JP2021510307A

JP2021510307A - 抗グリコｍｕｃ１抗体およびその使用

Info

Publication number: JP2021510307A
Application number: JP2020543460A
Authority: JP
Inventors: ホワイト，セイヤー
Original assignee: ジーオーセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2021-04-22
Anticipated expiration: 2037-10-24
Also published as: CA3078812A1; KR20200067885A; KR102608763B1; EP3700936A1; BR112020008001A2; JP2024001073A; AU2017436815A1; MX2020004220A; WO2019083506A1; KR20230165874A; JP7358367B2; CN111479828B; IL274202A; EP3700936A4; CN111479828A

Abstract

本発明の開示は、ＭＵＣ１のがん特異的なグリコシル化バリアントに特異的に結合する抗グリコＭＵＣ１抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびに関連の融合タンパク質および抗体−薬物コンジュゲート、加えてこのような生体分子をコードする核酸に関する。本発明の開示はさらに、がん療法のための、抗体、抗原結合フラグメント、融合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲートおよび核酸の使用に関する。

Description

１．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これによりその全体が参照により組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年１０月２４日に作成され、ＧＯＴ−００１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、３３，２６５バイトのサイズである。

２．背景
ヒトムチンＭＵＣ１は、単層上皮および腺上皮の頂端表面上に発現される多形性の膜貫通糖タンパク質である（Taylor-Papadimitriou et al., 1999）。ＭＵＣ１は、腺癌で高度に過剰発現され、異常にＯ−グリコシル化される。ムチンの細胞外ドメインは、５つの可能性のあるＯ−グリコシル化のための部位を有する２０アミノ酸残基の可変数タンデムリピート（ＴＲ）（２５〜１２５）を含有する。Ｏ−グリカンは、がん細胞中で不完全にプロセシングされ、結果として汎癌（pancarcinoma）炭水化物抗原Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）の発現が起こる（Springer, 1984）。単純なムチン型Ｏ−グリカンであるＴｎは腺癌（乳房および卵巣がんを含む）で広く発現され、正常な成人組織では限定された分布を示す（Springer, 1984）。がんにおけるこれらのＯ−グリカンの発現は、予後不良と相関しており、がん患者ではこれらの炭水化物ハプテンに対する天然抗体が増加する（Miles et al., 1995；Soares et al., 1996；Werther et al., 1996）。当業界においてがん細胞で過剰発現されるグリコＭＵＣ１エピトープを利用する治療法への必要性がある。

３．要約
本開示は、グリコＭＵＣ１のがん特異的なエピトープに選択的な抗体および抗原結合フラグメントに基づく治療剤および診断剤を提供することによって、グリコペプチドバリアントの腫瘍特異性を獲得するものである。

本発明の開示は、ＭＵＣ１のがん特異的なグリコシル化バリアントに結合する抗グリコＭＵＣ１抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の開示はさらに、抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質および抗体−薬物コンジュゲート、ならびに抗グリコＭＵＣ１抗体、抗原結合フラグメントおよび融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

本発明の開示はさらに、がん療法のための、抗グリコＭＵＣ１抗体、抗原結合フラグメント、融合タンパク質、抗体−薬物コンジュゲートおよび核酸の使用方法を提供する。

特定の態様において、本開示は、ＭＵＣ１のがん特異的なグリコシル化バリアントと、第２のエピトープとに結合する、二重特異性および他の多重特異性を有する抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントを提供する。第２のエピトープは、ＭＵＣ１それ自体、がん細胞上でＭＵＣ１と共発現される別のタンパク質、または活性化Ｔ細胞などの異なる細胞上に存在する別のタンパク質のいずれの上にあるものでもよい。さらに、コドン最適化されたコード領域を含む核酸、および特定の宿主細胞における発現にコドン最適化されていないコード領域を含む核酸などの抗体をコードする核酸も開示される。

抗グリコＭＵＣ１抗体および結合フラグメントは、融合パートナーを含有する融合タンパク質の形態であり得る。融合パートナーは、第２の機能、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質のシグナル伝達ドメインのシグナル伝達機能、Ｔ細胞活性化のペプチドモジュレーター、または標識システムの酵素的な要素を提供するのに有用であり得る。例示的なＴ細胞シグナル伝達タンパク質としては、４−１ＢＢ、ＣＯ３Ｃ、ならびに融合ペプチド、例えば、ＣＤ２８−ＣＤ３−ゼータおよび４−１ＢＢ−ＣＤ３−ゼータが挙げられる。４−１ＢＢ、またはＣＤ１３７は、Ｔ細胞の共刺激受容体であり、ＣＤ３−ゼータは、Ｔ細胞抗原受容体のシグナル伝達要素である。第２の機能を提供する部分は、Ｔ細胞活性化のモジュレーター、例えばＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒａ、またはＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ融合であってもよく、またはインビボまたはインビトロでの結合の程度および／または場所をモニターするのに有用な標識システムの標識または酵素的な要素をコードしていてもよい。Ｔ細胞、例えば自己Ｔ細胞の状況下に置かれた、これらの予防および治療活性を有する生体分子をコードするコンストラクトは、本開示の一部の実施形態において、様々ながんを防止または処置するための、養子導入されたＴ細胞を補充するための強力なプラットフォームを提供する。

特定の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、表１に記載の重鎖および／または軽鎖可変配列を含む（またはヌクレオチド配列によってコードされる）。明確にするために、この文書中で用語「抗グリコＭＵＣ１抗体」が使用される場合、それは、文脈上別段の指示がない限り、単一特異性および多重特異性（二重特異性を含む）抗グリコＭＵＣ１抗体、単一特異性および多重特異性抗体の抗原結合フラグメント、ならびに抗体およびその抗原結合フラグメントを含有する融合タンパク質およびコンジュゲートを含むことが意図される。同様に、用語「抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント」が使用される場合、それはまた、文脈上別段の指示がない限り、単一特異性および多重特異性（二重特異性を含む）抗グリコＭＵＣ１抗体およびその抗原結合フラグメントに加えて、このような抗体および抗原結合フラグメントを含有する融合タンパク質およびコンジュゲートも含むことが意図される。

他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、表１〜３に記載の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列を含む（またはヌクレオチド配列によってコードされる）。表１に記載のＣＤＲ配列は、ＣＤＲの境界を定義するための、ＩＭＧＴ（Lefranc et al., 2003, Dev Comparat Immunol 27:55-77, Kabat （Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.）、およびChothia（Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol 273:927-948）のスキームに従って定義されるＣＤＲ配列を含む。表２に記載のＣＤＲ配列は、表１に示されるＣＤＲ配列の組み合わされたオーバーラップ領域であり、ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ配列は下線の太字で示される。表３に記載のＣＤＲ配列は、表１に示されるＣＤＲ配列の共通のオーバーラップ領域である。このような抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントのフレームワーク配列は、表１に記載の天然マウスのフレームワーク配列であってもよいし、または非天然（例えば、ヒト化された、またはヒト）フレームワーク配列であってもよい。

特定の態様において、本開示は、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、番号付けされた実施形態３から１７に記載のＣＤＲ組合せのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＤＲを含むことを提供する。したがって、特定の実施形態において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号５、２３、２８、または３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号６または２４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号３０または２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号５〜７の重鎖ＣＤＲおよび配列番号８〜１０の軽鎖ＣＤＲを含む。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２３〜２５の重鎖ＣＤＲならびに配列番号２６、２７、および１０の軽鎖ＣＤＲを含む。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２８、２９、および２５の重鎖ＣＤＲならびに配列番号３０、９、および３１の軽鎖ＣＤＲを含む。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３２、２４、および７の重鎖ＣＤＲならびに配列番号２６、２７、および１０の軽鎖ＣＤＲを含む。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３３、２９、および２５の重鎖ＣＤＲならびに配列番号８、９、および３１の軽鎖ＣＤＲを含む。抗体または抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体またはこれらの抗原結合フラグメントであってもよい。

さらなる態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号３および４の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合する。さらに他の態様において、本開示は、それぞれ配列番号３および４の少なくとも９５％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域を有する抗ＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

さらに他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。例示的なｓｃＦｖは、軽鎖可変フラグメントのＮ末端側に重鎖可変フラグメントを含む。一部の実施形態において、ｓｃＦｖの重鎖可変フラグメントおよび軽鎖可変フラグメントは、４〜１５アミノ酸のリンカー配列に共有結合している。ｓｃＦｖは、二重特異性Ｔ細胞誘導体の形態であってもよいし、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）内であってもよい。

抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントは、単鎖可変フラグメントの多量体、二重特異性単鎖可変フラグメント、および二重特異性単鎖可変フラグメントの多量体の形態であってもよい。一部の実施形態において、単鎖可変フラグメントの多量体は、２価単鎖可変フラグメント、トリボディ（tribody）またはテトラボディ（tetrabody）から選択される。これらの実施形態の一部において、二重特異性単鎖可変フラグメントの多量体は、二重特異性Ｔ細胞誘導体である。

本開示の他の態様は、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントをコードする核酸に関心を寄せている。一部の実施形態において、抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸の部分は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。特定の態様において、本開示は、配列番号１１または配列番号１３と少なくとも９５％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有する重鎖ヌクレオチド配列、および配列番号１２または配列番号１４と少なくとも９５％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有する軽鎖ヌクレオチド配列によってコードされた重鎖および軽鎖可変領域を有する抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを提供する。核酸を含むベクター（例えば、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター）および宿主細胞も本開示の範囲内である。重鎖および軽鎖をコードする配列は、単一のベクターに存在していてもよいし、または別個のベクターに存在していてもよい。

本開示のさらに別の態様は、抗グリコＭＵＣ１抗体、抗原結合フラグメント、核酸（または核酸の対）、ベクター（またはベクターの対）または本開示による宿主細胞、および生理学的に好適な緩衝液、アジュバントまたは希釈剤を含む医薬組成物である。

本開示のさらに別の態様は、キメラ抗原受容体を作製する方法であって、コード領域の発現に好適な条件下で、本開示による核酸またはベクターを含む細胞をインキュベートすること、およびキメラ抗原受容体を収集することを含む方法である。

本開示の別の態様は、がんを検出する方法であって、細胞または組織サンプルを、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントと接触させること、および抗体が細胞または組織サンプルに結合しているかどうかを検出することを含む方法である。

本開示のさらに別の態様は、がんを処置する方法であって、予防的または治療的有効量の本開示による抗グリコＭＵＣ１抗体、抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、宿主細胞または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。

ＭＵＣ１に対するグリコＭＵＣ１へのＧＯ２の結合特異性を示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。結腸がん組織へのＧＯ２の結合を示す図である。ｍＡｂのＧＯ２を使用する浸潤性の結腸癌組織および隣接する健康な組織の免疫組織化学的な標識。ｍＡｂのＧＯ２は、結腸がん組織への別個の結合を示し、がん細胞の細胞内と表面構造の両方で高い反応性を有する。対照的に、健康な結腸細胞の表面構造への反応性は見られない。膵臓がん組織へのＧＯ２の結合を示す図である。ｍＡｂのＧＯ２を使用する膵臓がん組織の免疫組織化学的な標識。ｍＡｂＧＯ２は、膵臓がん細胞への別個の結合を示す。対照的に、周囲の健康な組織への反応性はないかまたは限定的であった。乳がん組織へのＧＯ２の結合を示す図である。ｍＡｂのＧＯ２を使用する乳がん組織の免疫組織化学的な標識。ｍＡｂＧＯ２は、浸潤性の乳がん細胞への別個の結合を示した。抗体ＧＯ２および抗チューブリン剤であるモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした二次抗体を用いた抗体依存性細胞傷害アッセイの結果を示す図である。ＧＯ２を使用して循環腫瘍細胞を定量化するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。Ｘ軸は、細胞の数を示し、Ｙ軸は、ＯＤ４５０値を示す。ＭＵＣ１陽性ＴＭＡ腫瘍のコアの代表的な画像を示す図である。図７Ａ：乳がん；図７Ｂ：非小細胞肺がん；図７Ｃ：卵巣がん；図７Ｄ：結腸直腸がん；図７Ｅ：前立腺がん。例示的な抗グリコＭＵＣ１および抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）の略図である。未消化の患者由来の腫瘍サンプル（気管支および肺の悪性新生物：中葉、気管支または肺、扁平上皮癌）および５０ｎＭの異なるＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。未消化の患者由来の腫瘍サンプル（気管支および肺の悪性新生物：中葉、気管支または肺、扁平上皮癌）および５ｎＭの異なるＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。未消化の患者由来の腫瘍サンプル（気管支および肺の悪性新生物：下葉、気管支または肺、非角化型扁平上皮癌）および５０ｎＭの異なるＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。未消化の患者由来の腫瘍サンプル（気管支および肺の悪性新生物：上葉、気管支または肺、腺房型を有する腺癌）および５０ｎＭの異なるＴＣＢを用いたＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。フローサイトメトリーによって測定された、ＭＣＦ７ｃｓ細胞上で発現されたＭＵＣ１へのＧＯ２ＴＣＢの結合を示す図である。フローサイトメトリーによって測定された、Ｔ３Ｍ４ｐｚｆｖ細胞上で発現されたＭＵＣ１へのＧＯ２ＴＣＢの結合を示す図である。２人の健康なドナー由来のＰＢＭＣの存在下における、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節、加えて、Ｔ３Ｍ４ｐｚｆｖ上でのＧＯ２ＴＣＢによるＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの放出によって測定された、腫瘍細胞の致死およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である（ドナー１図１３Ａ〜１３Ｌ）。図１３Ａ〜１３Ｘのそれぞれにつき凡例は同じである。２人の健康なドナー由来のＰＢＭＣの存在下における、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節、加えて、Ｔ３Ｍ４ｐｚｆｖ上でのＧＯ２ＴＣＢによるＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの放出によって測定された、腫瘍細胞の致死およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である（ドナー１図１３Ａ〜１３Ｌ）。図１３Ａ〜１３Ｘのそれぞれにつき凡例は同じである。２人の健康なドナー由来のＰＢＭＣの存在下における、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節、加えて、Ｔ３Ｍ４ｐｚｆｖ上でのＧＯ２ＴＣＢによるＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの放出によって測定された、腫瘍細胞の致死およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である（ドナー２図１３Ｍ〜１３Ｘ）。図１３Ａ〜１３Ｘのそれぞれにつき凡例は同じである。２人の健康なドナー由来のＰＢＭＣの存在下における、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節、加えて、Ｔ３Ｍ４ｐｚｆｖ上でのＧＯ２ＴＣＢによるＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの放出によって測定された、腫瘍細胞の致死およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である（ドナー２図１３Ｍ〜１３Ｘ）。図１３Ａ〜１３Ｘのそれぞれにつき凡例は同じである。ＰＢＭＣの存在下におけるＭＣＦ７ｃｓ上のＧＯ２ＴＣＢを用いたＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節によって測定された、腫瘍細胞の致死（図１４Ａ〜１４Ｂ）およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である（それぞれ図１４Ｃ〜１４Ｆ）。図１４Ａ〜１４Ｆのそれぞれにつき凡例は同じである。ＭＣＦ１０Ａ（ヒト非腫瘍形成性乳房上皮細胞株）（図１５Ａ）およびＨＢＥｐｉＣ（ヒト気管支上皮細胞）（図１５Ｂ）へのＧＯ２ＴＣＢおよびＨＭＦＧ１ＴＣＢの結合を示す図である。ＰＢＭＣの存在下における、ＭＣＦ１０Ａ細胞上のＧＯ２ＴＣＢおよびＨＭＦＧ１ＴＣＢによる、ＣＤ４Ｔ細胞（図１６Ｂ）およびＣＤ８Ｔ細胞（図１６Ｃ）上でのＣＤ２５の上方調節によって測定された、腫瘍細胞の致死（図１６Ａ）およびＴ細胞の活性化の誘導を示す図である。グリコペプチドがカップリングされたフローセルを通って流動するＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢのイラストである。ヒトおよびカニクイザル（cynomolgous）のグリコペプチドへのＧＯ２の結合を示すセンサーグラムである。ヒトおよびカニクイザルのグリコペプチドへのＧＯ２ＴＣＢの結合を示すセンサーグラムである。図１９Ａ〜Ｂ：ヒトおよびカニクイザルのグリコペプチドへのＧＯ２抗体の結合（結合活性）、および「見かけの」ＫＤの推測値を示す図である。図１９Ｃ〜Ｄ：ヒトおよびカニクイザルのグリコペプチドへのＧＯ２ＴＣＢの結合（結合活性）、および「見かけの」ＫＤの推測値を示す図である。

５．詳細な説明
５．１抗体
本発明者は、腫瘍細胞上に提示されるＭＵＣ１のグリコフォームに向けられた新規の抗体を開発した。これらは抗体５Ｆ７によって例示され、本明細書では「ＧＯ２」と称される。腫瘍細胞上に提示されるＭＵＣ１のグリコシル化パターンを模擬するように、精製された組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼであるポリペプチドのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１でグリコシル化された、ＭＵＣ１中に存在するタンデムリピートの１つ、ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ（配列番号５０）のグリコシル化された６０−ｍｅｒの代表的な３つのコピーに結合する抗体に関するスクリーニングでＧＯ２を同定した。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、抗体ＧＯ２によって例示され、がんの診断および療法におけるツールとして有用である。

したがって、特定の態様において、本開示は、腫瘍細胞上に提示されるＭＵＣ１のグリコフォーム（本明細書では「グリコＭＵＣ１」と称される）に、好ましくは、米国特許第６，４６５，２２０号明細書に記載される、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１でグリコシル化された６０−ｍｅｒのペプチド（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）_３（配列番号４７）に結合する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作された、および／またはそれ以外の方法で性質が改変されたものであってもよく、例えば、これらに限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン抗体などが挙げられる。様々な実施形態において、抗体は、抗体の定常領域の全部または一部を含む。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ_１またはＩｇＡ_２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４）、およびＩｇＭから選択されるアイソタイプである。具体的な実施形態において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、ＩｇＧ_１の定常領域のアイソタイプを含む。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、あらゆる真核、原核、またはファージクローンを含み、これらは、当業界において利用可能な、または公知のあらゆる手段によって単一のクローンから誘導される。本発明の開示において有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む当業界において公知の様々な技術を使用して調製することができる。ヒトにおける抗グリコＭＵＣ１抗体のインビボでの使用を含む本発明の開示の多くの使用において、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を、好適に使用することができる。

用語「キメラ」抗体は、本明細書で使用される場合、非ヒト免疫グロブリン、例えばラットまたはマウス抗体由来の可変配列と、典型的にはヒト免疫グロブリンテンプレートから選ばれるヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当業界において公知である。例えば、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221；Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202；米国特許第５，８０７，７１５号明細書；第４，８１６，５６７号明細書；および第４，８１６３９７号明細書を参照されたい。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むと予想される。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体ヒト化の方法は、当業界において公知である。例えば、全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7；Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号明細書；第５，５８５，０８９号明細書；第５，６９３，７６１号明細書；第５，６９３，７６２号明細書；および第６，１８０，３７０号明細書；欧州特許第２３９４００号明細書；ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；欧州特許第５９２１０６号明細書；欧州特許第５１９５９６号明細書；Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498；Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814；Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい。

「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、さらに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または１つまたは複数のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ方法などの当業界において公知の様々な方法によって作製することができる。これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第４，４４４，８８７号明細書および第４，７１６，１１１号明細書；ならびにＰＣＴ国際公開第９８／４６６４５号パンフレット；国際公開第９８／５０４３３号パンフレット；国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９８／１６６５４号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体はまた、機能的な内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用することにより産生することもできる。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；国際公開第９６／３４０９６号パンフレット；国際公開第９６／３３７３５号パンフレット；米国特許第５，４１３，９２３号明細書；第５，６２５，１２６号明細書；第５，６３３，４２５号明細書；第５，５６９，８２５号明細書；第５，６６１，０１６号明細書；第５，５４５，８０６号明細書；第５，８１４，３１８号明細書；第５，８８５，７９３号明細書；第５，９１６，７７１号明細書；および第５，９３９，５９８号明細書を参照されたい。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドされる選択」と称される技術を使用して生成することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体は、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするのに使用される（Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903を参照）。

「霊長類化抗体」は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む。霊長類化抗体を産生するための方法は、当業界において公知である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６５８，５７０号明細書；第５，６８１，７２２号明細書；および第５，６９３，７８０号明細書を参照されたい。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、全長（無傷）抗体分子と、グリコＭＵＣ１と結合することが可能な抗原結合フラグメントの両方を含む。抗原結合フラグメントの例としては、一例として、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメントおよび単一ドメインフラグメントが挙げられる。

Ｆａｂフラグメントは、軽鎖（ＣＬ）の定常ドメイン、および重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２ペプシン消化生成物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断によって産生される。抗体フラグメントの追加の化学的カップリングは、当業者公知である。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_１フラグメントは無傷抗体のＦｃフラグメントを欠き、無傷抗体より迅速に動物の循環から排除され、無傷抗体より少ない非特異的な組織結合を有する可能性がある（例えば、Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316を参照）。

「Ｆｖ」フラグメントは、完全な標的認識および結合部位を含有する抗体の最小フラグメントである。この領域は、しっかりとした非共有結合による会合での１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体）からなる。この立体配置で、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上の標的結合部位が規定される。しばしば６つのＣＤＲは、抗体に標的結合特異性を付与する。しかしながら、一部の場合において、単一の可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体より低い親和性ではあるが標的を認識してそれに結合する能力を有する場合がある。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗原結合フラグメントは、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含み、この場合、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが標的結合にとって望ましい構造を形成することを可能にする。

「単一ドメイン抗体」は、グリコＭＵＣ１に十分な親和性を示す単一のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインで構成される。具体的な実施形態において、単一ドメイン抗体は、ラクダ化抗体である（例えば、Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38を参照）。

また本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、二重特異性および他の多重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、同一または異なる抗原上の２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、多くの場合、ヒトまたはヒト化抗体抗体である。本発明の開示において、結合特異性の一方は、グリコＭＵＣ１に向けられていてもよく、他方は、他のあらゆる抗原、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来のタンパク質、ウイルスによってコードされたエンベロープタンパク質、細菌由来のタンパク質、または細菌表面タンパク質などに向けられていてもよい。特定の好ましい実施形態において、二重特異性および他の多重特異性を有する抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントは、第２のＭＵＣ１エピトープ、がん細胞上でＭＵＣ１と共発現される別のタンパク質上のエピトープ、または活性化Ｔ細胞などの異なる細胞上に存在する別のタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。本開示の二重特異性抗体は、ＩｇＧ様式の二重特異性抗体および単鎖ベースの二重特異性抗体を含む。

ＩｇＧ様式の本開示の二重特異性抗体は、当業界において公知の様々な種類のＩｇＧ様式の二重特異性抗体のいずれか、例えば、クアドローマ二重特異性抗体、「ノブ−イン−ホール（knobs-in-hole）」二重特異性抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体、電荷対を有する二重特異性抗体、一般的な軽鎖二重特異性抗体、１アームの単鎖Ｆａｂ−免疫グロブリンガンマ二重特異性抗体、ジスルフィドで安定化されたＦｖ二重特異性抗体、ＤｕｅｔＭａｂ、制御されたＦａｂアーム交換二重特異性抗体、鎖交換操作されたドメインボディの二重特異性抗体、２アームのロイシンジッパーヘテロ二量体モノクローナル二重特異性抗体、κλボディの二重特異性抗体、二重可変ドメイン二重特異性抗体、および交差二重可変ドメイン二重特異性抗体であってもよい。例えば、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497；Milstein and Cuello, 1983, Nature 305:537-40；Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9:617-621；Schaefer et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92；Gunasekaran et al., 2010, J Biol Chem 285:19637-46；Fischer et al., 2015 Nature Commun 6:6113；Schanzer et al., 2014, J Biol Chem 289:18693-706；Metz et al., 2012 Protein Eng Des Sel 25:571-80；Mazor et al., 2015 MAbs 7:377-89；Labrijn et al., 2013 Proc Natl Acad Sci USA 110:5145-50；Davis et al., 2010 Protein Eng Des Sel 23:195-202；Wranik et al., 2012, J Biol Chem 287:43331-9；Gu et al., 2015, PLoS One 10(5):e0124135；Steinmetz et al., 2016, MAbs 8(5):867-78；Klein et al., 2016, mAbs, 8(6):1010-1020；Liu et al., 2017, Front. Immunol. 8:38；およびYang et al., 2017, Int. J. Mol. Sci. 18:48を参照されたい。

一部の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂである。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術は、この参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／０８０２５１号パンフレット、国際公開第２００９／０８０２５２号パンフレット、国際公開第２００９／０８０２５３号パンフレット、国際公開第２００９／０８０２５４号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、国際公開第２０１６／０２０３０９号パンフレット、およびSchaefer et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92で詳細に記載されている。簡単に言えば、ＣｒｏｓｓＭａｂ技術は、正しい鎖会合を促進する二重特異性ＩｇＧの１つのＦａｂアーム内の重鎖と軽鎖との間のドメインの交差に基づく。本開示のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体の一方のアームのＦａｂ部分の重鎖および軽鎖が交換されている「ＣｒｏｓｓＭａｂ^ＦＡＢ」抗体であってもよい。他の実施形態において、本開示のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体の一方のアームのＦａｂ部分の重鎖および軽鎖の可変ドメインのみが交換されている「ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ−ＶＬ}」抗体であってもよい。さらに他の実施形態において、本開示のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体の一方のアームのＦａｂ部分の重鎖および軽鎖の定常ドメインのみが交換されている「ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１−ＣＬ}」抗体であってもよい。ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１−ＣＬ}抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ^ＦＡＢおよびＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ−ＶＬ}とは対照的に、予測された副産物を有さず、それゆえに、一部の実施形態において、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１−ＣＬ}二重特異性抗体が好ましい。Klein et al., 2016, mAbs, 8(6):1010-1020を参照されたい。本開示のＣｒｏｓｓＭａｂのさらなる実施形態は、セクション５．２で後述される。

一部の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、制御されたＦａｂアーム交換二重特異性抗体である。Ｆａｂアーム交換二重特異性抗体を作製するための方法は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ国際公開第２０１１／１３１７４６号パンフレットおよびLabrijn et al., 2014 Nat Protoc. 9(10):2450-63に記載されている。簡単に言えば、制御されたＦａｂアーム交換二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメイン中に単一の一致する点突然変異を含有する２つの親ＩｇＧ１を別々に発現させること、インビトロで、酸化還元条件下で親ＩｇＧ１を混合して、半分の分子の組換えを可能にすること、および還元体を除去して鎖間のジスルフィド結合を再酸化し、それにより二重特異性抗体を形成することによって作製することができる。

本開示の二重特異性抗体は、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含んでいてもよい。一実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメインである。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（ＫａｂａｔＥＵインデックスの番号付け）を含むＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボにおいてＩｇＧ_４抗体のＦａｂアーム交換を低減させる（Stubenrauch et al., 2010, Drug Metabolism and Disposition 38:84-91を参照）。さらなる特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。よりさらに特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号４２に示される。

特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も大規模なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＣＨ３ドメイン中にある。したがって、一実施形態において、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中にある。

