ES2713952T3

ES2713952T3 - Análogos de glucagón que muestran actividad de receptor de GIP

Info

Publication number: ES2713952T3
Application number: ES11808086T
Authority: ES
Inventors: Richard D Dimarchi; Brian Ward
Original assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Current assignee: Indiana University Research and Technology Corp
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2031-12-20
Also published as: US20130116173A1; AU2011349331A1; US8507428B2; US9587005B2; CR20130295A; CO6761302A2; CL2013001783A1; ECSP13012697A; US9249206B2; EP2654773B1; EA201390941A1; CA2821766A1; CN103458920A; EP2654773A2; SG191194A1; BR112013015389A2; CN103458920B; US20160115215A1; MX2013006304A; WO2012088116A2

Abstract

Análogo de glucagón que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 con hasta 3 modificaciones de aminoácidos.

Description

DESCRIPCION

Analogos de glucagon que muestran actividad de receptor de GIP

ANTECEDENTES

De acuerdo con los datos mas recientes de la National Diabetes Fact Sheet of the American Diabetes Association, 23,6 millones de ninos y adultos en los Estados Unidos padecen diabetes. Cada ano, se diagnostican 1,6 millones de nuevos casos de diabetes en personas de 20 anos o mas. Segun un estudio publicado recientemente en el Journal of the American Medical Association, mas de dos tercios de los adultos en los Estados Unidos tienen sobrepeso o son obesos (Flegal et al, JAMA 303 (3): 235-241 (2010)) y mas de un tercio de esta poblacion es obesa.

Las hormonas incretinas, el peptido similar a glucagon 1 (GLP-1) y el peptido insulinotropico dependiente de glucosa (GIP), son hormonas peptldicas naturales. Tanto GLP-1 como GIP estimulan la slntesis y secrecion de insulina de una manera dependiente de la glucosa y no producen hipoglucemia (vease, por ejemplo, Nauck et al, J. Clin Endocrinol Metab 76: 912-917 (1993) y Irwin et al., Regul Pept 153: 70-76 (2009)).

GLP-1 ha demostrado ser eficaz como terapia adyuvante para la diabetes y esta asociado con la perdida de peso. Lo que no queda claro acerca de la terapia dirigida a GIP, sin embargo, es si se conseguira un tratamiento exitoso de la diabetes y la obesidad a traves de antagonizar los efectos de esta hormona (por ejemplo, a traves del antagonismo del receptor de GIP) o por medio de imitar o potenciar los efectos de GIP.

DESCRIPCION RESUMIDA

La presente invencion se refiere a un analogo de glucagon tal como se define en el juego de reivindicaciones. La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende el analogo de glucagon tal como se define en el juego de reivindicaciones y un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion se refiere ademas a la composicion farmaceutica, tal como se define en el juego de reivindicaciones, para utilizar en reducir la ganancia de peso o inducir la perdida de peso en un sujeto en necesidad del mismo, para utilizar en el tratamiento de la obesidad y para utilizar en el tratamiento de diabetes.

En el presente documento se proporcionan peptidos que son peptidos agonistas de GIP contemplados para utilizar en el tratamiento de sujetos con necesidad de los mismos, por ejemplo con diabetes y obesidad.

El glucagon natural no activa el receptor de GIP, y normalmente tiene aproximadamente un 1% de la actividad de GLP-1 natural en el receptor de GLP-1. En algunas realizaciones, los peptidos son analogos de glucagon que comprenden una estructura basada en la secuencia de aminoacidos del glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1), pero que difieren en una o mas posiciones en comparacion con la SEQ ID NO: 1, en los que las diferencias, o modificaciones, aumentan la actividad agonista del analogo en el receptor de GIP. Dichos analogos de glucagon tendran una actividad agonista en el receptor de GIP mayor que la del glucagon natural y, en algunos aspectos, mayor que la de GIP natural. En algunas o cualquier realizacion, el agonista de GIP tiene un porcentaje de potencia de GIP de al menos el 0,1%. En algunos o cualquier aspecto de la presente descripcion, el analogo de glucagon muestra, ademas, actividad agonista en uno o ambos de los receptores de glucagon y el receptor de GLP-1. Por consiguiente, en este documento se proporcionan agonistas de GIP, coagonistas de GIP-GLP-1, coagonistas de GIP-glucagon y triagonistas de GIP-GLP-1-glucagon.

En realizaciones de ejemplo, la selectividad del peptido agonista de GIP de la presente descripcion para el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP es menos de 100 veces. En algunas o cualquier realizacion, el peptido agonista de GIP tiene un porcentaje de potencia de GIP de menos de 20 veces o 10 veces diferente (mayor o menor) que el porcentaje de potencia del glucagon y/o el porcentaje de potencia de GLP-1.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, los analogos de glucagon comprenden (i) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1, (ii) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2, (iii) un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural, opcionalmente en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 37-43, y opcionalmente en el que el grupo acilo o alquilo no natural esta unido a dicho aminoacido a traves de un espaciador; (iv) un aminoacido estabilizador de la helice alfa en una o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20 o 21, y (v) hasta diez (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) modificaciones de aminoacidos adicionales en relacion con la SEQ ID NO: 1. En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon comprende (i) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1, (ii) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2, opcionalmente acido aminoisobutlrico, (iii) un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural, opcionalmente en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 37-43, opcionalmente en el que el grupo acilo o alquilo no natural esta unido a dicho aminoacido a traves de un espaciador; (iv) un aminoacido alfa, alfa disustituido en la posicion 20, y (v) hasta diez (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) modificaciones de aminoacidos adicionales en relacion con la SEQ ID NO: 1. En realizaciones de ejemplo, cuando el analogo de glucagon carece de un grupo hidrofilo, el analogo de glucagon muestra un porcentaje de potencia de GIP de al menos el 0,1% (por ejemplo, al menos 1%, al menos 10% , al menos 20%). En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon tiene una selectividad de menos de 100 veces (por ejemplo, menos de 50 veces, menos de 25 veces, menos de 10 veces) por el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP. En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon muestra una EC50 en el receptor de GLP-1 que esta dentro de 100 veces (por ejemplo, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, desntro de 10 veces) de su EC50 en el receptor de GIP.

A lo largo de la solicitud, todas las referencias a una posicion de aminoacido particular por numero (por ejemplo, la posicion 28) se refieren al aminoacido en esa posicion en el glucagon natural (SEQ ID NO: 1) o la posicion de aminoacido correspondiente en cualquier analogo del mismo. Por ejemplo, una referencia en este documento a la "posicion 28" significarla la posicion correspondiente 27 para un analogo de glucagon en la que el primer aminoacido de la SEQ ID NO: 1 ha sido eliminado. Del mismo modo, una referencia en este documento a la "posicion 28" significarla la posicion correspondiente 29 de un analogo de glucagon en la que se ha anadido un aminoacido antes del N-terminal de la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, los peptidos agonistas de GIP comprenden una secuencia de aminoacidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88 y 92. En algunas realizaciones, los peptidos agonistas de GIP comprenden una estructura basada en una secuencia original que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, y 92, pero difiere de la secuencia original en una o mas posiciones, tal como se describe adicionalmente en este documento.

La presente invencion proporciona en consecuencia un peptido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 28. Tambien se proporciona un peptido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 37. La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 89. La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 180. La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende, que consiste esencialmente en, o consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 31.

La descripcion proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 184,

HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 184) en la que:

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo Gln;

X10 es Tyr o un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C12 a C18;

X16 es cualquier aminoacido, opcionalmente, cualquier aminoacido distinto de Gly, Pro, y Ser;

X18 es Arg o Ala;

X20 es un aminoacido cargado negativamente o un aminoacido de carga neutra, opcionalmente, AIB o Gln;

X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala o Gly;

X35 es Ala o un aminoacido basico (opcionalmente, Arg o Lys);

en la que, cuando X28 es un aminoacido acido, X35 es un aminoacido basico;

en la que, cuando X10 es Tyr, el peptido comprende en la posicion 40 un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C12 a C18, y, en la que, opcionalmente, el peptido comprende Gly en la posicion 41, y en la que el aminoacido C-terminal del peptido esta amidado.

La descripcion tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 184 con hasta 3 modificaciones de aminoacido con respecto a SEQ ID NO: 184, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno del receptor de GIP humano, receptor de GLP-1 humano y receptor de glucagon humano.

La descripcion proporciona adicionalmente un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185,

HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 185) en la que:

X2 es AIB;

X16 es Glu, un aminoacido alfa, alfa disustituido, Lys o

X18 es Arg o Ala;

X20 es AIB o Gln;

X21 es Asp o Glu;

X27 es Leu, Nle, o Met;

X28 es Ala, Asp o Glu;

X29 es Gly o Thr;

y

en en la que, cuando X10 es Tyr, el peptido comprende en la posicion 40 un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C12 a C l8 y, en la que, opcionalmente, el peptido comprende Gly en la posicion 41, y en la que el aminoacido C-terminal del peptido esta amidado.

La description proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185 con hasta 3 modificaciones de aminoacido con respecto a SEQ ID NO: 185, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno del receptor de GIP humano, el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagon humano.

Se proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 186:

HX2X3GTFT SDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQW LX27X28X29 (SEQ ID NO: 186)

en la que:

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo Gln;

X10 es Tyr o un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C10 a C26;

X16 es cualquier aminoacido, opcionalmente, cualquier aminoacido distinto de Gly, Pro y Ser;

X18 es Arg o Ala;

X20 es un aminoacido de carga negativa o un aminoacido de carga neutra, opcionalmente, AIB o Gln;

X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala, Gly o Thr; y

en la que el peptido comprende un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C10 a C26, opcionalmente, en la posicion 10, y el aminoacido C-terminal del peptido esta amidado.

Se proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 186 con hasta 3 modificaciones de aminoacido con respecto a SEQ ID NO: 186, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno del receptor de GIP humano, el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagon humano.

La descripcion proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 187:

HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21 FVQW LX27X28X29 (SEQ ID NO: 187)

en la que:

X2 es AIB;

X16 es Glu, aminoacido alfa, alfa disustituido, o Lys;

X18 es Arg o Ala;

X21 es Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala, Asp o Glu;

X29 es Gly o Thr; y

en la que el peptido comprende un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C12 a C18, opcionalmente, en la posicion 10, y el aminoacido C-terminal del peptido esta amidado.

La descripcion tambien proporciona SEQ ID NO: 187 con hasta 3 modificaciones de aminoacido con relation a la SEQ ID NO: 187, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno del receptor de GIP humano, el receptor de GLP-1 humano y el receptor de glucagon humano.

La descripcion proporciona ademas un analogo de cualquiera de las SEQ ID NOs: 184, 185, 186, y 187, tal como se describe en el presente documento, pero X3 o el aminoacido en la posicion 3 es Gln o analogo de Gln o un aminoacido que reduce la actividad de glucagon, incluyendo los descritos en el presente documento. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido que reduce la actividad de glucagon es un aminoacido acido, basico, o hidrofobo (por ejemplo, Glu, Orn, o Nle). Opcionalmente, el aminoacido en la posicion 3 es Glu.

Se proporciona ademas en este documento un analogo de glucagon (SEQ ID NO: 1) que tiene actividad agonista de GIP, que comprende:

(a) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1,

(b) en la posicion 16, un aminoacido de formula IV:

en la que n es de 1 a 7, en la que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, (alquil C1-C18)OH, (alquil C1-C18)NH2, (alquil C1-C18)SH, (alquil C0-C4)cicloalquilo (C3-C6), (alquilo C0-C4)(heterociclo C2-C5), (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7, y (alquilo C1-C4)(heteroarilo C3-C9), en el que R7 es H o OH, en la que opcionalmente la cadena lateral del aminoacido de Formula IV comprende un grupo amino libre,

(c) un aminoacido a, a-disustituido en la posicion 20,

(d) hasta diez modificaciones de aminoacido adicionales en relacion a la SEQ ID NO: 1,

en la que, cuando el analogo carece de un resto hidrofilo, el analogo de glucagon muestra al menos un 0,1% de actividad de GIP natural en el receptor de GIP, en el que el analogo de glucagon tiene una selectividad de menos de 100 veces por el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP.

Tambien se proporcionan en el presente documento dlmeros y multlmeros que comprenden dos o mas peptidos agonistas de GIP de la presente descripcion. En el presente documento se proporcionan adicionalmente conjugados que comprenden un peptido agonista de GIP de la presente descripcion y un grupo conjugado. En algunos aspectos, el conjugado es un polipeptido de fusion que comprende el peptido agonista de GIP de la presente descripcion fusionado a un peptido heterologo. La presente descripcion tambien proporciona kits que comprenden los peptidos agonistas de GIP, dlmeros, multlmeros, o conjugados de la presente descripcion (o una combinacion de los mismos).

La presente descripcion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden cualquiera de los peptidos agonistas de GIP, dlmeros, multlmeros, o conjugados de la presente descripcion (o una combinacion de los mismos) y un portador, diluyente, o excipiente farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas son preferiblemente esteriles y adecuadas para la administracion parenteral. Las composiciones farmaceuticas se contemplan para su uso en procedimientos de tratamiento o prevencion de la diabetes o la obesidad, o afecciones medicas asociadas con la diabetes o la obesidad. Por consiguiente, en realizaciones de ejemplo, la presente descripcion proporciona un procedimiento para reducir el aumento de peso o inducir la perdida de peso, un procedimiento de tratamiento o prevencion de la diabetes o la obesidad, y un procedimiento para inducir la paralisis temporal del tracto intestinal. Otras aplicaciones de los analogos de peptidos y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos se proporcionan en la siguiente descripcion.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un grafico del peso corporal (gramos) de los ratones inyectados con 5 nmol/kg de: un peptido de SEQ ID NO: 28 (O), un peptido de la SEQ ID NO: 37 (□), un peptido de la SEQ ID NO: 38 V o un peptido de la SEQ ID NO: 39 (◊), o inyectados con un vehlculo de control (A), en funcion del tiempo despues de la primera inyeccion.

La Figura 2 representa un grafico del cambio total en el peso corporal (%), tal como se mide en el Dla 7, de ratones inyectados con un control del vehlculo, o con uno de los siguientes peptidos: un peptido de SEQ ID NO: 138, cuyo peptido esta directamente unido a un grupo acilo graso C16 en Lys en la posicion 40, un peptido de la SEQ ID NO: 143, cuyo peptido esta acilado por medio de un espaciador dipeptido gamma-Glu-gamma-Glu en un residuo 4-amino-Phe en la posicion 10, un peptido de SEQ ID NO: 144, cuyo peptido esta succinoilado en C16 en un 4-aminoPhe en la posicion 10, un peptido de la SEQ ID NO: 139, cuyo peptido esta unido directamente a un grupo acilo graso C16 en Lys en la posicion 40 (que es seguida por una Gly en la posicion 41), un peptido de la SEQ ID NO: 140, cuyo peptido esta succinoilado en C16 en una Lys en la posicion 40 (que es seguida por una Gly en la posicion 41), un peptido de la SEQ ID NO: 141, cuyo peptido esta succinoilada en C16 en una Lys en la posicion 40 a traves de un espaciador beta-Ala (cuya Lys es seguida por una Gly en la posicion 41), o un peptido de la SEQ ID NO: 142, cuyo peptido esta unido directamente a un grupo acilo graso C18 en un Lys en la posicion 40 (que es seguida por una Gly en la posicion 41).

Las figuras 3A-3C se refieren a peptidos acilados comprenden un grupo succinoilo. La Figura 3A representa las estructuras qulmicas de diferentes residuos de aminoacidos acilados. De izquierda a derecha, (i) un residuo de Lys directamente acilado con un acido graso C16, (ii) un residuo de Lys acilado con un acido graso C16 a traves de un espaciador de acido gamma-glutamico, (iii) un residuo de Lys acilado con un acido graso C16 a traves de un dipeptido espaciador (acido gamma-glutamico-acido gamma glutamico), (iv) un residuo de Lys acilado con un succinoilo en C16. La figura 3B representa las estructuras de tres anhldridos succlnicos de ejemplo. La Figura 3C representa un esquema de slntesis de la SEQ ID NO: 156.

La Figura 4 es un grafico del cambio en el peso corporal (%) de los ratones inyectados con el control del vehlculo (V), o con un peptido de SEQ ID NO: 152, cuyo peptido comprende un residuo Lys en la posicion 16 unido covalentemente a un grupo acilo graso C16 a traves de un espaciador de acido gammGlu (^A), un peptido de la SEQ ID NO: 28, cuyo peptido comprende un residuo Lys en la posicion 10 unido covalentemente a un grupo acilo graso C16 a traves de una gammaGlu (hexagono son rellenar), un peptido de la SEQ ID NO: 89, cuyo peptido comprende una Lys en la posicion 40 unida covalentemente a un grupo acilo graso C16 a traves de un espaciador dipeptido gammaGlu-gammaGlu (^□), un peptido de la SEQ ID NO: 145, cuyo peptido comprende una 4-aminoPhe en la posicion 40 unida covalentemente a un grupo acilo graso C16 a traves de un dipeptido espaciador de gammaGlugammaGlu (^o), o un peptido de la SEQ ID NO: 148, cuyo peptido comprende una 4-aminoPhe en la posicion 10 unidoa covalentemente a un grupo acilo graso C16 a traves de un espaciador de gammaGlu (^◊).

Las Figuras 5A-5F se refieren a peptidos acilados duales. La figura 5A representa tres tipos de compuestos dobles acilados: (1) un sitio que comprende dos grupos acilo en una formacion ramificada, (2) un sitio que comprende dos grupos acilo en una formacion lineal, y (3) dos sitios cada uno conectado a un grupo acilo graso a traves de un espaciador de gammaGlu. La Figura 5b representa un esquema de slntesis de un peptido que comprende dos grupos acilo de diferentes tamanos en una formacion ramificada. La figura 5C representa un esquema de slntesis de un peptido que comprende dos grupos acilo de mismo tamano en una formacion ramificada. La figura 5D representa un esquema de slntesis de un peptido que comprende dos grupos acilo en una formacion lineal. La figura 5E representa un grafico del cambio en el peso corporal (%), medido en el dla 7 del estudio de los ratones que recibieron una inyeccion de peptido o una inyeccion de control del vehlculo. La figura 5F representa un grafico del cambio en los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) tal como se mide en el Dla 7 del estudio de los ratones que recibieron una inyeccion de peptido o una inyeccion de control del vehlculo.

La Figura 6 representa la alquilacion con S-palmitilo de un residuo de Cys que es parte de una cadena principal peptldica.

La Figura 7 representa dos tipos de alquilacion con S-palmitilo de un residuo Cys, en el que el residuo Cys es parte de un espaciador de acilacion. En un tipo (estructura de la izquierda dentro de la caja), una Cys se une a un residuo de Lys del esqueleto del peptido y la Cys se alquila con S-palmitilo. En otro tipo (estructura derecha dentro de la caja), una Cys es parte de un espaciador dipeptido (gammaGlu-Cys) del que la gamma Glu esta unida a la Lys del esqueleto del peptido y la Cys se alquila en S-palmitilo.

La Figura 8 representa un grafico del cambio en el peso corporal (%), tal como se mide en el Dla 7 de los ratones inyectados con vehlculo de control o con uno de los nueve diferentes peptidos acilados: SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166.

Las Figuras 9A y 9B se refieren a dlmeros que comprenden dos peptidos en los que al menos uno comprende un grupo acilo. La Figura 9A representa una estructura de un homodlmero, en donde cada peptido comprende un residuo de Lys en la 40a posicion. Cada residuo de Lys esta unido covalentemente a traves del grupo epsilon NH2 a un residuo de Cys. Cada residuo de Cys esta unido en el peptido a un residuo gammaGlu, que, a su vez, esta unido a un grupo acilo graso C16. Los atomos de azufre de cada residuo de Cys forman un puente disulfuro. La figura 9B representa una estructura de un homodlmero que esta unida a traves de un enlace tioeter. Cada peptido comprende un residuo de Lys en la 40a posicion. La Lys del peptido superior esta unida a un residuo Cys, que esta unido en el peptido a un residuo gammaGlu, que, a su vez, esta unido a un grupo acilo graso C16. El azufre del residuo de Cys se une mediante un enlace tioeter a un residuo qulmico que, a su vez, esta unido al residuo de Lys del peptido inferior.

La Figura 10 representa un grafico del cambio en el peso corporal (%) de los ratones inyectados con un vehlculo de control o con un peptido de la SEQ ID NO: 28 (al 1 o 3 nmol/kg), un peptido de la SEQ ID NO: 89 (a 1 o 3 nmol/kg), un peptido de la SEQ ID NO: 138 (a 3 nmol/kg), o un peptido de la ^sE^qID NO: 171 (a 3 nmol/kg), como una funcion del tiempo despues de la inyeccion.

La Figura 11 representa un grafico de los niveles de insulina, tal como se mide en el Dla 21, de ratones inyectados con un vehlculo de control o con un peptido de la SEQ ID NO: 28 (a 1 o 3 nmol/kg), un peptido de la SEQ ID NO: 89 (a 1 o 3 nmol/kg), un peptido de la SEQ ID NO: 138 (a 3 nmol/kg), o un peptido de la SEQ I^dNO: 171 (a 3 nmol/kg).

Las Figuras 12A-12C representan una coleccion de diagramas esquematicos de peptidos acilados que comprenden cada uno un aminoacido acilado unido covalentemente a un grupo acilo a traves de un espaciador "miniPEG". La Figura 12A representa el peptido acilado de la SEQ ID NO: 157, la figura 12B representa el peptido acilado de la SEQ ID NO: 158, y la Figura 12C representa el peptido acilado de la SEQ ID NO: 159.

DESCRIPCION DETALLADA

La presente descripcion proporciona peptidos agonistas de GIP (por ejemplo, analogos de glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1) (tambien referidos como "analogos de glucagon"), analogos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 27 33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, y 92, analogos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 184-199) que presentan actividad agonista en el receptor de GIP. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "peptido" incluye una secuencia de 2 o mas aminoacidos y por lo general menos de 100, o menos de 50 aminoacidos. Los aminoacidos pueden ser de origen natural o codificados o no naturales o no codificados. Los aminoacidos de origen no natural se refieren a aminoacidos que no se producen de forma natural in vivo, pero que, sin embargo, se pueden incorporar en las estructuras peptldicas descritas en el presente documento. "No codificado", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un aminoacido que no es un L-isomero de cualquiera de los siguientes 20 aminoacidos: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. El termino "peptido agonista de GIP" se refiere a un compuesto que se une y activa la serialization aguas abajo del receptor de GIP. El peptido agonista de GIP puede tener cualquiera de los niveles de actividad en el receptor de GIP (por ejemplo, nivel absoluto de actividad o nivel relativo de actividad), selectividad por el receptor de GIP, o porcentaje de la potencia de GIP, descritos en este documento. Vease, por ejemplo, la section titulada Actividad del receptor de GIP. Sin embargo, este termino no debe interpretarse como una limitation de que el compuesto tiene actividad en solo el receptor de GIP. Mas bien, los peptidos agonistas de GIP de la presente descripcion pueden mostrar actividades adicionales en otros receptores, tal como se describe adicionalmente en este documento. Los peptidos agonistas de GIP, por ejemplo, pueden presentar actividad agonista en el receptor de GLP-1 y/o el receptor de glucagon.

ACTIVIDAD DE LOS PEPTIDOS DESCRITOS EN ESTE DOCUMENTO

Actividad de recepcion de GIP

En algunas o cualquiera de las realizaciones, los peptidos de la presente descripcion presentan una EC50 para la activation del receptor de GIP que esta en el intervalo nanomolar. En realizaciones de ejemplo, la EC50 del peptido en el receptor de GIP es de menos de 1000 nM, menos de 900 nM, menos de 800 nM, menos de 700 nM, menos de 600 nM, menos de 500 nM, menos de 400 nM, menos de 300 nM, menos de 200 nM. En algunas realizaciones, la EC50 del peptido en el receptor de GIP es de aproximadamente 100 nM o menos, por ejemplo, aproximadamente 75 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 5 nM o menos, o aproximadamente 1 nM o menos. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion muestra una EC50 para la activacion del receptor de GIP que esta en el intervalo picomolar. En realizaciones de ejemplo, la EC50 del peptido agonista de GIP en el receptor de GIP es de menos de 1000 pM, menos de 900 pM, menos de 800 pM, menos de 700 pM, menos de 600 pM, menos de 500 pM, menos de 400 pM, menos de 300 pM, menos de 200 pM. En algunas realizaciones, la EC50 del peptido en el receptor de GIP es de aproximadamente 100 pM o menos, por ejemplo, aproximadamente 75 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 25 pM o menos, aproximadamente 10 pM o menos, aproximadamente 5 pM o menos, o aproximadamente 1 pm o menos. El termino "aproximadamente" tal como se utiliza en este documento significa mayor o menor que el valor o intervalo de valores indicados en un 10 por ciento, pero no se pretende designar cualquier valor o intervalo de valores solo a esta definition mas amplia. Cada valor o intervalo de valores precedidos por el termino "aproximadamente" tambien pretende abarcar la realization del valor absoluto o intervalo de valores indicados.

Los procedimientos adecuados para la determination de la EC50 de un peptido para la activacion de un receptor, por ejemplo, el receptor de GIP, se conocen en la tecnica. Un ejemplo de ensayo in vitro, en el que la induction de AMPc como se representa por la actividad de luciferasa se mide en celulas HEK293 que sobreexpresan el receptor de GIP, se describe en el presente documento en el Ejemplo 2.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, los peptidos (por ejemplo, analogos de glucagon, analogos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90, o cualquiera de SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88 y 92) de las presentes divulgaciones presentan una mayor actividad en el receptor de GIP, en comparacion con el glucagon humano natural. El glucagon natural (SEQ ID NO: 1) no activa el receptor de GIP; el glucagon natural muestra esencialmente, 0% (por ejemplo, menos de 0,001%, menos del 0,0001%) de actividad de GIP natural en el receptor de GIP. Una actividad relativa de un peptido en el receptor de GIP en relacion con el glucagon natural se calcula como la relacion inversa de (EC50 del peptido de la presente descripcion/EC50 de glucagon natural) x 100%.

La actividad relativa de un peptido en el receptor de GIP en comparacion con GIP natural se calcula como la relacion inversa de (EC50 del peptido de la presente descripcion/EC50 del GIP natural) x 100% (un valor denominado tambien en este documento como "porcentaje de potencia de GIP ").

En algunas o cualquiera de las realizaciones de la presente descripcion, los peptidos de la presente description muestran un porcentaje de potencia de GIP que es de al menos o aproximadamente el 0,1%. En realizaciones de ejemplo, los peptidos muestran al menos o aproximadamente el 0,5%, al menos o aproximadamente 1%, al menos o aproximadamente 5%, al menos o aproximadamente 10%, al menos o aproximadamente 20%, al menos o aproximadamente 30%, al menos o aproximadamente 40%, al menos o aproximadamente 50%, al menos o aproximadamente 60%, al menos o aproximadamente 70%, al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 90%, o al menos o aproximadamente 100% de la la actividad de GIP natural en el receptor de GIP.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, los peptidos de la presente descripcion muestran actividad en el receptor de GIP que es mayor que la de GIP natural. En realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP presenta un porcentaje de potencia de GIP de al menos o aproximadamente 125%, al menos o aproximadamente 150%, al menos o aproximadamente 175%, al menos, o aproximadamente 200%, al menos o aproximadamente 300%, al menos o aproximadamente 400%, al menos o aproximadamente 500%, al menos o aproximadamente 600%, al menos o aproximadamente 700%, al menos o aproximadamente 800%, al menos o aproximadamente 900%, o al menos o aproximadamente 1.000%. En algunas realizaciones, los peptidos agonistas de GIP descritos en este documento muestran un porcentaje de potencia de GIP de no mas del 1.000% o no mas del 10.000%.

En algunos aspectos, los peptidos de la presente descripcion muestran un porcentaje de potencia de GIP dentro del intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 10.000 por ciento, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10.000 por ciento, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10.000 por ciento, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 por ciento, o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5.000 por ciento, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5.000 por ciento, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5.000 por ciento, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1.000 por ciento.

Coagonistas

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un peptido coagonista en la medida en que activa el receptor de GIP y un segundo receptor diferente del receptor de GIP.

Coagonistas de GIP/GLP-1

A modo de ejemplo, el peptido de la presente descripcion en algunos aspectos muestra actividad tanto en el receptor de GIP como en el receptor de GLP-1 ("coagonistas de los receptores de GLP-1/GIP"). En algunos aspectos, los peptidos muestran actividad en los receptores de GLP-1 y GIP, pero la actividad de glucagon se ha reducido significativamente o destruido, por ejemplo, mediante una modification de aminoacido en la position 3. Por ejemplo, la sustitucion en esta posicion por un aminoacido acido, basico o hidrofobo (acido glutamico, ornitina, norleucina) reduce la actividad de glucagon. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido agonista de GIP es un peptido que presenta aproximadamente el 10% o menos (por ejemplo, aproximadamente 5% o menos, o aproximadamente 1% o menos, o aproximadamente 0,1% o menos) de la actividad de glucagon natural en el receptor de glucagon.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, la EC50 del peptido de la presente descripcion en el receptor de GIP esta dentro de aproximadamente 50 veces o menos, aproximadamente 40 veces o menos, aproximadamente 30 veces o menos, aproximadamente 20 veces o menos, o aproximadamente 10 veces o menos, o aproximadamente 5 veces o menos diferente (mayor o menor) de su EC50 en el receptor de GLP-1. Por ejemplo, la EC50 en el receptor de GIP puede ser 10 veces mayor o 10 veces menor que la EC50 en el receptor de GLP-1. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el porcentaje de potencia de GIP del peptido de la presente descripcion es menor que o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10 o 5 veces diferente (mayor o menor) de su porcentaje de potencia de GLP-1. Por consiguiente, el peptido de la presente descripcion tiene una selectividad de menos de 100 veces para el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP. Tal como se utiliza en este documento, el termino "selectividad" de una molecula de un primer receptor con respecto a un segundo receptor se refiere a la siguiente relacion: EC50 de la molecula en el segundo receptor dividido por la EC50 de la molecula en el primer receptor. Por ejemplo, una molecula que tiene una EC50 de 1 nM en un primer receptor y una EC50 de 100 nM en un segundo receptor tiene una selectividad de 100 veces para el primer receptor en relacion con el segundo receptor. En realizaciones de ejemplo, la selectividad del peptido de la presente descripcion para el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos que o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, de menos de o aproximadamente 5 veces).

En algunas o cualquiera de las realizaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran mayor actividad en el receptor de GLP-1, en comparacion con el glucagon humano natural. El glucagon natural tiene aproximadamente un 1% de la actividad de GLP-1 natural en el receptor de GLP-1. La actividad relativa de un peptido en el receptor de GLP-1 con respecto al glucagon natural se calcula como la relacion inversa de (EC50 del peptido de la presente descripcion/EC50 de glucagon natural) x 100%.

La actividad relativa de un peptido en el receptor de GLP-1 en comparacion con el GLP-1 natural se calcula como la relacion inversa de (EC50 del peptido de la presente descripcion/EC50 de GLP-1 natural) x 100% (un valor que se refiere en este documento como "porcentaje de potencia de GLP-1").

En algunas o cualquiera de las realizaciones de las presentes divulgaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran un porcentaje de potencia de GLP-1 de al menos o aproximadamente el 0,1%. En realizaciones de ejemplo, los peptidos muestran un porcentaje de potencia de GLP-1 de al menos o aproximadamente el 0,5%, al menos o aproximadamente 1%, al menos o aproximadamente 5%, al menos o aproximadamente 10%, al menos o aproximadamente 20%, al menos o aproximadamente 30%, al menos o aproximadamente 40%, al menos o aproximadamente 50%, al menos o aproximadamente 60%, al menos o aproximadamente 70%, al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 90%, o al menos o aproximadamente 100%.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, los peptidos de la presente descripcion muestran actividad en el receptor de GLP-1 que es mayor que la de GLP-1 natural. En realizaciones de ejemplo, el peptido de la presente descripcion presenta un porcentaje de potencia de GLP-1 de al menos o aproximadamente 125%, al menos o aproximadamente 150%, al menos o aproximadamente 175%, al menos, o aproximadamente 200%, al menos o aproximadamente 300 %, al menos o aproximadamente 400%, al menos o aproximadamente 500%, al menos o aproximadamente 600%, al menos o aproximadamente 700%, al menos o aproximadamente 800%, al menos o aproximadamente 900%, o al menos o aproximadamente 1.000 %. En algunas realizaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran un porcentaje de potencia de GLP-1 de no mas de 1.000% o no mas de 10.000%. Coagonistas de GlP/glucagon

A modo de otro ejemplo, el peptido de la presente descripcion, en algunos aspectos, muestra actividad tanto en el receptor de GIP como en el receptor de glucagon ("coagonistas de los receptores de glucagon/GIP"). En algunas realizaciones, la actividad de GLP-1 se ha reducido significativamente o destruido, por ejemplo, mediante una modificacion de aminoacido en la posicion 7, por ejemplo, la sustitucion con Ile, una delecion del aminoacido o aminoacidos C-terminal al aminoacido en posicion 27 o 28, produciendo un peptido de 27 o 28 aminoacidos, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un peptido que muestra aproximadamente el 10% o menos (por ejemplo, aproximadamente 5% o menos, o aproximadamente 1% o menos, o aproximadamente 0,1% o menos) de la actividad de GLP-natural 1 en el receptor de GLP-1.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, la EC50 del peptido de la presente descripcion en el receptor de GIP esta dentro de aproximadamente 50 veces o menos, aproximadamente 40 veces o menos, aproximadamente 30 veces o menos, aproximadamente 20 veces o menos, o aproximadamente 10 veces o menos, o aproximadamente 5 veces o menos diferente (mayor o menor) de su EC50 en el receptor de glucagon. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el porcentaje de potencia de GIP del peptido de la presente descripcion es menor que o aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10 o 5 veces diferente (mayor o menor) de su porcentaje de potencia de glucagon. En algunas realizaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran mayor actividad en el receptor de glucagon, en comparacion con el glucagon humano natural. La actividad relativa de un peptido en el receptor de glucagon en comparacion con el glucagon natural se calcula como la relacion inversa de (EC50 del peptido de la presente descripcion/EC50 de glucagon natural) x 100% (un valor que se refiere en este documento como "porcentaje de potencia de glucagon").

En algunas realizaciones de la presente descripcion, los peptidos de la presente descripcion muestran un porcentaje de potencia de glucagon de al menos o aproximadamente el 0,1%. En realizaciones de ejemplo, los peptidos muestran un porcentaje de potencia de glucagon de al menos o aproximadamente el 0,5%, al menos o aproximadamente 1%, al menos o aproximadamente 5%, al menos o aproximadamente 10%, al menos o aproximadamente 20%, al menos o aproximadamente 30%, al menos o aproximadamente 40%, al menos o aproximadamente 50%, al menos o aproximadamente 60%, al menos o aproximadamente 70%, al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 90%, o al menos o aproximadamente el 100%.

En algunas realizaciones de la presente descripcion, los peptidos de la presente descripcion muestran actividad en el receptor de glucagon que es mayor que la del glucagon natural. En realizaciones de ejemplo, el peptido de la presente descripcion presenta un porcentaje de potencia de glucagon de al menos o aproximadamente 125%, al menos o aproximadamente 150%, al menos o aproximadamente 1 menos, o aproximadamente 200 menos o aproximadamente 300%, al menos o aproximadamente 4 menos o aproximadamente 500 menos o aproximadamente 600%, al menos o aproximadamente 7 menos o aproximadamente 800 menos o aproximadamente 900%, o al menos o aproximadamente En algunas realizaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran un porcentaje de potencia de gluca

de 1.000% o no mas de 10.000%.

Triagonistas

En algunas realizaciones, los peptidos de la presente descripcion muestran actividad en dos o mas receptores, a parte del receptor de GIP. Por consiguiente, la presente descripcion proporciona en algunos aspectos peptidos triagonistas de GIP. En algunos aspectos, los peptidos de la presente descripcion muestran actividad en cada uno de los receptores de glucagon, GIP y GLP-1 ("triagonistas de glucagon/GIP/GLP-1").

En algunas realizaciones, la EC50 del peptido de la presente descripcion en el receptor de GIP es dentro de 50 veces o menos, 20 veces o menos, o 10 veces o menos diferente (mayor o menor) que la EC50 del peptido de la presente descripcion en (a) el receptor de GLP-1, (b) el receptor de glucagon, o ambos. En algunas realizaciones, la EC50 del peptido de la presente descripcion en el receptor de GIP es de aproximadamente 40 veces o menos, aproximadamente 30 veces o menos, aproximadamente 20 veces o menos diferente (mayor o menor) de su EC50 en el receptor de GLP-1, y opcionalmente menos de aproximadamente 50 veces diferente de su EC50 en el receptor de glucagon. En algunas realizaciones, el porcentaje de potencia GIP del peptido de la presente descripcion es menos de o aproximadamente 50 veces, 20 veces o 10 veces diferente (mayor o menor) de (a) su porcentaje de potencia GLP-1, (b) su porcentaje de potencia de glucagon, o ambos. En algunas realizaciones, el porcentaje de potencia de GIP del peptido de la presente descripcion es de menos de aproximadamente 40 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 20 veces diferente (mayor o menor) de su porcentaje de potencia de

GLP-1, y, opcionalmente, de menos de aproximadamente 50 veces diferente de su porcentaje de potencia de glucagon. En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion no tiene una selectividad de al menos 100 veces por el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP. En realizaciones de ejemplo, la selectividad del peptido de la presente descripcion para el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente 5 veces).

Agonismo de GIP en ausencia de agonismo de GLP-1 y agonismo de glucagon

En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion muestra actividad en solo el receptor de GIP, y no en cualquier otro receptor, por ejemplo, el receptor de GLP-1, el receptor de glucagon. En realizaciones de ejemplo, el peptido de la presente descripcion muestra actividad en el receptor de GIP, y la actividad de glucagon y GLP-1 se ha reducido significativamente o destruido, por ejemplo, mediante modificaciones de aminoacidos en las posiciones 3 y

7. En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un peptido que muestra un porcentaje de potencia de GLP-1 de aproximadamente 10% o menos (por ejemplo, aproximadamente 5% o menos, o aproximadamente 1% o menos, o aproximadamente 0,1% o menos). En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un peptido que muestra un porcentaje de potencia de glucagon de aproximadamente 10% o menos (por ejemplo, aproximadamente 5% o menos, o aproximadamente 1% o menos, o aproximadamente 0,1% o menos).

Actividad de conjugados

En algunas o cualquiera de las realizaciones, cuando el peptido de la presente descripcion se conjuga con un grupo heterologo (por ejemplo, un grupo hidrofilo), tal como se describe adicionalmente en este documento, el peptido de la presente descripcion presenta una disminucion de la actividad (por ejemplo, un porcentaje de potencia mas bajo o una EC50 mas alta) que cuando el peptido de la presente descripcion esta en una forma libre o no conjugada. Por lo tanto, se contempla que cuando cualquiera de los niveles de actividad absolutos anteriores (por ejemplo, porcentaje de potencia de GIP, porcentaje de potencia de GLP-1 o porcentaje de potencia de glucagon, pero no proporciones relativas) se aplica a un peptido en forma conjugada, por ejemplo, pegilado, dichos niveles de actividad absolutos se reducen en aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, y que dichos niveles de actividad reducidos un numero de veces se contemplan dentro del alcance de la descripcion. A la inversa, cuando no esta conjugado, el peptido de la presente descripcion presenta un porcentaje de potencia de GIP que es aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces o mas mayor que la potencia del peptido de la presente descripcion cuando se conjuga con un grupo heterologo.

ESTRUCTURA DE LOS PEPTIDOS DESCRITOS EN ESTE DOCUMENTO

Analogos de glucagon

En algunas realizaciones, los peptidos de la presente descripcion son estructuralmente similares al glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, es un analogo del glucagon humano natural (tambien denominado en este documento como "analogo de glucagon" o "peptido analogo de glucagon "). Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos "analogo de glucagon" y " peptido analogo de glucagon", y similares, se refieren a peptidos que son estructuralmente similares al glucagon humano natural y estos terminos no implican necesariamente que los peptidos activan el receptor de glucagon.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un analogo de glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1) que comprende una secuencia de aminoacidos basada en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, pero que difiere de SEQ ID NO: 1, puesto que la secuencia de aminoacidos del analogo de glucagon comprende uno o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , y en algunos casos, 16 o mas (por ejemplo, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, etc.), modificaciones de aminoacidos especificadas u opcionales. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende un total de 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9 o hasta 10 modificaciones de aminoacidos adicionales (por ejemplo, ademas de las modificaciones de aminoacidos especificadas), en relacion a la secuencia de glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, con respecto a un analogo de glucagon (SEQ ID NO: 1) que comprende (a) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1, (b) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2, (c) un aminoacido acilado o aminoacido alquilado en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 37-43, (d) un aminoacido estabilizador de helice alfa en una o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20 y 21, y (e) hasta diez modificaciones de aminoacidos adicionales en relacion a la SEQ Id NO: 1, la presente descripcion proporciona un analogo de glucagon que comprende (a)-(d) con hasta 10 modificaciones de aminoacidos adicionales ademas de las modificaciones de aminoacidos especificadas en (a) -(d). En algunas o cualquiera de las realizaciones, las modificaciones son cualquiera de las descritas en el presente documento, por ejemplo, acilacion, alquilacion, pegilacion, truncamiento en C-terminal, sustitucion del aminoacido en una o mas de las posiciones 1, 2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 y 29.

Tal como se utiliza en el presente documento una "modificacion de aminoacido" se refiere a (i) una sustitucion de un aminoacido de la SEQ ID NO: 1 por un aminoacido diferente (aminoacido de origen natural o codificado o no codificado o no natural), (ii) una adicion de un aminoacido (aminoacido de origen natural o codificado o no codificado o no natural), a la SEQ ID NO: 1 o (iii) una delecion de uno o mas aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, la sustitucion de aminoacido es una sustitucion conservativa de aminoacidos, por ejemplo, una sustitucion conservativa de aminoacido en una o mas de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sustitucion conservativa de aminoacidos" se define en este documento como la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que tiene propiedades similares, por ejemplo, tamano, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o aromaticidad, e incluye intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

I. Residuos pequenos alifaticos, no polares o ligeramente polares:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas y esteres:

Asp, Asn, Glu, Gln, acido cisteico y acido homocisteico;

III. Residuos polares cargados positivamente:

His, Arg, Lys; Ornitina (Orn)

IV. Residuos grandes, alifaticos, no polares:

Met, Leu, Ile, Val, Cys, norleucina (Nle), homocistelna

V. Residuos grandes aromaticos:

Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanina

En realizaciones alternativas, la sustitucion de aminoacido no es una sustitucion conservativa de aminoacidos, por ejemplo, es una sustitucion no conservativa de aminoacidos.

Tal como se utiliza en este documento, el termino "aminoacido cargado" se refiere a un aminoacido que comprende una cadena lateral que esta cargada negativamente (es decir, desprotonada) o cargada positivamente (es decir, protonada) en solucion acuosa a pH fisiologico. Por ejemplo los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico, acido glutamico, acido cisteico, acido homocisteico y acido homoglutamico, mientras que los aminoacidos cargados positivamente incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoacidos cargados incluyen los aminoacidos cargados entre los 20 aminoacidos codificados, as! como los aminoacidos atlpicos o de origen no natural o no codificados. Tal como se utiliza en este documento, el termino "aminoacido acido" se refiere a un aminoacido que comprende un segundo grupo acido (que no sea el acido alfa carboxllico del aminoacido), incluyendo, por ejemplo, un grupo acido carboxllico o acido sulfonico en la cadena lateral.

[0061] En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 25% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos del glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85 %, al menos un 90% o mayor que un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del peptido de la presente descripcion que tiene el % de identidad de secuencia anteriormente mencionado es la secuencia de aminoacidos de longitud completa del peptido descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del peptido de la presente descripcion que tiene el % de identidad de secuencia anteriormente mencionado es solo una parte de la secuencia de aminoacidos del peptido descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el peptido descrito en el presente documento comprende una secuencia de aminoacidos que tiene aproximadamente un % de identidad de secuencia A o superior con una secuencia de aminoacidos de referencia de al menos 5 aminoacidos contiguos (por ejemplo, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 aminoacidos) de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de aminoacidos de referencia comienza con el aminoacido en la posicion C de la SEQ ID NO: 1 y termina con el aminoacido en la posicion D de la SEQ ID NO : 1, en la que A es 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99; C es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 y D es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28 o 29. Se contemplan cualquier y todas las posibles combinaciones de los parametros anteriores, incluyendo, por ejemplo, cuando A es 90% y C y D son 1 y 27, o 6 y 27, u 8 y 27, o 10 y 27, o 12 y 27, o 16 y 27.

Los analogos de glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1) descritos en el presente documento pueden comprender una cadena principal peptldica de cualquier numero de aminoacidos, es decir, puede ser de cualquier longitud de peptido. En algunas realizaciones, los peptidos descritos en este documento son de la misma longitud que la SEQ ID NO: 1, es decir, tienen 29 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido descrito en el presente documento es mas largo que 29 aminoacidos de longitud, por ejemplo, el peptido descrito en el presente documento comprende una extension C-terminal de 1-21 aminoacidos, tal como se describe adicionalmente en este documento. Por consiguiente, el peptido de la presente descripcion, en algunas realizaciones, es de 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,49 o 50 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido descrito en el presente documento es de hasta 50 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido descrito en el presente documento es mas largo que 29 aminoacidos de longitud (por ejemplo, mayor que 50 aminoacidos, (por ejemplo, al menos o aproximadamente 60, al menos o aproximadamente 70, al menos o aproximadamente 80, al menos o aproximadamente 90, al menos o aproximadamente 100, al menos o aproximadamente 150, al menos o aproximadamente 200, al menos o aproximadamente 250, al menos o aproximadamente 300, al menos o aproximadamente 350, al menos o aproximadamente 400, al menos o aproximadamente 450, al menos o aproximadamente 500 aminoacidos de longitud) debido a la fusion con otro peptido. En otras realizaciones, el peptido descrito en el presente documento es de menos de 29 aminoacidos de longitud, por ejemplo, 28, 27, 26, 25, 24, 23, aminoacidos.

De acuerdo con lo anterior, en algunos aspectos, el peptido de la presente descripcion es un analogo de glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1) que comprende una secuencia de aminoacidos basada en la SEQ ID NO: 1, cuya secuencia comprende una o mas modificaciones de aminoacidos que afectan la actividad de GIP, la actividad de glucagon, y/o la actividad de GLP-1, mejoran la estabilidad, por ejemplo, mediante la reduccion de la degradation del peptido (por ejemplo, mediante la mejora de la resistencia a las proteasas de DPP-IV), mejoran la solubilidad, aumentan la semimedia, retrasan la aparicion de la action, amplian la duration de la action en el receptor de GIP, glucagon o GLP-1, o una combination de cualquiera de los anteriores. Tales modificaciones de aminoacidos, ademas de otras modificaciones, se describen mas adelante, y cualquiera de estas modificaciones se puede aplicar individualmente o en combinacion.

AMINOACIDOS QUE COMPRENDEN UN GRUPO ACILO NO NATURAL

De acuerdo con algunas o cualquiera de las realizaciones, los peptidos agonistas de GIP que son analogos de glucagon (SEQ ID NO: 1) comprenden un aminoacido que comprende un grupo acilo no natural (denominado en este documento como un "aminoacido acilado", independientemente de como se prepara, por ejemplo, mediante la incorporation de un aminoacido acilado previamente en el peptido, o acilacion del peptido despues de la slntesis). En algunos o cualquiera de los aspectos, el aminoacido acilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 del analogo de glucagon. En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 40 del analogo de glucagon o en cualquiera de las posiciones 10, 13, 14, 16, 17, o 40 del analogo de glucagon. En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado se encuentra en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40. En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 10, 12, o 16 del analogo peptldico.

El aminoacido acilado en algunas realizaciones hace que el peptido agonista de GIP tenga uno o mas de (i) una semivida prolongada en la circulation, (ii) un retraso en la aparicion de la accion, (iii) una duracion de accion prolongada, (iv) una resistencia mejorada a las proteasas, tales como DPP-IV, y (v) aumento de la potencia en una cualquiera o mas de los receptores de GIP, GLP-1 y glucagon.

Acilacion directa

En algunas realizaciones, el grupo acilo esta directamente unido a un aminoacido del peptido agonista de GIP. De acuerdo con una realizacion, el peptido agonista de GIP comprende un grupo acilo que esta unido al peptido a traves de una union ester, tioester, o amida.

En aspectos especlficos, el peptido agonista de GIP comprende un grupo acilo tras la acilacion directa de una amina, hidroxilo, o tiol de una cadena lateral de un aminoacido del peptido agonista de GIP. En algunas realizaciones, la acilacion esta en la posicion 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 40 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14 y 40) del peptido agonista de GIP. A este respecto, el peptido agonista de GIP comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoacidos modificada de la misma que comprende una o mas de las modificaciones de aminoacidos descritas en este documento, en la que al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 40 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14 y 40) del peptido agonista de GIP es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo, o tiol en la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral es un aminoacido de Formula I:

En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido de Formula I, es el aminoacido en el que n es 4 (Lys) o n es 3 (Orn). En algunas realizaciones, el aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral es un aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-fenilalanina (4-aminoPhe), p-amino fenilglicina, p-amino homofenilalanina, o 3-amino tirosina. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-Phe.

En otras realizaciones, el aminoacido que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es un aminoacido de formula II:

En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido de Formula II es el aminoacido en el que n es 1 (Ser). En aspectos de ejemplo, el aminoacido de Formula II es el aminoacido en el que n es 2 (homoserina). En realizaciones de ejemplo similares, el aminoacido que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es una Thr o homotreonina. En realizaciones de ejemplo similares, el aminoacido que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es un aminoacido aromatico que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral es tirosina, homotirosina, metiltirosina, o 3-amino tirosina.

En otras realizaciones, el aminoacido que comprende un grupo tiol en la cadena lateral es un aminoacido de formula III:

H

H2N------C------COOH

(CH2)n

SH

en la que n = 1 a 4

[Formula III]

En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido de Formula II es el aminoacido en el que n es 1 (Cys).

En otras realizaciones, el aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral es un aminoacido disustituido que comprende la misma estructura de la Formula I, Formula II o Formula III, excepto que el hidrogeno unido al carbono alfa del aminoacido de Formula I, Formula II o Formula III esta sustituido por una segunda cadena lateral.

Espaciadores de acilacion

En realizaciones alternativas, el grupo acilo esta unido a traves de un espaciador a un aminoacido del peptido agonista de GIP, en el que el espaciador esta situado entre el aminoacido del peptido agonista de GIP y el grupo acilo. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GIP comprende un espaciador entre el peptido y el grupo acilo. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GIP esta unido covalentemente al espaciador, que esta unido covalentemente al grupo acilo.

