체, 이의 결합 단편 및 ADC로 표적화함으로써, 일반적으로 조혈 줄기 세포(HSC) 및 백혈구 둘 모두가 고갈될 수 있다(CD45는 범 백혈구 마커임). 따라서, 특정 구현예에서, 면역 재설정을 필요로 하는 대상체에서 면역 재설정을 제공하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 본원에 설명된 항-CD45 항체 또는 ADC를 백혈구를 유발하는 질병과 관련된 질병, 예를 들어, 자가면역 질병을 갖는 환자에 투여함으로써, 백혈구를 유발하는 질병이 (HSC와 함께) 제거될 수 있고, 환자는 이어서 이후 이식된 HSC로부터 새로운 면역계를 구축할 수 있다.
본원에 설명된 CD45 특이적 항체 및 ADC의 추가 이점은 비-표적화된 매우 독성의 화학요법과 반대로, 적혈구가 일반적으로 CD45를 발현하지 않는다는 점을 고려할 때 적혈구가 환자에서 영향을 받지 않아야 한다는 것이다.
따라서, 특히 조혈 계통의 세포 유형의 질병, 암, 자가면역 질병, 대사 장애 및 줄기 세포 장애와 같은 다양한 장애를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은 (i) 병리를 발생시키는 세포 집단, 예를 들어, 암 세포(예를 들어, 백혈병 세포) 및 자가면역 세포(예를 들어, 자가반응성 T-세포)의 집단을 직접 고갈시킬 수 있고/있거나 (ii) 이식된 세포가 귀소할 수 있는 니치를 제공함으로써 이식된 조혈 줄기 세포의 생착을 촉진하기 위해 내인성 조혈 줄기 세포의 집단을 고갈시킬 수 있다. 상기 활성은 내인성 질병-유발 세포 또는 조혈 줄기 세포에 결합할 수 있는 항-CD45 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여에 의해 달성될 수 있다. 질병의 직접적인 치료의 경우, 이러한 투여는 관심 병리를 발생시키는 세포의 양을 감소시킬 수 있다. 조혈 줄기 세포 이식 요법을 위해 환자를 준비하는 경우, 이러한 투여는 내인성 조혈 줄기 세포 집단의 선택적 고갈을 야기할 수 있고, 이에 따라 골수와 같은 조혈 조직에 빈자리를 생성할 수 있으며, 이는 이후에 이식된 외인성 조혈 줄기 세포에 의해 충전될 수 있다. CD45에 결합할 수 있는 본원에 설명된 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 환자에게 투여되어 상기 둘 모두의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 면역 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포에 의해 발현되는 CD45 항원에 결합하는 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암 또는 자가면역 질병을 앓고 있는 환자에게 투여되어 암성 세포 또는 자가면역 세포의 집단을 직접 고갈시킬 수 있고, 또한 조혈 줄기 세포 이식 요법을 필요로 하는 환자에게 투여되어 이식된 조혈 줄기 세포의 생존 및 생착 잠재성을 촉진시킬 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이 조혈 줄기 세포 이식 요법은 하나 이상의 혈액 세포 유형을 채우거나 다시 채우도록 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 조혈 줄기 세포는 일반적으로 다능성을 나타내며, 이에 따라 과립구(예를 들어, 전골수구, 호중구, 호산구, 호염기구), 적혈구(예를 들어, 그물적혈구, 적혈구), 혈소판(예를 들어, 거대핵모세포, 혈소판 생성 거대핵세포, 혈소판), 단핵구(예를 들어, 단핵구, 대식세포), 수지상 세포, 미세아교세포, 파골세포 및 림프구(예를 들어, NK 세포, B-세포 및 T-세포)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 상이한 혈액 계통으로 분화할 수 있다. 조혈 줄기 세포는 추가로 자가-재생할 수 있고, 따라서 모세포와 동등한 잠재성을 갖는 딸 세포를 발생시킬 수 있고, 또한 이식 수용자에게 재도입될 수 있는 능력을 특징으로 하며, 그래서 이들은 조혈 줄기 세포 니치로 귀소하고 생산적이고 지속적인 조혈을 재확립한다.
따라서, 조혈 줄기 세포는 결손되거나 결핍된 세포 집단을 생체 내에서 재구성하기 위해 조혈 계통의 하나 이상의 세포 유형에 있어서 결손 또는 결핍 환자에게 투여될 수 있으며, 이에 의해 내인성 혈액 세포 집단에서의 결손 또는 결핍과 관련된 병리를 치료할 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 비-악성 혈색소병증(예를 들어, 낫적혈구빈혈, 지중해빈혈, 판코니 빈혈, 재생불량빈혈 및 비스코트-올드리치 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈색소병증)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 선천성 면역결핍과 같은 면역결핍을 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 후천적 면역결핍(예를 들어, HIV 및 AIDS로 구성된 군으로부터 선택되는 후천적 면역결핍)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은 대사 장애(예를 들어, 글리코겐 축적병, 점액다당류증, 고셔병, 헐러병, 스핑로리피드증 및 이염색백색질장애로 구성된 군으로부터 선택되는 대사 장애)를 치료하는 데 사용될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 악성 또는 증식성 장애, 예를 들어, 혈액 암, 골수증식성 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 암 치료의 경우, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 조혈 줄기 세포 이식 요법 이전에 내인성 조혈 줄기 세포의 집단을 고갈시키기 위해 환자에게 투여될 수 있으며, 이 경우 이식된 세포는 내인성 세포 고갈 단계에 의해 생성된 니치에 귀소하고 생산적인 조혈을 확립할 수 있다. 이는, 차례로, 전신 화학요법 동안과 같이 암 세포 박멸 동안 고갈된 세포 집단을 재구성할 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 혈액 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 및 비-호지킨 림프종뿐만 아니라 신경모세포종을 포함하는 다른 암성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 설명된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 추가 질병은 아데노신 데아미나제 결핍 및 중증 복합 면역결핍, 과 면역글로불린 M 증후군, 체디악-히가시 질병, 유전성 림프조직구증, 골화석증, 불완전골생성증, 축적병, 중증성 지중해빈혈, 전신경화증, 전신 홍반 루푸스, 다발경화증 및 청소년 류마티스 관절염을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 설명된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 컨쥬게이트는 고체 장기 이식 내성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 표적 조직으로부터 세포 집단을 고갈시키거나 제거하는 데(예를 들어, 골수 줄기 세포 니치로부터 조혈 줄기 세포를 고갈시키기 위해) 사용될 수 있다. 표적 조직으로부터 세포의 이러한 고갈 후, 장기 기증자로부터의 줄기 또는 전구 세포 집단(예를 들어, 장기 기증자로부터의 조혈 줄기 세포)이 이식 수용자에게 투여될 수 있고, 상기 줄기 또는 전구 세포의 생착 후, 일시적이거나 안정적인 혼합 키메라현상이 달성될 수 있으며, 이에 의해 추가 면역억제제에 대한 필요 없이 장기간의 이식 장기 내성이 가능하다. 예를 들어, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 고체 장기 이식 수용자(예를 들어, 특히 신장 이식, 폐 이식, 간 이식 및 심장 이식)에서 이식 내성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 낮은 백분율의 일시적 또는 안정적 공여자 생착이 이식된 장기의 장기 내성을 유도하기에 충분하기 때문에 고체 장기 이식 내성의 유도와 관련하여 사용하기에 매우 적합하다.
또한, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 암, 예를 들어, CD45+인 세포를 특징으로 하는 암을 직접 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 CD45+ 백혈병 세포를 나타내는 환자에서와 같이 백혈병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 백혈병 세포와 같은 CD45+ 암성 세포를 고갈시킴으로써, 본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여 다양한 암을 직접 치료할 수 있다. 이러한 방식으로 치료될 수 있는 예시적인 암은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 다발골수종, 미만성 거대 B-세포 림프종 및 비-호지킨 림프종과 같은 혈액 암을 포함한다.
또한, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 자가면역 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD45+ 면역 세포를 사멸시키기 위해 자가면역 장애를 앓고 있는 인간 환자와 같은 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, CD45+ 면역 세포는 자가 항원에 특이적으로 결합하고 이에 대한 면역 반응을 일으키는 T-세포 수용체를 발현하는 T-세포와 같은 자가반응성 림프구일 수 있다. 자가-반응성 CD45+를 고갈시킴으로써, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 하기 설명된 것과 같은 자가면역 병리를 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에 설명된 조성물 및 방법은 조혈 줄기 세포 이식 요법 이전에 내인성 조혈 줄기 세포의 집단을 고갈시킴으로써 자가면역 질병을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 이 경우 이식된 세포는 내인성 세포 고갈 단계에 의해 생성된 니치에 귀소하고 생산적인 조혈을 확립할 수 있다. 이는, 차례로, 자가면역 세포 근절 동안 고갈된 세포 집단을 재구성할 수 있다.
본원에 설명된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가면역 장애는 건선, 건선성 관절염, 타입 1 진성당뇨병(타입 1 당뇨병), 류마티스 관절염(RA), 인간 전신 루푸스(SLE), 다발경화증(MS), 염증성 장질병(IBD), 림프구성 결장염, 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 애디슨병, 전신탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군(APS), 재생불량빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 내이 질병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 난소염, 발로병, 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 샤가스병, 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 크론병, 반흔성 유사천포창, 복강 스프루-포진 피부염, 저온응집병, CREST 증후군, 데고스병, 원반모양 루푸스, 자율신경기능이상, 자궁내막증, 원발성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군(GBS), 하시모토 갑상선염, 화농땀샘염, 특발성 및/또는 급성 혈소판감소성 자반증, 특발성 폐 섬유증, IgA 신경병증, 간질성 방광염, 청소년 관절염, 가와사키병, 편평태선, 라임병, 메니에르병, 혼합 결합 조직병(MCTD), 중증근무력증, 신경근긴장증, 간대성 근간대성 증후군(OMS), 시신경염, 오드 갑상선염, 보통천포창, 악성 빈혈, 다발연골염, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 담즙성 간경변증, 결절다발동맥염, 다분비성 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 무감마글로불린혈증, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스열, 사코이드증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 타카야수 동맥염, 측두동맥염("거세포성 동맥염"으로도 공지됨), 궤양성 결장염, 교원성 결장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 외음부통("외음부 전정염") 및 베게너 육아종증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 이식은 동종이형이다. 일부 구현예에서, 이식은 자가이다.
일부 구현예에서, 이식은 골수 이식, 말초 혈액 이식 또는 제대혈 이식이다.
일부 구현예에서, 이식은 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포)를 포함한다.
본원에 설명된 임의의 구현예에서, 이식은 임의의 고형 장기 또는 피부 이식일 수 있다. 일부 구현예에서, 이식은 신장 이식, 심장 이식, 간 이식, 췌장 이식, 폐 이식, 장 이식 및 피부 이식으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 설명된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 다양한 투여 형태로 환자(예를 들어, 암, 자가면역 질병을 앓고 있거나 조혈 줄기 세포 이식 요법이 필요한 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 암, 자가면역 질병을 앓고 있거나 수용액, 예를 들어, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 수용액의 형태로 조혈 줄기 세포 이식 요법이 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 부형제는 점도 개질제를 포함한다. 수용액은 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 멸균될 수 있다.
항-CD45 항체 또는 이의 컨쥬게이트(예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 ADC)를 포함하는 약학적 제형은 상기 항체 또는 ADC를 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 세륨 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 설명된 항체, 항원 결합 단편 또는 ADC는 경구, 경피, 피하, 비강 내, 정맥 내, 근육 내, 안내 또는 비경구와 같은 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 임의의 제공된 경우에 투여하기에 가장 적합한 경로는 투여되는 특정 항체 또는 항원 결합 단편, 환자, 약학적 제형화 방법, 투여 방법(예를 들어, 투여 시간 및 투여 경로), 환자의 연령, 체중, 성별, 치료되는 질병의 중증도, 환자의 식이 및 환자의 배설률에 의존할 것이다.
본원에 설명된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유효 용량은, 예를 들어, 단일(예를 들어, 볼루스) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 약 100 mg/체중 kg의 범위일 수 있거나, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 최적 혈청 농도(예를 들어, 0.0001-5000 μg/mL의 혈청 농도)를 달성하는 것이다. 용량은 조혈 줄기 세포 이식을 받기 위한 준비로 암, 자가면역 질병을 앓고 있거나 컨디셔닝 요법을 받는 대상체(예를 들어, 인간)에게 1일, 1주일 또는 1개월에 1회 이상(예를 들어, 2-10회) 투여될 수 있다. 조혈 줄기 세포 이식 전 컨디셔닝 절차의 경우, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 외인성 조혈 줄기 세포 이식의 투여 전 1시간 내지 1주(예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 또는 그 이상의 외인성 조혈 줄기 세포의 생착을 최적으로 촉진하는 시간에 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하여, 당업자는 조혈 줄기 세포에 의해 발현된 CD45에 결합할 수 있는 ADC, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 조혈 줄기 세포 이식 요법을 필요로 하는 인간 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 방식으로, 내인성 조혈 줄기 세포의 집단은 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 촉진하기 위해 외인성 조혈 줄기 세포 이식편의 투여 전에 고갈될 수 있다. 항체는 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 세포독성 분자와 같은 독소에 공유적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 슈도모나스 외독소 A, 데부가닌, 디프테리아 독소, 아마톡신, 예를 들어, γ-아마니틴, α-아마니틴, 사포린, 메이탄신, 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 안트라사이클린, 칼리케아마이신, 이리노테칸, SN-38, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노벤조디아제핀, 인도릴노벤조디아제핀 이량체 또는 이들의 변이체와 같은 세포독소에 공유적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 컨쥬게이션은 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 공유 결합-형성 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 이후, 예를 들어, 외인성 조혈 줄기 세포(예를 들어, 자가, 동계 또는 동종이형 조혈 줄기 세포)의 이식 전에 정맥 내 투여에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 표적 CD45 발현 세포의 양을 감소시키기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 골수 및/또는 말초 혈액에서 내인성 CD45+ 세포의 양을, 예를 들어, 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상만큼 감소시키기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 조혈 줄기 세포 이식 요법 전에 내인성 조혈 줄기 세포의 양을, 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상만큼 감소시키기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 조혈 줄기 세포 수의 감소는 컨디셔닝 요법 동안 다양한 간격으로 환자로부터 회수된 혈액 샘플에서 특징적인 조혈 줄기 세포 표면 항원을 발현하는 세포의 FACS 분석과 같은 당 분야에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 컨디셔닝 요법 동안 다양한 시점에서 환자로부터 혈액 샘플을 회수하고, 조혈 줄기 세포 마커 항원에 결합하는 항체를 사용하여 샘플에서 조혈 줄기 세포의 상대 농도를 밝히기 위해 FACS 분석을 수행함으로써 내인성 조혈 줄기 세포 감소의 정도를 결정할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 조혈 줄기 세포의 농도가 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC를 사용한 컨디셔닝 요법에 반응하여 최소 값에 도달하는 경우, 의사는 컨디셔닝 요법을 종료하고 조혈 줄기 세포 이식 요법을 위한 환자 준비를 시작할 수 있다.
항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 점도 개질제를 함유하는 수용액으로 환자에게 투여될 수 있다. 수용액은 본원에 설명되거나 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 멸균될 수 있다. 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는, 예를 들어, 환자에게 조혈 줄기 세포 이식편을 투여하기 전에 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.15 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.15 mg/kg 내지 약 0.25 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.2 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.25 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg 또는 1.0 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 약물-항체 컨쥬게이트는 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 9.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 8.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 7.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 6.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 3.5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 9 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 7 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 6 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 4 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 설명된 항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC는 외인성 조혈 줄기 세포 이식의 투여 전 약 1시간 내지 약 1주(예를 들어, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 또는 그 이상의 외인성 조혈 줄기 세포의 생착을 최적으로 촉진하는 시간에 환자에게 투여될 수 있다.
컨디셔닝 요법의 종결 후, 환자는 이후, 예를 들어, 컨디셔닝 요법을 수행한 동일한 의사 또는 상이한 의사로부터 외인성 조혈 줄기 세포의 주입(예를 들어, 정맥 내 주입)을 받을 수 있다. 의사는, 예를 들어, 약 1 x 103 내지 약 1 x 109 조혈 줄기 세포/kg의 투여량으로 환자에게 자가, 동계 또는 동종이형 조혈 줄기 세포의 주입을 환자에게 투여할 수 있다. 의사는, 예를 들어, 이식의 투여 후 환자로부터 혈액 샘플을 회수하고 조혈 줄기 세포 또는 조혈 계통의 세포(예를 들어, 거대핵세포, 트롬보사이트, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 골수모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 미세아교세포, 과립구, 단핵구, 파골세포, 항원-제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-림프구 및 B-림프구)의 농도의 증가를 결정함으로써 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 모니터링할 수 있다. 이러한 분석은, 예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식 요법 후 약 1시간 내지 약 6개월(예를 들어, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주 또는 그 이상) 동안 수행될 수 있다. 조혈 줄기 세포 또는 조혈 계통의 세포의 농도가 이식 요법 전의 해당 세포 유형의 농도에 비해 이식 요법 후 증가(예를 들어, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 500% 이상만큼)했다는 발견은 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 ADC를 이용한 치료가 이식된 조혈 줄기 세포 이식편의 생착을 성공적으로 촉진시켰다는 하나의 징후를 제공한다. 전술한 것은 또한 CD45 세포와 관련된 요법; 자가면역 질병의 치료 또는 혈액 암의 치료를 위한 고갈, 예를 들어, HSC 및 면역 세포 고갈에 사용될 수 있다.
항-CD45 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 ADC의 투여로 인한 조혈 줄기 세포 이식의 생착은 다양한 경험적 측정으로 나타날 수 있다. 예를 들어, 이식된 조혈 줄기 세포의 생착은 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 및 조혈 줄기 세포 이식의 후속 투여 후 환자의 골수 내에 존재하는 경쟁적 재증식 단위(competitive repopulating unit; CRU)의 양을 평가함으로써 평가될 수 있다. 추가로, 형광성, 발색성 또는 발광성 생성물을 생성하는 화학 반응을 촉매하는 효소와 같은 리포터 유전자를 공여자 조혈 줄기 세포가 형질감염된 벡터에 혼입시키고, 이후 골수와 같은 조혈 줄기 세포가 귀소된 조직에서 상응하는 신호를 모니터링함으로써 조혈 줄기 세포 이식의 생착을 관찰할 수 있다. 또한, 예를 들어, 당 분야에 공지된 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 방법에 의해 결정된 바와 같이 조혈 줄기 및 전구 세포의 양 및 생존을 평가함으로써 조혈 줄기 세포 생착을 관찰할 수 있다. 생착은 또한 이식 후 기간 동안 말초 혈액에서 백혈구 수를 측정하고/하거나 골수 흡인물 샘플에서 공여자 세포에 의한 골수 세포의 회복을 측정함으로써 결정될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본원에 설명된 조성물 및 방법이 어떻게 사용되고, 제조되고, 평가될 수 있는지에 대한 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되며, 순전히 본 발명의 예시인 것으로 의도되며, 본 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1. 항-CD45 항체 Ab1-Ab7의 확인