具体的な実施形態において、前記Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する改変は、いわゆる「ノブ−イントゥー−ホール（knob-into-hole）」改変であり、これは、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」の改変、およびＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（whole）」の改変を含む。ノブ−イントゥー−ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第７，６９５，９３６号明細書；Ridgway et al., 1996, Prot Eng 9:617-621、およびCarter, J, 2001, Immunol Meth 248:7-15に記載されている。一般的に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように、突起部が空洞に入ることができるように、第１のポリペプチドの境界に突起部（「ノブ」）、および第２のポリペプチドの境界に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。突起部は、第１のポリペプチドの境界からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの境界に、突起部と同一または類似のサイズを有するそれに見合った空洞が作り出される。

したがって、一部の実施形態において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基を、より大きい側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えることによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に入ることができる突起部が生じ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中のアミノ酸残基を、より小さい側鎖の体積を有するアミノ酸残基で置き換えることによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起部を入れることができる空洞が生じる。好ましくは、より大きい側鎖の体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。好ましくは、より小さい側鎖の体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）からなる群から選択される。突起部および空洞は、例えば部位特異的突然変異誘発によってポリペプチドをコードする核酸を変更することにより、またはペプチド合成により作製することができる。例示的な置換は、Ｙ４７０Ｔである。

特定のこのような実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位におけるスレオニン残基は、トリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位におけるチロシン残基は、バリン残基で置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択で３６６位におけるスレオニン残基は、セリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位におけるロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、加えて、３５４位におけるセリン残基は、システイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、または３５６位におけるグルタミン酸残基は、システイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位におけるセリン残基は、システイン残基で置き換えられている）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、加えて、３４９位におけるチロシン残基は、システイン残基によって置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施形態において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

一部の実施形態において、固定のステアリング（例えば、Gunasekaran et al., 2010, J Biol Chem 285(25):19637-46に記載される通り）を使用して、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進することができる。

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態において、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、およびサイトカイン分泌の群から選択される１つまたは複数である。特定の実施形態において、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。

典型的には、同じ１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。一実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を低減する。一実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、または少なくとも１０分の１にする。

一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。このような実施形態の一つにおいて、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。一実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７およびＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施形態において、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓである。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４およびＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。より特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」または「ＬＡＬＡＰＧ」）。具体的には、特定の実施形態において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む（ＫａｂａｔＥＵインデックスの番号付け）、すなわち、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットのそれぞれにおいて、２３４位におけるロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位におけるロイシン残基は、アラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位におけるプロリン残基は、グリシン残基によって置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。このような実施形態の一つにおいて、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。

本開示の単鎖ベースの二重特異性抗体は、当業界において公知の様々な種類の単鎖ベースの二重特異性抗体、例えば二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）（二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体）、ダイアボディ、タンデム（tandam）ダイアボディ（ｔａｎｄａｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ：dual-affinity retargeting molecule）、および二重特異性キラー細胞誘導体のいずれかであり得る。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Loffler et al., 2000, Blood 95:2098-103；Holliger et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90:6444-8；Kipriyanov et al., 1999, Mol Biol 293:41-56；Johnson et al., 2010, Mol Biol 399:436-49；Wiernik et al., 2013, Clin Cancer Res 19:3844-55；Liu et al., 2017, Front. Immunol. 8:38；およびYang et al., 2017, Int. J. Mol. Sci. 18:48を参照されたい。

一部の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）である。ＢｉＴＥは、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子であり、抗原結合ドメインの一方がＴ細胞抗原に結合し、第２の抗原結合ドメインが標的の表面上に提示される抗原に結合する（参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ国際公開第０５／０６１５４７号パンフレット；Baeuerle et al., 2008, Drugs of the Future 33: 137-147；Bargou, et al., 2008, Science 321:974-977を参照）。したがって、本開示のＢｉＴＥは、Ｔ細胞抗原に結合する抗原結合ドメイン、およびグリコＭＵＣ１に向けられた第２の抗原結合ドメインを有する。

一部の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）である。ＤＡＲＴは、会合して（特に共有結合による相互作用を介して）少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含み、これらのエピトープ結合部位は、同一のエピトープを認識してもよいし、または異なるエピトープを認識してもよい。ＤＡＲＴのポリペプチド鎖のそれぞれは、免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域は、相互作用してエピトープ結合部位を形成しない。そうではなく、ＤＡＲＴポリペプチド鎖の一方の（例えば、第１の）免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば、第２の）ＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。同様に、ＤＡＲＴポリペプチド鎖の一方の（例えば、第１の）の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ＤＡＲＴポリペプチド鎖の異なる（例えば、第２の）免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴは、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであってもよく、したがって、１、２、３またはそれより多くの異なるエピトープ（これらは、同じまたは異なる抗原のものであってもよい）と同時に結合することができる。ＤＡＲＴは、加えて、１価、２価、３価、４価、５価、６価などであってもよく、したがって、１、２、３、４、５、６つまたはそれより多くの分子と同時に結合することができる。ＤＡＲＴのこれら２つの特性（すなわち、特異性の程度および原子価を組み合わせて、例えば、４価の（すなわち、エピトープの４つのセットと結合することが可能な）二重特異性抗体（すなわち、２つのエピトープと結合することが可能な）などを産生することができる。ＤＡＲＴ分子は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ国際公開第２００６／１１３６６５号パンフレット、国際公開第２００８／１５７３７９号パンフレット、および国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレットに開示されている。

本開示の二重特異性抗体の一部の実施形態において、結合特異性の１つは、グリコＭＵＣ１に向けられ、他方は、免疫エフェクター細胞上で発現される抗原に向けられる。用語「免疫エフェクター細胞」または「エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、活性化されて標的細胞の生存能に影響を与えることができる、哺乳類免疫系中の細胞の天然レパートリー内の細胞を指す。免疫エフェクター細胞としては、リンパ球系細胞、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＢ細胞が挙げられることに加えて、単球またはマクロファージ、樹状細胞および好中性顆粒球などの骨髄系細胞も、免疫エフェクター細胞とみなすことができる。したがって、前記エフェクター細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球である。異常な細胞へのエフェクター細胞の補充は、エフェクター細胞が、それらが補充される異常な細胞を直接致死させるか、またはその致死を間接的に開始させることができるように、免疫エフェクター細胞が、異常な標的細胞に近接して取り込まれることを意味する。非特異的な相互作用を回避するために、本開示の二重特異性抗体は、体内の他の細胞と比較して、これらの免疫エフェクター細胞によって少なくとも過剰発現される免疫エフェクター細胞上の抗原を特異的に認識することが好ましい。免疫エフェクター細胞上に提示される標的抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６を挙げることができる。好ましくは、免疫エフェクター細胞上の抗原は、Ｔ細胞上で発現されるＣＤ３である。

「ＣＤ３」は、本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）およびげっ歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のあらゆる天然ＣＤ３を指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＣＤ３に加えて、細胞中でのプロセシングに起因するＣＤ３のあらゆる形態を包含する。この用語はまた、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。免疫エフェクター細胞上の最も好ましい抗原は、ＣＤ３イプシロン鎖である。この抗原は、異常な細胞へのＴ細胞の補充において非常に有効であることが示されている。したがって、本開示の二重特異性抗体は、好ましくは、ＣＤ３イプシロンを特異的に認識する。ヒトＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（www.uniprot.org）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、またはＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/）ＲｅｆＳｅｑＮＰ＿０００７２４．１で示される。カニクイザル［カニクイザル（Macaca fascicularis）］ＣＤ３イプシロンのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１で示される。ヒトの治療的使用の場合、ＣＤ３結合ドメインがヒトＣＤ３（例えば、ヒトＣＤ３イプシロン鎖）に特異的に結合する二重特異性抗体が使用される。非ヒト動物や細胞株における前臨床試験の場合、前臨床試験に利用される種（例えば、霊長類の試験の場合、カニクイザルＣＤ３）においてＣＤ３結合ドメインがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を使用することができる。

本明細書で使用される場合、特定の種由来の標的抗原に「特異的に結合する」またはそれを「特異的に認識する」結合ドメインは、他の種由来の抗原への結合またはその認識を除外せず、したがって、結合ドメインの１つまたは複数が種間の交差反応性を有する抗体を包含する。例えば、ヒトＣＤ３に「特異的に結合する」またはそれを「特異的に認識する」ＣＤ３結合ドメインはまた、カニクイザル（cyomolgus）ＣＤ３に結合する、またはそれを認識することもでき、逆もまた同様である。

一部の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープとの結合に関して、モノクローナル抗体Ｈ２Ｃ（ＰＣＴ国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載される）と競合することができる。他の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープとの結合に関して、モノクローナル抗体Ｖ９（Rodrigues et al., 1992, Int J Cancer Suppl 7:45-50および米国特許第６，０５４，２９７号明細書に記載される）と競合することができる。さらに他の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープとの結合に関して、モノクローナル抗体ＦＮ１８（Nooij et al., 1986, Eur J Immunol 19:981-984に記載される）と競合することができる。さらに他の実施形態において、本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープとの結合に関して、モノクローナル抗体ＳＰ３４（Pessano et al., 1985, EMBO J 4:337-340に記載される）と競合することができる。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、誘導体化された抗体を含む。例えば、ただし限定されないが、誘導体化された抗体は、典型的には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解による切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結によって改変される。様々な化学修飾のいずれも、これらに限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などの公知の技術によって行うことができる。加えて、誘導体は、例えばａｍｂｒｘの技術を使用して、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含有していてもよい（例えば、Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2を参照）。

抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントは、少なくとも１つの定常領域が媒介する生物学的なエフェクター機能を変更するようにその配列が改変されている抗体またはフラグメントであり得る。例えば、一部の実施形態において、抗グリコＭＵＣ１抗体は、改変されていない抗体と比べて、少なくとも１つの定常領域が媒介する生物学的なエフェクター機能を低減するように改変されてもよく、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減するように改変される。ＦｃγＲへの結合は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって低減させることができる（例えば、Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491；およびLund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662を参照）。抗体のＦｃγＲ結合能の低減はまた、ＦｃγＲ相互作用を頼る他のエフェクター機能、例えばオプソニン化、貪食および抗原依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）も低減することができる。

本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントは、少なくとも１つの定常領域が媒介する生物学的なエフェクター機能を獲得するか、または改変されていない抗体に比べて改善する、例えば、ＦｃγＲ相互作用を強化するように改変された抗体および／または結合フラグメントを含む（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号明細書を参照）。例えば、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、対応する野生型定常領域より大きい親和性でＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡと結合する定常領域を有していてもよい。

したがって、本開示の抗体は、オプソニン化、貪食、またはＡＤＣＣの増加または減少を引き起こす生物学的活性における変更を有していてもよい。このような変更は、当業界において公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低減する抗体における改変は、米国特許第５，８３４，５９７号明細書に記載されている。例示的なＡＤＣＣを低下させるバリアントは、残基２３６が欠失し、残基２３４、２３５および２３７（ＥＵの番号付けを使用）がアラニンで置換された「突然変異体３」に相当する（米国特許第５，８３４，５９７号明細書の図４に示される）。

一部の実施形態において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、低いレベルのフコースを有するか、またはフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、特に低用量の抗体で、ＡＤＣＣ活性の強化との相関が示されている。Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73を参照されたい。フコースが少ない抗体を調製する方法としては、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）での増殖が挙げられる。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８ｍＲＮＡを低いレベルで発現する。

さらに別の態様において、抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントは、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることによって、胎児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎへのその結合親和性を増加または減少させる改変を含む（例えば、国際公開第２００５／１２３７８０号パンフレットを参照）。特定の実施形態において、ＩｇＧクラスの抗グリコＭＵＣ１抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４、および４２８の少なくとも１つが、例えば２５０および４２８位、または２５０および３１４位、または３１４および４２８位、または２５０、３１４、および４２８位で、単独で、またはそれらのいずれかの組合せで置換されるように突然変異しており、具体的な組合せは２５０および４２８位である。２５０位の場合、置換されるアミノ酸残基は、スレオニン以外のいずれのアミノ酸残基であってもよく、例えば、これらに限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシンなどであってもよい。３１４位の場合、置換されるアミノ酸残基は、ロイシン以外のいずれのアミノ酸残基であってもよく、例えば、これらに限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンなどであってもよい。４２８位の場合、置換されるアミノ酸残基は、メチオニン以外のいずれのアミノ酸残基であってもよく、例えば、これらに限定されないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシンなどであってもよい。好適なアミノ酸置換の具体的な組合せは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，２１７，７９７号明細書の表１で特定されている。このような突然変異は、ＦｃＲｎへの結合を増加させ、それにより抗体を分解から保護し、その半減期を増加させる。

さらに他の態様において、本開示の抗原結合フラグメントの抗グリコＭＵＣ１抗体は、例えばJung and Pluckthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966；Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug. 17；および米国特許出願第２００７／０２８０９３１号明細書に記載されるように、その高度可変領域の１つまたは複数に挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有する。

診断適用に特に有用なさらに他の態様において、本開示の抗原結合フラグメントの抗グリコＭＵＣ１抗体は、検出可能な部分に取り付けられている。検出可能な部分としては、放射性部分、比色分子、蛍光部分、化学発光部分、抗原、酵素、検出可能なビーズ（例えば磁気または高電子密度（例えば、金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン））が挙げられる。

放射性同位体または放射性核種は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉを挙げることができる。

蛍光標識としては、ローダミン、ランタニド蛍光、フルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（ＧＦＰは「ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ（緑色蛍光タンパク質）」を表す）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（phthaldehyde）、およびフルオレサミンを挙げることができる。

酵素標識としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」）、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼを挙げることができる。

化学発光標識または化学発光物質（chemiluminescer）、例えばイソルミノール、ルミノールおよびジオキセタン

他の検出可能な部分としては、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンなどの分子が挙げられる。

特定の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、ＧＯ２またはＧＯ２の重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体もしくは抗原結合フラグメント（それぞれ配列番号３および４）と競合する。

競合は、ＧＯ２と結合するグリコＭＵＣ１エピトープを発現する細胞で、またはＧＯ２と結合するエピトープを含有するグリコシル化ＭＵＣ１ペプチド、例えば、米国特許第６，４６５，２２０号明細書に記載される、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１でグリコシル化された６０−ｍｅｒのペプチド（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）_３でアッセイすることができる。対照として、エピトープを発現しない細胞またはグリコシル化されていないペプチドを使用することができる。

競合アッセイを行うことができる細胞としては、これらに限定されないが、乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄ、およびグリコＭＵＣ１エピトープを発現するように操作される組換え細胞が挙げられる。１つの非限定的な例において、ＣＨＯＩｄＩＤ細胞は、ＵＤＰ−Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃエピメラーゼを欠き、それぞれＧａｌＮＡｃおよびＧａｌの外因性の付加の非存在下でＧａｌＮＡｃのＯ−グリコシル化およびガラクトシル化が不十分なものであり、これは、ＭＵＣ１を発現するように操作され、ＧａｌＮＡｃの非存在または存在下で増殖し、後者の場合、ＧＯ２が結合するＭＵＣ１のＴｎグリコフォームを発現する細胞を生じる。ＭＵＣ１のグリコシル化されていない形態を発現する細胞は、陰性対照として使用することができる。

競合に関するアッセイとしては、これらに限定されないが、放射活性物質標識によるイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイおよびＢｉａｃｏｒｅアッセイが挙げられる。

参照抗体と試験抗体との間の抗体競合アッセイ（種またはアイソタイプに関わりなく）を実行することにおいて、最初に、後続の同定が可能になるように、検出可能な標識、例えばフルオロフォア、ビオチンまたは酵素標識（または放射性標識でも）で参照を標識してもよい。この場合、グリコＭＵＣ１を発現する細胞は、標識されていない試験抗体とインキュベートされ、標識された参照抗体が添加され、結合した標識の強度が測定される。試験抗体が、オーバーラップするエピトープに結合することによって標識された参照抗体と競合する場合、強度は、試験抗体なしで行われた対照反応と比較して減少すると予想される。

このアッセイの具体的な実施形態において、アッセイ条件（例えば、特定された細胞密度）下における最大の結合の８０％をもたらす標識された参照抗体の濃度（「ｃｏｎｃ_８０％」）がまず決定され、競合アッセイは、標識されていない試験抗体の１０×ｃｏｎｃ_８０％および標識された参照抗体のｃｏｎｃ_８０％行われる。

阻害は、阻害定数、またはＫ_ｉとして表すことができ、これは、以下の式：
Ｋ_ｉ＝ＩＣ_５０／（１＋［参照Ａｂ濃度］／Ｋ_ｄ）
に従って計算され、式中、ＩＣ_５０は、参照抗体の結合の５０％低減をもたらす試験抗体の濃度であり、Ｋ_ｄは、参照抗体の解離定数であり、これは、グリコＭＵＣ１に対するその親和性の尺度である。本明細書で開示される抗グリコＭＵＣ１抗体と競合する抗体は、本明細書に記載されるアッセイ条件下で、１０ｐＭから１０ｎＭのＫ_ｉを有し得る。

様々な実施形態において、使用される特定のアッセイ条件下で最大の結合の８０％である参照抗体濃度、および参照抗体濃度の１０倍高い試験抗体濃度で、少なくとも約２０％またはそれより多く、例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくはそれよりさらに多く、または前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージで、試験抗体が参照抗体の結合を減少させる場合、試験抗体は参照抗体と競合するとみなされる。

競合アッセイの一例では、グリコシル化ＭＵＣ１である６０−ｍｅｒのペプチドを、プレートをペプチドの溶液と接触させることによって（例えば、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩）、固体表面、例えばマイクロウェルプレート上に接着させる。プレートを洗浄し（例えば、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、ブロックする（例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬで）。ＥＬＩＳＡ緩衝液（例えば、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中の飽和未満の量のビオチン化ＧＯ２（例えば、８０ｎｇ／ｍＬの濃度での）および連続希釈した（例えば、２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬ、または２５μｇ／ｍＬの濃度での）標識されていないＧＯ２（「参照」抗体）または競合する抗グリコＭＵＣ１抗体（「試験」抗体）抗体の混合物をウェルに添加し、プレートを穏やかに振盪しながら１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、各ウェルにＥＬＩＳＡ緩衝液で希釈した１μｇ／ｍＬのＨＲＰがコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加し、プレートを１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、基質（例えば、ＴＭＢ、ＢｉｏｆｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．、ＯｗｉｎｇｓＭｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって結合した抗体を検出した。停止緩衝液（例えば、ＢｉｏＦＸＳｔｏｐ試薬、ＢｉｏｆｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．、ＯｗｉｎｇｓＭｉｌｌｓ、ＭＤ）の添加によって反応を止め、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、吸光度を６５０ｎｍで測定する。

ＧＯ２と別の抗グリコＭＵＣ１抗体との競合を試験するのに、この競合アッセイにおけるバリエーションも使用することができる。例えば、特定の態様において、抗グリコＭＵＣ１抗体は参照抗体として使用され、ＧＯ２は試験抗体として使用される。加えて、グリコシル化ＭＵＣ１である６０−ｍｅｒのペプチドの代わりに、培養中に細胞表面上で（例えば上述の細胞型の１つの表面上で）発現される膜結合型グリコＭＵＣ１を使用してもよい。一般的に、約１０^４から１０^６個の形質転換体、例えば、約１０^５個の形質転換体が使用される。競合アッセイの他の様式は当業界において公知であり、採用することができる。

様々な実施形態において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、抗グリコＭＵＣ１抗体が、０．０８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの濃度で、または前述の値のいずれかの間の範囲の濃度で（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で）使用される場合、標識されたＧＯ２の結合を、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージで低減させる（例えば、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、標識されたＧＯ２の結合を、５０％から７０％低減させる）。

他の実施形態において、ＧＯ２が、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬの濃度で、または前述の値のいずれかの間の範囲の濃度で（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で）使用される場合、ＧＯ２は、本開示の標識された抗グリコＭＵＣ１抗体の結合を、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または前述の値のいずれかの間の範囲のパーセンテージで低減させる（例えば、ＧＯ２は、本開示の標識された抗グリコＭＵＣ１抗体の結合を、５０％から７０％低減させる）。

前述のアッセイにおいて、ＧＯ２抗体は、ＧＯ２のＣＤＲまたは重鎖および軽鎖可変領域を含むあらゆる抗体または抗原結合フラグメント、例えばＧＯ２のヒト化またはキメラカウンターパートで置き換えることができる。

特定の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、表１に記載の重鎖および／または軽鎖可変配列を含む（またはヌクレオチド配列によってコードされる）。他の態様において、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントは、表１に記載の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列を含む（またはヌクレオチド配列によってコードされる）。このような抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントのフレームワーク配列は、表１に記載の天然マウスフレームワーク配列であってもよいし、または非天然（例えば、ヒト化またはヒト）フレームワーク配列であってもよい。

さらに他の態様において、本開示は、それぞれ配列番号３および４と少なくとも９５％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域を有する抗ＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを提供する。

５．２抗グリコＭＵＣ１および抗ＣＤ３二重特異性抗体
一部の態様において、本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ３（例えば、表４に記載のＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬを含むもの）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびグリコＭＵＣ１に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含んでいてもよい。第２の抗原結合ドメインは、上記でグリコＭＵＣ１抗体に関して記載された特徴を、単独で、または組み合わせて含んでいてもよい（例えば、表１〜３で同定されたＣＤＲの組合せ、例えば下記の番号付けされた実施形態３から１７に記載のＣＤＲ組合せのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＤＲの組合せ、または表１で特定されたＶＨおよびＶＬ配列を含む）。

一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、例えば番号付けされた実施形態３から１７に記載のＣＤＲ組合せのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＤＲ、例えば（ｉ）配列番号５の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ）１、配列番号９のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合し、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｉｉ）グリコＭＵＣ１に特異的に結合し、（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、より好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、より好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、より好ましくは配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、より好ましくは配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、第２の抗原結合ドメイン
を含む。

一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。

一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号４０の重鎖可変領域配列および配列番号４１の軽鎖可変領域配列を含む。

一部の実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。

一部の実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号３の重鎖可変領域配列および配列番号４の軽鎖可変領域配列を含む。

一部の実施形態において、第１および／または第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変または定常領域のいずれかが交換されている交差Ｆａｂ分子である。このような実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、好ましくは、従来のＦａｂ分子である。

一部の実施形態において、二重特異性抗体の第１および第２の抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの一方（特に第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、
ｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｉｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

二重特異性抗体は、ｉ）およびｉｉ）で述べる改変の両方を含まない。ＶＨ／ＶＬの交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられていない（すなわち、それらは交換されないままである）。

より具体的な実施形態において、
ｉ）第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｉｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

このような実施形態の一つにおいて、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

さらなる実施形態において、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

特定の実施形態において、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

さらに特定の実施形態において、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

よりさらに特定の実施形態において、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

特定の実施形態において、上記の実施形態によるアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１においてなされる場合、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプの定常ドメインＣＬである。

一部の実施形態において、第１および第２の抗原結合ドメインは、任意選択でペプチドリンカーを介して、互いに融合している。

一部の実施形態において、第１および第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているかのいずれかである。

一部の実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ３への１価の結合を提供する。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する単一の抗原結合ドメイン、およびグリコＭＵＣ１に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。したがって、一部の実施形態において、二重特異性抗体は、グリコＭＵＣ１に特異的に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、第３の抗原部分は、第１の抗原結合ドメインと同一である（例えば、Ｆａｂ分子でもあり、同じアミノ酸配列を含む）。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをさらに含む。一実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメインである。特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４Ｆｃドメインである（ＫａｂａｔＥＵインデックスの番号付け）。さらなる特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。よりさらに特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号４２に示される。

一部の実施形態において、第１、第２、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているかのいずれかであり；（ｂ）第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。

特定の実施形態において、Ｆｃドメインは、例えば、セクション５．１に記載される通り、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、例えばセクション５．１に記載されるような、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、
（ｉ）ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、交差Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変または定常領域のいずれか、特に可変領域は、交換されている、第１の抗原結合ドメイン；
（ｉｉ）グリコＭＵＣ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインであって、配列番号５の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、第２および第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、特に従来のＦａｂ分子である、第２および第３の抗原結合ドメイン；
（ｉｉｉ）安定な会合が可能な、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含み、
第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。

一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。

一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号４０の重鎖可変領域配列および配列番号４１の軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態において、第２および第３の抗原結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む。好ましくは、抗原結合ドメインは、番号付けされた実施形態３から１７に記載のＣＤＲ組合せのいずれかのアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。一実施形態において、第２および第３の抗原結合ドメインは、配列番号３の重鎖可変領域および配列番号４の軽鎖可変領域を含む。

上記の実施形態によるＦｃドメインは、Ｆｃドメインに関して上記で説明した特徴の全てを単独で、または組み合わせて含んでいてもよい。

一部の実施形態において、抗原結合ドメインおよびＦｃ領域は、ペプチドリンカーによって、例えば配列番号４５および配列番号４６におけるようなペプチドリンカーによって、互いに融合している。

一実施形態において、（ｉｉ）の第２および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）で、特にアルギニン（Ｒ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（ｉｉ）の第２および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）。

一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号４３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド（好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む）、配列番号４４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド（好ましくは、表４に記載のＣＤ３重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む）、配列番号４５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド（好ましくは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む）、および配列番号４６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド（好ましくは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む）を含む。

一実施形態において、二重特異性抗体は、配列番号４３の配列を含むポリペプチド（特に２つのポリペプチド）、配列番号４４の配列を含むポリペプチド、配列番号４５の配列を含むポリペプチド、および配列番号４６の配列を含むポリペプチドを含む。

５．３抗体−薬物コンジュゲート
本開示の別の態様は、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメントを含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。ＡＤＣは、一般的に、１つまたは複数のリンカーを介して１つまたは複数の細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質がそれに連結された、本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体および／または結合フラグメントを含む。具体的な実施形態において、ＡＤＣは、構造式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］_ｎ−Ａｂ
による化合物またはその塩であり、式中、各「Ｄ」は、それぞれ独立して、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質（「薬物」）を表し；各「Ｌ」は、それぞれ独立して、リンカーを表し；「Ａｂ」は、抗グリコＭＵＣ１抗原結合ドメイン、例えば本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントを表し；各「ＸＹ」は、リンカー上の官能基Ｒ^ｘと抗体上の「相補的」官能基Ｒ^ｙとの間で形成された連結を表し、ｎは、ＡＤＣに連結された薬物の数、またはＡＤＣの薬物対抗体の比率（ＤＡＲ）を表す。

ＡＤＣを含み得る様々な抗体（Ａｂ）の具体的な実施形態は、上述した抗グリコＭＵＣ１抗体および／または結合フラグメントの様々な実施形態を含む。

構造式（Ｉ）のＡＤＣおよび／または塩の一部の具体的な実施形態において、各Ｄが同じであり、および／または各Ｌが同じである。

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣを構成し得る細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質（Ｄ）およびリンカー（Ｌ）に加えて、ＡＤＣに連結された多数の細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質の具体的な実施形態を、以下でより詳細に説明する。

５．３．１．細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質
細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、細胞、特にがんおよび／または腫瘍細胞の増殖および／または複製を阻害する、および／またはそのような細胞を致死させることがわかっているあらゆる薬剤であり得る。細胞傷害性および／または細胞増殖抑制特性を有する多数の薬剤が文献公知である。細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質のクラスの非限定的な例としては、一例として、これらに限定されないが、放射性核種、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＤＮＡ挿入剤（例えば、副溝結合剤、例えば副溝バインダー）、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗物質、細胞周期モジュレーター、キナーゼ阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ミトコンドリア阻害剤、および抗有糸分裂剤が挙げられる。