En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral, o un dipeptido o tripeptido que comprende un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral. El aminoacido al que se une el espaciador puede ser cualquier aminoacido (por ejemplo, un aminoacido a-sustituido individualmente o por duplicado) que comprenda un grupo que permita la union al espaciador. Por ejemplo, un aminoacido que comprende NH2,-OH, o -COOH en la cadena lateral (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. En este sentido, el peptido agonista de GIP, en algunos aspectos, comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoacidos modificada de la misma que comprende una o mas de las modificaciones de aminoacidos descritas en el presente documento, en la que al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 37-43 (por ejemplo, la posicion 10, 14 o 40) es un aminoacido que comprende amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral, o un dipeptido o tripeptido que comprende un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral.

Cuando el grupo acilo esta unido a traves de un grupo amina de un espaciador, el grupo acilo, en algunos aspectos, esta unido a traves de la amina alfa o una amina de la cadena lateral del aminoacido del espaciador. En el caso en el que el grupo acilo se une a traves de una amina alfa, el aminoacido del espaciador puede ser cualquier aminoacido. Por ejemplo, el aminoacido del espaciador puede ser un aminoacido hidrofobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, acido 6-aminohexanoico, acido 5-aminovalerico, acido 7-aminoheptanoico y acido 8-aminooctanoico. Alternativamente, en algunos aspectos, el aminoacido del espaciador puede ser un residuo acido, por ejemplo, Asp, Glu, acido homoglutamico, acido homocisteico, acido cisteico, acido gamma-glutamico.

En el caso en el que el grupo acilo se une a traves de una amina en la cadena lateral del aminoacido del espaciador, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral, por ejemplo, un aminoacido de Formula I (por ejemplo, Lys u Orn). En este caso, es posible unir la amina alfa y la amina de la cadena lateral del aminoacido del espaciador a un grupo acilo, de manera que el peptido agonista de GIP se diacila. Las realizaciones descritas en el presente documento incluyen tales moleculas diaciladas. En algunas realizaciones, el grupo acilo esta unido a un 4-amino-Phe, p-amino fenilglicina, p-amino homofenilalanina o 3-amino tirosina.

Cuando el grupo acilo se une a traves de un grupo hidroxilo de un espaciador, el aminoacido o uno de los aminoacidos del dipeptido o tripeptido puede ser un aminoacido de Formula II. En una realizacion de ejemplo especlfica, el aminoacido es Ser. En realizaciones de ejemplo similares, el grupo acilo se une a una Thr u homotreonina. En realizaciones de ejemplo similares, el grupo acilo esta unido a traves del hidroxilo de un amino acido aromatico que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral, por ejemplo, tirosina, homotirosina, metiltirosina o 3-amino tirosina.

Cuando el grupo acilo se une a traves de un grupo tiol de un espaciador, el aminoacido o uno de los aminoacidos del dipeptido o tripeptido puede ser un aminoacido de Formula III. En una realizacion de ejemplo especlfica, el aminoacido es Cys.

En algunas realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrofilo. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende dos o mas grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo tiol y un carboxilato. En una realizacion especlfica, el espaciador comprende un amino poli(alquiloxi) carboxilato. En este sentido, el espaciador puede comprender, por ejemplo, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, en el que m es cualquier numero entero de 1 a 6 y n es cualquier numero entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, que esta disponible comercialmente de Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

En realizaciones de ejemplo, el espaciador comprende un grupo pequeno de polietilenglicol (PEG) que comprende una estructura [-O-CH2-CH2-K en donde n es un numero entero entre 2 y 16, (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Dichos PEG pequenos se denominan en este documento como "miniPEG." En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG funcionalizado que comprende uno o mas grupos funcionales. Los grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG acido que comprende una estructura de {[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, en donde n se define como anteriormente. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG amido que comprende una estructura de {N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}, en donde n se define como anteriormente. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG amido acido que comprende una estructura de {N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, en donde n se define como anteriormente. Los reactivos adecuados para su uso en la acilacion de un aminoacido con un miniPEG estan disponibles comercialmente de proveedores, tales como Peptides International (Louisville, KY). Tambien, las tecnicas adecuadas para la acilacion de un aminoacido con un miniPEG se describen en el presente documento (vease el Ejemplo 1).

En algunas realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrofobo. Los espaciadores bifuncionales hidrofobos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende dos o mas grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo amina y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo tiol y un carboxilato. Los espaciadores bifuncionales hidrofobos adecuados que comprenden un carboxilato, y un grupo hidroxilo o un grupo tiol son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, acido 8-hidroxioctanoico y acido 8-mercaptooctanoico.

En algunas realizaciones, el espaciador bifuncional no es un acido dicarboxllico que comprende un metileno no ramificado de 1-7 atomos de carbono entre los grupos carboxilato. En algunas realizaciones, el espaciador bifuncional es un acido dicarboxllico que comprende un metileno no ramificado de 1-7 atomos de carbono entre los grupos carboxilato.

El espaciador (por ejemplo, aminoacido, dipeptido, tripeptido, espaciador bifuncional hidrofilo, o espaciador bifuncional hidrofobo) en realizaciones especlficas tiene de 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos de, (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, o 10 atomos)) de longitud. En realizaciones mas especlficas, el espaciador tiene de aproximadamente 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos) de longitud y el grupo acilo es un grupo acilo graso C12 a C18, por ejemplo, un grupo acilo graso C14, un grupo acilo graso C16, de manera que la longitud total del espaciador y grupo acilo es de 14 a 28 atomos, por ejemplo, aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, o 28 atomos. En algunas realizaciones, la longitud del espaciador y grupo acilo es de 17 a 28 (por ejemplo, 19 a 26, 19 a 21) atomos.

Segun algunas o cualquiera de las realizaciones anteriores, el espaciador bifuncional puede ser un aminoacido sintetico o de origen natural (incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento) que comprende una cadena principal de aminoacido que tiene de 3 a 10 atomos de longitud (por ejemplo, acido 6-aminohexanoico, acido 5-aminovalerico, acido 7-aminoheptanoico, y acido 8-aminooctanoico). Alternativamente, el espaciador puede ser un espaciador dipeptido o tripeptido que tiene una cadena principal peptldica que tiene de 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos) de longitud. Cada aminoacido del espaciador dipeptido o tripeptido puede ser el mismo que o diferente de otro aminoacido o aminoacidos del dipeptido o tripeptido y puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en: aminoacidos de origen natural o codificados y/o de origen no natural o no codificados, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los isomeros D o L de los aminoacidos de origen natural (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg , Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), o cualquier isomero D o L de los aminoacidos de origen no natural o no codificados seleccionados del grupo que consiste en: b-alanina (b-Ala), N-a-metil alanina (Me-Ala), acido aminobutlrico (Abu), acido g-aminobutlrico (g-Abu), acido aminohexanoico (e-Ahx), acido aminoisobutlrico (Aib), acido aminometilpirrolcarboxllico, acido aminopiperidincarboxllico, aminoserina (Ams), acido aminotetrahidropirano-4- carboxllico, arginina N-metoxi-N-metil amida, acido b-aspartico (b-Asp), acido azetidin-carboxllico, 3-(2-benzotiazolil) alanina, a-terc-butilglicina, acido 2-amino-5-ureido-n-valerico (citrulina, Cit), b-Ciclohexilalanina (Cha), acetamidometilo-cistelna, acido diaminobutanoico (Dab), acido diaminopropionico (Dpr), dihidroxifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), acido g-glutamico (g-Glu), homoserina (Hse), hidroxiprolina (Hyp), isoleucina N-metoxi-N-metil amida, metil-isoleucina (Melle), acido isonipecotico (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lisina, dimetil- lisina, trimetil-lisina, metanoprolina, metionina-sulfoxido (Met(O)), metionina-sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), acido para-aminobenzoico (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4-cianofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-deshidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar), selenocistelna (Sec), O-bencil-fosfoserina, acido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico (Sta), acido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA), acido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico (AHPPA), acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxllico (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi), O-bencil-fosfotirosina, O-fosfotirosina, metoxitirosina, etoxitirosina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirosina, tirosina tetrabutilamina sulfato, metil-valina (MeVal), y acido 3-mercaptopropionico alquilado. En aspectos de ejemplo, el espaciador es un residuo de Cys o un residuo de Lys.

En algunas realizaciones, el espaciador comprende una carga global negativa, por ejemplo, comprende uno o dos aminoacidos cargados negativamente. En algunas realizaciones, el dipeptido no es ninguno de los dipeptidos de estructura general A-B, donde A se selecciona del grupo que consiste en Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe y Pro, en el que B se selecciona entre el grupo que consiste en Lys, His, Trp. En algunas realizaciones, los aminoacidos del espaciador dipeptido se selecciona del grupo que consiste en: Ala, b-Ala, Leu, Pro, acido g-aminobutlrico, Glu y g-Glu.

En algunas realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP comprende un grupo acilo tras la acilacion de una amina, hidroxilo o tiol de un espaciador, cuyo espaciador esta unido a una cadena lateral de un aminoacido en la posicion 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), o en el aminoacido C-terminal del peptido agonista de GIP.

En realizaciones aun mas especlficas, el grupo acilo esta unido al aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14, y 40) del analogo peptldico y la longitud del espaciador y grupo acilo es de 14 a 28 atomos. El aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), en algunos aspectos, es un aminoacido de la Formula I, por ejemplo, Lys, o un aminoacido disustituido relacionado con la Formula I. En realizaciones mas especlficas, el analogo peptldico carece de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente. El analogo de glucagon, por ejemplo, puede ser un analogo de glucagon que comprende uno o mas aminoacidos alfa, alfa-disustituidos, por ejemplo, AIB, para la estabilizacion de la helice alfa del analogo.

Grupos acilo

El grupo acilo del aminoacido acilado puede ser de cualquier tamano, por ejemplo, una cadena de carbono de cualquier longitud, y puede ser lineal o ramificado. En algunas realizaciones especlficas, el grupo acilo es un acido graso C4 a C30. Por ejemplo, el grupo acilo puede ser cualquiera de un acido graso C4, acido graso C6, acido graso C8, acido graso C10, acidos graso C12, acidos graso C14, acidos graso C16, acidos graso C18, acidos graso C20, acidos graso C22 , acido graso C24, acido graso C26, acido graso C28, o un acido graso C30. En algunas realizaciones, el grupo acilo es un acido graso C8 a C20, por ejemplo, un acido graso C14 o un acido graso C16.

En una realizacion alternativa, el grupo acilo es un acido biliar. El acido biliar puede ser cualquier acido biliar adecuado, incluyendo acido colico, acido quenodesoxicolico, acido desoxicolico, acido litocolico, acido taurocolico, acido glicocolico, y acido colesterol.

En realizaciones de ejemplo, el grupo acilo es un acido succlnico o un derivado de acido succlnico. Por "derivado de acido succlnico" como se utiliza en este documento se entiende un compuesto que comprende un acido succlnico sustituido o un acido succlnico clclico sustituido (es decir, anhldrido succlnico) o un anhldrido succlnico de anillo expandido sustituido, (es decir, un anillo de 6-8 miembros que comprende el grupo -C(O)-O-C(O)- y de 3 a 5 atomos de carbono adicionales), en el que el acido succlnico sustituido, el acido succlnico clclico sustituido (es decir, anhldrido succlnico), o anhldrido succlnico de anillo expandido sustituido estan sustituidos con uno o mas cadenas de alquilo o una o mas cadenas de carbono funcionalizadas.

En aspectos de ejemplo, el derivado de acido succinico comprende una estructura de Formula V:

en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a ^c20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido. En aspectos de ejemplo; el derivado de acido succinico comprende un anhidrido succinico que comprende una estructura de Formula VI:

en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo, carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido. En aspectos de ejemplo, el derivado de acido succinico es un derivado de anhidrido succinico que incluye los de Formula VII:

en la que n es 1-4, y en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido.

Cuando solo uno de R y R' de las Formulas V-VI es H, el aminoacido acilado se denomina "Cx succinollo". Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx succinollo", en el que x es un numero entero, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos de carbonos y x no incluye los atomos de carbono del grupo succinollo. Por ejemplo, una estructura de la Formula VI en la que R es un grupo alquilo C16 y R' es un H se denomina C16 succinollo. Por ejemplo, la figura 3A representa una Lys C16 succinoilo, en la que una Lys ha sido succinoilada en la amina e. Cuando ni R ni R' de las Formulas V-VI es H, entonces el aminoacido acilado se denomina como "Cx,Cx' succinollo." Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx,Cx' succinollo", en el que x y x' son numeros enteros, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos carbonos y R' es una cadena de alquilo de x' atomos de carbono, e y' = x' - 1. Por ejemplo, una estructura de Formula VI en la que R es un grupo alquilo C16 y R' es un grupo alquilo C14 se denomina C16, C14 succinollo. Cuando el derivado de acido succlnico es un anhldrido succlnico de anillo expandido sustituido y ni R ni R' de la Formula VII es H, entonces el aminoacido acilado se denomina "Cx,Cx'-n-succinollo". Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx,Cx'-n-succinollo", en el que x, x' y n son numeros enteros, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos de carbono, R' es una cadena de alquilo de y' atomos de carbono, y el anillo de anhldrido succlnico se extiende mediante n carbonos. Por ejemplo, una estructura de la Formula VII en la que R y R' son grupos alquilo C15 y n = 2 se denomina C16, C16-2-succinollo.

En realizaciones de ejemplo, el grupo acilo es un acido maleico o un derivado de acido maleico. Por "derivado de acido maleico" tal como se utiliza en este documento se entiende un compuesto que comprende un acido maleico sustituido o un acido maleico clclico sustituido (es decir, anhldrido maleico) o un anhldrido maleico de anillo expandido sustituido, (es decir, un anillo de 6-8 miembros que comprende el grupo -C(O)-OC(O)- y de 3 a 5 atomos de carbono adicionales), en el que el acido maleico sustituido, el acido maleico clclico sustituido (es decir, anhldrido maleico), o anhldrido maleico de anillo expandido sustituido esta sustituido con una o mas cadenas de alquilo o una o mas cadenas de carbono funcionalizadas.

En aspectos de ejemplo, el derivado de acido maleico comprende una estructura de Formula VIII:

en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido.

En aspectos de ejemplo, el derivado de acido maleico comprende un anhldrido maleico que comprende una estructura de Formula IX:

en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido. En aspectos de ejemplo, el derivado de acido maleico es un derivado de anhldrido maleico que incluye los de Formula X:

en la que n es 1-4, existe al menos un doble enlace C=C entre dos carbonos no carbonilos,

y

en la que cada uno de R y R' es, independientemente, H, una cadena de carbono C4-C30 lineal o ramificada, o una cadena de carbono funcionalizada C4-C30 lineal o ramificada. En realizaciones de ejemplo, R y/o R' es una cadena de carbono que comprende una cadena de alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un grupo alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxilo, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido. Cuando solo uno de R y R' de las Formulas VIII-IX es H, el aminoacido acilado se denomina "Cx maleollo". Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx maleollo", en el que x es un numero entero, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos de carbono y x no incluye los atomos de carbono del grupo maleollo. Por ejemplo, una estructura de la Formula IX en la que R es un grupo alquilo C15 y R' es un H se denomina C16 maleollo. Cuando ni R ni R' de las Formulas VIII-IX es H, entonces el aminoacido acilado se denomina como "Cx,Cx' maleollo." Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx,Cx' maleollo", en el que x y x' son numeros enteros, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos carbonos y R' es una cadena de alquilo de x' atomos de carbono. Por ejemplo, una estructura de Formula IX en la que R es un grupo alquilo C16 y R' es un grupo alquilo C14 se denomina C16, C14 maleollo. Cuando el derivado de acido maleico es un anhldrido maleico de anillo expandido sustituido y ni R ni R' de la Formula X es H, entonces el aminoacido acilado se denomina "Cx,Cx'-n-maleollo". Tal como se utiliza en este documento, el termino "Cx,Cx'-nmaleollo", en el que x, x' y n son numeros enteros, se refiere a una estructura en la que R es una cadena de alquilo de x atomos de carbono, R' es una cadena de alquilo de x' atomos de carbono, y el anillo de anhldrido maleico se extiende mediante n carbonos. Por ejemplo, una estructura de la Formula X en la que R y R' son grupos alquilo C16 y n = 2 se denomina C16, C16-2-maleollo.

Procedimientos de union de un grupo acilo

Los procedimientos adecuados de union de grupos acilo a peptidos a traves de aminas, hidroxilos, y tioles de los peptidos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, el Ejemplo 1 (para los procedimientos de acilacion a traves de una amina), Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi y Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); y Previero et al, Biochim Biophys Acta 263: 7-13. (1972) (para procedimientos de acilacion a traves de un hidroxilo); y San y Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (para los procedimientos de acilacion a traves de un tiol); Bioconjugate Chem.: "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications” Paginas 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pag.171-176 (1989).

En algunas realizaciones, el peptido agonista de GIP comprende un aminoacido acilado por acilacion de un alcano de cadena larga por el peptido agonista de GIP. En aspectos especificos, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo o tiol (por ejemplo, octadecilamina, tetradecanol, y hexadecanotiol) que reacciona con un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, del peptido agonista de GIP. El grupo carboxilo, o forma activada del mismo, del peptido agonista de GIP pueden ser parte de una cadena lateral de un aminoacido (por ejemplo, acido glutamico, acido aspartico) del peptido agonista de GIP o pueden ser parte de la cadena principal peptidica.

En realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP comprende un grupo acilo por acilacion del alcano de cadena larga por un espaciador que se une al peptido agonista de GIP. En aspectos especificos, el alcano de cadena larga comprende un grupo amina, hidroxilo, o tiol que reacciona con un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, del espaciador. Los espaciadores adecuados que comprenden un grupo carboxilo, o forma activada del mismo, se describen en el presente documento e incluyen, por ejemplo, espaciadores bifuncionales, por ejemplo, aminoacidos, dipeptidos, tripeptidos, espaciadores bifuncionales hidrofilos y los espaciadores bifuncionales hidrofobos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "forma activada de un grupo carboxilo" se refiere a un grupo carboxilo con la formula general R(C=O)X, en donde X es un grupo saliente y R es el analogo de glucagon o el espaciador. Por ejemplo, las formas activadas de un grupo carboxilo pueden incluir, pero no se limitan a, cloruros de acilo, anhidridos, y esteres. En algunas realizaciones, el grupo carboxilo activado es un ester con un ester de N-hidroxisuccinimida (NHS) como grupo saliente.

Con respecto a estos aspectos, en los que se acila un alcano de cadena larga por el analogo de glucagon o el espaciador, el alcano de cadena larga puede ser de cualquier tamano y puede comprender cualquier longitud de cadena de carbonos. El alcano de cadena larga puede ser lineal o ramificado. En ciertos aspectos, el alcano de cadena larga es un alcano C4 a C30. Por ejemplo, el alcano de cadena larga puede ser cualquiera de un alcano C4, alcano C6, alcano C8, alcano C10, alcano c 12, alcano C14, alcano C16, alcano C18, alcano C20, alcano C22, alcano C24, alcano C26, alcano C28, o un alcano C30. En algunas realizaciones, el alcano de cadena larga comprende un alcano C8 a C20, por ejemplo, un alcano C14, alcano C16, o un alcano C18.

Ademas, en algunas realizaciones, se acila un grupo amina, hidroxilo o tiol del peptido agonista de GIP con un acido colesterol. En una realization especifica, el peptido agonista de GIP esta unido al acido colesterol a traves de un espaciador de desamino Cys modificado, es decir un espaciador de acido 3-mercaptopropionico alquilado.

Cuando el grupo acilo es un acido succinico, derivado de acido succinico, acido maleico, o derivado de acido maleico, el peptido se succinoila/maleona por la reaction de un grupo amina, hidroxilo o tiol del peptido agonista de GIP, o espaciador, con un acido succinico, derivado de acido succinico, acido maleico o derivado de acido maleico de la formula V, formula VI, formula VII, la formula VIII, formula IX o formula X. Los procedimientos de succinoilacion se describen en este documento.

Grupos de acilo adicionales

El peptido en algunas o cualquiera de las realizaciones comprende un aminoacido acilado en una position distinta de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37 a 43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14, y 40). La ubicacion del aminoacido acilado puede ser cualquier posicion dentro del peptido agonista de GIP, incluyendo cualquiera de las posiciones 1-29, una posicion C-terminal al aminoacido 29 (por ejemplo, el aminoacido en la posicion 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 44, 45, 46, 47, etc., en una posicion dentro de una extension C-terminal o en el extremo C-terminal), opcionalmente junto con un segundo aminoacido acilado en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37 a 43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), siempre que la actividad agonista de GIP del analogo peptidico se mantenga, si no mejore. Los ejemplos no limitantes incluyen las posiciones 5, 7, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, o 29.

De acuerdo con lo anterior, el analogo de glucagon, en aspectos de ejemplo, comprende dos (o mas) aminoacidos acilados, y puede considerarse un peptido acilado dual o un peptido diacilado, cuando hay dos grupos acilo. En aspectos de ejemplo, todos los aminoacidos acilados estan situados en dos posiciones de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37 a 43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40). En aspectos de ejemplo, las acilaciones se producen en dos de las posiciones 10, 14 y 40. En aspectos de ejemplo, el peptido comprende un primer aminoacido acilado en la posicion 10 y un segundo aminoacido acilado en la posicion 40.

En realizaciones de ejemplo adicionales, el analogo de glucagon comprende dos (o mas) grupos acilo unidos a un solo aminoacido de la cadena principal del peptido. El peptido puede considerarse como un peptido acilado dual o un peptido diacilado, cuando hay dos grupos acilo. Los dos (o mas) grupos acilo pueden ser el mismo grupo acilo o diferentes grupos acilo, dispuestos en una formation lineal o ramificada. Por ejemplo, para lograr una formation ramificada, el analogo del glucagon puede comprender un aminoacido acilado (que es parte de la cadena principal del peptido) unido a un espaciador que comprende al menos tres grupos funcionales, al menos dos de los cuales estan cada uno unido covalentemente a un grupo acilo y uno de los cuales esta unido al aminoacido acilado de la cadena principal del peptido. En aspectos de ejemplo, puede lograrse una formacion ramificada a traves de, por ejemplo, un residuo de Lys que comprende dos grupos amina (una amina de cadena lateral y una amina alfa) para la union directa a un grupo acilo graso o la union indirecta a un grupo acilo graso a traves de un espaciador. En aspectos de ejemplo, se puede colocar un espaciador adicional entre el aminoacido de la cadena principal del peptido y el espaciador comprende al menos tres grupos funcionales. Por ejemplo, el aminoacido de la cadena principal del peptido puede estar unida (por ejemplo, a traves de su cadena lateral) a un primer espaciador, que, a su vez, esta unido a un segundo espaciador, en el que el segundo espaciador comprende al menos tres grupos funcionales, al menos dos de los cuales estan cada uno unido covalentemente a un grupo alquilo y uno de los cuales esta unido al primer espaciador.

En aspectos de ejemplo, en el que los grupos alquilo estan dispuestos en una formation lineal, el analogo de glucagon comprende un aminoacido acilado (que es parte de la cadena principal del peptido) unido directamente a un primer grupo acilo, que, a su vez, esta unido a un espaciador, que, a su vez, esta unido a un segundo grupo acilo. Los ejemplos de estructuras de compuestos acilados duales se representan en la Figura 5A.

Grupos hidrofilos y grupos acilo

Los peptidos agonistas de GIP que comprenden un aminoacido acilado opcionalmente comprenden ademas un grupo hidrofilo. En algunas o cualquiera de las realizaciones el grupo hidrofilo comprende una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporation de un grupo hidrofilo se lleva a cabo a traves de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. A este respecto, el peptido agonista de GIP puede comprender SEQ ID NO: 1, incluyendo cualquiera de las modificaciones descritas en el presente documento, en el que al menos uno de los aminoacidos en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 1720, y 37 a 43 (por ejemplo, en una o mas de las posiciones 10, 14 y 40) es un aminoacido acilado y al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 16, 17, 21, 24, o 29, una position dentro de una extension C-terminal, o el aminoacido C-terminal es una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, de los cuales la cadena lateral esta unida covalentemente a un grupo hidrofilo (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, el aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 37 a 43 (por ejemplo, en una o mas de las posiciones 10, 14 y 40) del peptido agonista de GIP esta unido (opcionalmente a traves de un espaciador) con el grupo acilo y el aminoacido esta unido ademas a un grupo hidrofilo o esta unido ademas a una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, que esta unido al grupo hidrofilo.

Alternativamente, el analogo de glucagon acilado puede comprender un espaciador, en el que el espaciador esta acilado y modificado para comprender el grupo hidrofilo. Ejemplos no limitantes de espaciadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo-Cys, y Ac-Phe.

En algunos aspectos, el peptido agonista de GIP en algunas realizaciones se acila en la misma posicion de aminoacido donde esta unido un grupo hidrofilo, o en una posicion de aminoacido diferente. Los ejemplos no limitantes incluyen la acilacion en la posicion 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 40 (por ejemplo, en una o mas de las posiciones 10, 14 y 40) y la pegilacion en una o mas posiciones en parte C-terminal del analogo de glucagon, por ejemplo, la posicion 24, 28 o 29, dentro de una extension C-terminal (por ejemplo, 37-43), o en el extremo C-terminal (por ejemplo, a traves de la adicion de una Cys C-terminal).

En algunas realizaciones especlficas, el peptido agonista de GIP que comprende un aminoacido acilado carece de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente (por ejemplo, un puente de lactama). AMINOACIDOS QUE COMPRENDEN UN GRUPO ALQUILO NO NATURAL

De acuerdo con algunas o cualquiera de las realizaciones, los peptidos agonistas de GIP que son analogos de glucagon (SEQ ID NO: 1) comprenden un aminoacido que comprende un grupo alquilo no natural (denominado en este documento como un " aminoacido alquilado," independientemente de como se prepara, por ejemplo, mediante la incorporacion de un aminoacido alquilado previamente en el peptido o alquilacion del peptido despues de la slntesis). En algunos o cualquiera de los aspectos, el aminoacido alquilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 37, 38, 39, 40, 41, 42, o 43 (por ejemplo, en una o mas de las posiciones 10, 14 y 40). En aspectos de ejemplo, el aminoacido alquilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 40 o en cualquiera de las posiciones 10, 13, 14, 16, 17, o 40. En aspectos de ejemplo, el aminoacido alquilado se encuentra en cualquiera de las posiciones 10, 12, 16, o 40 o en cualquiera de las posiciones 10, 12, o 16. En aspectos de ejemplo, el aminoacido alquilado se encuentra en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14, y 40.

El aminoacido alquilado, en algunas realizaciones, hace que el peptido agonista de GIP tenga uno o mas de (i) una vida media en circulation prolongada, (ii) un retraso en la aparicion de la action, (iii) una duration prolongada de action, (iv) una resistencia mejorada a las proteasas, tales como DPP-IV, y (v) un aumento de la potencia en una cualquiera o mas del receptor de GIP, el receptor GLP-1, y el receptor de glucagon.

Alquilacion directa

En algunas realizaciones, el grupo alquilo esta directamente unido a un aminoacido del peptido agonista de GIP. Segun una realizacion, el peptido agonista de GIP comprende un grupo alquilo que esta unido al peptido a traves de un enlace eter, tioeter o amina.

En aspectos especlficos, el peptido agonista de GIP comprende un grupo alquilo tras la alquilacion directa de una amina, hidroxilo, o tiol de una cadena lateral de un aminoacido del peptido agonista de GIP. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el grupo alquilo se une al aminoacido del peptido agonista de GIP mediante la reaccion de la amina, hidroxilo, tiol o con un grupo alquilo activado. Los grupos alquilo en algunos aspectos se activan con un grupo saliente, por ejemplo, un halogeno, ester de sulfonato, pyridylthiol, sal de amonio, o fenoxilo.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el aminoacido alquilado se encuentra en una de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 40 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14, y 40) o en una de las posiciones 10, 12, o 16. En este sentido, el peptido agonista de GIP comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoacidos modificada de la misma, que comprende una o mas de los modificaciones de aminoacido descritas en el presente documento, en la que al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 40 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14 y 40) es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral es un aminoacido de formula I. En algunas realizaciones, el aminoacido de Formula I es el aminoacido en el que n es 4 (Lys) o n es 3 (Orn). En algunas realizaciones, el aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral es un aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-fenilalanina (4-aminoPhe), p-amino fenilglicina, p-amino homofenilalanina o 3-amino tirosina. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-Phe.

En otras realizaciones, el aminoacido que comprende un hidroxilo en la cadena lateral es un aminoacido de formula II. En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido de Formula II es el aminoacido en el que n es 1 (Ser). En aspectos de ejemplo, el aminoacido de Formula II es el aminoacido en el que n es 2 (homoserina). En realizaciones de ejemplo similares, el aminoacido que comprende un hidroxilo en la cadena lateral es una Thr o homotreonina. En realizaciones de ejemplo similares, el aminoacido que comprende un hidroxilo en la cadena lateral es un aminoacido aromatico que comprende un hidroxilo en la cadena lateral. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende un hidroxilo en la cadena lateral es tirosina, homotirosina, metil tirosina, o 3-amino tirosina.

En otras realizaciones, el aminoacido que comprende un tiol en la cadena lateral es un aminoacido de formula III. En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido de formula III es el aminoacido en el que n es l (Cys). En algunas o cualquiera de las realizaciones de ejemplo, el aminoacido de formula III se une covalentemente a un grupo alquilo, por ejemplo, una cadena de carbono no funcionalizada o funcionalizada. En aspectos de ejemplo, el aminoacido esta alquilado en S-palmitilo (es decir, alquilado en S-palmitato) en el que el atomo de azufre de un residuo de Cys se une covalentemente al carbono b de palmitato. En otras realizaciones, el aminoacido de formula III se une covalentemente al carbono b de un acetato Cn a traves del atomo de azufre de un residuo Cys, en el que n es un numero entero de 4 a 30. Ejemplos de diferentes formas de alquilato de S-palmitilo se muestran en las figuras 6 y 7. En otras realizaciones, el aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral es un aminoacido disustituido que comprende la misma estructura de la Formula I, Formula II o Formula III, excepto que el hidrogeno unido al carbono alfa del aminoacido de Formula I, Formula II o Formula III esta sustituido por una segunda cadena lateral.

Espaciadores de alquilacion

En realizaciones alternativas, el grupo alquilo no natural esta unido a traves de un espaciador a un aminoacido del peptido agonista de GIP, en el que el espaciador se encuentra entre el aminoacido del peptido agonista de GIP y el grupo alquilo no natural. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GIP esta unido covalentemente al espaciador, que esta unido covalentemente al grupo alquilo no natural.

En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon se modifica para comprender un grupo alquilo no natural mediante alquilacion de una amina, hidroxilo o tiol de un espaciador, cuyo espaciador esta unido a una cadena lateral de un aminoacido en una de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14 y 40). En realizaciones de ejemplo, el grupo alquilo se une al espaciador mediante reaccion de la amina, hidroxilo, o tiol del espaciador con un grupo alquilo que tiene un grupo saliente (por ejemplo, halogeno, ester de sulfonato, piridiltiol, sal de amonio, fenoxilo).

El aminoacido al que esta unido el espaciador puede ser cualquier aminoacido que comprende un grupo que permite la union con el espaciador. Por ejemplo, un aminoacido que comprende un NH2, -OH, o -COOH en la cadena lateral (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. A este respecto, el analogo de glucagon alquilado puede comprender una secuencia de aminoacidos modificada de SEQ ID NO: 1, que comprende una o mas de las modificaciones de aminoacidos descritas en este documento, con al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40) modificado a cualquier aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o carboxilato en la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral o un dipeptido o tripeptido que comprende un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral. El aminoacido al que se une el espaciador puede ser cualquier aminoacido (por ejemplo, un aminoacido simple o doblemente a-sustituido) que comprende un grupo que permite la union con el espaciador. Por ejemplo, un aminoacido que comprende un NH2, -OH, o -COOH en la cadena lateral (por ejemplo, Lys, Orn, Ser, Asp, o Glu) es adecuado. A este respecto, el peptido agonista de GIP en algunos aspectos comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoacidos modificada de la misma que comprende una o mas de las modificaciones de aminoacidos descritas en este documento, en la que al menos uno de los aminoacidos en las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 37-43 (por ejemplo, en cualquiera de las posiciones 10, 14 y 40) es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo, o carboxilato en la cadena lateral.

En algunas realizaciones, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral, o un dipeptido o tripeptido que comprende un aminoacido que comprende una amina, hidroxilo o tiol en la cadena lateral.

Cuando el grupo alquilo esta unido a traves de un grupo amino de un espaciador, el grupo alquilo en algunos aspectos esta unido a traves de la amina alfa o a traves de una amina de la cadena lateral del aminoacido del espaciador. En el caso en el que el grupo alquilo esta unido a traves de una amina alfa, el aminoacido del espaciador puede ser cualquier aminoacido. Por ejemplo, el aminoacido del espaciador puede ser un aminoacido hidrofobo, por ejemplo, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, acido 6-amino hexanoico, acido 5-aminovalerico, acido 7-aminoheptanoico y acido 8-aminooctanoico. Alternativamente, en algunos aspectos, el aminoacido del espaciador es un residuo acido, por ejemplo, Asp, Glu, acido homoglutamico, acido homocisteico, acido cisteico, acido gamma-glutamico.

En el caso en el que el grupo alquilo esta unido a traves de una amina de la cadena lateral del espaciador de aminoacidos, el espaciador es un aminoacido que comprende una amina en la cadena lateral, por ejemplo, un aminoacido de formula I (por ejemplo, Lys o Orn). En este caso, es posible tanto que la amina alfa y la amina de la cadena lateral del aminoacido del espaciador se unan a un grupo alquilo, de manera que el peptido agonista de GIP esta dialquilado. Las realizaciones descritas en este documento incluyen dichas moleculas dialquiladas. En algunas realizaciones, el grupo alquilo esta unido a 4-amino-Phe, p-amino fenilglicina, p-amino homofenilalanina o 3-amino tirosina.

Cuando el grupo alquilo esta unido a traves de un grupo hidroxilo de un espaciador, el aminoacido o uno de los aminoacidos del dipeptido o tripeptido puede ser un aminoacido de formula II. En una realizacion de ejemplo especlfica, el aminoacido es Ser. En realizaciones de ejemplo similares, el grupo alquilo esta unido a una Thr o homotreonina. En realizaciones de ejemplo similares, el grupo alquilo esta unido a traves del hidroxilo de un aminoacido aromatico que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral, por ejemplo, tirosina, homotirosina, metil-tirosina, o 3-amino tirosina.

Cuando el grupo alquilo esta unido a traves de un grupo tiol de un espaciador, el aminoacido o uno de los aminoacidos del dipeptido o tripeptido puede ser un aminoacido de formula III. En una realizacion de ejemplo especlfica, el aminoacido es Cys. Cuando el grupo alquilo esta unido a traves de un grupo tiol de un espaciador, el aminoacido o uno de los aminoacidos del dipeptido o tripeptido puede ser un aminoacido de formula III. En una realizacion de ejemplo especlfica, el aminoacido es Cys. En realizaciones de ejemplo, el espaciador es un residuo de Cys, que esta unido covalentemente a un grupo alquilo, por ejemplo, una cadena de carbonos no funcionalizada 0 funcionalizada. En aspectos de ejemplo, el residuo de Cys esta alquilado con S-palmitilo (es decir, alquilado en S-palmitato), opcionalmente, en el que el residuo de Cys esta unido a un residuo de Lys que es parte de la cadena principal peptldica. En realizaciones alternativas, el espaciador es un dipeptido que comprende un residuo de Cys que esta unido covalentemente a un grupo alquilo. En aspectos de ejemplo, la Cys esta alquilada con S-palmitilo, y la Cys esta unida a otro aminoacido del separador, que, a su vez, esta unido a, por ejemplo, un residuo de Lys que es parte de la cadena principal peptldica. Ejemplificacion adicional de alquilacion con S-palmitilo se proporciona en el presente documento en el Ejemplo 20.

En otras realizaciones de ejemplo, el espaciador es un espaciador bifuncional que comprende (i) un primer extremo que comprende un grupo saliente que reacciona con un grupo alquilo que comprende una amina, hidroxilo o tiol y (ii) un segundo extremo que comprende un grupo funcional que reacciona con la cadena lateral del aminoacido del analogo de glucagon. En aspectos de ejemplo, el aminoacido del analogo de glucagon es un aminoacido de formula 1 (por ejemplo, Lys) o de Formula II (por ejemplo, Ser) y el aminoacido esta funcionalizado con un acido carboxllico o derivado de acido carboxllico. En aspectos de ejemplo alternativos, el aminoacido del analogo de glucagon es un aminoacido de formula III y el aminoacido esta funcionalizado con una haloacetamida, maleimido, o disulfuro. En algunas realizaciones, el aminoacido del analogo de glucagon es un aminoacido que comprende un carboxilato en la cadena lateral, por ejemplo, Glu, Asp, funcionalizados con una amina, hidroxilo o tiol.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrofilo. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende dos o mas grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo amina y un grupo carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofilo comprende un grupo tiol y un carboxilato. En una realizacion especlfica, el espaciador comprende un amino poli(alquiloxi)carboxilato. En este sentido, el separador puede comprender, por ejemplo, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, en el que m es cualquier numero entero de 1 a 6 y n es cualquier numero entero de 2 a 12, tal como, por ejemplo, acido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico, que esta disponible comercialmente de Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

En realizaciones de ejemplo, el espaciador comprende un pequeno grupo de polietilenglicol (PEG) que comprende una estructura [-O-CH2-CH2-]n, en donde n es un numero entero entre 2 y 16, (por ejemplo, 2, 3 ,4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Dichos PEG pequenos se denominan en este documento como "miniPEG." En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG funcionalizado que comprende uno o mas grupos funcionales. Los grupos funcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de combinaciones de los mismos. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un miniPEG que comprende una estructura {[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, en donde n se define anteriormente. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un amido miniPEG que comprende una estructura {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n}, en donde n se define anteriormente. En aspectos de ejemplo, el miniPEG es un amido miniPEG acido que comprende una estructura {-N-CH2-CH2-[-O-CH2-CH2-]n-COO-}, en donde n se define anteriormente. Los reactivos adecuados para su uso en la alquilacion de un aminoacido con un miniPEG estan disponibles comercialmente de proveedores, tales como Peptides International (Louisville, KY).

En algunas realizaciones, el espaciador es un espaciador bifuncional hidrofobo. Los espaciadores bifuncionales hidrofobos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende dos o mas grupos reactivos, por ejemplo, una amina, un hidroxilo, un tiol, y un grupo carboxilo o cualquiera de sus combinaciones. En realizaciones de ejemplo, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo hidroxilo y un carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo amina y un grupo carboxilato. En otras realizaciones, el espaciador bifuncional hidrofobo comprende un grupo tiol y un grupo carboxilato. Los espaciadores bifuncionales hidrofobos adecuados que comprenden un grupo carboxilato y un grupo hidroxilo o un grupo tiol son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, acido 8-hidroxioctanoico y acido 8-mercaptooctanoico.

El espaciador (por ejemplo, aminoacido, dipeptido, tripeptido, espaciador bifuncional hidrofilo, o espaciador bifuncional hidrofobo) en realizaciones especlficas es de 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos, (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, o 10 atomos) de longitud. En realizaciones mas especlficas, el espaciador es de aproximadamente 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos) de longitud y el grupo alquilo no natural es un alquilo C12 a C18, por ejemplo, alquilo C14, alquilo C16, de manera que la longitud total del espaciador y el grupo alquilo es de 14 a 28 atomos, por ejemplo, aproximadamente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 atomos. En algunas realizaciones, la longitud del espaciador y el grupo alquilo es de 17 a 28 (por ejemplo, de 19 a 26, 19 a 21) atomos.

Segun alguna o cualquiera de las realizaciones anteriores, el espaciador bifuncional puede ser un aminoacido sintetico o de origen natural (incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento) que comprende una cadena principal de aminoacidos que tiene de 3 a 10 atomos de longitud (por ejemplo, acido 6-aminohexanoico, acido 5-aminovalerico, acido 7-aminoheptanoico, y acido 8-aminooctanoico). Alternativamente, el espaciador puede ser un espaciador dipeptido o tripeptido que tiene una cadena principal peptldica que tiene de 3 a 10 atomos (por ejemplo, 6 a 10 atomos) de longitud. Cada aminoacido del espaciador dipeptido o tripeptido puede ser el mismo que o diferente de otro aminoacido o aminoacidos del dipeptido o tripeptido y puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en: aminoacidos de origen natural o codificados y/o de origen no natural o no codificados, incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los isomeros D o L de los aminoacidos de origen natural (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), o cualquier isomero D o L de los aminoacidos de origen no natural o no codificados seleccionados del grupo que consiste en: b-alanina (b-Ala), N-a-metil alanina (Me-Ala), acido aminobutlrico (Abu), acido g-aminobutlrico (g-Abu), acido aminohexanoico (e-Ahx), acido aminoisobutlrico (Aib), acido aminometilpirrolcarboxllico, acido aminopiperidincarboxllico, aminoserina (Ams), acido aminotetrahidropirano-4-carboxllico, arginina N-metoxi-N-metil amida, acido b-aspartico (b-Asp), acido azetidin-carboxllico, 3-(2-benzotiazolil) alanina, a-terc-butilglicina, acido 2-amino-5-ureido-n-valerico (citrulina, Cit), bCiclohexilalanina (Cha), acetamidometilo-cistelna, acido diaminobutanoico (Dab), acido diaminopropionico (Dpr), dihidroxifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), acido g-glutamico (g-Glu), homoserina (Hse), hidroxiprolina (Hyp), isoleucina N-metoxi-N-metil amida, metil-isoleucina (Melle), acido isonipecotico (Isn), metil leucina (MeLeu), metil lisina, dimetil lisina, trimetil lisina, metanoprolina, metionina sulfoxido (Met(O)), metionina sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), acido para-aminobenzoico (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-clorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe 4-NO2)), 4-cianofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-deshidroprolina, pirrolidinilalanina, sarcosina (Sar), selenocistelna (Sec), O-bencil-fosfoserina, acido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico (Sta), acido 4-amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA), acido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico (AHPPA), acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxllico (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi), O-bencil-fosfotirosina, O-fosfotirosina, metoxitirosina, etoxitirosina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirosina, tirosina tetrabutilamina sulfato, metil valina (MeVal), y acido 3-mercaptopropionico alquilado. En aspectos de ejemplo, el espaciador es un residuo de Cys.

En algunas realizaciones, el espaciador comprende una carga global negativa, por ejemplo, comprende uno o dos aminoacidos cargados negativamente. En algunas realizaciones, el dipeptido no es ninguno de los dipeptidos de estructura general A-B, en el que A se selecciona del grupo que consiste en Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe y Pro, en el que B se selecciona entre el grupo que consiste en Lys, His, Trp. En algunas realizaciones, los aminoacidos del espaciador dipeptido se seleccionan del grupo que consiste en: Ala, b-Ala, Leu, Pro, acido g-aminobutlrico, Glu y g-Glu.

En algunas realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP comprende un grupo alquilo tras la alquilacion de una amina, hidroxilo o tiol de un espaciador, cuyo espaciador esta unido a una cadena lateral de un aminoacido en la posicion 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40) o en el aminoacido C-terminal del peptido agonista de GlP.

En realizaciones aun mas especlficas, el grupo alquilo esta unido al aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), del peptido de glucagon y la longitud del espaciador y el grupo alquilo es de 14 a 28 atomos. El aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20 o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), en algunos aspectos, es un aminoacido de Formula I, por ejemplo, Lys, o un aminoacido disustituido relacionado con la Formula I. En realizaciones mas especlficas, el analogo del peptido carece de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente. El analogo de glucagon, por ejemplo, puede ser un analogo de glucagon que comprende uno o mas aminoacidos alfa, alfa-disustituidos, por ejemplo, AIB, para la estabilizacion de la helice alfa del analogo.

Grupos alquilo

El grupo alquilo no natural del aminoacido alquilado puede ser de cualquier tamano, por ejemplo, cualquier longitud de cadena de carbonos, y puede ser lineal o ramificado. En algunas realizaciones especlficas, el grupo alquilo es un alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un alquilo c4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28 o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16.

En realizaciones de ejemplo, el grupo alquilo no natural del aminoacido alquilado es una cadena de carbonos lineal o ramificada funcionalizada de cualquier longitud. En algunas realizaciones especlficas, la cadena de carbonos es un alquilo C4 a C30. Por ejemplo, el grupo alquilo puede ser cualquiera de un alquilo C4, alquilo C6, alquilo C8, alquilo C10, alquilo C12, alquilo C14, alquilo C16, alquilo C18, alquilo C20, alquilo C22, alquilo C24, alquilo C26, alquilo C28, o un alquilo C30. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un alquilo C8 a C20, por ejemplo, un alquilo C14 o un alquilo C16. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbono funcionalizada comprende un grupo funcional, incluyendo carboxi, sulfhidrilo, amina, cetilo, sulfoxilo o amido.

En realizaciones de ejemplo, el grupo alquilo no natural es una cadena de carbonos con funcionalidad carboxi de la estructura -Cx-COOH, en la que x es un numero entero, opcionalmente un numero entero entre 4 y 30 (por ejemplo, 4, 5, 6, 7 ,8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30), en la que el carbono carboxilo es el carbono alfa y cada uno de los carbonos de Cx se designan como beta, gamma, delta, epsilon, etc., en el que el carbono beta esta unido al carbono alfa. Por ejemplo, en la que, cuando x es 4, el grupo alquilo no natural serla se designarla de la siguiente manera: C^e-C^s-Cr C^p-C^aOOH. En realizaciones de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves de un carbono distinto del carbono carboxilo, es decir, uno de los carbonos de Cx. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta, gamma, delta, o epsilon de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral del aminoacido alquilado. En realizaciones alternativas, la cadena de carbono con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta, gamma, delta, o epsilon de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral de un espaciador, cuyo espaciador esta unido al aminoacido alquilado. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral del aminoacido alquilado. En realizaciones alternativas, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral de un espaciador, cuyo espaciador esta unido al aminoacido alquilado.

Procedimientos de union de un grupo alquilo

Los procedimientos de union de un grupo alquilo a un aminoacido se conocen en la tecnica. Por ejemplo, un grupo alquilo activado con un grupo saliente se pueden hacer reaccionar con un aminoacido que comprende una cadena lateral nucleofila, por ejemplo, una cadena lateral que comprende una amina, hidroxilo o tiol. El grupo saliente en aspectos de ejemplo es un halogeno, ester de sulfonato, piridiltiol, sal de amonio, o fenoxilo.

En realizaciones de ejemplo, el aminoacido que se une a un grupo alquilo es un residuo de Cys y el atomo de azufre esta alquilado, por ejemplo, "S-alquilado." En realizaciones de ejemplo, el azufre de la Cys se hace reaccionar con el grupo saliente en un grupo alquilo que comprende una cadena de carbonos con funcionalidad carboxi de la estructura -Cx-COOH, en la que x es un numero entero, opcionalmente un numero entero entre 4 y 30 (por ejemplo, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30), en la que el carbono carboxilo es el carbono alfa y cada uno de los carbonos de Cx se designan como beta, gamma, delta, epsilon, etc., en el que el carbono beta esta unido al carbono alfa. Por ejemplo, en la que, cuando x es 4, el grupo alquilo no natural serla se designarla de la siguiente manera: C^e-C^s-Cr C^p-C^aOOH. En realizaciones de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves de un carbono distinto del carbono carboxilo, es decir, uno de los carbonos de Cx. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta, gamma, delta, o epsilon de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral del aminoacido alquilado. En realizaciones alternativas, la cadena de carbono con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta, gamma, delta, o epsilon de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral de un espaciador, cuyo espaciador esta unido al aminoacido alquilado. En aspectos de ejemplo, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral del aminoacido alquilado. En realizaciones alternativas, la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi esta unida a traves del carbono beta de la cadena de carbonos con funcionalidad carboxi a la cadena lateral de un espaciador, cuyo espaciador esta unido al aminoacido alquilado.

En aspectos de ejemplo, el grupo saliente es un halogeno, tal como yodo, bromo, cloro, o fluor, esteres de sulfonato tales como tosilato, triflatos, o fluorosulfonatos, piridiltiol, sal de amonio, sales de diazonio, nitratos, fosfatos o fenoxilo.

En aspectos especlficos, el grupo alquilo comprende un grupo saliente yodo y una cadena de carbonos con funcionalidad carboxi que comprende un total de 16 carbonos (incluyendo el carbono del carboxilato). La alquilacion con dicho acido yodo-carboxllico puede ser referido como "alquilacion S-palmitilo", que es sinonimo de "alquilacion S-palmitato". Una ejemplificacion adicional de alquilacion S-palmitilo se proporciona en el presente documento en los Ejemplos 1 y 20.

Grupos alquilo adicionales

El peptido en algunos aspectos comprende un aminoacido alquilado en una posicion distinta de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10 , 14, y 40). La ubicacion del aminoacido alquilado puede ser cualquier posicion dentro del peptido agonista de GIP, incluyendo cualquiera de las posiciones 1-29, una posicion C-terminal al aminoacido 29 (por ejemplo, el aminoacido en la posicion 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 44, 45, 46, 47, etc., en una posicion dentro de una extension C-terminal o en el extremo C-terminal), opcionalmente junto con un segundo aminoacido alquilado en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40), siempre que se mantenga, si no mejore, la actividad agonista de GIP del analogo peptldico. Los ejemplos no limitantes incluyen las posiciones 5, 7, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28, o 29.

En concordancia con lo anterior, el analogo de glucagon, en aspectos de ejemplo, comprende dos (o mas) aminoacidos alquilados. En aspectos de ejemplo, todos los aminoacidos alquilados estan situados en dos posiciones de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40). En aspectos de ejemplo, el peptido comprende un primer aminoacido alquilado en la posicion 10 y un segundo aminoacido alquilado en la posicion 40.