완전한 인간 라이브러리를 스크리닝하고, 항-인간 CD45 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6 및 Ab7을 확인하였다. 각각의 상기 항체는 CD45 발현 세포에서 내재화될 수 있었다. 라이브러리 스크리닝 및 결과로서 생성된 항체에 대한 추가 세부사항은 후속되는 실시예에 제공된다.
효모 디스플레이
완전한 인간 항체(천연 또는 합성)를 디스플레이하는 효모 디스플레이 라이브러리를 인간 CD45(아이소형 CD45RABC; Uniprot: P08575-3) 및 비-인간 영장류(NHP) CD45의 엑토도메인에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 재조합 CD45 항원에 결합되는 항체를 인코딩하는 효모 세포를 선택하였다. 선택된 효모 세포로부터의 항체를 나타내는 핵산 서열은 당 분야에 공지된 기술에 따라 분리하였다.
특히, 인간 및 NHP 교차-반응성 항-CD45 항체를 확인하기 위해 스크리닝을 수행하였다. 첫 번째 스크리닝은 대략 55개의 항체를 생성했지만, 이들은 인간 CD45에만 결합하고, NHP CD45 항원에 교차 반응하지 않았다. 두 번째 스크리닝은 성공적으로 82개의 인간 반응성 클론을 생성하였고, 이 중 17개는 인간 및 레서스 CD45에 반응성이었고, 이 중 8개는 인간, 레서스 및 시노몰구스 CD45 재조합 항원에 대해 삼중 교차-반응성이었다.
8개의 삼중 교차-반응성(인간, 레서스, 시노몰구스 CD45 반응성) 항체로부터, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3에서 서열을 다양화시키고 당 분야에 공지된 방법에 따라 개선된 친화성에 대해 선택함으로써 친화성의 추가 개선을 위한 친화성 성숙의 여러 라운드에 별개의 CDR3 중쇄 서열을 갖는 4개의 인간 IgG 항체를 선택하였다. 개선된 친화성 및 변이체 서열을 갖는 총 55개의 인간 IgG 항체를 4개의 입력 항체의 친화성 성숙 후에 후속적으로 확인하였다. 친화성 성숙 과정으로의 4개의 모 항체 입력으로부터, 단지 하나의 항체가 인간 및 시노몰구스 말초 단핵 세포(PBMC)에 대해 수행된 결합 검정에 의해 살아 있는 세포에 대한 진정한 교차-반응성 클론인 것으로 확인된 딸 변이체를 생성하였다(도 1 참조).
도 1에 제시된 바와 같이, Ab1으로부터 유래된 딸 변이체는 옥텟 결합 검정에 의해 평가된 바와 같이 모 항체에 비해 인간 CD45에 대한 결합을 개선시켰다. 또한, Ab1으로부터 유래된 친화성 성숙된 딸 변이체는 인간 CD45 및 시노몰구스 CD45와 종간 교차-반응성을 나타내었다(도 1). 대조적으로, 다른 3개의 모 항체로부터 유래된 항체는 교차-반응성이 불량하였다(도 1).
Ab1으로부터 유래된 선택된 딸 변이체를 발현시키고, 생성된 항체를 추가로 스크리닝하여 CD45 발현 세포 상에서 내재화할 수 있는 항-CD45 항체를 확인하였다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 예시적인 방법 및 시약은, 예를 들어, 문헌[Boder E.T. and Wittrup K.D., Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol, 328:430-44 (2000) 및 Boder E.T. and Wittrup K.D., Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nat Biotechnol. 15(6):553-7 (June 1997)]에서 발견될 수 있다.
상기 스크리닝 공정으로부터, 친화성 성숙 전에 확인된 1개의 항체(Ab1) 및 친화성 성숙 후 4개의 항체(Ab2, Ab3, Ab4 및 Ab6)를 포함하는 5개의 인간 IgG 항체를 원하는 항원 및 살아 있는 세포 결합 특성에 기초하여 선택하였다. Ab5를 생성시키기 위해 후속 부위 특이적 치환이 Ab4에 도입되었다. 유사하게, Ab7을 생성시키기 위해 부위 특이적 치환이 Ab3에 도입되었다. 7개의 선택된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 CDR 영역의 아미노산 서열이 표 27에 제공된다. 7개의 항체는 항체 1(Ab1), 항체 2(Ab2), 항체 3(Ab3), 항체 4(Ab4), 항체 5(Ab5), 항체 6(Ab6) 및 항체 7(Ab7)을 포함한다.
Ab1-7의 추가 특징은 실시예 2 내지 14에 제공된다.
실시예 2. 항-CD45 항체의 시험관 내 안정성 분석
실시예 1에서 확인된 항체의 안정성을 다양한 스트레스 조건하에서 평가하였다. 이들 연구는 항체 비균질성 및/또는 결합에 영향을 미칠 수 있는 번역 후 변형의 형성에 민감할 수 있는 VH/VL 프레임워크 및 CDR 아미노산을 확인하였다.
Ab3 및 Ab4를 15일 동안 4℃, 25℃ 및 40℃에서 인큐베이션하여 2주 안정성 검정을 수행하였고, 그 후 항체를 친수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 분석하였다. 간단히, 25 마이크로그램의 지시된 항체를 Waters ARC HPLC/UPLC 시스템 상의 Tosoh TSKgel Phenyl-5PW 7.5 mm ID x 7.5 cm 10-마이크론 컬럼(카탈로그 # 07573)에 주입하였다. 항체의 HIC 용리 프로파일은 열 스트레스의 함수로서 증가된 비교적 친수성인 프리-피크를 나타내었다. 이러한 친수성 프리-피크는 번역 후 변형(예를 들어, 산화 또는 탈아미드화)의 잠재적인 부위를 나타낸다. 이후, 스트레스(높은 pH, 낮은 pH 및 산화 스트레스)에 노출시 각각의 항체에서 변형된 아미노산을 확인하기 위해 펩티드 맵핑을 수행하였다. 펩티드 맵핑 분석은 높은 pH 조건(예를 들어, pH 8 이상)에 대한 반응으로 CDR-L1의 아스파라긴(N30 위치)에서 잠재적인 탈아미드화 부위를 확인하였다.
친화성 성숙 후에 확인된 다른 클론의 비교는 세린이 CDR-L1의 N30 위치에서 용인될 수 있음을 시사하였다. 따라서, CDR-L1의 아스파라긴(예를 들어, 위치 30B)이 세린으로 치환된 Ab3 및 Ab4의 변이체가 생성되었다. 생성된 항체는 각각 Ab7 및 Ab5로 명명되었다. 탈아미드화 종에 상응하는 프리-피크는 높은 pH 처리에 노출된 후 Ab5의 HIC 프로파일에서 관찰되지 않았으며, 이는 이러한 치환이 이러한 잠재적인 탈아미드화 부위를 제거함을 확인한다.
실시예 3. 항-CD45 항체의 시험관 내 결합 분석
실시예 1 및 2에 설명된 항체를 연구하여 인간 CD45에 대한 이들의 결합 특징을 결정하고, 레서스 및 시노몰구스 CD45와 교차 반응하는 능력을 평가하였다.
항체 결합 연구를 생물층 간섭법(BLI)을 사용하여 Pall ForteBio Octet Red96으로 0.1% w/v 소 혈청 알부민이 보충된 1x PBS에서 25℃에서 수행하였다. 각각의 정제된 인간 항체를 항-인간 Fc 바이오센서(AHQ; Pall ForteBio 18-5001)에 고정시키고, 친화성 성숙된 클론 Ab2-Ab7에 대한 50nM의 정제된 인간, 레서스 또는 시노몰구스 CD45 엑토도메인, 및 모 클론 Ab1에 대해 100nM의 인간 CD45 및 300nM의 레서스 또는 시노몰구스 CD45와 함께 인큐베이션하였다.
겉보기 1가 친화성(KD), 겉보기 결합 속도(KON) 및 겉보기 해리 속도(KOFF)는 정제된 인간, 시노몰구스 또는 레서스 CD45 엑토도메인에 대한 각각의 IgG의 ForteBio 데이터 분석 소프트웨어 버전 10에 의해 계산된 바와 같이 1:1 결합 모델을 사용한 국소 완전 적합화에 의해 결정하였다. 각각의 항체의 KD, KON 및 Kdis는 표 2에 제시되어 있다. 친화성 성숙된 딸 클론(Ab 2-Ab 7)은 모 클론 Ab1에 비해 인간 CD45에 대한 개선된 결합을 나타내었다. 또한, 이들 결과는 Ab5 및 Ab7의 N_30_S 치환이 CD45 결합을 변경하지 않았음을 나타낸다. 특히, 선택된 항체 Ab2-Ab7 각각은 인간, 시노몰구스 및 레서스 CD45와 교차 반응할 수 있었다. 결합은 하기를 사용하여 확인하였다.
표 2. 인간 CD45 엑토도메인, 시노몰구스 CD45 엑토도메인 또는 레서스 CD45 엑토도메인에 대한 표시된 IgG의 1가 친화성(KD), 겉보기 결합 속도(KON) 및 겉보기 해리 속도(KOFF 또는 Kdis)
Figure pct00124
실시예 4. 항-CD45 항체의 시험관 내 REH 및 PBMC 세포 결합 활성
실시예 1 및 2에서 확인된 선택된 항-CD45 항체(Ab5 및 Ab7)의 시험관 내 REH 및 PBMC 세포 결합을 본 실시예에서 평가하였다. 각각의 항체의 Fc 영역은 아미노산 치환 D265C LALA H435A로 변형되었다.
세포 배양 배지에서 REH-1(B 세포 비-호지킨 림프종 세포주, ATCC No. CRL-3004) 세포 또는 일차 인간 또는 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 37℃에서 밤새 적정 용량의 Ab5 및 Ab7과 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항-CD45 항체를 흐름세포측정법을 사용하여 형광 표지된 AF488 항-인간 IgG 이차 항체로 검출하였다. IC50을 GraphPad Prism을 사용하여 데이터를 적합화시킴으로써 결정하였다.
표 3 및 도 2에 제시된 바와 같이, Ab5 및 Ab7은 인간 및 시노몰구스 PBMC 사이에 유사한 IC50을 나타내었고, 이는 살아 있는 세포에서 인간 및 시노몰구스 CD45에 대한 교차-반응성 결합을 입증한다. 항체는 또한 인간 CD45를 발현하는 REH-1 세포주에 대한 강력한 결합을 나타내었다.
표 3. EC50 (nM)
Figure pct00125
실시예 5. 에피토프 맵핑
실시예 1 및 2에서 확인된 항-CD45 항체(Ab5)에 의해 결합된 에피토프를 가교 질량분광법을 사용하여 맵핑하였다. 가교 실험은 High-Mass MALDI 질량분광법에 의한 비-공유 상호작용의 직접적인 분석을 가능하게 한다. 비-공유 상호작용을 포함하는 단백질 샘플을 특별히 개발된 가교 혼합물(Bich, C et al. Anal. Chem., 2010, 82 (1), pp 172-179)과 혼합함으로써, 높은 민감성을 갖는 비-공유 복합체를 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 가교에 의해 생성된 공유 결합은 상호 작용하는 종이 샘플 제조 공정 및 MALDI 이온화에서 생존할 수 있게 한다. 특별한 High-Mass 검출 시스템은 High-Mass 범위에서 상호작용의 특성규명을 허용한다.
고분해능으로 Ab5의 에피토프를 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화된 가교 결합제와 함께 인큐베이션하고 다중 효소 절단에 적용시켰다. 단백질 복합체는 인간 CD45에 결합된 Ab5 변이체 항체(Ab5와 동일한 에피토프를 가짐)였다. 가교된 펩티드의 농축 후, 샘플을 고 분해능 질량분광법(nLC-LTQ-Orbitrap MS)으로 분석하였고, 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
중수소화 d0d12를 갖는 단백질 복합체 CD45/Ab5의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써몰리신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 Ab5 에피토프가 펩티드 TEKDCLNLDKNLIKYDLQNLK(SEQ ID NO:114) 및 RPPRDRNGPHERYHLEVEAGNTLVRNESH(SEQ ID NO:116) 내의 잔기를 포함하고, 특히 SEQ ID NO:113(NP_002829.3에 해당하는 CD45 아이소형의 단편)의 405T, 407K, 419Y, 425K, 481R, 505R 및 509H에 상응하는 인간 CD45 상의 아미노산과 상호작용하는 것을 나타내었다. 이들 결과는 Ab5의 에피토프(예를 들어, SEQ ID NO:114 및 SEQ ID NO:116에 설명된 바와 같은 에피토프), 및 상호작용의 특정 부위를 포함하는 SEQ ID NO:115 및 117에 상응하는 CD45 아미노산 단편을 제시하는 도 3에 예시되어 있다.
CD45는 뮤신-유사 도메인, d1-d4 피브로넥틴-유사 도메인, 막횡단 및 포스파타제 도메인을 포함한다. 본 결과에 기초하여, Ab5는 CD45의 피브로넥틴-유사 도메인의 d3 및 d4와 상호작용하는 것으로 보인다. Ab5 에피토프의 잔기 405T, 407K, 419Y, 425K 및 505R 은 인간, 레서스 및 시노몰구스 CD45에 결합하는 Ab5(및 Ab1으로부터 유래된 클론)의 능력과 일치하는 인간, 시노몰구스 및 레서스 CD45에 걸쳐 보존된다.
실시예 6. 항-CD45 항체 컨쥬게이트의 세포 내재화
이러한 연구를 위해, 실시예 1 및 2에서 확인된 항-CD45 항체(Ab5)를 인간 골수 세포에서 시험관 내 내재화 검정으로 평가하였다. 변형된 Fc 영역(D265C LALA H435A)을 갖는 Ab5를 아마톡신(아마톡신 1(AM1))에 컨쥬게이션시켜 항체 약물 컨쥬게이트(Ab5-AM1)를 형성시켰다. 달리 명시되지 않는 한 전체적으로 사용되는 AM1은 본원에 설명된 화학식 VI로 표현된다.
항-CD45 ADC를 수용성이고, 밝고, 감광성이고, pH 반응성인 pHAb 염료에 컨쥬게이션시켰다. 내재화시, 컨쥬게이션된 항체는 산성 엔도좀/리소좀으로 이동할 수 있으며, 여기서 pHAb 염료는 563 nM에서 방출되고 흐름세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, CD34+ 인간 골수 세포에서 Ab5-AM1 ADC의 내재화를 평가하였다.
이러한 검정을 0, 2, 24, 48 또는 72시간 동안 ADC의 포화 농도로 2시간 동안 얼음 상에서 CD34+ 인간 골수 세포를 인큐베이션함으로써 수행하였다. pHAb의 수준(gMFI에 의해 측정됨)을 시간 경과에 따라 평가하였다(도 4; 좌측 패널). 시간 경과의 끝에서, 형광단 표지된 항-IgG 분자를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 결합된 표면 hIgG1을 평가하였다. 인간 CD34+ 세포에 결합하지 않는 아마톡신 1에 컨쥬게이션된 동형 IgG(동형-AM1)를 비-내재화 대조군으로 포함시켰다. 0h 시점이 CD45의 포화된 결합을 나타내기 때문에, 각각의 시점에서 결합된 표면 IgG의 기하 평균 형광 강도(gMFI)를 0시간에 동일한 ADC의 gMFI와 비교함으로써 내재화된 ADC 백분율을 계산하였다(도 4; 우측 패널).
도 4에 제시된 바와 같이, 세포에서 검출된 pHAb의 수준은 시간이 지남에 따라 증가하였고(도 4, 좌측 패널), 이는 시간이 지남에 따라 ADC 내재화 백분율의 증가에 상응하였다(도 4, 우측 패널). Ab5-AM1의 내재화 백분율은 동형-AM1의 내재화 백분율에 비해 현저히 높았는데, 이는 Ab5-AM1이 인간 CD34+ 골수 세포에 의해 내재화되었지만, 동형 대조군은 내재화되지 않았음을 나타낸다. 이들 결과는 Ab5-AM1이 인간 CD34+ 골수 세포에 의해 내재화되었음을 나타낸다.
실시예 7. 시험관 내 세포주 사멸 검정을 사용한 항-CD45 항체 컨쥬게이트의 분석
실시예 1 및 2에서 확인된 항-CD45 항체(Ab2-Ab7)의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 Jurkat(급성 T 세포 백혈병 세포주, ATCC No. TIB-152), SKNO-1(급성 골수성 백혈병 세포주 JCRB1170) 및 REH-1(B 세포 비-호지킨 림프종 세포주, ATCC No. CRL-3004) 세포주, 및 REH CD45 -/- 넉아웃 세포주의 시험관 내 사멸에 대해 평가하였다. 변형된 Fc 영역(D265C LALA H435A 또는 D265C.LALA.H435A-SG3249)을 갖는 항-CD45 항체를 각각 2개의 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)) 중 하나 또는 PBD(테시린)에 컨쥬게이션시켜 ADC를 형성시켰다. 달리 지시되지 않는 한 전체적으로 사용되는 AM2는 화학식 III로 표현되며, 여기서 X는 S이다.
세포주를 사용한 시험관 내 사멸 검정의 경우, 세포를 ATCC 지침에 따라 성장시켰다. 보다 구체적으로, 세포는 CD45-ADC 또는 동형 대조군-ADC의 존재하에 7일 동안 배양하였다. 이후, 살아 있는 세포와 관련된 아데노신 트리포스페이트(ATP) 함량을 측정하는 Cell-titer Glo 검정에 의해 세포 생존율을 측정하였다. 세포주 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50을 GraphPad Prism을 사용하여 계산하였다.
표 4 및 5 및 도 5a 및 5b에 설명된 결과는 각각의 시험된 항 CD45-ADC가 시험관 내에서 CD45 발현 세포주(예를 들어, Jurkat, REH-1 또는 SKNO-1 세포)를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
표 4. 시험관 내 Jurkat, REH 및 SKNO-1 세포주 사멸 검정 - IC50 값
Figure pct00126
표 5. 시험관 내 REH 세포주 사멸 검정 - IC50 값
Figure pct00127
실시예 8. 시험관 내 PBMC 및 HSC 사멸 검정을 사용한 항-CD45 항체 컨쥬게이트의 분석
실시예 1 및 2에서 확인된 항-CD45 항체(Ab2-Ab7)의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 일차 인간 또는 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 조혈 줄기 세포(HSC)의 사멸에 대해 평가하였다. 변형된 Fc 영역(D265C LALA H435A 또는 D265C.LALA.H435A-SG3249)을 갖는 항-CD45 항체를 본 연구에서 각각 2개의 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)) 중 하나 또는 PBD에 컨쥬게이션시켜 ADC를 형성시켰다.
PBMC는 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해 세포) 및 단핵구의 이종성 세포 집단으로 구성된 CD45 발현 세포이다. 세포주를 사용한 시험관 내 사멸 검정의 경우, PBMC를 CD45-ADC 또는 동형 대조군-ADC의 존재하에서 7일 동안 10% 소 태아 혈청을 갖는 RPMI 1640에서 배양하였다. 이후, 세포 생존력을 Cell-titer Glo 검정에 의해 측정하였다. PBMC 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50을 GraphPad Prism을 사용하여 계산하였다.
도 6a 및 표 6에 설명된 결과는 각각의 항 CD45-ADC가 시험관 내에서 인간 및 시노몰구스 PBMC를 사멸시키는 데 효과적인라는 것을 나타낸다. Ab5-AM1에 대한 인간 및 시노몰구스 사멸을 묘사하는 예시적인 그래프는 도 6a 및 표 7에 제시되어 있다. Ab5-AM1은 인간 PBMC에 대해 8.5 pM의 IC50 및 시노몰구스 PBMC에 대해 9.1 pm의 IC50을 갖는 일차 PBMC의 강력한 사멸을 나타내었으며, 이는 인간 및 시노몰구스 PBMC가 Ab5-AM1에 동일하게 민감하다는 것을 나타낸다.
표 6. 시험관 내 세포주 사멸 검정 - IC50 값
Figure pct00128
표 7. Ab5-AM1을 사용한 시험관 내 인간 및 시노몰구스 PBMC 세포 사멸 검정 - IC50 값
Figure pct00129
인간 HSC를 사용한 시험관 내 사멸 검정을 위해, 일차 인간 CD34+ 골수 세포를 Ab2-AM2, Ab4-AM2, Ab5-AM1 또는 동형 ADC와 함께 5일 동안 배양하였다. 살아 있는 CD34+CD90+ HSC 수를 항체 농도의 함수로서 흐름세포측정법에 의해 결정하였다. 도 6b에 제시된 바와 같이, Ab5-AM1은 0.49 nm IC50으로 인간 HSC의 강력한 사멸을 나타내었다. 도 6c에 제시되고, 표 8에 요약된 바와 같이, Ab2-AM2 및 Ab4-AM2는 또한 시험관 내에서 HSC를 사멸시켰다.
표 8. 시험관 내 HSC 세포 사멸 검정 - IC50 값
Figure pct00130
실시예 9. 시험관 내에서 자극된 분열 대 자극되지 않은 비-분열 PBMC에 대한 항-CD45 ADC 세포 사멸 활성의 분석
실시예 1에 설명된 항-CD45 항체(Ab2)를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 성장 자극 및 비-자극 일차 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사멸시키는 이의 능력에 대해 평가하였다. 이러한 연구를 위해, 변형된 Fc 영역(D265C LALA H435A)을 갖는 Ab2를 아마톡신 2(AM2)에 컨쥬게이션시켜 Ab2-AM2를 형성시켰다.
냉동보존된 인간 PBMC를 해동하고 2개로 분할하였다. 세포의 절반을 2:1의 세포 대 비드 비율의 CD3 CD28 Dyna 비드로 자극하였고, 세포의 나머지 절반을 자극하지 않았다. 둘 모두의 세포를 5000 세포/웰로 384 웰 플레이트에 플레이팅하고, 4일 동안 ADC로 처리한 후, 세포 생존율을 Cell Titer-Glo로 측정하였다.
도 7에 설명된 결과는 아마톡신 2 페이로드를 갖는 항 CD45-ADC가 시험관 내에서 인간 PBMC를 발현하는 비-자극(비-분열) 및 자극(분열) CD45 둘 모두를 사멸시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 하기 표 9는 이러한 세포 사멸 검정에서 획득된 EC50 값을 정량화하는 추가 데이터를 제공한다.
표 9. 시험관 내 HSC PBMC 사멸 검정(자극 대 비-자극) - IC50 값
Figure pct00131
실시예 10. 시험관 내 1차 단핵구-유래 대식세포 검정을 사용한 항-CD45 ADC의 분석
실시예 1에 설명된 항-CD45 항체(Ab6)를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 일차 단핵구-유래 대식세포의 시험관 내 사멸에 대해 평가하였다. 이러한 연구를 위해, 변형된 Fc 영역(D265C LALA H435A)을 갖는 Ab6를 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션시켜 Ab6-AM1을 형성시켰다.
인간 PBMC를 7일 동안 재조합 M-CSF를 사용하여 플레이팅하고 분화시켰다. 이후, 이들 세포를 리프팅시키고, 대식세포 마커에 대해 평가하고, 세포 사멸 검정을 위해 5x10^3 세포/웰로 384 편평 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 6일 동안 Ab6-AM1의 10포인트 희석으로 처리하고, 그 후 Cell Titer Glo를 사용하여 이들의 생존력을 평가하였다.
도 8에 제시된 바와 같이, 인간 단핵구 유래 대식세포는 Ab6-AM1에 의한 사멸에 민감하였다.
실시예 11. 시험관 내 세포 사멸 검정을 사용한 항-CD45 항체 컨쥬게이트 혈청 안정성의 분석
실시예 1 및 2에 설명된 항-CD45 항체(Ab5)를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 혈청에서의 안정성에 대해 평가하였다. 이러한 연구를 위해, Ab5를 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션시켜 ADC를 형성시켰다.
ADC를 0 또는 72시간 동안 37℃에서 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 사전-인큐베이션하였다. 혈청에서 인큐베이션 후, ADC를 적정하고 성장 배양 배지에서 REH 세포에 첨가하였다. 세포를 7일 동안 인큐베이션하고, 세포 생존력을 Cell-Titer-Glo에 의해 평가하였다.
도 9에 제시된 바와 같이, Ab5-AM1은 0시간과 비교하여 인간 또는 시노몰구스 혈청에서 72시간 인큐베이션 후 유사한 사멸을 나타내었고, 이는 ADC가 인간 및 시노몰구스 혈청에서 안정하다는 것을 나타낸다.
실시예 12. 인간화된 NSG 마우스에서 짧은 반감기 항-CD45 ADC를 사용한 생체 내 조혈 줄기 세포(HSC) 및 면역 세포 고갈 검정
실시예 1 및 2에서 확인된 선택된 항-CD45 항체(Ab2, Ab3, Ab5 및 Ab7)의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 인간화된 NSG 마우스(Jackson Laboratories)에서 생체 내 HSC 및 면역 세포 고갈에 대해 평가하였다. 이러한 연구에서, Fc 영역에서 변형(즉, D265C LALA H435A 아미노산 치환)을 갖는 Ab2, Ab3, Ab5 및 Ab7을 각각 2개의 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)) 중 하나에 컨쥬게이션시켜 ADC(Ab2-AM2, Ab3-AM2, Ab5-AM1, Ab7-AM1)를 형성시켰다. Fc 영역에서 H435A 아미노산 치환을 도입하여 각각의 항체의 반감기를 감소시켰다.
Ab5-AM1 및 Ab7-AM1을 인간화 마우스 모델에 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg의 단일 주사로서 투여하였다. Ab2-AM2(DAR 1.8) 및 Ab3-AM2(DAR 2.0)를 인간화 마우스 모델에 1 mg/kg, 2 mg/kg 또는 3 mg/kg의 단일 주사로서 투여하였다. 골수를 14일에 수집하였고, CD34+ 세포의 절대수를 흐름세포측정법에 의해 결정하였다. 혈액을 또한 7일 및 14일에 수집하였고, 흐름세포측정법에 의해 조사하였다.
기준선에 비해 처리된 또는 대조군 처리된 마우스의 인간 CD3+ T-세포, CD19+ B-세포 및 CD33+ 골수 세포의 백분율이 도 10a에 제시되어 있다. Ab2-AM2 및 Ab3-AM2로 처리된 인간화된 NSG 마우스는 치료 요법의 단일 투여 후 기준선에 비해 인간 CD3+ T-세포, CD19+ B-세포 및 CD33+ 골수 세포의 유의한 고갈을 나타내었다(도 10a). 이들 결과는 Ab2-AM2 및 Ab3-AM2가 면역 세포(골수성, T 세포 및 B 세포)를 고갈시켰음을 나타낸다.
또한, 도 10b-10e에 제시된 바와 같이, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg의 ADC Ab2-AM2, Ab3-AM2, Ab5-AM1 또는 Ab7-AM1의 단일 주사로 처리된 인간화된 NSG 마우스는 대조군과 비교하는 경우 ADC의 단일 투여 후 14일에 말초 혈액 및 골수에서 인간 HSC를 포함하는 표적 인간 CD45 세포의 유의한 고갈을 나타내었다.
이들 결과는 선택된 짧은 반감기 항-CD45 ADC가 용량 의존적 방식으로 말초 및 골수에서 표적 인간 세포를 효율적으로 고갈시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 짧은 반감기 항-CD45-아마톡신 항체 약물 컨쥬게이트는 생체 내에서 비-인간 영량쥬 HSC 및 면역 세포를 효과적으로 고갈시킨다.
실시예 1 및 2에서 설명된 선택된 항-CD45 항체(Ab4, Ab5 및 Ab7)의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 비-인간 영장류(NHP)에서 생체 내 HSC 및 면역 세포 고갈에 대해 평가하였다. 이러한 연구에서, Fc 영역에서 변형(즉, Fc 영역에서 D265C LALA H435A 아미노산 치환)을 갖는 Ab4, Ab5 및 Ab7을 아마톡신 1(AM1)에 컨쥬게이션시켜 ADC(Ab4-AM1, Ab5-AM1, Ab7-AM1)를 형성시켰다. Fc 영역의 변형은 각각의 항체의 반감기를 감소시키기 위해 도입되었다.