これらの様々なクラスのうち特定のものの範囲内の薬剤の具体的な非限定的な例を以下に示す。

アルキル化剤：アサレー（asaley）（（Ｌ−ロイシン、Ｎ−［Ｎ−アセチル−４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノ］−ＤＬ−フェニルアラニル］−、エチルエステル；ＮＳＣ１６７７８０；ＣＡＳ登録番号３５７７８９７））；ＡＺＱ（（１，４−シクロヘキサジエン−１，４−ジカルバミン酸、２，５−ビス（１−アジリジニル）−３，６−ジオキソ−、ジエチルエステル；ＮＳＣ１８２９８６；ＣＡＳ登録番号５７９９８６８２））；ＢＣＮＵ（（Ｎ，Ｎ’−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソウレア；ＮＳＣ４０９９６２；ＣＡＳ登録番号１５４９３８））；ブスルファン（１，４−ブタンジオールジメタンスルホネート；ＮＳＣ７５０；ＣＡＳ登録番号５５９８１）；（カルボキシフタラト）白金（ＮＳＣ２７１６４；ＣＡＳ登録番号６５２９６８１３）；ＣＢＤＣＡ（（ｃｉｓ−（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）ジアンミン白金（ＩＩ））；ＮＳＣ２４１２４０；ＣＡＳ登録番号４１５７５９４４））；ＣＣＮＵ（（Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ’−シクロヘキシル−Ｎ−ニトロソウレア；ＮＳＣ７９０３７；ＣＡＳ登録番号１３０１０４７４））；ＣＨＩＰ（イプロプラチン；ＮＳＣ２５６９２７）；クロラムブシル（ＮＳＣ３０８８；ＣＡＳ登録番号３０５０３３）；クロロゾトシン（（２−［［［（２−クロロエチル）ニトロソアミノ］カルボニル］アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース；ＮＳＣ１７８２４８；ＣＡＳ登録番号５４７４９９０５））；シスプラチン（シスプラチン；ＮＳＣ１１９８７５；ＣＡＳ登録番号１５６６３２７１）；クロメソン（clomesone）（ＮＳＣ３３８９４７；ＣＡＳ登録番号８８３４３７２０）；シアノモルホリノドキソルビシン（ＮＣＳ３５７７０４；ＣＡＳ登録番号８８２５４０７３）；シクロジソン（cyclodisone）（ＮＳＣ３４８９４８；ＣＡＳ登録番号９９５９１７３８）；ジアンヒドロガラクチトール（５，６−ジエポキシズルシトール；ＮＳＣ１３２３１３；ＣＡＳ登録番号２３２６１２０３）；フルオロドパン（fluorodopan）（（５−［（２−クロロエチル）−（２−フルオロエチル）アミノ］−６−メチル−ウラシル；ＮＳＣ７３７５４；ＣＡＳ登録番号８３４９１３）；ヘプスルファム（ＮＳＣ３２９６８０；ＣＡＳ登録番号９６８９２５７８）；ヒカントン（ＮＳＣ１４２９８２；ＣＡＳ登録番号２３２５５９３８）；メルファラン（ＮＳＣ８８０６；ＣＡＳ登録番号３２２３０７２）；メチルＣＣＮＵ（（１−（２−クロロエチル）−３−（ｔｒａｎｓ−４−メチルシクロヘキサン）−１−ニトロソウレア；ＮＳＣ９５４４１；１３９０９０９６）；マイトマイシンＣ（ＮＳＣ２６９８０；ＣＡＳ登録番号５００７７）；ミトゾロミド（mitozolamide）（ＮＳＣ３５３４５１；ＣＡＳ登録番号８５６２２９５３）；ナイトロジェンマスタード（（ビス（２−クロロエチル）メチルアミンヒドロクロリド；ＮＳＣ７６２；ＣＡＳ登録番号５５８６７）；ＰＣＮＵ（（１−（２−クロロエチル）−３−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジル）−１−ニトロソウレア；ＮＳＣ９５４６６；ＣＡＳ登録番号１３９０９０２９））；ピペラジンアルキル化薬（（１−（２−クロロエチル）−４−（３−クロロプロピル）−ピペラジンジヒドロクロリド；ＮＳＣ３４４００７））；ピペラジンジオン（ＮＳＣ１３５７５８；ＣＡＳ登録番号４１１０９８０２）；ピポブロマン（（Ｎ，Ｎ−ビス（３−ブロモプロピオニル）ピペラジン；ＮＳＣ２５１５４；ＣＡＳ登録番号５４９１１））；ポルフィロマイシン（Ｎ−メチルマイトマイシンＣ；ＮＳＣ５６４１０；ＣＡＳ登録番号８０１５２５）；スピロヒダントインマスタード（ＮＳＣ１７２１１２；ＣＡＳ登録番号５６６０５１６４）；テロキシロン（teroxirone）（トリグリシジルイソシアヌレート；ＮＳＣ２９６９３４；ＣＡＳ登録番号２４５１６２９）；テトラプラチン（ＮＳＣ３６３８１２；ＣＡＳ登録番号６２８１６９８２）；チオテパ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ−１，２−エタンジイルチオホスホルアミド；ＮＳＣ６３９６；ＣＡＳ登録番号５２２４４）；トリエチレンメラミン（ＮＳＣ９７０６；ＣＡＳ登録番号５１１８３）；ウラシルナイトロジェンマスタード（デスメチルドパン（desmethyldopan）；ＮＳＣ３４４６２；ＣＡＳ登録番号６６７５１）；Ｙｏｓｈｉ−８６４（（ビス（３−メシルオキシプロピル）アミンヒドロクロリド；ＮＳＣ１０２６２７；ＣＡＳ登録番号３４５８２２８）。

トポイソメラーゼＩ阻害剤：カンプトテシン（ＮＳＣ９４６００；ＣＡＳ登録番号７６８９−０３−４）；様々なカンプトテシン誘導体および類似体（例えば、ＮＳＣ１００８８０、ＮＳＣ６０３０７１、ＮＳＣ１０７１２４、ＮＳＣ６４３８３３、ＮＳＣ６２９９７１、ＮＳＣ２９５５００、ＮＳＣ２４９９１０、ＮＳＣ６０６９８５、ＮＳＣ７４０２８、ＮＳＣ１７６３２３、ＮＳＣ２９５５０１、ＮＳＣ６０６１７２、ＮＳＣ６０６１７３、ＮＳＣ６１０４５８、ＮＳＣ６１８９３９、ＮＳＣ６１０４５７、ＮＳＣ６１０４５９、ＮＳＣ６０６４９９、ＮＳＣ６１０４５６、ＮＳＣ３６４８３０、およびＮＳＣ６０６４９７）；モルホリンイソキソルビシン（morpholinisoxorubicin）（ＮＳＣ３５４６４６；ＣＡＳ登録番号８９１９６０４３）；ＳＮ−３８（ＮＳＣ６７３５９６；ＣＡＳ登録番号８６６３９−５２−３）。

トポイソメラーゼＩＩ阻害剤：ドキソルビシン（ＮＳＣ１２３１２７；ＣＡＳ登録番号２５３１６４０９）；アモナフィド（ベンゾイソキノリンジオン；ＮＳＣ３０８８４７；ＣＡＳ登録番号６９４０８８１７）；ｍ−ＡＭＳＡ（（４’−（９−アクリジニルアミノ）−３’−メトキシメタンスルホンアニリド；ＮＳＣ２４９９９２；ＣＡＳ登録番号５１２６４１４３））；アントラピラゾール誘導体（（ＮＳＣ３５５６４４）；エトポシド（ＶＰ−１６；ＮＳＣ１４１５４０；ＣＡＳ登録番号３３４１９４２０）；ピラゾロアクリジン（（ピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２（６Ｈ）−プロパンアミン、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロ−、モノメタンスルホネート；ＮＳＣ３６６１４０；ＣＡＳ登録番号９９００９２１９）；ビサントレンヒドロクロリド（ＮＳＣ３３７７６６；ＣＡＳ登録番号７１４３９６８４）；ダウノルビシン（ＮＳＣ８２１１５１；ＣＡＳ登録番号２３５４１５０６）；デオキシドキソルビシン（ＮＳＣ２６７４６９；ＣＡＳ登録番号６３９５００６１）；ミトキサントロン（ＮＳＣ３０１７３９；ＣＡＳ登録番号７０４７６８２３）；メノガリル（ＮＳＣ２６９１４８；ＣＡＳ登録番号７１６２８９６１）；Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン（ＮＳＣ２６８２４２；ＣＡＳ登録番号７０８７８５１２）；オキサントラゾール（oxanthrazole）（ＮＳＣ３４９１７４；ＣＡＳ登録番号１０５１１８１２５）；ルビダゾン（rubidazone）（ＮＳＣ１６４０１１；ＣＡＳ登録番号３６５０８７１１）；テニポシド（ＶＭ−２６；ＮＳＣ１２２８１９；ＣＡＳ登録番号２９７６７２０２）。

ＤＮＡ挿入剤：アントラマイシン（ＣＡＳ登録番号４８０３２７４）；チカマイシンＡ（ＣＡＳ登録番号８９６７５３７６）；トマイマイシン（ＣＡＳ登録番号３５０５０５５６）；ＤＣ−８１（ＣＡＳ登録番号８１３０７２４６）；シビロマイシン（ＣＡＳ登録番号１２６８４３３２）；ピロロベンゾジアゼピン誘導体（ＣＡＳ登録番号９４５４９００９５）；ＳＧＤ−１８８２（（Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）−７−メトキシ−８−（３−４（Ｓ）−７−メトキシ−２−（４−メトキシフェニル）−５−オキソ−５，１１ａ−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−８−イル）オキシ）プロポキシ）−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）；ＳＧ２０００（ＳＪＧ−１３６；（１１ａＳ，１１ａ’Ｓ）−８，８’−（プロパン−１，３−ジイルビス（オキシ））ビス（７−メトキシ−２−メチレン−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピロロ［１，２−ａ］［１，４］ジアゼピン−５（１１ａＨ）−オン）；ＮＳＣ６９４５０１；ＣＡＳ登録番号２３２９３１５７６）。

ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗物質：Ｌ−アラノシン（ＮＳＣ１５３３５３；ＣＡＳ登録番号５９１６３４１６）；５−アザシチジン（ＮＳＣ１０２８１６；ＣＡＳ登録番号３２０６７２）；５−フルオロウラシル（ＮＳＣ１９８９３；ＣＡＳ登録番号５１２１８）；アシビシン（ＮＳＣ１６３５０１；ＣＡＳ登録番号４２２２８９２２）；アミノプテリン誘導体Ｎ−［２−クロロ−５−［［（２，４−ジアミノ−５−メチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル−］Ｌ−アスパラギン酸（ＮＳＣ１３２４８３）；アミノプテリン誘導体Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−５−エチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］Ｌ−アスパラギン酸（ＮＳＣ１８４６９２）；アミノプテリン誘導体Ｎ−［２−クロロ−４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］Ｌ−アスパラギン酸一水和物（ＮＳＣ１３４０３３）；葉酸代謝拮抗薬（antifo）（（Ｎ^α−（４−アミノ−４−デオキシプテロイル）−Ｎ^７−ヘミフタロイル−Ｌ−オルニチン；ＮＳＣ６２３０１７））；ベーカー（Baker）の可溶性葉酸代謝拮抗薬（antifol）（ＮＳＣ１３９１０５；ＣＡＳ登録番号４１１９１０４２）；ジクロロアリルローソン（lawsone）（（２−（３，３−ジクロロアリル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン；ＮＳＣ１２６７７１；ＣＡＳ登録番号３６４１７１６０）；ブレキナル（ＮＳＣ３６８３９０；ＣＡＳ登録番号９６２０１８８６）；フトラフル（（プロドラッグ；５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリル）−ウラシル；ＮＳＣ１４８９５８；ＣＡＳ登録番号３７０７６６８９）；５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＮＳＣ２６４８８０；ＣＡＳ登録番号６２４０２３１７）；メトトレキセート（ＮＳＣ７４０；ＣＡＳ登録番号５９０５２）；メトトレキセート誘導体（Ｎ−［［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］メチルアミノ］−１−ナフタレニル］カルボニル］Ｌ−グルタミン酸；ＮＳＣ１７４１２１）；ＰＡＬＡ（（Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート；ＮＳＣ２２４１３１；ＣＡＳ登録番号６０３４２５５６５）；ピラゾフリン（ＮＳＣ１４３０９５；ＣＡＳ登録番号３０８６８３０５）；トリメトレキセート（ＮＳＣ３５２１２２；ＣＡＳ登録番号８２９５２６４５）。

ＤＮＡ代謝拮抗物質：３−ＨＰ（ＮＳＣ９５６７８；ＣＡＳ登録番号３８１４７９７）；２’−デオキシ−５−フルオロウリジン（ＮＳＣ２７６４０；ＣＡＳ登録番号５０９１９）；５−ＨＰ（ＮＳＣ１０７３９２；ＣＡＳ登録番号１９４９４８９４）；α−ＴＧＤＲ（α−２’−デオキシ−６−チオグアノシン；ＮＳＣ７１８５１ＣＡＳ登録番号２１３３８１５）；アフィジコリングリシネート（ＮＳＣ３０３８１２；ＣＡＳ登録番号９２８０２８２２）；ａｒａＣ（シトシンアラビノシド；ＮＳＣ６３８７８；ＣＡＳ登録番号６９７４９）；５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＮＳＣ１２７７１６；ＣＡＳ登録番号２３５３３３５）；β−ＴＧＤＲ（β−２’−デオキシ−６−チオグアノシン；ＮＳＣ７１２６１；ＣＡＳ登録番号７８９６１７）；シクロシチジン（ＮＳＣ１４５６６８；ＣＡＳ登録番号１０２１２２５６）；グアナゾール（ＮＳＣ１８９５；ＣＡＳ登録番号１４５５７７２）；ヒドロキシ尿素（ＮＳＣ３２０６５；ＣＡＳ登録番号１２７０７１）；イノシングリコジアルデヒド（ＮＳＣ１１８９９４；ＣＡＳ登録番号２３５９０９９０）；マクベシンＩＩ（ＮＳＣ３３０５００；ＣＡＳ登録番号７３３４１７３８）；ピラゾロイミダゾール（ＮＳＣ５１１４３；ＣＡＳ登録番号６７１４２９０）；チオグアニン（ＮＳＣ７５２；ＣＡＳ登録番号１５４４２７）；チオプリン（ＮＳＣ７５５；ＣＡＳ登録番号５０４４２）。

細胞周期モジュレーター：シリビニン（ＣＡＳ登録番号２２８８８−７０−６）；没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ；ＣＡＳ登録番号９８９５１５）；プロシアニジン誘導体（例えば、プロシアニジンＡ１［ＣＡＳ登録番号１０３８８３０３０］、プロシアニジンＢ１［ＣＡＳ登録番号２０３１５２５７］、プロシアニジンＢ４［ＣＡＳ登録番号２９１０６５１２］、アレカタニン（arecatannin）Ｂ１［ＣＡＳ登録番号７９７６３２８３］）；イソフラボン（例えば、ゲニステイン［４％５，７−トリヒドロキシイソフラボン；ＣＡＳ登録番号４４６７２０］、ダイゼイン［４’，７−ジヒドロキシイソフラボン、ＣＡＳ登録番号４８６６６８］；インドール−３−カルビノール（ＣＡＳ登録番号７０００６１）；ケルセチン（ＮＳＣ９２１９；ＣＡＳ登録番号１１７３９５）；エストラムスチン（ＮＳＣ８９２０１；ＣＡＳ登録番号２９９８５７４）；ノコダゾール（ＣＡＳ登録番号３１４３０１８９）；ポドフィロトキシン（ＣＡＳ登録番号５１８２８５）；酒石酸ビノレルビン（ＮＳＣ６０８２１０；ＣＡＳ登録番号１２５３１７３９７）；クリプトフィシン（ＮＳＣ６６７６４２；ＣＡＳ登録番号１２４６８９６５２）。

キナーゼ阻害剤：アファチニブ（ＣＡＳ登録番号８５０１４０７２６）；アキシチニブ（ＣＡＳ登録番号３１９４６０８５０）；ＡＲＲＹ−４３８１６２（ビニメチニブ）（ＣＡＳ登録番号６０６１４３８９９）；ボスチニブ（ＣＡＳ登録番号３８０８４３７５４）；カボザンチニブ（ＣＡＳ登録番号１１４０９０９４８３）；セリチニブ（ＣＡＳ登録番号１０３２９００２５６）；クリゾチニブ（ＣＡＳ登録番号８７７３９９５２５）；ダブラフェニブ（ＣＡＳ登録番号１１９５７６５４５７）；ダサチニブ（ＮＳＣ７３２５１７；ＣＡＳ登録番号３０２９６２４９８）；エルロチニブ（ＮＳＣ７１８７８１；ＣＡＳ登録番号１８３３１９６９９）；エベロリムス（ＮＳＣ７３３５０４；ＣＡＳ登録番号１５９３５１６９６）；フォスタマチニブ（ＮＳＣ７４５９４２；ＣＡＳ登録番号９０１１１９３５５）；ゲフィチニブ（ＮＳＣ７１５０５５；ＣＡＳ登録番号１８４４７５３５２）；イブルチニブ（ＣＡＳ登録番号９３６５６３９６１）；イマチニブ（ＮＳＣ７１６０５１；ＣＡＳ登録番号２２０１２７５７１）；ラパチニブ（ＣＡＳ登録番号３８８０８２７８８）；レンバチニブ（ＣＡＳ登録番号８５７８９０３９２）；ムブリチニブ（ＣＡＳ３６６０１７０９６）；ニロチニブ（ＣＡＳ登録番号９２３２８８９５３）；ニンテダニブ（ＣＡＳ登録番号６５６２４７１７５）；パルボシクリブ（ＣＡＳ登録番号５７１１９０３０２）；パゾパニブ（ＮＳＣ７３７７５４；ＣＡＳ登録番号６３５７０２６４６）；ペガプタニブ（ＣＡＳ登録番号２２２７１６８６１）；ポナチニブ（ＣＡＳ登録番号１１１４５４４３１８）；ラパマイシン（ＮＳＣ２２６０８０；ＣＡＳ登録番号５３１２３８８９）；レゴラフェニブ（ＣＡＳ登録番号７５５０３７０３７）；ＡＰ２３５７３（リダフォロリムス）（ＣＡＳ登録番号５７２９２４５４０）；ＩＮＣＢ０１８４２４（ルキソリチニブ）（ＣＡＳ登録番号１０９２９３９１７７）；ＡＲＲＹ−１４２８８６（セルメチニブ）（ＮＳＣ７４１０７８；ＣＡＳ登録番号６０６１４３−５２−６）；シロリムス（ＮＳＣ２２６０８０；ＣＡＳ登録番号５３１２３８８９）；ソラフェニブ（ＮＳＣ７２４７７２；ＣＡＳ登録番号４７５２０７５９１）；スニチニブ（ＮＳＣ７３６５１１；ＣＡＳ登録番号３４１０３１５４７）；トファシチニブ（ＣＡＳ登録番号４７７６００７５２）；テムシロリムス（ＮＳＣ６８３８６４；ＣＡＳ登録番号１６３６３５０４３）；トラメチニブ（ＣＡＳ登録番号８７１７００１７３）；バンデタニブ（ＣＡＳ登録番号４４３９１３７３３）；ベムラフェニブ（ＣＡＳ登録番号９１８５０４６５１）；ＳＵ６６５６（ＣＡＳ登録番号３３０１６１８７０）；ＣＥＰ−７０１（レスタウルチニブ（lesaurtinib））（ＣＡＳ登録番号１１１３５８８８４）；ＸＬ０１９（ＣＡＳ登録番号９４５７５５５６６）；ＰＤ−３２５９０１（ＣＡＳ登録番号３９１２１０１０９）；ＰＤ−９８０５９（ＣＡＳ登録番号１６７８６９２１８）；ＡＴＰ競合ＴＯＲＣ１／ＴＯＲＣ２阻害剤、例えばＰＩ−１０３（ＣＡＳ登録番号３７１９３５７４９）、ＰＰ２４２（ＣＡＳ登録番号１０９２３５１６７１）、ＰＰ３０（ＣＡＳ登録番号１０９２７８８０９４）、Ｔｏｒｉｎ１（ＣＡＳ登録番号１２２２９９８３６８）、ＬＹ２９４００２（ＣＡＳ登録番号１５４４４７３６６）、ＸＬ−１４７（ＣＡＳ登録番号９３４５２６８９３）、ＣＡＬ−１２０（ＣＡＳ登録番号８７０２８１３４８）、ＥＴＰ−４５６５８（ＣＡＳ登録番号１１９８３５７７９７）、ＰＸ８６６（ＣＡＳ登録番号５０２６３２６６８）、ＧＤＣ−０９４１（ＣＡＳ登録番号９５７０５４３０７）、ＢＧＴ２２６（ＣＡＳ登録番号１２４５５３７６８１）、ＢＥＺ２３５（ＣＡＳ登録番号９１５０１９６５７）、ＸＬ−７６５（ＣＡＳ登録番号９３４４９３７６２）など。

タンパク質合成阻害剤：アクリフラビン（ＣＡＳ登録番号６５５８９７００）；アミカシン（ＮＳＣ１７７００１；ＣＡＳ登録番号３９８３１５５５）；アルベカシン（ＣＡＳ登録番号５１０２５８５５）；アストロマイシン（ＣＡＳ登録番号５５７７９０６１）；アジスロマイシン（ＮＳＣ６４３７３２；ＣＡＳ登録番号８３９０５０１５）；ベカナマイシン（ＣＡＳ登録番号４６９６７６８）；クロルテトラサイクリン（ＮＳＣ１３２５２；ＣＡＳ登録番号６４７２２）；クラリスロマイシン（ＮＳＣ６４３７３３；ＣＡＳ登録番号８１１０３１１９）；クリンダマイシン（ＣＡＳ登録番号１８３２３４４９）；クロモサイクリン（ＣＡＳ登録番号１１８１５４０）；シクロヘキシミド（ＣＡＳ登録番号６６８１９）；ダクチノマイシン（ＮＳＣ３０５３；ＣＡＳ登録番号５０７６０）；ダルフォプリスチン（ＣＡＳ登録番号１１２３６２５０２）；デメクロサイクリン（ＣＡＳ登録番号１２７３３３）；ジベカシン（ＣＡＳ登録番号３４４９３９８６）；ジヒドロストレプトマイシン（ＣＡＳ登録番号１２８４６１）；ジリスロマイシン（ＣＡＳ登録番号６２０１３０４１）；ドキシサイクリン（ＣＡＳ登録番号１７０８６２８１）；エメチン（ＮＳＣ３３６６９；ＣＡＳ登録番号４８３１８１）；エリスロマイシン（ＮＳＣ５５９２９；ＣＡＳ登録番号１１４０７８）；フルリスロマイシン（ＣＡＳ登録番号８３６６４２０８）；フラマイセチン（ネオマイシンＢ；ＣＡＳ登録番号１１９０４０）；ゲンタマイシン（ＮＳＣ８２２６１；ＣＡＳ登録番号１４０３６６３）；グリシルシクリン、例えばチゲサイクリン（ＣＡＳ登録番号２２０６２００９７）；ハイグロマイシンＢ（ＣＡＳ登録番号３１２８２０４９）；イセパマイシン（ＣＡＳ登録番号６７８１４７６０）；ジョサマイシン（ＮＳＣ１２２２２３；ＣＡＳ登録番号１６８４６２４５）；カナマイシン（ＣＡＳ登録番号８０６３０７８）；ケトライド、例えばテリスロマイシン（ＣＡＳ登録番号１９１１１４４８４）、セスロマイシン（ＣＡＳ登録番号２０５１１０４８１）、およびソリスロマイシン（ＣＡＳ登録番号７６０９８１８３７）；リンコマイシン（ＣＡＳ登録番号１５４２１２）；ライムサイクリン（ＣＡＳ登録番号９９２２１２）；メクロサイクリン（ＮＳＣ７８５０２；ＣＡＳ登録番号２０１３５８３）；メタサイクリン（ロンドマイシン（rondomycin）；ＮＳＣ３５６４６３；ＣＡＳ登録番号９１４００１）；ミデカマイシン（ＣＡＳ登録番号３５４５７８０８）；ミノサイクリン（ＮＳＣ１４１９９３；ＣＡＳ登録番号１０１１８９０８）；ミオカマイシン（ＣＡＳ登録番号５５８８１０７７）；ネオマイシン（ＣＡＳ登録番号１１９０４０）；ネチルマイシン（ＣＡＳ登録番号５６３９１５６１）；オレアンドマイシン（ＣＡＳ登録番号３９２２９０５）；オキサゾリジノン、例えばエペレゾリド（ＣＡＳ登録番号１６５８０００４４）、リネゾリド（ＣＡＳ登録番号１６５８０００３３）、ポジゾリド（posizolid）（ＣＡＳ登録番号２５２２６００２９）、ラデゾリド（ＣＡＳ登録番号８６９８８４７８６）、ランベゾリド（ranbezolid）（ＣＡＳ登録番号３９２６５９３８０）、ステゾリド（ＣＡＳ登録番号１６８８２８５８８）、テジゾリド（ＣＡＳ登録番号８５６８６７５５５）；オキシテトラサイクリン（ＮＳＣ９１６９；ＣＡＳ登録番号２０５８４６０）；パロモマイシン（ＣＡＳ登録番号７５４２３７２）；ペニメピサイクリン（ＣＡＳ登録番号４５９９６０４）；ペプチジルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、クロラムフェニコール（ＮＳＣ３０６９；ＣＡＳ登録番号５６７５７）ならびにアジダムフェニコール（ＣＡＳ登録番号１３８３８０８９）、フロルフェニコール（ＣＡＳ登録番号７３２３１３４２）、およびチアンフェニコール（ＣＡＳ登録番号１５３１８４５３）、およびプロイロムチリン、例えばレタパムリン（ＣＡＳ登録番号２２４４５２６６８）、チアムリン（ＣＡＳ登録番号５５２９７９５５）、バルネムリン（ＣＡＳ登録番号１０１３１２９２９）などの誘導体；ピルリマイシン（ＣＡＳ登録番号７９５４８７３５）；ピューロマイシン（ＮＳＣ３０５５；ＣＡＳ登録番号５３７９２）；キヌプリスチン（ＣＡＳ登録番号１２０１３８５０３）；リボスタマイシン（ＣＡＳ登録番号５３７９７３５６）；ロキタマイシン（ＣＡＳ登録番号７４０１４５１０）；ロリテトラサイクリン（ＣＡＳ登録番号７５１９７３）；ロキシスロマイシン（ＣＡＳ登録番号８０２１４８３１）；シソマイシン（ＣＡＳ登録番号３２３８５１１８）；スペクチノマイシン（ＣＡＳ登録番号１６９５７７８）；スピラマイシン（ＣＡＳ登録番号８０２５８１８）；ストレプトグラミン、例えばプリスチナマイシン（ＣＡＳ登録番号２７００７６６０３）、キヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＣＡＳ登録番号１２６６０２８９９）、およびバージニアマイシン（ＣＡＳ登録番号１１００６７６１）；ストレプトマイシン（ＣＡＳ登録番号５７９２１）；テトラサイクリン（ＮＳＣ１０８５７９；ＣＡＳ登録番号６０５４８）；トブラマイシン（ＣＡＳ登録番号３２９８６５６４）；トロレアンドマイシン（ＣＡＳ登録番号２７５１０９９）；タイロシン（ＣＡＳ登録番号１４０１６９０）；ベルダマイシン（verdamicin）（ＣＡＳ登録番号４９８６３４８１）。