En realizaciones de ejemplo adicionales, el analogo de glucagon comprende grupos alquilo adicionales unidos a un aminoacido de la cadena principal del peptido. Los dos (o mas) grupos alquilo pueden ser el mismo grupo alquilo o grupos alquilo diferentes, dispuestos en una formacion lineal o ramificado. Por ejemplo, para lograr una formacion ramificado, el analogo del glucagon puede comprender un aminoacido alquilado (que es parte de la cadena principal del peptido) unido a un espaciador que comprende al menos tres grupos funcionales, al menos dos de los cuales estan cada uno unido covalentemente a un grupo alquilo grupo y uno de los cuales esta unido al aminoacido alquilado de la cadena principal del peptido. En aspectos de ejemplo, puede lograrse una formacion ramificada a traves de, por ejemplo, un residuo de Lys que comprende dos grupos amina (una amina de cadena lateral y una amina alfa) para la union directa a un grupo alquilo graso o la union indirecta a un grupo alquilo graso a traves de un espaciador. En aspectos de ejemplo, se puede colocar un espaciador adicional entre el aminoacido de la cadena principal del peptido y el espaciador que comprende al menos tres grupos funcionales. Por ejemplo, el aminoacido de la cadena principal del peptido puede estar unido (por ejemplo, a traves de su cadena lateral) a un primer espaciador, que, a su vez, esta unido a un segundo separador, en el que el segundo separador comprende al menos tres grupos funcionales, al menos dos de los cuales estan cada uno unido covalentemente a un grupo alquilo y uno de los cuales esta unido al primer espaciador.

En aspectos de ejemplo, en el que los grupos alquilo estan dispuestos en una formacion lineal, el analogo de glucagon comprende un aminoacido alquilado (que es parte de la cadena principal del peptido) unido directamente a un primer grupo alquilo, el cual, a su vez, esta unido a un espaciador, que, a su vez, esta unido a un segundo grupo alquilo.

Los ejemplos de estructuras de compuestos alquilados duales son derivables de los compuestos acilados duales representados en la figura 5A.

Grupos hidrofilo y grupos alquilo

Los peptidos agonistas de GIP que comprenden un aminoacido alquilado opcionalmente comprenden ademas un grupo hidrofilo. En algunas realizaciones especlficas el grupo hidrofilo comprende una cadena de polietilenglicol (PEG). La incorporation de un grupo hidrofilo en algunos aspectos se lleva a cabo a traves de cualquier medio adecuado, tal como cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. A este respecto, el peptido agonista de GIP puede comprender la SEQ ID NO: 1, incluyendo cualquiera de las modificaciones descritas en el presente documento, en la que al menos uno de los aminoacidos en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17 , 20, y 37-43 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40) del peptido agonista GIP comprende un grupo alquilo y al menos uno de los aminoacidos en la position 16, 17, 21, 24 o 29, una position dentro de una extension C-terminal, o el aminoacido C-terminal es una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, de los cuales la cadena lateral esta unida covalentemente a un grupo hidrofilo (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, el aminoacido en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, y 37-43 (por ejemplo, en cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40) del peptido agonista de GIP esta unido (opcionalmente a traves de un espaciador) con el grupo alquilo y el aminoacido esta unido ademas a un grupo hidrofilo o esta unido ademas a una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, que esta unida al grupo hidrofilo.

Alternativamente, el analogo de glucagon alquilado puede comprender un espaciador, en el que el espaciador esta alquilado y modificado para comprender el grupo hidrofilo. Ejemplos no limitantes de separadores adecuados incluyen un espaciador que comprende uno o mas aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en Cys, Lys, Orn, homo-Cys, y Ac-Phe.

En algunos aspectos, el peptido agonista de GIP en algunas realizaciones esta alquilado en la misma posicion de aminoacido donde esta unido un grupo hidrofilo, o en una posicion de aminoacido diferente. Los ejemplos no limitantes incluyen la alquilacion en la posicion 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 20, o 40 (por ejemplo, en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14 y 40) y la pegilacion en una o mas posiciones en la parte C-terminal del analogo de glucagon, por ejemplo, la posicion 24, 28 o 29, dentro de una extension C-terminal (por ejemplo, 37-43), o en el extremo C-terminal (por ejemplo, a traves de la adicion de una Cys C-terminal).

Realizacion de grupo alquilo adicional

En realizaciones especlficas, el peptido agonista de GIP que comprende un aminoacido alquilado carece de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular covalente (por ejemplo, un puente de lactama).

ESTABILIZACION DE LA HELICE ALFA Y AMINOACIDOS QUE ESTABILIZAN LA HELICE ALFA

Sin estar ligado a ninguna teorla particular, los peptidos agonistas de GIP que se analogos de glucagon comprenden una estructura helicoidal, por ejemplo, una helice alfa. En algunas o cualquier realizacion, el peptido agonista de GIP comprende aminoacidos que estabilizan la estructura helicoidal alfa. Por consiguiente, en algunos aspectos, el peptido agonista de GIP comprende uno o mas aminoacidos estabilizantes de la helice alfa. Tal como se utiliza en este documento, el termino "aminoacido que induce la helice alfa" se utiliza indistintamente con el termino "aminoacido que estabiliza la helice alfa” y se refiere a un aminoacido que proporciona mayor estabilidad a una helice alfa de los peptidos agonistas de GIP de la que es una parte. Los aminoacidos que inducen la helice alfa son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Lyu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88: 5317-5320 (1991); Branden y Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, Nueva York, Nueva York, 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, ed. Fasman, Plenum, NY, 1989). Los aminoacidos que inducen la helice alfa adecuados para los propositos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a: alanina, norvalina, norleucina, acido alfa aminobutlrico, acido alfa-aminoisobutlrico (AIB), leucina, isoleucina, valina, y similares. En algunas realizaciones, el aminoacido que induce la helice alfa es cualquier aminoacido que es parte de una helice alfa que se encuentra en una protelna de origen natural, por ejemplo, Leu, Phe, Ala, Met, Gly, Ile, Ser, Asn, Glu, Asp , Lys, Arg.

En realizaciones de ejemplo, el aminoacido que induce la helice alfa proporciona mas estabilidad a la helice alfa en comparacion con la glicina o alanina. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido que induce la helice alfa es un aminoacido alfa, alfa disustituido, por ejemplo, AIB.

Helice alfa: Posicion de los aminoacidos que inducen la helice alfa

En algunas o cualquiera de las realizaciones de la presente descripcion, el peptido agonista de GIP comprende una secuencia de aminoacidos que es similar al glucagon natural (SEQ ID NO: 1) y el peptido agonista de GIP comprende al menos un aminoacido que induce la helice alfa en una o mas de las posiciones 16-21 del analogo peptldico (por ejemplo, una o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21). En algunas o cualquiera de las realizaciones, el analogo peptldico comprende un aminoacido que induce la helice alfa en una, dos, tres, o la totalidad de las posiciones 16, 17, 20, y 21.

Helice alfa: Aminoacidos alfa, alfa-disustituidos

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el aminoacido que induce la helice alfa es un aminoacido alfa, alfa di sustituido. En realizaciones especlficas, el aminoacido alfa, alfa di-sustituido comprende R1y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos forman un anillo (por ejemplo, un anillo C3-C8). En realizaciones de ejemplo, cada uno de R1y R2 se selecciona del grupo que consiste en: metilo, etilo, propilo y n-butilo, o R1 y R2 juntos forman un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo, acido 1-aminociclooctano-1-carboxllico). En realizaciones de ejemplo, R1 y R2 son los mismos. En otras realizaciones, R1 es diferente de R2. En aspectos de ejemplo, cada uno de R1 y R2 es un alquilo C1-C4. En algunos aspectos, cada uno de R1 y R2 es un alquilo C1 o C2. En realizaciones de ejemplo, cada uno de R1y R2 es metilo, de manera que el aminoacido alfa, alfa di-sustituido es acido alfa-aminoisobutlrico (AIB). En otras realizaciones de ejemplo, el aminoacido alfa, alfa disustituido aminoacido es ACPC.

En algunos aspectos, el peptido agonista de GIP descrito en este documento comprende uno o mas aminoacidos alfa, alfa di-sustituidos y el peptido agonista de GIP carece especlficamente de un puente intramolecular covalente (por ejemplo, una lactama), ya que el aminoacido alfa, alfa-disustituido es capaz de estabilizar la helice alfa en ausencia de un puente covalente. En algunos aspectos, el peptido agonista de GIP comprende uno o mas aminoacidos alfa, alfa di-sustituidos en el C-terminal (alrededor de las posiciones 12 a 29). En algunas o cualquiera de las realizaciones, una, dos, tres, cuatro o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 o 29 o, una, dos, tres, cuatro, cinco, o la totalidad de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, o 21 del peptido agonista de GIP esta sustituida por un aminoacido alfa, alfa disustituido, por ejemplo, acido amino iso-butlrico (AIB), un aminoacido disustituido con el mismo o un grupo diferente seleccionado entre metilo, etilo, propilo y n-butilo, o con un ciclooctano o cicloheptano (por ejemplo, acido 1-aminociclooctano-1-carboxllico). Por ejemplo, la sustitucion de la posicion 20 por AIB aumenta la actividad de GIP, en ausencia de un puente intramolecular, por ejemplo, un puente intramolecular no covalente (por ejemplo, un puente salino) o un puente intramolecular covalente (por ejemplo, una lactama). En algunas o cualquiera de las realizaciones, una, dos, tres o mas de las posiciones 16, 20, 21 o 24 estan sustituidas por AIB. En realizaciones de ejemplo, uno, dos o todos los aminoacidos correspondientes a las posiciones 2, 16, y 20 de glucagon humano natural (SEC ID NO: 1) se sustituyen por un aminoacido alfa, alfa disustituido, tal como AIB. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un AIB en las posiciones 2 y 16 o en las posiciones 2 y 20. En otros aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende una D-Ser en la posicion 2 y un AIB en la posicion 16 o la posicion 20.

Helice alfa: puentes intramoleculares

En algunas realizaciones de ejemplo, el aminoacido que induce la helice alfa es un aminoacido que esta unido a otro aminoacido del peptido agonista de GIP a traves de un puente intramolecular. En dichas realizaciones, cada uno de estos dos aminoacidos unidos a traves de un puente intramolecular se considera un aminoacido que induce la helice alfa. En realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP comprende uno o dos puentes intramoleculares. En realizaciones de ejemplo, el peptido agonista de GIP comprende un puente intramolecular en combinacion con al menos otro aminoacido que induce al helice alfa, por ejemplo, un aminoacido alfa, alfa disustituido.

En algunas realizaciones, el puente intramolecular es un puente que conecta dos partes del peptido agonista de GIP a traves de enlaces no covalentes, incluyendo, por ejemplo, interacciones de van der Waals, enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, interacciones hidrofobicas, interacciones dipolo-dipolo, y similares. En este sentido, el analogo de glucagon comprende un puente intramolecular no covalente. En algunas realizaciones, el puente intramolecular no covalente es un puente salino.

En algunas realizaciones, el puente intramolecular es un puente que conecta dos partes del peptido agonista de GIP a traves de enlaces covalentes. En este sentido, el peptido agonista de GIP comprende un puente intramolecular covalente.

En algunas realizaciones, se forma el puente intramolecular (por ejemplo, puente intramolecular no covalente, puente intramolecular covalente) entre dos aminoacidos que estan separados 3 aminoacidos, por ejemplo, aminoacidos en las posiciones i e i 4, en los que i es cualquier numero entero entre 12 y 25 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, y 25). Mas particularmente, las cadenas laterales de los pares de aminoacidos 12 y 16, 16 y 20, 20 y 24 o 24 y 28 (pares de aminoacidos en los que i = 12, 16, 20, o 24) estan unidas entre si y, de este modo, estabilizan la helice alfa. Alternativamente, i puedo ser 17. En algunas realizaciones especlficas, el peptido agonista de GIP comprende un puente intramolecular entre los aminoacidos 17 y 21. En algunas realizaciones especlficas, el peptido agonista de GIP comprende un puente intramolecular entre los aminoacidos en las posiciones 16 y 20 o 12 y 16 y un segundo puente intramolecular entre los aminoacidos en las posiciones 17 y 21. En el presente documento se contemplan los peptidos agonistas de GIP que comprenden uno o mas puentes intramoleculares. En realizaciones especlficas, en las que los aminoacidos en las posiciones i e i 4 estan unidos por un puente intramolecular, el tamano del enlazador es de aproximadamente 8 atomos, o aproximadamente 7-9 atomos.

En otras realizaciones, el puente intramolecular se forma entre dos aminoacidos que estan separados dos aminoacidos, por ejemplo, aminoacidos en las posiciones j y j 3, en los que j es cualquier numero entero entre 12 y 26 (por ejemplo, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26). En algunas realizaciones especlficas, j es 17. En realizaciones especlficas, en las que los aminoacidos en las posiciones j y j 3 estan unidos por un puente intramolecular, el tamano del enlazador es de aproximadamente 6 atomos, o aproximadamente 5 a 7 atomos.

En otras realizaciones, se forma el puente intramolecular entre dos aminoacidos que estan separados 6 aminoacidos, por ejemplo, aminoacidos en las posiciones k y k 7, en las que k es cualquier numero entero entre 12 y 22 (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22). En algunas realizaciones especlficas, k es 12, 13, o 17. En una realizacion de ejemplo, k es 17.

Helice alfa: aminoacidos implicados en puentes intramoleculares

Entre los ejemplos de emparejamientos de aminoacidos que son capaces de unirse (covalentemente o no covalentemente) para formar un puente que une seis atomos se incluyen Orn y Asp, Glu y un aminoacido de la formula I, en la que n es 2, y acido homoglutamico y un aminoacido de la formula I, en la que n es 1, en la que la Formula I es:

Ejemplos de emparejamientos de aminoacidos que son capaces de unirse covalentemente para formar un puente de union que tiene siete atomos incluyen Orn-Glu (lactama); Lys-Asp (lactama); o Homoser-Homoglu (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoacidos que pueden formar un enlazador de ocho atomos incluyen Lys-Glu (lactama); Homolys-Asp (lactama); Orn-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe- Asp (lactama); o Tyr-Asp (lactona). Ejemplos de emparejamientos de aminoacidos que pueden formar un enlazador de nueve atomos incluyen Homolys-Glu (lactama); Lys-Homoglu (lactama); 4-aminoPhe-Glu (lactama); o Tyr-Glu (lactona). Cualquiera de las cadenas laterales de estos aminoacidos puede estar sustituida adicionalmente con grupos qulmicos adicionales, siempre y cuando la estructura tridimensional de la helice alfa no se interrumpa. Un experto en la tecnica puede imaginar emparejamientos alternativos o analogos de aminoacidos alternativos, incluyendo derivados modificados qulmicamente, que crearlan una estructura estabilizadora de tamano similar y efecto deseado. Por ejemplo, un puente disulfuro homocistelna-homocistelna tiene 6 atomos de longitud y se puede modificar adicionalmente para proporcionar el efecto deseado.

Incluso sin enlace covalente, los emparejamientos de aminoacidos descritos anteriormente (o emparejamientos similares que un experto en la tecnica puede imaginar) tambien pueden proporcionar estabilidad anadida a la helice alfa a traves de enlaces no covalentes, por ejemplo, mediante la formacion de puentes salinos o interacciones de puentes de hidrogeno. Por consiguiente, se pueden formar puentes salinos entre: Orn y Glu; Lys y Asp; Homo-serina y Homo-glutamato; Lys y Glu; Asp y Arg; Homo-Lys y Asp; Orn y Homo-glutamato; 4-aminoPhe y Asp; Tyr y Asp; Homo-Lys y Glu; Lys y Glu-Homo; 4-aminoPhe y Glu; o Tyr y Glu. En algunas realizaciones, el analogo comprende un puente salino entre cualquiera de los siguientes pares de aminoacidos: Orn y Glu; Lys y Asp; Lys y Glu; Asp y Arg; Homo-Lys y Asp; Orn y Homo-glutamato; Homo-Lys y Glu; y Lys y Glu-Homo. Los puentes salinos se pueden formar entre otros pares de cadenas laterales de carga opuesta. Vease, por ejemplo, Kallenbach et al, Role of the Peptide Bond in Protein Structure and Folding, en The Amide Linkage: Structural Significance in Chemistry, Biochemistry and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc. (2000).

En algunas realizaciones, el puente intramolecular no covalente es un puente hidrofobo. De acuerdo con una realizacion, la helice alfa del analogo se estabiliza mediante la incorporacion de aminoacidos hidrofobos en las posiciones j y j 3 o i y i 4. Por ejemplo, i puedo ser Tyr e i 4 puede ser Val o Leu; i puede ser Phe e i 4 puede ser Met; o i puedo ser Phe e i 4 puede ser Ile. Debe entenderse que, para los propositos del presente documento, los emparejamientos de aminoacidos anteriores se pueden invertir, de manera que el aminoacido indicado en la posicion i, alternativamente, podrla estar situado en i 4, mientras que el aminoacido i 4 puede estar situado en la posicion i. Tambien debe entenderse que se pueden formar emparejamientos de aminoacidos adecuados para j y j 3.

Helice alfa: puente intramolecular covalente

En algunas realizaciones, el puente intramolecular covalente es un anillo de lactama o un puente de lactama. El tamano del anillo de lactama puede variar dependiendo de la longitud de las cadenas laterales de aminoacidos, y en una realizacion, la lactama esta formada por la union de las cadenas laterales de una ornitina a una cadena lateral de acido aspartico. Los puentes de lactama y procedimientos de fabricacion de los mismos son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Houston, Jr., et al, J Peptide Sci. 1: 274-282 (2004), y el Ejemplo 1 en el presente documento. En algunas realizaciones, el analogo comprende una secuencia modificada de la SEQ ID NO: 1 y un puente de lactama entre i y i 4, en el que i es tal como se define en este documento anteriormente. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GlP comprende dos puentes de lactama: uno entre los aminoacidos en las posiciones 16 y 20 y otro entre los aminoacidos en las posiciones 17 y 21. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GlP comprende un puente de lactama y un puente salino. Otras realizaciones de ejemplo se describen en el presente documento en la seccion titulada "EJEMPLOS". Otras realizaciones de ejemplo incluyen los siguientes emparejamientos, opcionalmente con un puente de lactama: Glu en la posicion 12 con Lys en la posicion 16; Lys natural en la posicion 12 con Glu en la posicion 16; Glu en la posicion 16 con Lys en la posicion 20; Lys en la posicion 16 con Glu en la posicion 20; Glu en la posicion 20 con Lys en la posicion 24; Lys en la posicion 20 con Glu en la posicion 24; Glu en la posicion 24 con Lys en la posicion 28; Lys en la posicion 24 con Glu en la posicion 28.

En algunas realizaciones, el puente intramolecular covalente es una lactona. Los procedimientos adecuados para producir un puente de lactona son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sheehan et al, J Am Chem Soc. 95: 875-879 (1973).

En algunos aspectos, se utiliza la metatesis de olefinas para reticular uno o dos giros de la helice alfa del analogo utilizando un sistema de reticulacion de todos los hidrocarburos. El peptido agonista de GlP en este caso comprende aminoacidos a-metilados que llevan cadenas laterales oleflnicas de longitud variable y configuradas con estereoqulmica R o S en las posiciones j y j 3 o i e i 4. En algunas realizaciones, la parte oleflnica comprende (CH2)n, en el que n es cualquier numero entero entre 1 a 6. En algunas realizaciones, n es 3 para una longitud de reticulacion de 8 atomos. En algunas realizaciones, n es 2 para una longitud de reticulacion de 6 atomos. Los procedimientos adecuados para la formacion de tales puentes intramoleculares se describen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) y Walensky et al, Science 305: 1466 1470 (2004). En realizaciones alternativas, el analogo comprende residuos de O-alil Ser situados en giros helicoidales adyacentes, que estan puenteados entre si a traves de la metatesis de cierre de anillo catalizada por rutenio. Dichos procedimientos de reticulacion se describen en, por ejemplo, Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed.

37: 3281-3284 (1998).

En aspectos especlficos, el uso del aminoacido tio-dialanina no natural, lantionina, que ha sido ampliamente adoptado como un peptidomimetico de cistina, se utiliza para reticular un giro de la helice alfa. Los procedimientos adecuados de ciclacion a base de lantionina son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Matteucci et al, Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. JPN. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman y Shao, Appl puro. Chem. 68: 1303-1308 (1996); y Osapay y Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).

En algunas realizaciones, las uniones a,w-diaminoalcano, por ejemplo, 1,4-diaminopropano y 1,5-diaminopentano, entre dos residuos de Glu en las posiciones i e i 7 se utilizan para estabilizar la helice alfa del analogo. Dichas uniones conducen a la formacion de un puente de 9 atomos de longitud o mas, dependiendo de la longitud de la union de diaminoalcano. Los procedimientos adecuados para la produccion de peptidos reticulados con dichas uniones se describen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997). En otras realizaciones, se utiliza un puente disulfuro para reticular uno o dos giros de la helice alfa del analogo. Alternativamente, se utiliza un puente de disulfuro modificado en el que uno o ambos atomos de azufre se sustituyen por un grupo metileno que da lugar a una macrociclacion isosterica para estabilizar la helice alfa del analogo. Los procedimientos adecuados de la modificacion de peptidos con puentes disulfuro o ciclacion a base de azufre se describen, por ejemplo, en Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9.391-9.392 (1991) y Rudinger y Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).

En otras realizaciones, la helice alfa del analogo se estabiliza a traves de la union del atomo de metal por dos residuos de His o un par de His y Cys situado en j y j 3, o i e i 4. El atomo de metal puede ser, por ejemplo, Ru (III), Cu (II), Zn (II), o Cd (II). Tales procedimientos de estabilizacion de helice alfa a base de union a metal son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Andrews y Tabor, Tetrahedron 55: 11711 a 11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); y Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063 a 9064 (1997).

La helice alfa del peptido agonista de GIP puede alternativamente estabilizarse a traves de otros medios de ciclacion de peptidos, cuyo significado se revisa en Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003). La helice alfa se puede estabilizar mediante la formacion de un puente de amida, puente de tioeter, puente de tioester, puente de urea, puente de carbamato, puente de sulfonamida, y similares. Por ejemplo, se puede formar un puente de tioester entre el extremo C-terminal y la cadena lateral de un residuo de Cys. Alternativamente, se puede formar un tioester a traves de cadenas laterales de aminoacidos que tienen un tiol (Cys) y un acido carboxllico (por ejemplo, Asp, Glu). En otro procedimiento, un agente de reticulacion, tal como un acido dicarboxllico, por ejemplo, acido suberico (acido octanodioico), etc. puede introducir un enlace entre dos grupos funcionales de una cadena lateral de aminoacido, tal como un amino libre, hidroxilo, grupo tiol, y combinaciones de los mismos.

DESCRIPCIONES ADICIONALES

A continuation se proporcionan descripciones adicionales de los analogos de glucagon de la presente description. Como se describe en este documento, la position del aminoacido en la siguiente descripcion hace referencia con respecto a la numeration de aminoacidos de SEQ ID NO: 1. Ademas, mientras que las descripciones siguientes se describen en referencia a glucagon humano natural (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, modificaciones de la SEQ ID NO: 1, estas descripciones no implican necesariamente (i) que tales modificaciones estan presentes en todos los peptidos descritos en el presente documento (ii) que el unico procedimiento de fabrication de los peptidos descritos en el presente documento es comenzar con glucagon humano natural y modificar esa secuencia. Mas bien, se proporcionan las descripciones para describir algunas realizaciones de los analogos de glucagon de las presentes descripciones, y los peptidos de las presentes descripciones se pueden producir de novo sin utilizar glucagon humano natural como material de partida, tal como se describe mas adelante en la section titulada "PROCEDIMIENTOS PARA LA FABRICACION DE PEPTIDOS".

Posicion 1

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 1, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido que no es His en la posicion 1. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido grande, aromatico en la posicion 1. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido grande, aromatico es Tyr, Phe, Trp, amino-Phe (por ejemplo, 4-amino-Phe), cloro-Phe, sulfo-Phe, 4-piridil-Ala, metil-Tyr o 3-amino Tyr.

En otras realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1. En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 1 comprende una estructura de Formula A:

en la que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-6), O-alquilo (C1-6), alquilo (C1-6)-OH, F, y acilo (C1-C6), de los cuales al menos un H se sustituye por F.

En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 1 es el residuo natural de glucagon (SEQ ID NO: 1) L-histidina (His), o es un derivado de His (derivado de His), por ejemplo, un derivado de His en el que se modifican los atomos alfa. El derivado de His en aspectos de ejemplo es D-histidina, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina, homo-histidina, N-metil histidina, alfa-metil histidina, acido imidazol acetico, o acido alfa, alfa-dimetil imidazol acetico (DMIA).

En otros aspectos, el aminoacido en la posicion 1 es un aminoacido protector de DPP-IV, tal como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el aminoacido protector de DPP-IV es un derivado de His.

Posicion 2

En algunas realizaciones, los peptidos descritos en el presente documento comprenden un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "aminoacido protector de DPP-IV" se refiere a un aminoacido que consigue una resistencia sustancial del peptido descrito en el presente documento contra la escision por dipeptidil peptidasa IV (DPP IV). En algunos aspectos, el aminoacido protector de DPP-IV es uno de D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, o acido alfa, aminoisobutlrico (AIB). En algunos aspectos, el aminoacido protector de DPP-IV es un aminoacido a,a-disustituido. En algunos aspectos, el aminoacido a,a-disustituido comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos forman un anillo. En algunos aspectos, el aminoacido a,a-disustituido es AIB o 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACPC).

El termino "alquilo C1-Cn", en el que n puede ser de 1 a 6, tal como se utiliza en el presente documento, representa un grupo alquilo ramificado o lineal que tiene de uno al numero especificado de atomos de carbono. Los grupos alquilo C1-C6 tlpicos incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo y similares.

En realizaciones de ejemplo, el aminoacido protector de DPP-IV es el D-isomero de Ser (D-Ser), o una sustitucion de aminoacidos conservativa del mismo. Por ejemplo, el aminoacido protector de DPP-IV puede comprender una estructura de cadena lateral de -(alquilo C1-C4)OH. Opcionalmente, cuando la estructura de la cadena lateral comprende -(alquilo C3)OH o -(alquilo C4)OH, la cadena de carbono puede ser de cadena lineal o ramificada.

En aspectos de ejemplo, cuando el aminoacido protector de DPP-IV es D-Ser y el aminoacido en la posicion 1 es His, el peptido agonista de GIP no esta conjugado a un grupo heterologo, por ejemplo, un grupo hidrofilo (por ejemplo, PEG). En otros aspectos de la presente descripcion, el aminoacido protector de DPP-IV no es D-serina. Posicion 3

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende en la posicion 3 un residuo de aminoacido acido, basico o hidrofobo. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, tales analogos de glucagon presentan una actividad del receptor de glucagon reducida. En algunas realizaciones, el aminoacido acido, basico o hidrofobo es el acido glutamico, ornitina, norleucina. Los analogos de glucagon que estan sustituidos con, por ejemplo, acido glutamico, ornitina, o norleucina en algunos aspectos tienen aproximadamente 10% o menos de la actividad de glucagon natural en el receptor de glucagon, por ejemplo, aproximadamente 1-10%, o aproximadamente 0,1-10%, o mas de aproximadamente 0,1% pero menos de aproximadamente 10%. En algunas realizaciones, los analogos de glucagon muestran aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 1% o aproximadamente el 7% de la actividad del glucagon natural.

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende el aminoacido natural de la SEQ ID NO: 1 en la posicion 3, por ejemplo, glutamina, o comprende un analogo de glutamina. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, estos analogos de glucagon que comprenden un analogo de glutamina no muestran una perdida sustancial de actividad en el receptor de glucagon, y en algunos casos, el analogo de glucagon que comprende el analogo de glutamina aumenta la actividad del receptor de glucagon. En algunas realizaciones, el analogo de glutamina comprende en la posicion 3 un aminoacido que comprende una cadena lateral de la Estructura I, II o III:

en las que R1 es alquilo C0-3 o heteroalquilo C0-3; R2 es NHR4 o alquilo C1-3; R3 es alquilo C1-3; R4 es H o alquilo C1-3; X es NH, O, o S; e Y es NHR4, SR3, u OR3. En algunas realizaciones, X es Nh o Y es NHR4. En algunas realizaciones, R1 es alquilo C0-2 o heteroalquilo C1. En algunas realizaciones, R2 es NHR4 o alquilo C1. En algunas realizaciones, R4 es H o alquilo C1. En realizaciones de ejemplo, se proporciona un aminoacido que comprende una cadena lateral de estructura I en donde, R1 es CH2-S, X es NH, y R2 es CH3 (acetamidometil-cistelna, C(Acm)) ; R1 es CH2, X es NH, y R2 es CH3 (acido acetildiaminobutanoico, Dab (Ac)); R1 es alquilo C0, X es NH, R2 es NHR4, y R4 es H (acido carbamoildiaminopropanoico, Dap (urea)); R1 es CH2-CH2, X es NH, y R2 es CH3 (acetilornitina, Orn (Ac)). En realizaciones de ejemplo, se proporciona un aminoacido que comprende una cadena lateral de la Estructura II donde, R1 es CH2, Y es NHR4, y R4 es CH3 (metilglutamina, Q (Me)). En realizaciones de ejemplo, se proporciona un aminoacido que comprende una cadena lateral de la Estructura III donde, R1 es CH2 y R4 es H (metionina-sulfoxido, M(O)); en realizaciones especlficas, el aminoacido en la posicion 3 esta sustituido por Dab (Ac).

Posicion 7

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 7, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Thr en la posicion 7. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 7 es un aminoacido alifatico grande, por ejemplo, Ile, Leu, Ala, y similares. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, se cree que los analogos de glucagon que comprenden dicho aminoacido en la posicion 7 presentan una actividad drasticamente reducida en el receptor de GLP-1.

Posicion 9

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 9, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Asp en la posicion 9. En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un aminoacido cargado negativamente distinto de Asp, por ejemplo, Glu, acido homoglutamico, acido cisteico, acido homocisteico. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 9 es un aminoacido acilado o un aminoacido alquilado, tal como se describe en este documento.

Posicion 10

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 10, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Tyr en la posicion 10. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 10 es Trp. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, se cree que los analogos de glucagon que comprenden dicho aminoacido en la posicion 10 muestran actividad en el receptor de GIP, receptor GLP-1, y/o receptor de glucagon que no esta reducida, en comparacion con el peptido correspondiente con una Tyr en la posicion 10.

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un aminoacido acilado o un aminoacido alquilado, tal como se describe en este documento.

Posicion 12

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 12, con respecto a SEQ ID NO: 1. por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Lys en la posicion 10. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 12 es un aminoacido alifatico, no polar, grande, opcionalmente, isoleucina. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 12 es Arg. Sin estar ligado a una teorla en particular, los analogos de glucagon que comprenden un aminoacido alifatico, no polar, grande, por ejemplo, Ile, muestran una mayor actividad en el receptor de GIP. En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un un aminoacido acilado o un aminoacido alquilado, tal como se describe en este documento.

Posicion 15

En algunas realizaciones, los analogos de glucagon comprenden una modificacion de aminoacido en la posicion 15, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Asp en la posicion 15. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 15 esta eliminado o es acido glutamico, acido homoglutamico, acido cisteico o acido homocisteico. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, estos analogos de glucagon muestran una estabilidad mejorada, por ejemplo, mediante la reduccion de la degradacion o la escision del analogo con el tiempo, especialmente en tampones acidos o alcalinos, por ejemplo, tampones a un pH dentro del intervalo de 5,5-8. En algunas realizaciones, los analogos de glucagon que comprenden esta modificacion retienen al menos 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del analogo original despues de 24 horas a 25°C.

Posicion 16

En algunas realizaciones, los analogos de glucagon comprenden una modificacion de aminoacido en la posicion 16, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido diferente de Ser en la posicion 16. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 16 es acido glutamico u otro aminoacido de carga negativa que tiene una cadena lateral con una longitud de 4 atomos, o alternativamente uno cualquiera de glutamina, acido homoglutamico, o acido homocisteico, o un aminoacido cargado que tiene una cadena lateral que contiene al menos un heteroatomo, (por ejemplo, N, o, S, P) y con una longitud de cadena lateral de aproximadamente 4 (o 3-5) atomos. En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende en la posicion 16 por un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en acido glutamico, glutamina, acido homoglutamico, acido homocisteico, treonina o glicina o es un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en acido glutamico, glutamina, acido homoglutamico y acido homocisteico.

Sin estar ligado a ninguna teorla particular, dichos analogos de glucagon muestran una estabilidad mejorada, por ejemplo, mediante la reduccion de la degradacion del peptido con el tiempo, especialmente en tampones acidos o alcalinos, por ejemplo, tampones a un pH dentro del intervalo de 5,5 a 8. Tales analogos de glucagon son menos susceptibles a la escision del enlace peptldico Asp15-Ser16.

En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido cargado negativamente, opcionalmente en combinacion con un aminoacido que induce la helice alfa (por ejemplo, un aminoacido alfa, alfa disustituido, o AIB) en la posicion 20. Dichos analogos de glucagon presentan actividad GIP.

En realizaciones alternativas, el analogo de glucagon comprende en la posicion 16 una Thr o un aminoacido qeue induce la helice alfa, tal como se describe anteriormente. En algunas realizaciones, el aminoacido que induce la helice alfa es AIB o Glu.

En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido cargado positivamente, por ejemplo, la Formula IV:

en la que n es de 1 a 16, o de 1 a 10, o de 1 a 7, o de 1 a 6, o de 2 a 6, o 2 o 3 o 4 o 5, cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, (alquil C1-C18)OH, (alquil C1-C18)NH2, (alquil C1-C18)s H, (alquil C0-C4)cicloalquilo (C3-C6), (alquilo C0-C4)(heterociclo C2-C5), (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7, (alquilo C1-C4)(heteroarilo C3-C9), en el que R7 es H o OH. En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 16 es Lys.

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un un aminoacido acilado o un aminoacido alquilado, tal como se describe en el presente documento.

En realizaciones adicionales, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido que comprende una cadena lateral que esta conjugada a un grupo heterologo, tal como se describe en el presente documento en la seccion titulada "CONJUGADOS".

Posiciones 17 y 18

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en una o ambas de las posiciones 17 y 18, en relacion con la SEQ ID NO: 1, de manera que el sitio Arg-Arg dibasico en las posiciones 17 y 18 esta eliminado. En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un aminoacido distinto de Arg en una o ambas de las posiciones 17 y 18. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, se cree que la eliminacion del sitio dibasico mejora la eficacia in vivo del analogo de glucagon. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 17 no es un aminoacido basico. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 17 es un aminoacido alifatico. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 17 esta sustituido por otro aminoacido, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, un aminoacido que comprende un grupo hidrofilo, un aminoacido que induce la helice alfa. En algunas realizaciones, el aminoacido que induce la helice alfa forma un puente intramolecular no covalente con un aminoacido en j 3 o i 4. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 17 es Gln.

En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 18 no es un aminoacido basico. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 18 es un aminoacido alifatico. En algunas realizaciones, el aminoacido en la posicion 18 es un aminoacido alifatico pequeno, por ejemplo, Ala.

En algunos aspectos especlficos, el aminoacido en la posicion 18 es un aminoacido alifatico pequeno, por ejemplo, Ala, y el aminoacido en la posicion 17 es Arg. En otros aspectos, el aminoacido en la posicion 18 es un aminoacido alifatico pequeno, por ejemplo, Ala, y el aminoacido en posicion 17 es Gln.

En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 17 es un aminoacido que comprende una cadena lateral que esta conjugada a un grupo heterologo, tal como se describe en el presente documento en la seccion titulada "CONJUGADOS”.

Posicion 20

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 20, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido distinto de Gln. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido que induce la helice alfa, por ejemplo tal como se describe anteriormente. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido alfa, alfa disustituido, por ejemplo, AIB, ACPC. En algunas realizaciones, el aminoacido que induce la helice alfa forma un puente intramolecular no covalente con un aminoacido en j-3 o i-4.

En algunas realizaciones especlficas, el aminoacido es un aminoacido hidrofilo que tiene una cadena lateral que esta cargada o tiene una capacidad de enlaces de hidrogeno, y tiene al menos aproximadamente 5 (o aproximadamente 4-6) atomos de longitud, por ejemplo, lisina, citrulina, arginina u ornitina. En otros aspectos, el aminoacido en la posicion 20 es Ser, Thr, Ala o AlB.

En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido acilado o aminoacido alquilado, tal como se describe en este documento.

En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido que comprende una cadena lateral que esta conjugada a un grupo heterologo, tal como se describe en el presente documento en la seccion titulada "CONJUGADOS”.

Sin estar ligado a ninguna teorla particular, estos analogos de glucagon presentan una mayor actividad en el receptor de GLP-1 y/o receptor de GIP o muestran una degradacion reducida que se produce a traves de la desamidacion de Gln y/o muestran una mayor estabilidad.

Posicion 21

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacido en la posicion 21, con respecto a SEQ ID NO: 1, por ejemplo, el aminoacido en la posicion el 21 es un aminoacido distinto de Asp. En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 21 es Ser, Thr, Ala o AIB. En otros aspectos, el aminoacido en la posicion 21 es Lys, Arg, Orn, o citrulina. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 21 es Glu, acido homoglutamico o acido homocisteico. En algunos aspectos, el aminoacido en la posicion 21 es un aminoacido que comprende una cadena lateral que esta conjugada a un grupo heterologo, tal como se describe en el presente documento en la seccion titulada "CONJUGADOS”.

En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a m in o a c id o e n la posición 21 e s un a m in o a c id o que in d u c e la h e lic e a lfa . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a m in o a c id o que in d u c e la h e lic e a lfa fo rm a un p u e n te in tra m o le c u la r n o c o v a le n te c o n un a m in o a c id o e n j- 3 o i-4.

S in e s ta r lig a d o a n in g u n a te o r la p a r t ic u la r , e s to s a n a lo g o s d e g lu c a g o n m u e s tra n u n a re d u c c io n d e la d e g ra d a c io n que s e p ro d u c e a t ra v e s d e la d e g ra d a c io n a t ra v e s d e la d e s h id ra ta c io n d e A s p p a ra fo rm a r un in te rm e d io d e s u c c in im id a c lc l ic o s e g u id o d e is o m e r iz a c io n a is o -a s p a r ta to y /o m u e s tra n u n a m a y o r e s ta b ilid a d .

Posicion 23

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o e n la posición 23 , c o n re s p e c to a S E Q ID N O : 1. E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 23 e s un a m in o a c id o d is t in to d e V a l, in c lu y e n d o Ile .

Posicion 24

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o e n la posición 24 , c o n re s p e c to a S E Q ID N O : 1. E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 24 e s un a m in o a c id o d is t in to d e G ln , p o r e je m p lo , A la , A s n , C y s . En a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 24 e s un a m in o a c id o que c o m p re n d e u n a c a d e n a la te ra l que e s ta c o n ju g a d a a un g ru p o h e te ro lo g o , tal como se describe en e l p re s e n te d o c u m e n to e n la s e c c io n t i tu la d a "C O N J U G A D O S ” .

Posicion 27

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o e n la posición 27 , c o n re s p e c to a S E Q ID N O : 1. E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o en la posición 27 e s un a m in o a c id o d is t in to d e M et. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , el a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e e n la posición 27 un a m in o a c id o que e v ita la d e g ra d a c io n o x id a t iv a de l p e p tid o . E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 27 e s la m e t io n in a s u lfo x id o , le u c in a , is o le u c in a o n o r le u c in a . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s e s p e c lf ic a s , el a m in o a c id o e n la posición 27 e s le u c in a o n o r le u c in a .

E n o tro s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 27 e s un a m in o a c id o a lifa t ic o (p o r e je m p lo , G ly , A la , V a l, L e u , Ile ) o un a m in o a c id o d e fo rm u la IV , tal como se describe e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , L ys . E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , e l a m in o a c id o e n la posición 27 e s V a l o L ys . S in e s ta r l ig a d o a n in g u n a te o r la p a r t ic u la r , d ic h a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o re d u c e la a c t iv id a d d e g lu c a g o n .

Posicion 28

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o e n la posición 28 , c o n re s p e c to a S E Q ID N O : 1. E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o en la posición 28 e s un a m in o a c id o d is t in to d e A s n . En a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 28 e s A la , S e r, T h r, o A IB . En a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o en la posición 28 e s un a m in o a c id o c a rg a d o , p o r e je m p lo , un a m in o a c id o c o n c a rg a n e g a tiv a , tal como se describe ^{a d ic io n a lm e n te e n e s te d o c u m e n to . V e a s e la s e c c io n t itu la d a} "Extremo C-terminal cargado." ^{E n a lg u n o s a s p e c to s , el}a m in o a c id o e n la posición 28 e s A s p .

E n a s p e c to s d e e je m p lo , e l a m in o a c id o e n la posición 28 e s un a m in o a c id o d e fo rm u la IV tal como se describe e n el p re s e n te d o c u m e n to . E l a m in o a c id o e n la s re a liz a c io n e s d e e je m p lo e s L ys . S in e s ta r l ig a d o a n in g u n a te o r la p a r t ic u la r , d ic h a m o d if ic a c io n d e a m in o a c id o re d u c e la a c t iv id a d d e g lu c a g o n .

Posicion 29

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a m o d if ic a c io n de aminoácidos e n la posición 29 , c o n re s p e c to a S E Q ID N O : 1. En a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 29 e s un a m in o a c id o d is t in to d e T h r. E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 29 e s G ly . E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o en la posición 29 e s A la .

E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a m in o a c id o e n la posición 29 e s un a m in o a c id o que c o m p re n d e u n a c a d e n a la te ra l que e s ta c o n ju g a d a a un re s to h e te ro lo g o , tal como se describe e n e l p re s e n te d o c u m e n to e n la s e c c io n t itu la d a " C O N J U G A D O S ” .

Extremo C-terminal cargado

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , el a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e u n a o m a s s u s t itu c io n e s de aminoácidos y /o a d ic io n e s que in tro d u c e n un a m in o a c id o c a rg a d o e n la p a rte C - te rm in a l d e l a n a lo g o , e n re la c io n a la S E Q ID N O : 1. En a lg u n a s re a liz a c io n e s , ta le s m o d if ic a c io n e s m e jo ra n la e s ta b il id a d y s o lu b il id a d . T a l c o m o s e u t iliz a e n e s te documento, el termino "aminoacido cargado" o "residuo cargado" se refiere a un aminoacido que comprende una cadena lateral que es esta cargada positivamente o esta cargada negativamente (es decir, desprotonada) o cargada positivamente (es decir, protonada) en solucion acuosa a pH fisiologico. En algunos aspectos, estas sustituciones de aminoacidos y/o adiciones que introducen modificaciones con aminoacidos cargados estan en una posicion C-terminal con respecto a la posicion 27 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, se introducen uno, dos o tres (y en algunos casos, mas de tres) aminoacidos cargados dentro de la parte C-terminal (por ejemplo, la posicion o posiciones C-terminal con respecto a la posicion 27). Segun algunas realizaciones, el aminoacido o aminoacidos naturales en las posiciones 28 y/o 29 estan sustituidos con un aminoacido cargado, y/o en una realizacion adicional, tambien se anaden de uno a tres aminoacidos cargados en el extremo C-terminal del analogo. En realizaciones de ejemplo, uno, dos o todos los aminoacidos cargados son de carga negativa. El aminoacido con carga negativa, en algunas realizaciones, es acido aspartico, acido glutamico, acido cisteico, acido homocisteico, o acido homoglutamico. En algunos aspectos, estas modificaciones aumentan la solubilidad o estabilidad. En algunas realizaciones, la posicion 30 no es un aminoacido cargado. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, un aminoacido cargado, por ejemplo, un aminoacido con carga negativa, por ejemplo, Glu, reducla la actividad de GIP.

Truncamiento C-terminal

De acuerdo con algunas realizaciones, los analogos de glucagon descritos en este documento estan modificados mediante el truncamiento del extremo C-terminal por uno o dos residuos de aminoacidos. Tales peptidos modificados de glucagon, retienen una actividad y potencia similar en el receptor de glucagon y el receptor de GLP-1. A este respecto, los peptidos de glucagon pueden comprender aminoacidos 1-27 o 1-28 del analogo de glucagon natural (SEQ ID NO: 1), opcionalmente con cualquiera de las modificaciones adicionales que se describen en este documento.

Extremo C-terminal de carga neutra

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon comprende un grupo de carga neutra, tal como una amida o ester, en el extremo C-terminal en lugar del alfa carboxilato, con respecto a SEQ ID NO: 1. Sin estar ligado a ninguna teorla particular, dichas modificaciones en los aspectos de ejemplo aumentan la actividad del analogo de glucagon en el receptor de GLP-1. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el analogo de glucagon es un peptido amidado, de manera que el residuo C-terminal comprende una amida en lugar del alfa carboxilato de un aminoacido. Tal como se utiliza en el presente documento una referencia general a un peptido o analogo pretende abarcar peptidos que tienen un extremo amino, extremo carboxi, o ambos extremos amino y carboxi modificados. Por ejemplo, una cadena de aminoacidos que componen un grupo amida en lugar del acido carboxllico terminal esta abarcado por una secuencia de aminoacidos que designan los aminoacidos estandar.

Extensiones C-terminal

En algunas realizaciones de la presente description, los analogos de glucagon comprenden una extension C-terminal de 1-21 aminoacidos fusionados al aminoacido en la posicion 29. La extension C-terminal puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 aminoacidos. En algunos aspectos, la extension C-terminal es cualquiera de los peptidos heterologos descritos a continuation en la section "CONJUGADOS". Por ejemplo, en algunos aspectos, la extension comprende una secuencia de aminoacidos que forma una estructura de jaula de Trp, por ejemplo, la extension comprende la secuencia de aminoacidos de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5), o una secuencia sustituida de forma conservativa de la misma. En aspectos alternativos, la extension de 1 a 21 aminoacidos comprende al menos un aminoacido cargado. En aspectos de ejemplo, la extension comprende una secuencia de aminoacidos de: X1-X2, en la que X1 es un aminoacido cargado y X2 es un aminoacido alifatico pequeno. En algunos aspectos, X1 es un aminoacido con carga positiva, por ejemplo, Arg. En algunos aspectos, la extension comprende Arg-Gly.

En algunas realizaciones, la extension comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 6 (GGPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 7 (KRNRNNIA), o SEQ ID NO: 8 (KRNR). En aspectos especlficos, la secuencia de aminoacidos esta unida a traves del aminoacido C-terminal del analogo de glucagon, por ejemplo, el aminoacido en posicion 29. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 5-8 esta unida al aminoacido 29 del analogo de glucagon a traves de un enlace peptldico. En algunas realizaciones especlficas, el aminoacido en la posicion 29 del analogo de glucagon es una Gly y la Gly se fusiona a una de las secuencias de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 5-8.

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende una extension que forma una forma una estructura conocida en la tecnica como una jaula de Trp (vease, por ejemplo, Paschek et al, Proc Natl Acad Sci USA. 105 (46): 17754-17759. (2008) En algunos aspectos, la extension comprende la secuencia de aminoacidos GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) o GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) o GPSSGRPPPS (SEQ ID NO: 183) o una secuencia de una de los anteriores con 1, 2, o 3 sustituciones conservativas de aminoacidos. En aspectos de ejemplo, cuando la extension comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 183, el aminoacido en la posicion 28 es un aminoacido cargado negativamente, por ejemplo, Asp o Glu.

Otras modificaciones

Las descripciones de otras modificaciones, en relacion con la SEQ ID NO: 1, de los analogos de glucagon de la presente descripcion se encuentran a lo largo de toda esta solicitud. La lista anterior no es exhaustiva, sino meramente de ejemplo.

En algunas realizaciones, los analogos de glucagon descritos en este documento estan glicosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclados a traves de, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertido en una sal (por ejemplo, una sal de adicion de acido, una sal de adicion de base), y/o opcionalmente dimerizados, multimerizados, o polimerizados, o conjugados.

PEPTIDOS EXCLUIDOS

Los analogos de glucagon de la presente descripcion son estructuralmente distintos de los analogos de glucagon que presentan actividad agonista del receptor de GIP descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT US2009/47447 (presentada el 16 de junio de 2009), solicitud de Estados Unidos n° 61/073.274 (presentada el 17 de junio de 2008); Solicitud de Estados Unidos n° 61/078.171 (presentada el 3 de julio de 2008); solicitud de Estados Unidos N° 61/090.448 (presentada el 20 de agosto de 2008), solicitud de Estados Unidos n° 61/151.349 (presentada el 10 de febrero de 2009), solicitud de Estados Unidos N° 61/187.578 (presentada el 16 de junio de 2009), solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2010-038825 (presentada el 16 de junio de 2010). En consecuencia, en cualquiera o todas las realizaciones, el analogo de glucagon de la presente descripcion no es cualquiera de los analogos de glucagon o peptidos descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2009/47447 (presentada el 16 de junio de 2009 y publicada como WO 2010/011439), solicitud de Estados Unidos n° 61/073.274 (presentada el 17 de junio de 2008); Solicitud de Estados Unidos n° 61/078.171 (presentada el 3 de julio de 2008); solicitud de Estados Unidos N° 61/090.448 (presentada el 20 de agosto de 2008), solicitud de Estados Unidos n° 61/151.349 (presentada el 10 de febrero de 2009), solicitud de Estados Unidos n° 61/187.578 (presentada el 16 de junio de 2009), Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2010/038825 (presentada el 16 de junio de 2010 y publicada como WO 2010/148089), Solicitud de Estados Unidos N° 61/298.812 (presentada el 27 de enero del 2010), o Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2011/022608 (presentada el 26 de enero de 2011, y publicada como WO 2011/094337). En realizaciones de ejemplo, los peptidos, peptidos de glucagon, o analogos de glucagon de la presente descripcion no es (es decir, excluye) uno cualquiera o todos de los peptidos de SEQ ID

NOs: 1-262 del documento WO 2010/011439; SEQ ID NOs: 1 a 680 del documento WO 2010/148089, o SEQ ID

NOs: 1 a 1318 del documento PCT/US2011/022608).

En realizaciones de ejemplo, los peptidos, peptidos de glucagon, o analogos de glucagon de la presente descripcion no son (es decir, excluyen) uno cualquiera o todos los peptidos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7 , 8, 9, 10, 11, 12,

13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 , 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,

127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 , 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,

173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195,

196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206,207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218,

219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,

242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256 , 257, 258, 259, 260, 261, y/o 262 de la publicacion de solicitud de Patente Internacional N° WO 2010/011439.

En realizaciones de ejemplo, los peptidos, peptidos de glucagon, o analogos de glucagon de la presente descripcion no son (es decir, excluyen) uno cualquiera o todos los peptidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 4 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 7 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 104, 105, 106 , 107, 108, 109, 110, 111 , 112., 113., 114., 115., 116, 117 118 119 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,

127, 128, 129, 130, 131 , 132, 133, 134, 135., 136., 137., 138., 139, 140, 141 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149,

150, 151, 152, 153, 154, 155, 156 , 157, 158., 159., 160., 161 , 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172,

173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 , 182., 183., 184., 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195,

196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206 , 207, 208 209 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218,

219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 232 233 234 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,

242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256 257 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264

265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287

288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306 , 307, 308, 309, 310,

311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333

334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356

357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379

380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388 , 389, 390, 391 , 392 393 394 395 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402

403, 404, 405, 406,407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425,

426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448,

449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456,457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471,

472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494,

495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 , 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517,

518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 , 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540,

541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556 , 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563,

564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581 , 582, 583, 584, 585, 586,

587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606,607, 608, 609,

610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631 , 632,

633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655,

656,657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678,

679, y/o 680 de la publicacion de solicitud de Patente Internacional N° WO 2010/148089. En realizaciones de

ejemplo, los peptidos, peptidos de glucagon, o analogos de glucagon de la presente descripcion no son (es decir,

excluyen) uno cualquiera o todos los peptidos de SEQ ID NO: 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667,

668, 669 de la publicacion de solicitud de patente internacional n° WO 2010/148089, que se presentan en este

documento como SEQ ID NOs: 219-229, respectivamente.