NHP HSC 및 면역 고갈을 단일 상승 용량(3/그룹)으로 수컷 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 골수에서의 HSC 함량, 및 말초 혈액 및 골수에서의 면역 고갈을 흐름세포측정법에 의해 모니터링하였다.
도 11a에 제시된 바와 같이, 항-CD45 ADC(0.5 mg/kg 또는 2 mg/kg의 Ab5-AM1 및 Ab7-AM1)를 투여한 후 72시간에 말초 혈액에서 림프구에서의 표적 상 용량 의존적 감소(≥90% 고갈)가 관찰되었다. 또한, 항-CD45 ADC(1 mg/kg의 Ab4-AM1 및 0.5 및 2 mg/kg의 Ab5-AM1; 도 11b)를 투여한 후 7일째에 골수에서 WBC, HSC 및 림프구에서의 표적 상 용량 의존적 감소가 관찰되었다.
이들 결과는 짧은 반감기 항-CD45 ADCs Ab4-AM1, Ab5-AM1 및 Ab7-AM1이 생체 내에서 NHP HSC 및 면역 세포의 강력한 제거를 나타냄을 나타낸다.
실시예 14: NHP에서 짧은 반감기 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트의 약동학 분석 및 혈청 안정성
실시예 1에 설명된 항-CD45 항체(Ab4)를 포함하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)의 약동학을 비-인간 영장류에서 평가하였다. 본 연구에서, Fc 영역에서 변형(즉, Fc 영역에서 D265C LALA H435A 아미노산 치환)을 갖는 Ab4를 2개의 아마톡신(아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2)) 중 하나에 컨쥬게이션시켜 ADC(Ab4-AM1, Ab4-AM2)를 형성시켰다. Fc 영역에 대한 변형을 항체의 반감기를 감소시키기 위해 도입시켰다.
수컷 시노몰구스 원숭이에서 혈장 약물 농도를 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 적합화시켰다. 간단히 말해서, 플레이트를 항-인간 IgG 포획 항체로 코팅하였다. 샘플 및 표준 물질(ADC)을 희석액에서 검정의 동적 범위 내에서 희석시키고, 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 항-IgG-HRP(총 항체를 계산하기 위함) 또는 항-아마톡신-HRP(ADC를 계산하기 위함)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, HRP 기질 TMB를 첨가한 후 정지 용액을 첨가하였다. 색의 강도는 결합된 IgG(총 항체를 계산하기 위함) 또는 IgG/아마톡신(ADC를 계산하기 위함)의 양에 직접 비례하였다.
도 12에 제시된 바와 같이, 항-아마톡신 검출-기반 PK와 항-IgG 검출-기반 PK의 오버레이는 ADC가 혈청 안정적임을 나타내었다. 약동학 분석의 결과는 표 10에 추가로 요약되어 있다. 항-CD45 ADC는 3.2-7.4 h의 반감기로 신속하게 제거되었으며, 이는 ADC가 생체 내에서 짧은 반감기를 가졌음을 나타낸다.
표 10. PK 요약
Figure pct00132
실시예 15. 인간화된 항-CD45 모노클로날 항체의 제조
인간 CD45(특히 인간 CD45 RO의 세포 외 영역)를 사용하여 래트를 면역화하여 항-인간 CD45 항체를 획득하였다. 인간 CD45RO, 인간 전장 CD45(RABC), 시노몰구스 RABC 및 마우스 CD45 RABC를 발현하는 세포주를 생성하고, CD45에 대한 216개의 항체 클론의 결합을 흐름세포측정법을 사용하여 평가하였다.
교차 반응성 mAb를 확인하기 위해 Octet 생물층 간섭계(BLI) 결합 실험을 수행하였다. 인간 CD45RO 및 CD45RABC뿐만 아니라 비-인간 영장류(시노몰구스) CD45RABC에 결합하는 항체의 능력에 기초하여 클론을 선택하였다. 3개의 클론(모 클론 A, 모 클론 B 및 모 클론 C)은 인간 및 비-인간 영장류 CD45 RABC에 대해 우수한 교차-반응성을 갖는 것으로 확인되었다. 모 클론 A, B 및 C의 서열은 국제 공개 번호 WO 2020/092654 A1호(예를 들어, WO 2020/092654 A1호의 SEQ ID NOs: 1-30 참조)에 설명되어 있으며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
3개의 선택된 교차-반응성 mAb 각각에 대해 인간화 및 친화성 성숙을 사용하였다. 모 클론 A로부터의 13개의 인간화 클론, 모 클론 B로부터의 11개의 인간화 클론 및 모 클론 C로부터의 5개의 인간화 클론을 획득하였다.
모 클론 A, B 및 C로부터의 인간화 및 친화성 성숙된 클론을 또한 다중특이적 시약(PSR) 결합 검정을 사용하여 막 및 세포질 단백질의 혼합물에 대한 비-특이적 결합에 대해 시험하였고, 여기서 각각의 항체에 대한 비오틴화된 세포 용해질의 비-특이적 결합을 평가하였다. 결과는 도 13에 설명되어 있다. 도 13에 제시된 바와 같이, 모 클론 A의 인간화 및 친화성 성숙된 변이체는 낮은 수준의 비-특이적 결합을 가졌다(낮은 PSR 스코어로부터 명백함). 모 클론 B 및 C의 인간화 변이체는 일반적으로 더 높은 수준의 비-특이적 결합을 가졌다. 그러나, 친화성 성숙 후, 클론 A의 변이체로 관찰된 수준과 유사한 비-특이적 결합의 현저하게 감소된 수준을 갖는 변이체를 선택하였다(도 13).
인간화 및 친화성 성숙된 클론을 후속적으로 IgG1 항체로서 발현시키고, 인간 CD45 세포에 대한 결합 및 활성에 대해 시험하였다. 인간 CD45 RABC, 시노몰구스(cyno) CD45 RABC 및 레서스 CD45RABC에 대한 AbA, AbB 및 AbC의 1가 결합 정도를 BLI에 의해 평가하였고, 인간 및 시노몰구스 PBMC에 대한 결합을 흐름세포측정법에 의해 확인하였다.
이러한 스크리닝 공정으로부터, 인간 및 시노몰구스 CD45와의 교차-반응성 및 낮은 비-특이적 결합을 포함하는 원하는 특징에 기초하여 3개의 인간화 IgG1 항체를 선택하였다. 이들 항체는 AbA(모 클론 A의 인간화 및 친화성 성숙 변이체), AbB(모 클론 B의 친화성 성숙 변이체) 및 AbC(모 클론 C의 친화성 성숙 변이체)를 포함한다. 3개의 선택된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 CDR 영역의 아미노산 서열이 표 27에 제공된다.
실시예 16. 항-CD45 항체의 시험관 내 결합 분석
실시예 15에 설명된 인간화 및 친화성 성숙된 항-CD45 항체(AbA, AbB 및 AbC)를 연구하여 인간 CD45에 대한 결합 특징 및 시노몰구스(cyno) CD45와 교차 반응하는 능력을 결정하였다. 인간 CD45 RABC 및 시노몰구스 CD45 RABC에 대한 1가 결합 정도에 대해 인간화된 클론을 평가하기 위해, 각각의 AbA, AbB 및 AbC, 및 각각의 모 클론 A, B 및 C를 OCTET 생물층 간섭계(BLI)에 의해 평가하였다.
간단히 말해서, 항체 결합 연구를 생물층 간섭법(BLI)을 사용하여 PALL FORTEBIO OCTET RED96으로 0.1% w/v 소 혈청 알부민이 보충된 1x PBS에서 25℃에서 수행하였다. 각각의 정제된 항체를 항-인간 Fc 바이오센서(AHQ; PALL FORTEBIO 18-5001)에 고정시키고, 100 nM의 정제된 인간 또는 300 nM의 시노몰구스 CD45 엑토도메인과 함께 인큐베이션하였다.
겉보기 1가 친화성(KD), 겉보기 결합 속도(KON) 및 겉보기 해리 속도(KDIS 또는 KOFF)를 FORTEBIO 데이터 분석 소프트웨어 버전 10에 의해 계산된 바와 같이 1:1 결합 모델을 사용한 국소 완전 적합화에 의해 결정하였다. 정제된 인간 또는 시노몰구스 CD45 엑토도메인에 대한 각각의 항체에 대한 KD, KON 및 KDIS는 표 11에 제시되어 있다. 표 11에 설명된 바와 같이, 인간화 클론 AbA 및 AbB의 결합 친화성은 각각의 모 클론 A 및 B의 결합 친화성과 유사한 반면, 인간화된 클론 AbC는 모 클론 C에 비해 4배 초과의 개선된 친화성을 나타내었다. 선택된 인간화 항체 AbA, AbB 및 AbC 각각은 인간 및 시노몰구스 CD45와 교차 반응할 수 있었다. 또한, 인간화 및 친화성 성숙된 항체 AbB는 유의하게 개선된 다중특이적 결합 스코어를 가졌으며(도 13), 이는 AbB가 모 클론 B에 비해 비-특이적 항원에 대한 유의하게 낮은 결합을 갖는 것을 나타낸다.
표 11. 인간 또는 시노몰구스 CD45 엑토도메인에 대한 표시된 IgG의 KD, KON 및 KDIS
Figure pct00133
실시예 17. 항-CD45 항체의 시험관 내 PBMC 세포 결합 활성
실시예 15에 설명된 인간화 및 친화성 성숙된 항-CD45 항체(AbA, AbB, AbC)를 CD45-발현 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. 이를 위해, 세포 배양 배지에서 일차 인간 또는 시노몰구스(cyno) 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 37℃에서 밤새 적정 용량의 항-CD45 항체와 함께 인큐베이션하였다. 간단히 말해서, 항-CD45 항체의 4개 농도 지점이 사용되었고, 가장 높은 농도는 로그 단계 용량 반응 곡선을 확립하기 위해 4배 아래로 적정된 6.25 nM이었다. 결합된 항-CD45 항체를 흐름세포측정법을 사용하여 형광 표지된 AF488 항-인간 IgG 이차 항체로 검출하였다. IC50을 GRAPHPAD PRISM을 사용하여 데이터를 적합화시킴으로써 결정하였다. 동형 IgG를 대조군으로 사용하였다.
상기 방법을 사용하여, 인간화 클론 AbA, AbB 및 AbC의 PBMC 결합 활성을 결정하였다. 결과는 도 14 및 표 12에 설명되어 있다. 도 14에 설명된 바와 같이, 동형 대조군과 비교하여, 인간화된 클론 AbA, AbB 및 AbC는 인간 PBMC 및 시노몰구스 PBMC 둘 모두에 대해 강한 결합을 나타내었다. 또한, 도 14 및 표 12에 설명된 바와 같이, AbA, AbB 및 AbC는 각각의 세포 유형에 걸쳐 낮은 nM EC50에서 CD45에 결합하였고, 따라서 살아 있는 세포에서 인간 및 시노몰구스 CD45에 대한 교차 반응성 결합을 입증한다. 그러나, 시노몰구스 PBMC에 비해 인간에서 전반적으로 더 높은 결합 신호가 관찰되었다.
표 12. 인간 또는 시노몰구스 PBMC에 대한 인간화된 클론의 결합
Figure pct00134
다음으로, 상기 방법을 사용하여, 인간 및 시노몰구스 PBMC에 대한 인간화된 클론 AbA, AbB 및 AbC의 결합을 각각의 모 클론 A, B 및 C의 결합과 비교하였다. 표 13에 제시된 바와 같이, 인간 및 시노몰구스 PBMC에 대한 인간화 클론 AbA 및 AbB의 결합은 각각의 모 클론 A 및 B의 결합과 유사했지만, 인간화 클론 AbC는 모 클론 C에 비해 결합에서 개선을 나타내었다.
표 13. 인간 또는 시노몰구스 PBMC에 대한 인간화된 클론 및 모 키메라의 결합
Figure pct00135
다음으로, 상기 방법을 사용하여, 인간화 클론 AbA(즉, AbA_D265C_LALA_H435A), AbB(즉, AbB_D265C_LALA_H435A) 및 AbC(즉, AbC_D265C_LALA_H435A)의 Fc 변이체의 PBMC 결합 활성을 결정하였다. 이들 항체는 Fc 치환 D265C, L234A/L235A("LALA") 및 H435A를 함유한다. 결과는 표 14에 제시되어 있다. 동형 대조군과 비교하여, 인간화 클론의 Fc 변이체는 인간 PBMC 및 시노몰구스 PBMC에 대한 강한 결합을 나타내었다. 또한, 표 14에 제시된 바와 같이, 인간화된 클론의 Fc 변이체는 각각의 세포 유형에 걸쳐 낮은 nM EC50에서 CD45에 결합하였고, 따라서 살아 있는 세포에서 인간 및 시노몰구스 CD45에 대한 교차 반응성 결합을 입증한다. 그러나, 시노몰구스 PBMC에 비해 인간에서 전반적으로 더 높은 결합 신호가 관찰되었다. 따라서, 표 14에 설명된 결과는 D265C, L234A/L235A(LALA) 및 H435A 변형이 인간화 클론의 PBMC 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
표 14. 인간 또는 시노몰구스 PBMC에 대한 인간화된 클론의 Fc 변이체의 결합
Figure pct00136
실시예 18. AbA의 에피토프 맵핑
AbA에 의해 결합된 에피토프는 가교 질량 분광법을 사용하여 맵핑되었다. 가교 실험은 고-질량 MALDI 질량분광법에 의한 비-공유 상호작용의 직접적인 분석을 가능하게 한다. 비-공유 상호작용을 포함하는 단백질 샘플을 특별히 개발된 가교 혼합물(Bich et al., Anal Chem 82:172-179 (2010))과 혼합함으로써, 상기 실시예 5에 설명된 바와 같이 높은 민감성을 갖는 비-공유 복합체를 특이적으로 검출하는 것이 가능하다.
고분해능으로 AbA의 에피토프를 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화된 가교제와 함께 인큐베이션하고 다중 효소 절단에 적용시켰다. 단백질 복합체는 인간 CD45에 결합된 AbA 변이체 항체(AbA와 동일한 에피토프를 가짐)였다. 가교된 펩티드의 농축 후, 샘플을 고 분해능 질량분광법(nLC-LTQ-Orbitrap MS)으로 분석하였고, 생성된 데이터를 XQUEST 및 STAVROX 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
중수소화 d0d12를 갖는 단백질 복합체 CD45/AbA의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제 및 써몰리신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 AbA 에피토프가 펩티드 RNGPHERYHLEVEAGNT(SEQ ID NO:118) 내의 잔기를 포함하고, 특히 SEQ ID NO:113(NP_002829.3에 해당하는 CD45 아이소형의 단편)의 486R, 493Y 및 502T에 상응하는 인간 CD45 상의 아미노산과 상호작용하는 것을 나타내었다. 이들 결과는 도 15에 예시되어 있다. 도 15는 AbA의 에피토프, 특히 영역 RNGPHERYHLEVEAGNT(SEQ ID NO:118)를 함유하는 아미노산 단편을 설명한다.
본 결과에 기초하여, AbA는 대안적으로 스플라이싱된 CD45 아이소형(예를 들어, RO, RA, RB, RC, RABC 등) 사이에 보존된 CD45의 피브로넥틴 d4 도메인과 상호작용한다. AbA 에피토프의 잔기 493Y 및 502T는 AbA의 종간 반응성과 일치하는 인간, 시노몰구스 및 레서스 CD45에 걸쳐 보존된다.
실시예 19. AbA Fc 변이체(AbA_D265C_LALA_H435A) ADC의 내재화
AbA의 Fc 변이체("AbA_D265C_LALA_H435A")를 아마톡신(AM1)에 컨쥬게이션시켜 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)("AbA_D265C_LALA_H435A-AM1")를 형성시켰다. AbA_D265C_LALA_H435A-AM1의 내재화 능력을 시험관 내 항체 내재화 검정에서 평가하였다.
이러한 검정을 위해, 항-CD45 ADC를 pHAb 염료에 컨쥬게이션시켰다. 내재화시, 컨쥬게이션된 항체/ADC는 산성 엔도좀/리소좀으로 이동하며, 여기서 pHAb 염료는 상기 설명된 바와 같이 PE 채널에서 흐름세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, AbA_D265C_LALA_H435A 아마톡신 ADC의 내재화를 인간 CD34+ 골수 세포를 사용하여 시험관 내에서 평가하였다.
0, 2, 24, 48 또는 72시간 동안 ADC의 포화 농도로 2시간 동안 얼음 상에서 CD34+ 인간 골수 세포를 인큐베이션하였다. pHAb의 수준(gMFI에 의해 측정됨)을 시간 경과에 따라 평가하였다. 시간 경과의 끝에서, 형광단 표지된 항-IgG 분자를 사용하여 흐름세포측정법에 의해 결합된 표면 인간 IgG1(hIgG1)을 평가하였다. 인간 CD34+ 세포에 결합하지 않는 아마톡신 1에 컨쥬게이션된 동형 IgG(동형-AM1)를 비-내재화 대조군으로 포함시켰다. 0h 시점이 CD45의 포화된 결합을 나타내기 때문에, 각각의 시점에서 결합된 표면 IgG의 기하 평균 형광 강도(gMFI)를 0시간에 동일한 ADC의 gMFI와 비교함으로써 내재화된 ADC 백분율을 계산하였다. 결과는 도 16에 설명되어 있다.
도 16에 제시된 바와 같이, 세포에서 검출된 pHAb의 수준은 시간이 지남에 따라 증가하였고(도 16, 좌측 패널), 이는 시간이 지남에 따라 ADC 내재화 백분율의 증가에 상응하였다(도 16, 우측 패널). AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 ADC의 내재화 백분율은 동형-AM1의 내재화 백분율에 비해 현저히 높았는데, 이는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1이 인간 CD34+ 골수 세포에 의해 내재화되었지만, 동형 대조군은 내재화되지 않았음을 나타낸다.
실시예 20. 시험관 내 세포주 사멸 검정을 사용한 CD45 ADC의 분석
AbA의 Fc 변이체(예를 들어, AbA_D265C_LALA_H435A, AbA_D265C_LALA_IHH 및 AbA_S239C_LALA_IHH)를 피롤로벤조디아제핀(PBD) 또는 2개의 아마톡신, 즉, 아마톡신 1(AM1) 또는 아마톡신 2(AM2) 중 하나에 컨쥬게이션시켜 AbA_D265C_LALA_IHH-PBD, AbA_S239C_LALA_IHH-PBD, AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 또는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2의 ADC를 형성시켰다. 다음 실시예는 시험관 내에서 CD45-양성 암 세포주, 예를 들어, SKNO-1(급성 골수성 백혈병 세포주 JCRB1170), Jurkat(급성 T 세포 백혈병 세포주, ATCC No. TIB-152) 및 REH-1(B 세포 비-호지킨 림프종 세포주, ATCC 번호 CRL-3004)를 사멸시키는 이들 ADC의 능력을 시험하기 위한 시험관 내 세포 사멸 검정을 설명한다.
SKNO-1, Jurkat 및 REH-1 세포주를 사용한 시험관 내 사멸 검정의 경우, 세포를 ATCC 지침에 따라 성장시켰다. 보다 구체적으로, 세포를 CD45 ADC(예를 들어, AbA_D265C_LALA_IHH-PBD, AbA_S239C_LALA_IHH-PBD, AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 또는 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2) 또는 동형 대조군-ADC, 즉, 아마톡신에 컨쥬게이션된 IgG1 동형("동형-AM") 또는 PBD에 컨쥬게이션된 IgG1 동형("동형-PBD")의 존재하에서 7일 동안 배양(10% FBS 및 1% Pen-Strep이 보충된 RPMI-1640 (1X) 배지에서 배양)하였다. 이후, 살아 있는 세포와 관련된 아데노신 트리포스페이트(ATP) 함량을 측정하는 CELL-TITER GLO 검정에 의해 세포 생존력을 측정하였다. 살아 있는 세포의 백분율(y-축)을 항체 농도(x-축)의 함수로서 CELL-TITER GLO(CTG)에 의해 측정하였다. 세포주 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50을 GRAPHPAD PRISM을 사용하여 계산하였다. 결과는 표 15에 설명되어 있다.
표 15에 설명된 바와 같이, 시험된 다양한 항 CD45 ADC 각각은 시험관 내에서 CD45 발현 세포주(즉, SKNO-1, Jurkat 및 REH-1 세포주)를 사멸시키는 데 효과적이었다.
표 15. 시험관 내 세포주 사멸 검정
Figure pct00137
실시예 21. 시험관 내 PBMC 사멸 검정을 사용한 CD45 ADC의 분석
실시예 15에 설명된 인간화된 항-CD45 항체의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 일차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사멸시키는 능력에 대해 평가하였다.
AbA의 Fc 변이체인 AbA_D265C_LALA_H435A를 아마톡신 AM1 또는 AM2에 컨쥬게이션시켜 ADC AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 및 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2를 형성시켰다. 일차 인간 또는 시노몰구스 PBMC를 사멸시키는 이들 ADC의 능력을 시험관 내 PBMC 사멸 검정에 의해 평가하였다. PBMC는 림프구(T 세포, B 세포, 자연 살해 세포) 및 단핵구의 이종성 세포 집단으로 구성된 CD45 발현 세포이다. 인간 또는 시노몰구스 PBMC를 사용하는 시험관 내 사멸 검정의 경우, PBMC를 CD45 ADC, 또는 동형 대조군-ADC, 즉, AM1에 컨쥬게이션된 IgG1 동형("동형-AM1") 또는 AM2에 컨쥬게이션된 IgG1 동형("동형-AM2")의 항체의 존재하에서 7일 동안 10% 소 태아 혈청을 갖는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 이후, 세포 생존력을 CELL-TITER GLO(CTG) 검정에 의해 측정하였다. PBMC 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50을 GRAPHPAD PRISM을 사용하여 계산하였다. 결과는 도 17a-17b, 표 16 및 표 17에 설명되어 있다.
도 17a-17b, 표 16 및 표 17에 설명된 바와 같이, AM1-컨쥬게이션된 또는 AM2-컨쥬게이션된 항 CD45 ADC 각각은 시험관 내에서 인간 및 시노몰구스 PBMC를 사멸시키는 데 효과적이었다. 하기 표 16 및 17은 세포 사멸 검정의 정량화에 관한 추가 데이터를 제공한다. 도 17a-17b, 표 16 및 표 17로부터 명백한 바와 같이, 인간 및 시노몰구스 PBMC는 AM1-컨쥬게이션된 CD45 ADC 및 AM2-컨쥬게이션된 CD45 ADC에 동일하게 민감하였다.
표 16. 시험관 내 PBMC 사멸 검정: AM1에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00138
표 17. 시험관 내 PBMC 사멸 검정: AM2에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00139
또한, AbA의 Fc 변이체를 PBD에 컨쥬게이션시키고(AbA_D265C_LALA_IHH-PBD), AbC의 Fc 변이체를 AM1에 컨쥬게이션시켰다(AbC_D265C_LALA_ H435A-AM1). 일차 인간 PBMC 및 REH 세포주를 사멸시키는 이전 단락에 설명된 ADC(AbA_D265C_LALA_H435A-AM1 및 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2)와 함께 이들 ADC의 능력을 평가하였다. 결과는 하기 표 18에 제공된다.
표 18에 설명된 바와 같이, PBD-컨쥬게이션된 ADC는 REH 세포에 대해 더 높은 효능을 나타낸 반면, AM1-컨쥬게이션된 또는 AM2-컨쥬게이션된 ADC는 PBMC에 대해 더 높은 효능을 나타내었다.
표 18. 시험관 내 세포 사멸 검정: AM1, AM2 또는 PBD에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00140
다음으로, 실시예 15에 설명된 인간화 항-CD45 항체의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 성장 자극 및 비자극 일차 인간 PBMC를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다. 냉동보존된 인간 PBMC를 해동하고 2개로 분할하였다. 세포의 절반을 2:1의 세포 대 비드 비율의 CD3 CD28 DYNA BEADS로 자극하였고, 세포의 나머지 절반을 자극하지 않은 채로 두었다. 자극된 세포 및 자극되지 않은 세포 둘 모두를 5000 세포/웰의 농도로 384 웰 플레이트에 플레이팅하고, 4일 동안 다양한 농도에서 CD45 ADC(AbA_D265C_LALA_H435A-AM2) 또는 동형 대조군 ADC(동형-AM2)로 처리하였고, 그 후 세포 생존력을 CELL TITER-GLO(CTG) 검정으로 측정하였다. 세포 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50을 GRAPHPAD PRISM을 사용하여 계산하였다. 대표적 결과는 표 19에 설명되어 있다.
표 19에 설명된 바와 같이, AbA_D265C_LALA_H435A-AM2는 시험관 내에서 인간 PBMC를 발현하는 자극되지 않은(비-분열) 및 자극(분열) CD45 둘 모두를 사멸시키는 데 효과적이었다.
표 19. 시험관 내 PBMC 사멸 검정: AM1, PBD 또는 IGN에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00141
실시예 22. 시험관 내 HSC 사멸 검정을 사용한 CD45 ADC의 분석
다음으로, 실시예 15에 설명된 선택된 항-CD45 인간 IgG 항체의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 인간 조혈 줄기 세포(HSC)를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다.
AbA의 Fc 변이체를 AM1, AM2 또는 PBD에 컨쥬게이션시켜 ADC AbA_D265C_LALA_H435A-AM1, AbA_D265C_LALA_H435A-AM2 및 AbA_D265C_LALA_IHH-PBD를 각각 형성시켰다. 인간 골수(BM) HSC를 사멸시키는 이들 ADC의 능력을 평가하였다. 상기 ADC 중 하나의 존재하에서 또는 AM1(동형-AM1), AM2("동형-AM2") 또는 PBD("동형-PBD")에 커플링된 동형 대조군 항체를 함유하는 동형 대조군 ADC의 존재하에서 5일 동안 SCF, IL-6, FLT3 및 TPO를 갖는 SFEM 배지에서 CD34+ 인간 BM 세포를 배양하였다. CD34+CD90+ 인간 BM HSC의 생존력을 7-AAD에 의해 측정하였다. 세포 사멸 검정 후, 세포독성 수준을 정량화하고, IC50 값을 GRAPHPAD PRISM을 사용하여 계산하였다. 결과는 도 18에 설명되어 있으며, 이는 AM1, AM2 또는 PBD에 컨쥬게이션된 AbA ADC에 의해 인간 CD34+CD90+ BM HSC의 사멸을 나타내는 대표적인 결과를 제공한다. IC50 값은 표 20 및 표 21에 제공된다.
이들 결과는 AbA ADC가 인간 골수 HSC를 효과적으로 사멸시킨다는 것을 확인한다.
표 20. 시험관 내 BM HSC 사멸 검정: AM1 또는 PBD에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00142
표 21. 시험관 내 BM HSC 사멸 검정: AM2에 컨쥬게이션된 ADC
Figure pct00143
실시예 23. 시험관 내 1차 단핵구-유래 대식세포(MDM) 검정을 사용한 CD45 ADC의 분석
다음으로, AM1에 컨쥬게이션된 Fc 변이체(AbA_D265C_LALA_H435A-AM1)를 함유하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)를 시험관 내에서 인간 단핵구 유래 대식세포(MDM)를 사멸시키는 능력에 대해 시험하였다. 간단히 말해서, 인간 PBMC를 7일 동안 재조합 M-CSF를 사용하여 플레이팅하고 분화시켰다. 이후, 이들 세포를 리프팅시키고, 대식세포 마커에 대해 평가하고, C100 사멸 검정을 위해 5x103 세포/웰의 농도로 384-웰 편평 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 이후, 세포를 7일 동안 CD45 ADC(즉, AbA_D265C_LALA_H435A-AM1) 또는 동형 대조군-ADC, 즉, 아마톡신 1에 컨쥬게이션된 IgG1 동형("동형-AM1")의 10포인트 희석으로 처리하였고, 그 후 이들의 생존력을 CELL TITER GLO (CTG) 검정을 사용하여 평가하였다. 결과는 도 19에 설명되어 있다.