ヒストンデアセチラーゼ阻害剤：アベキシノスタット（ＣＡＳ登録番号７８３３５５６０２）；ベリノスタット（ＮＳＣ７２６６３０；ＣＡＳ登録番号４１４８６４００９）；チダミド（chidamide）（ＣＡＳ登録番号７４３４２００２２）；エンチノスタット（ＣＡＳ登録番号２０９７８３８０２）；ギビノスタット（givinostat）（ＣＡＳ登録番号７３２３０２９９７）；モセチノスタット（ＣＡＳ登録番号７２６１６９７３９）；パノビノスタット（ＣＡＳ登録番号４０４９５０８０７）；キシノスタット（ＣＡＳ登録番号８７５３２０２９９）；レスミノスタット（ＣＡＳ登録番号８６４８１４８８０）；ロミデプシン（ＣＡＳ登録番号１２８５１７０７７）；スルホラファン（ＣＡＳ登録番号４４７８９３７）；チオウレイドブチロニトリル（Ｋｅｖｅｔｒｉｎ（商標）；ＣＡＳ登録番号６６５９８９０）；バルプロ酸（ＮＳＣ９３８１９；ＣＡＳ登録番号９９６６１）；ボリノスタット（ＮＳＣ７０１８５２；ＣＡＳ登録番号１４９６４７７８９）；ＡＣＹ−１２１５（ロシリノスタット（rocilinostat）；ＣＡＳ登録番号１３１６２１４５２４）；ＣＵＤＣ−１０１（ＣＡＳ登録番号１０１２０５４５９９）；ＣＨＲ−２８４５（テフィノスタット（tefinostat）；ＣＡＳ登録番号９１４３８２６０８）；ＣＨＲ−３９９６（ＣＡＳ登録番号１２３５８５９１３８）；４ＳＣ−２０２（ＣＡＳ登録番号９１０４６２４３０）；ＣＧ２００７４５（ＣＡＳ登録番号９３６２２１３３９）；ＳＢ９３９（プラシノスタット；ＣＡＳ登録番号９２９０１６９６６）。

ミトコンドリア阻害剤：パンクラチスタチン（ＮＳＣ３４９１５６；ＣＡＳ登録番号９６２８１３１１）；ローダミン−１２３（ＣＡＳ登録番号６３６６９７０９）；エデルフォシン（edelfosine）（ＮＳＣ３２４３６８；ＣＡＳ登録番号７０６４１５１９）；ｄ−アルファ−コハク酸トコフェロール（ＮＳＣ１７３８４９；ＣＡＳ登録番号４３４５０３３）；化合物１１β（ＣＡＳ登録番号８６５０７０３７７）；アスピリン（ＮＳＣ４０６１８６；ＣＡＳ登録番号５０７８２）；エリプチシン（ＣＡＳ登録番号５１９２３３）；ベルベリン（ＣＡＳ登録番号６３３６５８）；セルレニン（ＣＡＳ登録番号１７３９７８９６）；ＧＸ０１５−０７０（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ（登録商標）；１Ｈ−インドール、２−（２−（（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン）−３−メトキシ−２Ｈ−ピロール−５−イル）−；ＮＳＣ７２９２８０；ＣＡＳ登録番号８０３７１２６７６）；セラストロール（トリプテリン；ＣＡＳ登録番号３４１５７８３０）；メトホルミン（ＮＳＣ９１４８５；ＣＡＳ登録番号１１１５７０４）；ブリリアントグリーン（ＮＳＣ５０１１；ＣＡＳ登録番号６３３０３４）；ＭＥ−３４４（ＣＡＳ登録番号１３７４５２４５５６）。

抗有糸分裂剤：アロコルヒチン（allocolchicine）（ＮＳＣ４０６０４２）；オーリスタチン、例えばＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ；ＣＡＳ登録番号４７４６４５−２７−７）およびＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ；ＣＡＳ登録番号７４５０１７−９４−１；ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ６０９３９５）；コルヒチン（ＮＳＣ７５７；ＣＡＳ登録番号６４８６８）；コルヒチン（cholchicine）誘導体（Ｎ−ベンゾイル−デアセチルベンズアミド；ＮＳＣ３３４１０；ＣＡＳ登録番号６３９８９７５３）；ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８；ＣＡＳ登録番号１１０４１７−８８−４）；メイタンシン（ＮＳＣ１５３８５８；ＣＡＳ登録番号３５８４６−５３−８）；リゾキシン（rhozoxin）（ＮＳＣ３３２５９８；ＣＡＳ登録番号９０９９６５４６）；タキソール（ＮＳＣ１２５９７３；ＣＡＳ登録番号３３０６９６２４）；タキソール誘導体（（２’−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］グルタメート（glutaramate）タキソール；ＮＳＣ６０８８３２）；チオコルヒチン（３−デメチルチオコルヒチン；ＮＳＣ３６１７９２）；トリチルシステイン（ＮＳＣ４９８４２；ＣＡＳ登録番号２７９９０７７）；硫酸ビンブラスチン（ＮＳＣ４９８４２；ＣＡＳ登録番号１４３６７９）；硫酸ビンクリスチン（ＮＳＣ６７５７４；ＣＡＳ登録番号２０６８７８２）。

これらの薬剤のうち、抗体への取り付け部位を含むか、または抗体への取り付け部位を含むように改変できるものはいずれも、本明細書で開示されるＡＤＣに含めることができる。

具体的な実施形態において、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、抗有糸分裂剤である。

別の具体的な実施形態において、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、オーリスタチン、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（「ＭＭＡＥ」）またはモノメチルオーリスタチンＦ（「ＭＭＡＦ」）である。

５．３．２．リンカー
本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣにおいて、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、リンカーによって抗体に連結されている。ＡＤＣの抗体に細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を連結するリンカーは、短い、長い、疎水性、親水性、フレキシブルな、または硬いリンカーであってもよく、またはリンカーが異なる特性を有するセグメントを含み得るように、それぞれ独立して上述の特性の１つまたは複数を有するセグメントで構成されていてもよい。リンカーは、それらが１つより多くの薬剤を抗体上の単一の部位に共有結合で連結するように多価であってもよいし、またはそれらが単一の薬剤を抗体上の単一の部位に共有結合で連結するように１価であってもよい。

当業者は理解していると予想されるように、リンカーは、一方の位置で細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質への共有結合による連結を形成し、他方の位置で抗体への共有結合による連結を形成することによって、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を抗体に連結する。共有結合による連結は、リンカー上の官能基と薬剤および抗体上の官能基との反応によって形成される。本明細書で使用される場合、「リンカー」という表現は、（ｉ）リンカーを細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質に共有結合で連結することが可能な官能基と、リンカーを抗体に共有結合で連結することが可能な官能基とを含む、リンカーのコンジュゲートしていない形態；（ｉｉ）リンカーを抗体に共有結合で連結することが可能であり、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質に共有結合で連結されている官能基を含むか、またはその逆である、リンカーの部分的にコンジュゲートした形態；および（ｉｉｉ）細胞傷害性物質ならびに／または細胞増殖抑制性物質および抗体の両方に共有結合で連結されている、リンカーの完全にコンジュゲートした形態を含むことが意図される。本開示のリンカーおよび抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣに加えて、リンカー−薬剤を抗体にコンジュゲートするのに使用されるシントンの一部の具体的な実施形態において、リンカー上の官能基およびリンカーと抗体との間で形成された共有結合による連結を含む部分は、それぞれＲ_ｘおよびＸＹとして具体的に例示される。

リンカーは、好ましくは、ただし必ずしもそうでなくてもよいが、細胞の外側の条件に対して化学的に安定であり、細胞の内部で切断される、破壊される、および／またはそれ以外の方法で特異的に分解するように設計されていてもよい。代替として、細胞の内部で特異的に切断または分解されるように設計されていないリンカーを使用してもよい。安定なリンカーと不安定なリンカーとの選択は、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質の毒性によって決まる場合がある。正常細胞に対して毒性の薬剤の場合、安定なリンカーが好ましい。正常細胞に対して選択的であるかまたはそれを標的化して毒性を低める薬剤を利用してもよく、細胞外環境に対するリンカーの化学的安定性は、それほど重要ではない。ＡＤＣの状態で薬物を抗体に連結するのに有用な様々なリンカーは、当業界において公知である。これらのリンカーのいずれか、および他のリンカーは、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣの抗体に連結するのに使用することができる。

多くの細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を単一抗体分子に連結するのに使用できる例示的な多価リンカーは、例えば、その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／０７３４４５号パンフレット；国際公開第２０１０／０６８７９５号パンフレット；国際公開第２０１０／１３８７１９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２００５３号パンフレット；国際公開第２０１１／１７１０２０号パンフレット；国際公開第２０１３／０９６９０１号パンフレット；国際公開第２０１４／００８３７５号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３３７９号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３３９４号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３６４０号パンフレットに記載されている。例えば、Ｍｅｒｓａｎａらにより開発されたＦｌｅｘｉｍｅｒリンカー技術は、優れた物理化学的な特性を有する高ＤＡＲのＡＤＣを可能にする能力を有する。以下に示すように、Ｍｅｒｓａｎａ技術は、エステル結合の配列を介して可溶性のポリアセタールバックボーンに薬物分子を取り込むことに基づく。この手法は、優れた物理化学的な特性を維持しながら高度にローディングされたＡＤＣ（最大２０のＤＡＲ）をもたらす。

樹枝型のリンカーのさらなる例は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００６／１１６４２２号明細書；米国特許出願公開第２００５／２７１６１５号明細書；de Groot et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494；Amir et al. (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499；Shamis et al.(2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731；Sun et al.(2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun et al.(2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768；King et al.(2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990に見出すことができる。

使用できる例示的な１価リンカーは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Nolting, 2013, Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology 1045:71-100；Kitson et al., 2013, CROs/CMOs--Chemica Oggi--Chemistry Today 31(4):30-38；Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13；Zhao et al., 2011, J. Med. Chem. 54:3606-3623；米国特許第７，２２３，８３７号明細書；米国特許第８，５６８，７２８号明細書；米国特許第８，５３５，６７８号明細書；および国際公開第２００４０１０９５７号パンフレットに記載されている。

一例として、これらに限定されないが、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る一部の切断可能および切断不可能なリンカーは、後述される。

５．３．３．切断可能なリンカー
特定の実施形態において、選択されたリンカーは、インビボで切断可能である。切断可能なリンカーは、化学的または酵素的に不安定な、または分解可能な連結を含んでいてもよい。切断可能なリンカーは、一般的に、薬物を開放する細胞の内部のプロセス、例えば細胞質内での還元、リソソーム中での酸性条件への曝露、または細胞内の特異的なプロテアーゼまたは他の酵素による切断を頼る。切断可能なリンカーは、一般的に、化学的または酵素的のいずれかで切断可能な１つまたは複数の化学結合を取り込んでおり、それと同時に、リンカーの残部は、切断不可能である。特定の実施形態において、リンカーは、化学的に不安定性の基、例えばヒドラゾンおよび／またはジスルフィド基を含む。化学的に不安定性の基を含むリンカーは、血漿と一部の細胞質内区画との間で特性が異なることを利用する。ヒドラゾンを含有するリンカーの場合の薬物放出を容易にする細胞内条件は、エンドソームおよびリソソームの酸性環境であり、一方、ジスルフィドを含有するリンカーは、高いチオール濃度、例えばグルタチオンを含有するサイトゾル中で還元される。特定の実施形態において、化学的に不安定性の基を含むリンカーの血漿安定性は、化学的に不安定性の基付近の置換基を使用して立体障害を導入することによって増加させることができる。

酸不安定性の基、例えばヒドラゾンは、血液の中性ｐＨ環境（ｐＨ７．３〜７．５）での体循環の間は無傷のままであるが、ＡＤＣが細胞の弱酸性のエンドソーム（ｐＨ５．０〜６．５）およびリソソーム（ｐＨ４．５〜５．０）の区画に内在化されると加水分解を受けて薬物を放出する。このｐＨ依存性の放出メカニズムは、薬物の非特異的な放出と関連付けられている。リンカーのヒドラゾン基の安定性を増加させるために、リンカーは、循環中での損失を最小化しながらもリソソーム中でのより効率的な放出を達成するように調整できる化学修飾、例えば置換によって変更してもよい。

ヒドラゾンを含有するリンカーは、追加の切断部位、例えば追加の酸不安定性の切断部位および／または酵素不安定性の切断部位を含有していてもよい。例示的なヒドラゾンを含有するリンカーを含むＡＤＣは、以下の構造を含む。

式中、ＤおよびＡｂは、それぞれ細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質（薬物）およびＡｂを表し、ｎは、抗体に連結された薬物−リンカーの数を表す。特定のリンカー、例えばリンカー（Ｉｇ）において、リンカーは、２つの切断可能な基、すなわちジスルフィド部分およびヒドラゾン部分を含む。このようなリンカーの場合、改変されていない遊離の薬物の有効な放出は、酸性ｐＨまたはジスルフィド還元および酸性ｐＨを必要とする。（Ｉｈ）および（Ｉｉ）などのリンカーは、単一のヒドラゾン切断部位に有効であることが示されている。

体循環の間は無傷のままであるがＡＤＣが酸性細胞区画の内部に内在化されると加水分解を受けて薬物を放出する追加のリンカーとしては、カーボネートが挙げられる。このようなリンカーは、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質が、酸素を介して共有結合で取り付けることができる場合、有用な可能性がある。

リンカー中に含まれ得る他の酸不安定性の基としては、ｃｉｓ−アコニチルを含有するリンカーが挙げられる。ｃｉｓ−アコニチル化学は、酸性条件下でのアミド加水分解を促進するために、アミド結合に並置されたカルボン酸を使用する。

切断可能なリンカーはまた、ジスルフィド基も含み得る。ジスルフィドは、生理学的なｐＨで熱力学的に安定であり、細胞の内部に内在化されると薬物を放出するように設計され、この場合サイトゾルは、細胞外の環境と比較してより有意に高い還元性の環境を提供する。ジスルフィド結合の分離は、一般的に、ジスルフィドを含有するリンカーが循環中で適度に安定であり、サイトゾル中で薬物を選択的に放出するように、細胞質内のチオール補因子、例えば（還元された）グルタチオン（ＧＳＨ）の存在を必要とする。また、細胞内酵素タンパク質であるジスルフィドイソメラーゼ、またはジスルフィド結合の切断が可能な類似の酵素も、細胞の内部におけるジスルフィド結合の優先的な切断に寄与する可能性がある。およそ５つの腫瘍細胞において、循環中でＧＳＨまたはシステイン（これは最も豊富な低分子量チオールである）がより有意に低い濃度であることと比較して、ＧＳＨは、０．５〜１０ｍＭの濃度範囲で細胞中に存在することが報告されており、この場合、不規則な血流が低酸素状態を引き起こし、還元性酵素の活性が強化され、それゆえにグルタチオン濃度がより一層高くなる。特定の実施形態において、ジスルフィドを含有するリンカーのインビボでの安定性は、リンカーの化学修飾によって、例えば、ジスルフィド結合に隣接する立体障害の使用によって強化することができる。

例示的なジスルフィドを含有するリンカーを含むＡＤＣは、以下の構造を含む。

式中、ＤおよびＡｂは、それぞれ薬物および抗体を表し、ｎは、抗体に連結された薬物−リンカーの数を表し、Ｒは、各出現につき、例えば水素またはアルキルから独立して選択される。特定の実施形態において、ジスルフィド結合に隣接する立体障害を増加させることは、リンカーの安定性を増加させる。（Ｉｊ）および（Ｉｌ）などの構造は、１つまたは複数のＲ基が低級アルキルから選択され、例えばメチルである場合、インビボにおける増加した安定性を示す。

使用することができる別のタイプの切断可能なリンカーは、酵素によって特異的に切断されるリンカーである。このようなリンカーは、典型的にはペプチドベースであるか、または酵素の基質として作用するペプチド領域を含む。ペプチドベースのリンカーは、血漿および細胞外環境中で、化学的に不安定性のリンカーより安定である傾向がある。リソソームのタンパク質分解酵素は、内因性阻害剤およびリソソームと比較して都合悪く高いｐＨ値の血液のために、血液中で非常に低い活性を有するため、一般的に、ペプチド結合は血清中で優れた安定性を有する。抗体からの薬物の放出は、具体的にはリソソームのプロテアーゼ、例えばカテプシンおよびプラスミンの作用に起因して起こる。これらのプロテアーゼは、特定の腫瘍細胞中において高いレベルで存在する場合がある。

例示的な実施形態において、切断可能なペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１２８）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１２９）などのテトラペプチド、またはＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｖａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｈｉｓ−Ｖａｌ、ＮｏｒＶａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ａｌａ−（Ｄ）Ａｓｐ５、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅ３Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、フェニルＧｌｙ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、ＡＭＭｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、ＡＷＭｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、およびＡｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓなどのジペプチドから選択される。特定の実施形態において、より長いペプチドは疎水性であるため、ジペプチドが、より長いポリペプチドより好ましい。

ドキソルビシン、マイトマイシン、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、タリソマイシン（tallysomycin）およびオーリスタチン／オーリスタチンファミリーメンバーなどの薬物を抗体に連結するのに有用な様々なジペプチドベースの切断可能なリンカーが記載されている（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Dubowchik et al., 1998, J. Org. Chem. 67:1866-1872；Dubowchik et al., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(21):3341-3346；Walker et al., 2002, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:217-219；Walker et al., 2004, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:4323-4327；Sutherland et al., 2013, Blood 122: 1455-1463；およびFrancisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465を参照）。これらのジペプチドリンカー、またはこれらのジペプチドリンカーの改変されたバージョンの全ては、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣで使用することができる。使用できる他のジペプチドリンカーとしては、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓのブレンツキシマブベドチン（Vendotin）ＳＧＮ−３５（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓのＳＧＮ−７５（抗ＣＤ−７０、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓのＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ−３３、Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＳＧＤ−１８８２））、ＣｅｌｌｄｅｘＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのグレンバツムマブ（ＣＤＸ−０１１）（抗ＮＭＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびサイトジェン（Cytogen）ＰＳＭＡ−ＡＤＣ（ＰＳＭＡ−ＡＤＣ−１３０１）（抗ＰＳＭＡ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）などのＡＤＣに見出されるものが挙げられる。

酵素的に切断可能なリンカーとしては、酵素的切断部位から薬物を空間的に分離するための自壊性スペーサーを挙げることができる。ペプチドリンカーへの薬物の直接の取り付けは、タンパク質分解による薬物のアミノ酸付加物の放出を引き起こすことができ、それによってその活性が損なわれる。自壊性スペーサーの使用は、アミド結合の加水分解の後に、十分活性な化学的に改変されていない薬物の脱離を可能にする。

１つの自壊性スペーサーは、二機能性のパラアミノベンジルアルコール基であり、これは、アミノ基を介してペプチドに連結されてアミド結合を形成するが、アミンを含有する薬物は、リンカー（ＰＡＢＣ）のベンジルのヒドロキシル基にカルバミン酸官能性を介して取り付けられていてもよい。得られたプロドラッグは、プロテアーゼ媒介の切断で活性化され、１，６脱離反応を引き起こし、改変されていない薬物、二酸化炭素、およびリンカー基の残部を放出する。以下のスキームは、ｐ−アミドベンジルエーテルのフラグメント化および薬物の放出を描写する。

式中、Ｘ−Ｄは、改変されていない薬物を表す。

この自壊性基の複素環式バリアントも記載されている。例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，９８９，４３４号明細書を参照されたい。

一部の実施形態において、酵素的に切断可能なリンカーは、β−グルクロン酸ベースのリンカーである。薬物の容易な放出は、リソソーム酵素であるβ−グルクロニダーゼによるβ−グルクロニドグリコシド結合の切断を介して実現することができる。この酵素は、リソソーム内に豊富に存在し、一部の腫瘍タイプにおいて過剰発現されるが、細胞の外側での酵素活性は低い。β−グルクロン酸ベースのリンカーは、β−グルクロニドの親水性の性質のために凝集を受けるＡＤＣの傾向を回避するのに使用することができる。一部の実施形態において、β−グルクロン酸ベースのリンカーは、疎水性薬物に連結されたＡＤＣのためのリンカーとして好ましい。以下のスキームは、β−グルクロン酸ベースのリンカーを含有するＡＤＣからの薬物の放出を描写する。

オーリスタチン、カンプトテシンおよびドキソルビシン類似体、ＣＢＩ副溝バインダー、およびプシムベリン（psymberin）などの薬物を抗体に連結するのに有用な、様々な切断可能なβ−グルクロン酸ベースのリンカーが記載されている（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Nolting, Chapter 5 “Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,” In: Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013；Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17:831-840；Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280；およびJiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255を参照）。これらのβ−グルクロン酸ベースのリンカーは全て、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣで使用することができる。

加えて、フェノール基を含有する細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、フェノールの酸素を介してリンカーに共有結合で結合させることができる。１つのこのようなリンカーは、国際公開第２００７／０８９１４９号パンフレットに記載されており、ジアミノ−エタン「ＳｐａｃｅＬｉｎｋ」を、フェノールを送達するために従来の「ＰＡＢＯ」ベースの自壊性基と共に使用する手法を頼る。リンカーの切断は、以下に模式的に描写され、式中、Ｄは、フェノールのヒドロキシル基を有する細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を表す。

切断可能なリンカーは、切断不可能な部分またはセグメントを含んでいてもよいし、および／または切断可能なセグメントまたは部分は、それを切断可能にするために、それ以外の切断不可能なリンカー中に含まれていてもよい。単なる例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および関連するポリマーは、ポリマーバックボーン中に切断可能な基を含んでいてもよい。例えば、ポリエチレングリコールまたはポリマーリンカーは、１つまたは複数の切断可能な基、例えばジスルフィド、ヒドラゾンまたはジペプチドを含んでいてもよい。

リンカー中に含まれ得る他の分解可能な連結としては、ＰＥＧのカルボン酸または活性化されたＰＥＧのカルボン酸と生物活性薬剤上のアルコール基との反応によって形成されたエステル連結が挙げられ、この場合、このようなエステル基は一般的に生理学的条件下で加水分解して生物活性薬剤を放出する。加水分解で分解可能な連結としては、これらに限定されないが、炭酸連結；アミンとアルデヒドの反応の結果生じるイミン連結；アルコールをリン酸基と反応させることによって形成されたリン酸エステル連結；アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタール連結；ギ酸塩とアルコールの反応生成物であるオルトエステル連結；ならびにこれに限定されないが、ポリマーの末端のホスホアミダイト基、およびオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成されたオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。

特定の実施形態において、リンカーは、酵素的に切断可能なペプチド部分、例えば、構造式（ＩＶａ）または（ＩＶｂ）：

を含むリンカーまたはその塩を含み、式中、ペプチドは、リソソーム酵素によって切断可能なペプチド（Ｃ→Ｎで例示され、カルボキシおよびアミノ「末端」は示されていない）を表し；Ｔは、１つまたは複数のエチレングリコール単位もしくはアルキレン鎖、またはそれらの組合せを含むポリマーを表し；Ｒ^ａは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；ｐは、０から５の範囲の整数であり；ｑは、０または１であり；ｘは、０または１であり；ｙは、０または１であり；

は、リンカーの細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質への取り付け点を表し；^＊は、リンカーの残部への取り付け点を表す。

特定の実施形態において、ペプチドは、トリペプチドまたはジペプチドから選択される。特定の実施形態において、ジペプチドは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ｖａｌ；Ａｌａ−Ａｌａ；Ａｌａ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ａｌａ；Ａｓｎ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ａｓｎ；Ｃｉｔ−Ｃｉｔ；Ｖａｌ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ−Ｖａｌ；Ｓｅｒ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ｓｅｒ；Ｌｙｓ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ｌｙｓ；Ａｓｐ−Ｃｉｔ；Ｃｉｔ−Ａｓｐ；Ａｌａ−Ｖａｌ；Ｖａｌ−Ａｌａ；Ｐｈｅ−Ｌｙｓ；Ｖａｌ−Ｌｙｓ；Ａｌａ−Ｌｙｓ；Ｐｈｅ−Ｃｉｔ；Ｌｅｕ−Ｃｉｔ；Ｉｌｅ−Ｃｉｔ；Ｐｈｅ−Ａｒｇ；およびＴｒｐ−Ｃｉｔから選択される。特定の実施形態において、ジペプチドは、Ｃｉｔ−Ｖａｌ；およびＡｌａ−Ｖａｌから選択される。

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る構造式（ＩＶａ）によるリンカーの特定の例示的な実施形態としては、以下で例示されるリンカーが挙げられる（例示されるように、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基を含む）：

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る構造式（ＩＶｂ）によるリンカーの特定の例示的な実施形態としては、以下で例示されるリンカーが挙げられる（例示されるように、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基を含む）：

特定の実施形態において、リンカーは、酵素的に切断可能なペプチド部分、例えば、構造式（ＩＶｃ）または（ＩＶｄ）：

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る構造式（ＩＶｃ）によるリンカーの特定の例示的な実施形態としては、以下で例示されるリンカーが挙げられる（例示されるように、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基を含む）：

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る構造式（ＩＶｄ）によるリンカーの特定の例示的な実施形態としては、以下で例示されるリンカーが挙げられる（例示されるように、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基を含む）：

特定の実施形態において、構造式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、または（ＩＶｄ）を含むリンカーは、酸性媒体への曝露によって切断可能なカーボネート部分をさらに含む。特定の実施形態において、リンカーは、酸素を介して細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質に取り付けられる。

５．３．４．切断不可能なリンカー
切断可能なリンカーは一定の利点を提供し得るが、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣを含むリンカーは、必ずしも切断可能でなくてもよい。切断不可能なリンカーの場合、薬物の放出は、血漿と一部の細胞質内区画との間で特性が異なることに依存しない。薬物の放出は、抗原媒介エンドサイトーシスを介したＡＤＣの内在化とリソソーム区画への送達の後に起こり、そこで抗体は、細胞内タンパク質分解を介してアミノ酸レベルに分解されると仮定されている。このプロセスは、薬物、リンカー、およびリンカーが共有結合で取り付けられたアミノ酸残基によって形成される薬物誘導体を放出する。切断不可能なリンカーとのコンジュゲートからのアミノ酸薬物代謝産物は、切断可能なリンカーとのコンジュゲートと比較して、より親水性であり、一般的にはより低い膜透過性であり、それにより、より少ないバイスタンダー作用およびより少ない非特異的な毒性が生じる。一般的に、切断不可能なリンカーとのＡＤＣは、循環中で切断可能なリンカーとのＡＤＣより大きい安定性を有する。切断不可能なリンカーは、アルキレン鎖であってもよく、または天然の重合体、例えば、ポリアルキレングリコールポリマー、アミドポリマーベースのものであってもよいし、またはアルキレン鎖、ポリアルキレングリコール（glocol）および／またはアミドポリマーのセグメントを含んでいてもよい。