En realizaciones de ejemplo, los peptidos, peptidos de glucagon, o analogos de glucagon de la presente descripcion

no son (es decir, excluyen) uno cualquiera o todos los peptidos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7 , 8, 9, 10, 11, 12,

75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103,

104, 105, 106 , 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,

196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206,207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256,257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306 , 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 , 332, 333,

334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 ,

357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402,

472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481 , 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506 , 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 , 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540,

564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581 , 582, 583; 584, 585, 586,

587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609,

610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683,684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701,

702, 703, 704, 705, 706, 707, 708,709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724,

725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733,734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747,

748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758,759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783,784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808 , 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833 , 834, 835, 836, 837, 838, 839,

840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858 , 859, 860, 861, 862,

863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883 , 884, 885,

886, 887, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908 ,

909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931,

932, 933 , 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954,

955, 956, 957, 958 , 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977,

978, 979, 980, 981, 982, 983 , 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 1000,

1001, 1002, 1003, 1004, 1005, 1006, 1007, 1008 , 1009, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018,

1019, 1020, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1026, 1027, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033 , 1034, 1035, 1036,

1037, 1038, 1039, 1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045, 1046, 1047, 1048, 1049, 1050, 1051, 1052, 1053, 1054,

1055, 1056, 1057, 1058 , 1059, 1060, 1061, 1062, 1063, 1064, 1065, 1066, 1067, 1068, 1069, 1070, 1071, 1072, 1073 , 1074 , 1075 , 1076 , 1077 , 1078 , 1079 , 1080 , 1081 , 1082 , 1083 , 1084 , 1085 , 1086 , 1087 , 1088 , 1089 , 1090 , 1091 , 1092 , 1093 , 1094 , 1095 , 1096 , 1097 , 1098 , 1099 , 1100 , 1101 , 1102 , 1103 , 1104 , 1105 , 1106 , 1107 , 1108 , 1109 , 1110 , 1111 , 1112 , 1113 , 1114 , 1115 , 1116 , 1117 , 1118 , 1119 , 1120 , 1121 , 1122 , 1123 , 1124 , 1125 , 1126 , 1127 , 1128 , 1129 , 1130 , 1131 , 1132 , 1133 , 1134 , 1135 , 1136 , 1137 , 1138 , 1139 , 1140 , 1141 , 1142 , 1143 , 1144 , 1145 , 1146 , 1147 , 1148 , 1149 , 1150 , 1151 , 1152 , 1153 , 1154 , 1155 , 1156 , 1157 , 1158 , 1159 , 1160 , 1161 , 1162 , 1163 , 1164 , 1165 , 1166 , 1167 , 1168 , 1169 , 1170 , 1171 , 1172 , 1173 , 1174 , 1175 , 1176 , 1177 , 1178 , 1179 , 1180 , 1181 , 1182 , 1183 , 1184 , 1185 , 1186 , 1187 , 1188 , 1189 , 1190 , 1191 , 1192 , 1193 , 1194 , 1195 , 1196 , 1197 , 1198 , 1199 , 1200 , 1201 , 1202 , 1203 , 1204 , 1205 , 1206 , 1207 , 1208 , 1209 , 1210 , 1211 , 1212 , 1213 , 1214 , 1215 , 1216 , 1217 , 1218 , 1219 , 1220 , 1221 , 1222 , 1223 , 1224 , 1225 , 1226 , 1227 , 1228 , 1229 , 1230 , 1231 , 1232 , 1233 , 1234 , 1235 , 1236 , 1237 , 1238 , 1239 , 1240 , 1241 , 1242 , 1243 , 1244 , 1245 , 1246 , 1247 , 1248 , 1249 , 1250 , 1251 , 1252 , 1253 , 1254 , 1255 , 1256 , 1257 , 1258 , 1259 , 1260 , 1261 , 1262 , 1263 , 1264 , 1265 , 1266 , 1267 , 1268 , 1269 , 1270 , 1271 , 1272 , 1273 , 1274 , 1275 , 1276 , 1277 , 1278 , 1279 , 1280 , 1281 , 1282 , 1283 , 1284 , 1285 , 1286 , 1287 , 1288 , 1289 , 1290 , 1291 , 1292 , 1293 , 1294 , 1295 , 1296 , 1297 , 1298 , 1299 , 1300 , 1301 , 1302 , 1303 , 1304 , 1305 , 1306 , 1307 , 1308 , 1309 , 1310 , 1311 , 1312 , 1313 , 1314 , 1315 , 1316 , 1317 , y /o 1318 d e la p u b lic a c io n d e la s o lic itu d in te rn a c io n a l N o . W O /2011 /094337.

REALIZACIONES DE EJEMPLO

E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , e l p e p tid o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n e s un a n a lo g o d e g lu c a g o n (S E Q ID N O : 1) que c o m p re n d e (i) un a m in o a c id o que c o m p re n d e u n a c a d e n a la te ra l d e im id a z o l e n la posición 1, ( ii) un in h ib id o r p ro te c to r d e D P P -IV e n la posición 2 , ( iii) un a m in o a c id o a c ila d o o un a m in o a c id o a lq u ila d o , o p c io n a lm e n te en cualquiera de las posición e s 9, 10, 12, 16, 20 , o 37 -43 , e n e l que o p c io n a lm e n te el g ru p o a c ilo o a lq u ilo e s ta u n id o al a m in o a c id o a t ra v e s d e un e s p a c ia d o r ; i lv ) un a m in o a c id o e s ta b i l iz a d o r d e la h e lic e a lfa e n u n a o m a s de las posición e s 16 -21 , y (v ) h a s ta d ie z m o d if ic a c io n e s de aminoácidos a d ic io n a le s en re la c io n a la S E Q ID N O : 1, en el que c u a n d o el a n a lo g o d e g lu c a g o n n o e s ta c o n ju g a d o c o n u n re s to h e te ro lo g o , p o r e je m p lo , un re s to h id ro f ilo (p o r e je m p lo , P E G ), e l a n a lo g o d e g lu c a g o n m u e s tra a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 % (p o r e je m p lo , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 1% , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 10 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te e l 50 % , a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te 80 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 100 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te e l 500 % ) la a c t iv id a d de G IP n a tu ra l e n e l re c e p to r d e G IP .

L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to p u e d e n c o m p re n d e r c u a lq u ie r p e rfil d e a c t iv id a d d e s c r ito en ^{e l p re s e n te d o c u m e n to . V e a s e , p o r e je m p lo , la s e c c io n t i tu la d a} "ACTIVIDAD DE LOS PEPTIDOS DESCRITOS EN ESTE DOCUMENTO." ^{E n a s p e c to s d e e je m p lo , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n m u e s tra un p o rc e n ta je d e p o te n c ia d e G IP}d e a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 1% , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 10 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 50 % , al m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 90 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 100 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 300 % , o al m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 500 % . E n a lg u n o s a s p e c to s , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n ta m b ie n m u e s tra un p o rc e n ta je d e p o te n c ia d e G L P -1 d e al m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 1% , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 10% , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 50 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 90 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te e l 100 % , o a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te 300 % , o a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 500 % . E n a s p e c to s a lte rn a t iv o s o a d ic io n a le s , el a n a lo g o d e g lu c a g o n m u e s tra un p o rc e n ta je d e p o te n c ia d e g lu c a g o n d e a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 1% , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 10 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 50 % , a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 90 % , o a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te e l 100 % . P o r c o n s ig u ie n te , m ie n tra s que lo s a n a lo g o s d e g lu c a g o n p u e d e n s e r c o n s id e ra d o s c o m o p e p tid o s a g o n is ta s d e G IP , e n a lg u n o s a s p e c to s , lo s a n a lo g o s de glucagón a d e m a s , p u e d e n s e r c o n s id e ra d o s c o m o un c o a g o n is ta d e G IP -G L P -1 , un c o a g o n is ta d e G IP -g lu c a g o n , o un t r ia g o n is ta d e G IP -G L P -1 -g lu c a g o n . P o r e je m p lo , el p e p tid o p u e d e m o s tra r u n a a c t iv id a d a g o n is ta en c a d a u n o d e l re c e p to r d e G IP h u m a n o , e l re c e p to r d e G L P -1 y o p c io n a lm e n te e l re c e p to r d e g lu c a g o n h u m a n o , en e l que e l p e p tid o m u e s tra u n a E C 50 e n e l re c e p to r d e G IP que e s ta d e n tro d e 100 v e c e s (p o r e je m p lo , 50 v e c e s , 40 v e c e s , 30 v e c e s , 20 v e c e s , 15 v e c e s , 10 v e c e s , o m e n o s ) s u E C 50 en e l re c e p to r d e G L P -1 y, o p c io n a lm e n te , e s ta d e n tro d e 100 v e c e s (p o r e je m p lo , 50 v e c e s , 40 v e c e s , 30 v e c e s , 20 v e c e s , 15 v e c e s , 10 v e c e s , o m e n o s ) s u E C 50 e n e l re c e p to r d e g lu c a g o n .

E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , e l a n a lo g o d e g lu c a g o n c o m p re n d e un a m in o a c id o que c o m p re n d e u n a c a d e n a la te ra l d e im id a z o l e n la posición 1. E n a s p e c to s d e e je m p lo , el a m in o a c id o e n la posición 1 c o m p re n d e u n a e s tru c tu ra d e F o rm u la A

en la que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-6) alquilo, O alquilo (C1-6), alquilo (C1-6)-OH, F, y (C1-C6) alquilo, de los que al menos un H esta sustituido por F.

En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 1 es el residuo natural de glucagon (SEQ ID NO: 1) L-histidina (His) o es un derivado de His (derivado de His), por ejemplo, un derivado de His en el que se modifican los atomos alfa. Tal como se utiliza en este documento, el termino "derivado de His" se refiere a un grupo qulmico que comprende un imidazol, por ejemplo, que comprende una estructura de Formula A, o un imidazol sustituido, unido a al menos un atomo de carbono. En realizaciones de ejemplo, el derivado de His comprende una estructura similar a la estructura de la histidina, excepto que la alfa amina, el carbono alfa, o alfa carboxilato se sustituyen por otro grupo qulmico. En realizaciones de ejemplo, el derivado de His es una histidina alfa sustituida de la que el atomo de hidrogeno unido al carbono alfa esta sustituido por otro grupo qulmico, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, hidroxilo, metoxi, etoxi, y similares. El derivado de His en algunos aspectos es D-histidina, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetil-histidina, homo-histidina, N-metil histidina, alfa-metil histidina, acido imidazol acetico, o acido alfa, alfa-dimetil imidazolacetico (DMIA).

En algunos aspectos, el aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2 es uno de D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina, o acido alfa, aminoisobutlrico (AIB). En algunos aspectos, el aminoacido protector de DPP-IV es D-Ser, o una sustitucion conservativa de aminoacido del mismo, o un aminoacido alfa, alfa disustituido. En algunos aspectos, el aminoacido alfa, alfa disustituido comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos forman un anillo. En algunos aspectos, el aminoacido alfa, alfa disustituido es AIB. En aspectos de ejemplo, cuando el aminoacido protector de DPP-IV es D-Ser, el peptido agonista de GIP no esta conjugado a un grupo heterologo, por ejemplo, un grupo hidrofilo (por ejemplo, PEG). En otros aspectos de la presente descripcion, aminoacido protector de DPP-IV no es D-serina.

En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en cualquiera de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, o 21. En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en uno, dos, tres, cuatro, cinco, o la totalidad de las posiciones 16, 17, 18, 19, 20, o 21. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en las posiciones 16, 17, 20, y 21. En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en las posiciones 16 y 20. En aspectos alternativos o adicionales, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en las posiciones 17 y 21.

En algunos aspectos, cuando el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido alfa, alfa disustituido. En aspectos de ejemplo, el aminoacido a,a-disustituido comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos, forman un anillo. En algunas realizaciones, el aminoacido a,a-disustituido es 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACPC). En algunos aspectos, el a, a-disustituido en la posicion 20 es AIB. Opcionalmente, en algunas realizaciones, cuando el aminoacido en la posicion 20 es un el aminoacido a,a-disustituido, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido estabilizador de la helice alfa distinto de AIB. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido cargado, por ejemplo, un aminoacido con carga positiva, un aminoacido con carga negativa. En algunos aspectos, cuando el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido alfa, alfa-disustituido, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido con carga positiva de formula IV, por ejemplo, Lys, o es un aminoacido con carga negativa, por ejemplo, Glu. En algunos aspectos, cuando el aminoacido en la posicion 20 es un aminoacido alfa, alfa disustituido, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido de carga neutra, por ejemplo, Ser, Ala, Gly.

En consecuencia, en realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon comprende (i) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1, (ii) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2, opcionalmente, acido aminoisobutlrico, (iii) un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural, opcionalmente en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 37-43, opcionalmente en el que el grupo acilo o alquilo no natural esta unido a dicho aminoacido a traves de un espaciador; (iv) un aminoacido alfa, alfa disustituido en la posicion 20, y (v) hasta diez (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) modificaciones de aminoacidos adicionales en relacion con SEQ ID NO: 1.

En realizaciones de ejemplo, cuando el analogo de glucagon comprende un aminoacido alfa, alfa disustituido en la posicion 20, y cuando el analogo de glucagon carece de un resto hidrofilo, el analogo de glucagon muestra un porcentaje de potencia de GIP de al menos 0,1% (por ejemplo, al menos 1%, al menos 10%, al menos 20%). En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon tiene menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, a menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces o menos de o aproximadamente 5 veces) la selectividad por el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP. En aspectos de ejemplo, el peptido tiene una EC50 en el receptor de GIP que es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces mayor, menor o sobre 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, o menos de o aproximadamente 5 veces) diferente que su EC50 en el receptor de GLP-1, que, opcionalmente, es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces , a menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos que o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente 5 veces), diferente de su EC50 en el receptor de glucagon.

En realizaciones de ejemplo, cuando el analogo de glucagon comprende un aminoacido alfa, alfa disustituido en la posicion 20, el aminoacido a, a-disustituido comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos, forman un anillo. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido a, a-disustituido en la posicion 20 es AIB. Tambien, en realizaciones de ejemplo, cuando el analogo de glucagon comprende un aminoacido alfa, alfa disustituido en la posicion 20, el aminoacido en la posicion 16 es aminoacido estabilizador de la helice alfa distinto de AIB. En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido cargado, opcionalmente, un aminoacido con carga nativa (por ejemplo, Glu o Asp) o un aminoacido con carga positiva (por ejemplo, Lys u Orn).

En realizaciones alternativas, el analogo de glucagon no comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, y una o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, o 21 es un aminoacido estabilizador de la helice alfa. En algunos aspectos, el aminoacido estabilizador de la helice alfa se encuentra en la posicion 16. En algunas realizaciones, aminoacido estabilizador de la helice alfa es un aminoacido con carga negativa (por ejemplo, Glu), un aminoacido con carga positiva, (por ejemplo, que comprende una estructura de la Formula IV (por ejemplo, Lys)), o un aminoacido alfa, alfa disustituido. En algunos aspectos, el aminoacido a,a-disustituido comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos, forman un anillo. En aspectos especlficos, el aminoacido a, a-disustituido en la posicion 16 es AIB.

En realizaciones adicionales, cuando el analogo de glucagon no comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, y cuando una o mas de las posiciones 16, 17, 18, 19, o 21 es un aminoacido estabilizador de la helice alfa, el analogo de glucagon comprende (i) una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29 del analogo de peptido o (ii) el aminoacido acilado o aminoacido alquilado se encuentra en la posicion 10, 12, o 16. En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29 del analogo de peptido, y opcionalmente el aminoacido en la posicion 29 es Gly. La extension de 1 a 21 aminoacidos en algunos aspectos es cualquiera de las descritas en el presente documento; vease, por ejemplo, la seccion titulada "Ex te n sio n e s C -term inales" En algunos aspectos, la extension comprende una secuencia de aminoacidos que forma una estructura de jaula de Trp, por ejemplo, la extension comprende la secuencia de aminoacidos de GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5), o una secuencia sustituida de forma conservativa de la misma. En aspectos alternativos, la extension de 1 a 21 aminoacidos comprende al menos un aminoacido cargado. En aspectos de ejemplo, la extension comprende una secuencia de aminoacidos de: X1-X2, en la que X1 es un aminoacido cargado y X2 es un aminoacido alifatico pequeno. En algunos aspectos, X1 es un aminoacido con carga positiva, por ejemplo, Arg. En algunos aspectos, la extension comprende Arg-Gly.

Por consiguiente, en realizaciones de ejemplo alternativas, el analogo de glucagon comprende (i) un aminoacido que comprende una cadena lateral de imidazol en la posicion 1, (ii) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2, opcionalmente, acido aminoisobutlrico, (iii) un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural, opcionalmente en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20, o 37-43, opcionalmente en el que el grupo acilo o alquilo no natural esta unido a dicho aminoacido mediante un espaciador; (iv) un aminoacido estabilizador de la helice alfa en una o mas de las posiciones 16-21, opcionalmente, la posicion 16, donde el analogo no comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, y (v) hasta diez (por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) modificaciones de aminoacidos adicionales en relacion a la SEQ ID No: 1. En aspectos de ejemplo, el analogo no comprende en la posicion 20 un aminoacido alfa, alfa disustituido, opcionalmente, AIB, o un aminoacido estabilizador de la helice alfa seleccionado del grupo que consiste en: Leu, Phe, Ala, Met, Gly, Ile, Ser, Asn, Glu, Asp, Lys y Arg. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon no esta modificado en la posicion 20 en comparacion con la SEQ ID NO: 1, y, por lo tanto tiene un residuo de Gln que es el aminoacido natural de glucagon en esta posicion.

En realizaciones de ejemplo, cuando el analogo de glucagon comprende una aminoacido estabilizador de la helice alfa en una o mas de las posiciones 16-21, opcionalmente, la posicion 16, y el analogo no comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, y cuando el glucagon analogo carece de un resto hidrofilo, el analogo de glucagon muestra un porcentaje de potencia de GIP de al menos 0,1% (por ejemplo, al menos 1%, al menos 10%, al menos 20%). En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon tiene menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, a menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente 5 veces) la selectividad por el receptor de GLP-1 humano frente al receptor de GIP. En aspectos de ejemplo, el peptido tiene una EC50 en el receptor de GIP que es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces mayor, menor o sobre 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 -fold, menos de o aproximadamente de 5 veces) diferente de su EC50 en el receptor de GLP-1, que, opcionalmente, es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces , a menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos que o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente de 5 veces), diferente de su EC50 en el receptor de glucagon.

En aspectos de ejemplo, cuando el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en una o mas de las posiciones 16-21 y el analogo no comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 20, el analogo de glucagon comprende un aminoacido estabilizador de la helice alfa en la posicion 16, opcionalmente, en el que aminoacido estabilizador de la helice alfa es un aminoacido con carga negativa (por ejemplo, Glu o Asp) o un aminoacido alfa, alfa disustituido. El aminoacido a, a-disustituido en la posicion 16 puede comprender R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos, forman un anillo. En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 16 es AIB. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende en la posicion 18 un aminoacido alifatico pequeno, opcionalmente, Ala, y una Arg en la posicion 17. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende la secuencia de ERAAQ (SEQ ID NO: 200) como posiciones 16 a 20 o ERAAQD (SEQ ID NO: 201) como posiciones 16 a 21.

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural en cualquiera de las posiciones 9, 10, 12, 16, 20. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o un grupo alquilo C12 a C18 en una cualquiera o mas de las posiciones 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, y 20. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o un grupo alquilo C12 a C18 en una cualquiera o mas de las posiciones 10, 14. En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende un aminoacido acilado o aminoacido alquilado en la posicion 10, 12, o 16. En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado o aminoacido alquilado esta en la posicion 14. En algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29 y comprende un aminoacido que comprende un grupo acilo o alquilo no natural en cualquiera de las posiciones 37-43 (por ejemplo, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43). En algunos aspectos, el aminoacido que comprende un grupo acilo o un grupo alquilo no natural esta en la posicion 40.

En realizaciones de ejemplo, el acilo

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29 y, en algunos aspectos, la extension forma una estructura conocida en la tecnica como una jaula de Trp. En algunos aspectos, la extension comprende la secuencia de aminoacidos GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) o GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 6) o GPSSGRPPPS (SEQ ID NO: 183) o una secuencia de uno de los anteriores con 1, 2, o 3 sustituciones conservativas de aminoacidos. En aspectos alternativos, la extension comprende al menos un aminoacido cargado, por ejemplo, la extension comprende una secuencia de aminoacidos de: X1-X2, en la que X1 es un aminoacido cargado (por ejemplo, un aminoacido cargado positivamente (por ejemplo, Arg)) y X2 es un aminoacido alifatico pequeno. En algunos aspectos, la extension comprende Arg-Gly.

En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado o aminoacido alquilado comprende una estructura de Formula I (opcionalmente, Lys), formula II, (opcionalmente, Cys) o Formula III, (opcionalmente, Ser). Opcionalmente, en algunos aspectos, el aminoacido acilado o aminoacido alquilado comprende una estructura de Formula I, por ejemplo, Lys.

En algunas realizaciones, el aminoacido acilado o alquilado es un aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-fenilalanina (4-aminoPhe), p-amino fenilglicina, p-amino homofenilalanina o 3-amino tirosina. En aspectos de ejemplo, el aminoacido aromatico que comprende una amina en la cadena lateral es 4-amino-Phe. En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado o alquilado es un aminoacido de formula II, n es 2 (homoserina). En aspectos de ejemplo, el aminoacido acilado o alquilado es Thr o homotreonina. En realizaciones de ejemplo, el aminoacido acilado o alquilado es un aminoacido aromatico que comprende un grupo hidroxilo en la cadena lateral, incluyendo tirosina, homotirosina, metil-tirosina o 3-amino tirosina.

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende un aminoacido unido covalentemente a un Cxsuccinoilo, en el que x es un numero entero entre 10 y 26, opcionalmente, entre 12 y 18. En aspectos de ejemplo, el Cx-succinoilo esta unido al peptido o analogo de glucagon a traves de un espaciador. El espaciador puede ser uno cualquiera de los descritos en este documento.

En algunos aspectos, el aminoacido acilado o aminoacido alquilado esta unido al grupo acilo o grupo alquilo a traves de un espaciador. En algunos aspectos, el espaciador es de 3 a 10 atomos de longitud. En algunos aspectos, el espaciador es un aminoacido o dipeptido, y, en algunos aspectos, el espaciador comprende uno o dos residuos de aminoacidos acidos, por ejemplo, Glu. En algunos aspectos, el grupo acilo o alquilo esta unido al aminoacido a traves de la longitud total del espaciador y el grupo acilo tien aproximadamente 14 a aproximadamente 28 atomos de longitud. En algunos aspectos, el espaciador comprende una Cys. En algunos aspectos, el espaciador comprende uno o dos gamma-Glu. En algunos aspectos, el espaciador comprende una Lys. En algunos aspectos, el espaciador comprende una combinacion de dos de Cys, gamma-Glu, y Lys, o dos residuos de gamma-Glu.

En aspectos particulares, el espaciador es un residuo de Cys, que esta unido covalentemente a un grupo alquilo, por ejemplo, una cadena de carbono funcionalizada o no funcionalizada. En aspectos de ejemplo, el residuo de Cys se alquila con S-palmitilo (es decir, esta S-palmitato alquilada), opcionalmente, en el que el residuo de Cys se une a un residuo de Lys que es parte de la cadena principal del peptido. En realizaciones alternativas, el espaciador es un dipeptido que comprende un residuo Cys, que esta unido covalentemente a un grupo alquilo. En aspectos de ejemplo, la Cys se alquila a S-palmitilo, y la Cys esta unida a otro aminoacido del espaciador, que, a su vez, esta unido a, por ejemplo, un residuo de Lys que es parte de la cadena principal del peptido.

En aspectos de ejemplo, el espaciador comprende un resto de polietilenglicol (PEG) pequeno que comprende una estructura [-O-CH2-CH2-]n , en donde n es un numero entero entre 2 y 16, (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16).

Con respecto al aminoacido acilado, el grupo acilo en algunos aspectos es un grupo acilo graso C12 a C18 (por ejemplo, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18). En algunos aspectos, el grupo acilo es un grupo acilo graso C14 o C16. En aspectos alternativos, el grupo acilo es un acido succlnico o un derivado del acido succlnico (por ejemplo, un derivado del acido succlnico de la formula V, VI, o VII). En aspectos alternativos, el grupo acilo es un acido maleico o un derivado de acido maleico (por ejemplo, un derivado de acido maleico de formula VlII, IX, o X).

Con respecto al aminoacido alquilado, el grupo alquilo no natural en algunos aspectos es una cadena de carbonos con funcionalidad carboxi de estructura -Cx-COOH, en la que x es un numero entero, opcionalmente un numero entero entre 4 - 30 (por ejemplo, 4, 5 ,6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30).

En un aspecto de ejemplo, el peptido o analogo de glucagon comprende dos o mas grupos acilo o alquilo. En este sentido, el peptido o analogo de glucagon puede ser un peptido acilado dual o diacilado. Los dos o mas grupos acilo o alquilo pueden estar dispuestos en una formacion lineal, opcionalmente con espaciadores intermedios. Los dos o mas grupos acilo o alquilo pueden estar dispuestos en una formacion ramificada, tal como se describe en el presente documento. En aspectos de ejemplo, los dos grupos acilo o alquilo estan unidos a un residuo espaciador de Lys. En algunos aspectos de la presente descripcion, el analogo de glucagon comprende al menos un aminoacido cargado C-terminal al aminoacido en la posicion 27. Por ejemplo, en algunos aspectos, el analogo de glucagon comprende un aminoacido cargado (por ejemplo, un aminoacido con carga negativa) en la posicion 28. El aminoacido con carga negativa, en algunos aspectos, es Asp. En aspectos alternativos, el aminoacido en la posicion 28 es un aminoacido cargado positivamente, por ejemplo, un aminoacido cargado positivamente es un aminoacido de Formula I, por ejemplo, Lys.

En aspectos alternativos o adicionales, el analogo de glucagon comprende una modificacion de aminoacidos en la posicion 27, en la posicion 29, o en ambas posiciones 27 y 29. Por ejemplo, el aminoacido en la posicion 27 es, en algunos aspectos, Leu, Nle, Val, o Lys y/o el aminoacido en la posicion 29 es, en algunos aspectos, Gly o Thr.

Los analogos de glucagon descritos en el presente documento pueden comprender modificaciones de aminoacidos adicionales, por ejemplo, de hasta diez (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) modificaciones de aminoacidos adicionales, con respecto a la SEQ ID NO: 1, tal como se discute adicionalmente en este documento. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende uno o mas de:

a) un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 1 del analogo de peptido;

b) un aminoacido acido, opcionalmente, Glu, en la posicion 3;

c) una Ile en la posicion 7;

d) una Ile o Arg en la posicion 12;

e) un aminoacido acido, opcionalmente, Glu, en la posicion 15;

f) un aminoacido alifatico, opcionalmente, Ala, en la posicion 18;

g) un aminoacido acido, opcionalmente, Glu, en la posicion 21;

h) un Asn, Ala, o Aib en la posicion 24;

i) un aminoacido alifatico, opcionalmente, Ala, o Leu, o Nle, en la posicion 27;

j) un aminoacido acido, opcionalmente, Glu, o un aminoacido alifatico, opcionalmente, Ala, en la posicion 28; k) un aminoacido alifatico, opcionalmente, Ala, en la posicion 29;

l) amidacion en el extremo C-terminal.

De acuerdo con lo anterior, el analogo de glucagon, en aspectos de ejemplo, comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90 o cualquiera de SEQ ID NOs: 94-100, 102-112, 120-124, 127-131. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs: 94-100, 102-112, 120-124, 127-131. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90. En aspectos de ejemplo, el glucagon analogo comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37 41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203 -207, 212, y 230. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 27. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 30. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 32. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 33. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 35. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 36. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 28. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 37. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 89. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 31. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende o consiste en la SEQ ID NO: 180.

La presente invencion proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 28.

Tambien se proporciona en la descripcion un peptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 31. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 31.

La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 37.

La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 89. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 89.

La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 95. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 95.

La descripcion proporciona ademas un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 130. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 130.

Ademas, en el presente documento se proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 31. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 171.

Tambien se proporciona en el presente documento un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 180. En aspectos de ejemplo, el peptido consiste en la SEQ ID NO: 180.

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo Gln;

X18 es Arg o Ala;

X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala o Gly;

X35 es Ala o un aminoacido basico (opcionalmente, Arg o Lys);

en la que, cuando X28 es un aminoacido acido, X35 es un aminoacido basico;

En aspectos de ejemplo, X10 de la SEQ ID NO: 184 es Tyr, el peptido comprende en la posicion 40 un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o un grupo alquilo de C12 a C18, y el peptido comprende opcionalmente Gly en la posicion 41. En aspectos de ejemplo, X10 de SEQ ID NO: 184 es un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o un grupo alquilo C12-C18.

En aspectos de ejemplo, X20 de la SEQ ID NO: 184 es Gln, y opcionalmente, el aminoacido en la posicion 16 es un aminoacido con carga negativa (por ejemplo, Glu). En aspectos de ejemplo, X18 de la SEQ ID NO: 184 es Ala y el peptido comprende E16, R17, A18, A19, y Q20.

En aspectos de ejemplo alternativos, X20 de la SEQ ID NO: 184 es AIB. Opcionalmente, X16 de la SEQ ID NO: 184 es cualquier aminoacido distinto de AIB.

Ademas, en aspectos a modo de ejemplo, (i) X28 de la SEQ ID NO: 184 es un aminoacido acido, opcionalmente Asp o Glu, y X35 de la SEQ ID NO: 184 es un aminoacido basico, opcionalmente Arg o Lys, (ii) solo uno de X27, X28 y X29 de la SEQ ID NO: 184 es una Ala, (iii) el peptido amidado comprende una Gly en el extremo C-terminal.

La description tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 184 con hasta 3 modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) con relation a la SEQ ID NO: 184, en el que el analogo muestra actividad agonista en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano. En realizaciones de ejemplo, la actividad (por ejemplo, la EC50) en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano del analogo de glucagon esta dentro de 100 veces (por ejemplo, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 10 veces) de uno al otro.

X2 es AIB;

X16 es Glu, un aminoacido alfa, alfa disustituido, Lys o

X18 es Arg o Ala;

X20 es AIB o Gln;

X21 es Asp o Glu;

X27 es Leu, Nle, o Met;

X28 es Ala, Asp o Glu;

X29 es Gly o Thr;

y

en en la que, cuando X10 es Tyr, el peptido comprende en la posicion 40 un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C12 a C18 y, en la que, opcionalmente, el peptido comprende Gly en la posicion 41, y en la que el aminoacido C-terminal del peptido esta amidado.

La descripcion tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185 con hasta 3 modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) con relacion a la SEQ ID NO: 185, en el que el analogo muestra actividad agonista en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano. En realizaciones de ejemplo, la actividad (por ejemplo, la EC50) en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano del analogo de glucagon esta dentro de 100 veces (por ejemplo, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 10 veces) de uno al otro.

La descripcion tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 196.

HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29GPSSGX35PPPS (SEQ ID NO: 196) en la que:

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo de Gln o un aminoacido que reduce la actividad de glucagon (opcionalmente Glu);

X18 es Arg o Ala;

X20 es aminoacido cargado negativamente o un aminoacido de carga neutra, opcionalmente,

AIB o Gln;

X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala o Gly;

X35 es Ala o un aminoacido basico (opcionalmente, Arg o Lys);

en la que, cuando X28 es un aminoacido acido, X35 es un aminoacido basico;

En este documento se describen aminoacidos adicionales que reducen la actividad de glucagon. Vease la seccion titulada "Posicion 3." En aspectos de ejemplo, X3 es un aminoacido acido, basico, o hidrofobo (por ejemplo, acido glutamico, ornitina, norleucina). En aspectos de ejemplo, X3 es Glu.

Ademas, se proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 186:

HX2X3GTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQWLX27X28X29 (SEQ ID NO: 186)

en la que:

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo Gln;

X18 es Arg o Ala;

X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala, Gly o Thr; y

En aspectos de ejemplo, X20 de la SEQ ID NO: 186 es AIB. En aspectos de ejemplo, X29 es Thr y el peptido no comprende GPSSGApPPS (SEQ ID NO: 5). En algunos aspectos, X20 de la SEQ ID NO: 186 es A iB y X16 es un aminoacido distinto de AIB.

En aspectos de ejemplo, X20 es Gln. En algunos aspectos, X16 es un aminoacido cargado negativamente, opcionalmente, Glu. En aspectos de ejemplo, X18 es Ala, y opcionalmente, el peptido comprende E16, R17, A18, A19, y Q20.

En algunos aspectos, el peptido de la SEQ ID NO: 186 comprende una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29, y opcionalmente el aminoacido en la posicion 29 es Gly. En aspectos de ejemplo, la extension comprende la secuencia de aminoacidos GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5), o una secuencia sustituida de forma conservativa de la misma, o en la que la extension comprende la secuencia X1-X2, en la que X1 es un aminoacido cargado y X2 es un aminoacido alifatico pequeno, opcionalmente, en el que X1 es un aminoacido cargado positivamente. En algunos aspectos, el aminoacido cargado positivamente es Arg y, opcionalmente, el peptido comprende o consiste en Arg-Gly. En ciertos aspectos, la extension comprende la secuencia de aminoacidos GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 5) seguido de Lys o Lys-Gly, en el que la Lys esta unida covalentemente a un grupo acilo de C10 a C26.

En aspectos de ejemplo, el peptido comprende la SEQ ID NO: 186, en la que X2 es AIB, X3 es Gln, X10 es un aminoacido unido covalentemente a un grupo acilo o alquilo C10 a C26, X18 es Arg o Ala, X20 es AIB o Gln, X21 es Asp o Glu, X29 es Gly, y el aminoacido C-terminal esta amidado, en la que Gly en la posicion 29 esta fusionada a GPSSGAPPPS, seguido de Lys o Lys-Gly, en el que la Lys esta unida covalentemente a un grupo acilo C10-C26.

La description tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 186 con hasta 3 modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) con relation a la SEQ ID NO: 186, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano. En realizaciones de ejemplo, la actividad (por ejemplo, la EC50) en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano del analogo de glucagon esta dentro de 100 veces (por ejemplo, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 10 veces) de uno al otro.

HX2QGTFTSDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQW LX27X28X29 (SEQ ID NO: 187)

en la que:

X2 es AIB;

Xi6 es Glu, aminoacido alfa, alfa-disustituido, o Lys;

X18 es Arg o Ala;

X21 es Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala, Asp o Glu;

X29 es Gly o Thr; y

La description tambien proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 187 con hasta 3 modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) con relation a la SEQ ID NO: 187, en la que el analogo muestra actividad agonista en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano. En realizaciones de ejemplo, la actividad (por ejemplo, la EC50) en cada uno de los receptores de GIP humano, GLP-1 humano y glucagon humano del analogo de glucagon esta dentro de 100 veces (por ejemplo, dentro de 50 veces, dentro de 25 veces, dentro de 10 veces) de uno al otro.

La descripcion proporciona un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 198:

HX2X3GTFT SDX10SKYLDX16RX18AX20X21FVQW LX27X28X 29 (SEQ ID NO: 198)

en la que:

X2 es AIB;

X3 es Gln o analogo de Gln o un aminoacido que reduce la actividad de glucagon (por ejemplo, Glu);

X18 es Arg o Ala;

X21 es X21 es un aminoacido acido, opcionalmente, Asp o Glu;

X27 es Leu, Ala, Nle, o Met;

X28 es Ala o un aminoacido acido (opcionalmente, Asp o Glu);

X29 es Ala, Gly o Thr; y

Los aminoacidos adicionales que reducen la actividad de glucagon se describen en este documento. Vease la section titulada "Posicion 3." En aspectos de ejemplo, X3 es un aminoacido acido, basico, o hidrofobo (por ejemplo, acido glutamico, ornitina, norleucina). En aspectos de ejemplo, X3 es Glu.

La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 184. La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 185. La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 196. La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 186. La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 187. La descripcion proporciona un peptido que comprende la SEQ ID NO: 198.

Ademas se proporciona en este documento un analogo de glucagon (SEQ ID NO: 1) que tiene actividad agonista de GIP, que comprende:

(b) en la posicion 16, un aminoacido de formula IV:

en la que n es de 1 a 7, en la que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, (alquil C1-C18)OH, (C1-C18(alquil C1-C18)SH, (alquil C0-C4)cicloalquilo (C3-C6), (alquilo C0-C4)(heterociclo C2-C5), (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7, y (alquilo C1-C4)(heteroarilo C3-C9), en el que R7 es H o OH, en la que opcionalmente la cadena lateral del aminoacido de Formula IV comprende un grupo amino libre, (c) un aminoacido a, a-disustituido en la posicion 20,

En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon (SEQ ID NO: 1) que tiene actividad agonista de GIP, comprende uno o mas de:

(b) en la posicion 16, un aminoacido de formula IV:

(c) un aminoacido a, a-disustituido en la posicion 20,

(d) hasta diez modificaciones de aminoacido adicionales en relacion a la SEQ ID NO: 1,en la que, cuando el analogo carece de un resto heterologo, por ejemplo, un resto hidrofilo (por ejemplo, PEG), el analogo de glucagon muestra al menos o aproximadamente 0,1% (por ejemplo, al menos o aproximadamente 1%, al menos o aproximadamente 10%, al menos o aproximadamente 50%, al menos o aproximadamente 80%, al menos o aproximadamente 100%, al menos o aproximadamente el 500%) la actividad de GIP natural en el receptor de GIP. En aspectos de ejemplo, el peptido tiene una EC50 en el receptor de GIP que es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces mayor, menor o sobre 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente de 5 veces), diferente de su EC50 en el receptor de GLP-1, que, opcionalmente, es menos de 100 veces (por ejemplo, menos de o aproximadamente 90 veces, menos de o aproximadamente 80 veces, menos de o aproximadamente 70 veces, menos de o aproximadamente 60 veces, menos de o aproximadamente 50 veces, menos de o aproximadamente 40 veces, menos de o aproximadamente 30 veces, menos de o aproximadamente 20 veces, menos de o aproximadamente 15 veces, menos de o aproximadamente 10 veces, menos de o aproximadamente de 5 veces), diferente de su EC50 en el receptor de glucagon.

En realizaciones de ejemplo, el analogo de glucagon comprende en la posicion 1 un aminoacido que comprende una estructura de Formula A

En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 1 es el residuo natural de glucagon (SEQ ID NO: 1) L-histidina (His), o es un derivado de His (derivado de His), por ejemplo, D-histidina, desaminohistidina, hidroxil-histidina, acetilhistidina, homo-histidina, N-metil histidina, alfa-metil histidina, acido imidazol acetico, o acido alfa, alfa-dimetil imidazol acetico (DMIA).

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende el aminoacido de la Formula IV en la posicion 16 en (b) es homoLys, Lys, Orn, o acido 2,4-diaminobutlrico (Dab).

En aspectos de ejemplo, el aminoacido en la posicion 20, por ejemplo, el aminoacido a,a-disustituido, comprende R1 y R2, cada uno de los cuales esta unido al carbono alfa, en el que cada uno de R1 y R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, opcionalmente sustituido con un hidroxilo, amida, tiol, halo, o R1 y R2 junto con el carbono alfa al que estan unidos, forman un anillo. En aspectos de ejemplo, el a,adisustituido en la posicion 20 es AIB. En otros aspectos de ejemplo, el a,a-disustituido en la posicion 20 es ACPC. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende hasta diez modificaciones adicionales, con respecto a SEQ ID NO: 1. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende una sustitucion de aminoacidos, con respecto a SEQ ID NO: 1, en una o mas de las posiciones 2, 12, 17, 18, 21, 24, 27, 28 y 29. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende uno o mas de:

. un aminoacido protector de DPP-IV en la posicion 2; opcionalmente AIB o D-Ser;

i. un aminoacido grande, alifatico, no polar en la posicion 12, opcionalmente Ile;

ii. un aminoacido distinto de Arg en la posicion 17, opcionalmente Gln;

v. un aminoacido alifatico pequeno en la posicion 18, opcionalmente Ala;

v. un aminoacido distinto de Asp en la posicion 21, opcionalmente Glu;

vi. un aminoacido distinto de Gln en la posicion 24, opcionalmente Asn o Ala;

vii. un aminoacido distinto de Met en la posicion 27, opcionalmente Leu;

viii. un aminoacido distinto de Asn en la posicion 28, opcionalmente Ala;

ix. un aminoacido distinto de Thr en la posicion 29, opcionalmente Gly; y

x. una extension de 1 a 21 aminoacidos C-terminal al aminoacido en la posicion 29.

En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon comprende una extension de GPSSGAPPPS o GPSSGAPPPSC. En aspectos de ejemplo, el analogo de glucagon que comprende una His en la posicion 1, Lys en la posicion 16 y AIB en la posicion 20 no comprende Gln-Ala en las posiciones 17-18.

En otros ejemplos de realizacion, el analogo de glucagon comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 48, 52, 53 y 74. Tales analogos de glucagon son similares en estructura a los de SEQ ID NOs: 27 33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, y 90, excepto que los primeros analogos de glucagon (SEQ ID NOS: 48, 52, 53, y 74) no comprenden un aminoacido acilado o aminoacido alquilado.

En aun otros ejemplos de realizacion, el analogo de glucagon comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de ^sE^qID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, y 92 o cualquiera de las SEQ ID NOs: 114-119, 125, 126, y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 139-144, 150-153, 208, 210 y 211. Tales analogos de glucagon comprenden un aminoacido aromatico grande en la posicion 1, por ejemplo, Tyr.

En algunas realizaciones, los peptidos agonistas de GIP comprenden una secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124 y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126 y 133. En algunas realizaciones, el peptido agonista de GIP comprende una secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212 y 230.

En algunas realizaciones, los peptidos agonistas de GIP comprenden una estructura basada en una secuencia original que comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124, y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62 -66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126, y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79,80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212, y 230, pero difiere de la secuencia original en una o mas posiciones.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion es un analogo de una secuencia original que comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124 y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58- 60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126 y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212, y 230 que comprende una secuencia de aminoacidos basada en la secuencia de aminoacidos de la secuencia original, pero difiere de la secuencia original puesto que la secuencia de aminoacidos del analogo comprende una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, y en algunos casos, 16 o mas (por ejemplo, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, etc.), modificaciones de aminoacidos especificadas u opcionales. En algunoas o en cualquiera de las realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende un total de 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9 o hasta 10 modificaciones de aminoacidos adicionales con respecto a la secuencia original que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43- 46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124, y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62 66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126, y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212, y 230. En algunas o cualquiera de las realizaciones, las modificaciones son cualquiera de las descritas en el presente documento con respecto a los analogos de glucagon, por ejemplo, acilacion, alquilacion, pegilacion, truncamiento en C-terminal, sustitucion del aminoacido en una o mas de las posiciones 1,2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28, y 29.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, la modificacion es una sustitucion o reemplazo de aminoacido, por ejemplo, una sustitucion conservativa de aminoacidos. En algunos aspectos, la sustitucion conservativa es una sustitucion de aminoacido en una o mas de las posiciones 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 o 29. En realizaciones alternativas, la sustitucion de aminoacido no es una sustitucion conservativa de aminoacidos, por ejemplo, es una sustitucion de aminoacido no conservativa.

En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 25% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la secuencia original, que comprende cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124 y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de SeQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126, y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212 y 230. En algunas realizaciones, el peptido de la presente descripcion comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% , al menos 85%, al menos 90% o tiene mas de un 90% de identidad de secuencia con la secuencia original. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del peptido aqul descrito que tiene el % de identidad de secuencia anteriormente referenciado es la secuencia de aminoacidos de longitud completa del peptido aqul descrito. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos del peptido de la presente descripcion que tiene el % de identidad de secuencia referenciado anteriormente es solo una parte de la secuencia de aminoacidos del peptido aqul descrito. En algunas realizaciones, el peptido aqul descrito comprende una secuencia de aminoacidos que tiene aproximaamente un % A o mayor identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos de referencia de al menos 5 aminoacidos contiguos (por ejemplo, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 aminoacidos) de la secuencia original, en la que la secuencia de aminoacidos de referencia comienza con el aminoacido en la posicion C de la SEQ ID NO: 1 y termina con el aminoacido en la posicion D de la SEQ ID NO: 1, en donde A es 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99; C es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 y D es 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28 o 29. Cualquiera y todas las posibles combinaciones de los parametros anteriores se contemplan, incluyendo, por ejemplo, en la que A es 90% y C y D son 1 y 27, o 6 y 27, u 8 y 27, o 10 y 27, o 12 y 27, o 16 y 27.

Los analogos de la secuencia original que comprenden cualquiera de SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83 87, 89, y 90, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53 y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58 60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, y 92, o cualquiera que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212 y 230 descritas en este documento puede comprender una cadena principal peptldica de cualquier numero de aminoacidos, es decir, puede ser de cualquier longitud de peptido. En algunas realizaciones, los peptidos descritos en este documento son de la misma longitud que la SEQ ID NO: 1, es decir, de 29 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido aqul descrito es mas largo que 29 aminoacidos de longitud, por ejemplo, el peptido aqul descrito comprende una extension C-terminal de 1-21 aminoacidos, tal como se describe adicionalmente en este documento. En consecuencia, el peptido de la presente descripcion, en algunas realizaciones, tiene 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido aqul descrito tiene hasta 50 aminoacidos de longitud. En algunas realizaciones, el peptido aqul descrito es mas largo que 29 aminoacidos de longitud (por ejemplo, mayor que 50 aminoacidos, (por ejemplo, al menos o aproximadamente 60, al menos o aproximadamente 70, al menos o aproximadamente 80, al menos o aproximadamente 90, al menos o aproximadamente 100, al menos o aproximadamente 150, al menos o aproximadamente 200, al menos o aproximadamente 250, al menos o aproximadamente 300, al menos o aproximadamente 350, al menos o aproximadamente 400, al menos o aproximadamente 450, al menos o aproximadamente 500 aminoacidos de longitud) debido a la fusion con otro peptido. En otras realizaciones, el peptido aqul descrito tiene menos de 29 aminoacidos de longitud, por ejemplo, 28, 27, 26, 25, 24, 23 aminoacidos.

De acuerdo con lo anterior, en algunos aspectos, el peptido de la presente descripcion es un analogo de una secuencia original que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs: 27-33, 35-41, 43-46, 76-80, 83-87, 89, 90, 94-100, 102-112, 120-124, y 127-131, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 48, 52, 53, y 74, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 50, 51, 54, 56, 58-60, 62-66, 68-70, 72, 73, 75, 81, 82, 88, 92, 114-119, 125, 126, y 133, o cualquiera de las SEQ ID NOs: 28, 29, 31, 37-41, 79, 80, 89, 90, 95, 130, 145-152, 155-167, 171, 176, 177, 180, 203-207, 212, y 230, cuya secuencia del analogo comprende una o mas modificaciones de aminoacidos que afectan a la actividad de GIP, actividad de glucagon y/o actividad de GLP-1, mejoran la estabilidad, por ejemplo, mediante la reduccion de la degradacion del peptido (por ejemplo, mediante la mejora de la resistencia a las proteasas de DPP-IV), mejoran la solubilidad, aumentan la media vida, retrasan la aparicion de la accion, extienden la duracion de la accion en el receptor de GIP, glucagon o GLP-1, o una combination de cualquiera de los anteriores. Tales modificaciones de aminoacidos, ademas de otras modificaciones, se describen adicionalmente en el presente documento con respecto a los analogos de glucagon, y cualquiera de estas modificaciones se puede aplicar individualmente o en combinacion.

PROCEDIMIENTOS DE FABRICACION DE PEPTIDOS

Los analogos de glucagon de la description se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Los procedimientos adecuados de la slntesis de novo de peptidos se describen en, por ejemplo, Chan et al, Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido., 2005; Peptide and Proteina Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido., 2000; y la patente de Estados Unidos N° 5.449.752. Procedimientos de ejemplo adicionales de fabrication de peptidos de la presente descripcion se exponen en el Ejemplo 1.

En algunas realizaciones, los peptidos descritos en el presente documento se sintetizan comercialmente por empresas, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD), y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los peptidos pueden ser sinteticos, recombinantes, aislados, y/o purificados.

Ademas, en los casos en los que los analogos de la descripcion no comprenden cualquiera de los aminoacidos no codificados o no naturales, el analogo del glucagon puede producirse de forma recombinante utilizando un acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos del analogo utilizando procedimientos recombinantes estandar. Vease, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY., 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, 1994.

En algunas realizaciones, los analogos de glucagon de la descripcion estan aislados. El termino "aislado", tal como se utiliza en este documento, significa haber sido extraldo de su entorno natural. En realizaciones de ejemplo, el analogo se fabrica a traves de procedimientos recombinantes y el analogo se alsla de la celula huesped.

En algunas realizaciones, los analogos de glucagon de la descripcion estan purificados. El termino "purificado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al aislamiento de una molecula o compuesto en una forma que esta sustancialmente libre de contaminantes que, en algunos aspectos, se asocian normalmente con la molecula o compuesto en un entorno nativo o natural y significa haber aumentado en pureza como resultado de estar separado de otros componentes de la composition original. El peptido o compuesto purificado incluye, por ejemplo, los peptidos sustancialmente libres de moleculas de acidos nucleicos, llpidos, e hidratos de carbono, u otros materiales de partida o intermedios que se utilizan o se forman durante la slntesis qulmica de los peptidos. Se entiende que "pureza" es un termino relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta o enriquecimiento absoluto o la selection absoluta. En algunos aspectos, la pureza es de al menos o aproximadamente 50%, al menos o aproximadamente 60%, al menos o aproximadamente 70%, al menos o aproximadamente 80%, o al menos o aproximadamente 90% (por ejemplo, al menos o aproximadamente 91%, al menos o aproximadamente 92%, al menos o aproximadamente 93%, al menos o aproximadamente 94%, al menos o aproximadamente 95%, al menos o aproximadamente 96%, al menos o aproximadamente 97%, al menos o aproximadamente 98 %, al menos o aproximadamente 99% o aproximadamente 100%).