도 19에 설명된 바와 같이, 인간 MDM은 AbA_D265C_LALA_H435A-AM1에 의한 사멸에 민감하였다.
실시예 24. 인간화 NSG 마우스 모델에서 항-CD45-PBD ADC의 생체 내 효능
PBD 세포독소(테시린)에 컨쥬게이션된 인간 CD45에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(AbA)를 포함하는 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 본 실시예("CD45-PBD")에서 평가하였다. ADC의 항-CD45 항체는 Fc 영역에 아미노산 치환 L234A L235A D265C 및 H435A를 포함하였다.
CD45-PBD는 인간화된 NSG 마우스에서 말초 혈액 림프구, 골수(BM) HSC 또는 성숙 단일 양성(SP) 흉선세포를 고갈시키는 능력에 대해 평가하였다(도 20). hNSG 마우스에게 비히클(PBS), PBD에 컨쥬게이션된 동형 대조군 항체("Iso-PBD") 또는 CD45-PBD의 지시된 단일 용량을 투여하였다. CD45-PBD를 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ADC의 단일 용량으로 마우스에 투여하였다. Iso-PBD를 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ADC의 단일 용량으로 마우스에 투여하였다.
0일, 7일 및 14일에 말초 혈액을 수집하고, 총 인간 조혈 세포 함량(hβ2M+), 골수 세포 함량(CD33+), B 세포 함량(CD19+) 및 T 세포 함량(CD3+)에 대해 평가하였다. 말초 혈액 연구로부터의 결과는 도 20에 제시되어 있다. 이들 결과는 인간 세포의 용량 의존적 고갈이 CD45-PBD의 허용 용량에서 말초 혈액에서 달성되었음을 나타낸다. 3 mg/kg 이상의 CD45-PBD 용량은 용인되지 않았다.
골수 고갈을 평가하기 위해, 골수 샘플을 치료 후 14일에 마우스로부터 수집하고, 인간 전구 세포/HSC 함량에 대해 평가하였다. 골수 연구로부터의 결과는 도 21에 설명되어 있고, 인간 세포의 백분율("백분율") 또는 대퇴골 당 세포의 절대 수("수")로 제시된다. 이들 결과는 CD45-PBD가 CD45-PBD 처리 후 골수에서 인간 전구 세포 및 HSC의 표적화되고, 용량 의존적이며, 깊은 고갈을 매개함을 나타내었다. 동형-PBD는 3 mg/kg 및 6 mg/kg의 증가된 용량에서 골수에서 유의한 플랫폼 독성을 가졌다.
다음으로, CD45-PBD에 의한 이중 양성(DP) 흉선세포 및 성숙 단일 양성(SP) 흉선세포의 고갈을 평가하였다. hNSG 마우스를 무작위화하고, 증가하는 용량의 동형-PBD, CD45-PBD 또는 비히클(PBS)로 처리하였다. 흉선세포 고갈 연구의 결과는 도 22에 제시되어 있다. 인간 CD45+ 세포 및 인간 이중 양성(DP) 흉선세포의 용량 의존적 고갈이 CD45-PBD로 처리된 동물에서 관찰되었다. 성숙한 CD4 및 CD8 SP 흉선세포의 불완전한 표적화된 고갈이 CD45-PBD의 허용 용량에서 관찰되었다. 상승된 용량의 동형-PBD에서 관찰된 이중 양성(DP) 흉선세포의 고갈은 PBD의 공지된 플랫폼 독성과 일치한다.
실시예 25: 인간화 NSG 마우스 모델에서 항-CD45-IGN ADC의 생체 내 효능
IGN 세포독소(DGN549)에 컨쥬게이션된 인간 CD45에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(AbA)를 포함하는 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 본 실시예("CD45-IGN")에서 평가하였다. ADC의 항-CD45 항체는 Fc 영역에 아미노산 치환 L234A L235A D265C 및 H435A를 포함하였다.
hNSG 마우스에게 비히클(PBS), IGN에 컨쥬게이션된 동형 대조군 항체("Iso-IGN") 또는 CD45-IGN의 단일 용량을 투여하였다. CD45-IGN을 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ADC의 단일 용량으로 마우스에 투여하였다. Iso-IGN을 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 6 mg/kg ADC의 단일 용량으로 마우스에 투여하였다.
0일, 7일 및 14일에 말초 혈액을 수집하고, 총 인간 조혈 세포 함량(hβ2M+), 골수 세포 함량(CD33+), B 세포 함량(CD19+) 및 T 세포 함량(CD3+)에 대해 평가하였다. 말초 혈액 연구로부터의 결과는 도 23에 제시되어 있다. 이들 결과는 인간 세포의 용량 의존적 고갈이 단일 용량의 CD45-IGN의 투여 후 말초 혈액에서 달성되었음을 나타낸다. CD45-IGN은 모든 시험 용량에서 잘 용인되었다.
골수 고갈은 치료 후 14일에 마우스로부터 골수 샘플의 수집에 의해 평가하였다. 샘플을 인간 전구 세포/HSC 함량에 대해 평가하였다. 골수 연구로부터의 결과는 도 24에 설명되어 있고, 인간 세포의 백분율("백분율") 또는 대퇴골 당 세포의 절대 수("수")로 제시된다. 이들 결과는 CD45-IGN이 CD45-IGN 처리 후 골수에서 인간 전구 세포 및 HSC의 표적화되고, 용량 의존적이며, 깊은 고갈을 매개함을 나타내었다. 동형-IGN은 어떠한 시험 용량에서도 유의한 영향을 미치지 않았다.
CD45-IGN에 의한 이중 양성(DP) 흉선세포 및 성숙 단일 양성(SP) 흉선세포의 고갈을 또한 평가하였다. hNSG 마우스를 무작위화하고, 증가하는 용량의 동형-IGN, CD45-IGN 또는 비히클 대조군(PBS)으로 처리하였다. 흉선세포 고갈 연구의 결과는 도 25에 제시되어 있다. 인간 CD45+ 세포 및 인간 이중 양성(DP) 흉선세포의 용량 의존적 고갈이 CD45-IGN으로 처리된 동물에서 관찰되었다. 또한, CD45-IGN을 통한 표적화는 일치된 용량에서 동형-IGN과 비교하여 CD4 및 CD8 SP 흉선세포의 더 깊은 고갈을 발생시켰으며, 이는 CD45-IGN ADC가 인간 흉선세포의 강력하고 표적화된 고갈을 달성함을 입증한다.
실시예 26. CD45 ADC는 생체 내에서 비-인간 영장류(NHP) HSC 및 면역 세포를 고갈시킨다.
인간 CD45에 특이적으로 결합할 수 있는 항체(AbA)를 포함하는 항-CD45 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 생체 내에서 조혈 줄기 세포(HSC) 및 비-인간 영장류(NHP)로부터의 면역 세포를 고갈시키는 능력에 대해 시험하였다. 반감기를 감소시키기 위해 Fc 영역에서 H435A 변형을 함유하는 AbA의 Fc 변이체(AbA_D265C_LALA_H435A)를 아마톡신 AM1 또는 아마톡신 AM2에 컨쥬게이션시켜 CD45 ADC AbA_D265C_LALA_H435A-AM1("CD45 ADC-AM1") 및 AbA_D265C_LALA_H435A-AM2("CD45 ADC-AM2")를 각각 형성시켰다. 이들 CD45 ADC의 HSC 및 면역 세포 고갈 효능을 생체 내에서 NHP에서 시험하였다.
수컷 시노몰구스 원숭이에게 1 mg/kg의 CD45 ADC-AM1, CD45 ADC-AM2 또는 비히클 대조군(PBS)의 단일 주사를 투여하였다. 골수에서 HSC 함량 및 말초 혈액에서 면역 세포 고갈은 표시된 시간에 흐름세포측정법에 의해 모니터링되었다. 연구 전체에 걸쳐 혈액학 및 임상 화학을 평가하였다. 결과는 도 26에 설명되어 있다.
도 26에 설명된 바와 같이, WBC, HSC 및 림프구의 표적 상 고갈은 CD45 ADC로 처리한 후 NHP의 BM에서 관찰되었다. 결론적으로, 항체 반감기를 감소시키기 위해 Fc 영역에서 변형을 갖는 AbA를 함유하는 ADC CD45 ADC-AM1 및 CD45 ADC-AM2는 생체 내에서 NHP HSC 및 면역 세포의 강력한 제거를 나타내었다.
실시예 27. NHP에서 CD45 ADC의 약동학 분석 및 혈청 안정성
항-CD45 항체 AbA를 함유하는 ADC를 시험하여 비-인간 영장류에서 혈청 안정성 및 약동학을 평가하였다. 수컷 시노몰구스 원숭이에서 CD45 ADC-AM1 및 CD45 ADC-AM2(실시예 26에 설명됨)의 혈장 약물 농도를 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 적합화시켰다.
간단히 말해서, ELISA 플레이트를 항-인간 IgG 포획 항체로 코팅하였다. 혈장 샘플 및 표준 물질(CD45 ADC)을 희석액에서 검정의 동적 범위 내에서 희석시키고, 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 항-IgG-HRP(총 항체를 계산하기 위함) 또는 항-아마톡신-HRP(CD45 ADC를 계산하기 위함)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, HRP 기질 TMB를 첨가한 후 정지 용액을 첨가하였다. 색의 강도는 결합된 IgG(총 항체를 계산하기 위함) 또는 IgG/아마톡신(AM1- 또는 AM2-컨쥬게이션된 CD45 ADC를 계산하기 위함)의 양에 직접 비례하였다. 결과는 도 27 및 표 22에 설명되어 있다.
항-아마톡신 검출 기반 PK와 항-IgG 검출 기반 PK의 오버레이는 ADC가 NHP에서 생체 내에서 혈청 안정적임을 나타낸다. CD45 ADC는 3.79-14.4 h의 반감기로 신속하게 청소되었으며, 이는 CD45 ADC가 생체 내에서 짧은 반감기를 가졌음을 나타낸다.
표 22. 평균 CD45 ADC PK
Figure pct00144
실시예 28. AbA-AM의 단일 용량은 환자-유래 종양에서 세포환원성이고, 혈액 악성종양의 여러 전임상 모델에서 치료 기준을 넘어서 생존을 연장시킨다.
본 실시예에 설명된 표적화된 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 접근법은 CD45+ 세포를 특이적으로 고갈시킴으로써 현재 컨디셔닝 프로토콜의 안정성을 개선하도록 설계된다. 아마톡신(AbA-AM1)에 컨쥬게이션된 AbA를 포함하는 항-인간 CD45-표적화된 짧은 반감기 ADC를 본 연구에 사용하였다. CD45는 모든 조혈 세포(적혈구, 형질 세포 및 혈소판 제외) 및 대부분의 혈액 악성종양에서 발현되기 때문에 동종-HSCT 컨디셔닝을 위해 표적화될 수 있다. 표적화된 특이성이 제공되면, 항-CD45-AM은 HSCT에 대한 효과적인 컨디셔닝과 표적-보유 종양 세포의 고갈을 조합함으로써 백혈병 환자에게 이중의 이점을 제공할 수 있다.
AbA-AM이 항-백혈병 활성을 갖는다는 것을 입증하기 위해, ADC를 인간 백혈병 이종이식 뮤린 모델에서 시험하였다. 미처리 및 불응성 질병을 모방하기 위해 모델의 패널을 평가하였다: AML 환자 유래 이종이식(PDX) 모델(치료 나이브이고 재발 후 동종이형 HCT 환자로부터; 모두 FLT-3+NPM1+), 무한증식화된 세포주로부터의 ALL 세포(REH-Luc), 및 T-ALL 환자-유래 이종이식(PDX) 모델(DHAP 화학요법 후 진행 중인 환자로부터).
AML #1은 치료 나이브인 환자(J000106134)로부터 유래되었고, AML #2는 동종이형 HSCT 후 심하게 사전 치료를 받은 재발된 불응성 환자(J000106132)로부터 유래되었고, T-ALL은 DHAP 후 화학요법이 진행 중인 환자로부터 유래되었다. 세포주 유래 ALL을 형질도입하여 반딧불이 루시페라제를 발현시켰다. 각각의 종양 유형의 세포를 면역 결핍 마우스(NSG-SGM3 또는 NSG)에 전신 접종하였다.
PDX의 말초 종양 부담(n=3-5/그룹), 및 CDX 마우스가 말초 혈액에서 또는 REH-luc 모델(n=10/그룹)에 대해 이식 후 5일에 2-16% 모세포에 도달한 경우에 치료가 시작되었다. 항-CD45-ADC(1, 3, 6 또는 10 mg/kg)의 단일 용량을 비히클(PBS) 또는 동형-AM1(6 또는 10 mg/kg)과 비교하였고, 이는 Ara-c(30 mg/kg QDx5, IV), 덱사메타손(5 mg/kg Q3Dx9, IP) 또는 독소루비신(3 mg/kg QWx3, IV)의 임상적으로 검증된 치료 표준 요법과 동등하였다. 연구 과정에 걸친 종양 부담은 도 28에 제시되어 있다.
인간 ALL의 REH-루시페라제 모델 세포주 유래(CDX) 모델에서, AbA-AM1의 단일 용량이 잘 용인되었고, 세포환원성이어서 종양 성장을 지연시키고, 비히클(PBS), 동형-AM1 또는 표준 치료(SoC) 독소루비신과 비교하여 적어도 두배(2.2-2.8x)까지 중앙값 생존을 연장시켰다(도 28; 하단 좌측 패널 및 도 29b). 도 29a 및 표 23에 제시된 바와 같이, ALL 접종 후 5일에 AbA-AM1(1, 3 또는 10 mg/kg)의 단일 주사는 PBS, 또는 동형-ADC 처리 대조군에 비해 그리고 독소루비신과 유사하게 55-66일의 중앙값만큼 더 긴 생존을 발생시켰으며, 상기 독소루비신은 ALL(n=10 마우스/그룹)에 대한 치료 표준으로서 임상적으로 사용된다. 생물발광 신호를 IVIS 영상화 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 측정하였다. 발광(평균±SEM)을 연구 기간에 걸쳐 포착하였다. 도 29c에 제시된 바와 같이 모든 처리 그룹에 대해 이식 후 22-23일에 대표적인 생물발광 신호 유사 컬러 이미지를 포착하였다.
표 23. REH-루시페라제 ALL 이종이식 모델에서 중앙 생존
Figure pct00145
T-ALL 환자-유래 이종이식(PDX) 모델에서, T-ALL 접종 후 5일에 짧은 반감기 CD45-ADC(3 또는 6 mg/kg의 AbA-AM1)의 단일 주사는 PBS(28일), 또는 동형-ADC(28일) 처리된 대조군, 또는 덱사메타손(47일, n=5 마우스/그룹; 도 30a 및 표 24)과 비교하여 66-67일의 중앙값만큼 더 긴 생존을 발생시켰다. 또한, 도 30b에 제시된 바와 같이, AbA-AM 처리는 말초 종양 부담을 유의하게 감소시켜 비히클, 동형-ADC에 비해 지연된 종양 성장을 발생시키고, 이는 T-ALL PDX 모델에서 2개의 임상적으로 검증된 치료 표준(각각 Ara-C 및 덱사메타손)과 동등하다. 이들 결과는 짧은 반감기 CD45-ADC의 단일 용량을 이용한 치료가 말초 백혈병 세포를 감소시켜 종양 성장을 지연시키고 중앙값 생존을 두 배로 증가시킨다는 것을 나타낸다.
표 24. T-ALL PDX 모델에서의 중앙값 생존
Figure pct00146
치료 나이브이고 재발된 동종이형 HCT 후 환자로부터의 AML 환자 유래 이종이식(PDX) 모델에서, 치료는 말초에서 2-16% 모세포가 검출된 경우에 시작되었다(n=3-5 마우스/그룹/AML PDX 모델). 마우스를 단일 정맥 내 용량의 항-인간 CD45-ADC(AbA-AM), 동형-ADC 또는 비히클(PBS)로 처리하였다. Ara-c를 연속 5일 동안 1일 1회 정맥 내 투여하였다. 도 31a 및 31b(및 표 25 및 26)에 제시된 바와 같이, 단일 정맥 내 용량의 ADC, (항-CD45-ADC(AbA-AM), 동형-ADC), 비히클(PBS)로 처리된 PDX AML 마우스는 PBS 대조군과 비교하여 항-CD45-ADC의 수용자에서 더 긴 생존을 발생시켰다. 또한, 도 31c 및 도 31d에 제시된 바와 같이, 단일 용량의 짧은 반감기 CD45-ADC는 비히클(PBS) 또는 동형-ADC에 비해 2개의 환자 유래 이종이식 모델에 걸쳐 인간 급성 골수성 백혈병 세포의 종양 부담을 효과적으로 감소시키며, 임상적으로 검증된 표준 치료 요법(Ara-c)과 동등하였다.
표 25. PDX 모델(AML #1)의 중앙값 생존
Figure pct00147
표 26. PDX 모델(AML #2)의 중앙값 생존
Figure pct00148
이들 결과는 짧은 반감기 CD45-ADC(AbA-AM)의 단일 용량 투여가 잘 용인되며 다중 이종이식 모델(ALL, T-All, AML)에서 백혈병 세포를 강력하게 표적화하고 대조군 및 임상적으로 검증된 치료 표준과 비교하여 확립된 백혈병 이종이식 모델(세포주 및 환자 유래)의 중앙값 생존을 유의하게 연장시킴으로써 종양 부담을 감소시킬 수 있음을 입증하였다.
PDX AML, 및 T-ALL에서의 AbA-AM 처리는 말초 종양 부담을 유의하게 감소시켜 비히클, 동형-AM에 비해 지연된 종양 성장을 발생시키며, 이는 2개의 임상적으로 검증된 치료 표준(각각 Ara-C 및 덱사메타손; 도 28)과 동등하다. 이식 적응증을 위해 설계된 바와 같이, ADC는 야생형 항체 대조군에 비해 감소된 반감기를 가졌다(16 대 79h).
인간화 뮤린 이종이식 모델에서 이들 데이터는 짧은 반감기 AbA-AM ADC가 강력한 표적화된 항-백혈병 제제임을 입증한다. 이들 비-유전독성 ADC는 특히 재발 위험이 높은 감소된 강도의 컨디셔닝을 받은 환자에서 이식 후 환자의 질병 부담을 감소시키고 지속적인 완화를 유도하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 개시 전체에 걸쳐 참조된 서열은 표 27에 제공된다.
표 27. 서열 표
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
Figure pct00160
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
기타 구현예
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적 간행물 또는 특허 출원이 특별히 및 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 지정되는 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 이의 특정 구현예와 관련하여 설명되었지만, 이는 추가 변형이 가능하고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야 내에서 공지되거나 관례적인 관행 내에 있는 본 발명으로부터의 상기 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적합화를 포함하도록 의도되며, 이는 앞서 제시되는 본질적인 특징에 적용될 수 있고, 청구범위의 범위 내에 있음이 이해될 것이다.
다른 구현예는 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MAGENTA THERAPEUTICS, INC. <120> ANTI-CD45 ANTIBODIES AND CONJUGATES THEREOF <130> M103034 1525WO <150> 63/084,903 <151> 2020-09-29 <150> 63/046,046 <151> 2020-06-30 <150> 63/046,164 <151> 2020-06-30 <150> 63/015,348 <151> 2020-04-24 <150> 62/978,147 <151> 2020-02-18 <150> 62/940,742 <151> 2019-11-26 <150> 62/929,137 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,194 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,207 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,288 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,601 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,283 <151> 2019-11-01 <150> 62/929,347 <151> 2019-11-01 <160> 161 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Phe Thr Phe Thr Asn Phe Trp Met Ala 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Asp <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Val Lys Phe His His Tyr Ser Gly Gly Gly Asp Ala 1 5 10 <210> 85 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Thr Asn Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala 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Synthetic peptide <400> 96 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Asn Thr Asn Asn Leu His Thr 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 98 Leu Gln His Ile Ser Arg Trp Thr 1 5 <210> 99 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Tyr 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MOD_RES <222> (8)..(8) <223> P or W <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> F or S <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> T or F <400> 124 Met Gln Arg Arg Arg Thr Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 125 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggcggtgt actactgcgc cagaggtgga 300 caatactact acgacagcag cagatacggt gaggtagcat tcgacatatg gggtcagggt 360 acaatggtca ccgtctcctc a 381 <210> 126 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 126 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcagagaag acgcactcct 300 cctttcactt ttggcggagg gaccaaggtt gagatcaaa 339 <210> 127 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 127 gaagtgcagc ttgtggagtc cggtggcgga ctggtccagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcgaa gcgtattcca tgaactgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtac attagcctgt cgggggccac catccattac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gaggggtggc 300 cagtactact acgactcaag cgactacggc gaagtggcat tcgatatctg gggacagggg 360 accatggtca ccgtcagctc c 381 <210> 128 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 128 gatatcgtga tgacacagtc ccctctgtcc ctccctgtga cccccggaga accagcctct 60 atttcctgcc ggtcctccca atccctggtg tccaacggtt ataactacct ggattggtac 120 ttgcaaaagc ccggacagag cccccagctg ctcatctact tcggaagctc acgcgcgagc 180 ggggtgccgg ataggttttc gggatccgga agcggcaccg acttcacgct gaagatctcg 240 agagtcgagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgtatgc agcggcggcg caccccctgg 300 tccttcggcg gcggaactaa ggtcgagatc aag 333 <210> 129 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 129 caagtgcagc ttgtggagtc cggtggcgga ctggtcaagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcggc ggatattcca tgaactgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtac attagcatct cgggggccac catcacttac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gaggggtggc 300 cagtactact acgactcaag cgactacggc gaagtggcat tcgatatctg gggacagggg 360 accatggtca ccgtcagctc c 381 <210> 130 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 130 gatatcgtga tgacacagtc ccctctgtcc ctccctgtga cccccggaga accagcctct 60 atttcctgcc ggtcctccca atccctggtg tccaacggtt ataactacct ggattggtac 120 ttgcaaaagc ccggacagag cccccagctg ctcatctact tcggaagctc acgcgcgagc 180 ggggtgccgg ataggttttc gggatccgga agcggcaccg acttcacgct gaagatctcg 240 agagtcgagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgtatgc agcggcggcg caccccgccc 300 ttcaccttcg gcggcggaac taaggtcgag atcaag 336 <210> 131 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 131 gaagtgcagc ttgtggagtc cggtggcgga ctggtccagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcgaa gcgtattcca tgaactgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtac attagcctgt cgggggccac catccattac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gaggggtggc 300 cagtactact acacctcaag cgactacggc gaagtggcat tcgatatctg gggacagggg 360 accatggtca ccgtcagctc c 381 <210> 132 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 132 gatatcgtga tgacacagtc ccctctgtcc ctccctgtga cccccggaga accagcctct 60 atttcctgcc ggtcctccca atccctggtg tccaacggtt ataactacct ggattggtac 120 ttgcaaaagc ccggacagag cccccagctg ctcatctact tcggaagctc acgcgcgagc 180 ggggtgccgg ataggttttc gggatccgga agcggcaccg acttcacgct