薬物を抗体に連結するのに使用される様々な切断不可能なリンカーが記載されている。それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17；831-840；Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280；and Jiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255を参照されたい。これらのリンカーはいずれも、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれていてもよい。

特定の実施形態において、リンカーは、インビボで切断不可能であり、例えば、構造式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩｃ）または（ＶＩｄ）によるリンカーであり（例示された通り）、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基：

またはその塩を含み、式中、Ｒ^ａは、水素、アルキル、スルホネートおよびメチルスルホネートから選択され；Ｒ^ｘは、リンカーを抗体に共有結合で連結することが可能な官能基を含む部分であり；

は、リンカーの細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質への取り付け点を表す。

本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣ中に含まれ得る構造式（ＶＩａ）〜（ＶＩｄ）によるリンカーの特定の例示的な実施形態としては、以下で例示されるリンカーが挙げられる（例示されるように、リンカーは、リンカーを抗体に共有結合で連結するのに好適な基を含み、

は、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質）への取り付け点を表す。

５．３．５．リンカーを抗体に取り付けるのに使用される基
リンカー−薬物シントンを抗体に取り付けてＡＤＣを得るために、様々な基を使用することができる。取り付け基は、本質的に求電子性であってもよく、その例としては、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性エステル、例えばＮＨＳエステルおよびＨＯＢｔエステル、ギ酸ハロゲン化物、酸ハロゲン化物、ハロゲン化アルキルおよびベンジル、例えばハロアセトアミドが挙げられる。以下で論じられるように、本開示に従って使用することができる「自己安定化」マレイミドおよび「架橋形成ジスルフィド」に関する新興の技術もある。使用される具体的な基は、抗体への取り付け部位に一部依存すると予想される。

抗体コンジュゲーション条件下で自発的に加水分解して安定性が改善されたＡＤＣ種を生じる「自己安定化」マレイミド基の一例を以下の略図に描写する。米国特許出願公開第２０１３０３０９２５６号明細書；さらに、Lyon et al., Nature Biotech published online, doi:10.1038/nbt.2968も参照されたい。

Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓは、天然ヒンジジスルフィド結合の還元から誘導されたスルフヒドリル基の対を架橋する方法を開示している。Badescu et al., 2014, Bioconjugate Chem. 25:1124-1136を参照されたい。この反応を以下の略図に描写する。この手法の利点は、ＩｇＧの完全な還元（スルフヒドリルの４つの対を生じる）とそれに続く４当量のアルキル化剤との反応によって富化したＤＡＲ４ＡＤＣを合成する能力である。「架橋されたジスルフィド」を含有するＡＤＣも、安定性が増加したと述べられている。

同様に、以下で描写されるように、スルフヒドリル基の対を架橋することが可能なマレイミド誘導体（１、以下）が開発されている。国際公開第２０１３／０８５９２５号パンフレットを参照されたい。

５．３．６．リンカー選択の考察
当業者公知のように、特定のＡＤＣのための選択されたリンカーは、これらに限定されないが、抗体への取り付けの部位（例えば、ｌｙｓ、ｃｙｓまたは他のアミノ酸残基）、薬物の薬理作用団の構造的な拘束、および薬物の親油性などの様々な要因によって影響を受ける可能性がある。具体的なＡＤＣのための選択されたリンカーは、具体的な抗体／複合薬に対してこれらの様々な要因のバランスをとることが求められることになる。ＡＤＣにおけるリンカーの選択によって影響を受ける要因の総論に関して、Nolting, Chapter 5 “Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates,” In: Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013を参照されたい。

例えば、ＡＤＣは、抗原陽性腫瘍細胞の近くに存在するバイスタンダー抗原陰性細胞を致死させることが観察されている。ＡＤＣによるバイスタンダー細胞致死のメカニズムは、ＡＤＣの細胞内プロセシング中に形成された代謝産物が役割を果たし得ることを示した。抗原陽性細胞中でのＡＤＣの代謝によって生成した中性の細胞傷害性の代謝産物は、バイスタンダー細胞致死において役割を果たすようであるが、電荷を有する代謝産物は、膜を介した媒体への拡散が阻止される可能性があり、それゆえにバイスタンダー致死に影響を与えることができない。特定の実施形態において、リンカーは、ＡＤＣの細胞代謝産物によって引き起こされるバイスタンダー致死作用を弱めるように選択される。特定の実施形態において、リンカーは、バイスタンダー致死作用を増加させるように選択される。

またリンカーの特性も、使用および／または貯蔵条件下でＡＤＣの凝集に影響を与える可能性がある。典型的には、文献で報告されたＡＤＣは、抗体分子１個当たり３〜４個以下の薬物分子を含有する（例えば、Chari, 2008, Acc Chem Res 41:98-107を参照）。より高い薬物対抗体の比率（「ＤＡＲ」）を得ようとする試みは、特に薬物とリンカーの両方が疎水性の場合、ＡＤＣが凝集するため失敗することが多い（King et al., 2002, J Med Chem 45:4336-4343；Hollander et al., 2008, Bioconjugate Chem 19:358-361；Burke et al., 2009 Bioconjugate Chem 20:1242-1250）。多くの例において、３〜４より高いＤＡＲが、効力増加の手段として有益であり得る。細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質が本質的に疎水性である例において、特に３〜４より大きいＤＡＲが望ましい例において、ＡＤＣ凝集を低減させる手段として、相対的に親水性のリンカーを選択することが望ましい場合がある。したがって、特定の実施形態において、リンカーは、貯蔵および／または使用中にＡＤＣの凝集を低減する化学成分を取り込んでいる。リンカーは、ＡＤＣの凝集を低減するために、極性または親水性基、例えば電荷を有する基または生理学的なｐＨで電荷を有するようになる基を取り込んでいてもよい。例えば、リンカーは、生理学的なｐＨで、例えばカルボン酸を脱プロトン化する、または例えばアミンをプロトン化する、電荷を有する基、例えば塩または基を取り込んでいてもよい。

２０もの高いＤＡＲをもたらすと報告されている、多数の細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を抗体に連結するのに使用できる例示的な多価リンカーは、その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００９／０７３４４５号パンフレット；国際公開第２０１０／０６８７９５号パンフレット；国際公開第２０１０／１３８７１９号パンフレット；国際公開第２０１１／１２００５３号パンフレット；国際公開第２０１１／１７１０２０号パンフレット；国際公開第２０１３／０９６９０１号パンフレット；国際公開第２０１４／００８３７５号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３３７９号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３３９４号パンフレット；国際公開第２０１４／０９３６４０号パンフレットに記載されている。

特定の実施形態において、貯蔵または使用中のＡＤＣの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した場合、約１０％未満である。特定の実施形態において、貯蔵または使用中のＡＤＣの凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した場合、１０％未満、例えば、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満であるか、またはそれよりさらに低い。

５．３．７．抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣを作製する方法
本開示の抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣは、周知の化学的方法を使用して合成することができる。選択された化学的方法は、数ある中でも、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質、リンカーを抗体に取り付けるのに使用されるリンカーおよび基の性質に依存すると予想される。一般的に、式（Ｉ）によるＡＤＣは、以下のスキームに従って調製することができる：
Ｄ−Ｌ−Ｒ^ｘ＋Ａｂ−Ｒ^ｙ→［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］_ｎ−Ａｂ（Ｉ）
式中、Ｄ、Ｌ、Ａｂ、ＸＹおよびｎはこれまでに定義した通りであり、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、上記で論じられたように、互いに共有結合による連結を形成することが可能な補完的な基を表す。

Ｒ^ｘおよびＲ^ｙ基の性質は、シントンＤ−Ｌ−Ｒ^ｘを抗体に連結するのに使用される化学的方法に依存すると予想される。一般的に、使用される化学的方法は、抗体の完全性、例えばその標的に結合するその能力を変更しないものであるべきである。好ましくは、コンジュゲートした抗体の結合特性は、コンジュゲートしていない抗体の結合特性に極めて類似していると予想される。分子を抗体などの生体分子にコンジュゲートするための様々な化学的方法および技術が当業界において公知であり、特に抗体にコンジュゲートするためのものが周知である。例えば、Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in: Controlled Drug Delivery, Robinson et al. Eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd Ed. 1987；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in: Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., Eds., 1985；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., Eds., Academic Press, 1985；Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58；ＰＣＴ国際公開第８９／１２６２４号パンフレットを参照されたい。これらの化学的方法のいずれも、シントンを抗体に連結するのに使用することができる。

接近可能なリシン残基にシントンを連結するのに有用な官能基Ｒ^ｘの数および化学的方法は公知であり、一例としては、これらに限定されないが、ＮＨＳ−エステルおよびイソチオシアネートが挙げられる。

システイン残基の接近可能な遊離のスルフヒドリル基にシントンを連結するのに有用な官能基Ｒ^ｘの数および化学的方法は公知であり、一例としては、これらに限定されないが、ハロアセチルおよびマレイミドが挙げられる。

しかしながら、コンジュゲーションの化学的性質は、利用可能な側鎖基に限定されない。アミンなどの側鎖は、適切な小分子をアミンに連結することによって、他の有用な基、例えばヒドロキシルに変換することができる。この戦略は、抗体の接近可能なアミノ酸残基の側鎖に多官能性の小分子をコンジュゲートすることによって抗体上の利用可能な連結部位の数を増加させるために使用することができる。次いで、これらの「変換された」官能基にシントンを共有結合で連結するのに好適な官能基Ｒ^ｘが、シントンに含まれる。

抗体はまた、コンジュゲーションのためのアミノ酸残基を含むように操作することができる。ＡＤＣの状態で薬物をコンジュゲートするのに有用な非遺伝子コード化アミノ酸残基を含むように抗体を操作するためのアプローチは、非コード化アミノ酸にシントンを連結するのに有用な化学的方法および官能基と共に、Axupet al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109(40):16101-16106によって記載されている。

典型的には、シントンは、抗体のアミノ酸残基の側鎖に、例えば、接近可能なリシン残基の一級アミノ基または接近可能なシステイン残基のスルフヒドリル基などに連結されている。遊離のスルフヒドリル基は、鎖間のジスルフィド結合を還元することにより得ることができる。

Ｒ^ｙがスルフヒドリル基である場合（例えば、Ｒ^ｘがマレイミドである場合）の連結では、一般的に、抗体はまず完全または部分的に還元して、システイン残基間の鎖間のジスルフィド架橋を崩壊させる。

１つまたは複数のコドンの突然変異によって、ジスルフィド架橋に参加しないシステイン残基が抗体に入るように操作することができる。これらの対応のないシステインの還元により、コンジュゲーションに好適なスルフヒドリル基が生じる。操作されたシステインを取り込むのに好ましい位置としては、一例として、これらに限定されないが、ヒトＩｇＧ_１重鎖上の、Ｓ１１２Ｃ位、Ｓ１１３Ｃ位、Ａ１１４Ｃ位、Ｓ１１５Ｃ位、Ａ１７６Ｃ位、５１８０Ｃ位、Ｓ２５２Ｃ位、Ｖ２８６Ｃ位、Ｖ２９２Ｃ位、Ｓ３５７Ｃ位、Ａ３５９Ｃ位、Ｓ３９８Ｃ位、Ｓ４２８Ｃ位（Ｋａｂａｔの番号付け）、およびヒトＩｇカッパ軽鎖上の、Ｖ１１０Ｃ位、Ｓ１１４Ｃ位、Ｓ１２１Ｃ位、Ｓ１２７Ｃ位、Ｓ１６８Ｃ位、Ｖ２０５Ｃ位（Ｋａｂａｔの番号付け）が挙げられる（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書、米国特許第７，８５５，２７５号明細書および米国特許第８，４５５，６２２号明細書を参照）。

当業者により理解されていると予想されるように、抗体分子に連結された多数の細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質は、一部の抗体は１つの連結された薬剤を含有する、一部の抗体は２つの連結された薬剤を含有する、一部の抗体は３つの連結された薬剤を含有するなど（一部の抗体は連結された薬剤を含有しない）、ＡＤＣの集合体が本質的に不均質であり得るように変更することが可能である。不均質性の程度は、数ある中でも、細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を連結するのに使用される化学的方法に依存すると予想される。例えば、抗体が還元されて取り付けのためのスルフヒドリル基が生じる場合、分子１個当たり０、２、４、６または８個の連結された薬剤を有する抗体の不均質な混合物が産生されることが多い。さらに、取り付け化合物のモル比を制限することによって、分子１個当たり０、１、２、３、４、５、６、７または８個の連結された薬剤を有する抗体が産生されることが多い。したがって、文脈に応じて、述べられるＤＡＲは、抗体の集合体の平均であり得ることが理解されると予想される。例えば、「ＤＡＲ４」は、特定のＤＡＲピークを単離するために精製に供されておらず、抗体１個当たりの取り付けられた細胞増殖抑制性物質および／または細胞傷害性物質の数が異なる（例えば、抗体１個当たり０、２、４、６、８個の薬剤）ＡＤＣ分子の不均質な混合物を含み得るが、平均の薬物対抗体の比率が４であるＡＤＣ調製物を指すことができる。同様に、一部の実施形態において、「ＤＡＲ２」は、平均の薬物対抗体の比率が２である不均質なＡＤＣ調製物を指す。

富化した調製物が望ましい場合、既定の数の連結された細胞傷害性物質および／または細胞増殖抑制性物質を有する抗体は、不均質な混合物の精製を介して、例えば、カラムクロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーを介して得ることができる。

純度は、当業界において公知のように、様々な方法によって評価することができる。具体的な例として、ＡＤＣ調製物は、ＨＰＬＣまたは他のクロマトグラフィーを介して分析してもよく、純度は、得られたピークの曲線下面積を分析することによって評価してもよい。

５．４キメラ抗原受容体
本発明の開示は、本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本開示のＣＡＲは、典型的には、膜貫通ドメインに作動可能に連結した細胞外ドメインを含み、これが順にシグナル伝達のための細胞内ドメインに作動可能に連結している。

本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントの配列（例えば、セクション５．１または実施形態１から９０に記載される通り）を含む。

例示的な膜貫通ドメイン配列および細胞内ドメイン配列は、それぞれセクション５．４．１および５．４．２に記載されている。

本明細書に記載される数々の融合タンパク質（例えば、実施形態９２および９４〜９６）は、ＣＡＲであり、ＣＡＲに関連する開示は、このような融合タンパク質に適用される。

５．４．１．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに作動可能に連結された（例えば、融合した）膜貫通ドメインを含むように設計することができる。

膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれに由来するものでもよい。源が天然である場合、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質由来であり得る。この開示における特定の用途の膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のアルファ、ベータまたはゼータ鎖由来であってもよい（すなわち、その少なくとも膜貫通領域を含んでいてもよい）。一部の場合において、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジなどの様々なヒトヒンジも同様に採用することができる。

一実施形態において、膜貫通ドメインは、合成である（すなわち、天然に存在しない）。合成膜貫通ドメインの例は、ロイシンおよびバリンなどの主として疎水性の残基を含むペプチドである。好ましくは、合成膜貫通ドメインの各末端に、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が見出されると予想される。任意選択で、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２から１０アミノ酸の長さのものが、膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞質内シグナル伝達ドメインとの間に連結を形成することができる。グリシン−セリンの二つ組は、特に好適なリンカーを提供する。

一実施形態において、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＹＬＨＬＧＡＬＧＲＤＬＷＧＰＳＰＶＴＧＹＨＰＬＬを含む。

一実施形態において、本開示のＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶを含む。

一部の場合において、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＣＤ８ａヒンジドメインは、アミノ酸配列ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣを含む。

５．４．２．細胞内ドメイン
本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。例えばＴ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを変換し、細胞が特殊化した機能を実行するように方向付けるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用できるが、多くの場合において、鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化された部分が使用される限りにおいて、このような短縮化された部分は、それがエフェクター機能シグナルを変換しさえすれば、無傷の鎖の代わりに使用することができる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを変換するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる短縮化された部分を含むことを意味する。

本開示のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、抗原受容体と結合した後に協同的に作用してシグナル伝達を開始させるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および補助受容体の細胞質内配列、加えて、これらの配列のあらゆる誘導体またはバリアント、および同じ機能的な能力を有するあらゆる合成配列が挙げられる。

ＴＣＲ単独により生成したシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分な場合があり、二次または共刺激シグナルも必要である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞質内シグナル伝達配列、すなわち、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始させるシグナル伝達配列（一次細胞質内シグナル伝達配列）、および抗原非依存性の方式で作用して、二次または共刺激シグナルをもたらすシグナル伝達配列（二次細胞質内シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。

一次細胞質内シグナル伝達配列は、刺激によるか、または阻害によるかのいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激による方式で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有していてもよい。

本開示のＣＡＲにおいて特定の用途を有するＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列の例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。本開示のＣＡＲにおける細胞質内シグナル伝達分子は、ＣＤ３−ゼータ由来の細胞質内シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。

好ましい実施形態において、ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータのもの）そのものを含む、または本開示のＣＡＲの状況で有用な他のあらゆる望ましい細胞質内ドメインと組み合わせて含むように設計される。例えば、ＣＡＲの細胞質内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含んでいてもよい。

共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、リンパ球の抗原への効率的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

本開示のＣＡＲの細胞質内シグナル伝達部分内の細胞質内シグナル伝達配列は、ランダムな、または特定された順番で互いに連結されていてもよい。任意選択で、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２から１０アミノ酸の長さのものが、連結を形成することができる。グリシン−セリンの二つ組は、特に好適なリンカーを提供する。

一実施形態において、細胞質内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、細胞質内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。

５．５核酸、組換えベクターおよび宿主細胞
本発明の開示は、抗グリコＭＵＣ１抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子をコードする核酸分子、このような核酸を含むベクター、および本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体を産生することが可能な宿主細胞を包含する。特定の態様において、核酸分子は、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および抗原結合フラグメント（例えば、セクション５．１および実施形態１〜９０に記載される通り）、加えて、それらを含有する融合タンパク質（例えば、実施形態９１〜９６に記載される通り）およびキメラ抗原受容体（例えば、セクション５．４および実施形態９７〜９８に記載される通り）をコードし、宿主細胞は、それらを発現することが可能である。本開示の例示的なベクターは、実施形態１１１〜１１３に記載されており、例示的な宿主細胞は、実施形態１１４〜１１７に記載されている。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体は、宿主細胞中での免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。抗体を組換え発現するために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを有する１つまたは複数の組換え発現ベクターをトランスフェクトされ、それにより、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現され、任意選択でそれらは宿主細胞が培養される培地に分泌され、その培地から抗体を回収することができる。標準的な組換えＤＮＡ手法は、抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを、宿主細胞に、例えば、Molecular Cloning；A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989)および米国特許第４，８１６，３９７号明細書に記載されるものに導入するのに使用される。

このような抗グリコＭＵＣ１抗体をコードする核酸を生成するために、まず、軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡフラグメントを得る。これらのＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、軽鎖および重鎖可変配列をコードする生殖細胞系ＤＮＡまたはｃＤＮＡを増幅および改変することにより得ることができる。ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、当業界において公知である（例えば、「ＶＢＡＳＥ」ヒト生殖細胞系配列データベースを参照されたい；Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242；Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198；and Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836も参照されたい；これらそれぞれの内容は参照により本明細書に組み入れられる）。

抗グリコＭＵＣ１抗体関連のＶ_ＨおよびＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントはさらに、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントは、別のタンパク質、例えば抗体定常領域またはフレキシブルなリンカーをコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結されている。用語「作動可能に連結される」は、この状況で使用される場合、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされたアミノ酸配列がフレーム内に残るように２つのＤＮＡフラグメントが合体することを意味することが意図される。

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２、ＣＨ_３、および任意選択でＣＨ_４）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当業界において公知であり（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域であってもよいが、特定の実施形態において、ＩｇＧ_１またはＩｇＧ_４の定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されていてもよい。

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（加えてＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当業界において公知であり（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってもよいが、特定の実施形態において、カッパ定常領域である。

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列が、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域がフレキシブルなリンカーによって合体した連続する単鎖タンパク質として発現できるように、フレキシブルなリンカーをコードする別のフラグメント、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ_４〜Ｓｅｒ）_３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結されていてもよい（例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-426；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554を参照）。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体を発現させるために、上述したようにして得られた部分的なまたは全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。この文脈において、用語「作動可能に連結した」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図した機能を発揮するように、抗体遺伝子がベクターにライゲートされることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入されていてもよいし、またはより典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。

抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位ライゲーション、または制限部位が存在しない場合、平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗グリコＭＵＣ１抗体関連の軽鎖または重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、すでに抗体定常領域配列を有していてもよい。例えば、抗グリコＭＵＣ１モノクローナル抗体関連のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を全長抗体遺伝子に変換するための１つのアプローチは、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、重鎖定常および軽鎖定常領域をそれぞれ予めコードする発現ベクターにそれらを挿入することである。加えて、または代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしていてもよい。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがフレーム内で抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。

抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞中で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif., 1990に記載されている。当業者であれば、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現のレベルなどのような要因によって決まる可能性があることを理解していると予想される。哺乳類宿主細胞発現に好適な調節配列としては、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ならびにポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明に関して、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号明細書、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号明細書を参照されたい。

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を有していてもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、第４，６３４，６６５号明細書および第５，１７９，０１７号明細書を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。好適な選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲ⁻宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅と共に使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が挙げられる。軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために一般的に使用される様々な技術を包含することが意図される。

原核または真核宿主細胞のいずれかで本開示の抗体を発現することが考えられる。特定の実施形態において、抗体の発現、または適切にフォールディングされ免疫学的に活性な抗体の最適な分泌は、真核細胞、例えば、哺乳類宿主細胞で実行される。本開示の組換え抗体を発現するための例示的な哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されるＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞などであり、これは、例えば、Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621に記載されるようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現または宿主細胞が増殖する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたり、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。宿主細胞も、無傷抗体の一部、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を産生するために使用することができる。上記の手順のバリエーションは本発明の開示の範囲内であることが理解される。例えば、本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（ただし両方ではない）をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。

本開示のＣＡＲの発現に関して、例えばセクション５．４として、さらに実施形態９７および９８に記載される通り、好ましくは、宿主細胞はＴ細胞であり、好ましくはヒトＴ細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、細胞が腫瘍細胞上のＭＵＣ１と架橋されると、抗腫瘍免疫を示す。本開示のＴ細胞を産生するための詳細な方法は、セクション５．５．１に記載されている。

組換えＤＮＡ技術はまた、グリコＭＵＣ１への結合に必ずしも必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去するのに使用することもできる。このような短縮化されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体に包含される。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体の組換え発現のために、宿主細胞は、２つの本開示の発現ベクター、すなわち、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターをコトランスフェクトされてもよい。２つのベクターは、同一な選択可能マーカーを含有していてもよく、またはそれらは、それぞれ別の選択可能マーカーを含有していてもよい。代替として、両方の重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする単一のベクターを使用してもよい。

核酸が抗グリコＭＵＣ１抗体の１つまたは複数の部分をコードするようになれば、例えば、異なるＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体への親和性が低減した抗体、または異なるサブクラスの抗体をコードする核酸を生成するように、さらなる変更または突然変異をコード配列に導入することができる。

本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体はまた、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載される方法によって）産生することもできる。バリアント抗体も、無細胞プラットフォームを使用して生成することができる（例えば、Chu et al., Biochemia No.2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)およびMurray et al., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420-426を参照）。

組換え発現によって本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体が産生されたら、免疫グロブリン分子の精製に関する当業界において公知のあらゆる方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解によって、または他のあらゆる標準的なタンパク質精製技術によってこれを精製することができる。さらに、本発明の開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および／または結合フラグメントは、精製を容易にするために、本明細書に記載される、またはそれ以外の当業界において公知の異種ポリペプチド配列に融合させることができる。

抗グリコＭＵＣ１抗体は、単離されたら、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィーによって（Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980を参照）、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden）でのゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製してもよい。

５．５．１．Ｔ細胞におけるＣＡＲの組換え産生
一部の実施形態において、本開示の抗グリコＭＵＣ１ＣＡＲをコードする核酸は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して細胞に送達される。ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは、担体として形質導入された細胞を使用して、またはカプセル化された、結合した、または裸のベクターの無細胞の局所または全身送達を使用して、異なるタイプの真核細胞に、さらには組織および生物全体にも送達することができる。使用される方法は、安定な発現が必要であるかまたは十分なあらゆる目的のための方法であり得る。

他の実施形態において、ＣＡＲ配列は、インビトロで転写されたｍＲＮＡを使用して細胞に送達される。インビトロで転写されたｍＲＮＡＣＡＲは、担体としてトランスフェクトされた細胞を使用して、またはカプセル化された、結合した、または裸のｍＲＮＡの無細胞の局所または全身送達を使用して、異なるタイプの真核細胞に、さらには組織および生物全体にも送達することができる。使用される方法は、一過性発現が必要であるかまたは十分なあらゆる目的のための方法であり得る。

別の実施形態において、望ましいＣＡＲは、トランスポゾンによって細胞中で発現させることができる。

本開示のＲＮＡトランスフェクション方法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションは、本質的に一過性であり、ベクターを含まないことであり、すなわちＲＮＡ導入遺伝子は、リンパ球に送達され、短時間のインビトロにおける細胞活性化の後、いかなる追加のウイルス配列も必要とせずに、最小限の発現カセットとしてそこで発現される。これらの条件下で、宿主細胞ゲノムへの導入遺伝子の組込みが起こる可能性は低い。細胞のクローニングは、必ずしもＲＮＡのトランスフェクション効率やリンパ球集団全体を均一に改変するその能力によるわけではない。

インビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）でのＴ細胞の遺伝学的改変は、両方とも様々な動物モデルで継続的に試験されている２つの異なる戦略を利用する。細胞に、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって、インビトロで転写されたＲＮＡをトランスフェクトする。好ましくは、移入されたＩＶＴ−ＲＮＡの持続的な発現を達成するために、様々な改変を使用してＩＶＴ−ＲＮＡを安定化させることが望ましい。

一部のＩＶＴベクターが、インビトロでの転写のためのテンプレートとして標準化された方式で利用されており、安定化されたＲＮＡ転写物が産生されるように遺伝子改変されていることが文献公知である。現在のところ、当業界で使用されるプロトコールは、以下の構造：ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続き３’および／または５’のいずれかで非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する目的の遺伝子、および５０〜７０個のＡヌクレオチドを含有する３’ポリアデニルカセットを有するプラスミドベクターに基づく。インビトロでの転写の前に、環状プラスミドを、ポリアデニルカセットの下流でＩＩ型制限酵素（認識配列は切断部位に対応する）によって線形化する。したがってポリアデニルカセットは、転写物中の後期ポリ（Ａ）配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは、線形化後に酵素切断部位の一部として残り、３’末端におけるポリ（Ａ）配列を伸長させるかまたはマスキングする。この非生理学的なオーバーハングが、このようなコンストラクトから細胞内で産生されたタンパク質の量に影響を与えるかどうかは不明確である。

ＲＮＡは、より伝統的なプラスミドまたはウイルスアプローチを超える数々の利点を有する。ＲＮＡ源からの遺伝子発現は、転写を必要とせず、タンパク質生成物は、トランスフェクションのすぐ後に産生される。さらに、ＲＮＡは、核ではなく細胞質に侵入するだけでよいため、典型的なトランスフェクション方法は、極めて高いトランスフェクション率をもたらす。加えて、プラスミドベースアプローチは、研究中の細胞中で目的の遺伝子の発現を駆動させるプロモーターを活性にすることを必要とする。