CONJUGADOS

La invencion proporciona ademas conjugados que comprenden uno o mas de los analogos de glucagon descritos en el presente documento conjugados a un grupo heterologo. Tal como se utiliza en este documento, el termino "grupo heterologo" es sinonimo del termino "grupo conjugado" y se refiere a cualquier molecula (qulmica o bioqulmica, de origen natural o no codificado) que es diferente de los analogos de glucagon descritos en el presente documento. Los grupos conjugados de ejemplo que se pueden unir a cualquiera de los analogos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, un peptido o polipeptido heterologo (incluyendo, por ejemplo, una proteina de plasma), un agente de reconocimiento, una inmunoglobulina o parte de la misma (por ejemplo, region variable, CDR, o la region Fc), una etiqueta de diagnostico, tal como una etiqueta de radioisotopo, fluoroforo o enzimatica, un pollmero que incluye pollmeros solubles en agua, u otros agentes terapeuticos o de diagnostico. En algunas realizaciones, se proporciona un conjugado que comprende un analogo descrito en este documento y una proteina de plasma, en el que la proteina de plasma se selecciona del grupo que consiste en albumina, transferrina, fibrinogeno y globulinas.

En algunas realizaciones, el grupo de protelna de plasma del conjugado es albumina o transferrina. El conjugado, en algunas realizaciones, comprende uno o mas de los analogos de glucagon descritos en este documento y uno o mas de: un peptido (que es distinto de lo analogos de glucagon activos del receptor de glucagon y/o GLP-1 descritos en el presente documento), un polipeptido, una molecula de acido nucleico, un anticuerpo o fragmento del mismo, un pollmero, un punto cuantico, una molecula pequena, una toxina, un agente de diagnostico, un carbohidrato, un aminoacido.

En algunas realizaciones, el grupo heterologo es un peptido que es distinto de los analogos de glucagon descritos en este documento y el conjugado es un peptido de fusion o un peptido quimerico. En algunas realizaciones, el grupo heterologo es una extension de peptido de 1-21 aminoacidos. En realizaciones especlficas, la extension se une al C-terminal del analogo de glucagon, por ejemplo, al aminoacido en la posicion 29.

En algunos aspectos especlficos, la extension es un unico aminoacido o dipeptido. En realizaciones especlficas, la extension comprende un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: un aminoacido cargado (por ejemplo, un aminoacido con carga negativa (por ejemplo, Glu), un aminoacido con carga positiva), un aminoacido que comprende un grupo hidrofilo. En algunos aspectos, la extension es Gly, Glu, Cys, Gly-Gly, Gly-Glu.

En algunas realizaciones, el grupo heterologo es un pollmero. En algunas realizaciones, el pollmero se seleccona del grupo que consiste en: poliamidas, policarbonatos, polialquilenos y derivados de los mismos, incluyendo, polialquilenglicoles, oxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, pollmeros de esteres acrllicos y metacrllicos, incluyendo poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), y poli(acrilato de octadecilo), pollmeros vinllicos, incluyendo alcoholes de polivinilo, eteres de polivinilo, esteres de polivinilo, haluros de polivinilo, poli(acetato de vinilo), y polivinilpirrolidona, poliglicolidos, polisiloxanos, poliuretanos y copollmeros de los mismos, celulosas incluyendo alquilcelulosa, hidroxialquil celulosas, eteres de celulosa, esteres de celulosa, nitrocelulosas, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxibutil metil celulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, carboxiletil celulosa, triacetato de celulosa, y sal sodica de sulfato de celulosa, polipropileno, polietilenos, incluyendo poli(etilenglicol), poli(oxido de etileno) y poli (tereftalato de etileno), y poliestireno.

En algunos aspectos, el pollmero es un pollmero biodegradable, incluyendo un pollmero biodegradable sintetico (por ejemplo, pollmeros de acido lactico y acido glicolico, polianhldridos, poli(orto)esteres, poliuretanos, poli(acido butlrico), poli (acido valerico), y poli(lactido-cocaprolactona)), y un pollmero natural biodegradable (por ejemplo, alginato y otros polisacaridos, incluyendo dextrano y celulosa, colageno, derivados qulmicos de los mismos (sustituciones, adiciones de grupos qulmicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones, y otras modificaciones realizadas rutinariamente por los expertos en la materia), albumina y otras protelnas hidrofilas (por ejemplo, zelna y otras prolaminas y protelnas hidrofobicas)), as! como cualquier copollmero o mezcla de los mismos. En general, estos materiales se degradan mediante hidrolisis enzimatica o la exposicion al agua in vivo, por erosion superficial o en masa.

En algunos aspectos, el pollmero es un pollmero bioadhesivo, tal como un hidrogel biodegradable descrito por H.S. Sawhney, C. P. Pathak y J.A. Hubbell en Macromolecules, 1993, 26, 581-587, acidos polihialuronicos, caselna, gelatina, glutina, polianhldridos, acido poliacrllico, alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), y poli(acrilato de octadecilo).

En algunas realizaciones, el pollmero es un pollmero soluble en agua o u pollmero hidrofilo. Los pollmeros hidrofilos se describen adicionalmente en este documento bajo el tltulo “Grupos hidrofilos”. Los pollmeros solubles en agua adecuados son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa (HPC; Klucel), hidroxipropil metilcelulosa (HPMC; Methocel), nitrocelulosa, hidroxipropiletilcelulosa, hidroxipropil butilcelulosa, hidroxipropil pentilcelulosa, metil celulosa, etil celulosa (Ethocel), hidroxietil celulosa, diversas alquil celulosas e hidroxialquil celulosas, diversos eteres de celulosa, acetato de celulosa, carboximetil celulosa, carboximetil celulosa de sodio, carboximetil celulosa de calcio, copollmeros de acetato de vinilo/acido crotonico, metacrilato de poli-hidroxialquilo, metacrilato de hidroximetilo, copollmeros de acido metacrllico, acido metacrllico, polimetacrilato de metilo, copollmeros de anhldrido maleico/metil vinil eter, poli vinilalcohol, acido poliacrllico sodico y calcico, acido poliacrllico, carboxi pollmeros acidos, carboxipolimetileno, pollmeros de carboxivinilo, copollmero de polioxietileno y polioxipropileno, anhldrido de polimetilvinileter co-maleico, carboximetilamida, co-pollmero de metacrilato de potasio y divinilbenceno, polioxietilenglicoles, oxido de polietileno, y derivados, sales, y combinaciones de los mismos.

En realizaciones especlficas, el pollmero es un polialquilenglicol, incluyendo, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). En algunas realizaciones, el grupo heterologo es un hidrato de carbono. En algunas realizaciones, el hidrato de carbono es un monosacarido (por ejemplo, glucosa, galactosa, fructosa), un disacarido (por ejemplo, sacarosa, lactosa, maltosa), un oligosacarido (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa), un polisacarido (un almidon, amilasa, amilopectina, celulosa, quitina, calosa, laminarina, xilano, manano, fucoidano, galactomanano).

En algunas realizaciones, el grupo heterologo es un llpido. El llpido, en algunas realizaciones, es un acido graso, eicosanoide, prostaglandina, leucotrienos, tromboxano, N-acil etanolamina), glicerollpido (por ejemplo, mono, gliceroles mono-, di-, trisustituidos), glicerofosfollpido (por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina), esfingollpidos (por ejemplo, esfingosina, ceramida), llpido esterol (por ejemplo, esteroide, colesterol), llpido prenol, sacarollpido, o un policetido, aceite, cera, colesterol, esterol, vitamina soluble en grasa, monoglicerido, diglicerido, triglicerido, un fosfollpido.

En algunas realizaciones, el grupo heterologo esta unido mediante enlace no covalente o covalente al analogo de la presente descripcion. En aspectos de ejemplo, el grupo heterologo esta unido al analogo de la presente descripcion a traves de un enlazador. La union puede llevarse a cabo por enlaces qulmicos covalentes, fuerzas flsicas, tales interacciones electrostaticas, puentes de hidrogeno, ionicas, de van der Waals, o interacciones hidrofobas o hidrofilas. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de acoplamiento no covalentes, incluyendo biotina-avidina, ligando/receptor, enzima/sustrato, acido nucleico/protelna de union a acido nucleico, llpido/protelna de union a llpido, complementos de la molecula de adhesion celular; o cualquier complemento de union o fragmentos de los mismos que tengan afinidad entre si.

El analogo de glucagon, en algunas realizaciones, esta unido a grupos de conjugacion a traves de union covalente directa mediante la reaccion de los residuos de aminoacidos diana del analogo con un agente de derivatizacion organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de los extremos N o C-terminales de estos aminoacidos diana. Los grupos reactivos en el peptido o conjugado incluyen, por ejemplo, un grupo aldehldo, amino, ester, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino. Los agentes de derivatizacion incluyen, por ejemplo, ester de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugacion a traves de residuos de cistelna), N-hidroxisuccinimida (a traves de residuos de lisina), glutaraldehldo, anhldrido succlnico u otros agentes conocidos en la tecnica. Alternativamente, los grupos conjugados se pueden unir al analogo indirectamente a traves de portadores intermedios, tales como polisacaridos o polipeptidos portadores. Ejemplos de portadores de polisacaridos incluyen aminodextrano. Ejemplos de portadores de polipeptidos adecuados incluyen polilisina, acido poliglutamico, acido poliaspartico, copollmeros de los mismos, y los pollmeros mixtos de estos aminoacidos y otros, por ejemplo, serinas, para conferir propiedades de solubilidad deseables en el portador cargado resultante.

Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar mas habitualmente con a-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como acido cloroacetico o cloroacetamida, para producir derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos cisteinilo tambien se derivan mediante reaccion con bromotrifluoroacetona, acido alfa-bromo-b-(5-imidozoil)propionico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil 2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivan mediante la reaccion con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente especlfico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo tambien es util; la reaccion se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos de lisinilo y amino terminales se hacen reaccionar con anhldridos de acido succlnico u otros acidos carboxllicos. La derivatizacion con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoesteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, acido trinitrobencenosulfonico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona, y reaccion catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican mediante reaccion con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatizacion de residuos de arginina requiere que la reaccion se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional guanidina. Ademas, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, as! como con el grupo epsilon-amino de arginina.

La modificacion especlfica de los residuos de tirosilo se puede realizar, con especial interes en la introduccion de marcadores espectrales en los residuos tirosilo, mediante la reaccion con compuestos de diazonio aromaticos o tetranitrometano. Mas habitualmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reaccion con carbodiimidas (R-N = C = N-R '), en las que R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4 etil) carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Ademas, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutaminilo mediante la reaccion con iones amonio.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilacion de prolina y lisina, la fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilacion de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pag. 79-86 (1983)), la desamidacion de glutamina o asparagina, la acetilacion de la amina N-terminal, y/o la amidacion o esterificacion del grupo acido carboxllico C-terminal.

Otro tipo de modificacion covalente implica el acoplamiento qulmico o enzimatico de glicosidos al antagonista. Se puede unir un azucar o azucares a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cistelna, (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromaticos, tales como los de tirosina, o triptofano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos metodos se describen en el documento WO87/05330 publicado 11 de septiembre 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pag. 259-306 (1981).

En algunas realizaciones, el analogo de glucagon se conjuga a un grupo heterologo a traves de un enlace covalente entre una cadena lateral de un aminoacido del analogo de glucagon y el grupo heterologo. En algunas realizaciones, el analogo de glucagon se conjuga a un grupo heterologo a traves de la cadena lateral de un aminoacido en la posicion 16, 17, 21, 24, o 29, una posicion dentro de una extension C-terminal, o el aminoacido C-terminal o una combinacion de estas posiciones. En algunos aspectos, el aminoacido unido covalentemente a un grupo heterologo (por ejemplo, el aminoacido que comprende un grupo heterologo) es una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoacido esta unida covalentemente a un grupo heterologo.

En algunas realizaciones, el conjugado comprende un enlazador que une el analogo de glucagon al grupo heterologo. En algunos aspectos, el enlazador comprende una cadena de atomos de 1 a aproximadamente 60, o de 1 a 30 atomos o mas, de 2 a 5 atomos, de 2 a 10 atomos, de 5 a 10 atomos, o de 10 a 20 atomos de longitud. En algunas realizaciones, los atomos de la cadena son todos atomos de carbono. En algunas realizaciones, los atomos de la cadena en la cadena principal del enlazador se seleccionan del grupo que consiste en C, O, N, y S. Los atomos de la cadena y los enlazadores se pueden seleccionar segun su solubilidad (hidrofilicidad) esperada a fin de proporcionar un conjugado mas soluble. En algunas realizaciones, el enlazador proporciona un grupo funcional que esta sujeto a la escision por una enzima u otro catalizador o condiciones hidrollticas que se encuentran en el tejido u organo o celula dianas. En algunas realizaciones, la longitud del enlazador es lo suficiente larga para reducir el potencial impedimento esterico. Si el enlazador es un enlace covalente o un enlace peptidilo y el conjugado es un polipeptido, todo el conjugado puede ser una protelna de fusion. Dichos enlazadores peptidilo pueden tener cualquier longitud. Los enlazadores de ejemplo tienen de aproximadamente 1 a 50 aminoacidos de longitud, de 5 a 50, de 3 a 5, de 5 a 10, de 5 a 15, o de 10 a 30 aminoacidos de longitud. Dichas protelnas de fusion pueden producirse, alternativamente, mediante metodos de ingenierla genetica recombinante conocidos para un experto en la materia.

Conjugados: fusiones de Fc

Tal como se indico anteriormente, en algunas realizaciones, los analogos se conjugan, por ejemplo, se fusionan a una inmunoglobulina o parte de la misma (por ejemplo, region variable, CDR, o region Fc). Los tipos conocidos de inmunoglobulinas (Ig) incluyen IgG, IgA, IgE, IgD o IgM. La region Fc es una region C-terminal de una cadena pesada de Ig, que es responsable de la union a los receptores Fc que llevan a cabo actividades, tales como el reciclaje (que da lugar a una vida media prolongada), citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC), y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Por ejemplo, segun algunas definiciones, la region Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde la Cys226 al extremo C-terminal de la cadena pesada. La "region bisagra" generalmente se extiende desde Glu216 a Pro230 de Ia IgG1 humana (regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 mediante la alineacion de las cistelnas implicadas en la union a cistelna). La region Fc de una IgG incluye dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una region Fc de IgG humana normalmente se extiende desde el aminoacido 231 hasta el aminoacido 341. El dominio CH3 de una region Fc de IgG humana normalmente se extiende entre los aminoacidos 342 a 447. Las referencias a la numeracion de amino acidos de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina, o regiones, se basan todas en Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud Publica, Bethesda, MD. En realizaciones relacionadas, la region Fc puede comprender una o mas regiones constantes modificadas o nativas de una cadena pesada de inmunoglobulina, diferente de CH1, por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de IgG e IgA, o las regiones CH3 y CH4 de IgE.

Los grupos de conjugado adecuados incluyen partes de secuencia de inmunoglobulina que incluyen el sitio de union a FcRn. El FcRn, un receptor de salvamento, es responsable del reciclaje de inmunoglobulinas y su retorno a la circulacion en la sangre. La region de la parte Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basandose en cristalografla de rayos X (Burmeister et al 1994, Nature 372: 379). El area de contacto principal de la Fc con el FcRn esta cerca de la union de los dominios CH2 y CH3. Los contactos Fc-FcRn estan todos dentro de una sola cadena pesada de Ig. Los sitios de contacto principales incluyen los residuos de aminoacidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, y 314 del dominio CH2 y los residuos de aminoacidos 385-387, 428, y 433-436 del dominio CH3.

Algunos grupos de conjugado pueden incluir o no un sitio o sitios de union a FcgR. FcgR son responsables de ADCC y CDC. Los ejemplos de posiciones dentro de la region Fc que realizan un contacto directo con FcgR son los aminoacidos 234-239 (region bisagra inferior), los aminoacidos 265-269 (bucle B/C), los aminoacidos 297-299 (bucle C'/E), y los aminoacidos 327-332 (bucle F/G) (Sondermann et al., Nature 406:. 267-273, 2000). La region bisagra inferior de IgE tambien se ha implicado en la union a FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568 a 15578, 1997). Los residuos implicados en la union al receptor de IgA se describen en Lewis et al., (J Immunol. 175: 6694-701, 2005). Los residuos de aminoacidos implicados en la union al receptor de IgE se describen en Sayers et al. (J Biol Chem.

279 (34): 35320-5, 2004).

Las modificaciones de aminoacidos pueden realizarse en la region Fc de una inmunoglobulina. Dichas regiones Fc variantes comprenden al menos una modificacion de aminoacidos en el dominio CH3 de la region Fc (residuos 342 447) y/o al menos una modificacion de aminoacido en el dominio CH2 de la region Fc (residuos 231-341). Las mutaciones que se cree que transmiten una mayor afinidad por FcRn incluyen T256A, T307A, E380A, y N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591). Otras mutaciones pueden reducir la union de la region Fc a FcgRI, FcgRIIA, FcgRIIB, y/o FcgRIIIA sin reducir significativamente la afinidad por FcRn. Por ejemplo, la sustitucion de Asn en la posicion 297 de la region Fc por Ala u otro aminoacido elimina un sitio de N-glicosilacion altamente conservado y puede dar lugar a una inmunogenicidad reducida con una vida media prolongada concomitante de la region Fc, as! como una union reducida a FcgRs (Routledge et al 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al 1999, Transplantation 68: 1632; Shields y otros, 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Se han realizado modificaciones de aminoacidos en las posiciones 233-236 de IgG1 han sido hechos que reducen la union a FcgRs (Ward y Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 y Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613). Algunas sustituciones de aminoacidos de ejemplo se describen en las Patentes de Estados Unidos 7.355.008 y 7.381.408.

Conjugados: restos hidrofilos

Los analogos de glucagon descritos en este documento pueden modificarse adicionalmente para mejorar su solubilidad y estabilidad en soluciones acuosas a pH fisiologico, mientras conservan la actividad biologica elevada en relacion con el glucagon natural. Los grupos hidrofilos, tales como PEG, se pueden unir a los analogos bajo cualquier condicion adecuada utilizada para hacer reaccionar una protelna con una molecula de pollmero activada. Se pueden usar cualquier medio conocido en la tecnica, incluyendo a traves de acilacion, alquilacion reductora, adicion de Michael, alquilacion con tiol u otros metodos de conjugacion/union quimioselectiva a traves de un grupo reactivo sobre el grupo PEG (por ejemplo, un grupo aldehldo, amino, ester, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino) a un grupo reactivo en el compuesto diana (por ejemplo, un grupo aldehldo, amino, ester, tiol, a-haloacetilo, maleimido o hidrazino). Los grupos activadores que pueden utilizarse para enlazar el pollmero soluble en agua a una o mas protelnas incluyen, sin limitacion sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano, 5-piridilo y grupo acilo alfa-halogenado (por ejemplo, acido alfa-yodo acetico, acido alfa-bromo acetico, acido alfa-cloro acetico). Si se une al analogo mediante alquilacion reductora, el pollmero seleccionado debe tener un unico aldehldo reactivo, de manera que se controla el grado de polimerizacion. Vease, por ejemplo, Kinstler et al., Adv. Drugs. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); y Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).

En aspectos especlficos, un residuo de aminoacido del analogo que tiene un tiol se modifica con un grupo hidrofilo, tal como PEG. En algunas realizaciones, el tiol se modifica con PEG activado con maleimida en una reaccion de adicion de Michael para dar lugar a un analogo PEGilado que comprende el enlace de tioeter que se muestra a continuacion:

En algunas realizaciones, el tiol se modifica con un PEG activado con haloacetilo en una reaccion de sustitucion nucleofila para dar lugar a un analogo PEGilado que comprende un enlace tioeter.

Los grupos hidrofilos adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioles polioxietilados (por ejemplo, POG), sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), polioxialquilenos, propionaldehldo con polietilenglicol, copollmeros de etilenglicol/propilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, mono (C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol, carboximetilcelulosa, poliacetales, alcohol polivinllico (PVA), polivinilpirrolidona, poli- 1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copollmero de etileno/anhldrido maleico, poli (b-aminoacidos) (ya sean homopollmeros o copollmeros aleatorios), poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopollmeros de propropilenglicol (PPG) y otros oxidos de polialquileno, copollmeros de oxido de polipropileno/oxido de etileno, acidos colonicos u otros pollmeros de polisacaridos, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos. Los dextranos son pollmeros de polisacaridos de subunidades de glucosa, predominantemente unidas por uniones a1-6. El dextrano esta disponible en muchos intervalos de peso molecular, por ejemplo, de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 100 kD, o de aproximadamente 5, 10, 15 o 20 kD a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 kD. Se contemplan pollmeros lineales o ramificados. Las preparaciones resultantes de conjugados pueden ser esencialmente monodispersas o polidispersas, y pueden tener aproximadamente 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 o 2 grupos de pollmeros por analogo.

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el analogo de glucagon se conjuga a un grupo hidrofilo a traves de enlace covalente entre una cadena lateral de un aminoacido del analogo de glucagon y el grupo hidrofilo. En algunas o cualquiera de las realizaciones, el analogo de glucagon se conjuga a un grupo hidrofilo a traves de la cadena lateral de un aminoacido en la posicion 16, 17, 21, 24, o 29, una posicion dentro de una extension C-terminal, o en el aminoacido C-terminal, o una combinacion de estas posiciones. En algunos aspectos, el aminoacido unido covalentemente a un grupo hidrofilo (por ejemplo, el aminoacido que comprende un grupo hidrofilo) es una Cys, Lys, Orn, homo-Cys, o Ac-Phe, y la cadena lateral del aminoacido esta covalentemente unido a un grupo hidrofilo (por ejemplo, PEG).

Coniuaados: rPEG

En algunas o cualquiera de las realizaciones, el conjugado de la presente descripcion comprende el analogo de glucagon que tiene actividad agonista del receptor de GIP fusionado a un analogo accesorio que es capaz de formar una conformacion extendida similar al PEG qulmico (por ejemplo, una molecula PEG recombinante (rPEG)), tales como los descritos en la publicacion de solicitud de Patente Internacional No. WO2009/023270 y la publicacion de la solicitud de Patente de Estados Unidos N° US20080286808. La molecula de rPEG en algunos aspectos es un polipeptido que comprende una o mas de glicina, serina, acido glutamico, acido aspartico, alanina o prolina. En algunos aspectos, el rPEG es un homopollmero, por ejemplo, poli-glicina, poli-serina, poli-acido glutamico, poli-acido aspartico, poli-alanina, o poli-prolina. En otras realizaciones, el rPEG comprende dos tipos de aminoacidos repetidos, por ejemplo, poli (Gly-Ser), poli (Gly-Glu), poli (Gly-Ala), poli (Gly-Asp), poli (Gly-Pro), poli (Ser-Glu), etc. En algunos aspectos, el rPEG comprende tres tipos diferentes de aminoacidos, por ejemplo, poli (Gly-Ser-Glu). En aspectos especlficos, el rPEG aumenta la vida media del analogo agonista de glucagon y/o GLP-1. En algunos aspectos, el rPEG comprende una carga positiva neta o carga negativa neta. El rPEG en algunos aspectos carece de estructura secundaria. En algunas realizaciones, el rPEG es mayor que o igual a 10 aminoacidos de longitud y en algunas realizaciones es de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoacidos de longitud. El peptido accesorio en algunos aspectos se fusiona con el extremo N- o C-terminal del analogo de la presente descripcion a traves de un enlace peptldico o un sitio de escision por proteinasa, o se inserta en los bucles del analogo de la presente descripcion. El rPEG en algunos aspectos comprende una etiqueta de afinidad o esta unido a un PEG que es mayor que 5 kDa. En algunas realizaciones, el rPEG confiere al analogo de la presente descripcion un mayor radio hidrodinamico, mayor vida media en suero, mayor resistencia a la proteasa, o mayor solubilidad y, en algunos aspectos, confiere el analogo una menor inmunogenicidad.

Coniuaados: multimero

La presente invention proporciona ademas multlmeros o dlmeros de los analogos descritos en este documento, incluyendo homomultlmeros o heteromultlmeros u homodlmeros o heterodlmeros. Dos o mas de los analogos se pueden unir utilizando agentes de union estandar y procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los dlmeros se pueden formar entre dos peptidos mediante el uso de agentes de reticulation bifuncionales tiol y agentes de reticulacion de amina bi-funcionales, en particular para los analogos que se han substituido con residuos de cistelna, lisina ornitina, homocistelna o acetil fenilalanina. El dlmero puede ser un homodlmero o, alternativamente, puede ser un heterodlmero. En realizaciones de ejemplo, el enlazador que conecta los dos (o mas) analogos es PEG, por ejemplo, un PEG de 5 kDa, un PEG de 20 kDa. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlace disulfuro. Por ejemplo, cada monomero del dlmero puede comprender un residuo de Cys (por ejemplo, una Cys terminal o situada internamente) y el atomo de azufre de cada residuo de Cys participa en la formation del enlace disulfuro. En aspectos de ejemplo, cada monomero del dlmero esta unido a traves de un enlace tioeter. En aspectos de ejemplo, una amina epsilon de un residuo de Lys de un monomero se une a un residuo Cys, que, a su vez, esta conectado a traves de un grupo qulmico a la amina epsilon de un residuo de Lys del otro monomero. Los procedimientos de fabrication de tales dlmeros unidos por tioeter se describen con mas detalle en el presente documento. En algunos aspectos, los monomeros estan conectados a traves de aminoacidos terminales (por ejemplo, N-terminal o C-terminal), a traves de aminoacidos internos, o a traves de un aminoacido terminal de al menos un monomero y un aminoacido interno de al menos otro monomero. En aspectos especificos, los monomeros no estan conectados a traves de un aminoacido N-terminal. En algunos aspectos, los monomeros del multimero se unen jen una orientacion "cola con cola" en la que los aminoacidos C-terminales de cada monomero se unen.

p r o f A r m a c o s

Se proporciona ademas en la description profarmacos de los peptidos y analogos descritos en este documento. Tal como se utiliza en este documento, el termino "profarmaco" se define como cualquier compuesto que se somete a modification quimica antes de mostrar sus efectos farmacologicos completos.

En realizaciones de ejemplo, el profarmaco es un profarmaco de peptido basado en amida, similar a los descritos en la solicitud de Patente Internacional n° WO/2010/071807, que se publico el 24 de junio de 2010. Tales profarmacos pretenden retrasar el inicio de action y extender la vida media del farmaco. El retraso en la aparicion de la action es ventajosa ya que permite la distribucion sistemica del profarmaco antes de su activacion. Por consiguiente, la administration de profarmacos elimina complicaciones causadas por actividades intensas tras la administration y aumenta el indice terapeutico del farmaco original.

En aspectos de ejemplo, el profarmaco comprende la estructura: A-B-Q; en la que Q es un peptido o analogo descrito en el presente documento; A es un aminoacido o un hidroxiacido; B es un aminoacido N-alquilado unido a Q a traves de un enlace amida entre A-B y una amina de Q; en la que A, B, o el aminoacido de Q al que estan unidos

A-B es un aminoacido no codificado, en el que ademas la vida media de escision quimica (t 1 /2) de A-B de Q es al menos aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 semana en PBS en condiciones fisiologicas. Tal como se utiliza en este documento, el termino "hidroxiacido" se refiere a un aminoacido que ha sido modificado para reemplazar el grupo amino del carbono alfa por un grupo hidroxilo.

En algunas realizaciones, el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura general de Formula I:

en la que

R1, R2, R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, (alquilo C1-C18)OH, (alquilo C1-C18)^sH, (alquilo C2-C3)SCH3, (alquilo C1-C4)CONH2, (alquilo C1-C4)COOH, (alquilo C1-C4)NH2, (alquilo C1-C4)NHC(NH2+)NH2, (alquil C0-C4) (cicloalquilo C3-C6), (alquil C0-C4) (heterocicliclo C2-C C0-C4) (arilo C6-C10)R7, (alquil C1-C4) (heteroarilo C3-C9), y alquil C1-C12(A) (W1) alquilo C1-C12, en el que W1 es un heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R1 y R2 junto con los atomos a los que estan unidos forman un cicloalquilo o arilo C3-C12; o R4 y R8 junto con los atomos a los que estan unidos forman un cicloalquilo C3-C6;

R3 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C1-C18, (alquilo C1-C18)OH, (alquilo C1-C18)NH2, (alquilo C1-C18)SH, (alquil C0-C4) (cicloalquilo C3-C6), (alquil C0-C4) (heterocicliclo C2-C5), (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7, y (alquil

C1-C4) (heteroarilo C3-C9) o R4 y R3 junto con los atomos a los que estan unidos forman un anillo heterociclico de 4,

5 o 6 miembros;

R5 es NHR6 u OH;

R6 es H, alquilo C1-C8 o R6 y R2 junto con los atomos a los que estan forman un anillo heterociclico de 4, 5 o 6 miembros; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en H y OH.

En otras realizaciones el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura general de Formula I:

en la que

Ri, R2, R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18,

(alquilo C1-C18)OH, (alquilo C1-C18)SH, (alquilo C2-C3)SCH3, (alquilo C1-C4)CONH2, (alquilo C1-C4)COOH, (alquilo C1-C4)NH2, (alquilo C1-C4)NHC(NH2+)NH2, (alquil C0-C4) (cicloalquilo C3-C6), (alquil C0-C4) (heterocicliclo C2-C C0-C4) (arilo C6-C10)R7, (alquil C1-C4) (heteroarilo C3-C9), y alquil C1-C12(A) (W1) alquilo C1-C12, en el que W1 es un

heteroatomo seleccionado del grupo que consiste en N, S y O, o R1 y R2 junto con los atomos a los que estan unidos

forman un cicloalquilo C3-C12; o R4 y R8 junto con los atomos a los que estan unidos forman un cicloalquilo C3-C6;

C1-C4) (heteroarilo C3-C9) o R4 y R3 junto con los atomos a los que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4,

5 o 6 miembros;

R5 es NHR6 u OH;

R6 es H, alquilo C1-C8 o R6 y R1 junto con los atomos a los que estan forman un anillo heteroclclico de 4, 5 o 6

miembros; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, (alquilo C0-C4)CONH2,

(alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH, y halo.

En algunas realizaciones R8 es H y R5 es NHR6.

En algunas realizaciones, el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura de Formula I, en la que

R1 y R8 son independientemente H o alquilo C1-C8;

R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, (alquilo

C1-C4)OH, (alquilo C1-C4)SH, (alquilo C2-C3)SCH3, (alquilo C1-C4)CONH2, (alquilo C1-C4)COOH, (alquilo C1-C4)NH2,

(alquilo C1-C4)NHC(NH2+)NH2, (alquil C0-C4) (cicloalquilo C3-C6), (alquil C0-C4) (heterocicliclo C2-C5), (alqu (arilo C6-C10)R7, CH2(heteroarilo C3-C9), o R1 y R2 junto con los atomos a los que estan unidos forman un cicloalquilo

o arilo C3-C12;

R5 es NHR6; y

R6 es H o alquilo C1-C8

En otras realizaciones el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura de Formula I, en la que

R1 y R8 son independientemente H o alquilo C1-C8;

R2 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, (alquilo C1-C4)OH, (alquilo C1-C4)SH, (alquilo C2-C3)SCH3, (alquilo C1-C4)CONH2, (alquilo C1-C4)COOH, (alquilo C1-C4)NH2,

C3-C12;

R3 es alquilo C1-C18;

R5 es NHR6; y

R6 es H o alquilo C1-C8; y

(alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH, y halo.

La vida media del profarmaco formado de acuerdo con la presente descripcion se determina mediante los

sustituyentes del elemento dipeptido profarmaco, su ubicacion, y el aminoacido al que esta unido. Por ejemplo, el

profarmaco puede comprender un peptido o analogo descrito en este documento, en el que el elemento dipeptido

profarmaco esta unido a traves del grupo alfa amino del aminoacido N-terminal del peptido o analogo descrito en el

presente documento. En esta realizacion, los profarmacos que tienen un t1/2 de, por ejemplo, aproximadamente 1

hora comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que

R1 y R2 son independientemente alquilo o arilo C1-C18; o R1 y R2 estan unidos a traves de -(CH2)p, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo C1-C18;

R4 y R8 son cada uno hidrogeno; y

R5 es una amina.

En otras realizaciones, los profarmacos que tienen un ti/2 de, por ejemplo, aproximadamente 1 hora comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que

Ri y R2 son independientemente alquilo C1-C18 o (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)R7; o Ri y R2 estan unidos a traves de -(CH2)p, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo C1-C18;

R4 y R8 son cada uno hidrogeno;

R5 es NH2; y R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, (alquilo C0-C4)CONH2, (alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH, y halo.

Ademas, los profarmacos que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido alfa N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un t1/2, por ejemplo, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas, comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C18 y arilo, o R1 y R2 estan unidos a traves de (CH2)p, en en el que p es 2-9;

R3 es alquilo C1-C18 o R3 y R4 junto con los atomos a los que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4 a 12 atomos;

R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8 y arilo; y R5 es una amina;

con la condicion de que tanto R1 como R2 no son hidrogeno y siempre que uno de R4 o R8 sea hidrogeno.

En algunas realizaciones, los profarmacos que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido alfa N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un t1/2, por ejemplo, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura

en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C18, (alquilo C1-C18)OH, (alquilo C1-C4)NH2, y (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7 o R1 y R2 estan unidos a traves de (CH2)p, en en el que p es 2-9;

R4 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)R7;

R5 es NH2; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo Ci-Cis, alquenilo C2-C18, (alquilo C0-C4)CONH2, (alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH y halo;

con la condicion de que tanto Ri como R2 no son hidrogeno y siempre que al menos uno de R4 o Rs sea hidrogeno.

En algunas realizaciones, los profarmacos que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un ti/2, por ejemplo, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 48 horas, comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y (alquilo Ci-C4)NH2, o Ri y R2 estan unidos a traves de (CH2p)p, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo Ci-Cs o R3 y R4 junto con los atomos a los que estan unidos formar un anillo heteroclclico de 4-6 atomos;

R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno y alquilo Ci-Cs; y

R5 es NH2;

con la condicion de que tanto Ri como R2 no son hidrogeno.

En otras realizaciones, los profarmacos que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un ti/2, por ejemplo, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 4s horas, comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que Ri y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y (alquilo Ci-C4)NH2;

R3 es alquilo Ci-C6;

R4 es hidrogeno; y

R5 es NH2;

con la condicion de que tanto Ri como R2 no son hidrogeno.

En algunas realizaciones, los profarmacos que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un ti/2, por ejemplo, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones, entre aproximadamente i2 y aproximadamente 4s horas, comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

6 i

R3 es alquilo Ci-Cs;

R4 es (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)R7;

R5 es NH2; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y (alquilo C0-C4)OH;

con la condicion de que tanto Ri como R2 no son hidrogeno.

Ademas, se proporciona un profarmaco que tiene el elemento dipeptido profarmaco unido al aminoacido alfa N-terminal del peptido o analogo descrito en este documento y que tiene un ti/2, por ejemplo, de aproximadamente i2 y aproximadamente i68 horas, en el que elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura:

en la que Ri se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y arilo;

R3 es alquilo Ci-Cis;

R4 y Rs son cada uno hidrogeno; y

R5 es amina o amina N-sustituida o un hidroxilo;

con la condicion de que, si Ri es alquilo o arilo, entonces Ri y R5 junto con los atomos a los que se unen forman un anillo heteroclclico de 4 - i i atomos.

En algunas realizaciones, el elemento de dipeptido profarmaco tiene la estructura:

en la que Ri se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)R7;

R3 es alquilo Ci-Cis;

R4 y Rs son cada uno hidrogeno;

R5 es NHR6 u OH;

R6 es H, alquilo Ci-Cs, o R6 y Ri junto con los atomos a los que se unen forman un anillo heteroclclico de 4, 5 o 6 miembros; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cis, alquenilo C2-Cis, (alquilo C0-C4)CONH2, (alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH y halo;

con la condicion de que, si Ri es alquilo o (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)R7, entonces Ri y R5 junto con los atomos a los que se unen forman un anillo heteroclclico de 4 - i i atomos.

En algunas realizaciones, el elemento de profarmaco dipeptido esta unido a una amina de la cadena lateral de un aminoacido interno del peptido o analogo descrito en el presente documento. En esta realizacion, los profarmacos tienen un ti/2, por ejemplo, de aproximadamente 1 hora, tienen la estructura:

en la que

Ri y R2 son independientemente alquilo Cl-Cs o arilo; o Ri y R2 estan unidos a traves de (CH2)p, en el que p es 2-9; R3 es alquilo Ci-Cis;

R4 y Rs son cada uno hidrogeno; y R5 es una amina.

En algunas realizaciones, los profarmacos que tienen un ti/2 , por ejemplo, de aproximadamente 1 hora tienen la estructura:

en la que

Ri y R2 son independientemente alquilo Ci-Cs o (alquil C0-C4) (arilo C6-Ci0)Rz; o Ri y R2 estan unidos a traves de -(CH2)p-, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo Ci-Cis;

R4 y Rs son cada uno hidrogeno;

R5 es NH2; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cis, alquenilo C2-Cis, (alquilo C0-C4)CONH2, (alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH, y halo.

Ademas, los profarmacos que tienen un ti/2, por ejemplo, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 24 horas y que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido a una cadena lateral de aminoacido interno comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que Ri y R2 e seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs y arilo, o Ri y R2 estan unidos a traves de -(CH2)p, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo Ci-Cis o R3 y R4 junto con los atomos a los que estan unidos forman un anillo de heteroclclico de 4-i2 atomos;

R4 y R8 son independientemente alquilo C1-C18 o arilo; y

R5 es una amina o amina N-sustituida;

En algunas realizaciones, los profarmacos que tienen un ti/2, por ejemplo, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 72 horas, o en algunas realizaciones, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 48 horas, y que tienen el elemento dipeptido profarmaco unido a una cadena lateral de aminoacido interno comprenden un elemento dipeptido profarmaco con la estructura:

en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8, y (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7, o R1 y R2 estan unidos a traves de -(CH2)p-, en el que p es 2-9;

R3 es alquilo C1-C18 o R3 y R4 junto con los atomos a que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 44 a 12 atomos;

R4 y R8 son independientemente hidrogeno, alquilo C1-C18 o (alquil C0-C4) (arilo C6-C10)R7;

R5 es NHR6;

R6 es H o alquilo C1-C8, o R6 y R2 junto con los atomos a los que estan unidos forman un anillo heteroclclico de 4, 5 o 6 miembros; y

R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C18, alquenilo C2-C18, (alquil C0-C4)CONH2, (alquilo C0-C4)COOH, (alquilo C0-C4)NH2, (alquilo C0-C4)OH, y halo;

con la condicion de que tanto R1 como R2 no son hidrogeno y siempre que al menos uno de R4 o R8 sea hidrogeno.

Ademas, se proporciona un profarmaco que tiene un t1/2, por ejemplo, de aproximadamente 72 a aproximadamente 168 horas y que tiene el elemento dipeptido profarmaco unido a una cadena lateral del aminoacido interno del peptido o analogo descrito en este documento, en el que el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura:

en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8 y arilo; R3 es alquilo C1-C18;

R4 y R8 son cada uno hidrogeno; y

R5 es amina o amina N-sustituida o un hidroxilo;

con la condicion de que, si R1 y R2 son ambos independientemente un alquilo o arilo, entonces R1 o R2 se une a traves de (CH2)p a R5, en el que p es 2-9.

En algunas realizaciones, se proporciona un profarmaco que tiene un t1/2, por ejemplo, de aproximadamente 72 a aproximadamente 168 horas y que tiene el elemento dipeptido profarmaco unido a una cadena lateral de aminoacido interno del peptido o analogo descrito en este documento, en el que el elemento dipeptido profarmaco tiene la estructura:

^{e n la q u e R}i ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^{- C}i0^)R7^{; R}3 ^{e s a lq u ilo C}1^-C18^;

^R4 ^{y R}8 ^{s o n c a d a u n o h id ro g e n o ;}

^R5 ^{e s N H R}6 ^{u O H ;}

^R6 ^{e s H o a lq u ilo C}1^-C8^{, o R}6 ^{y R}1 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 4 , 5}o 6 m ie m b ro s ; y

^R7 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^{- C}18^{, a lq u e n ilo C}2^-C18^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}0^-C4^{)N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)O H , y h a lo ;}

^{c o n la c o n d ic io n d e q u e , s i R}1 ^{y R}2 ^{s o n a m b o s in d e p e n d ie n te m e n te un g ru p o a lq u ilo o (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^{- C}10^)R7^{, R}1 ^{o R}2 ^{e s ta u n id o a t ra v e s d e (C H}2⁾p ^{a R}5^{, e n e l q u e p e s 2 -9.}

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a u n a a m in a d e la c a d e n a la te ra l d e un a m in o a c id o in te rn o d e l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e n e l que e l a m in o a c id o in te rn o c o m p re n d e la e s tru c tu ra d e F o rm u la II:

e n la que

n e s un n u m e ro e n te ro s e le c c io n a d o d e 1 a 4. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s n e s 3 o 4 y , e n a lg u n a s re a liz a c io n e s , el a m in o a c id o in te rn o e s lis in a . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a u n a a m in a p r im a r ia e n u n a c a d e n a la te ra l d e un a m in o a c id o s itu a d o e n la posición 12, 16 , 17, 18, 20 , 28 , o 29 d e l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a m in o a c id o e n 12, 16, 17, 18, 20 , 28 , o 29 c o m p re n d e la e s tru c tu ra d e F o rm u la II:

e n la que n e s un n u m e ro e n te ro s e le c c io n a d o d e 1 a 4 y e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a la c a d e n a la te ra l d e a m in o a c id o a t ra v e s d e un e n la c e a m id a . En a lg u n a s re a liz a c io n e s n e s 4 y e l a m in o a c id o s e e n c u e n tra en la posición 20.

E n u n a re a liz a c io n a d ic io n a l de l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o al p e p tid o o a n a lo g o d e l m is m o a t ra v e s d e u n a a m in a p re s e n te e n un g ru p o a r ilo d e un a m in o a c id o a ro m a tic o . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a m in o a c id o a ro m a tic o e s un a m in o a c id o in te rn o d e l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e s te d o c u m e n to , s in e m b a rg o , e l a m in o a c id o a ro m a tic o p u e d e s e r ta m b ie n e l a m in o a c id o N - te rm in a l. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a m in o a c id o a ro m a tic o s e s e le c c io n a d e l g ru p o que c o n s is te e n a m in o -P h e , a m in o -n a ft i l a la n in a , a m in o tr ip to fa n o , a m in o - fe n il-g lic in a , a m in o -h o m o -P h e , y a m in o t iro s in a . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a m in a p r im a r ia q u e fo rm a un e n la c e a m id a c o n e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta e n la posición p a ra e n e l g ru p o a rilo . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a m in a a ro m a tic a c o m p re n d e la e s tru c tu ra d e F o rm u la III:

e n la que m e s un n u m e ro e n te ro d e 1 a 3.

P a ra a que lla s re a liz a c io n e s e n la s que e l e le m e n to d i p e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito en e s te d o c u m e n to a t ra v e s d e u n a a m in a p re s e n te e n un g ru p o a r ilo d e un a m in o a c id o a ro m a tic o , lo s p ro fa rm a c o s q u e t ie n e n un t i / 2, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 1 h o ra t ie n e n u n a e s tru c tu ra d e d ip e p tid o de :

^{e n la q u e R}1 ^{y R}2 ^{s o n in d e p e n d ie n te m e n te a lq u ilo C}1^-C18 ^{o a rilo ;}

^R3 ^{e s a lq u ilo C}1^{- C}18 ^{o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc lic o d e 4 -12}a to m o s ;

^R4 ^{y R}8 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y a rilo ; y R}5 ^{e s u n a}a m in a o un h id ro x ilo .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o al p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e s te d o c u m e n to a t ra v e s d e u n a a m in a p re s e n te e n un g ru p o a r i lo d e un a m in o a c id o a ro m a tic o , lo s p ro fa rm a c o s q u e ^{t ie n e n un t}1/2^{, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 1 h o ra t ie n e n u n a e s tru c tu ra d e d ip e p tid o de :}

^{e n la q u e R}i ^{y R}2 ^{s o n in d e p e n d ie n te m e n te a lq u ilo C}1^-C18 ^{o (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^-Ci0^)R7^;

^R3 ^{e s a lq u ilo C}1^-C18 ^{o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 4 a 12}a to m o s ;

^R4 ^{y R}8 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^{- C}10^)R7^;

^R5 ^{e s N H}2 ^{o O H ; y}

^R7 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^{- C}18^{, a lq u e n ilo C}2^-C18^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}0^-C4^{)N H}2^{, (a lq u ilo C}0^{-C 4 )O H , y h a lo .}

A d e m a s , s e p ro p o rc io n a n p ro fa rm a c o s que t ie n e n el e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o u n id o a t ra v e s d e un ^{a m in o a c id o a ro m a tic o y q u e t ie n e n un t}i/2^{, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 6 a a p ro x im a d a m e n te 24 h o ra s , e n el}que el d ip e p tid o c o m p re n d e u n a e s tru c tu ra de :

e n la que

^R1 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y a rilo , o R}1 ^{y R}2 ^{e s ta n u n id o s a t ra v e s d e -(C H}2⁾p^{, e n el q u e p e s 2 -9 ;}

^R3 ^{e s a lq u ilo C}1^-C18 ^{o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 4 -6}a to m o s ;

^R4 ^{y R}8 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y a rilo ; y R}5 ^{e s u n a}a m in a o a m in a N -s u s titu id a .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a n p ro fa rm a c o s que t ie n e n el e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o u n id o a t ra v e s ^{d e un a m in o a c id o a ro m a tic o y q u e t ie n e n un t}1/2^{, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 6 a a p ro x im a d a m e n te 24 h o ra s}e n e l que e l d ip e p tid o c o m p re n d e u n a e s tru c tu ra de :

e n la que

^R1 ^{s e s e le c c io n a de l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18^{, (a lq u ilo C}1^-C18^{)O H , (a lq u ilo C}1^-C4^{)N H}2^{, y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C 6- C 10) r 7 ;}

^R4 ^{y R}8 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^-C18 ^{y (a lq u ilo C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^-C10^{)R 7 ;}

^R5 ^{e s N H R}6^;

^R6 ^{e s H, a lq u ilo C}1^-C8^{, o R}6 ^{y R1 ju n to co n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 4, 5 o}6 m ie m b ro s ; y

^R7 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}1^{- C}18^{, a lq u e n ilo C}2^-C18^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}0^-C4^{)N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)O H , y h a lo .}

A d e m a s , s e p ro p o rc io n a n p ro fa rm a c o s que t ie n e n el e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o u n id o a t ra v e s d e un ^{a m in o a c id o a ro m a tic o y q u e t ie n e n un t}1/2^{, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 72 a a p ro x im a d a m e n te 168 h o ra s , en}e l que e l d ip e p tid o c o m p re n d e u n a e s tru c tu ra de:

^{e n la q u e R}i ^{y R}2 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}i ^-Cs ^{y a rilo ; R}3 ^{e s a lq u ilo C}i ^-Cis ^{o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 4 -6}a to m o s ;

^R4 ^{y R}s ^{s o n c a d a u n o h id ro g e n o ; y}

^R5 ^{s e s e le c c io n a de l g ru p o q u e c o n s is te e n a m in a , a m in a N -s u s titu id a e h id ro x ilo .}

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a n p ro fa rm a c o s que t ie n e n el e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o u n id o a t ra v e s ^{d e un a m in o a c id o a ro m a tic o y q u e t ie n e n un t}i /2^{, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 72 a a p ro x im a d a m e n te 168}h o ra s , e n e l que e l d ip e p tid o c o m p re n d e u n a e s tru c tu ra de:

^{e n la q u e R}i ^{y R}2 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te de l g ru p o q u e c o n s is te e n h id ro g e n o , a lq u ilo C}i ^-Cs^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)C o O H , y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^-Ci0^)R7^{, o R}i ^{y R}5 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo}h e te ro c lc l ic o d e 4 a i i a to m o s ;

^R3 ^{e s a lq u ilo C}i ^{- C}is ^{o R}3 ^{y R 4 ju n to co n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 4 -6}a to m o s ;

^R4 ^{e s h id ro g e n o o fo rm a un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 4 -6 a to m o s c o n R}3^;

^Rs ^{e s h id ro g e n o ;}

^R5 ^{e s N H R}6 ^{u O H ;}

^R6 ^{e s H o a lq u ilo C}i ^-Cs^{, o R}6 ^{y R}i ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 4 , 5}o 6 m ie m b ro s ; y

^R7 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}i ^{- C}is^{, a lq u e n ilo C}2^-Cis^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}0^-C4^{)N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)O H , y h a lo .}

En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a un a m in o a c id o a ro m a tic o a t ra v e s d e u n a a m in a p r im a r ia p re s e n te c o m o un s u s t itu y e n te a r ilo d e l a m in o a c id o a ro m a tic o , e n e l que e l a m in o a c id o a ro m a tic o s e e n c u e n tra en la posición i0 , i 3 , 22 , o 25 de l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e s te d o c u m e n to (e n b a s e a la n u m e r a t io n d e g lu c a g o n n a tu ra l, v e a s e , p o r e je m p lo , S E Q ID N O : i ) . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o u n id o a l a m in o a c id o a ro m a tic o s e e n c u e n tra en la posición 22 de l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito en el p re s e n te d o c u m e n to .

S e g u n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a la a m in a N - te rm in a l de l p e p tid o o a n a lo g o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to , in c lu y e n d o , p o r e je m p lo , un p e p tid o re la c io n a d o c o n g lu c a g o n , o la o s te o c a lc in a , a s ! c o m o a n a lo g o s , d e r iv a d o s y c o n ju g a d o s d e lo s anteriores, e n e l que e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o c o m p re n d e la e s tru c tu ra :

63

^{e n la q u e R}i ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H y a lq u ilo C}i ^-Cs^;

^R2 ^{y R}4 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H, a lq u ilo C}i ^-Cs^{, a lq u e n ilo C}2^-C8^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)S H , (a lq u ilo C}2^-C3^{)S C H}3^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H}2^,

^{(a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H C (N H}2+^{)N H}2^{, (a lq u il C}0^-C4^{) (c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^{), (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^-Ci0^)R7^{, C H}2^{( C}9^{), o R}i ^{y R}2 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un c ic lo a lq u ilo C}6^-Ci 2^;

^R3 ^{s e s e le c c io n a de l g ru p o q u e c o n s is te e n a lq u ilo C}i ^-Cs^{, c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^{, o R}4 ^{y R}3 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e}

e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 5 o 6 m ie m b ro s ;

^R5 ^{e s N H R}6 ^{u O H ;}

^R6 ^{e s H, o R}6 ^{y R}2 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 5 o 6 m ie m b ro s ; y}

^R7 ^{s e s e le c c io n a de l g ru p o q u e c o n s is te e n H y O H . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s R}i ^{e s H o a lq u ilo C}i ^-Cs^{, R}2 ^se

^{s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H, a lq u ilo C}i ^-C6^{, C H}2^{O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H}2^{, ( c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^{) y C H}2^{(a r ilo}

^C6^)R7 ^{o R}6 ^{y R}2 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc lic o d e 5 m ie m b ro s , R}3 ^{es a lq u ilo C}i ^-C6^{, y R}4 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H, a lq u ilo C}i ^-C4^{, c ic lo a lq u ilo (C}3^-C6^{), (a lq u ilo C}i ^-C4^{)O H ,}

^{(a lq u ilo C}i ^-C4^{)S H y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^)R7^{, o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo}

^{h e te ro c lc l ic o d e 5 m ie m b ro s . E n u n a re a liz a c io n a d ic io n a l, R}3 ^{e s C H}3^{, R}5 ^{e s N H R}6^{, y en u n a re a liz a c io n a d ic io n a l a lte rn a t iv a , R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 5 m ie m b ro s y R}5 ^{e s}

^{N H R}6^.