gaagatctcg 240 agagtcgagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgtatgc agcggcggcg caccccctgg 300 tccttcggcg gcggaactaa ggtcgagatc aag 333 <210> 133 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 133 gaagtgcagc ttgtggagtc cggtggcgga ctggtccagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcgaa gcgtattcca tgaactgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtac attagcctgt cgggggccac catccattac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gaggggtggc 300 cagtactact acacctcaag cgactacggc gaagtggcat tcgatatctg gggacagggg 360 accatggtca ccgtcagctc c 381 <210> 134 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 134 gatatcgtga tgacacagtc ccctctgtcc ctccctgtga cccccggaga accagcctct 60 atttcctgcc ggtcctccca atccctggtg tcctcgggtt ataactacct ggattggtac 120 ttgcaaaagc ccggacagag cccccagctg ctcatctact tcggaagctc acgcgcgagc 180 ggggtgccgg ataggttttc gggatccgga agcggcaccg acttcacgct gaagatctcg 240 agagtcgagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgtatgc agcggcggcg caccccctgg 300 tccttcggcg gcggaactaa ggtcgagatc aag 333 <210> 135 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 135 gaggtgcagc tggtcgaaag cggaggaggg ctggtgcagc ctggaggatc cctgcggctc 60 tcatgtgccg cctccggctt taccttcgaa gcctactcca tgaactgggt cagacaggct 120 cccgggaagg gactggaatg ggtcagctac atttcgctgt ccggagccac catccactac 180 gctgactcag ttaagggacg cttcaccatc tcccgggata atgcaaagaa ctccctgtac 240 ctccaaatga attcactgag ggccgaggac actgccgtgt actactgcgc ccggggaggt 300 caatactatt acacctcctc cgactacggc gaagtggcct tcgatatctg gggccaagga 360 accctcgtga ctgtctcctc c 381 <210> 136 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 136 gacatcgtgc tgacccagtc accgctttcc ttgcccgtga ctcctgggga accggcctcc 60 atttcgtgcc ggtccagcca gtccctggtg tcctccggct acaattacct ggattggtac 120 ctccaaaagc ccggacagtc cccacaactg ctcatctact tcgggagctc aagggcctca 180 ggagtgccgg atcgcttctc gggttccgga agcgggactg acttcactct gaaaatcagc 240 cgcgtggaag cagaggacgt gggcgtgtac tactgcatgc agcgcaggag aaccccctgg 300 tcctttggcg gtggaacgaa ggtcgaaatc aag 333 <210> 137 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 137 caagtgcagc ttgtggagtc cggtggcgga ctggtcaagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcggc ggatattcca tgaactgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtac attagcatct cgggggccac catcacttac 180 gccgatagcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gaggggtggc 300 cagtactact acgactcaag cgactacggc gaagtggcat tcgatatctg gggacagggg 360 accatggtca ccgtcagctc c 381 <210> 138 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 138 gatatcgtga tgacacagtc ccctctgtcc ctccctgtga cccccggaga accagcctct 60 atttcctgcc ggtcctccca atccctggtg tcctccggtt ataactacct ggattggtac 120 ttgcaaaagc ccggacagag cccccagctg ctcatctact tcggaagctc acgcgcgagc 180 ggggtgccgg ataggttttc gggatccgga agcggcaccg acttcacgct gaagatctcg 240 agagtcgagg ccgaggacgt gggcgtgtac tactgtatgc agcggcggcg caccccgccc 300 ttcaccttcg gcggcggaac taaggtcgag atcaag 336 <210> 139 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 139 gaagtgcagc ttctggagtc cggtggcgga ctggtccagc cgggcggatc tctgagactt 60 tcgtgtgccg cctcgggatt caccttcaac aactattgga tgacctgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtcgtca attagctcct cggggggatc catctactac 180 cctgatcgcg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca acagcaagaa caccctctac 240 ctccaaatga acagcctgcg cgctgaggac actgctgtgt actattgcgc gagggacgag 300 agatgggccg gcgcaatgga tgcctgggga caggggacca ccgtcaccgt cagctcc 357 <210> 140 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 140 gatattcaga tgacccagtc cccatcatcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacg 60 atcacttgca aagccagcca gaatatcaac aagaacctgg attggtacca acagaagccg 120 gggaaggccc ctaagctgct gatctacgaa accaacaact tgcaaactgg cgtgccgtca 180 aggttcagcg gttccgggtc gggcaccgac ttcaccctga ccatttcctc gctgcaaccc 240 gaggacttcg cgacctacta ctgctatcag cacaacagcc ggttcacctt cggacagggc 300 accaagctcg agatcaag 318 <210> 141 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 141 gaagtgcagc tcgtggagtc gggtggaggc cttgtgcaac cgggaggatc cctgcggctc 60 tcctgcgccg catcaggctt cacgttcacc aacttttgga tggcctggat tagacaggca 120 ccggggaagg gactggaatg ggtggcgtcc attagctcgt ccggaggatc catctactat 180 cctgactcag tgaaggacag gtttaccatc tcccgggaca acagcaagaa cactctgtac 240 ctccaaatga actcgctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgt gaagttccat 300 cactactccg gcggaggaga tgcctgggga cagggtactc tcgtgactgt gtcgtcc 357 <210> 142 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 142 gacatccaga tgacccagag cccctcctcc ctgtccgcgt ctgtgggcga ccgcgtgacc 60 attacgtgca aagcttccca gaacattaac aagtacctgg attggtacca gcagaagcct 120 ggaaaggccc ccaagctgtt gatccactac acaaacaacc tccacactgg tatcccgtcc 180 cggttctcgg ggtccggatc gggaactgac tacaccctga ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatttcg ccacctatta ctgcctgcaa cactcctcgc gctggacctt cggcgggggt 300 actaaggtcg agatcaag 318 <210> 143 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 143 gaagtgcagc tcgtggagtc gggtggaggc cttgtgcaac cgggaggatc cctgcggctc 60 tcctgcgccg catcaggctt cacgttcaac aactactgga tgacttgggt cagacaggca 120 ccggggaagg gactggaatg ggtgtccagc attagctcgt ccggaggatc catctactat 180 ccggactcag tgaaggacag gtttaccatc tcccgggaca acgcaaagaa ctccctgtac 240 ctccaaatga actcgctgcg cgccgaggac atggccgtgt actactgcgc gaggctgtac 300 tactacgatg gggggggcga tgcctgggga cagggaaccc tagtgactgt gtcgtcc 357 <210> 144 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 144 ggaatccaga tgacacagag cccgtctagc ctgtcagcat ccgtggggga cagggtcacc 60 atcacctgta aagccagcca ggatattaac aagtacctgg actggtacca 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Tyr Thr Leu Arg Val Phe Glu Leu Arg His Ser 1100 1105 1110 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Tyr Thr Asn 1115 1120 1125 Trp Ser Val Glu Gln Leu Pro Ala Glu Pro Lys Glu Leu Val Ser 1130 1135 1140 Leu Ile Gln Val Leu Lys Glu Lys Leu Pro Gln Lys Asn Ser Ser 1145 1150 1155 Glu Gly Asn Lys His His Lys Ser Thr Pro Leu Leu Ile His Cys 1160 1165 1170 Arg Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Ile Phe Cys Ala Leu Leu Asn 1175 1180 1185 Leu Leu Glu Ser Ala Glu Thr Glu Glu Val Val Asp Ile Phe Gln 1190 1195 1200 Val Val Lys Ala Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Met Val Ser Thr 1205 1210 1215 Phe Glu Gln Tyr Gln Phe Leu Tyr Asp Ile Ile Ala Ser Thr Tyr 1220 1225 1230 Pro Ala Gln Asn Gly Gln Val Lys Lys Asn Asn His Gln Glu Asp 1235 1240 1245 Lys Ile Glu Phe Asp Asn Glu Val Asp Lys Val Lys Gln Asp Ala 1250 1255 1260 Asn Cys Val Asn Pro Leu Gly Ala Thr Glu Lys Leu Pro Glu Ala 1265 1270 1275 Lys Glu Gln Ala Thr Gly Ser Glu Pro Thr Ser Gly Thr Glu Gly 1280 1285 1290 Pro Glu His Ser Val Asn Gly Pro Ala Ser Pro Ala Leu Asn Gln 1295 1300 1305 Gly Ser 1310 <210> 147 <211> 293 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 147 Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser 20 25 30 Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn 35 40 45 Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe 50 55 60 Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly 65 70 75 80 Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser 85 90 95 His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser 130 135 140 His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met 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coli <400> 149 Asp Glu Phe Thr Val Asp Phe Ser Ser Gln Lys Ser Tyr Val Asp Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ser Ile Arg Ser Ala Ile Ser Thr Pro Leu Gly Asn Ile Ser 20 25 30 Gln Gly Gly Val Ser Val Ser Val Ile Asn His Val Leu Gly Gly Asn 35 40 45 Tyr Ile Ser Leu Asn Val Arg Gly Leu Asp Pro Tyr Ser Glu Arg Phe 50 55 60 Asn His Leu Arg Leu Ile Met Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Ala Gly 65 70 75 80 Phe Ile Asn Thr Glu Thr Asn Ile Phe Tyr Arg Phe Ser Asp Phe Ser 85 90 95 His Ile Ser Val Pro Asp Val Ile Thr Val Ser Met Thr Thr Asp Ser 100 105 110 Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Arg Ile Ala Asp Leu Glu Arg Thr Gly Met 115 120 125 Gln Ile Gly Arg His Ser Leu Val Gly Ser Tyr Leu Asp Leu Met Glu 130 135 140 Phe Arg Gly Arg Ser Met Thr Arg Ala Ser Ser Arg Ala Met Leu Arg 145 150 155 160 Phe Val Thr Val Ile Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg 165 170 175 Gly Phe Arg Pro Ala Leu Ser Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Thr Met Thr 180 185 190 Ala Gln Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Ile Ser Asn Val 195 200 205 Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Glu Gly Val Arg Ile Gly Arg Ile Ser 210 215 220 Phe Asn Ser Leu Ser Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Val Ile Leu Asn 225 230 235 240 Cys His Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Val Arg Ser Val Ser Gln Lys Gln 245 250 255 Lys Thr Glu Cys Gln Ile Val Gly Asp Arg Ala Ala Ile Lys Val Asn 260 265 270 Asn Val Leu Trp Glu Ala Asn Thr Ile Ala Ala Leu Leu Asn Arg Lys 275 280 285 Pro Gln Asp Leu Thr Glu Pro Asn Gln 290 295 <210> 150 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 150 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcgaa gcatatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtctca gtggtgccac catacactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt attactgcgc cagaggtgga 300 caatactact acgacagcag tgattacggt gaggtagcat tcgacatatg gggtcagggt 360 acaatggtca ccgtctcctc a 381 <210> 151 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 151 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctggtc agtaatggat acaactattt ggattggtac 120 ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatt tcggttcttc ccgggcctcc 180 ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga tcaggcacag attttacact gaaaatcagc 240 agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgcatgc agagaagacg cactccttgg 300 tcttttggcg gagggaccaa ggttgagatc aaa 333 <210> 152 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 152 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcgga ggatatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtatca gtggtgccac cataacctac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc cagaggtgga 300 caatactact acgacagcag cgattatggt gaggtagcat tcgacatatg gggtcagggt 360 acaatggtca ccgtctcctc a 381 <210> 153 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 153 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctggtc agtaatggat acaactattt ggattggtac 120 ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatt tcggttcttc ccgggcctcc 180 ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga tcaggcacag attttacact gaaaatcagc 240 agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgcatgc agagaagacg cactcctcct 300 ttcacttttg gcggagggac caaggttgag atcaaa 336 <210> 154 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 154 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcgaa gcatatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtctca gtggtgccac catacactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt attactgcgc cagaggtgga 300 caatactact acacgagcag tgattacggt gaggtagcat tcgacatatg gggtcagggt 360 acaatggtca ccgtctcctc a 381 <210> 155 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 155 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctggtc agtaatggat acaactattt ggattggtac 120 ctgcagaagc cagggcagtc tccacagctc ctgatctatt tcggttcttc ccgggcctcc 180 ggggtccctg acaggttcag tggcagtgga tcaggcacag attttacact gaaaatcagc 240 agagtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgcatgc agagaagacg cactccttgg 300 tcttttggcg gagggaccaa ggttgagatc aaa 333 <210> 156 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 156 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcgggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat aattattgga tgacatgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatct attagttcca gtggtggtag catttactac 180 cccgacaggg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgc aagagacgag 300 agatgggcag gtgctatgga tgcctggggg caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 157 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 157 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggcaagtca gaatattaac aagaatttag actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgag acgaataact tgcaaacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgttatcag cataattcta gatttacttt tggccagggg 300 accaagctgg agatcaaa 318 <210> 158 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 158 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttacc aatttttgga tggcgtggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcaagt attagttcaa gtggtggtag catctactac 180 cctgactccg tgaaggaccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggcggtgt actactgcgt caagtttcac 300 cactattcag gcggcggcga tgcttggggc caagggaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 159 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 159 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aagcaagtca gaatattaac aagtatttag attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatccattac actaacaact tgcacaccgg gattccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtctgcag cacagttcca gatggacatt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaa 318 <210> 160 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcaat aactattgga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatcc attagtagta gtggcggtag tatatactac 180 cctgactctg tgaaggatcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac atggcggtgt actactgcgc caggttgtac 300 tactacgacg ggggagggga tgcgtggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 161 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 161 ggcatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaat aagtatttag attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacaat acaaacaatt tgcatacagg gatcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tatactctta ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacatatta ctgtcttcaa cacatatcta gatggacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaa 318