別の態様において、ＲＮＡコンストラクトは、エレクトロポレーションによって細胞に送達することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００１４６４５号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号明細書、米国特許出願公開第２００５／００７０８４１号明細書、米国特許出願公開第２００４／００５９２８５号明細書、米国特許出願公開第２００４／００９２９０７号明細書で教示されるような、哺乳類細胞への核酸コンストラクトのエレクトロポレーションの配合物および手法を参照されたい。あらゆる公知の細胞型のエレクトロポレーションに必要な電場強度などの様々なパラメーターは、一般的に、この分野の関連する研究文献に加えて多数の特許および出願において公知である。例えば、米国特許第６，６７８，５５６号明細書、米国特許第７，１７１，２６４号明細書、および米国特許第７，１７３，１１６号明細書を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置、例えば、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（商標）ＤＮＡエレクトロポレーション治療システム（Ｉｎｏｖｉｏ／Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が商業的に利用可能であり、米国特許第６，５６７，６９４号明細書；米国特許第６，５１６，２２３号明細書、米国特許第５，９９３，４３４号明細書、米国特許第６，１８１，９６４号明細書、米国特許第６，２４１，７０１号明細書、および米国特許第６，２３３，４８２号明細書などの特許に記載されており、エレクトロポレーションは、例えば米国特許出願公開第２００７０１２８７０８号明細書で記載されるように、インビトロでの細胞のトランスフェクションのためにも使用することができる。またエレクトロポレーションは、インビトロで核酸を細胞に送達することにも利用することができる。したがって、当業者公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用する、発現コンストラクトを含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介投与は、標的細胞に目的のＲＮＡを送達するためのエキサイティングな新しい手段を提供する。

５．５．１．１Ｔ細胞源
Ｔ細胞源は、増加させ遺伝学的に改変する前に、対象から得られる。用語「対象」は、免疫応答を惹起できる生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。好ましくは、対象は、ヒトである。

Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、および腫瘍などの多数の源から得ることができる。本発明の開示の特定の実施形態において、当業界において入手可能な様々なＴ細胞株を使用することができる。本発明の開示の特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者公知の様々な技術を使用して対象から収集された血液単位から得ることができる。好ましい一実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球、および血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、それに続く処理工程のために、細胞を適切な緩衝液または媒体中に入れることができる。本開示の一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠いていてもよく、または部分的であっても多くの２価カチオンを欠いていてもよい。ここでも、驚くべきことに、カルシウムの非存在下における最初の活性化工程は、一層の活性化をもたらす。当業者であれば容易に理解していると予想されるように、洗浄工程は、当業者公知の方法によって、例えば、製造元の指示に従って半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１セルプロセッサー、ＢａｘｔｅｒＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓＣｅｌｌＳａｖｅｒ５）を使用することによって達成してもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性の緩衝液、例えば、Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、または緩衝液含有もしくは非含有の他の塩類溶液などに再懸濁してもよい。代替として、アフェレーシスサンプルの不要な成分を除去して、細胞を培養培地に直接再懸濁してもよい。

別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させ、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることによって末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の部分集団、例えばＣＤ３^＋、ＣＤ２８’、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋およびＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８個の）コンジュゲートビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔと、望ましいＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたりインキュベートすることによって単離される。一実施形態において、期間は、約３０分である。さらなる実施形態において、期間は、３０分から、３６時間またはそれより長い時間の範囲、その間の全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態において、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい実施形態において、期間は、１０から２４時間である。好ましい一実施形態において、インキュベーション期間は、２４時間である。白血病を有する患者からのＴ細胞の単離の場合、より長いインキュベーション時間、例えば２４時間の使用は、細胞収量を上昇させることができる。より長いインキュベーション時間は、腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞が極めて少ないあらゆる状況でＴ細胞を単離するのに使用することができる。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を増加させることができる。したがって、単にＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短くするまたは長くすることによって、および／またはビーズのＴ細胞に対する比率を増加または減少させることによって（本明細書でさらに記載される通り）、培養開始のときに、またはプロセス中の他のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を、存在するかしないかにかかわらず優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始のときに、または他の望ましいタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を、存在するかしないかにかかわらず優先的に選択することができる。当業者であれば、本開示の状況において複数回の選択も使用できることを認識しているものと予想される。特定の実施形態において、選択手順を実行し、活性化および増加プロセスで「選択されなかった」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されなかった」細胞はまた、さらなる回数の選択に供することもできる。

陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有な表面マーカーに対する抗体を併用して達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に提示される細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを介したセルソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４^＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態において、典型的にはＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ、ＧＩＴＲ^＋、およびＦｏｘＰ３^＋を発現する調節性Ｔ細胞を富化する、またはそれらを陽性選択することが望ましい場合がある。代替として、特定の実施形態において、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似の選択方法によって、枯渇される。

陽性または陰性選択による望ましい細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は、様々であってもよい。特定の実施形態において、ビーズおよび細胞を一緒に混合する体積を顕著に減少させ（すなわち、細胞の濃度を増加させる）、細胞およびビーズの最大の接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態において、１ｍｌ当たり細胞２０億個の濃度が使用される。一実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１０億個の濃度が使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１億個より多くが使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態において、１ｍｌ当たり細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個からの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度が使用されてもよい。高濃度の使用は、細胞収量の上昇、細胞の活性化、および細胞の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、例えばＣＤ２８陰性Ｔ細胞のより効率的な捕捉、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）からの捕捉を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、入手が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８^＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。

関連する実施形態において、より低い細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を顕著に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合させようとする望ましい抗原を大量に発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希薄な濃度でＣＤ８^＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態において、使用される細胞濃度は、５×１０^６／ｍｌである。他の実施形態において、使用される濃度は、約１×１０^５／ｍｌから１×１０^６／ｍｌ、およびその間のあらゆる整数値の範囲であってもよい。

他の実施形態において、細胞は、回転器において、様々な長さの時間にわたり、様々な速度で、２℃〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートしてもよい。

刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後に凍結してもよい。理論に縛られるつもりはないが、凍結およびそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球やある程度の単球を除去することによって、より均質な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後に、細胞を凍結溶液中に懸濁してもよい。多くの凍結溶液およびパラメーターが当業界において公知であり、この状況において有用であると予想されるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで細胞は、１°／分の速度で−８０℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中に貯蔵される。他の制御冷凍方法も、−２０℃で即座の、または液体窒素中の制御されていない冷凍と同様に使用することができる。

特定の実施形態において、本発明の開示の方法を使用して活性化する前に、低温保存された細胞を融解し、本明細書に記載される通り洗浄し、室温で１時間そのまま静置する。

また、本明細書に記載される増加した細胞が必要と思われるときの前の期間に、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス生成物を収集することも本開示の状況において予期される。したがって、増加させようとする細胞の源は、必要なあらゆるタイムポイントで収集でき、望ましい細胞、例えばＴ細胞を、Ｔ細胞療法によって利益を得ると予想される様々な疾患または状態、例えば本明細書に記載される疾患または状態のためのＴ細胞療法での後の使用のために単離および凍結することができる。一実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、全体的に健康な対象から採取される。特定の実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症させるリスクがあるが疾患をまだ発症させていない全体的に健康な対象から採取され、目的の細胞は、後の使用のために単離および凍結される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、その後の時間で増加する、凍結する、および使用することが可能である。特定の実施形態において、サンプルは、本明細書に記載される特定の疾患の診断の直後に、ただしいずれかの処置の前に、患者から収集される。さらなる実施形態において、様々な関連する処置法、例えば、これらに限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線照射などの薬剤での処置の前に、細胞は、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子によって誘導されたシグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害するか（ラパマイシン）のいずれかである。（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993）。さらなる実施形態において、細胞は、化学療法剤、例えばフルダラビン、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドのいずれかを使用する骨髄もしくは幹細胞移植またはＴ細胞除去療法を併用する（例えば、その前の、それと同時の、またはその後の）後の使用のために、患者ごとに単離され、凍結される。

本発明の開示のさらなる実施形態において、Ｔ細胞は、処置の直後に患者から得られる。これに関して、特定のがん処置の後、特に免疫系に損傷を与える薬物での処置の後、患者が通常処置から回復すると予想される期間中の処置の直後に、得られたＴ細胞の品質は、そのエクスビボで増加する能力に関して最適であるかまたは改善されている可能性があることが観察されている。同様に、本明細書に記載される方法を使用するエクスビボでの操作の後、これらの細胞は、生着およびインビボでの増加の強化にとって好ましい状況にある可能性がある。したがって、本発明の開示の状況において、この回復期間中、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系統の細胞を含む血液細胞を収集することが予期される。さらに、特定の実施形態において、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員）およびコンディショニングレジメンは、特に療法後の既定された時間枠中に特定の細胞型の再定着、再循環、再生、および／または増加にとって好ましい、対象における状態を生じさせるために使用することができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細胞が挙げられる。

５．５．１．２Ｔ細胞の活性化および増加
Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；第６，５３４，０５５号明細書；第６，９０５，６８０号明細書；第６，６９２，９６４号明細書；第５，８５８，３５８号明細書；第６，８８７，４６６号明細書；第６，９０５，６８１号明細書；第７，１４４，５７５号明細書；第７，０６７，３１８号明細書；第７，１７２，８６９号明細書；第７，２３２，５６６号明細書；第７，１７５，８４３号明細書；第５，８８３，２２３号明細書；第６，９０５，８７４号明細書；第６，７９７，５１４号明細書；第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許公開公報第２００６０１２１００５号明細書に記載されるような方法を使用して活性化および増加される。

一般的に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤およびＴ細胞表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが取り付けられた表面と接触させることによって増加される。特に、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面上に固定された抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、本明細書に記載されるように刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、一般的に当業界で公知の他の方法と同様に使用できる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。

特定の実施形態において、Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液の形態であってもよいし、または表面にカップリングされていてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「ｃｉｓ」構成で）または別の表面に（すなわち、「ｔｒａｎｓ」構成で）カップリングされていてもよい。代替として、一方の薬剤が表面にカップリングされ、他方の薬剤が溶液の形態であってもよい。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤が、細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを提供する薬剤が、溶液の形態であるかまたは表面にカップリングされている。特定の実施形態において、両方の薬剤が、溶液の形態であってもよい。別の実施形態において、薬剤は、可溶性の形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面に、または薬剤に結合すると予想される抗体もしくは他の結合剤に架橋されてもよい。これに関して、例えば、本発明の開示においてＴ細胞の活性化および増加での使用に関して予期される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関して、米国特許出願公開公報第２００４０１０１５１９号明細書および第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。

一実施形態において、２つの薬剤は、同じビーズ上、すなわち「ｃｉｓ」、または別のビーズ上、すなわち「ｔｒａｎｓ」のいずれかで、ビーズ上に固定される。一例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両方の薬剤は、同等の分子の量で同じビーズ共に固定される。一実施形態において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増加およびＴ細胞増殖のために、１：１比率のビーズに結合した各抗体が使用される。本発明の開示の特定の態様において、１：１の比率を使用して観察された増加と比較してＴ細胞増加における上昇が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が使用される。１つの特定の実施形態において、１：１の比率を使用して観察された増加と比較して、約１から約３倍の上昇が観察される。一実施形態において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から、１：１００の範囲、およびその間の全ての整数値の範囲である。本発明の開示の一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比率は、１未満である。本開示の特定の実施形態において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体の抗ＣＤ３抗体に対する比率は、２：１より大きい。１つの特定の実施形態において、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。別の実施形態において、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる実施形態において、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。別の実施形態において、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。好ましい一実施形態において、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。別の実施形態において、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらに別の実施形態において、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。

１：５００から５００：１、およびその間のあらゆる整数値の粒子の細胞に対する比率が、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するのに使用することができる。当業者であれば容易に理解できるように、粒子の細胞に対する比率は、標的細胞に対する粒度によって決まる可能性がある。例えば、小さいサイズのビーズは数個の細胞としか結合できないが、より大きいビーズは多くの細胞と結合できる。特定の実施形態において細胞の粒子に対する比率は、１：１００から１００：１の範囲、およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる実施形態において、比率は、１：９から９：１の範囲、およびその間のあらゆる整数値を含み、これらもＴ細胞を刺激するのに使用することができる。Ｔ細胞刺激が起こる抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がカップリングした粒子とＴ細胞の比率は、上述したように様々であってもよいが、特定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比率は、少なくとも１：１の粒子のＴ細胞に対する比率である。一実施形態において、１：１またはそれより低い粒子の細胞に対する比率が使用される。１つの特定の実施形態において、好ましい粒子：細胞の比率は、１：５である。さらなる実施形態において、粒子の細胞に対する比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、一実施形態において、粒子の細胞に対する比率は、１日目に１：１から１０：１であり、その後、１０日まで、追加の粒子が、１：１から１：１０の最終的な比率で（添加の日の細胞数に基づく）毎日または１日おきに細胞に添加される。１つの特定の実施形態において、粒子の細胞に対する比率は、刺激の１日目に１：１であり、刺激の３日目および５日目に１：５に調整される。別の実施形態において、粒子は、毎日または１日おきに添加され、１日目に１：１の最終的な比率に、刺激の３日目および５日目に１：５にする。別の実施形態において、粒子の細胞に対する比率は、刺激の１日目に２：１であり、刺激の３日目および５日目に１：１０に調整される。別の実施形態において、粒子は、毎日または１日おきに添加され、１日目に１：１の最終的な比率に、刺激の３日目および５日目に１：１０にする。当業者は、様々な他の比率が、本発明の開示で使用するのに適している可能性があることを理解しているものと予想される。特に、比率は、粒度および細胞のサイズおよびタイプに応じて様々であると予想される。

本発明の開示のさらなる実施形態において、細胞、例えばＴ細胞を、薬剤でコーティングされたビーズと合わせ、その後、ビーズおよび細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替の実施形態において、培養の前に、薬剤でコーティングされたビーズおよび細胞を分離しないが、一緒に培養する。さらなる実施形態において、まず磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、その結果として細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それによって細胞の刺激を誘導する。

一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が取り付けられている常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞と接触させることによってライゲートさせることができる。一実施形態において、細胞（例えば、１０^４から１０^９個のＴ細胞）およびビーズ（例えば、１：１の比率のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズ）を、緩衝液中で、好ましくはＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの２価カチオンを含まない）中で合わせる。ここでも当業者は、あらゆる細胞濃度が使用できることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、サンプル中で非常に希少であってもよいし、サンプルの０．０１％を構成するだけでもよく、またはサンプル全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞で構成されていてもよい。したがって、あらゆる細胞数が、本発明の開示の内容に含まれる。特定の実施形態において、粒子および細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞と粒子との最大の接触を確実にすることが望ましい場合がある。例えば、一実施形態において、１ｍｌ当たり細胞約２０億個の濃度が使用される。別の実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１億個より多くが使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌ当たり、細胞１０００万個、１５００万個、２０００万個、２５００万個、３０００万個、３５００万個、４０００万個、４５００万個、または５０００万個の細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態において、１ｍｌ当たり、細胞７５００万個、８０００万個、８５００万個、９０００万個、９５００万個、または１億個の細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１ｍｌ当たり細胞１億２５００万個または１億５０００万個の濃度が使用されてもよい。高濃度の使用は、細胞収量の上昇、細胞の活性化、および細胞の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、目的の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、例えばＣＤ２８陰性Ｔ細胞のより効率的な捕捉を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、特定の実施形態において入手が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。

本発明の開示の一実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）から約１４日にわたり、またはその間の整数値のいずれかの時間で培養することができる。別の実施形態において、混合物は、２１日間培養することができる。本開示の一実施形態において、ビーズおよびＴ細胞は、約８日間、一緒に培養される。別の実施形態において、ビーズおよびＴ細胞は、２〜３日間、一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間を６０日またはそれより長くできるように、数サイクルの刺激が望ましい場合もある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−αなどの増殖および生存に必要な因子、または当業者公知の細胞増殖のための他のあらゆる添加剤を含有していてもよい適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞増殖のための他の添加剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加された、無血清か、または適切な量の血清（または血漿）または既定されたセットのホルモン、および／またはＴ細胞の増殖および増加に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養でのみ含まれ、対象に注入しようとする細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件下で、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気に加えて５％ＣＯ_２）下で維持される。

様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを受けた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（Ｔ_Ｃ、ＣＤ８^＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（Ｔ_Ｈ、ＣＤ４^＋）を有する。エクスビボでのＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞の増加は、約８〜９日目の前、主としてＴ_Ｈ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、より一層大きいＴ_Ｃ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、主としてＴ_Ｈ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが、有利な場合がある。同様に、Ｔ_Ｃ細胞の抗原特異的なサブセットが単離された場合、このサブセットをより高度に増加させることが有益な場合がある。

さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞増加プロセスの経過中、他の表現型マーカーは、顕著に、ただし大部分は再現性よく変化する。したがって、このような再現性は、活性化Ｔ細胞生成物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。

５．６組成物
本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および／または抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣは、抗グリコＭＵＣ１抗体および／またはＡＤＣ、ならびに１つまたは複数の担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物の形態であってもよい。組成物は、特定の使用のために、例えば、獣医学的な使用またはヒトでの医薬的な使用のために製剤化されてもよい。使用される組成物（例えば、乾燥粉末、液体配合物など）ならびに賦形剤、希釈剤および／または担体の形態は、抗体および／またはＡＤＣの意図される使用によって、さらに治療的使用、投与様式ごとに決まると予想される。

治療的使用の場合、組成物は、医薬的に許容される担体を含む滅菌された医薬組成物の一部として供給されてもよい。この組成物は、あらゆる好適な形態であり得る（患者にそれを投与する望ましい方法に応じて）。医薬組成物は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、クモ膜下、外用または局所などの様々な経路によって患者に投与することができる。いずれかの所与の場合における最も好適な投与経路は、特定の抗体および／またはＡＤＣ、対象、ならびに対象の疾患および身体的な状態の性質および重症度によって決まると予想される。典型的には、医薬組成物は、静脈内または皮下投与されると予想される。

医薬組成物は、１用量当たり予め決定された量の本開示の抗グリコＭＵＣ１抗体および／または抗グリコＭＵＣ１ＡＤＣを含有する単位剤形で都合よく提供することができる。単位用量に含まれる抗体および／またはＡＤＣの量は、処置されている疾患、加えて当業界において周知の他の要因によって決まると予想される。このような単位投薬は、単回投与に好適な抗体および／またはＡＤＣの量を含有する凍結乾燥された乾燥粉末の形態であってもよいし、または液体の形態であってもよい。乾燥粉末の単位剤形は、キット中に、シリンジ、好適な量の希釈剤および／または投与に有用な他の成分と共にパッケージ化されていてもよい。液体形態での単位投薬は、単回投与に好適な量の抗体および／またはＡＤＣで予め充填されたシリンジの形態で都合よく供給することができる。

医薬組成物はまた、複数回投与に好適な量のＡＤＣを含有するバルクの形態で供給されてもよい。

医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液として貯蔵するために、望ましい純度を有する抗体および／またはＡＤＣを、当業界において典型的に採用される任意選択の医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これらは全て、本明細書では「担体」と称される）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性デタージェント、抗酸化剤、および他の混成の添加剤と混合することによって調製してもよい。Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.1980)を参照されたい。このような添加剤は、受容者に対して、採用された投薬および濃度で非毒性であるべきである。

緩衝剤は、ｐＨを生理学的条件に近い範囲に維持することを助ける。緩衝剤は、様々な濃度で存在していてもよいが、典型的には約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在すると予想される。本発明の開示で使用するために好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム（sodium glyconate）混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム（potassium glyuconate）混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などの、有機および無機酸の両方ならびにその塩が挙げられる。加えて、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えばトリスを使用することができる。

微生物の増殖を妨害するために、保存剤が添加されていてもよく、約０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。本発明の開示で使用するために好適な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびアルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、ならびに３−ペンタノールが挙げられる。等張化剤は、時には「安定剤」としても公知であり、本発明の開示の液体組成物の等張性を確実にするために添加することができ、その例としては、多価糖アルコール、例えば３水酸基またはそれより多くの水酸基を有する糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。安定剤は、賦形剤の広義のカテゴリーを指し、これは、増量剤から、治療剤を可溶化したり、または変性または容器壁への接着の防止を助けたりする添加剤まで機能面で様々なものであり得る。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記列挙されたもの）；例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール（myoinisitol）、ガラクチトール、グリセロールなど、例えばシクリトール、例えばイノシトールなどの有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄を含有する還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基またはそれより少ない残基のペプチド）；例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖；例えばラクトース、マルトース、スクロースおよびトレハロースなどの二糖類；ならびに例えばラフィノースなどの三糖（trisaccacharide）；ならびに例えばデキストランなどの多糖類であり得る。安定剤は、ＡＤＣの重量に対して０．５から１０ｗｔ％の範囲の量で存在していてもよい。

非イオン界面活性剤またはデタージェント（「湿潤剤」としても公知）は、糖タンパク質の可溶化を助けることに加えて、撹拌により誘発される凝集から糖タンパク質を保護するために添加されてもよく、それにより、タンパク質変性を引き起こすことなく配合物がストレスを受けた剪断面に曝されることも許容する。好適な非イオン界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（polyoxamer）（１８４、１８８など）、およびプルロニックポリオールが挙げられる。非イオン界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在していてもよい。

追加の混成の賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が挙げられる。

５．７使用方法
本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントは、様々な診断アッセイで使用することができる。例えば、抗体および結合フラグメントは、イムノアッセイ、例えば競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ、例えば、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、およびウェスタンブロットなどで採用することができる。

本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメントはまた、インビボの放射線撮影画像化にも有用であり、その場合、放射線不透過性の薬剤または放射線同位体などの検出可能な部分で標識された抗体が、対象に、好ましくは血流に投与され、標識された抗体の宿主中の存在および位置がアッセイされる。この画像化技術は、悪性腫瘍の病期分類および処置において有用である。

本明細書に記載される抗グリコＭＵＣ１抗体または結合フラグメント、ＡＤＣおよびＣＡＲは、グリコＭＵＣ１を発現するがん、特に上皮がん、例えば乳がん、卵巣がん、膵臓がん、および肺がんを処置するのに有用である。

療法に本開示のＣＡＲを使用する場合、本開示の治療方法は、グリコＭＵＣ１を発現する腫瘍を有する対象に、例えばセクション５．４または実施形態９７または実施形態９８に記載されるように、本開示のＣＡＲを発現するように操作された遺伝子改変細胞の有効量を投与することを含む。ＣＡＲを発現するように細胞、特にＴ細胞を改変する方法は、セクション５．５．１に記載されている。

[実施例１]
抗グリコＭＵＣ１抗体の同定
６．１．１．概要
異なるＯ−グリカン密度およびＴｎ（ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）グリコフォームを有する複数反復ＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素的合成を、組換えグリコシルトランスフェラーゼを使用して開発した。異なるポリペプチドであるＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼアイソフォームを使用して、Ｏ−グリカンの占有部位を割り当てた（Bennett et al., 1998）。最適なワクチン設計は、高いＯ−グリカン密度を有するＴｎグリコフォームであることが見出され、ＫＬＨにコンジュゲートしたグリコペプチドは、耐性を克服することが見出された。野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、完全なＯ−グリカン占有を有するグリコペプチドは、乳がん細胞株で発現されるＭＵＣ１と反応する最も強い抗体応答を惹起したことから、これが最も有効なワクチン設計の代表である。惹起された体液性免疫応答は、がん細胞に驚くべき特異性を示した。

６．１．２．材料および方法
６．１．２．１多量体ＴｎＭＵＣ１グリコペプチドの化学酵素的合成
ＭＵＣ１の６０−ｍｅｒ（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）ｎ＝３（配列番号４７）ペプチドを、Fontenot et al., 1993によって最初に報告されたようにして合成した。使用された対照ペプチドは、ＭＵＣ２（ＰＴＴＴＰＩＳＴＴＴＭＶＴＰＴＰＴＰＴＣ）（配列番号５１）およびＭＵＣ４（ＣＰＬＰＶＴＤＴＳＳＡＳＴＧＨＡＴＰＬＰＶ）（配列番号５２）のタンデムリピート（ＴＲ）から得た。米国特許第６，４６５，２２０号明細書に記載される通り、精製された組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼであるポリペプチドのＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（Bennett et al., 1998；Schwientek et al., 2002）を使用して、ペプチドをインビトロでグリコシル化した。ペプチドのＧａｌＮＡｃグリコシル化を、２５ｍＭのカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを含有する反応混合物（ペプチド１ｍｇ／ｍＬ）中で実行した。１ｍｇのＴＲ１つ当たり２つのＧａｌＮＡｃを有する６０−ｍｅｒのペプチド（ＭＵＣ１６０Ｔｎ６）のグリコシル化を、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を使用して達成した。ＴＲ１つ当たり３つのＧａｌＮＡｃの取り込み（ＭＵＣ１６０Ｔｎ９）を、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を使用して達成した。ＭＵＣ１ＴＲ（ＭＵＣ１６０Ｔｎ１５）中の全ての５つの推定上のＯ−グリコシル化部位の置換を、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４との反応で基質としてＭＵＣ１６０Ｔｎ９を使用して実行した。グリコシル化を、ナノスケールの逆相カラム（ＰｏｒｏｓＲ３、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用してモニターした。グリコペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および０〜８０％アセトニトリルの勾配を使用した、１１００ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄシステム（Ａｖｏｎｄａｌｅ、ＰＡ）におけるＺｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（９．４ｍｍ×２５ｃｍ）（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。グリコシル化反応の収量の定量化および推測を、標準として重さ１０μｇのペプチドを使用したＵＶ２１０吸光度によるＨＰＬＣピークの比較によって実行した。ペプチドのＧａｌＮＡｃグリコシル化の収量は、全体的に８０〜９０％の回収率であった。精製されたグリコペプチドは、ディレイドエクストラクションを備えたＶｏｙａｇｅｒＤＥまたはＶｏｙａｇｅｒＤＥＰｒｏＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられた。ＭＡＬＤＩマトリックスは、０．１％ＴＦＡと３０％アセトニトリル水溶液との２：１混合物中に溶解した１０ｇ／Ｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）であった。０．１％ＴＦＡ中に約１ｐｍｏｌ／ｕＬの濃度に溶解したサンプルを、１μＬのサンプル溶液をプローブチップに入れ、続いて１ｕＬのマトリックスを入れることによって分析のために調製した。全ての質量スペクトルをリニアモードで得た。データ処理を、ＧＲＡＭＳ／３８６ソフトウェア（ＧａｌａｃｔｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）を使用して行った。

６．１．２．２免疫化プロトコール
グリコペプチドを、グルタルアルデヒドを使用してＫＬＨ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）にカップリングした。コンジュゲーションの効率を、画分の抗ＭＵＣ１ＥＬＩＳＡを使用したＰＤ−１０カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより反応を分析することによって評価した。本質的に全ての反応性が、排除された画分で見出され、ペプチドを含有することが予測される排除されなかった画分で、有意ではない反応性が見出された。さらなる評価には、ＥＬＩＳＡでの対応するグリコペプチドとのＫＬＨコンジュゲートの比較滴定分析が含まれていた。コンジュゲーションが完全に近いと、１：３００の、ＫＬＨのグリコペプチドに対する比率がもたらすはずであり、両方の分析はコンジュゲーションが完全に近いことを示した。雌Ｂａｌｂ／ｃ野生型マウスに、総体積２００ｕＬの１０または１５μｇの（糖）ペプチド（フロイントアジュバント、Ｓｉｇｍａとの１：１の混合物）を皮下注射した。マウスは１４日の間隔をあけて４回の免疫化を受け、３回目および４回目の免疫化から１週間後に尾部または目からの出血によって血液サンプルを得た。