S e g u n o tra re a liz a c io n , el e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o e s ta u n id o a la a m in a N - te rm in a l d e l p e p tid o o a n a lo g o

d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e n e l que e l e le m e n to d ip e p tid o p ro fa rm a c o c o m p re n d e la e s tru c tu ra :

^R2 ^{y R}4 ^{s e s e le c c io n a n in d e p e n d ie n te m e n te d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H, a lq u ilo C}i ^-Cs^{, a lq u e n ilo C}2^-Cs^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)S H , (a lq u ilo C}2^-C3^{)S C H}3^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)C O N H}2^{, (a lq u ilo C}i ^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H}2^,

^{(a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H C (N H}2+^{)N H}2^{, (a lq u il C}0^-C4^{) (c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^{), (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^-Ci0^)R7^{, C H}2^{(h e te ro a r ilo C}5^-C9^{), o R}i ^{y R}2 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^;

^R5 ^{e s N H R}6 ^{u O H ;}

^R7 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en h id ro g e n o , a lq u ilo C}i ^{- C}is^{, a lq u e n ilo C}2^-Cis^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)C O N H}2^,

^{(a lq u ilo C}0^-C4^{)C O O H , (a lq u ilo C}0^-C4^{)N H}2^{, (a lq u ilo C}0^-C4^{)O H y h a lo . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s R}i ^{e s H o a lq u ilo C}i ^-Cs^,

^R2 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te en H, a lq u ilo C}i ^-C6^{, C H}2^{O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)N H}2^{, ( c ic lo a lq u ilo C}3^-C6^{) y}

^{C H}2^{(a r ilo C}6^)R7 ^{o R}6 ^{y R}2 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n illo h e te ro c lc l ic o d e 5 m ie m b ro s ,}

^R3 ^{e s a lq u ilo C}i ^-C6^{, y R}4 ^{s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n H, a lq u ilo C}i ^-C4^{, c ic lo a lq u ilo (C}3^-C6^{), (a lq u ilo C}i ^-C4^{)O H , (a lq u ilo C}i ^-C4^{)S H y (a lq u il C}0^-C4^{) (a r ilo C}6^)R7^{, o R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n}

^{un a n il lo h e te ro c lc l ic o d e 5 m ie m b ro s . E n u n a re a liz a c io n a d ic io n a l, R}3 ^{e s C H}3^{, R}5 ^{e s N H R}6^{, y e n u n a re a liz a c io n}

^{a d ic io n a l a lte rn a t iv a , R}3 ^{y R}4 ^{ju n to c o n lo s a to m o s a lo s q u e e s ta n u n id o s fo rm a n un a n il lo h e te ro c lc lic o d e 5 m ie m b ro s y R}5 ^{e s N H R}6^.

COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, USOS Y KITS

Sales

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , el a n a lo g o d e g lu c a g o n e s ta e n fo rm a d e u n a sa l, p o r e je m p lo , u n a s a l fa rm a c e u tic a m e n te a c e p ta b le . T a l c o m o s e u t iliz a e n e s te d o c u m e n to , e l te rm in o "s a l fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le " s e re f ie re a s a le s d e c o m p u e s to s que re t ie n e n la a c t iv id a d b io lo g ic a d e l c o m p u e s to p a re n ta l, y que n o s o n b io lo g ic a m e n te o d e o tra m a n e ra in d e s e a b le s . D ic h a s s a le s s e p u e d e n p re p a ra r in s itu d u ra n te e l a is la m ie n to f in a l y p u r if ic a c io n d e l a n a lo g o , o s e p u e d e n p re p a ra r p o r s e p a ra d o m e d ia n te re a c c io n d e u n a fu n c io n d e b a s e lib re c o n un a c id o a d e c u a d o . M u c h o s d e lo s c o m p u e s to s d e s c r ito s en e s te d o c u m e n to s o n c a p a c e s d e fo rm a r s a le s a c id a s y /o b a s ic a s s e g u n la p re s e n c ia d e g ru p o s a m in o y /o c a rb o x ilo o g ru p o s s im ila re s a lo s m is m o s .

L a s s a le s d e a d ic io n d e a c id o fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le s s e p u e d e n p re p a ra r a p a r t ir d e a c id o s in o rg a n ic o s y o rg a n ic o s . L a s s a le s d e a d ic io n d e a c id o re p re s e n ta t iv a s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, a c e ta to , a d ip a to , a lg in a to , c itra to , a s p a rta to , b e n z o a to , b e n c e n o s u lfo n a to , b is u lfa to , b u tira to , a lc a n fo ra to , a lc a n fo rs u lfo n a to , d ig lu c o n a to , g l ic e ro fo s fa to , h e m is u lfa to , h e p ta n o a to , h e x a n o a to , fu m a ra to , c lo rh id ra to , b ro m h id ra to , y o d h id ra to , 2 -h id ro x ie ta n o s u lfo n a to ( is o tio n a to ) , la c ta to , m a le a to , m e ta n o s u lfo n a to , n ic o t in a to , 2 -n a fta le n o s u lfo n a to , o x a la to , p a lm ito a to , p e c tin a to , p e rs u lfa to , 3 - fe n ilp ro p io n a to , p ic ra to , p iv a la to , p ro p io n a to , s u c c in a to , ta r tra to , t io c ia n a to , fo s fa to , g lu ta m a to , b ic a rb o n a to , p - to lu e n o s u lfo n a to y u n d e c a n o a to . L a s s a le s d e r iv a d a s d e a c id o s in o rg a n ic o s in c lu y e n a c id o c lo rh ld r ic o , a c id o b ro m h ld r ic o , a c id o s u lfu r ic o , a c id o n ltr ic o , a c id o fo s fo r ic o , y s im ila re s . L a s s a le s d e r iv a d a s d e a c id o s o rg a n ic o s in c lu y e n a c id o a c e tic o , a c id o p ro p io n ic o , a c id o g lic o lic o , a c id o p iru v ic o , a c id o o x a lic o , a c id o m a lic o , a c id o m a lo n ic o , a c id o s u c c ln ic o , a c id o m a le ic o , a c id o fu m a r ic o , a c id o ta r ta r ic o , a c id o c lt r ic o , a c id o b e n z o ic o , a c id o c in a m ic o , a c id o m a n d e lic o , a c id o m e ta n o s u lfo n ic o , a c id o e ta n o s u lfo n ic o , a c id o p - to lu e n o -s u lfo n ic o , a c id o s a lic ll ic o , y s im ila re s . Ejemplo s d e a c id o s que p u e d e n e m p le a rs e p a ra fo rm a r s a le s d e a d ic io n fa rm a c e u t ic a m e n te a c id o a c e p ta b le s in c lu y e n , p o r e je m p lo , un a c id o in o rg a n ic o , p o r e je m p lo , a c id o c lo rh ld r ic o , a c id o b ro m h ld r ic o , a c id o s u lfu r ic o , y a c id o fo s fo r ic o , y un a c id o o rg a n ic o , p o r e je m p lo , a c id o o x a lic o , a c id o m a le ic o , a c id o s u c c ln ic o y a c id o c ltr ic o .

L a s s a le s d e a d ic io n d e b a s e ta m b ie n s e p u e d e n p re p a ra r in s itu d u ra n te e l a is la m ie n to f in a l y la p u r if ic a c io n d e la fu e n te d e a c id o s a lic ll ic o , o h a c ie n d o re a c c io n a r un g ru p o que c o n t ie n e a c id o c a rb o x ll ic o co n u n a b a s e a d e c u a d a ta l c o m o h id ro x id o , c a rb o n a to o b ic a rb o n a to d e un c a tio n m e ta lic o fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le o c o n a m o n ia c o o u n a a m in a o rg a n ic a p r im a r ia , s e c u n d a r ia , o te rc ia r ia . L a s s a le s fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, c a t io n e s b a s a d o s e n m e ta le s a lc a lin o s o m e ta le s a lc a lin o te r re o s , ta le s c o m o s a le s d e lit io , s o d io , p o ta s io , c a lc io , m a g n e s io y a lu m in io , y s im ila re s , y a m o n ia c o c u a te rn a r io no to x ic o y c a t io n e s d e a m in a in c lu y e n d o a m o n io , te t ra m e tila m o n io , te t ra e t ila m o n io , m e t ila m o n io , d im e t ila m o n io , t r im e t ila m o n io , t r ie t i la m o n io , d ie t i la m o n io , y e t ila m o n io , e n tre o tro s . O tra s a m in a s o rg a n ic a s re p re s e n ta t iv a s u t ile s p a ra la fo rm a c io n d e s a le s d e a d ic io n d e b a s e in c lu y e n , p o r e je m p lo , e t i le n d ia m in a , e ta n o la m in a , d ie ta n o la m in a , p ip e r id in a , p ip e ra z in a , y s im ila re s . L a s s a le s d e r iv a d a s de b a s e s o rg a n ic a s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, s a le s d e a m in a s p r im a r ia s , s e c u n d a r ia s y te rc ia r ia s .

A d e m a s , lo s g ru p o s b a s ic o s que c o n t ie n e n n it ro g e n o s e p u e d e n c u a te rn iz a r c o n el a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n c o m o h a lu ro s d e a lq u ilo in fe r io r , ta le s c o m o c lo ru ro s , b ro m u ro s y y o d u ro s d e m e tilo , e tilo , p ro p ilo , y b u tilo ; h a lu ro s d e c a d e n a la rg a , ta le s c o m o c lo ru ro s , b ro m u ro s y y o d u ro s d e d e c ilo , la u r ilo , m ir is t i lo y e s te a r ilo ; h a lu ro s d e a r i la lq u ilo c o m o b ro m u ro s d e b e n c ilo y fe n e t i lo y o tro s . D e e s ta m a n e ra , s e o b t ie n e n p ro d u c to s s o lu b le s e n a g u a o s o lu b le s e n a c e ite o d is p e rs a b le s .

Formulaciones

S e g u n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a u n a c o m posición fa rm a c e u tic a e n la que la c o m posición c o m p re n d e un a n a lo g o d e g lu c a g o n d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , o u n a s a l fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le d e l m is m o , y un p o rta d o r fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le . T a l c o m o s e u t iliz a e n e s te d o c u m e n to , el te rm in o " p o r ta d o r fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le " in c lu y e cualquiera d e lo s p o r ta d o re s fa rm a c e u t ic o s e s ta n d a r , ta le s c o m o u n a s o lu c io n s a lin a ta m p o n a d a c o n fo s fa to , a g u a , e m u ls io n e s , ta le s c o m o u n a e m u ls io n d e a c e ite /a g u a o e m u ls io n d e a g u a /a c e ite y d iv e rs o s t ip o s d e a g e n te s h u m e c ta n te s . E l te rm in o ta m b ie n a b a rc a c u a lq u ie ra d e lo s a g e n te s a p ro b a d o s p o r u n a a g e n c ia re g u la d o ra d e l g o b ie rn o fe d e ra l d e lo s E E U U o in c lu id o s e n la F a rm a c o p e a d e lo s E s ta d o s U n id o s p a ra su u s o en a n im a le s , in c lu id o s lo s h u m a n o s .

L a c o m posición fa rm a c e u tic a p u e d e c o m p re n d e r c u a lq u ie r in g re d ie n te fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le , in c lu y e n d o , p o r e je m p lo , a g e n te s a c id if ic a n te s , a d it iv o s , a d s o rb e n te s , p ro p e le n te s d e a e ro s o le s , a g e n te s d e d e s p la z a m ie n to d e a ire , a g e n te s a lc a lin iz a n te s , a g e n te s a n t ia p e lm a z a n te s , a n t ic o a g u la n te s , c o n s e rv a n te s a n t im ic ro b ia n o s , a n tio x id a n te s , a n t is e p t ic o s , b a s e s , a g lu t in a n te s , a g e n te s d e ta m p o n a m ie n to , a g e n te s que la n te s , a g e n te s d e re c u b r im ie n to , a g e n te s c o lo ra n te s , d e s e c a n te s , d e te rg e n te s , d ilu y e n te s , d e s in fe c ta n te s , d is g re g a n te s , d is p e rs a n te s , a g e n te s p o te n c ia d o re s d e d is o lu c io n , c o lo ra n te s , e m o lie n te s , a g e n te s e m u ls io n a n te s , e s ta b i l iz a d o re s d e e m u ls io n , c a rg a s , a g e n te s fo rm a d o re s d e p e lic u la , p o te n c ia d o re s de l s a b o r, a g e n te s a ro m a tiz a n te s , p o te n c ia d o re s d e f lu jo , a g e n te s g e lif ic a n te s , a g e n te s d e g ra n u la c io n , h u m e c ta n te s , lu b r ic a n te s , m u c o a d h e s iv o s , b a s e s d e p o m a d a s , u n g u e n to s , v e h ic u lo s o le a g in o s o s , b a s e s o rg a n ic a s , b a s e s d e p a s tilla a , p ig m e n to s , p la s t if ic a n te s , a g e n te s d e p u lid o , c o n s e rv a n te s , a g e n te s s e c u e s tra n te s , a g e n te s d e p e n e tra c io n d e la p ie l, a g e n te s s o lu b il iz a n te s , d is o lv e n te s , a g e n te s e f ic a c e s p a ra c o m posición e s in y e c ta b le s s o n b ie n c o n o c id o s p a ra lo s e x p e r to s e n la te c n ic a (v e a s e , p o r e je m p lo , P h a rm a c e u t ic s a n d P h a rm a c y P ra c tic e , J .B . L ip p in c o tt C o m p a n y , P h ila d e lp h ia , P A , B a n k e r y C h a lm e rs , e d s ., p a g in a s 238 -250 (1982 ) y e l A S H P H a n d b o o k o n In je c ta b le D ru g s , T o is s e l, 4 a e d ., p a g in a s 622 -630 (1986 )).

A d e m a s , e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip t io n s e p u e d e d is p o n e r e n s u p o s ito r io s p a ra la a d m in is t r a t io n re c ta l m e d ia n te la m e z c la co n u n a v a r ie d a d d e b a s e s , ta le s c o m o b a s e s e m u ls io n a n te s o b a s e s s o lu b le s e n a g u a . L a s fo rm u la c io n e s a d e c u a d a s p a ra a d m in is tra c io n v a g in a l p u e d e n p re s e n ta rs e c o m o p e s a r io s , ta m p o n e s , c re m a s , g e le s , p a s ta s , e s p u m a s , o fo rm u la s d e p u lv e r iz a t io n q u e c o n t ie n e n , a d e m a s d e l p r in c ip io a c tiv o , p o r ta d o re s ta le s c o m o s e c o n o c e n e n la te c n ic a c o m o a p ro p ia d o s .

S e e n te n d e ra p o r un e x p e r to e n la te c n ic a que , a d e m a s d e la s c o m posición e s fa rm a c e u t ic a s d e s c r ita s a n te r io rm e n te , e l a n a lo g o d e la d e s c r ip c io n s e p u e d e fo rm u la r c o m o c o m p le jo s d e in c lu s io n , ta le s c o m o c o m p le jo s d e in c lu s io n d e c ic lo d e x tr in a , o lip o s o m a s .

Dosis

L o s a n a lo g o s d e la d e s c r ip c io n s e c re e que s o n u t ile s en p ro c e d im ie n to s d e tra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a en la que e l a g o n is m o de l re c e p to r d e G IP , c o a g o n is m o d e lo s re c e p to re s d e G IP /G L P -1 , c o a g o n is m o d e lo s re c e p to re s d e G IP /g lu c a g o n o tr ia g o n is m o d e lo s re c e p to re s d e G IP /G L P -1 /g lu c a g o n ju e g a n un p a p e l. P a ra lo s f in e s d e la d e s c r ip c io n , la c a n t id a d o d o s is de l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a d m in is tra d a d e b e s e r s u f ic ie n te p a ra e fe c tu a r , p o r e je m p lo , u n a re s p u e s ta te ra p e u t ic a o p ro f ila c t ic a , en el s u je to o a n im a l d u ra n te un in te rv a lo d e t ie m p o ra z o n a b le . P o r e je m p lo , la d o s is d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n d e b e s e r s u f ic ie n te p a ra e s t im u la r la s e c re t io n d e A M P c d e c e lu la s tal como se describe n e n e l p re s e n te d o c u m e n to o s u f ic ie n te p a ra d is m in u ir lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re , lo s n iv e le s d e g ra s a , lo s n iv e le s d e in g e s ta d e a lim e n to s , o e l p e s o c o rp o ra l d e un m a m lfe ro , e n un p e r lo d o d e d e a p ro x im a d a m e n te 1 a 4 m in u to s , d e 1 a 4 h o ra s o 1 a 4 s e m a n a s o m a s la rg o , p o r e je m p lo , d e 5 a 20 o m a s s e m a n a s , d e s d e e l m o m e n to d e la a d m in is tra c io n . E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , e l p e r lo d o d e t ie m p o p o d r la s e r in c lu s o m a s la rg o . L a d o s is s e d e te rm in a ra p o r la e f ic a c ia d e l a n a lo g o p a r t ic u la r d e la p re s e n te d e s c r ip c io n y la a fe c c io n de l a n im a l (p o r e je m p lo , h u m a n o ) , a s ! c o m o el p e s o c o rp o ra l de l a n im a l (p o r e je m p lo , h u m a n o ) a tra ta r .

En la te c n ic a s e c o n o c e n m u c h o s e n s a y o s p a ra la d e te r m in a t io n d e u n a d o s is a d m in is tra d a . P a ra lo s p ro p o s ito s de l p re s e n te d o c u m e n to , s e p o d r la u t i l iz a r un e n s a y o , q u e c o m p re n d e c o m p a ra r e l g ra d o e n q u e s e re d u c e n lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re t ra s la a d m in is tra c io n d e u n a d o s is d e te rm in a d a d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a un m a m lfe ro e n tre un c o n ju n to d e m a m lfe ro s , d e lo s c u a le s a c a d a d a d o s e a d m in is tra u n a d o s is d ife re n te d e l a n a lo g o , p a ra d e te rm in a r u n a d o s is d e in ic io p a ra s e r a d m in is t ra d a a un m a m lfe ro . El g ra d o e n q u e s e re d u c e n lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re d e s p u e s d e la a d m in is tra c io n d e u n a d e te rm in a d a d o s is p u e d e e n s a y a rs e m e d ia n te p ro c e d im ie n to s c o n o c id o s en la te c n ic a , in c lu y e n d o , p o r e je m p lo , lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n el p re s e n te d o c u m e n to e n e l Ejemplo 11.

L a d o s is de l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n ta m b ie n s e d e te rm in a ra m e d ia n te la e x is te n c ia , n a tu ra le z a y e x te n s io n d e c u a lq u ie r e fe c to s e c u n d a r io a d v e rs o q u e p u e d a a c o m p a n a r a la a d m in is tra c io n d e un a n a lo g o p a rt ic u la r d e la p re s e n te d e s c r ip c io n . T lp ic a m e n te , e l m e d ic o a c a rg o d e c id ira la d o s is de l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n c o n la que t r a ta r a c a d a p a c ie n te in d iv id u a l, te n ie n d o e n c u e n ta u n a v a r ie d a d d e fa c to re s , ta le s c o m o la e d a d , el p e s o c o rp o ra l, la s a lu d g e n e ra l, la d ie ta , e l s e x o , e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a a d m in is tra r , la v ia d e a d m in is tra c io n , y la g ra v e d a d d e la a fe c c io n a tra ta r . A m o d o d e e je m p lo , la d o s is d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,0001 a a p ro x im a d a m e n te 1 g /k g d e p e s o c o rp o ra l d e l s u je to a t ra ta r /d la , d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,0001 a a p ro x im a d a m e n te 0 ,001 g /k g d e p e s o c o rp o ra l/d la , o d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,01 m g a a p ro x im a d a m e n te 1 g /k g d e p e s o c o rp o ra l/d la . En re a liz a c io n e s d e e je m p lo , la d o s is p u e d e s e r u n a d o s is s e m a n a l to ta l d e a p ro x im a d a m e n te 1 m g a a p ro x im a d a m e n te 40 m g , o d e a p ro x im a d a m e n te 4 m g a a p ro x im a d a m e n te 30 m g , o d e a p ro x im a d a m e n te 4 a a p ro x im a d a m e n te 20 m g, o d e a p ro x im a d a m e n te 10 a a p ro x im a d a m e n te 20 m g, o d e a p ro x im a d a m e n te 12 m g a a p ro x im a d a m e n te 30 m g.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la c o m posición fa rm a c e u t ic a c o m p re n d e c u a lq u ie ra d e lo s a n a lo g o s d e s c r ito s e n el p re s e n te d o c u m e n to e n un n ive l d e p u re z a a d e c u a d o p a ra la a d m in is tra c io n a un p a c ie n te . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a n a lo g o t ie n e un n iv e l d e p u re z a d e a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te 90 % , a p ro x im a d a m e n te e l 91 % , a p ro x im a d a m e n te e l 92 % , a p ro x im a d a m e n te el 93 % , a p ro x im a d a m e n te el 94 % , a p ro x im a d a m e n te el 95 % , a p ro x im a d a m e n te e l 96 % , a p ro x im a d a m e n te e l 97 % , a p ro x im a d a m e n te e l 98 % o a p ro x im a d a m e n te e l 99 % , y un d ilu y e n te , p o r ta d o r o e x c ip ie n te fa rm a c e u t ic a m e n te a c e p ta b le . L a c o m posición fa rm a c e u tic a e n a lg u n o s a s p e c to s c o m p re n d e el a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a u n a c o n c e n t r a t io n d e a l m e n o s A , e n la q u e A e s d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,001 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 0 ,01 m g /m l, 0 a p ro x im a d a m e n te 1 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 1 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 2 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 3 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 4 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 5 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 6 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 7 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 8 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 9 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 10 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 11 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 12 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 13 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 14 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 15 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 16 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 17 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 18 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 19 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 20 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 21 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 22 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 23 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 24 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 25 m g /m l o m a y o r. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la c o m posición fa rm a c e u t ic a c o m p re n d e el a n a lo g o a u n a c o n c e n t ra t io n d e c o m o m a x im o B, e n la que B e s a p ro x im a d a m e n te 30 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 25 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 24 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 23 , m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 22 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 21 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 20 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 19 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 18 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 17 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 16 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 15 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 14 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 13 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 12 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 11 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 10 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 9 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 8 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 7 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 6 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 5 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 4 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 3 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 2 m g /m l, a p ro x im a d a m e n te 1 m g /m l, o a p ro x im a d a m e n te 0,1 m g /m l. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m posición e s p u e d e n c o n te n e r un a n a lo g o a un in te rv a lo d e c o n c e n tra c io n d e A a B m g /m l, p o r e je m p lo , d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,001 a a p ro x im a d a m e n te 30 ,0 m g /m l.

Formas dirigidas

U n e x p e r to e n la te c n ic a e n te n d e ra fa c i lm e n te que lo s a n a lo g o s d e la d e s c r ip t io n p u e d e n m o d if ic a rs e e n c u a lq u ie r n u m e ro d e fo rm a s , d e m a n e ra que la e f ic a c ia te ra p e u t ic a o p ro f ila c t ic a d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a u m e n te a t ra v e s d e la m o d if ic a t io n . P o r e je m p lo , e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n s e p u e d e c o n ju g a r d ire c ta o in d ire c ta m e n te a t ra v e s d e un e n la z a d o r a un g ru p o d e re c o n o c im ie n to . L a p ra c t ic a d e la c o n ju g a t io n d e c o m p u e s to s , p o r e je m p lo , a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , a g ru p o s d e re c o n o c im ie n to s e c o n o c e e n la te c n ic a . V e a s e , p o r e je m p lo , W a d h w a e t a l., J D ru g T a rg e t in g 3, 111 -127 (1995 ) y la p a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ° 5.087.616. El te rm in o "g ru p o d e re c o n c o m ie n to " , tal como s e u t iliz a e n e s te d o c u m e n to , s e re f ie re a c u a lq u ie r m o le c u la o a g e n te que re c o n o c e e s p e c lf ic a m e n te y s e u n e a un re c e p to r d e s u p e r f ic ie c e lu la r , d e m a n e ra que e l g ru p o d e re c o n o c im ie n to d ir ig e la l ib e r a t io n de l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a u n a p o b la c io n d e c e lu la s e n c u y a s u p e r f ic ie s e e x p re s a el re c e p to r (e l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 ). L o s g ru p o s d e re c o n o c im ie n to in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, a n tic u e rp o s , o f ra g m e n to s d e lo s m is m o s , p e p tid o s , h o rm o n a s , fa c to re s d e c re c im ie n to , c ito q u in a s , y o tro s lig a n d o s n a tu ra le s o n o n a tu ra le s , que s e u n e n a re c e p to re s d e la s u p e r f ic ie c e lu la r (p o r e je m p lo , re c e p to r d e l fa c to r d e c re c im ie n to e p ite lia l (E G F R ), re c e p to r d e c e lu la s T (T C R ), re c e p to r d e c e lu la s B (B C R ), C D 28 , re c p to r d e l fa c to r d e c re c im ie n to d e r iv a d o d e p la que ta s (P D G F ), re c e p to r d e a c e t ilc o lin a n ic o t ln ic o (n A C h R ), e tc .) . T a l c o m o s e u t iliz a e n e l p re s e n te d o c u m e n to un "e n la z a d o r " e s un e n la c e , m o le c u la o g ru p o d e m o le c u la s que u n e d o s e n t id a d e s s e p a ra d a s e n tre s i. L o s e n la z a d o re s p u e d e n p ro p o rc io n a r el e s p a c ia m ie n to o p t im o de las d o s e n t id a d e s , o p u e d e n s u m in is tr a r a d ic io n a lm e n te un e n la c e la b il que p e rm ite que la s d o s e n t id a d e s s e s e p a re n e n tre s i. L o s e n la c e s la b ile s in c lu y e n g ru p o s fo to e s c in d ib le s , g ru p o s la b ile s e n m e d io a c id o , g ru p o s la b ile s e n m e d io b a s ic o y g ru p o s e s c in d ib le s p o r e n z im a s . El te rm in o "e n la z a d o r " e n a lg u n a s re a liz a c io n e s s e re f ie re a c u a lq u ie r a g e n te o m o le c u la que u n e e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n a l g ru p o d e re c o n o c im ie n to . U n e x p e r to en la te c n ic a re c o n o c e que lo s s it io s e n e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , que no s o n n e c e s a r io s p a ra la fu n c io n de l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , s o n lu g a re s id e a le s p a ra la u n io n d e un e n la z a d o r y /o un g ru p o d e re c o n o c im ie n to , s ie m p re que e l e n la z a d o r y /o g ru p o d e re c o n o c im ie n to , u n a v e z u n id o s al a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , n o in te r f ie re n c o n la fu n c io n d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , e s d e c ir , la c a p a c id a d d e e s t im u la r la s e c re t io n d e A M P c d e la s c e lu la s , p a ra t r a ta r la d ia b e te s o la o b e s id a d .

Formulaciones de liberacion controlada

A lte rn a tiv a m e n te , lo s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to p u e d e n m o d if ic a rs e e n u n a fo rm a d e d e p o s ito , d e m a n e ra que la fo rm a e n que e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n s e lib e ra e n e l o rg a n is m o al que s e a d m in is tra e s ta c o n tro la d o c o n re s p e c to a l t ie m p o y la u b ic a c io n d e n tro d e la c u e rp o (v e a s e , p o r e je m p lo , la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ° 4.450.150 ) . L a s fo rm a s d e d e p o s ito d e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n p u e d e n s e r, p o r e je m p lo , u n a c o m posición im p la n ta b le que c o m p re n d e el a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n y un m a te r ia l p o ro s o o n o p o ro s o , tal como un p o llm e ro , e n e l que e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n e s e n c a p s u la d o p o r o d ifu n d id o p o r to d o e l m a te r ia l y /o la d e g ra d a t io n de l m a te r ia l n o p o ro s o . El d e p o s ito s e im p la n ta e n to n c e s e n la u b ic a c io n d e s e a d a d e n tro de l c u e rp o y e l a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip c io n s e lib e ra d e s d e el im p la n te a u n a v e lo c id a d p re d e te rm in a d a .

L a c o m posición fa rm a c e u t ic a e n a s p e c to s d e e je m p lo s e m o d if ic a p a ra te n e r c u a lq u ie r t ip o d e p e rfil d e lib e ra c io n in v iv o . E n a lg u n o s a s p e c to s , la c o m posición fa rm a c e u t ic a e s u n a fo rm u la t io n d e l ib e ra c io n in m e d ia ta , l ib e ra c io n c o n tro la d a , l ib e ra c io n s o s te n id a , lib e ra c io n p ro lo n g a d a , lib e ra c io n re ta rd a d a , o d e lib e ra c io n b ifa s ic a . L o s p ro c e d im ie n to s d e fo rm u la c io n d e p e p tid o s p a ra la lib e ra c io n c o n tro la d a s o n c o n o c id o s e n la te c n ic a . V e a s e , p o r e je m p lo , Q ia n e t a l, J P h a rm 374 : 46 -52 (2009 ) y la s p u b lic a c io n e s d e s o lic itu d d e P a te n te In te rn a c io n a l N ° W O 2008 /130158 , W O 2004 /033036 ; W O 2000 /032218 ; y W O 1999 /040942.

L a s p re s e n te s c o m posición e s p u e d e n c o m p re n d e r a d e m a s , p o r e je m p lo , m ic e la s o lip o s o m a s , o a lg u n a o tra fo rm a e n c a p s u la d a , o p u e d e n a d m in is tra rs e en u n a fo rm a d e l ib e ra c io n p ro lo n g a d a p a ra p ro p o rc io n a r un a lm a c e n a m ie n to p ro lo n g a d o y /o e fe c to d e l ib e ra c io n p ro lo n g a d o . L a s fo rm u la c io n e s fa rm a c e u t ic a s d e s c r ita s s e p u e d e n a d m in is t ra r s e g u n c u a lq u ie r re g im e n in c lu y e n d o , p o r e je m p lo , to d o s lo s d la s (1 v e z p o r d la , 2 v e c e s a l d la , 3 v e c e s a l d la , 4 v e c e s a l d la , 5 v e c e s a l d la , 6 v e c e s p o r d la ), t re s v e c e s p o r s e m a n a , c a d a d o s d la s , c a d a t re s d la s , c a d a c u a tro d la s , c a d a c in c o d la s , c a d a s e is d la s , s e m a n a l, q u in c e n a l, c a d a tre s s e m a n a s , m e n s u a l o b im e n s u a l.

Combinaciones

L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n a d m in is tra rs e s o lo s o e n c o m b in a c io n c o n o tro s a g e n te s te ra p e u t ic o s que t ie n e n c o m o o b je t iv o t r a ta r o p re v e n ir c u a lq u ie ra d e la s e n fe rm e d a d e s o a fe c c io n e s m e d ic a s d e s c r ita s e n e s te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , lo s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to p u e d e n s e r c o a d m in is t ra d o s c o n (s im u lta n e a o secuencia lm e n te ) un a g e n te a n t i-d ia b e t ic o o a n t i-o b e s id a d . L o s a g e n te s a n tid ia b e tic o s c o n o c id o s en la te c n ic a o b a jo in v e s t ig a t io n in c lu y e n la in s u lin a , la le p t in a , p e p tid o Y Y (P Y Y ), p a n c re a t ic o p e p tid o (P P ), fa c to r d e c re c im ie n to f ib ro b la s t ic o 21 (F G F 21 ) , a g o n is ta s d e lo s re c e p to re s Y 2 Y 4 , s u lfo n ilu re a s , ta le s c o m o to lb u ta m id a (O r in a s e ), a c e to h e x a m id a (D y m e lo r ) , to la z a m id a (T o lin a s e ), c lo rp ro p a m id a (D ia b in e s e ) , g lip iz id a (G lu c o tro l) , g l ib u r id a (D ia b e ta , M ic ro n a s e , G ly n a s e ), g lim e p ir id a (A m a ry l) , o g lic la z id a (D ia m ic ro n ) ; m e g lit in id a s , ta le s c o m o re p a g lin id a (P ra n d in ) o n a te g lin id a (S ta r lix ) ; b ig u a n id a s , ta le s c o m o m e tfo rm in a (G lu c o p h a g e ) o fe n fo rm in a ; t ia z o lid in d io n a s , ta le s c o m o ro s ig l ita z o n a (A v a n d ia ) , p io g lita z o n a (A c to s ) , o t ro g li ta z o n a (R e z u lin ) , u o tro s in h ib id o re s d e P P A R g ; in h ib id o re s d e la a lfa -g lu c o s id a s a que in h ib e n la d ig e s t io n d e h id ra to s d e c a rb o n o , ta le s c o m o el m ig lito l (G ly s e t) , a c a rb o s a (P re c o s e /a c a rb o s a ) ; e x e n a t id e (B y e tta ) o p ra m lin t id e ; in h ib id o re s d e d ip e p tid i l p e p tid a s a -4 (D P P -4 ), ta le s c o m o v ild a g lip t in a o s ita g lip t in a ; in h ib id o re s d e S G L t ( t ra n s p o r ta d o r d e g lu c o s a 1 d e p e n d ie n te d e s o d io ); a c t iv a d o re s d e la g lu c o q u in a s a (G K A ); a n ta g o n is ta s d e l re c e p to r d e g lu c a g o n (GR A ); o in h ib id o re s d e F B P a s a ( f ru c to s a 1 ,6 -b is fo s fa ta s a ) .

L o s a g e n te s a n t i-o b e s id a d c o n o c id o s e n la te c n ic a o b a jo in v e s t ig a c io n in c lu y e n s u p re s o re s de l a p e tito , in c lu y e n d o e s t im u la n te s d e t ip o fe n e t ila m in a , fe n te rm in a (o p c io n a lm e n te co n fe n f lu ra m in a o d e x fe n f lu ra m in a ) , d ie t i lp ro p io n (T e n u a te ® ), fe n d im e tra z in a (P re lu -2 ® , B o n tr il ® ), b e n z fe ta m in a (D id re x ® ), s ib u tra m in a (M e r id ia ® , R e d u c til ® ); r im o n a b a n t (A c o m p lia ® ), o tro s a n ta g o n is ta s d e lo s re c e p to re s d e c a n n a b in o id e s ; o x in to m o d u lin a ; c lo rh id ra to d e f lu o x e t in a (P ro z a c ) ; Q n e x a ( to p ira m a to y fe n te rm in a ) , E x c a lia (b u p ro p io n y z o n is a m id a ) o C o n tra v e (b u p ro p io n y n a lt re x o n a ), o in h ib id o re s d e lip a s a , s im ila r a X E N IC A L (O r lis ta t) o C e t il is ta t ( ta m b ie n c o n o c id o c o m o A T L - 962 ), o G T 389 -255.

L o s p e p tid o s d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to e n a lg u n a s re a liz a c io n e s s o n c o a d m in is t ra d o s co n un a g e n te p a ra el t ra ta m ie n to d e e n fe rm e d a d d e h lg a d o g ra s o n o a lc o h o lic o o N A S H . L o s a g e n te s u s a d o s p a ra t r a ta r la e n fe rm e d a d d e h lg a d o g ra s o no a lc o h o lic o in c lu y e n e l a c id o u rs o d e s o x ic o lic o ( ta m b ie n c o n o c id o c o m o A c t ig a ll, U R S O , y U rs o d io l) , m e tfo rm in a (G lu c o p h a g e ) , ro s ig l ita z o n a (A v a n d ia ) , C lo f ib ra to , G e m fib ro z ilo , P o lim ix in a B y B e ta ln a .

L o s p e p tid o s d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to , e n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e c o a d m in is tra n c o n un a g e n te p a ra el t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d n e u ro d e g e n e ra t iv a , p o r e je m p lo , la e n fe rm e d a d d e P a rk in s o n . L o s a g e n te s c o n tra la e n fe rm e d a d de l P a rk in s o n s o n c o n o c id o s a d e m a s e n la te c n ic a e in c lu y e n le v o d o p a , c a rb id o p a , a n tic o lin e rg ic o s , b ro m o c r ip t in a , p ra m ip e x o l, y ro p in iro l, a m a n ta d in a y ra s a g ilin a .

E n v is ta d e lo a n te r io r , la d e s c r ip c io n p ro p o rc io n a a d e m a s c o m posición e s fa rm a c e u t ic a s y k its que c o m p re n d e n , a d e m a s , u n o d e e s to s o tro s a g e n te s te ra p e u t ic o s . El a g e n te te ra p e u t ic o a d ic io n a l s e p u e d e a d m in is t ra r s im u lta n e a o secuencia lm e n te c o n el a n a lo g o d e la p re s e n te d e s c r ip t io n . E n a lg u n o s a s p e c to s , el a n a lo g o s e a d m in is t ra a n te s de l a g e n te te ra p e u t ic o a d ic io n a l, m ie n tra s que e n o tro s a s p e c to s , e l a n a lo g o s e a d m in is tra d e s p u e s d e l a g e n te te ra p e u t ic o a d ic io n a l.

Usos

E n b a s e a la in fo rm a t io n p ro p o rc io n a d a p o r p r im e ra v e z e n e l p re s e n te d o c u m e n to , s e c o n te m p la que la s c o m posición e s (p o r e je m p lo , c o m posición e s fa rm a c e u t ic a s re la c io n a d a s ) d e la p re s e n te d e s c r ip c io n s o n u t ile s p a ra e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a , e n la que p o r e je m p lo , la fa lta d e a c t iv id a d e n e l re c e p to r d e G IP , e l re c e p to r d e G L P -1 , o e n a m b o s re c e p to re s , e s un fa c to r e n la a p a r ic io n y /o p ro g re s io n d e la e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a . P o r c o n s ig u ie n te , la p re s e n te d e s c r ip c io n p ro p o rc io n a un p ro c e d im ie n to d e tra ta m ie n to o p re v e n c io n d e u n a e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a e n un p a c ie n te , d o n d e la e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a e s u n a e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a e n la que la fa lta d e a c t iv a t io n d e l re c e p to r d e G IP y /o a c t iv a t io n d e l re c e p to r de G L P -1 e s ta n a s o c ia d o s c o n la a p a r ic io n y /o p ro g re s io n d e la e n fe rm e d a d o la a fe c c io n m e d ic a . E l p ro c e d im ie n to c o m p re n d e p ro p o rc io n a r al p a c ie n te u n a c o m posición o c o n ju g a d o d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e lo s d e s c r ito s en e s te d o c u m e n to e n u n a c a n t id a d e f ic a z p a ra t r a ta r o p re v e n ir la e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a .

En a lg u n a s re a liz a c io n e s , la e n fe rm e d a d o a fe c c io n m e d ic a e s e l s ln d ro m e m e ta b o lic o . E l s ln d ro m e m e ta b o lic o , ta m b ie n c o n o c id o c o m o s ln d ro m e m e ta b o lic o X , s ln d ro m e d e re s is te n c ia a la in s u lin a o s ln d ro m e d e R e a v e n , e s un t ra s to rn o que a fe c ta a m a s d e 50 m illo n e s d e e s ta d o u n id e n s e s . E l s ln d ro m e m e ta b o lic o s e c a ra c te r iz a t lp ic a m e n te p o r u n a a g ru p a c io n d e al m e n o s tre s o m a s d e lo s s ig u ie n te s fa c to re s d e r ie s g o : ( 1 ) la o b e s id a d a b d o m in a l ( te jid o g ra s o e x c e s iv o e n y a lre d e d o r d e l a b d o m e n ), (2 ) la d is lip id e m ia a te ro g e n ic a ( t ra s to rn o s d e g ra s a e n la s a n g re in c lu y e n d o n iv e le s a lto s d e tr ig l ic e r id o s , b a jo c o le s te ro l H D L y a lto c o le s te ro l L D L que a u m e n ta n la a c u m u la c io n d e p la c a e n la s p a re d e s de las a r te r ia s ) , (3 ) la p re s io n a r te r ia l e le v a d a , (4 ) re s is te n c ia a la in s u lin a o in to le ra n c ia a la g lu c o s a , (5 ) e s ta d o p ro t ro m b o t ic o (p o r e je m p lo , a lto f ib r in o g e n o o in h ib id o r-1 d e l a c t iv a d o r d e p la s m in o g e n o en s a n g re ) , y (6 ) e s ta d o p ro in f la m a to r io (p o r e je m p lo , la p ro te ln a C re a c t iv a e le v a d a e n la s a n g re ) . O tro s fa c to re s d e r ie s g o p u e d e n in c lu ir e l e n v e je c im ie n to , d e s e q u il ib r io h o rm o n a l y la p re d is posición g e n e tic a .

T a l c o m o s e u t iliz a e n e l p re s e n te d o c u m e n to u n a c a n t id a d "e f ic a z " o u n a "c a n t id a d te ra p e u t ic a m e n te e f ic a z " d e un p e p tid o d e g lu c a g o n s e re f ie re a u n a c a n t id a d n o to x ic a p e ro s u f ic ie n te de l p e p tid o p a ra p ro p o rc io n a r e l e fe c to d e s e a d o . P o r e je m p lo , un e fe c to d e s e a d o s e r la la p re v e n c io n o e l t ra ta m ie n to d e la h ip o g lu c e m ia , tal como s e m id e , p o r e je m p lo , m e d ia n te un a u m e n to e n e l n iv e l d e g lu c o s a e n s a n g re . U n e fe c to d e s e a d o a lte rn a t iv o p a ra lo s p e p tid o s d e g lu c a g o n d e la p re s e n te d e s c r ip c io n in c lu ir la e l t ra ta m ie n to d e la h ip e rg lu c e m ia , p o r e je m p lo , m e d id o p o r un c a m b io e n e l n ive l d e g lu c o s a e n s a n g re c e rc a d e lo n o rm a l, o in d u c c io n d e la p e rd id a d e p e s o /p re v e n c io n de l a u m e n to d e p e s o , p o r e je m p lo , m e d id a m e d ia n te la re d u c c io n e n e l p e s o c o rp o ra l o p re v e n c io n o re d u c c io n d e un a u m e n to d e p e s o c o rp o ra l, o la n o rm a liz a c io n d e a l d is tr ib u c io n d e g ra s a c o rp o ra l. L a c a n t id a d q u e e s "e fic a z " v a r ia ra d e un s u je to a o tro , d e p e n d ie n d o d e la e d a d y el e s ta d o g e n e ra l d e la p e rs o n a , m o d o d e a d m in is tra c io n , y s im ila re s . P o r lo ta n to , n o s ie m p re e s p o s ib le e s p e c if ic a r u n a "c a n t id a d e f ic a z " e x a c ta . S in e m b a rg o , u n a c a n t id a d "e f ic a z " a p ro p ia d a e n c u a lq u ie r c a s o in d iv id u a l p u e d e s e r d e te rm in a d a p o r un e x p e r to h a b itu a l e n la te c n ic a u s a n d o e x p e r im e n ta c io n d e ru tin a .

SUJETOS

C o n re s p e c to a lo s p ro c e d im ie n to s a n te r io re s d e t ra ta m ie n to , e l p a c ie n te e s c u a lq u ie r h u e s p e d . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l h u e s p e d e s un m a m lfe ro . T a l c o m o s e u t iliz a e n e s te d o c u m e n to , e l te rm in o "m a m lfe ro " s e re f ie re a c u a lq u ie r a n im a l v e r te b ra d o d e la c la s e M a m m a lia , in c lu y e n d o c u a lq u ie ra d e lo s o rd e n e s d e m o n o tre m a s , m a rs u p ia l, y p la c e n ta r io s . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l m a m lfe ro e s u n o d e lo s m a m lfe ro s d e l o rd e n R o d e n tia , ta le s c o m o ra to n e s y h a m s te rs y m a m lfe ro s d e l o rd e n L o g o m o rp h a , ta le s c o m o c o n e jo s . E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , lo s m a m lfe ro s s o n de l o rd e n d e c a rn lv o ro s , que in c lu y e fe l in o s (g a to s ) y c a n in o s (p e r ro s ) . E n re a liz a c io n e s d e e je m p lo , lo s m a m lfe ro s s o n d e l o rd e n d e lo s a r t io d a c t ilo s , in c lu y e n d o b o v in o s (v a c a s ) y c o c h in o s (c e rd o s ) o de l o rd e n P e rs s o d a c ty la , in c lu id o s lo s e q u in o s (c a b a llo s ) . E n a lg u n o s c a s o s , lo s m a m lfe ro s s o n de l o rd e n d e lo s p r im a te s , C e b o id s , o S im o id s (m o n o s ) o d e la o rd e n d e lo s a n tro p o id e s (h u m a n o s y s im io s ) . E n re a liz a c io n e s p a rt ic u la re s , el m a m lfe ro e s un h u m a n o .

KITS

L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e la p re s e n te d e s c r ip c io n s e p u e d e n p ro p o rc io n a r d e a c u e rd o c o n u n a r e a l iz a t io n c o m o p a rte d e un kit. P o r c o n s ig u ie n te , e n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a un k it p a ra la a d m in is tra c io n d e un a n a lo g o d e g lu c a g o n a un p a c ie n te e n n e c e s id a d d e l m is m o , e n el q u e e l k it c o m p re n d e un a n a lo g o d e g lu c a g o n ta l c o m o se describe e n el p re s e n te d o c u m e n to .

En u n a re a liz a c io n , e l k it s e p ro p o rc io n a c o n un d is p o s it iv o p a ra a d m in is t ra r e l a n a lo g o d e g lu c a g o n a un p a c ie n te . El d is p o s it iv o , e n a lg u n o s a s p e c to s e s u n a a g u ja d e la je r in g a , d is p o s it iv o e n la p iz , in y e c to r d e c h o rro u o tro in y e c to r s in a g u ja . El k it p u e d e in c lu ir a lte rn a t iv a o a d ic io n a lm e n te u n o o m a s re c ip ie n te s , p o r e je m p lo , v ia le s , tu b o s , b o te lla s , je r in g a s p re c a rg a d a s in d iv id u a le s o d e m u lt ip le s c a m a ra s , c a r tu c h o s , b o m b a s d e in fu s io n ( im p la n ta b le s o e x te rn a s ) , in y e c to re s d e c h o rro , d is p o s it iv o s en la p iz p re c a rg a d o s y s im ila re s , q u e c o n t ie n e n o p c io n a lm e n te e l a n a lo g o d e g lu c a g o n e n u n a fo rm a lio f i l iz a d a o e n u n a s o lu t io n a c u o s a . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s k its ta m b ie n in c lu ira n in s t ru c c io n e s d e u s o . S e g u n u n a re a liz a c io n , el d is p o s it iv o d e l k it e s u n d is p o s it iv o d e d is p e n s a c io n e n a e ro s o l, en d o n d e la c o m posición v ie n e p re e n v a s a d a d e n tro d e l d is p o s it iv o d e a e ro s o l. E n o tra re a liz a c io n el k it c o m p re n d e u n a je r in g a y u n a a g u ja , y en u n a re a liz a c io n , la c o m posición d e g lu c a g o n e s te r il e s ta p re e n v a s a d a d e n tro d e la je r in g a .

L o s k its e n a lg u n a s re a liz a c io n e s c o m p re n d e n in s t ru c c io n e s d e u so . L a s in s tru c c io n e s e n a lg u n o s a s p e c to s in c lu y e n in s t ru c c io n e s p a ra s u u s o d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to . L a s in s t ru c c io n e s p u e d e n in c lu ir a d e m a s in s tru c c io n e s p a ra m a n te n e r u n a d ie ta s a n a y /o un p ro g ra m a d e e je rc ic io f ls ic o . L a s in s t ru c c io n e s p u e d e n e s ta r e n fo rm a d e un fo lle to d e p a p e l o e n fo rm a e le c tro n ic a , p o r e je m p lo , un d is p o s it iv o d e a lm a c e n a m ie n to le g ib le p o r o rd e n a d o r que c o m p re n d e la s in s tru c c io n e s .

L o s s ig u ie n te s e je m p lo s s e d a n m e ra m e n te p a ra ilu s tra r la p re s e n te in v e n t io n y d e n in g u n m o d o p a ra lim ita r su a lc a n c e .

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

A c o n t in u a t io n s e p ro p o rc io n a e je m p lo s d e p ro c e d im ie n to s d e s ln te s is d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o d e la p re s e n te d e s c r i p c io n .

Slntesis de fragmentos peptldicos de glucagon

Materiales:

T o d o s lo s p e p tid o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to e n lo s EJEMPLO S s e a m id a ro n a m e n o s q u e s e e s p e c if iq u e lo c o n tra r io .

S e u t il iz o re s in a M B H A ( re s in a d e 4 -m e t i lb e n z h id r i la m in a p o lie s t ire n o ) d u ra n te la s ln te s is d e p e p tid o s . L a re s in a M B H A , m a lla 100 -180 , p o lie s t ire n o re t ic u la d o c o n D V B al 1% ; c a rg a d e 0 ,7 a 1 ,0 m m o l/g ) , a m in o a c id o p ro te g id o s c o n B o c y p ro te g id o s co n F m o c s e a d q u ir ie ro n e n M id w e s t B io te c h . L a s s ln te s is d e p e p tid o s e n fa s e s o lid a u t iliz a n d o a m in o a c id o s p ro te g id o s c o n B o c s e re a liz a ro n e n un s in te t iz a d o r d e p e p tid o s A p p lie d B io s y s te m 430 A . L a s ln te s is d e a m in o a c id o s p ro te g id o s c o n F m o c s e re a liz o u t i l iz a n d o e l s in te t iz a d o r d e p e p tid o s A p p lie d B io s y s te m s M o d e lo 433.