Claims (89)

  1. 하기를 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    (a) SEQ ID NO:2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO:12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) SEQ ID NO:22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) SEQ ID NO:32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) SEQ ID NO:42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) SEQ ID NO:52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (g) SEQ ID NO:62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:67에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (h) SEQ ID NO:72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:73에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:77에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (i) SEQ ID NO:82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:83에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:87에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (j) SEQ ID NO:92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:93에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:96에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:97에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:98에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 하기를 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    SEQ ID NO:119에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:120에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:121에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 도메인, SEQ ID NO:123에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 도메인 및 SEQ ID NO:124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 하기를 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    (a) SEQ ID NO:1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO:11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) SEQ ID NO:21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) SEQ ID NO:31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) SEQ ID NO:41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) SEQ ID NO:51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (g) SEQ ID NO:61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (h) SEQ ID NO:71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:75에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (i) SEQ ID NO:81에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (j) SEQ ID NO:91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO:95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 Fc 영역을 포함하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제4항에 있어서, Fc 영역이 인간 IgG4 Fc 영역의 인간 IgG1 Fc 영역인 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 불변 영역을 포함하는 온전한 항체인 분리된 항-CD45 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG인 분리된 항-CD45 항체.
  9. 제8항에 있어서, IgG가 IgG1 또는 IgG4인 분리된 항-CD45 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 불변 영역을 포함하고, 상기 불변 영역이 L234A, L235A, D265C, H310A 및 H435A(EU 인덱스에 따른 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산 치환을 포함하는 분리된 항-CD45 항체.
  11. 제10항에 있어서, 불변 영역이 아미노산 치환 L234A, L235A 및 D265C(EU 인덱스에 따른 넘버링)를 포함하는 분리된 항-CD45 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역을 포함하고, 상기 불변 영역이 하기를 포함하는 분리된 항-CD45 항체:
    (a) SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 또는 SEQ ID NO:106에 제시된 중쇄 아미노산 서열; 및
    (b) SEQ ID NO:101에 제시된 경쇄 아미노산 서열.
  13. 하기를 포함하는 분리된 항-CD45 항체:
    (a) SEQ ID NO:9에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:10에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (b) SEQ ID NO:19에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:20에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (c) SEQ ID NO:29에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:30에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (d) SEQ ID NO:39에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:40에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (e) SEQ ID NO:49에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:50에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (f) SEQ ID NO:59에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:60에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (g) SEQ ID NO:69에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:70에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (h) SEQ ID NO:79에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:80에 제시된 경쇄 아미노산 서열;
    (i) SEQ ID NO:89에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:90에 제시된 경쇄 아미노산 서열; 또는
    (j) SEQ ID NO:99에 제시된 중쇄 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO:100에 제시된 경쇄 아미노산 서열.
  14. CD45 단편 1(SEQ ID NO:114), CD45 단편 2(SEQ ID NO:115), CD45 단편 3(SEQ ID NO:116), CD45 단편 4(SEQ ID NO:117) 및/또는 CD45 단편 5(SEQ ID NO:118) 내에 위치한 에피토프에서 인간 CD45에 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  15. 제14항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 하기에 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    (a) CD45 단편 2 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프, 및 단편 4 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프;
    (b) CD45 단편 1 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프, 및 CD45 단편 3 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프; 또는
    (c) CD45 단편 5 내에 위치한 인간 CD45의 에피토프.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 하기에 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    (a) 인간 CD45에서 405T, 407K, 419Y, 425K, 481R, 505R 및 509H로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기(SEQ ID NO:113을 참조하여 넘버링됨); 또는
    (b) 인간 CD45에서 486R, 493Y 및 502T로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기(SEQ ID NO:113을 참조하여 넘버링됨).
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD45에 특이적으로 결합하고, 시노몰구스 CD45와 교차 반응하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 생물층 간섭계(Bio-Layer Interferometry; BLI)에 의해 측정시 1x10-2 내지 1x10-3, 1x10-3 내지 1x10-4, 1x10-4 내지 1x10-5, 1x10-5 내지 1x10-6, 1x10-6 내지 1x10-7, 또는 1x10-7 내지 1x10-8의 해리 속도(KOFF)로 인간 CD45에 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 생물층 간섭계(BLI)에 의해 측정시 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 0.1 nM 이하의 KD로 인간 CD45에 결합하는 분리된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  22. 제21항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  23. 제21항의 분리된 핵산 또는 제22항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 HEK293T 세포인 숙주 세포.
  25. 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 약학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 인간 환자에 투여하는 것을 포함하는 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법.
  27. 제26항에 있어서, CD45+ 세포가 CD3+, CD19+, CD33+, CD34+ 또는 CD45+/B2M+인 방법.
  28. 제26항에 있어서, CD45+ 세포가 조혈 줄기 세포(HSC), T 세포, B 세포, 및/또는 골수 세포인 방법.
  29. 제26항에 있어서, CD45+ 세포가 암세포인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CD45+ 세포가 환자의 골수 및/또는 환자의 말초 혈액에서 고갈되는 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 하는 방법.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 이식이 동종이형인 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 이식이 자가인 방법.
  35. 링커를 통해 세포독소에 컨쥬게이션된 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로서, 상기 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  36. 제35항에 있어서, 항체가 항체의 불변 도메인에서 시스테인 잔기에 의해 세포독소에 컨쥬게이션되는 ADC.
  37. 제36항에 있어서, 시스테인 잔기가 항체의 불변 영역에서 아미노산 치환에 의해 도입되는 ADC.
  38. 제37항에 있어서, 아미노산 치환이 D265C 및/또는 V205C(EU 넘버링)인 ADC.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, ADC가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 약물 대 항체 비(DAR)를 갖는 ADC.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소가 RNA 중합효소 억제제, DNA 중격제, DNA 알킬화제, DNA 가교제, 단백질 합성을 방해하는 제제, 미세관 동역학을 방해하는 제제, 또는 유사분열 방추를 방해하는 제제인 ADC.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독소가 아마톡신, 안트라사이클린, 아우리스타틴, 칼리케아마이신, 데부가닌, 디프테리아 독소, 듀오카르마이신, 인돌리노벤조디아제핀(IGN), 인돌리노벤조디아제핀 이량체, 이리노테칸, 메이탄신, 메이탄시노이드, 슈도모나스 외독소 A, 피롤로벤조디아제핀(PBD), 피롤로벤조디아제핀 이량체, 사포린, 및 SN-38로 구성된 군으로부터 선택되는 ADC.
  42. 제40항에 있어서, 세포독소가 RNA 중합효소 억제제인 ADC.
  43. 제42항에 있어서, RNA 중합효소 억제제가 아마톡신인 ADC.
  44. 제43항에 있어서, ADC가 화학식 Ab-Z-L-Am으로 표현되고, 여기서 Ab가 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, L이 링커이고, Z가 화학적 모이어티이고, Am이 아마톡신인 ADC.
  45. 제44항에 있어서, 아마톡신-링커 컨쥬게이트가 하기 화학식 (I)로 표현되는 ADC:
    Figure pct00170