６．１．２．３マウスＭＡｂ抗Ｔｎ−ＭＵＣ１の生成
ＫＬＨにカップリングされた完全にＧａｌＮＡｃでグリコシル化された６０−ｍｅｒのＭＵＣ１グリコペプチドで免疫化された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスからＭＡｂを産生した。スクリーニングは、グリコペプチドのＥＬＩＳＡ、それに続く乳がん細胞株（ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ）を用いた免疫細胞学およびがん組織を用いた免疫組織学に基づいてなされた。選択は、同じマウスの総血清に類似した反応性パターンに基づいてなされた。

６．１．２．４ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを、９６−ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して実行した。プレートを、重炭酸−炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍＬのグリコペプチドで、４℃で一晩コーティングし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、続いて血清（ＰＢＳで希釈した）またはＭＡｂと共に室温で２時間インキュベートした。結合した抗体を、ペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはアイソタイプ特異的な抗体であるペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で検出した。プレートをＯ−フェニレンジアミンタブレット（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で展開し、４９２ｎｍで読んだ。対照抗体には、抗ＭＵＣ１抗体であるＨＭＦＧ２およびＳＭ３（Burchell et al., 1987）ならびに抗炭水化物抗体５Ｆ４（Ｔｎ）および３Ｆ１（ＳＴｎ）（Mandel et al., 1991）が含まれていた。対照血清には、ＫＬＨに連結されたＭＵＣ４ムチンペプチドで免疫化されたマウスが含まれていた。

６．１．３．結果
ＧａｌＮＡｃ−ＭＵＣ１に対するグリコペプチド特異的なｍＡｂを、免疫原としてＫＬＨにコンジュゲートしたＧａｌＮＡｃ−ＭＵＣ１の６０−ｍｅｒのグリコペプチドを使用して産生した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用したところ、生成したｍＡｂＧＯ２（５Ｆ７）は、精製された組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ４を使用してインビトロでグリコシル化されたＭＵＣ１タンデムリピート（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）_３（配列番号４７）と特異的に反応し、ＧａｌＮＡｃ−残基を有さない対応するＭＵＣ１ペプチドまたは同じタイプのＴｎグリコフォームを有する無関係のグリコペプチドとは反応しなかった。図１に、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

[実施例２]
抗グリコＭＵＣ１抗体の特徴付け
６．２．１．概要
モノクローナル抗体ＧＯ２（５Ｆ７）を、がん細胞に関連するＭＵＣ１のＴｎグリコフォームへのその結合の特異性に関して特徴付けた。

６．２．２．材料および方法
６．２．２．１免疫細胞化学
細胞株を氷冷したアセトンまたはメタノール：アセトン中で１０分固定した。固定した細胞を、マウス血清（１：２００／１：４００／１：８００）またはＭＡｂと共に５℃で一晩インキュベートし、続いてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共に室温で４５分インキュベートした。スライドをｐ−フェニレンジアミンを含有するグリセロール中でマウントし、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（ＦｌｕｏｒｅｓＳｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｌｌｂｅｒｇｍｏｏｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。

６．２．２．２免疫組織化学
乳癌のホルマリン固定したパラフィンワックス包埋組織を得た。全てのケースを組織型によって慣習的に分類した。免疫染色には、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体方法を使用した。パラフィン切片からワックスを取り除き、再水和し、メタノール中の０．５％Ｈ_２Ｏ_２で３０分処理した。切片をＴＢＳ中で濯ぎ、ウサギ非免疫血清と共に２０分インキュベートした。切片を濯ぎ、一次抗体と共に５℃で一晩インキュベートした。切片を濯ぎ、ＴＢＳで１：２００に希釈したビオチンで標識されたウサギ抗マウス血清（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共に３０分インキュベートし、ＴＢＳで濯ぎ、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＤａｋｏＣｙｔｏ−ｍａｔｉｏｎ）と共に１時間インキュベートした。切片をＴＢＳで濯ぎ、０．１％Ｈ_２Ｏ_２を含有する０．０５ＭＴＢＳ中の新たに調製した０．０５％３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを用いて展開した。切片をヘマトキシリンで染色し、脱水し、マウントした。

６．２．３．結果
結腸直腸癌、膵臓癌、および浸潤性乳腺癌の免疫組織化学をＧＯ２を用いて行った。結腸直腸がん組織の染色（図２）から、がん細胞の大部分における細胞内および表面構造の強い標識が実証された。対照的に、健康な円柱上皮細胞に対する反応性は、見られなかったか極めて低かった。健康な細胞における標識は、細胞内構造に制限された。これは、結腸の円柱上皮などの高い分泌能力を有する細胞中に大量の生合成中間体（ＧａｌＮＡｃ改変糖タンパク質）が存在することに起因すると予想される。類似のパターンが膵臓（図３）および乳がん組織（図４）で観察され、がん細胞とは強い反応性を示したが、周囲の健康な上皮または結合組織細胞における細胞内構造とは、反応性がないか限定的な反応性しかなかった。

[実施例３]
抗グリコＭＵＣ１抗体の配列分析
モノクローナル抗体ＧＯ２（５Ｆ７）を産生するハイブリドーマからのｍＲＮＡを調製し、逆転写し、シーケンシングした。

重鎖および軽鎖可変領域をそれらのシグナル配列と共にコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載される。配列番号１１および配列番号１２によってコードされた重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載される。予測された成熟可変領域配列（シグナルペプチドの切断後）は、それぞれ配列番号３および配列番号４に記載され、それぞれ配列番号１３および配列番号１４によってコードされる。予測された重鎖ＣＤＲ配列（ＩＭＧＴの定義）は、それぞれ配列番号５〜７に記載され、予測された軽鎖ＣＤＲ配列（ＩＭＧＴの定義）は、それぞれ配列番号８〜１０に記載される。

[実施例４]
抗グリコＭＵＣ１抗体を用いたがん細胞への薬物送達
６．４．１．概要
モノクローナル抗体ＧＯ２（５Ｆ７）を、標的細胞に細胞傷害性物質を送達するその能力に関して試験した。

６．４．２．材料および方法
ＯＶＣａｒヒト卵巣癌細胞を、２４−ウェル細胞培養プレートに細胞１，０００個／ウェルで添加した。モノクローナル抗体ＧＯ２および抗チューブリン剤であるモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（抗ｍＦｃ−ＮＣ−ＭＭＡＦ）（Ｍｏｒａｄｅｃカタログ番号ＡＭ−１０１−ＡＦ）にコンジュゲートした二次抗体をプレートに添加して、以下の濃度（μｇ／ｍｌで）のＧＯ２およびＡＤＣを得た。

プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、６００ｎｍでの蛍光を測定した。

６．４．３．結果
図５に結果を示す。結果は、細胞毒性が、一次抗体（ＧＯ２）の濃度および抗体の存在、ならびに二次ＡＤＣコンジュゲート抗体の濃度および存在に依存することを示す。言い換えれば、ＧＯ２は、細胞傷害性物質ＭＭＡＦを有する二次抗体とカップリングされた場合、このがん細胞株の細胞毒性を誘発する。

[実施例５]
抗Ｍｕｃ１抗体を用いた循環腫瘍細胞の定量化
６．５．１．概要
モノクローナル抗体ＧＯ２（５Ｆ７）を、循環腫瘍細胞を定量化するのに使用されるその能力に関して試験した。

６．５．２．材料および方法
ＧＯ２を磁気分離ビーズにコンジュゲートし、異なる濃度の腫瘍細胞のサンプルと相互作用させた。細胞およびビーズを磁石を用いて溶液から引き出し、数回洗浄して、未結合の材料を除去した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたＧＯ２を、結合したがん細胞を含有する磁気分離ビーズにアプライし、インキュベートし、次いで未結合のコンジュゲートしたＧＯ２を洗浄して除いた。基質としてＴＮＢを使用して比色反応を実行した。反応を硫酸を用いて終結させ、次いでサンプルのＯＤ４５０の読み取り値を取った。

６．５．３．結果
図６に結果を示す。アッセイの結果は、ＧＯ２腫瘍細胞の結合を実証した。

[実施例６]
抗グリコＭＵＣ１抗体を使用した腫瘍組織の免疫組織化学的染色
６．６．１．材料および方法
６つのホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）からの切片を２．５μｍの厚さにカットした。乳がん（ＢＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、卵巣がん（ＯＶＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および前立腺がん（ＰｒＣ）腫瘍からのＴＭＡを研究に使用した。ＴＭＡ１つ当たり２５〜４７個の腫瘍組織コアが評価に利用可能であった。コアサイズはＴＭＡに応じて１ｍｍ、２ｍｍまたは３ｍｍであった。各組織コアは、１人の患者の標本である。

染色を、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＸＴオートステイナー（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）で実行した。細胞条件１（ＣＣ１）溶液（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）を用いた抗原賦活化後、ＧＯ２を、Ｄａｋｏグリーンメディウム（ｇｒｅｅｎｍｅｄｉｕｍ）抗体希釈剤中、１μｇ／ｍＬの濃度で適用し、３７℃で６０分インキュベートした。腫瘍細胞へのＧＯ２の結合を、ＤＡＢで可視化（茶色の沈殿）したＯｐｔｉｖｉｅｗＤＡＢＩＨＣ検出キット（ＶｅｎｔａｎａＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して検出した。

６．６．２．結果
図７に、ＭＵＣ１陽性ＴＭＡ腫瘍コアの代表的な画像を示す。ＢＣおよびＯＶＣＴＭＡにおいて、スポットの大部分（＞９０％）が、中程度のまたは強い腫瘍細胞へのＧＯ２の結合を示した。ＮＳＣＬＣおよびＣＲＣのケースの７０％および５１％が、それぞれ中程度のおよび強い腫瘍細胞への抗体の結合を示した。前立腺がんでは、抗原の発現はより少ないようであった。ＴＭＡ１におけるスポットの２８％のみが、ＧＯ−２を適用した場合、中程度のまたは強い染色強度を示した。染色パターンは常に細胞質内であり、多くの場合において膜結合型であった。頂端膜染色パターンはほとんどのコアで観察されなかった。

[実施例７]
Ｔ細胞の二重特異性（ＴＣＢ）様式での抗ＭＵＣ１抗体の産生および精製
６．７．１．材料および方法
６．７．１．１発現ベクターの産生
Ｆｃ領域中にノブ−イントゥー−ホールおよびＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」）突然変異、ならびにＭＵＣ１ＣＨ１（１４７Ｅ／２１３Ｅ；「ＥＥ」）およびＣＬ（１２３Ｒ／１２４Ｋ；「ＲＫ」）領域中に電荷を有する残基を含むＴＣＢ様式に、ＧＯ２抗体を変換した（配列番号４３〜４６を参照）。図８に、ＴＣＢ抗体を例示する。簡単に言えば、ＧＯ２ｍＡｂの可変重鎖および可変軽鎖を合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、それらが適切なヒト定常重鎖またはヒト定常軽鎖に融合される好適な発現ベクターに挿入した。これらのベクター中の発現カセットは、５’ＵＴＲおよびＢＧＨポリアデニル化部位と共に、ＣＭＶプロモーター、イントロンＡからなる。加えて、プラスミドは、ＥＢＶ核抗原（ＥＢＮＡ）を内包するＨＥＫ２９３細胞における安定な維持のために、エプスタイン−バーウイルス由来のｏｒｉＰ領域を含有する。

６．７．１．２一過性トランスフェクションおよび産生
以下のようにＰＥＩ媒介トランスフェクション手順を使用してＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞中で、抗体を一時的に産生した。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞は、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＥｘｃｅｌｌ培養培地中の無血清の懸濁液中で培養される。５００ｍｌ振盪フラスコでの抗体の産生のために、トランスフェクションの２４時間前に、３億個のＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞をシーディングする（したがって代替のスケールの場合、全量を調整する）。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで１０分遠心分離し、上清を、予め温めた２０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地で交換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤＣＨＯ培地中に混合して、最終的なＤＮＡ量を２００μｇにする。５４０μｌのＰＥＩを添加した後、溶液を１５秒ボルテックスで混合し、その後室温で１０分インキュベートする。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ_２雰囲気を含むインキュベーター中で３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション後、６ｍＭのグルタミン、１．２５ｍＭのバルプロ酸および１２．５％Ｐｅｐｓｏｙを含有する１６０ｍｌのＥｘ−ｃｅｌｌ（登録商標）培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１２％フィード７（４８ｍＬ）＋３ｇ／Ｌグルコースを添加する。７日後、３０００×ｇで４５分の遠心分離による精製のために培養上清を収集する。溶液を滅菌ろ過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを添加する。次いで溶液を４℃で貯蔵する。

６．７．１．３抗体精製
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィー、それに続きサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＡＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。平衡緩衝液で洗浄することによって未結合のタンパク質を除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０を用いて作製した段階的（標準ＩｇＧ）または勾配（二重特異性抗体）溶出のいずれかを使用して溶出させた。収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ８．０を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、ろ過し、その後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にローディングした。

溶出した画分の集合体の内容物を、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。したがって、３０μｌの各画分を、２００ｍＭのアルギニン、２５ｍＭのＫ_２ＰＯ_４、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ６．７で平衡化したＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー株式会社、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）にアプライした。２％未満のオリゴマーを含有する画分をプールし、遠心濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ−１５、３０ｋＭＷＣＯ）を使用して１〜１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に濃縮した。精製されたタンパク質を−８０℃で貯蔵した。

６．７．２．結果
表５に、ＧＯ２ＴＣＢ抗体の産生収率および品質を示す。

[実施例８]
エクスビボでの未消化の患者由来の腫瘍サンプルにおける標的発現をモニターするためのＪｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイ
６．８．１．概要
ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴレポーターアッセイを使用して、エクスビボでの未消化の初代ヒト腫瘍サンプルにおける標的発現（グリコＭＵＣ１）を、ＧＯ２ＴＣＢを使用してモニターした。

６．８．２．材料および方法
６．８．２．１材料
・ＧＯ２ＴＣＢ（実施例７を参照）
・ＤＰ４７ＴＣＢ（非標的化陰性対照）
・Ｍａｔｒｉｇｅｌ（アイテム番号７３４−１１０１、Ｃｏｒｎｉｎｇ／ＶＷＲ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
・Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗアタッチメントマルチウェルプレート（アイテム番号ＣＬＳ７００７−２４ＥＡ、Ｓｉｇｍａ）
・細胞培養マイクロプレート、９６ウェル（アイテム番号６５５０９８、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
・ＲＰＭＩ１６４０培地（アイテム番号４２４０１−０１８、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｃｈｗｅｉｚ）
・Ｊｕｒｋａｔ培地：２ｇ／ｌのＤ−グルコース、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ_３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＲＰＭＩ１６４０培地
・ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）
・ＩｎｄｉｖｕｍｅｄＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙから受け取った腫瘍サンプル。サンプルは一晩かけて輸送培地中で送られた。外科手術の約２４時間後、サンプルを細かくカットした。

６．８．２．２方法
９６−ウェル細胞培養マイクロプレートを、１７μｌの冷たいＭａｔｒｉｇｅｌを添加することによって調製した。プレートを３７℃で２分インキュベートし、その後、腫瘍断片を添加した（３連）。ウェルごとに３３μｌの冷たいＭａｔｒｉｇｅｌを添加し、プレートを再度３７℃で２分インキュベートした。ウェルごとに１００μｌ（５０ｎＭまたは５ｎＭ）のＴＣＢ抗体希釈（ハイグロマイシン非含有であるが２×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＪｕｒｋａｔ培地で希釈した）を添加した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存率を評価した。細胞を３５０×ｇで７分遠心分離し、その後、それらをハイグロマイシン非含有のＪｕｒｋａｔ培地に再懸濁した。ウェルごとに５０μｌの細胞懸濁液を添加した（細胞５０，０００個／ウェル）。加湿したインキュベーター中でプレートを３７℃で４から５時間インキュベートし、その後、発光の読み出しのためにそれを取り出した。５０μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液を各ウェルに添加し、暗所で、室温で１０分インキュベートした。ＷＡＬＬＡＣＶｉｃｔｏｒ３ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を５秒／ウェルの検出時間で使用して、発光を検出した。

６．８．３．結果
図９〜１１に、３人の患者からの腫瘍サンプルからの結果を示す。図９に示される結果は、気管支および肺の悪性新生物：中葉、気管支または肺、扁平上皮癌を有する患者から得られた腫瘍サンプルからのものである。図１０に示される結果は、気管支および肺の悪性新生物：下葉、気管支または肺、非角化型扁平上皮癌を有する患者から得られた腫瘍サンプルからのものである。図１１に示される結果は、気管支および肺の悪性新生物：上葉、気管支または肺、腺房型を有する腺癌を有する患者から得られた腫瘍サンプルからのものである。図９〜１１に記載の各バーは、３連の平均を表す。標準誤差は、エラーバーによって示される。点線は、ＴＣＢをまったく用いずに腫瘍サンプルと共にインキュベートされたＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ細胞の発光を示す。対応のない両側ｔ検定を統計的分析に使用した。０．０５未満のＰ値を有意とみなし、星印と共に示した（^＊Ｐ≦０．０５；^＊＊Ｐ≦０．００１；^＊＊＊Ｐ≦０．００１）。図９〜１１のそれぞれにおいて、ＧＯ２ＴＣＢと共にインキュベートした腫瘍サンプルは、ＤＰ４７陰性対照ＴＣＢと共にインキュベートしたサンプルより有意に高い発光を呈した。

[実施例９]
インビトロにおけるＧＯ２ＴＣＢの特徴付け
６．９．１．概要
腫瘍特異的な異常にグリコシル化されたＭＵＣ１を認識するＧＯ２ＴＣＢ（実施例７）を、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞で機能的に特徴付けた。

６．９．２．材料および方法
６．９．２．１細胞株およびＰＢＭＣ
Ｔ３Ｍ４ｐｆｚｖおよびＭＣＦ７ｃｓで操作された腫瘍細胞株を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ＭＣＦ１０Ａは、ヒト非腫瘍形成性乳房上皮細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１０３１７）である。ＨＢＥｐｉＣは、ヒト気管支上皮細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ番号３２１０）である。健康な志願者からの全血を使用した勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。

６．９．２．２フローサイトメトリーによる標的結合
示された標的細胞を細胞解離緩衝液を用いて回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。９６−ウェルの丸底プレート中で抗体染色を実行した。ウェル１つ当たり２００，０００個の細胞をシーディングした。プレートを４００ｇで４分遠心分離し、上清を除去した。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、３０μｌの抗体溶液を、４℃で３０分かけて細胞に添加した。未結合の抗体を除去するために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、希釈した二次抗体（ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγフラグメント特異的、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ番号１０９−１１６−１７０）を添加した。４℃で３０分インキュベートした後、未結合の二次抗体を洗浄して除去した。測定の前に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａを使用したフローサイトメトリーによって分析した。アッセイを３連で実行した。

６．９．２．３Ｔ細胞によって媒介される腫瘍細胞の致死およびＴ細胞の活性化
標的細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて回収し、計数し、生存率をチェックした。細胞をそれらそれぞれの培地に細胞３００，０００個／ｍｌの最終濃度で再懸濁した。次いで１００μｌの標的細胞懸濁液を９６−平底プレートの各ウェルに移した。インキュベーター中で、プレートを３７℃で一晩インキュベートして、細胞をプレートに接着させた。次の日、ＰＢＭＣを全血から単離した。血液をＰＢＳで２：１に希釈し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブ中の１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（番号１０７７１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の上に重ね、ブレーキをかけずに４５０ｇで３０分遠心分離した。遠心分離の後、細胞を含有するバンドを１０ｍｌピペットを用いて収集し、５０ｍｌチューブに移した。チューブにＰＢＳを５０ｍｌまで満たし、遠心分離した（４００ｇ、１０分、室温）。上清を除去し、ペレットをＰＢＳに再懸濁した。遠心分離の後（３００ｇ、１０分、室温）、上清を捨て、２本のチューブをプールし、洗浄工程を繰り返した（このときは３５０ｇ、１０分、室温の遠心分離）。その後、細胞を再懸濁し、細胞係数のためにペレットを５０ｍｌのＰＢＳ中にプールした。細胞を計数した後、遠心分離し（３５０ｇ、１０分、室温）、２％ＦＣＳおよび２ｎＭグルタミンを含むＲＰＭＩ中に細胞６００万個／ｍｌで再懸濁した。プレーティングした標的細胞から培地を除去し、２％ＦＣＳおよび２ｎＭグルタミンを含むＲＰＭＩで希釈した試験抗体を添加した。エフェクター細胞溶液の３００，０００個の細胞を各ウェルに移し、１０：１の比率のＥ：Ｔを得た。最大の放出を決定するために、標的細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解させた。２４時間および４８時間後、細胞傷害性検出キット（１６４４７９３、ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ）を使用してＬＤＨ放出を決定した。腫瘍細胞致死後のＴ細胞における活性化マーカーの上方調節を、フローサイトメトリーによって測定した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを回収し、９６−ウェルの丸底プレートに移し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈したＣＤ４ＡＰＣ（３００５１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８ＦＩＴＣ（３４４７０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ＢＶ４２１（３０２６３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９ＰＥ（３１０９０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体で染色した。４℃で３０分インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａＩＩを使用して蛍光を測定する前に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。アッセイを３連で実行した。

６．９．２．４サイトメトリービーズアレイによるサイトカイン／ケモカイン放出
製造元のガイドラインに従ってサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を使用したフローサイトメトリーによって、上清中のサイトカイン／ケモカイン分泌を測定した。Ｔ細胞媒介致死アッセイからの上清を収集し、−２０℃で貯蔵した。その後、上清を融解させ、製造元の説明書に従って試験した。以下のＣＢＡキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した：ＣＢＡヒトインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）Ｆｌｅｘセット（Ｅ７）、ＣＢＡヒトグランザイムＢＦｌｅｘセット（Ｄ７）、ＣＢＡヒトＩＬ６Ｆｌｅｘセット（Ａ７）、ＣＢＡヒトＩＬ８Ｆｌｅｘセット（Ａ９）、ＣＢＡヒトＩＬ１０Ｆｌｅｘセット（Ｂ７）およびＣＢＡヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）Ｆｌｅｘセット（Ｄ９）。ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを使用してサンプルを測定し、Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析を実行した。アッセイを３連で実行した。

６．９．３．結果
両方とも異常にグリコシル化されたＭＵＣ１を発現するように操作された乳がん細胞株ＭＣＦ７および膵臓がん細胞株Ｔ３Ｍ４へのＧＯ２ＴＣＢの結合を確認した（図１２）。その後、新たに単離したＰＢＭＣを使用して、両方の腫瘍細胞株、ＭＣＦ７およびＴ３Ｍ４におけるＧＯ２ＴＣＢの活性を試験した（図１３および図１４）。２４時間後に、両方の細胞株の腫瘍細胞の致死が検出され、４８時間後にはより一層強くなっていた。これと同時に、２つの活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節、ならびにＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびグランザイムＢの上清への放出によって決定されたＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の強い活性化が起こった。陰性対照として、それぞれの非標的化ＴＣＢが含まれている。

ＧＯ２ＴＣＢが、上皮細胞上の正常にグリコシル化されたＭＵＣ１に結合しないことを証明するために、ヒト非腫瘍形成性乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０Ａ、および初代ヒト気管支上皮細胞であるＨＢＥｐｉＣへの結合を試験した。陽性対照として、正常な細胞上で発現されたＭＵＣ１と腫瘍細胞上で発現されたＭＵＣ１とを識別しないＨＭＦＧ１ＴＣＢが含まれていた。ＨＦＭＧ１ＴＣＢは、両方の試験した細胞に結合することが見出されたことから、ＭＵＣ１の発現が確認されるが、ＧＯ２ＴＣＢはこれらの細胞に結合することができなかった（図１５）。加えて、ＧＯ２ＴＣＢを試験して、それがＭＵＣ１を発現する正常な上皮細胞の存在下で致死またはＴ細胞の活性化を誘導するかどうかを見た。これをＭＣＦ１０Ａ細胞で試験したところ、ＧＯ２ＴＣＢで検出可能な致死またはＴ細胞の活性化はなく、それに対してＨＭＦＧ１ＴＣＢは、致死に加えてＴ細胞の活性化も誘導した（図１６）。

[実施例１０]
表面プラズモン共鳴によるＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢ抗体の機能的な特徴付け
６．１０．１．概要
ＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢ（実施例７）を、表面プラズモン共鳴によって特徴付けた。

６．１０．２．材料および方法
６．１０．２．１固定されたグリコペプチドへのＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢの結合
ヒトおよびカニクイザルのグリコペプチドへのＧＯ２抗体およびＧＯ２ＴＣＢの結合（表６）を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００で、２５℃で、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実行した。

ビオチン化したグリコペプチドをＰＢＳ中に溶解し、最終濃度を０．９から１．８ｍｇ／ｍｌの間にした（表６）。ビオチン化したグリコペプチドをストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接カップリングした。最大８８０共鳴単位（ＲＵ）の固定レベルを使用した。フローセルを通る３０μＬ／分のフローを用いて、２４０秒にわたり、１０００ｎＭの濃度で、ＧＯ２抗体またはＧＯ２ＴＣＢを注入した（図１７）。解離を５００秒にわたりモニターした。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定されていない参照フローセルで得られた応答を引くことによって補正した。

６．１０．２．２固定されたグリコペプチドへのＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢの結合活性
ＧＯ２およびＧＯ２ＴＣＢの結合活性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００で、２５℃で、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実行した。ビオチン化したグリコペプチド（表６）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接カップリングした。最大２００共鳴単位（ＲＵ）の固定レベルを使用した。

フローセルを通る３０μＬ／分のフローを用いて、１２０秒にわたり、３．９から１０００ｎＭ範囲の濃度で（１：２希釈）、ＧＯ２抗体またはＧＯ２ＴＣＢを注入した。解離を４００秒モニターした。バルクの屈折率差を、タンパク質が固定されていない参照フローセルで得られた応答を引くことによって補正した。相互作用の２価性にもかかわらず、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して曲線を１：１のラングミュア結合に当てはめることによって、ＫＤを得た。それゆえに「見かけの」ＫＤは、比較目的でのみ使用することができる。

６．１０．３．結果
図１８のセンサーグラムから見ることができるように、ＧＯ２抗体（図１８Ａ）およびＧＯ２ＴＣＢ（図１８Ｂ）は、ヒトおよびカニクイザルグリコペプチドの両方と結合する。ＧＯ２抗体およびＧＯ２ＴＣＢは、ヒトグリコペプチドより高い結合活性で、カニクイザルグリコペプチドに結合する。

図１９から見ることができるように、ヒトグリコペプチドへの２価のＧＯ２バインダー（ＩｇＧ、ＴＣＢ）の結合は、３桁のナノモル濃度であり（図１９Ａおよび１９Ｃ）、それに対してカニクイザルグリコペプチドへの結合は、２桁のナノモル濃度である（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。