Slntesis de peptidos (aminoacidos Boc/escision con HF):

L a s ln te s is d e e s to s a n a lo g o s s e re a liz o e n e l s in te t iz a d o r d e p e p tid o s A p p lie d B io s y s te m M o d e lo 430 A . L o s p e p tid o s s in te t ic o s s e c o n s tru y e ro n m e d ia n te la a d ic io n secuencia l de aminoácidos a un c a r tu c h o que c o n te n la 2 m m o l d e a m in o a c id o p ro te g id o c o n B oc. E s p e c lf ic a m e n te , la s ln te s is s e lle v o a c a b o u t il iz a n d o a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s c o n D E P B T B o c . A l f in a l d e la e ta p a d e a c o p la m ie n to , la p e p tid i l- re s in a s e t o n T F A p a ra e l im in a r el g ru p o p ro te c to r B o c N - te rm in a l. S e la v o v a r ia s v e c e s c o n d im e t il fo rm a m id a (D M F ) y e s te c ic lo re p e t it iv o s e re p it io el n u m e ro d e s e a d o d e e ta p a s d e a c o p la m ie n to . D e s p u e s d e l e n s a m b la je , s e e lim in o la p ro te c t io n d e la c a d e n a la te ra l, F m o c , m e d ia n te tra ta m ie n to c o n p ip e r id in a a l 20 % y la a c ila c io n s e re a liz o u t i l iz a n d o D IC . L a p e p tid i l- re s in a al fin a l dd ee llaas s ln te s is c o m p le ta s e s e c o m e d ia n te e l u so d e d ic lo ro m e ta n o (D C M ), y e l p e p tid o s e e s c in d io d e la re s in a c o n H F a n h id ro .

P a ra la la c ta m iz a c io n , s e s e le c c io n a ro n lo s g ru p o s p ro te c to re s o r to g o n a le s p a ra G lu y L ys (p o r e je m p lo , G lu (F m ), L ys (F m o c )) . D e s p u e s d e la e l im in a t io n d e lo s g ru p o s p ro te c to re s y a n te s d e e s c is io n c o n H F , la c ic la c io n s e re a liz o tal como s e d e s c r ib io a n te r io rm e n te (v e a s e , p o r e je m p lo , la P u b l ic a t io n d e s o lic itu d d e P a te n te In te rn a c io n a l N o. W O 2008 /101017 ) .

Tratamiento con HF de la peptidil-resina

L a p e p tid i l- re s in a s e tra to co n f lu o ru ro d e h id ro g e n o a n h id ro (H F ), y e s to n o rm a lm e n te p ro d u jo a p ro x im a d a m e n te 350 m g (~ 50 % d e re n d im ie n to ) d e un p e p tid o d e s p ro te g id o c ru d o . E s p e c lf ic a m e n te , la p e p tid i l- re s in a (30 m g a 200 m g) s e c o lo c o e n e l re c ip ie n te d e r e a c t io n c o n H F p a ra la e s c is io n . S e a n a d ie ro n 500 ml d e p -c re s o l al re c ip ie n te c o m o un a t ra p a d o r d e io n e s c a rb o n io . E l re c ip ie n te s e c o n e c to a l s is te m a H F y s u m e rg io e n la m e z c la de m e ta n o l/h ie lo s e c o . El re c ip ie n te s e e v a c u o c o n u n a b o m b a d e v a c lo y s e s e p a ra ro n p o r d e s t ila c io n 10 m l d e H F al re c ip ie n te d e re a c c io n . E s ta m e z c la d e re a c c io n d e la p e p tid i l- re s in a y e l H F s e a g ito d u ra n te u n a h o ra a 0 °C , d e s p u e s d e lo c u a l s e c re o un v a c lo y e l H F fu e e v a c u a d o ra p id a m e n te (10 -15 m in ). El re c ip ie n te s e re t iro c u id a d o s a m e n te y s e lle n o co n a p ro x im a d a m e n te 35 m l d e e te r p a ra p re c ip ita r e l p e p tid o y p a ra e x tra e r e l p -c re s o l y g ru p o s p ro te c to re s o rg a n ic o s d e m o le c u la s p e que n a s re s u lta n te s d e l t ra ta m ie n to c o n H F . E s ta m e z c la s e f i lt ro u t i l iz a n d o un f i lt r o d e te f lo n y s e re p it io d o s v e c e s p a ra e lim in a r to d o e l e x c e s o d e c re s o l. E s te f i lt r a d o s e d e s e c h o . El p e p tid o p re c ip ita d o s e d is u e lv e e n a p ro x im a d a m e n te 20 m l d e a c id o a c e t ic o a l 10 % (a q ). E s te f i lt ra d o , que c o n te n la e l p e p tid o d e s e a d o , s e re c o g io y s e lio filiz o .

U n a n a lis is d e H P L C a n a llt ic a d e l p e p tid o s o lu b il iz a d o e n b ru to s e lle v o a c a b o b a jo la s s ig u ie n te s c o n d ic io n e s [4 ,6 X 30 m m X te r ra C 8 , 1 ,50 m l/m in , 220 nm , ta m p o n A d e a c id o t r i f lu o ro a c e t ic o (T F A ) a l 0 ,1 % /a c r i lo n itr i lo (C A N ) a l 10% , ta m p o n B T F A al 0,1 % /100 % d e A C N , g ra d ie n te 5 -95 % d e B d u ra n te 15 m in u to s ]. El e x tra c to s e d ilu y o d o s v e c e s c o n a g u a y s e c a rg o e n u n a c o lu m n a d e fa s e in v e rs a p re p a ra tiv a 2 ,2 X 25 cm V y d a c C 4 y s e e lu y o u s a n d o un g ra d ie n te d e a c e to n it r i lo e n un s is te m a W a te rs H P L C ( ta m p o n A d e T F A al 0 ,1 % /A C N al 10 % , ta m p o n B d e T F A al 0 ,1 % /A C N al 10 % y un g ra d ie n te d e 0 a 100 % d e B d u ra n te 120 m in u to s a un c a u d a l d e 15 ,00 m l/m in . El a n a lis is p o r H P L C d e l p e p tid o p u r if ic a d o m o s tro u n a p u re z a m a y o r d e l 95 % y s e u t iliz o e l a n a lis is d e e s p e c tro d e m a s a s p o r io n iz a t io n c o n e le c t ro s p ra y p a ra c o n f irm a r la id e n t id a d d e l p e p tid o .

Acilacion de peptidos

L o s p e p tid o s a c ila d o s s e p re p a ra ro n d e la s ig u ie n te m a n e ra . L o s p e p tid o s s e s in te t iz a ro n s o b re u n a re s in a d e s o p o r te s o lid o u t i l iz a n d o un s in te t iz a d o r d e p e p tid o s C S B io 4886 o A p p lie d B io s y s te m s 430 A . S e u t iliz o q u lm ic a d e n e u tr a l iz a t io n tal como se describe p o r S c h n o lz e r e t a l., In t. J. P e p t id e P ro te in R e s . 40 : 180 -193 (1992 ) . P a ra lo s p e p tid o s a c ila d o s , e l re s id u o d e a m in o a c id o o b je t iv o p a ra s e r a c ila d o (p o r e je m p lo , la posición d ie z , c o n re s p e c to a la ^{n u m e ra t io n d e p o s ic io n d e lo s a m in o a c id o s d e S E Q}Id ^{N O : 3 ) fu e s u s t itu id o p o r un re s id u o d e lis in a F m o c N e p s ilo n .}E l t ra ta m ie n to d e l p e p tid o p ro te g id o c o n B O C N - te rm in a l c o m p le ta d o c o n p ip e r id in a a l 20 % e n D M F d u ra n te 30 m in u to s e l im in o F M O C /g ru p o s fo rm ilo . El a c o p la m ie n to a l re s id u o d e lis in a c o n e p s ilo n a m in o lib re s e lo g ro m e d ia n te e l a c o p la m ie n to d e un e x c e s o m o la r d e d ie z v e c e s d e c u a lq u ie ra d e un a m in o a c id o e s p a c ia d o r p ro te g id o c o n F m o c ^{(p o r e je m p lo , F M O C -G lu -O tB u ) o d e la c a d e n a d e a c ilo (p o r e je m p lo C H}3^{(C H}2⁾14^{-C O O H ) y re a c t iv o d e a c o p la m ie n to}P y B O P o D E P B T e n D M F /N ,N -d iis o p ro p ile t i la m in a (D IE A ). L a e l im in a c io n p o s te r io r de l g ru p o F M O C d e l a m in o a c id o e s p a c ia d o r e s s e g u id o p o r la re p e t i t io n d e l a c o p la m ie n to c o n u n a c a d e n a d e a c ilo . El t ra ta m ie n to f in a l c o n 100 % d e T F A d a c o m o re s u lta d o la e l im in a c io n d e c u a lq u ie r g ru p o p ro te c to r d e c a d e n a la te ra l y e l g ru p o B O C N - te rm in a l. L a s re s in a s d e p e p tid o s e n e u tra liz a ro n c o n D IE A al 5 % /D M F , s e s e c a ro n , y d e s p u e s s e e s c in d ie ro n d e l s o p o r te u t i l iz a n d o H F /p -c re s o l, 95 : 5, a 0 °C d u ra n te u n a h o ra . D e s p u e s d e e x t ra c t io n co n e te r, s e u t iliz o u n a s o lu t io n (H O A c ) a l 5 % d e a c id o a c e t ic o p a ra s o lv a ta r e l p e p tid o e n b ru to . A c o n t in u a t io n , s e v e r i f ic o u n a m u e s tra d e la s o lu c io n p a ra que c o n te n g a e l p e p tid o d e p e s o m o le c u la r c o r re c to p o r E S I-M S . L o p e p tid o s c o r re c to s s e p u r if ic a ro n m e d ia n te R P

d e l a c o p la m ie n to c o n u n a c a d e n a d e a c ilo . El t ra ta m ie n to fin a l co n 100 % d e T F A d a c o m o re s u lta d o la e lim in a c io n d e c u a lq u ie r g ru p o p ro te c to r d e c a d e n a la te ra l y e l g ru p o B O C N - te rm in a l. L a s re s in a s d e p e p tid o s e n e u tra liz a n co n D IE A al 5 % /D M F , s e s e c a n , y d e s p u e s s e e s c in d e n d e l s o p o r te u t iliz a n d o H F /p -c re s o l, 95 :5 , a 0 °C d u ra n te u n a h o ra . D e s p u e s d e e x tra c c io n c o n e te r, s e u t iliz a u n a s o lu c io n (H O A c ) a l 5 % d e a c id o a c e t ic o p a ra s o lv a ta r e l p e p tid o en b ru to . A c o n tin u a c io n , s e v e r if ic a u n a m u e s tra d e la s o lu c io n p a ra que c o n te n g a e l p e p tid o d e p e s o m o le c u la r c o r re c to p o r E S I-M S . L o s p e p tid o s c o r re c to s s e p u r if ic a n m e d ia n te R P -H P L C u s a n d o un g ra d ie n te lin e a l d e C H 3 C N ^{al 10 % /T F A al 0 ,1 % a}TfA ^{al 0 ,1 % e n 100 % d e C H 3 C N . S e u t iliz a u n a c o lu m n a d e p ro te ln a s V y d a c C 18 22 m m x}250 m m p a ra la p u r if ic a c io n . L o s a n a lo g o s p e p t ld ic o s a c ila d o s g e n e ra lm e n te c o m p le ta n la e lu c io n m e d ia n te u n a re la c io n d e ta m p o n 20 :80. L a s p o rc io n e s s e a g ru p a n y s e c o m p ru e b a la p u re z a e n u n a R P -H P L C a n a llt ic a . L a s f r a c c io n e s p u ra s s e lio f i l iz a n p ro p o rc io n a n d o p e p tid o s s o lid o s b la n c o s .

E n lo s c a s o s d e a c ila c io n e s d o b le s d e d o s s it io s o d e s it io u n ico , la s d o s c a d e n a s d e a c ilo a s e r a c o p la d a s a l p e p tid o p u e d e n s e r la s m is m a s o d ife re n te s . E n e l c a s o d e d o s c a d e n a s d e a c ilo d ife re n te s , e l a m in o a c id o o a m in o a c id o s o b je t iv o p a ra s e r a c ila d o s s e s u s t itu y e n p o r d o s g ru p o s p ro te c to re s d ife re n te s . P o r e je m p lo , un re s id u o d e lis in a F m o c N e p s ilo n y un re s id u o d e lis in a iv D d e N e p s ilo n (d o b le a c ila c io n d e d o s s it io s ) o u n a L y s F M O C ( iv D d e ) -O H (d o b le a c ila c io n d e s it io u n ic o , 852.082 N o v a b io c h e m ) . E l t ra ta m ie n to d e l p e p tid o p ro te g id o co n B O C N - te rm in a l c o m p le ta d o c o n p ip e r id in a a l 20 % e n D M F d u ra n te 30 m in u to s e lim in o F M O C /g ru p o s fo rm ilo . El re s id u o d e lis in a co n e p s ilo n a m in o lib re s e a c o p la c o n un g ru p o a c ilo o a m in o a c id o e s p a c ia d o r s e g u id o d e a c o p la m ie n to a un g ru p o a c ilo . E l p e p tid o a c ila d o u n ic o re s u lta n te s e tra ta c o n h id ra c in a a l 2 % /D M F p a ra e lim in a r e l g ru p o p ro te c to r ( iv D d e ). El re s id u o L y s c o n a m in o lib re s e a c o p la c o n un g ru p o a c ilo o un a m in o a c id o e s p a c ia d o r s e g u id o d e a c o p la m ie n to a un g ru p o a c ilo . S e a ls la e l p e p tid o a c ila d o d o b le c o m o se describe a n te r io rm e n te .

U n Ejemplo d e s ln te s is d e un p e p tid o a c ila d o d u a l (G lu c a g o n A ib 2 E 16 A 18 L 27 D 28 C e x K 40 (C 16 g a m m a E K -g a m m a E C 12 ) G 41 -a m id a , que t ie n e la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N O : 211 ) s e m u e s tra e n la f ig u ra 5 B y se describe a d ic io n a lm e n te a c o n t in u a c io n :

0 ,28 g m (0 ,2 m m o l) re s in a d e M B H A (M id w e s t B io te c h ) s e c o lo c o e n un re c ip ie n te d e re a c c io n y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo e n un s in te t iz a d o r C S B io 336 u s a n d o a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s D E P B T /D IE A d e a m in o a c id o s c o n B oc.

B o c -H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (F m o c )G - re s in a m b h a

El p e p tid o - re s in a p ro te g id o co n B o c s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n m a n u a l y s e tra to c o n p ip e r id in a al 20 % /D M F a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in . L a re s in a s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F 3 v e c e s , y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c L ys ( iv D d e )-O H (E M D -N o v a b io c h e m ) (p re p a ra d a p re v ia m e n te d is o lv ie n d o 2 m m o l de ^{F m o c L y s ( iv D d e ) e n 4 ,0 m l}dEp BT/Dm F ^{0 ,5 M y s e a n a d ie ro n 0 ,35 m l (2 m m o l) d e D IE A .}

El p e p tid o - re s in a s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 16 h, d e s p u e s s e f iltro , s e la v o c o n D M F y s e tra to co n p ip e r id in a a l 20 % /D M F d u ra n te 10 m in . L a re s in a s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F v a r ia s v e c e s , y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c -G lu -O B z l (p re p a ra d a p re v ia m e n te d is o lv ie n d o 2 m m o l d e F m o c -G lu O B z l e n 4 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y s e a n a d ie ro n 0 ,35 m l d e D IE A ). La re a c c io n s e m e z c lo 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te , d e s p u e s s e f i lt r o y la re s in a s e la v o c o n D M F . D e s p u e s d e o tro t ra ta m ie n to c o n 20 % p ip /D M F , la re s in a s e la v o c o n D M F v a r ia s v e c e s , y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e a c id o p a lm lt ic o p a ra c o m p le ta r la a c ila c io n d e la a m in a a lfa d e la L y s e n c a d e n a la te ra l e n la posición 40 (p re p a ra d a p re v ia m e n te d is o lv ie n d o 2 m m o l d e a c id o p a lm lt ic o e n 4 ,0 m l d e D E P B T /D M F 0 ,5 M y la a d ic io n d e 0 ,35 m l d e D IE A ). L a re a c c io n s e m e z c lo d u ra n te 1 h o ra .

El p e p tid o - re s in a s e f i lt ro , s e la v o c o n D M F y s e t ra to c o n h id ra c in a a l 2 % /D M F a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 15 m in u to s , e l f i l t r a d o s e la v o co n D M F v a r ia s v e c e s . S e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c -G lu -O B z l ( ig u a l que el a n te r io r ) y la re a c c io n s e m e z c lo d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a re s in a s e d iv id io e n t re s p o rc io n e s p a ra la a c ila c io n f in a l e n la a m in a e p s ilo n d e lis in a . E n e s te c a s o , a u n a p o rc io n s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e a c id o d o c e c a n o ic o . S e a n a d io p re v ia m e n te p re p a ra d a m e d ia n te d is o lu c io n d e 1 m m o l d e a c id o d o d e c a n o ic o (A ld r ic h ) en 2 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y s e a n a d io 0 ,175 m l d e D IE A . La re a c c io n s e m e z c lo 1 h o ra , s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F , a c o n t in u a c io n c o n d ic lo ro m e ta n o . El g ru p o B o c N - te rm in a l s e e lim in o en e l t ra ta m ie n to c o n T F A al 50 % /D C M , y d e s p u e s d e la n e u tra liz a c io n c o n D IE A al 5 % /D C M , s e re a liz o u n a e s c is io n c o n H F e n un b a n o d e h ie lo d u ra n te 1 h o ra u s a n d o p -c re s o l c o m o un a g e n te a t ra p a d o r. D e s p u e s d e la e v a p o ra c io n de l H F , e l re s id u o s e s u s p e n d io e n e te r e t l l ic o y la m e z c la d e p e p tid o /re s in a s e f i lt r o y s e la v o co n e te r. E l p e p tid o s e e x tra jo en a c id o a c e t ic o a c u o s o y se a n a liz o e n H P L C . (4.6 x 50 m m Z o rb a x S B -C 8 , 1 m l/m in , 45 °C , 214 nm (0 ,5 A ) A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % . El e x tra c to d e e s c is io n re s ta n te s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 21 ,2 x 250 m m y s e d e s a rro llo un g ra d ie n te d e T F A al 0 ,1 % /a c e to n it r i lo e n u n a F P L C P h a rm a c ia p a ra la p u r if ic a c io n .

L a s fra c c io n e s 83 -86 s e c o m b in a ro n , c o n g e la ro n y lio f i l iz a ro n p a ra d a r 22 ,3 m g de l p e p tid o de SEQ ID N O : 211 c o n u n a p u re z a d e 90 % . P. m o l te o r ic o = 5202 ,9 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I = 5202 ,0

Acilacion de peptidos a traves de succinoilacion

L o s p e p tid o s s u c c in o ila d o s s e p re p a ra n d e la s ig u ie n te m a n e ra . L o s p e p tid o s s e s in te t iz a n s o b re u n a re s in a d e s o p o r te s o lid o u t i l iz a n d o un s in te t iz a d o r d e p e p tid o s C S B io 4886 o A p p lie d B io s y s te m s 430 A . S e u t iliz a q u lm ic a d e n e u tra liz a c io n tal como se describe p o r S c h n o lz e r e t a l . , In t. J. P e p tid e P ro te in R e s . 40 : 180 -193 (1992 ). P a ra lo s p e p tid o s s u c c in o ila d o s , e l re s id u o d e a m in o a c id o o b je t iv o p a ra s e r a c ila d o (p o r e je m p lo , la posición d ie z , co n re s p e c to a la n u m e ra c io n d e posición d e lo s a m in o a c id o s de SEQ ID N O : 3 ) s e s u s t itu y e p o r un re s id u o d e lis in a F m o c N e p s ilo n . El t ra ta m ie n to de l p e p tid o p ro te g id o co n B O C N - te rm in a l c o m p le ta d o co n p ip e r id in a a l 20 % e n D M F d u ra n te 30 m in u to s e lim in a F M O C /g ru p o s fo rm ilo . L a re s in a s e f i lt ra , s e la v a co n D M F /D C M y s e re s u s p e n d e en D C M . El a c o p la m ie n to a l re s id u o d e lis in a c o n e p s ilo n a m in o lib re s e lo g ra m e d ia n te e l a c o p la m ie n to d e un e x c e s o m o la r d e d ie z v e c e s d e a n h ld r id o d e n -h e x a d e c ils u c c ln ic o (T C I) ju n to c o n 4 -d im e t ila m in o p ird in a . L a re s in a s e m e z c la d u ra n te la n o c h e , s e f ilt ra , s e la v a c o n D C M y s e tra ta c o n T F A al 50 % /D C M p a ra la e l im in a t io n d e c u a lq u ie r g ru p o p ro te c to r d e c a d e n a la te ra l y e l g ru p o B O C N - te rm in a l. L a s re s in a s d e p e p tid o s e n e u tra liz a n c o n D IE A al 5 % /D M F , s e s e c a n , y d e s p u e s s e e s c in d e n d e l s o p o r te u t i l iz a n d o H F /p -c re s o l, 95 :5 , a 0 °C d u ra n te u n a h o ra . D e s p u e s d e e x t ra c t io n co n e te r, s e u t iliz a u n a s o lu t io n (H O A c ) a l 5 % d e a c id o a c e t ic o p a ra s o lv a ta r e l p e p tid o e n b ru to . A c o n t in u a t io n , s e v e r i f ic a u n a m u e s tra d e la s o lu c io n m e d ia n te a n a lis is d e H P L C . L a s o lu c io n d e a c id o a c e tic o re s ta n te s e c a rg a e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m 10 x 250 m m X T 20 p a ra la p u r if ic a t io n . S e d e s a rro lla un g ra d ie n te de T F A a c u o s o /A C N m ie n tra s s e re c o g e n fra c c io n e s y s e c o n tro la U V a 214 nm . L a s fra c c io n e s p u ra s s e lio f iliz a n , p ro d u c ie n d o p e p tid o s s o lid o s .

U n e je m p lo d e s ln te s is d e un p e p tid o s u c c in o ila d o (G lu c a g o n A ib 2 E 16 A 18 L 27 D 28 C e x K 40 (C 16 s u c c in o il) G 41 -a m id a que t ie n e la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N O : 156 ) s e m u e s tra e n la f ig u ra 3 C y se describe a d ic io n a lm e n te a c o n t in u a c io n :

0 ,28 g (0 ,2 m m o l) d e re s in a d e m b h a (M id w e s t B io te c h ) s e c o lo c a ro n en un re c ip ie n te d e r e a c t io n y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo en un s in te t iz a d o r C S B io 336 u s a n d o a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s p o r D E P B T /D IE A . B o c -H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (F m o c )G - re s in a m b h a .

A p ro x im a d a m e n te , un te rc io d e la re s in a d e p e o tid o p ro te g id a c o n B o c s e t ra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n m a n u a l y s e tra to co n p ip e r id in a a l 20 % /D M F a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in . La re s in a s e f ilt ro , s e la v o co n D M F 3 v e c e s , c o n d ic lo ro m e ta n o d o s v e c e s y s e re s u s p e n d io e n 10 m l d e D C M . S e a n a d ie ro n 324 m g (1 m m o l) d e a n h ld r id o d e n -h e x a d e c ils u c c ln ic o (T C I) , ju n to c o n 2 -3 m g d e 4 -d im e t i la m in o p ir id in a (A ld r ic h ).

L a re s in a s e m e z c lo d u ra n te u n a n o c h e a te m p e ra tu ra a m b ie n te a n te s d e f ilt ra r , la v a r c o n D C M d o s v e c e s , y el t ra ta m ie n to c o n T F A al 50 % /D C M d u ra n te 1 -2 m in . L a re s in a s e f ilt ro , s e la v o v a r ia s v e c e s c o n D C M , s e n e u tra liz o m e d ia n te la v a d o co n 5 % D IE A /D C M y s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n H F . S e re a liz o u n a e s c is io n c o n H F u t il iz a n d o 5 m l d e f lu o ru ro d e h id ro g e n o l lq u id o y 0 ,5 m l d e a t ra p a d o r d e p -c re s o l. D e s p u e s d e a g ita r 1 h o ra e n un b a n o d e h ie lo , e l H F s e e lim in o a l v a c lo y e l re s id u o s e s u s p e n d io e n e te r e t l l ic o . La s u s p e n s io n s e f i lt r o u s a n d o un e m b u d o d e v id r io s in te r iz a d o , lo s s o lid o s s e la v a ro n c o n e te r, y e l p e p tid o s e e x tra jo en 15 m l d e a c id o a c e tic o a c u o s o a l 50 % . D e s p u e s d e l a n a lis is e n H P L C (Z o rb a x S B -C 8 4 ,6 x 50 m m , 1 m l/m in , 45 °C , 214 nm , A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % , g ra d ie n te = 30 % d e B a 90 % d e B d u ra n te 10 m in ), e l e x tra c to d e e s c is io n s e c a rg o en u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 21 ,2 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n . S e re a liz o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /a c e to n it r i lo m ie n trs s e re c o g la n la s f ra c c io n e s y s e c o n tro la b a la a b s o rb a n c ia U V . L a s fra c c io n e s 55 -56 se id e n t if ic a ro n c o m o un s o lo c o m p o n e n te y s e c o n g e la ro n y s e lio f i l iz a ro n . S e re c u p e ra ro n 32 ,5 m g c o n u n a p u re z a d e 90 % (D L S -027 -68 B ) . P. m o l te o r ic o = 4720 ,3 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I = 4717 ,0

Alquilacion de peptidos (por ejemplo, S-alquilacion)

U n Ejemplo d e s ln te s is d e un p e p tid o a lq u ila d o (p o r e je m p lo , S -a lq u ila d o ) (G lu c a g o n A ib 2 E 16 A 18 L 27 D 29 C e x C y s 40 (S -2 p a lm iti l) a m id a que t ie n e u n a secuencia de aminoácidos de SEQ ID N O : 164 ) s e m u e s tra en la F ig u ra 6 y se describe a d ic io n a lm e n te a c o n tin u a c io n :

0 ,28 g 0 ,2 m m o l d e re s in a m b h a (M id w e s t B io te c h ) s e c o lo c a ro n e n un re c ip ie n te d e re a c c io n C S B io y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo e n un s in te t iz a d o r C S B io 336 u t il iz a n d o a m in o a c id o s B o c y a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s p o r D E P B T /D IE A .

H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S C -a m id a

El p e p tid o - re s in a s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n c o n H F y s e re a liz o u n a e s c is io n co n H F u t il iz a n d o 10 m l d e f lu o ru ro d e h id ro g e n o llq u id o y 1 m l d e a t ra p a d o r d e p -c re s o l e n un b a n o d e h ie lo d u ra n te 1 h o ra . D e s p u e s d e e v a p o ra r el H F , e l re s id u o s e s u s p e n d io e n e te r e t l l ic o y e l p e p tid o y la re s in a s e f i lt ra ro n e n un e m b u d o d e v id r io s in te r iz a d o . D e s p u e s d e la v a r c o n e te r e t l l ic o y s e c a d o al a ire ra p id a m e n te , e l p e p tid o s e e x tra jo e n a c id o a c e tic o a c u o s o a l 50 % . D e s p u e s d e l a n a lis is m e d ia n te H P L C (Z o rb a x S B -C 8 4 ,6 x 50 m m , 1 m l/m in , 45 °C , 214 nm , A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % , 30 % a 90 % d e B d u ra n te 10 m in u to s ) , e l e x tra c to d e e s c is io n s e d ilu y o 3 -4 c o n a g u a y s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 22 ,2 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n u s a n d o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /C A N . U n g ru p o in ic ia l s e v o lv io a p u r if ic a r s o b re la m is m a c o lu m n a p a ra d a r 79 m g d e 95 % d e p u re z a . p .m o l te o r ic o = 4313 ,7 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I = 4312 ,0

S e s u s p e n d ie ro n 16 m g (3 ,7 m m o le s ) d e l p e p tid o d e t io l lib re a n te r io r e n 1 m l d e m e ta n o l y , c o n a g ita t io n , b a jo u n a c o r r ie n te d e n itro g e n o , s e a n a d ie ro n 1 ,5 ml d e te t ra m e t i lg u a n d in a e n 1 m l d e m e ta n o l (M e O H ) s e g u id o p o r 3 m g (7 ,8 m m ol) d e a c id o 2 -y o d o h e x a d e c a n o ic o (a c id o 2 -y o d o p a lm lt ic o ) e n 0 ,5 m g te t ra h id ro fu ra n o (T H F ). El a c id o 2 y o d o h e x a d e c a n o ic o s e p re p a re p re v ia m e n te m e d ia n te tra ta m ie n to d e a c id o 2 -b ro m o h e x a d e c a n o ic o c o n y o d u ro d e p o ta s io en a c e to n a (D L S -027 -52 ) . L a re a c c io n d e a lq u ila c io n s e c a le n to e n un b a n o d u ra n te 10 m in u to s d u ra n te lo c u a l la m a y o r p a r te d e l d is o lv e n te s e e v a p o ro . El re s id u o s e d is o lv io e n a c id o a c e t ic o a c u o s o , s e a n a liz o p o r H P L C y s e e n c o n tro que e ra m a s h id ro fo b o que e l p e p tid o d e p a rt id a . L a s o lu c io n d e a c id o a c e t ic o re s ta n te s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 10 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n . S e re a liz o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /A C N m ie n tra s s e re c o g la n la s f ra c c io n e s y s e c o n tro la b a la U V a 214 nm . L a s fra c c io n e s 64 -68 s e c o m b in a ro n , c o n g e la ro n y lio f i l iz a ro n p a ra d a r 6 ,1 m g d e m a te r ia l (e l p e p tid o de SEQ ID N O : 164 ) c o n u n a p u re z a d e 90 % . P e s o m o le c u la r te o r ic o = 4568 ,1 , m a s a o b s e rv a d a p o r M A L D I = 4568 ,79

C u a n d o el p e p tid o c o m p re n d e un re s id u o d e L ys e n lu g a r d e l re s id u o C y s e n e l e x tre m o C - te rm in a l, e l p e p tid o p u e d e fo rm a rs e p r im e ro c o n e l e s que le to d e L ys . El re s id u o d e a m in o a c id o o b je t iv o p a ra N -a lq u ila rs e s e s u s t itu y e c o n un re s id u o d e lis in a F m o c N e p s ilo n . El t ra ta m ie n to de l p e p tid o p ro te g id o c o n B O C N - te rm in a l c o m p le ta d o co n p ip e r id in a a l 20 % e n D M F d u ra n te 30 m in u to s e lim in a F M O C /g ru p o s fo rm ilo d e l re s id u o L ys . U n re s id u o d e C y s s e a c o p la al re s id u o d e L ys c o n e p s ilo n a m in o lib re . E l re s id u o d e C y s s e a lq u ila m e d ia n te re a c c io n c o n a c id o 2 -y o d o p a lm lt ic o ta l c o m o se describe a n te r io rm e n te .

Acilacion de peptidos con espaciadores "miniPEG"

U n Ejemplo d e s ln te s is d e un p e p tid o a c ila d o m e d ia n te un e s p a c ia d o r m in i-P E G (e l p e p tid o que t ie n e u n a s e c u e n c ia de aminoácidos de SEQ ID N O : 89 ) se describe a c o n t in u a c io n :

S e c o lo c a ro n 0 ,28 g (0 ,2 m m o l) d e re s in a d e 4 -m e t i lb e n z h id r i la m in a (m b h a ) (M id w e s t B io te c h , In c ., F is h e rs , IN ) en un re c ip ie n te d e re a c c io n y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo e n un s in te t iz a d o r C S B io 336 u t il iz a n d o a m in o a c id o s B o c y a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s p o r 3 - (d ie to x ifo s fo r i lo x i) -3 H -b e n z o [d ] [1 ,2 ,3 ] t r ia z in a -4 -o n a /N ,N -d iis o p ro p ile t i la m in a (D E P B T /D IE A ) .

B o c -H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (F m o c ) G -m b h a

A p ro x im a d a m e n te , un te rc io de l p e p tid o - re s in a p ro te g id o co n B o c s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n m a n u a l y s e tra to c o n p ip e r id in a a l 20 % /d im e t i l fo rm a m id a a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in . L a re s in a s e f i lt ro , s e la v o c o n d im e t il fo rm a m id a (D M F ) v a r ia s v e c e s y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c a m id o P E G 4 (p re p a ra d a p re v ia m e n te m e d ia n te la d is o lu c io n d e 487 ,5 m g 1 ,0 m m o l d e a c id o N -F m o c A m id o d P E G 4 (P e p t id e s In te rn a tio n a l, L o u is v il le , K Y ) e n 2 ,0 m l d e D E P B T /D M F 0 ,5 M y la a d ic io n d e 0 ,175 m l 1 m m o l d e d i is o p ro p ile t i la m in a ) . L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 1 h o ra .

El p e p tid o - re s in a s e f i lt ro , s e la v o co n D M F , y s e tra to d e n u e v o c o n p ip e r id in a a l 20 % /D M F d u ra n te 10 m in . La re s in a s e f ilt ro , s e la v o co n D M F v a r ia s v e c e s , y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c -G lu O B z l (p re v ia m e n te p re p a ra d a d is o lv ie n d o 470 m g 1 m m o l d e F m o c -G lu -g -O B z l (A a p p te c , L o u is v ille , K Y ) e n 2 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y a n a d ie n d o 0 ,175 m l 1 m m o l d e D IE A ). L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 h o ra .

El p e p tid o - re s in a s e f i lt r o d e n u e v o , s e la v o c o n D M F , y s e tra to c o n p ip e r id in a a l 20 % /D M F d u ra n te 10 m in . La re s in a s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F v a r ia s v e c e s , y s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e a c id o p a lm lt ic o (p re v ia m e n te p re p a ra d a d is o lv ie n d o 256 m g 1 m m o l d e a c id o p a lm lt ic o (S ig m a -A ld r ic h , S t. L o u is , M O ) e n 2 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y a n a d ie n d o 0 ,175 m l 1 m m o l d e D IE A ). L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 h o ra .

P o r u lt im o , e l p e p tid o - re s in a s e f ilt ro , s e la v o co n D M F s e g u id o d e d ic lo ro m e ta n o y s e tra to c o n T F A al 50 % /D C M p a ra e lim in a r e l g ru p o B o c N - te rm in a l. D e s p u e s d e 1- 2 m in , la re s in a s e f ilt ro , s e la v o c o n D C M v a r ia s v e c e s s e g u id o d e u n a s o lu c io n d e D IE A al 5 % /D C M . El p e p tid o - re s in a s e c a d o al a ire s e tra n s f i r io a un re c ip ie n te d e re a c c io n co n H F y s e re a liz o la e s c is io n co n H F u t il iz a n d o 5 m l d e f lu o ru ro d e h id ro g e n o llq u id o y 0 ,5 m l d e a t ra p a d o r p -c re s o l. D e s p u e s d e m e z c la r 1 h o ra en un b a n o d e h ie lo , e l H F s e e lim in o al v a c lo y e l re s id u o s e s u s p e n d io e n e te r e t llic o . L a m e z c la d e p e p tid o /re s in a s e f i lt r o e n un e m b u d o d e v id r io s in te r iz a d o , s e la v o co n e te r e t l l ic o , y ra p id a m e n te s e s e c o a l a ire . E l p e p tid o s e e x tra jo e n 10 m l d e a c id o a c e t ic o a c u o s o a l 50 % que s e a n a liz o p o r H P L C (Z o rb a x S B -C 8 4 ,6 x 50 m m , 1 m l/m in , 214 nm , A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % , g ra d ie n te = 30 % d e B a 90 % B d u ra n te 10 m in ). E l e x tra c to c ru d o re s ta n te s e d ilu y o 3 v e c e s c o n a g u a y s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 22 ,2 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n u t il iz a n d o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /A C N . U n g ru p o in ic ia l d e p u r if ic a c io n s e v o lv io a p u r if ic a r s o b re la m is m a c o lu m n a p a ra d a r 19 m g d e p ro d u c to c o n u n a p u re z a d e 90 % . m a s a te o r ic a = 5010 ,6 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I 5008 ,0.

S e re p it io e l m is m o p ro c e d im ie n to u s a n d o d ife re n te s a c id o s N -F m o c A m id o D P E G . E n un c a s o , s e u t iliz o a c id o N -F m o c A m id o d P E G 8 (P e p t id e s In te rn a t io n a l, L o u is v ille , K Y ), y e n o tro c a s o , s e u t iliz o a c id o N -F m o c A m id o d P E G 2 (P e p t id e s In te rn a t io n a l, L o u is v ille , K Y ). L a s e s tru c tu ra s d e lo s p e p tid o s a c ila d o s s e m u e s tra n e n la s F ig u ra s 12 A -12C .

Dimerizacion de peptidos - dimerizacion con disulfuro

A c o n t in u a c io n , se describe un Ejemplo d e s ln te s is d e un p e p tid o d lm e ro c o n d is u lfu ro :

S e c o lo c a ro n 0 ,28 g (0 ,2 m m o l) d e re s in a d e m b h a (M id w e s t B io te c h ) e n un re c ip ie n te d e re a c c io n C S B io y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo e n un s in te t iz a d o r C S B io 336 u t il iz a n d o a m in o a c id o s B o c y a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s co n D E P B T /D IE A .

B o c -H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (F m o c ) G -a m id a

El p e p tid o - re s in a p ro te g id o c o n B o c s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n m a n u a l y s e tra to c o n p ip e r id in a al 20 % /D M F a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in . L a re s in a s e f ilt ro , s e la v o a fo n d o c o n D M F , a c o n t in u a c io n , s e a c ilo c o n u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e F m o c C y s (T r t) ( p re v ia m e n te p re p a ra d a d is o lv ie n d o 1 ,17 g 2 m m o l d e F m o c C y s (T r t) -O H (A a p p te c ) e n 4 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y a n a d ie n d o 0 ,35 m l 2 m m o l d e d iis o p ro p ile t i la m in a ) . L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 2 h o ra s , d e s p u e s s e f i lt ro , s e la v o c o n D M F y s e u t iliz o el m is m o p ro c e d im ie n to p a ra a n a d ir F m o c G lu -O B z l s e g u id o d e a c id o p a lm lt ic o .

F in a lm e n te , la re s in a s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F , c o n d ic lo ro m e ta n o , y s e tra to c o n T F A al 50 % /D C M d u ra n te 1 -2 m in . D e s p u e s d e la n e u tra liz a c io n c o n D IE A al 5 % /D C M , e l p e p tid o - re s in a s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n c o n H F y s e re a liz o u n a e s c is io n c o n H F u t il iz a n d o 10 m l d e f lu o ru ro d e h id ro g e n o l lq u id o y 1 m l d e a t ra p a d o r p -c re s o l e n un b a n o d e h ie lo d u ra n te 1 h o ra . D e s p u e s d e e v a p o ra r e l H F , e l re s id u o s e s u s p e n d io en e te r e t l l ic o y e l p e p tid o y la re s in a s e f i lt ra ro n e n un e m b u d o d e v id r io s in te r iz a d o . D e s p u e s d e la v a r c o n e te r e t l l ic o y s e c a r a l a ire ra p id a m e n te , e l p e p tid o s e e x tra jo e n a c id o a c e t ic o a c u o s o al 50 % . D e s p u e s de l a n a lis is m e d ia n te H P L C (Z o rb a x S B -C 8 4 ,6 x 50 m m , 1 m l/m in , 45 °C , 214 n m , A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % , 30 % a 90 % d e B d u ra n te 10 m in u to s ) , e l e x tra c to d e e s c is io n s e d ilu y o 3 -4 co n a g u a y s e c a rg o en u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 21 ,2 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n u s a n d o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /a c e to n it r i lo . L a s f ra c c io n e s d e p u r i f ic a t io n 64 -67 s e c o m b in a ro n , s e c o n g e la ro n y s e lio f i l iz a ro n p a ra d a r 58 ,7 m g d e m a te r ia l c o n u n a p u re z a p o r H P L C d e l 90 % .

D L S -027 -97 A p e s o m o le c u la r te o r ic o = 4866 ,48 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I = 4864 ,0

H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (C y s (S H ) g E -C 16 ) G -a m id a

S e d is o lv ie ro n 18 ,6 m g (3 ,8 m m o le s ) de l p e p tid o a n te r io r e n 2 ,0 m l d e g u a n id in a 3 M /tr is 0 ,05 M (p H 8 ,5 ) y s e a n a d io 1 m l d e d im e t ils u lfo x id o . L a re a c c io n s e a g ito a te m p e ra tu ra a m b ie n te e x p u e s ta a l a ire . D e s p u e s d e 6 h o ra s , u n a H P L C a n a llt ic a e n c o m p a ra c io n c o n e l p e p tid o d e p a rt id a m o s tro la p re s e n c ia d e un p ic o m a s h id ro fo b o .

L a m e z c la d e re a c c io n s e d ilu y o c o n 20 m l d e T F A al 0 ,1 % y s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 10 x 250 m m . S e re a liz o u n a p u r if ic a c io n u t il iz a n d o un g ra d ie n te d e T F A al 0 ,1 % /a c e to n it r i l m ie n tra s s e c o n tro la b a la a b s o rb a n c ia U V a 220 nm . L a s fra c c io n e s 68 -72 s e c o m b in a ro n y s e lio f i l iz a ro n p a ra d a r 5 ,5 m g d e d lm e ro p u r if ic a d o .

L a p u re z a H P L C fu e d e l 90 % . P e s o m o le c u la r te o r ic o = 9.743 ,99 , m a s a o b s e rv a d a p o r M A L D I = 9745 ,1. D L S -027 -98 B . L a e s tru c tu ra d e l d lm e ro re s u lta n te s e m u e s tra e n la F ig u ra 9A .

Dimerizacion de peptidos - dimerizacion con tioeter

A c o n t in u a c io n , se describe un e je m p lo d e la s ln te s is d e un d lm e ro c o n t io e te r :

S e c o lo c a ro n 0 ,28 g (0 ,2 m m o l) d e re s in a m b h a (M id w e s t B io te c h ) e n un re c ip ie n te d e re a c c io n y la s ig u ie n te secuencia s e e n s a m b lo en un s in te t iz a d o r C S B io 336 u s a n d o a c o p la m ie n to s in d iv id u a le s a c t iv a d o s p o r D E P B T /D IE A . B o c -H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (F m o c ) G -M B H A

U n te rc io d e l p e p t id o - re s in a p ro te g id o c o n B o c x e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n m a n u a l y s e tra to co n p ip e r id in a a l 20 % /D M F a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in . D e s p u e s d e la v a r v a r ia s v e c e s c o n D M F , s e a n a d io u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e B o c D a p (F m o c ) (p re v ia m e n te p re p a ra d a d is o lv ie n d o 426 m g 1 m m o l d e B o c D a p (F m o c )-O H (C h e m - Im p e x ) e n 2 ,0 m l d e D E P B T /D M F 0 ,5 M y a n a d ie n d o 0 ,175 m l 1 m m o l d e D IE A ). L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 2 h o ra s , s e f ilt ro , s e la v o c o n D M F y s e v o lv io a t r a ta r c o n p ip e r id in a a l 20 % /D M F c o m o a n te s . D e s p u e s d e la v a r co n D M F , la re s in a s e a c ilo c o n u n a s o lu c io n a c t iv a d a d e a c id o b ro m o a c e tic o (p re v ia m e n te p re p a ra d a d is o lv ie n d o 139 m g 1 m m o l d e a c id o b ro m o a c e tic o (A ld r ic h ) e n 2 ,0 m l D E P B T /D M F 0 ,5 M y a n a d ie n d o 0 ,175 m l d e D IE A ). L a re a c c io n s e m e z c lo a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 1 -2 h o ra s , d e s p u e s s e f i lt r o y la re s in a s e la v o co n D M F s e g u id o d e D C M . L a re s in a p e p tld ic a s e tra to co n T F A al 50 % /D C M a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 2 m in u to s , d e s p u e s s e f ilt ro , s e la v o c o n D C M y s e n e u tra liz o co n D IE A al 5 % /D C M . L a re s in a p e p tld ic a c o m p le ta d a s e tra n s f ir io a un re c ip ie n te d e re a c c io n c o n H F y s e re a liz o u n a e s c is io n c o n H F u t il iz a n d o 5 m l d e f lu o ru ro d e h id ro g e n o llq u id o /0 ,5 m l d e p -c re s o l. D e s p u e s d e a g ita r 1 h o ra en un b a n o d e h ie lo , e l H F s e e v a p o ro y e l re s id u o s e s u s p e n d io e n e te r e t l l ic o . L a m e z c la d e re s in a /p e p t id o s e f i lt ro e n un e m b u d o d e v id r io s in te r iz a d o y s e la v o c o n e te r. El p e p tid o s e e x tra jo e n a c id o a c e t ic o a c u o s o a l 50 % y e l p ro d u c to c ru d o s e a n a liz o m e d ia n te H P L C : Z o rb a x S B -C 8 4 ,6 x 50 m m , 1 m l/m in , 45 °C , 214 nm , A = T F A al 0 ,1 % , B = T F A al 0 ,1 % /A C N al 90 % , g ra d ie n te = 30 % d e B a 90 % d e B d u ra n te 10 m in . El e x tra c to d e e s c is io n s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 21 ,2 x 250 m m y s e re a liz o u n a p u r if ic a c io n u s a n d o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /a c e to n it r i lo m ie n tra s s e c o n tro la b a la a b s o rb a n c ia U V a 220 nm . L a s f ra c c io n e s 48 -53 s e c o m b in a ro n , c o n g e la ro n y se lio f i l iz a ro n p a ra d a r 18 m g d e l p e p tid o d e la S E Q ID N O : 89 c o n K 40 (D a p -B rA c e t il) , p u re z a = 90 % . P e s o m o le c u la r te o r ic o = 4602 ,8 , m a s a o b s e rv a d a p o r E S I = 4616 ,0

H a ib Q G T F T S D Y S K Y L D E R A A Q D F V Q W L L D G G P S S G A P P P S K (D a p -B rA c e t il) G -a m id a

S e d is o lv ie ro n 15 m g (3 ,2 p m m o l) d e l p e p tid o a n te r io r K 40 (D a p -B rA c e t il) y 15 m g d e l p e p tid o d e la S E Q ID N O : 89 K 40 (C y s g E -C 16 ) e n 3 ,0 m l d e u re a 7 M /tr is 0 ,05 M (p H 8 ,6 ) y s e m e z c la ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te m ie n tra s s e c o n tro la b a p o r H P L C el p ro g re s o d e la re a c c io n . D e s p u e s d e 30 m in u to s , la m a y o r la d e lo s m a te r ia le s d e p a rt id a s e re d u je ro n e n la a ltu ra d e p ico , m ie n tra s que un n u e v o p ic o fu e e l c o m p o n e n te p r in c ip a l. L a m e z c la d e re a c c io n s e d ilu y o c o n 25 m l d e T F a al 0 ,1 % y s e c a rg o e n u n a c o lu m n a A m b e rc h ro m X T 20 10 x 250 m m p a ra la p u r if ic a c io n . S e re a liz o un g ra d ie n te d e T F A a c u o s o /a c e to n it r i lo m ie n tra s s e c o n tro la b a la a b s o rb a n c ia d e U V a 220 nm . L a s f r a c c io n e s 57 -61 s e c o m b in a ro n , s e c o n g e la ro n y s e lio f i l iz a ro n p a ra d a r 7 ,1 m g d e d lm e ro c o n t io e te r . P u re z a p o r H P L C = 90 % , P e s o m o le c u la r te o r ic o = 9401 ,4 , m a s a o b s e rv a d a p o r M A L D I = 9402 ,8. La e s tru c tu ra d e l d lm e ro s e m u e s tra e n la F ig u ra 9B .

PEGilacion de peptidos

P a ra la P E G ila c io n d e p e p tid o s , s e h iz o re a c c io n a r m e to x i p o li (e t i le n g lic o l) id o a c e ta m id a (N O F ) d e 40 k D a c o n un e q u iv a le n te m o la r d e p e p tid o e n u re a 7 M , ta m p o n T r is 50 m M -H C l u t i l iz a n d o la c a n t id a d m in im a d e d is o lv e n te n e c e s a r ia p a ra d is o lv e r ta n to e l p e p tid o c o m o el P E G e n u n a s o lu c io n tra n s p a re n te (p o r lo g e n e ra l m e n o s d e 2 m l p a ra u n a re a c c io n c o n 2 -3 m g d e p e p tid o ) . L a a g ita c io n v ig o ro s a a te m p e ra tu ra a m b ie n te s e in ic io d u ra n te 4 -6 h o ra s y la re a c c io n s e a n a liz o p o r R P -H P L C a n a llt ic a . L o s p ro d u c to s P E G ila d o s a p a re c ie ro n c la ra m e n te d is t in to s de l m a te r ia l d e p a rt id a c o n t ie m p o s d e re te n c io n d is m in u id o s . L a p u r if ic a c io n s e re a liz o e n u n a c o lu m n a V y d a c C 4 co n c o n d ic io n e s s im ila re s a la s u t i l iz a d a s p a ra la p u r if ic a c io n de l p e p tid o in ic ia l. L a e lu c io n s e p ro d u jo e n p ro p o rc io n e s d e ta m p o n d e 50 :50. S e e n c o n tra ro n la s f ra c c io n e s d e p e p tid o P E G ila d o y s e lio f i l iz a ro n . L o s re n d im ie n to s fu e ro n s u p e r io re s al 50 % , v a r ia n d o p o r re a c c io n .

Analisis utilizando espectrometrfa de masas

L o s e s p e c tro s d e m a s a s s e o b tu v ie ro n u s a n d o un e s p e c tro m e tro d e m a s a s c u a d ru p o lo p o r e le c t ro s p ra y S c ie x A P I- II I c o n u n a fu e n te d e io n e s E S I e s ta n d a r . L a s c o n d ic io n e s d e io n iz a c io n q u e s e u t il iz a ro n fu e ro n la s s ig u ie n te s : E S I en e l m o d o d e io n p o s it iv o ; v o lta je d e p u lv e r iz a c io n io n ic a , 3 ,9 kV ; p o te n c ia l d e o r if ic io , 60 V . El g a s d e n e b u liz a c io n y d e c o r t in a u t i l iz a d o fu e un f lu jo d e n it ro g e n o d e 9 l/m in . L o s e s p e c tro s d e m a s a s s e re g is tra ro n a p a rt ir T h o m p s o n 600 800 a 0 ,5 T h p o r e ta p a y 2 m s d e t ie m p o d e re p o s o . L a m u e s tra (a p ro x im a d a m e n te 1 m g /m l) s e d is o lv io en a c e to n it r i lo a c u o s o a l 50 % co n a c id o a c e t ic o al 1 % y s e in tro d u jo m e d ia n te u n a b o m b a d e je r in g a e x te rn a a la v e lo c id a d d e 5 p l/m in .