    상기 식에서, R1은 H, OH, ORA 또는 ORC이고;
    R2는 H, OH, ORB 또는 ORC이고;
    RA 및 RB는 존재하는 경우 이들이 결합된 산소 원자와 함께 조합하여 선택적으로 치환되는 5원 헤테로사이클로알킬 기를 형성하고;
    R3는 H, RC 또는 RD이고;
    R4, R5, R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, OH, ORC, ORD, RC 또는 RD이고;
    R8은 OH, NH2, ORC, ORD, NHRC 또는 NRCRD이고;
    R9은 H, OH, ORC 또는 ORD이고;
    X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이고;
    RC는 -L-Z이고;
    RD는 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환되는 아릴 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이고;
    L은 선택적으로 치환되는 C1-C6 알킬렌, 선택적으로 치환되는 C1-C6 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알케닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 알키닐렌, 선택적으로 치환되는 C2-C6 헤테로알키닐렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬렌, 선택적으로 치환되는 아릴렌, 선택적으로 치환되는 헤테로아릴렌, 펩티드, 디펩티드, -(C=O)-, 디설파이드, 하이드라존, 또는 이들의 조합이고;
    Z는 L에 존재하는 반응성 치환기와 항체 또는 이의 항원 결합 단편 내에 존재하는 반응성 치환기 사이의 커플링 반응으로부터 형성된 화학적 모이어티이고,
    여기서, Am은 정확히 하나의 RC 치환기를 포함한다.
  46. 제45항에 있어서, L-Z가 하기인 ADC:
    Figure pct00171