[実施例１１]
カニクイザルにおけるＧＯ２ＴＣＢの探索的単回用量の薬物動態学的および忍容性研究
６．１１．１．概要
この研究の目的は、カニクイザルへの単回の静脈注射によって与えられる場合の、実施例７に記載されるＧＯ２ＴＣＢの薬物動態学および忍容性を決定するためである。

６．１１．２．材料および方法
６．１１．２．１ＧＯ２ＴＣＢの調製
ＧＯ２ＴＣＢ（２．１２ｍｇ／ｍＬ）および配合緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ６．０）の凍結したストック溶液の融解を、４℃で維持されるように設定された冷蔵庫で一晩行う。試験項目の投与配合物を、滅菌条件下で、配合緩衝液での希釈によって用量レベルの必要条件を満たす適切な濃度に調製する。

投与配合物は、注射前の２時間以内に調製され、使用まで室温で貯蔵される。投与配合物の調製および貯蔵には、吸着を防止するためにポリプロピレン容器が使用される。投与配合物は、ろ過すべきではなく、撹拌または振盪もすべきではない。いずれの混合も、穏やかなピペッティングまたは穏やかな容器のスイングのいずれかによってなされる。

６．１１．２．２動物
２〜４歳であり体重４ｋｇ未満のカニクイザル（カニクイザル（Macaca fascicularis））が研究に使用される。動物は、投与開始前の少なくとも６週間、試験施設である霊長類毒物学施設に順化させる。

投与開始の前の週の間、動物は、十分な獣医学的検査（到着直後に実行される）、臨床的な観察記録、体重のプロファイルおよび臨床病理学的調査に基づき、実験への参加について承認を受ける。

研究のために選択された動物は、供給されたグループ適合性の情報と次いで支給された個々の研究数に基づいてランダムにケージに割り当てられる。動物は、最大５つのグループでケージに割り当てられる。

６．１１．２．３管理
動物を、可能であれば、２つの階の動物群の囲いに性別ごとに最大５つのグループに社会的に隔離し、下の階で１．６１×１．６６×２．５ｍ、上の階で１．６１×１．６６×２．０３ｍを測定する。土台の材料は、木材の削りくずである。土台中には研究目的に干渉すると予想される公知の汚染物質はない。

動物室の環境の標的化条件は、以下の通りである：
温度：１８〜２４℃
湿度：４０〜７０％
換気：１時間当たり最低限１０回の空気交換
光サイクル：１２時間の明期および１２時間の暗期（研究手順／活動により中断されるときを除く）。

温度および湿度の自動制御が行われ、これは、連続的にモニターされ、記録される。光サイクルの自動制御が行われる。

特別食供給（ＳＤＳ：Special Diets Service）ＭＰ（Ｅ）ショートＳＱＣ食（Short SQC Diet）が、研究中にわたり１日分の配給として提供される。動物１匹当たりおよそ２００グラムの餌の配給が１日１回提供される。餌中には研究目的に干渉すると予想される公知の汚染物質はない。動物は、共同の供給源から制限なく水を摂取する。水中には研究目的に干渉すると予想される公知の汚染物質はない。

社会的相互作用、遊び、および調査が促進されるように、動物の室内環境を豊かにする。動物は、安全な場所、およびプラスチックのおもちゃ、ボール、よじ登りのためのフレームおよびステンレス鋼の鏡などの資材を有する。これらは、慣れを低減するために頻繁に交換される。交換の前に、全てのおもちゃおよびよじ登りのためのフレームは、交差汚染を回避するために徹底的にクリーニングされる。動物はまた、通常は毎日、飼料混合物、野菜、堅果、ビスケットおよび果物などの様々な他のごほうびも提供される。

研究の経過中にわたり、獣医学的ケアを受けることが可能であり、臨床徴候または他の変化により当然と認められた場合、動物は獣医科のスタッフによる検査を受ける。

６．１１．２．４実験設計
１匹の雄および１匹の雌の動物にＧＯ２ＴＣＢを投与する。

ＧＯ２ＴＣＢは、少なくとも８日間あけて、伏在静脈または尾静脈における単回の静脈内へのゆっくりとしたボーラス注射（１〜２分）によって適切な動物に投与される。これは、どの１日においても１匹の雄および１匹の雌のみが新しい用量レベルを受けるように時間差でなされる。以前の用量レベルからの観察（臨床病理学データを含む）に基づいて、次の用量グループでは用量を増加または減少させる。各用量レベルにはナイーブ動物が使用される。用量は、Ｖｙｇｏｎ注射針が取り付けられたシリンジを使用して与えられる。

投与の約７２時間後（最後の計画的なサンプルを採取した後）に動物の検死を行う。重度の臨床症状のために計画的な日付の前に終結させなければならない全ての動物に関して、臨床病理学（可能であれば終結前の追加のサンプリング）および組織病理学の完全なパネルが分析される。

静脈注射による投与経路は、臨床的な適用の可能な経路であるため、この経路がこの研究に選択されている。臨床的に重要な用量範囲を網羅し、動物への起こり得る傷害を最小化するような低用量および高用量レベルを選択した。低用量は、類似の効力を有する類似のＴ細胞二重特異性抗体を用いたカニクイザルにおける経験に基づき選択され、高用量は、それを３倍に増加した量に相当する。

６．１１．３．結果
ＧＯ２ＴＣＢは、試験した用量で許容される。

７．具体的な実施形態、参考文献の引用
様々な具体的な実施形態を例示し記載したが、本開示の本質および範囲から逸脱することなく様々な変更をなすことができることが理解されると予想される。本発明の開示は、以下に記載の番号付けされた実施形態によって例示される。

１．ａ．正常細胞と比較して、がん細胞上で過剰発現されるグリコＭＵＣ１エピトープに優先的に結合し；
ｂ．乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄへの結合に関して、配列番号３の重鎖可変（ＶＨ）配列および配列番号４の軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合する抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２．ａ．精製された組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ４を使用してインビトロでグリコシル化されたＭＵＣ１タンデムリピート（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）_３（以下、「第１のエピトープ」と称する）に結合し；かつ、
ｂ．乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄへの結合に関して、配列番号３の重鎖可変（ＶＨ）配列および配列番号４の軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合する抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３．配列番号３３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、実施形態１または実施形態２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４．ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

５．ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

６．ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

７．ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、実施形態３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

８．ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態３から７のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

９．ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、実施形態３から７のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１０．ＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、実施形態３から９のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１１．ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、実施形態３から１０のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１２．ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、実施形態３から１０のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１３．ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、実施形態３から１２のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１４．ＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、実施形態３から１３のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１５．ＶＨが、配列番号５〜７の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＶＬが、配列番号８〜１０のＣＤＲを含む、実施形態１または実施形態２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１６．ＶＨが、配列番号２３〜２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＶＬが、配列番号２６、２７、および１０のＣＤＲを含む、実施形態１または実施形態２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１７．ＶＨが、配列番号２８、２９、および２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＶＬが、配列番号３０、９、および３１のＣＤＲを含む、実施形態１または実施形態２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１８．キメラ抗体またはヒト化抗体である、実施形態１から１７のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

１９．ＶＨが、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２０．ＶＨが、配列番号３と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２１．ＶＨが、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１から１８のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２２．ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１または実施形態２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２３．多価である、実施形態１から２２のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２４．単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態である、実施形態１から２２のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２５．ｓｃＦｖが、軽鎖可変フラグメントのＮ末端側に重鎖可変フラグメントを含む、実施形態２４に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２６．ｓｃＦｖの重鎖可変フラグメントおよび軽鎖可変フラグメントが、４〜１５アミノ酸のリンカー配列に共有結合している、実施形態２４に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２７．多重特異性抗体の形態である、実施形態１から２２のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２８．多重特異性抗体が、第１のエピトープと異なる第２のエピトープに結合する二重特異性抗体である、実施形態２７に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

２９．二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ、Ｆａｂアーム交換抗体、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）、または二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）である、実施形態２８に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３０．二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂである、実施形態２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３１．二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^ＦＡＢである、実施形態３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３２．二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ−ＶＬ}である、実施形態３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３３．二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１−ＣＬ}である、実施形態３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３４．二重特異性抗体が、Ｆａｂアーム交換抗体である、実施形態２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３５．二重特異性抗体が、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）である、実施形態２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３６．二重特異性抗体が、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）である、実施形態２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３７．第２のエピトープが、ＭＵＣ１エピトープである、実施形態２８から３５のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３８．第２のエピトープが、正常細胞と比較して、がん細胞上で過剰発現されるＭＵＣ１エピトープである、実施形態２８から３５のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

３９．第２のエピトープが、Ｔ細胞エピトープである、実施形態２８から３６のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４０．Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ８エピトープ、ＣＤ１６エピトープ、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ２８エピトープ、またはＮＫＧ２Ｄエピトープを含む、実施形態３９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４１．Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ３エピトープを含み、ＣＤ３エピトープは、任意選択でヒトＣＤ３に存在するエピトープである、実施形態４０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４２．ＣＤ３エピトープが、ＣＤ３ガンマエピトープ、ＣＤ３デルタエピトープ、ＣＤ３イプシロンエピトープ、またはＣＤ３ゼータエピトープを含む、実施形態４１に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４３．検出可能な部分にコンジュゲートされている、実施形態１から４２のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４４．検出可能なマーカーが、酵素、放射線同位体、または蛍光標識である、実施形態４３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。

４５．ＣＤ３（任意選択でヒトＣＤ３）に結合する第１の抗原結合ドメインおよびグリコＭＵＣ１に結合する第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体であって、二重特異性抗体は、乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄへの結合に関して、配列番号３の重鎖可変（ＶＨ）配列および配列番号４の軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合し、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体。

４６．第２の抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号５のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態４５に記載の二重特異性抗体。

４７．第１の抗原結合ドメインが、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む、実施形態４５または実施形態４６に記載の二重特異性抗体。

４８．第１の抗原結合ドメインが、配列番号４０の重鎖可変領域配列および配列番号４１の軽鎖可変領域配列を含む、実施形態４７に記載の二重特異性抗体。

４９．第２の抗原結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む、実施形態４５から４８のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

５０．第２の抗原結合ドメインが、配列番号３の重鎖可変領域配列および配列番号４の軽鎖可変領域配列を含む、実施形態４９に記載の二重特異性抗体。

５１．第１および／または第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、実施形態４５から５０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

５２．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変または定常領域のいずれかが交換されている交差Ｆａｂ分子である、実施形態５１に記載の二重特異性抗体。

５３．二重特異性抗体の第１および第２の抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合ドメインの一方（特に第１の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、
ａ．第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｂ．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、正電荷を有するアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、負電荷を有するアミノ酸で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、
ＶＨ／ＶＬの交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は、互いに置き換えられていない、実施形態５２に記載の二重特異性抗体。

５４．ａ．第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）；または
ｂ．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５３に記載の二重特異性抗体。

５５．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸または２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５４に記載の二重特異性抗体。

５６．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５５に記載の二重特異性抗体。

５７．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で独立して置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５５に記載の二重特異性抗体。

５８．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５７に記載の二重特異性抗体。

５９．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態５７に記載の二重特異性抗体。

６０．第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬが、カッパアイソタイプの定常ドメインＣＬである、実施形態５３から５９のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

６１．第１および第２の抗原結合ドメインが、任意選択でペプチドリンカーを介して、互いに融合している、実施形態４５から６０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

６２．第１および第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているかのいずれかである、実施形態６１に記載の二重特異性抗体。

６３．二重特異性抗体が、ＣＤ３への１価の結合を提供する、実施形態４５から６２のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

６４．グリコＭＵＣ１に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインを含む、実施形態６３に記載の二重特異性抗体。

６５．グリコＭＵＣ１に特異的に結合する２つの抗原結合ドメインが、同じアミノ酸配列を含む、実施形態６４に記載の二重特異性抗体。

６６．二重特異性抗体が、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインをさらに含む、実施形態４５から６５のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

６７．Ｆｃドメインが、ＩｇＧＦｃドメインである、実施形態６６に記載の二重特異性抗体。

６８．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ_１Ｆｃドメインである、実施形態６７に記載の二重特異性抗体。

６９．Ｆｃドメインが、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインである、実施形態６７に記載の二重特異性抗体。

７０．ＩｇＧ_４Ｆｃドメインが、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換（ＫａｂａｔＥＵインデックスの番号付け）、好ましくはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、実施形態６９に記載の二重特異性抗体。

７１．Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、実施形態６６に記載の二重特異性抗体。

７２．Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインであり、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインは、任意選択で、配列番号４２を含んでいてもよい、実施形態７１に記載の二重特異性抗体。

７３．第１、第２、および存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、（ａ）（ｉ）第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、または（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているかのいずれかであり；（ｂ）第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、実施形態６６から７２のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

７４．Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む、実施形態６６から７３のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

７５．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体および／またはエフェクター機能への結合を低減する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、実施形態６６から７４のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

７６．ａ．ＣＤ３に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインであって、第１の抗原結合ドメインは、交差Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変または定常領域のいずれか、好ましくは可変領域は、交換されている、第１の抗原結合ドメイン；
ｂ．グリコＭＵＣ１に特異的に結合する第２および第３の抗原結合ドメインであって、配列番号５の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号７のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号８の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、第２および第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子である、第２および第３の抗原結合ドメイン；
ｃ．安定な会合が可能な、第１および第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン
を含み、
第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、実施形態４５に記載の二重特異性抗体。

７７．第１の抗原結合ドメインが、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３５のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８のＣＤＲ−Ｌ２および配列番号３９のＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態７７に記載の二重特異性抗体。

７８．第１の抗原結合ドメインが、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む、実施形態７７に記載の二重特異性抗体。

７９．第１の抗原結合ドメインが、配列番号４０の重鎖可変領域配列および配列番号４１の軽鎖可変領域配列を含む、実施形態７８に記載の二重特異性抗体。

８０．第２および第３の抗原結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な重鎖可変領域配列、および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な軽鎖可変領域配列を含む、実施形態７６から７９のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

８１．第２および第３の抗原結合ドメインが、配列番号３の重鎖可変領域および配列番号４の軽鎖可変領域を含む、実施形態８０に記載の二重特異性抗体。

８２．Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインに関してセクション５．１および５．２に記載される特徴のいずれかを、単独で、または組み合わせて含む、実施形態７６から８１のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

８３．抗原結合ドメインおよびＦｃ領域が、ペプチドリンカーによって互いに融合している、実施形態７６から８２のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

８４．ペプチドリンカーが、配列番号４５および／または配列番号４６におけるようなペプチドリンカーを含む、実施形態８３に記載の二重特異性抗体。

８５．第２および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位におけるアミノ酸は、リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）で、好ましくはアルギニン（Ｒ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（ｉｉ）の第２および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＨ１において、１４７位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されており（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位におけるアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている（ＫａｂａｔＥＵインデックスによる番号付け）、実施形態７６から８４のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

８６．配列番号４３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド、配列番号４４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド、配列番号４５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチド、および配列番号４６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むポリペプチドを含む、実施形態７６から８５のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

８７．二重特異性抗体が、配列番号４３の配列を含むポリペプチド、配列番号４４の配列を含むポリペプチド、配列番号４５の配列を含むポリペプチド、および配列番号４６の配列を含むポリペプチドを含む、実施形態８６に記載の二重特異性抗体。

８８．配列番号４３の配列を含む２つのポリペプチドを含む、実施形態８７に記載の二重特異性抗体。

８９．検出可能な部分にコンジュゲートされている、実施形態４５から８８のいずれか一つに記載の二重特異性抗体。

９０．検出可能なマーカーが、酵素、放射線同位体、または蛍光標識である、実施形態８９に記載の二重特異性抗体。

９１．少なくとも第２のアミノ酸配列に作動可能に連結した、実施形態１から４４のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体もしくは抗原結合フラグメント、または実施形態４５から９０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体のアミノ酸配列を含む融合タンパク質。

９２．第２のアミノ酸配列が、４−１ＢＢ、ＣＤ３−ゼータ、またはそのフラグメントのアミノ酸配列である、実施形態９１に記載の融合タンパク質。

９３．第２のアミノ酸配列が、融合ペプチドのアミノ酸配列である、実施形態９１に記載の融合タンパク質。

９４．融合ペプチドが、ＣＤ２８−ＣＤ３−ゼータまたは４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）−ＣＤ３−ゼータ融合ペプチドである、実施形態９３に記載の融合タンパク質。

９５．第２のアミノ酸配列が、Ｔ細胞の活性化のモジュレーターまたはそのフラグメントのアミノ酸配列である、実施形態９１に記載の融合タンパク質。

９６．Ｔ細胞の活性化のモジュレーターが、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒａである、実施形態９５に記載の融合タンパク質。

９７．実施形態２４から２６のいずれか一つに記載のｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。

９８．アミノ末端からカルボキシ末端の順で、ヒトＣＤ８リーダーペプチド、ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジドメイン、ヒトＣＤ８膜貫通ドメイン、およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む、実施形態９７に記載のＣＡＲ。

９９．細胞傷害性物質にコンジュゲートした、実施形態１から４４のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体もしくは抗原結合フラグメント、または実施形態４５から９０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体、または実施形態９１から９６のいずれか一つに記載の融合タンパク質を含む抗体−薬物コンジュゲート。

１００．細胞傷害性物質が、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ドラスタチン、メイタンシノイド、またはビンカアルカロイドである、実施形態９９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０１．抗グリコＭＵＣ１抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは二重特異性抗体が、リンカーを介して細胞傷害性物質にコンジュゲートされている、実施形態１００に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０２．リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、実施形態１０１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０３．切断可能なリンカーが、細胞内のプロテアーゼによって切断可能である、実施形態１０２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０４．リンカーが、ジペプチドを含む、実施形態１０３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０５．ジペプチドが、ｖａｌ−ｃｉｔまたはｐｈｅ−ｌｙｓである、実施形態１０４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０６．切断可能なリンカーが、５．５未満のｐＨで加水分解性である、実施形態１０２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０７．加水分解性のリンカーが、ヒドラゾンリンカーである、実施形態１０６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０８．切断可能なリンカーが、ジスルフィドリンカーである、実施形態１０２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

１０９．実施形態１から４４のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体もしくは抗原結合フラグメント、または実施形態４５から９０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体、実施形態９１から９６のいずれか一つに記載の融合タンパク質、または実施形態９７または実施形態９８に記載のＣＡＲのコード領域を含む核酸。

１１０．コード領域が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態１０９に記載の核酸。

１１１．実施形態１０９または実施形態１１０に記載の核酸を含むベクター。

１１２．ウイルスベクターである、実施形態１１１に記載のベクター。

１１３．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態１１２に記載のベクター。

１１４．実施形態１０９または実施形態１１０に記載の核酸を発現するように操作された宿主細胞。

１１５．実施形態９７または実施形態９８に記載のＣＡＲを発現するように操作されたヒトＴ細胞である、実施形態１１４に記載の宿主細胞。

１１６．実施形態１１１から１１３のいずれか一つに記載のベクターを含む宿主細胞。

１１７．宿主細胞が、Ｔ細胞であり、ベクターが、実施形態９７または実施形態９８に記載のＣＡＲをコードする、実施形態１１６に記載の宿主細胞。

１１８．（ａ）実施形態１から４４のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント、実施形態４５から９０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体、実施形態９１から９６のいずれか一つに記載の融合タンパク質、実施形態９７または実施形態９８に記載のＣＡＲ、実施形態９９から１０８のいずれか一つに記載の抗体−薬物コンジュゲート、実施形態１０９または実施形態１１０に記載の核酸、実施形態１１１から１１３のいずれか一つに記載のベクター、または実施形態１１４から１１７のいずれか一つに記載の実施形態の宿主細胞、および（ｂ）生理学的に好適な緩衝液、アジュバントまたは希釈剤を含む医薬組成物。

１１９．がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態１から４４のいずれかに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント、実施形態４５から９０のいずれか一つに記載の二重特異性抗体、実施形態９１から９６のいずれか一つに記載の融合タンパク質、実施形態９７または実施形態９８に記載のＣＡＲ、実施形態９９から１０８のいずれか一つに記載の抗体−薬物コンジュゲート、実施形態１０９または実施形態１１０に記載の核酸、実施形態１１１から１１３のいずれか一つに記載のベクター、実施形態１１４から１１７のいずれか一つに記載の実施形態の宿主細胞、または実施形態１１８に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

１２０．対象が、乳がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、食道がん、または結腸直腸がんに罹っている、実施形態１１９に記載の方法。

１２１．生物学的サンプルでがんを検出する方法であって、サンプルを、実施形態１から４４のいずれか一つに記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントと接触させること、および抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出することを含む方法。

１２２．抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントの結合を定量化することをさらに含む、実施形態１２１に記載の方法。

１２３．結合が、陰性／ベースライン対照としての正常な組織対照と比較される、および／または陽性対照としてのがん性組織対照と比較される、実施形態１２１または実施形態１２２に記載の方法。

本出願で引用された全ての公報、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の公報、特許、特許出願または他の文書があらゆる目的のために参照により組み入れられることが個々に示されたのと同程度に、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。本明細書に組み入れられる参考文献の１つまたは複数の教示と本発明の開示との間に不一致がある事象では、本明細書の教示が意図される。

８．参考文献

Claims

ａ．正常細胞と比較して、がん細胞上で過剰発現されるグリコＭＵＣ１エピトープに優先的に結合し；
ｂ．乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄへの結合に関して、配列番号３の重鎖可変（ＶＨ）配列および配列番号４の軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合する抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ａ．精製された組換えヒトグリコシルトランスフェラーゼであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ４を使用してインビトロでグリコシル化されたＭＵＣ１タンデムリピート（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）_３（以下、「第１のエピトープ」と称する）に結合し；かつ、
ｂ．乳がん細胞株ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄへの結合に関して、配列番号３の重鎖可変（ＶＨ）配列および配列番号４の軽鎖可変（ＶＬ）配列を含む抗体または抗原結合フラグメントと競合する、
抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
配列番号３３のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ１が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｈ３が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｌ２が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
ＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号５〜７の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＶＬが、配列番号８〜１０のＣＤＲを含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号２３〜２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＶＬが、配列番号２６、２７、および１０のＣＤＲを含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号２８、２９、および２５の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記ＶＬが、配列番号３０、９、および３１のＣＤＲを含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号３と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号３と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＶＨが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
多価である、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態である、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ｓｃＦｖが、軽鎖可変フラグメントのＮ末端側に重鎖可変フラグメントを含む、請求項２４に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ｓｃＦｖの重鎖可変フラグメントおよび軽鎖可変フラグメントが、４〜１５アミノ酸のリンカー配列に共有結合している、請求項２４に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
多重特異性抗体の形態である、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記多重特異性抗体が、前記第１のエピトープと異なる第２のエピトープに結合する二重特異性抗体である、請求項２７に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ、Ｆａｂアーム交換抗体、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）、または二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）である、請求項２８に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂである、請求項２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^ＦＡＢである、請求項３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＶＨ−ＶＬ}である、請求項３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ^{ＣＨ１−ＣＬ}である、請求項３０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、Ｆａｂアーム交換抗体である、請求項２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）である、請求項２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記二重特異性抗体が、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）である、請求項２９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記第２のエピトープが、ＭＵＣ１エピトープである、請求項２８に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記第２のエピトープが、正常細胞と比較して、がん細胞上で過剰発現されるＭＵＣ１エピトープである、請求項２８に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記第２のエピトープが、Ｔ細胞エピトープである、請求項２８に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ３エピトープ、ＣＤ８エピトープ、ＣＤ１６エピトープ、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ２８エピトープ、またはＮＫＧ２Ｄエピトープを含む、請求項３９に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記Ｔ細胞エピトープが、ＣＤ３エピトープを含み、前記ＣＤ３エピトープは、任意選択でヒトＣＤ３に存在するエピトープである、請求項４０に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
前記ＣＤ３エピトープが、ＣＤ３ガンマエピトープ、ＣＤ３デルタエピトープ、ＣＤ３イプシロンエピトープ、またはＣＤ３ゼータエピトープを含む、請求項４１に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
検出可能な部分にコンジュゲートされている、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
検出可能なマーカーが、酵素、放射線同位体、または蛍光標識である、請求項４３に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント。
少なくとも第２のアミノ酸配列に作動可能に連結した、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
前記第２のアミノ酸配列が、４−１ＢＢ、ＣＤ３−ゼータ、またはそのフラグメントのアミノ酸配列である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
前記第２のアミノ酸配列が、融合ペプチドのアミノ酸配列である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
前記融合ペプチドが、ＣＤ２８−ＣＤ３−ゼータ融合ペプチドまたは４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）−ＣＤ３−ゼータ融合ペプチドである、請求項４７に記載の融合タンパク質。
前記第２のアミノ酸配列が、Ｔ細胞の活性化のモジュレーターまたはそのフラグメントのアミノ酸配列である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
前記Ｔ細胞の活性化のモジュレーターが、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒａである、請求項４９に記載の融合タンパク質。
請求項２４に記載のｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
アミノ末端からカルボキシ末端の順で、ヒトＣＤ８リーダーペプチド、前記ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジドメイン、ヒトＣＤ８膜貫通ドメイン、およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項５１に記載のＣＡＲ。
細胞傷害性物質にコンジュゲートした、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体−薬物コンジュゲート。
前記細胞傷害性物質が、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、アルキル化剤、エンジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシン、タキサン、ドラスタチン、メイタンシノイド、またはビンカアルカロイドである、請求項５３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
前記抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントが、リンカーを介して前記細胞傷害性物質にコンジュゲートされている、請求項５４に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
前記リンカーが、細胞内条件下で切断可能である、請求項５５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
切断可能なリンカーが、細胞内のプロテアーゼによって切断可能である、請求項５６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
前記リンカーが、ジペプチドを含む、請求項５７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
前記ジペプチドが、ｖａｌ−ｃｉｔまたはｐｈｅ−ｌｙｓである、請求項５８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
切断可能なリンカーが、５．５未満のｐＨで加水分解性である、請求項５６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
加水分解性のリンカーが、ヒドラゾンリンカーである、請求項６０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
切断可能なリンカーが、ジスルフィドリンカーである、請求項５６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントのコード領域を含む核酸。
前記コード領域が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項６３に記載の核酸。
請求項６３に記載の核酸を含むベクター。
ウイルスベクターである、請求項６５に記載のベクター。
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６６に記載のベクター。
請求項６３に記載の核酸を発現するように操作された宿主細胞。
請求項５１に記載のＣＡＲを発現するように操作されたヒトＴ細胞である宿主細胞。
請求項６５に記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項５１に記載のＣＡＲをコードするベクターを含むＴ細胞である宿主細胞。
（ａ）請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメント、および
（ｂ）生理学的に好適な緩衝液、アジュバントまたは希釈剤
を含む医薬組成物。
がんを処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む方法。
前記対象が、乳がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、食道がん、または結腸直腸がんを罹っている、請求項７３に記載の方法。
生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法であって、サンプルを、請求項１または２に記載の抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントと接触させること、および前記抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出することを含む方法。
前記抗グリコＭＵＣ１抗体または抗原結合フラグメントの結合を定量化することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
前記結合が、陰性／ベースライン対照としての正常な組織対照と比較される、および／または陽性対照としてのがん性組織対照と比較される、請求項７５に記載の方法。