    또는
    Figure pct00172
    .
  47. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 중 하나로 표현되는 ADC:
    Figure pct00173

    상기 식에서, X는 -S-, -S(O)- 또는 -SO2-이다.
  48. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 화학식을 갖는 ADC:
    Figure pct00174

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
  49. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 화학식을 갖는 ADC:
    Figure pct00175

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
  50. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 화학식을 갖는 ADC:
    Figure pct00176

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
  51. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 화학식을 갖는 ADC:
    Figure pct00177

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
  52. 제43항 또는 제44항에 있어서, ADC가 하기 화학식을 갖는 ADC:
    Figure pct00178

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체의 부착 지점을 나타낸다.
  53. 제41항에 있어서, 세포독소가 피롤로벤조디아제핀(PBD)인 ADC.
  54. 제53항에 있어서, 세포독소가 PBD 이량체인 ADC.
  55. 제54항에 있어서, PBD 이량체가 하기로 표현되는 ADC:
    Figure pct00179

    상기 식에서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 부착 지점을 나타낸다.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 펩티드, 올리고당류, -(CH2)p-, -(CH2CH2O)q-, -(C=O)(CH2)r-, -(C=O)(CH2CH2O)t-, -(NHCH2CH2)u-, -PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB 또는 Ala-PAB 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 p, q, r, t 및 u 각각이 각 발생에 대해 독립적으로 선택되는 1-12로부터의 정수인 ADC.
  57. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기 구조를 갖는 ADC:
    Figure pct00180

    상기 식에서, R1은 CH3 (Ala) 또는 (CH2)3NH(CO)NH2 (Cit)이다.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체로의 컨쥬게이션 전이고 L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 링커가 하기 구조를 갖는 ADC:
    Figure pct00181

    상기 식에서, R1은 CH3 (Ala) 또는 (CH2)3NH(CO)NH2 (Cit)이다.
  59. 제58항에 있어서, R1이 CH3인 ADC.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트가 하기 구조를 갖는 테시린인 ADC:
    Figure pct00182
    .
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조를 갖는 ADC:
    Figure pct00183

    상기 식에서, Ab는 항-CD45 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, S는 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 존재하거나 이에 도입된 황 원자를 나타낸다.
  62. 제41항에 있어서, 세포독소가 인돌리노벤조디아제핀(IGN)인 ADC.
  63. 제62항에 있어서, 세포독소가 IGN 이량체 또는 IGN 유사이량체인 ADC.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 세포독소가 하기로 표현되는 IGN 유사이량체인 ADC:
    Figure pct00184

    상기 식에서, 물결선은 ADC의 링커에 대한 공유 부착 지점을 나타낸다.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 디펩티드, 디설파이드, C1-C12 알킬, C=O 또는 이들의 조합을 포함하는 ADC.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 하기를 포함하는 ADC:
    Figure pct00185
    또는
    Figure pct00186
    .
  67. 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로의 컨쥬게이션 전이고 Cy-L-Z'로 함께 취해진 반응성 치환기 Z'을 포함하는 세포독소-링커 컨쥬게이트가 하기 구조를 갖는 ADC:
    Figure pct00187
    .
  68. 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항의 ADC, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  69. 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법으로서, 유효량의 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항의 ADC를 환자에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, CD45+ 세포가 CD3+, CD19+, CD33+, CD34+ 또는 CD45+/B2M+인 방법.
  71. 제69항에 있어서, CD45+ 세포가 조혈 줄기 세포(HSC)인 방법.
  72. 제69항에 있어서, CD45+ 세포가 HSC, T 세포, B 세포 및/또는 골수 세포인 방법.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, CD45+ 세포가 환자의 골수 및/또는 환자의 말초 혈액에서 고갈되는 방법.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 조혈 줄기 세포 이식을 필요로 하는 방법.
  75. 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  76. 조혈 줄기 세포(HSC) 이식을 필요로 하는 인간 환자에서 CD45+ 세포의 집단을 고갈시키는 방법으로서, 환자가 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 받기 전에 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항의 ADC를 환자에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  77. (a) 환자에서 CD45+ 세포 집단을 고갈시키기에 충분한 양의 제35항 내지 제67항 중 어느 한 항의 ADC를 인간 환자에 투여하고;
    (b) 후속적으로 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  78. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 이식이 동종이형인 방법.
  79. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 이식이 자가인 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포를 포함하는 이식이 ADC의 농도가 환자의 혈액으로부터 실질적으로 제거된 후에 환자에게 투여되는 방법.
  81. 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 줄기 세포 또는 이의 자손이 조혈 조직에 국소화될 수 있고/있거나 환자에게 조혈 줄기 세포의 이식 후에 조혈을 재확립할 수 있는 방법.
  82. 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 이식시, 조혈 줄기 세포가 거대핵세포, 트롬보사이트, 혈소판, 적혈구, 비만 세포, 골수모세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 미세아교세포, 과립구, 단핵구, 파골세포, 항원-제시 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-림프구 및 B-림프구로 구성된 군으로부터 선택되는 세포 집단의 회복을 발생시키는 방법.
  83. 제69항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 혈액 질병, 대사 장애, 암, 또는 자가면역 장애, 또는 중증 복합 면역결핍 질병(SCID)을 갖는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 환자가 암을 갖는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 암이 혈액암인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 혈액암이 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병 또는 다발골수종인 방법.
  87. 제83항에 있어서, 환자가 자가면역 장애를 갖는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 자가면역 장애가 다발경화증, 타입 1 당뇨병 또는 피부경화증인 방법.
  89. 제87항에 있어서, 자가면역 장애가 다발경화증, 인간 전신 루푸스, 류마티스 관절염, 염증성 장 질병, 건선 치료, 타입 1 당뇨병, 급성 파종성 뇌척수염, 애디슨병, 전신탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군, 재생불량빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질병, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 난소염, 발로병, 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 샤가스병, 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 크론병, 반흔성 유사천포창, 복강 스프루-포진 피부염, 저온응집병, CREST 증후군, 데고스병, 원반모양 루푸스, 자율신경기능이상, 자궁내막증, 원발성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근육염, 굿파스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 화농땀샘염, 특발성 및/또는 급성 혈소판감소성 자반증, 특발성 폐 섬유증, IgA 신경병증, 간질성 방광염, 청소년 관절염, 가와사키병, 편평태선, 라임병, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 중증근무력증, 신경근긴장증, 간대성 근간대성 증후군, 시신경염, 오드 갑상선염, 보통천포창, 악성 빈혈, 다발연골염, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 담즙성 간경변증, 결절다발동맥염, 다분비성 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 무감마글로불린혈증, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스열, 사코이드증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 타카야수 동맥염, 측두동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증, 외음부통 및 베게너 육아종증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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