C u a n d o lo s p e p tid o s fu e ro n a n a liz a d o s e n s o lu c io n d e P B S p o r E S I M S , q u e s e d e s a la ro n p r im e ro u s a n d o u n a p u n ta d e e x tra c c io n e n fa s e s o lid a Z ip T ip que c o n te n la 0 ,6 p l d e re s in a C 4 , s e g u n la s in s t ru c c io n e s p ro p o rc io n a d a s p o r el fa b r ic a n te (M ill ip o re C o rp o ra t io n , B il le r ic a , M A , v e r la p a g in a w e b d e M ill ip o re en m il l ip o re .c o m /c a ta lo g u e .n s f /d o c s /C 5737 ) .

Analisis por Cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC):

L o s a n a lis is p re lim in a re s s e re a liz a ro n c o n e s to s p e p tid o s e n b ru to p a ra o b te n e r u n a a p ro x im a c io n d e s u s ta s a s d e c o n v e rs io n re la t iv a s e n ta m p o n d e s o lu c io n s a lin a ta m p o n a d a c o n fo s fa to (P B S ) (p H , 7 ,2 ) m e d ia n te c ro m a to g ra f ia l iq u id o a d e a lta re s o lu c io n (H P L C ) y a n a lis is d e M A L D i . L a s m u e s tra s d e p e p tid o s e n b ru to s e d is o lv ie ro n en el ta m p o n P B S a u n a c o n c e n tra c io n d e 1 m g /m l. S e a lm a c e n o 1 m l d e la s o lu c io n re s u lta n te e n un v ia l d e 1 ,5 m l d e H P L C que d e s p u e s s e s e llo y s e in c u b o a 37 °C . S e e x tra je ro n a lic u o ta s d e 100 p l e n d iv e rs o s in te rv a lo s d e t ie m p o , s e e n fr ia ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te y se analizaron p o r H P L C .

L o s a n a lis is d e H P L C s e re a liz a ro n u t iliz a n d o un s is te m a d e c ro m a to g ra f ia B e c k m a n S y s te m G o ld u t i l iz a n d o un d e te c to r U V a 214 nm . El a n a lis is d e H P L C s e re a liz o e n u n a c o lu m n a C 18 V y d a c 150 m m x 4 ,6 m m . El c a u d a l fu e d e 1 m l/m in . D is o lv e n te A c o n te n la T F A al 0 ,1 % e n a g u a d e s tila d a , y e l d is o lv e n te B c o n te n la T F A al 0 ,1 % en C H 3 C N al 90 % . S e e m p le o un g ra d ie n te lin e a l (40 % a 70 % d e B e n 15 m in u to s ) . L o s d a to s fu e ro n re c o g id o s y a n a liz a d o s m e d ia n te el s o f tw a re P e a k S im p le C h ro m a to g ra p h y .

L a s ta s a s in ic ia le s d e h id ro lis is s e u t i l iz a ro n p a ra m e d ir la c o n s ta n te d e v e lo c id a d p a ra la d is o c ia c io n d e lo s re s p e c t iv o s p ro fa rm a c o s . L a s c o n c e n tra c io n e s d e l p ro fa rm a c o y e l fa rm a c o s e e s t im a ro n a p a r t ir d e s u s a re a s d e lo s p ic o s , re s p e c t iv a m e n te . L a s c o n s ta n te s d e v e lo c id a d d e d is o c ia c io n d e p r im e r o rd e n d e lo s p ro fa rm a c o s s e d e te rm in a ro n tra z a n d o el lo g a r itm o d e la c o n c e n tra c io n de l p ro fa rm a c o e n v a r io s in te rv a lo s d e t ie m p o . L a p e n d ie n te d e e s ta g ra f ic a p ro p ro c io n a la c o n s ta n te d e v e lo c id a d "k ". L a v id a m e d ia d e la d e g ra d a c io n d e lo s d iv e rs o s p ro fa rm a c o s fu e ro n c a lc u la d o s u t il iz a n d o la fo rm u la d e t1 /2 = 0 ,693 /k .

EJEMPLO 2

Este ejemplo d e s c r ib e un p ro c e d im ie n to d e e je m p lo d e p ro b a r la a c t iv id a d b io lo g ic a d e lo s p e p tid o s d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , c u y o p ro c e d im ie n to im p lic a a n a liz a r la s ln te s is d e A M P c .

[0478 ^{] L a c a p a c id a d d e lo s a n a lo g o s d e g lu c a g o n p a ra in d u c ir A M P c s e m id io e n un e n s a y o in d ic a d o r d e b a s a d o en}la lu c ife ra s a d e lu c ie rn a g a . C e lu la s H E K 293 c o tra n s fe c ta d a s c o n un re c e p to r ( re c e p to r d e g lu c a g o n , re c e p to r d e ^{G L P -1 o re c e p to r d e G IP ) y e l g e n d e lu c ife ra s a u n id o a un e le m e n to s e n s ib le a}a MpC ^{fu e ro n p r iv a d a s d e s u e ro}m e d ia n te e l c u lt iv o d e 16 h e n D M E M ( In v it ro g e n , C a r ls b a d , C A ) s u p le m e n ta d o c o n s u e ro n b o b in o d e c re c im ie n to al 0 ,25 % (H y c lo n e , L o g a n , U T ) y d e s p u e s s e in c u b a ro n c o n d ilu c io n e s e n s e r ie d e c u a lq u ie ra d e g lu c a g o n , G L P -1 , G IP ^{o n u e v o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n d u ra n te 5 h o ra s a 37 °C , 5 % d e C O}2 ^{e n p la c a s d e 96 p o c il lo s “ B io c o a t” re c u b ie r ta s}c o n p o li-D - lis in a (B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e , C A ). A l f in a l d e la in c u b a c io n s e a n a d ie ro n 100 m ic ro lit ro s d e re a c tiv o s u s tra to d e lu m in is c e n c ia L u c L ite (P e rk in -E lm e r , W e lle s le y , M A ) a c a d a p o c illo . L a p la c a s e a g ito b re v e m e n te , s e in c u b o 10 m in en la s a lid a d e lu z y o s c u r id a d , s e m id io e n un c o n ta d o r d e c e n te l le o llq u id o M ic ro B e ta -1450 (P e rk in -E lm e r, W e lle s le y , M A ). S e c a lc u la ro n la s c o n c e n tra c io n e s e f ic a c e s a l 50 % m e d ia n te e l u s o d e s o f tw a re d e O r ig in (O r ig in , N o r th a m p to n , M A ).

EJEMPLO 3

Este ejemplo d e s c r ib e un p ro c e d im ie n to d e e je m p lo d e e n s a y o d e la e s ta b i l id a d d e lo s p e p tid o s d e la p re s e n te d e s c r i p c io n .

C a d a a n a lo g o d e g lu c a g o n s e d is u e lv e e n a g u a o P B S y s e lle v a a c a b o un a n a lis is d e H P L C in ic ia l. D e s p u e s de a ju s ta r e l pH (4, 5, 6 , 7 ), la s m u e s tra s s e in c u b a n d u ra n te un p e r lo d o d e t ie m p o e s p e c if ic a d o a 37 °C y s e v u e lv e n a a n a liz a r p o r H P L C p a ra d e te rm in a r la in te g r id a d d e l p e p tid o . S e d e te rm in a la c o n c e n tra c io n de l p e p tid o e s p e c lf ic o d e in te re s y s e c a lc u la e l p o rc e n ta je d e re s ta n te in ta c to s e c a lc u la e n re la c io n c o n e l a n a lis is in ic ia l.

EJEMPLO 4

Este ejemplo d e s c r ib e un p ro c e d im ie n to d e e je m p lo d e e n s a y o d e s o lu b il id a d d e lo s p e p tid o s .

S e p re p a ra u n a s o lu c io n (1 m g /m l o 3 m g /m l) d e g lu c a g o n (o un a n a lo g o ) e n H C l 0 ,01 N. S e d ilu y e n 100 ml d e s o lu c io n m a d re e n 1 m l c o n H C l 0 ,01 N y s e d e te rm in a la a b s o rb a n c ia U V (276 n m ). El pH d e la s o lu c io n m a d re re s ta n te s e a ju s ta a pH 7 u t il iz a n d o 200 - 250 ml d e N a 2H P O 4 (p H 9 ,2 ). L a s o lu c io n s e d e ja re p o s a r d u ra n te la n o c h e a 4 °C , a c o n t in u a c io n s e c e n tr ifu g a . A c o n t in u a t io n , s e d ilu y e n 100 ml d e s o b re n a d a n te e n 1 m l c o n H C l 0 ,01 N y s e d e te rm in a la a b s o rb a n c ia U V (p o r d u p lic a d o ) .

L a le c tu ra in ic ia l d e a b s o rb a n c ia s e c o m p e n s a p o r e l a u m e n to d e v o lu m e n y s e u t iliz a e l s ig u ie n te c a lc u lo p a ra e s ta b le c e r el p o rc e n ta je d e s o lu b il id a d :

EJEMPLO 5

Este ejemplo d e s c r ib e un p ro c e d im ie n to d e e je m p lo d e e n s a y o d e p e p tid o s p a ra la u n io n a un re c e p to r .

L a a f in id a d d e p e p tid o s a l re c e p to r d e g lu c a g o n s e m id e e n un e n s a y o d e u n io n c o m p e t it iv a u t iliz a n d o la te c n o lo g la d e e n s a y o d e p ro x im id a d d e c e n te l le o . S e m e z c la n d ilu c io n e s d e 3 v e c e s e n s e r ie d e lo s p e p tid o s p ro d u c id o s e n un ta m p o n d e e n s a y o d e p ro x im id a d d e c e n te l le o (0 ,05 M T r is -H C l, pH 7 ,5 , 0 ,15 M N a C l, 0 ,1 % p /v d e a lb u m in a d e s u e ro b o v in o ) e n p la c a d e b a s e b la n c a /c la ra d e 96 p o c il lo s (C o rn in g Inc ., A c to n , M A ) c o n 0 ,05 nM d e g lu c a g o n T y r10 (3 - [125I ] -y o d o t iro s i lo ) (A m e rs h a m B io s c ie n c e s , P is c a ta w a y , N J), 1 -6 m ic ro g ra m o s p o r p o c illo , f ra g m e n to s d e m e m b ra n a p la s m a tic a p re p a ra d a a p a rt ir d e c e lu la s q u e s o b re e x p re s a n e l re c e p to r d e g lu c a g o n h u m a n o y 1 m g /p o c il lo d e m ic ro e s fe ra s d e e n s a y o d e p ro x im id a d d e c e n te l le o d e t ip o A d e a g lu t in in a d e g e rm e n d e t r ig o tra ta d a s c o n p o lie t i le n im in a (A m e rs h a m B io s c ie n c e s , P is c a ta w a y , N J ). T ra s 5 m in d e a g ita t io n a 800 rpm e n un a g ita d o r ro ta to r io , la p la c a s e in c u b a 12 h a te m p e ra tu ra a m b ie n te y , a c o n t in u a c io n , s e le e e n un c o n ta d o r d e c e n te l le o llq u id o M ic ro B e ta 1450 (P e rk in -E lm e r , W e lle s le y , M A ). L a ra d ia c t iv id a d n o u n id a e s p e c lf ic a m e n te (N S B ) s e m id e en lo s p o c il lo s co n u n a c o n c e n tra c io n 4 v e c e s m a y o r d e lig a n d o n a tu ra l " f r lo " q u e la m a y o r c o n c e n tra c io n e n la s m u e s tra s d e p ru e b a y s e d e te c ta la ra d ia c t iv id a d to ta l u n id o e n lo s p o c il lo s s in c o m p e t id o r . E l p o rc e n ta je d e u n io n e s p e c lf ic a s e c a lc u la d e la s ig u ie n te m a n e ra : % d e u n io n e s p e c lf ic a = ( (u n id o - N S B )/(T o ta l u n id o - N S B )) x 100. L o s v a lo re s IC 50 s e d e te rm in a ro n m e d ia n te e l u s o d e l s o f tw a re d e O r ig in (O r ig in L a b , N o r th a m p to n , M A ).

EJEMPLO 6

Se produjeron lo s s ig u ie n te s p e p tid o s que c o m p re n d e n al m e n o s T y r e n la posición 1, A IB e n la posición 2 (p a ra la re s is te n c ia a D P P -IV ), L y s en la posición 16, A IB e n la posición 20 , y Le u , A la y G ly e n la s posición e s 27 -29 , ta l c o m o se describe e s e n c ia lm e n te en Ejemplo 1 y se analizaron in v it ro p a ra la a c t iv id a d a g o n is ta e n c a d a u n o d e lo s re c e p to re s d e G L P -1 , g lu c a g o n y G IP , tal como s e d e c r ib e e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2:

L a s E C 50 e n e l re c e p to r d e GlP-1 (G L P -1 R ) , e l re c e p to r d e g lu c a g o n (G R ) y e l re c e p to r d e G IP ( GIPR ) se p ro p o rc io n a n e n la Tabla 1.

T A B L A 1

EJEMPLO 7

Se produjeron péptidos adicionales mt-395 (S E Q ID N O : 15 ), mt-396 (S E Q ID N O : 16 ), mt-397 (S E Q ID N O : 17 ) y mt-398 (SEQ ID NO: 18 ), que se basaban en la e s tru c tu ra d e mt-263 , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n el Ejemplo 1 y se analizaron in vitro , tal como se describe e s e n c ia lm e n te en e l Ejemplo 2. L a s E C 50 e n c a d a u n o d e lo s GLP-1R, GR y GIPR se muestran en la Tabla 2.

T A B L A 2

EJEMPLO 8

Se produjeron péptidos adicionales que c o m p re n d e n u n a Tyr e n la posición 1, A IB e n la posición 2 (p a ra la re s is te n c ia a D P P -IV ), Glu en la posición 16 y Lys e n la posición 20 (p u e n te a d o s p o r u n a lactama entre las posición e s 16 y 20 ), Leu-Ala-G ly en las posición e s 27 -29 y G P S S G A P P P S e n la s posición e s 30 -39 , tal como s e describe esencialmente en el Ejemplo 1 y se analizaron p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d a g o n is ta en c a d a u n o d e lo s GLP-1R, GR, y GIPR, tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2. Se produjeron otros péptidos q u e carecían de una lactama y se analizaron. L o s re s u lta d o s d e lo s e n s a y o s d e a c t iv id a d s e muestran en la Tabla 3.

T A B L A 3

EJEMPLO 9

Se produjeron a n a lo g o s d e p e p tid o s d e e je m p lo d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , tal como se describe e s e n c ia lm e n te en e l Ejemplo 1. C a d a u n o d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s c o m p re n d ia u n a s e c u e n c ia d e a m in o a c id o s b a s a d a e n el g lu c a g o n n a tu ra l (S E Q ID N O : 1) co n la H is n a tu ra l e n la posición 1, un a m in o a c id o p ro te c to r d e D P P -IV e n la posición 2 , un a m in o a c id o a c ila d o e n la posición 10 , u n o o m a s a m in o a c id o s e s ta b i l iz a n te s d e h e lic e a lfa d e n tro d e la s posición e s 16 -21 de l a n a lo g o d e p e p tid o , y o tra s m o d if ic a c io n e s . T o d o s lo s p e p tid o s s e a m id a ro n e n e l e x tre m o C - te rm in a l. L o s p e p tid o s s e e n s a y a ro n a c o n t in u a c io n p a ra la a c t iv id a d e n c a d a u n o d e lo s re c e p to re s d e g lu c a g o n , G L P -1 y G IP , tal como se describe e n e l Ejemplo 2. U n a c o m posición d e lo s re s u lta d o s d e m u lt ip le s e n s a y o s d e a c t iv id a d d ife re n te s s e m u e s tra n e n la Tabla 4.

T A B L A 4

C a d a u n o d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s d e la Tabla 4 m o s tro u n a p o te n te a c t iv id a d e n c a d a u n o d e lo s re c e p to re s d e g lu c a g o n , G IP y G L P -1. D e fo rm a d e s ta c a d a , c a d a u n o d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s m o s tra ro n u n a E C 50 e n el re c e p to r d e G IP d e < 0 ,5 nM , y la m a y o r la d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s m o s tra ro n u n a E C 50 e n e l re c e p to r d e G IP de < 0 ,1 nM . E s to s a n a lo g o s d e p e p tid o s ta m b ie n m o s tra ro n u n a p o te n te a c t iv id a d e n e l re c e p to r d e G L P -1 , m o s tra n d o c a d a a n a lo g o d e p e p tid o u n a E C 50 < 0 ,008 nM . L o s a n a lo g o s d e p e p tid o s que c a re c e n d e u n a G lu en la posición 3 m o s tra ro n u n a p o te n te a c t iv id a d e n el re c e p to r d e g lu c a g o n , c a d a a n a lo g o d e p e p tid o d e lo s c u a le s m o s tro u n a E C 50 < 0 ,03 nM .

E n g e n e ra l, lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s que c o m p re n d e n un A IB e n la posición 20 o u n a c o m b in a c io n d e G lu e n la posición 16 y u n a e x te n s io n C - te rm in a l m o s tra ro n u n a a c t iv id a d m u y p o te n te e n el re c e p to r d e G IP . A d e m a s , lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s que c o m p re n d e n A IB e n la posición 2 g e n e ra lm e n te m o s tra ro n m a y o r a c t iv id a d e n e l re c e p to r d e G IP , e n c o m p a ra c io n c o n un a n a lo g o d e p e p tid o c o r re s p o n d ie n te que c o m p re n d e d -S e r e n la posición 2 (p o r e je m p lo , c o m p a ra r la s E C 50 e n e l re c e p to r d e G IP e n tre S E Q ID N O s : 2 y 3 o S E Q ID N O s : 5 y 6 )

EJEMPLO 10

Se produjeron a n a lo g o s d e p e p tid o s d e e je m p lo d e la p re s e n te d e s c r ip c io n , tal como se describe e s e n c ia lm e n te en e l Ejemplo 1. L o s a n a lo g o s d e p e p tid o s fu e ro n s im ila re s e n e s tru c tu ra , que c o m p re n d la n u n a secuencia d e a m in o a c id o s b a s a d a e n g lu c a g o n n a tu ra l (S E Q ID N O : 1) co n la H is n a tu ra l e n la posición 1, un a m in o a c id o p ro te c to r d e D P P -IV e n la posición 2 y un a m in o a c id o e s ta b i l iz a d o r d e la h e lic e a lfa e n la posición 16, e x c e p to que la posición e n la que s e e n c o n tra b a un a m in o a c id o a c ila d o v a r ia b a e n tre e s te c o n ju n to d e a n a lo g o s d e p e p tid o s . T o d o s lo s p e p tid o s s e a m id a ro n en e l e x tre m o C - te rm in a l. L o s p e p tid o s s e e n s a y a ro n a c o n t in u a c io n p a ra la a c t iv id a d e n c a d a u n o d e lo s re c e p to re s de glucagón G L P -1 y G IP , tal como se describe e n e l Ejemplo 2. U n a c o m posición d e los re s u lta d o s d e m u lt ip le s e n s a y o s d e a c t iv id a d d ife re n te s s e m u e s tra n e n la Tabla 5 p a ra a lg u n o s d e lo s p e p tid o s p ro d u c id o s y e n s a y a d o s .

T A B L A 5

T a l c o m o s e m u e s tra e n la Tabla 5, lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s que c o m p re n d e n un a m in o a c id o a c ila d o e n cualquiera de las posición e s 9 y 12 m o s tra ro n u n a m e jo ra e n la a c t iv id a d d e G IP , e n c o m p a ra c io n c o n e l a n a lo g o d e p e p tid o no a c ila d o d e la S E Q ID N O : 42. N o to d o s lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s a c ila d o s que s e re a liz a ro n y s e e n s a y a ro n d e m o s tra ro n u n a a c t iv id a d m e jo ra d a d e G IP , s in e m b a rg o . U n o d e lo s a n a lo g o s d e p e p tid o s que s e a c ilo e n u n a posición d is t in ta d e la posición 9 y 12 m o s tro u n a a c t iv id a d re d u c id a e n e l re c e p to r d e G IP .

EJEMPLO 11

Este ejemplo d e s c r ib e la s a c t iv id a d e s in v iv o d e a n a lo g o s d e g lu c a g o n d e e je m p lo d e la p re s e n te d e s c r ip c io n .

L a s a c t iv id a d e s in v iv o d e a n a lo g o s d e g lu c a g o n a c t iv o s d e l re c e p to r d e G IP que t ie n e n u n a secuencia d e a m in o a c id o s d e u n a de las S E Q ID N O s : 28 , 37 -39 y 134 s e e n s a y a ro n en ra to n e s o b e s o s in d u c id o s p o r la d ie ta (D IO ) y s e c o m p a ra ro n c o n la s a c t iv id a d e s in v iv o d e ra to n e s a lo s que s e a d m in is tro un a n a lo g o a g o n is ta d e g lu c a g o n o un v e h ic u lo d e c o n tro l. C a d a g ru p o d e e n s a y o d e ra to n e s e s ta b a fo rm a d o d e d ie c in u e v e ra to n e s y c a d a ra to n s e in y e c to p o r v ia s u b c u ta n e a c o n u n a d o s is d e 10 n m o l/k g d e p e p tid o o un v e h ic u lo d e c o n tro l. S e m id ie ro n el p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s e n lo s d ia s 0, 1, 3, 5 y 7 d e s p u e s d e la a d m in is tra c io n , m ie n tra s que los n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re e n a y u n o s e m id ie ro n e n lo s d ia s 0 y 7. L o s ra to n e s s e d e ja ro n e n a y u n a s d u ra n te 6 h o ra s a n te s d e la m e d ic io n d e la g lu c o s a e n s a n g re e n lo s d ia s 0 y 7. L o s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re a d lib s e m id ie ro n a d ic io n a lm e n te en e l d ia 5 d e s p u e s d e la a d m in is tra c io n .

T o d o s lo s ra to n e s in y e c ta d o s c o n un a n a lo g o d e g lu c a g o n a c t iv o d e l re c e p to r d e G IP m o s tro u n a r e d u c t io n s ig n if ic a t iv a (u n a re d u c c io n e n tre a p ro x im a d a m e n te 11 % y a p ro x im a d a m e n te 27 % ) e n e l p e s o c o rp o ra l s ie te d ia s d e s p u e s d e la a d m in is tra c io n , e n c o m p a ra c io n c o n lo s ra to n e s a d m in is tra d o s c o n un v e h ic u lo d e c o n tro l. A d e m a s to d o s lo s ra to n e s in y e c ta d o s c o n un a n a lo g o d e g lu c a g o n a c t iv o d e l re c e p to r d e G IP m o s tra ro n u n a re d u c c io n s u s ta n c ia l (u n a re d u c c io n e n tre a p ro x im a d a m e n te 43 % y a p ro x im a d a m e n te 65 % ) e n lo s n iv e le s d e g lu c o s a en s a n g re s ie te d ia s d e s p u e s d e la a d m in is tra c io n .

^{S e lle v o a c a b o o tro e s tu d io e n ra to n e s d b /d b m a c h o s p a ra a n a liz a r la s a c t iv id a d e s} in vivo ^{d e a n a lo g o s d e g lu c a g o n}a c t iv o s d e re c e p to r d e G IP . En e s te e s tu d io , u n a d o s is d e 20 n m o l/k g d e un a n a lo g o d e g lu c a g o n a c t iv o d e l re c e p to r d e G IP que t ie n e u n a secuencia de aminoácidos d e u n a de las S E Q ID N O s : 28 , 31 , 37 , 135 y 136 s e a d m in is t ro a lo s ra to n e s p o r v ia s u b c u ta n e a . U n v e h ic u lo d e c o n tro l s e a d m in is tro a un g ru p o c o n tro l d e ra to n e s . S e a n a liz a ro n lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re a n te s d e la a d m in is tra c io n y 1, 2 , 4 , 8 , 24 , 48 , y 72 h o ra s d e s p u e s d e la d o s if ic a c io n . El p e s o c o rp o ra l s e m id io a n te s d e la d o s if ic a c io n y 72 h o ra s d e s p u e s d e la d o s if ic a c io n . E n c o n s o n a n c ia c o n lo s re s u lta d o s o b s e rv a d o s e n e l e s tu d io c o n ra to n e s D IO , to d o s lo s ra to n e s a lo s que s e le s a d m in is tro un a n a lo g o d e g lu c a g o n a c t iv o d e l re c e p to r d e G IP m o s tra ro n u n a re d u c c io n s u s ta n c ia l e n e l p e s o c o rp o ra l (u n a re d u c c io n d e e n tre a p ro x im a d a m e n te 2 % y a p ro x im a d a m e n te 5 % ), en c o m p a ra c io n co n e l g ru p o d e l v e h ic u lo d e c o n tro l. A d e m a s , to d o s lo s ra to n e s que re c ib ie ro n un a n a lo g o d e g lu c a g o n a c t iv o de l re c e p to r d e G IP m o s tra ro n u n a re d u c c io n e n lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re .

EJEMPLO 12

Este ejemplo d e s c r ib e la s e s tru c tu ra s d e p e p tid o s d e e je m p lo a d ic io n a le s .

S e p ro d u c e n a n a lo g o s de glucagón tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 1 y e n la Tabla 6 se describe la e s tru c tu ra d e e s to s a n a lo g o s . L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n s e a n a liz a n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d e n c a d a u n o de l re c e p to r de glucagón e l re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2 .

T A B L A 6

EJEMPLO 13

Se produjeron a n a lo g o s de glucagón tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 1 y la Tabla 7 d e s c r ib e la e s tru c tu ra d e e s to s a n a lo g o s . L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n s e e n s a y a ro n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d e n c a d a u n o de l re c e p to r de glucagón e l re c e p to r d e G L P -1 , y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2 .

T A B L A 7

EJEMPLO 14

Se produjeron a n a lo g o s de glucagón tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 1, y e n la Tabla 8 s e d e s c r ib e la e s tru c tu ra d e e s to s a n a lo g o s . L a s d e s c r ip c io n e s c o m p le ta s d e e s to s a n a lo g o s s e p ro p o rc io n a n e n el lis ta d o d e secuencia s y la S E Q ID N O : p a ra c a d a u n o s e p ro p o rc io n a e n la Tabla 8. L o s a n a lo g o s d e g lu c a g o n s e e n s a y a ro n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d e n c a d a u n o de l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 , y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2.

P a ra a n a liz a r la s a c t iv id a d e s in v iv o d e e s to s p e p tid o s , lo s p e p tid o s d e la Tabla 8 (e x c lu y e n d o lo s p e p tid o s n a tu ra le s ) fu e ro n in y e c ta d o s p o r v ia s u b c u ta n e a e n ra to n e s D IO ( ra to n e s C 57 B 66 ) a 5 o 10 n m o l/k g c a d a lu n e s , m ie rc o le s y v ie rn e s , d u ra n te 4 s e m a n a s . L o s ra to n e s fu e ro n a lim e n ta d o s c o n u n a d ie ta d ia b e to g e n ic a co n a lto c o n te n id o en g ra s a s . T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 1, s e re d u jo e l p e s o c o rp o ra l d e lo s ra to n e s que re c ib ie ro n in y e c c io n e s d e u n o d e e s to s p e p tid o s , e n c o m p a ra c io n , c o n e l v e h lc u lo d e c o n tro l.

EJEMPLO 15

Se produjeron p e p tid o s a c ila d o s que c o m p re n d la n la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N O : 1 (g lu c a g o n n a tu ra l) c o n u n a T y r e n posición 1, A IB e n posición 2 , G lu e n posición 3, Ile e n posición 12, L ys e n posición 16, G ln en posición 17, A la e n posición 18, A IB e n posición 20 , G lu e n posición 21 , A s n e n posición 24 , L e u en posición 27 , A la e n posición 28 , G ly en posición 29 , s e g u id o p o r la secuencia de aminoácidos G P S S G S P P P S (S E Q ID N O : 5), y u n a a m id a c io n C - te rm in a l, tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 1. L o s p e p tid o s s e d ife r la n p o r e l t ip o d e a c ila c io n , e l t ip o d e e s p a c ia d o r d e a c ila c io n , y /o la posición d e a m in o a c id o a c ila d o . L o s d ife re n te s re s id u o s a c ila d o s s e re p re s e n ta n e n F ig u ra 3. L o s p e p tid o s s e a n a liz a ro n a c o n t in u a t io n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o de l re c e p to r de glucagón e l re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n el Ejemplo 2. L a Tabla 9 re s u m e la e s tru c tu ra y la s a c t iv id a d e s d e c a d a p e p tid o .

94 L a s a c t iv id a d e s in v iv o d e lo s p e p tid o s lis ta d o s e n la Tabla 9 s e a n a liz a ro n m e d ia n te in y e c c io n en ra to n e s D IO (c a d a u n o c o n un p e s o c o rp o ra l p ro m e d io d e 49 ,0 g ) a u n a d o s is d e 10 n m o l/k g el lu n e s , m ie rc o le s , y v ie rn e s d u ra n te 1 s e m a n a . E l p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s d e lo s ra to n e s s e m id ie ro n lo s d la s 0, 2 , 4 , 6 y 7 , m ie n tra s q u e n iv e le s d e g lu c o s a en s a n g re s e m id ie ro n lo s d la s 0 y 7.

T a l c o m o s e m u e s tra e n F ig u ra 2, el p e s o c o rp o ra l d e ra to n e s q u e re c ib ie ro n in y e c c io n e s d e lo s p e p tid o s a c ila d o s m o s tra ro n u n a d is m in u c io n d e a l m e n o s e l 5 % e n p e s o c o rp o ra l to ta l e n el d la 7.

EJEMPLO 16

Se produjeron p e p tid o s a c ila d o s que c o m p re n d la n la s e c u e n c ia de aminoácidos d e g lu c a g o n n a tu ra l (S E Q ID N O : 1) c o n un A IB e n posición 2, G lu e n posición 16 (e x c e p to c u a n d o la posición 16 e s ta a c ila d a ), A la e n posición 18, L e u e n posición 27 , A s p e n posición 28 , G ly e n posición 29 , s e g u id o d e la s e c u e n c ia de aminoácidos G P S S G S P P P S (S E Q ID N O : 5 ), y u n a a m id a c io n C - te rm in a l, tal como se describe e s e n c ia lm e n te en el Ejemplo 1.L o s p e p tid o s s e d ife r la n p o r e l t ip o d e a c ila c io n , el t ip o d e e s p a c ia d o r d e a c ila c io n , y /o la posición de l a m in o a c id o a c ila d o . L o s p e p tid o s s e a n a liz a ro n a c o n t in u a c io n p a ra la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o d e l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2. L a Tabla 10 re s u m e la e s tru c tu ra y la s a c t iv id a d e s d e c a d a p e p tid o .

97 EJEM PLO 17

L o s p e p tid o s s e le c c io n a d o s a p a r t ir d e la Tabla 10 (p e p t id o s de SEQ ID N O s : 145 , 148 y 152 ) y lo s p e p tid o s de SEQ ID N O s : 28 y 89 fu e ro n a n a liz a d o s p a ra d e te rm in a r la s a c t iv id a d e s in v iv o e n ra to n e s D IO (que t ie n e n un p e s o c o rp o ra l p ro m e d io o r ig in a l d e 58 ,0 g ) en u n a d ie ta d ia b e to g e n ic a co n a lto c o n te n id o en g ra s a s . S e in y e c ta ro n p o r v ia s u b c u ta n e a lo s p e p tid o s a u n a d o s is d e 10 n m o l/k g (d e p e s o c o rp o ra l p ro m e d io o r ig in a l) e n lo s d la s 0 y 3. El p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s d e lo s ra to n e s s e m id ie ro n e n d la s 0, 1, 3, 5 y 7 , m ie n tra s que lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re s e m id ie ro n e n lo s d la s 0 y 7.

T a l c o m o s e m u e s tra en F ig u ra 4 , lo s ra to n e s que re c ib ie ro n u n a in y e c c io n d e u n o d e e s to s p e p tid o s m o s tra ro n u n a d is m in u c io n d e p e s o c o rp o ra l e n e l t ra n s c u rs o d e 7 d la s , e n c o m p a ra c io n c o n lo s v e h lc u lo s d e c o n tro l. L o s ra to n e s que re c ib ie ro n in y e c c io n e s d e lo s p e p tid o s m o s tra ro n u n a d is m in u c io n d e a l m e n o s 5 % e n e l p e s o c o rp o ra l to ta l e n el d la 7 , d e lo s c u a le s d o s m o s tra ro n a l m e n o s u n a d is m in u c io n d e l 10 % e n e l p e s o c o rp o ra l to ta l e n el d la 7.

EJEMPLO 18

Se produjeron p e p tid o s a c ila d o s que c o m p re n d la n un s e p a ra d o r "m in i-P E G " , tal como se describe e s e n c ia lm e n te en e l Ejemplo 1. L a f ig u ra 12 re p re s e n ta un e s que m a d e la s e s t ru c tu ra s d e e s to s p e p tid o s a c ila d o s . L o s p e p tid o s que c o m p re n d la n un s e p a ra d o r m in i-P E G s e a n a liz a ro n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o d e l re c e p to r de g lu c a g o n , el re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2 y s e c o m p a ra ro n co n la s a c t iv id a d e s d e lo s p e p tid o s a c ila d o s que n o c o m p re n d la n e s p a c ia d o r o un e s p a c ia d o r gE. T o d o s lo s p e p tid o s d e e s te e x p e r im e n to c o m p re n d la n la s e c u e n c ia de aminoácidos d e g lu c a g o n n a tu ra l (S E Q ID N O : 1) c o n A IB e n posición 2, G lu e n posición 16, A la e n posición 18, L e u en posición 28 , A s p e n posición 28 , G ly en posición 29 , s e g u id o p o r la secuencia de aminoácidos G P S S G S P P P S K (S E Q ID N O : 9), d o n d e K e ra un a m in o a c id o a c ila d o , y u n a a m id a c io n C - te rm in a l. La Tabla 11 re s u m e la e s tru c tu ra y la s a c t iv id a d e s d e c a d a p e p tid o .

EJEM PLO 19

Se produjeron p e p tid o s a c ila d o s d u a le s . D o s p e p tid o s c o m p re n d la n un u n ic o re s id u o d e a m in o a c id o a c ila d o que lle v a b a d o s a c ila c io n e s e n u n a fo rm a c io n ra m if ic a d a : u n p e p tid o te n ia la a c ila c io n ra m if ic a d a e n la posición 10, y un s e g u n d o p e p tid o te n ia la a c ila c io n ra m if ic a d a e n la posición 40. L a f ig u ra 5 (e n la p a rte s u p e r io r ) re p re s e n ta la e s tru c tu ra d e l u n ic o re s id u o d e L y s a c ila d o que lle v a d o s a c ila c io n e s e n u n a fo rm a c io n ra m if ic a d a . En o tro e je m p lo , un p e p tid o c o m p re n d ia un re s id u o d e a m in o a c id o a c ila d o que lle v a b a d o s a c ila c io n e s en u n a fo rm a c io n lin e a l. La F ig u ra 5 A (m e d io ) re p re s e n ta la e s tru c tu ra d e l u n ic o re s id u o d e L ys a c ila d o que lle v a u n a a c ila c io n C 12 u n id a a u n a a c ila c io n C 16 a t ra v e s d e un e s p a c ia d o r gE e n u n a fo rm a c io n lin e a l. E n a u n o tro e je m p lo , un p e p tid o que c o m p re n d ia d o s re s id u o s de aminoácidos a c ila d o s : u n o e n la posición 10 y o tro e n la posición 40. La f ig u ra 5 (e n la p a r te in fe r io r ) re p re s e n ta la e s tru c tu ra d e c a d a re s id u o d e L ys a c ila d o que lle v a u n a a c ila c io n d e C 16 a tra v e s d e un e s p a c ia d o r gE. L o s p a re n te s is in d ic a n que lo s re s id u o s d e L y s e s ta n c o n e c ta d o s a tra v e s d e lo s a m in o a c id o s d e la c a d e n a p r in c ip a l e n la s posición e s 11 -39.

S e e n s a y a ro n lo s p e p tid o s que lle v a n d o s a c ila c io n e s p a ra la a c t iv id a d in v it ro en c a d a u n o d e l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2 y lo s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la Tabla 12.

E n el D ia 0, lo s p e p tid o s d e la Tabla 12, a s i c o m o d o s d im e ro s (d e s c r ito s e n e l Ejemplo 22 y la F ig u ra 9 ) y d o s péptidos adicionales (u n p e p tid o de SEQ ID N O : 28 y un p e p tid o de SEQ ID N O : 89 ) s e in y e c ta ro n p o r v ia s u b c u ta n e a u n a v e z e n ra to n e O (a u n a d o s is d e 10 n m o l/k g ) . L o s ra to n e s D IO h a b ia n s id o a d m in is t ra d o s c o n u n a d ie ta d ia b e to g e n ic a a n te s d e la in y e c c io n y e l p e s o c o rp o ra l p ro m e d io d e lo s ra to n e s fu e d e 60 g. El p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s d e lo s ra to n e s s e m id ie ro n lo s d ia s 0, 1, 3, 5 y 7, m ie n tra s que lo s n iv e le s de g lu c o s a e n s a n g re en a y u n a s s e m id ie ro n lo s d ia s 0 y 7.

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 5E , lo s ra to n e s que re c ib ie ro n u n a in y e c c io n d e p e p tid o m o s tra ro n u n a d is m in u c io n de l p e s o c o rp o ra l e n e l D ia 7 d e e s te e s tu d io , e n c o m p a ra c io n c o n lo s ra to n e s que fu e ro n in y e c ta d o s c o n un v e h ic u lo d e c o n tro l.

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 5F , lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re d is m in u y e ro n e n ra to n e s que re c ib ie ro n u n a in y e c c io n d e p e p tid o , e n c o m p a ra c io n c o n lo s ra to n e s que fu e ro n in y e c ta d o s c o n un v e h ic u lo d e c o n tro l.

EJEMPLO 20

L o s p e p tid o s s e a lq u ila ro n e n S d e tre s m a n e ra s d ife re n te s . E n u n a p r im e ra fo rm a , un re s id u o d e C y s a lq u ila d o co n p a lm it i lo e n S e ra p a rte d e la c a d e n a p r in c ip a l de l p e p tid o . El re s id u o d e C y s a lq u ila d o s e lo c a liz a b a en la posición 40. L a e s tru c tu ra s e m u e s tra e n la F ig u ra 6 (p a r te in fe r io r ) y s e m u e s tra c o m o S E Q ID N O : 164 e n e l lis ta d o d e secuencia s . E n u n a s e g u n d a fo rm a , un re s id u o d e C y s se ag lqú un ila d o co n p a lm iti lo en S s e u n ia a un re s id u o d e L ys , c u y o re s id u o d e L ys s e lo c a liz a b a e n la posición 40 d e l p e p tid o . La e s tru c tu ra re s u lta n te s e m u e s tra e n la F ig u ra 7 (C y s -S -p a lm it ic o ) y s e m u e s tra c o m o S E Q ID N O : 165 e n e l l is ta d o d e secuencia s . En u n a te rc e ra fo rm a , un re s id u o d e C y s a lq u ila d o c o n p a lm iti lo e n S s e u n io a un re s id u o e s p a c ia d o r (a c id o g a m m a -g lu ta m ic o ) , que a s u v e z s e u n ia a un re s id u o d e L y s s itu a d o e n la posición 40 de l p e p tid o . L a e s tru c tu ra re s u lta n te s e m u e s tra e n la F ig u ra 7 (g E -C y s -S -p a lm it ic o ) y s e m u e s tra c o m o S E Q ID N O : 166 e n e l l is ta d o d e secuencia s . Se produjeron lo s p e p tid o s a lq u ila d o s en S, tal como se describe e n e l Ejemplo 1.

L o s p e p tid o s s e a n a liz a ro n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o de l re c e p to r d e g lu c a g o n , re c e p to r d e G L P -1 y re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l e je m p lo 2. L a s E C 50 e n c a d a re c e p to r p a ra c a d a p e p tid o s e in d ic a n a c o n t in u a c io n en la ta b la 13.

101 EJEM PLO 21

S e e n s a y a ro n la s a c t iv id a d e s in v iv o d e lo s p e p tid o s s e le c c io n a d o s d e lo s Ejemplo s a n te r io re s m e d ia n te in y e c c io n s u b c u ta n e a d e 10 n m o l/k g d e p e s o c o rp o ra l e n ra to n e s D IO . El p e s o c o rp o ra l p ro m e d io d e lo s ra to n e s fu e d e 60 g y h a b la 8 ra to n e s p o r g ru p o .

E n tre lo s p e p tid o s e n s a y a d o s h a b la n un p e p tid o a c ila d o co n un e s p a c ia d o r d e a c id o g a m m a -g lu ta m ic o , un p e p tid o a c ila d o c o n un e s p a c ia d o r d ip e p tid o d e d o s a c id o s g a m m a -g lu ta m ic o , un p e p tid o s u c c in o ila d o e n C 16 , un p e p tid o a c ila d o c o n un e s p a c ia d o r m in iP E G que c o m p re n d e la e s tru c tu ra ( -O -C H 2-C H 2-)n, d o n d e n e s 2 , un p e p tid o a c ila d o c o n un e s p a c ia d o r m in iP E G que c o m p re n d e la e s tru c tu ra ( -O -C H 2-C H 2- K d o n d e n e s 4, un p e p tid o a c ila d o c o n un e s p a c ia d o r m in iP E G que c o m p re n d e la e s tru c tu ra ( -O -C H 2-C H 2- K d o n d e n e s 8, un p e p tid o a lq u ila d o co n p a lm iti lo e n S, e n e l que la L ys e s e l re s id u o d e la c a d e n a p r in c ip a l y C y s e s un e s p a c ia d o r e n tre la L ys y e l g ru p o a c ilo , y un p e p tid o a lq u ila d o c o n p a lm it i lo e n S, e n el que L ys e s el re s id u o d e la c a d e n a p r in c ip a l y a c id o g a m m a -g lu ta m ic o -C y s e s un e s p a c ia d o r d ip e p tid o e n tre la L ys y e l g ru p o a c ilo . E l p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s s e m id ie ro n lo s d la s 0, 1, 3, 5 y 7 , m ie n tra s que s e to m a ro n m e d ic io n e s d e g lu c o s a e n s a n g re e n lo s d la s 0 y 7.

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 8, m u c h o s d e lo s p e p tid o s e n s a y a d o s d e m o s tra ro n al m e n o s u n a d is m in u c io n de l 5 % e n e l c a m b io to ta l en e l p e s o c o rp o ra l m e d id o e l d la 7.

EJEMPLO 22

Se produjeron t re s h o m o d lm e ro s , e n d o n d e c a d a h o m o d lm e ro c o m p re n d la d o s p e p tid o s d e S E Q ID N O : 167. El re s id u o L ys C - te rm in a l (e n la posición 40 ) d e c a d a p e p tid o d e la S E Q ID N O : 167 s e a m id o (e n lu g a r d e c o n te n e r un c a rb o x ila to a lfa ) y e l g ru p o e p s ilo n N H 2 d e e s te re s id u o d e L ys e s ta b a u n id o a l p e p tid o a un re s id u o d e C ys , q u e a su v e z s e u n la a un re s id u o d e a c id o g a m m a -g lu ta m ic o . El re s id u o d e a c id o g a m m a -g lu ta m ic o s e u n io a un g ru p o a c ilo C 16. C a d a m ita d d e l d lm e ro s e u n la a la o tra m ita d a t ra v e s d e un e n la c e d is u lfu ro o un e n la c e t io e te r . El e je m p lo 1 d e ta l la la s ln te s is d e lo s h o m o d lm e ro s .

L a s e s tru c tu ra s d e lo s p ro d u c to s re s u lta n te s s e m u e s tra n e n la s F ig u ra s 9 A y 9B .

L o s h o m o d lm e ro s s e e n s a y a ro n p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o d e l re c e p to r d e g lu c a g o n , el re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n e l Ejemplo 2. L a s E C 50 e n c a d a re c e p to r p a ra c a d a p e p tid o s e e n u m e ra n a c o n t in u a c io n e n la Tabla 14.

103 EJEM PLO 23

S e in y e c ta ro n ra to n e s D IO (8 a n im a le s p o r g ru p o , p e s o c o rp o ra l p ro m e d io d e 54 g ) p o r v ia s u b c u ta n e a c o n u n o d e lo s 4 p e p tid o s d e s c r ito s e n la s ig u ie n te ta b la a 1 n m o l/k g /d la o 3 n m o l/k g /d la , o s e le s a d m in is tro un v e h lc u lo d e c o n tro l c a d a d la . L a s e s tru c tu ra s y s u s a c t iv id a d e s in v it ro a c a d a u n o d e l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 y e l re c e p to r d e G IP s e p ro p o rc io n a n e n la Tabla 15.

T A B L A 15

El p e s o c o rp o ra l y la in g e s ta d e a lim e n to s s e m id ie ro n c a d a d o s d la s , c o m e n z a n d o c o n e l d la 0 (e l d la d e la p r im e ra a d m in is tra c io n ) . L a c o m posición c o rp o ra l s e m id io e n lo s d la s 0 y 19, m ie n tra s que lo s n iv e le s d e g lu c o s a e n s a n g re a d lib s e m id ie ro n lo s d la s 0, 7, 14, y 20. S e m id io ip G T T (1 g /k g ) e n e l d la 20 a lo s 0, 15, 20 , 60 , 120 m in u to s d e s p u e s d e la in y e c c io n c o n g lu c o s a ). S e re a liz o la n e c ro p s ia (h lg a d o y p a n c re a s ) y s e m id io un s a n g ra d o f in a l e n el d la 22 (d e s p u e s d e u n a n o c h e d e a y u n o ).

T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 10, el p e s o c o rp o ra l d is m in u y o e n to d o s lo s a n im a le s que re c ib ie ro n un p e p tid o d e la ta b la 15. La in g e s ta d e a lim e n to s c o m o s e m id e e n el D la 19 s e re d u jo e n to d o s lo s a n im a le s que fu e ro n a d m in is t ra d o s co n un p e p tid o d e la Tabla 15, e n c o m p a ra c io n c o n lo s ra to n e s que re c ib ie ro n un v e h lc u lo d e c o n tro l. T a l c o m o s e m u e s tra e n la F ig u ra 11, lo s n iv e le s d e in s u lin a ( tal como s e m id io e n e l d la 21 ) ta m b ie n d is m in u y e ro n e n lo s a n im a le s que re c ib ie ro n un p e p tid o , en c o m p a ra c io n c o n un v e h lc u lo . C a b e d e s ta c a r que lo s ra to n e s que h a b la n m o s tra d o la m a y o r c a n t id a d d e p e rd id a d e p e s o e ra n ta m b ie n lo s ra to n e s que m o s tra ro n lo s n iv e le s d e in s u lin a m a s b a jo s

EJEMPLO 24

S e s e le c c io n a ro n p e p tid o s que m o s tra ro n u n a c a p a c id a d d e d is m in u c io n d e l p e s o c o rp o ra l, tal como s e e v a lu o e n el Ejemplo 21 p a ra e s tu d io s d e m u ta t io n a d ic io n a le s , e n lo s que lo s a m in o a c id o s d e n tro d e la m ita d C - te rm in a l de l p e p tid o fu e ro n m o d if ic a d o s en u n a d e v a r ia s m a n e ra s . E n u n a p r im e ra fo rm a , e l p e p tid o que t ie n e la s e c u e n c ia de S E Q ID N O : 89 s e m o d if ic o d e m a n e ra que e l a m in o a c id o e n la posición 27 , 28 , o 29 s e s u s t itu y o p o r un re s id u o d e a la n in a . En o tra fo rm a , e l p e p tid o que t ie n e la s e c u e n c ia de SEQ ID N O : 28 s e m o d if ic o p a ra te n e r un G lu en la posición 28 y u n a A rg e n la posición 35. S e te o r iz o que un p u e n te s a lin o e n tre e s to s d o s a m in o a c id o s fo rm a r la un p u e n te s a lin o p a ra e s ta b i l iz a r la e s tru c tu ra d e ja u la d e T rp e n la p a r te C - te rm in a l d e l p e p tid o . P o r u lt im o , e l p e p tid o que t ie n e la secuencia de SEQ ID N O : 28 s e m o d if ic o p a ra in c lu ir u n a G ly c o m o a m in o a c id o C - te rm in a l. L o s p e p tid o s , a s ! c o m o o tro s p e p tid o s que s e p a re c e n a l p e p tid o de SEQ ID N O : 89 o a l p e p tid o d e la S E Q ID N O : 28 , s e e n s a y a ro n p a ra d e te rm in a r la s a c t iv id a d e s in v it ro e n c a d a u n o d e l re c e p to r d e g lu c a g o n , e l re c e p to r d e G L P -1 y el re c e p to r d e G IP , tal como e s e n c ia lm e n te s e h a d e s c r ito e n e l Ejemplo 2 y lo s re s u lta d o s s e p ro p o rc io n a n e n la Tabla 16.

T A B L A 16

EJEMPLO 25

Se produjeron p e p tid o s , tal como se describe e s e n c ia lm e n te e n el Ejemplo 1, y s e e n s a y a ro n p a ra la a c t iv id a d in v it ro e n c a d a u n o d e lo s re c e p to re s de glucagón G L P -1 y G IP , tal como se describe n e s e n c ia lm e n te e n e l p re s e n te d o c u m e n to . L a s e s tru c tu ra s y lo s v a lo re s d e E C 50 (n M ) d e c a d a p e p tid o s e p ro p o rc io n a n a c o n t in u a c io n e n la Tabla 17.

El u s o d e lo s te rm in o s "u n " y "u n a " y "e l/ la " y re fe re n te s s im ila re s e n el c o n te x to d e la d e s c r ip c io n d e la in v e n c io n (e s p e c ia lm e n te e n e l c o n te x to de las s ig u ie n te s reivindicaciones ) d e b e in te rp re ta rs e que c u b re n ta n to e l s in g u la r c o m o el p lu ra l, a m e n o s que s e in d ique lo c o n tra r io e n e s te d o c u m e n to o s e c o n tra d ig a c la ra m e n te p o r e l c o n te x to . L o s te rm in o s "que c o m p re n d e " , "que t ie n e " , "que in c lu y e " y "que c o n t ie n e " d e b e n in te rp re ta rs e c o m o te rm in o s a b ie r to s (e s d e c ir , que s ig n if ic a n "que in c lu y e n , p e ro n o lim ita d o a ") a m e n o s que s e in d ique lo c o n tra r io .

L a m e n c io n d e in te rv a lo s d e v a lo re s e n e l p re s e n te d o c u m e n to p re te n d e m e ra m e n te s e rv ir c o m o un p ro c e d im ie n to a b re v ia d o p a ra re fe r irs e in d iv id u a lm e n te a c a d a v a lo r s e p a ra d o que c a e d e n tro d e l in te rv a lo y c a d a p u n to f in a l, a m e n o s que s e in d ique lo c o n tra r io e n e l p re s e n te d o c u m e n to , y c a d a v a lo r y p u n to f in a l p o r s e p a ra d o s e in c o rp o ra n e n la m e m o r ia c o m o si s e h u b ie ra n m e n c io n a d o in d iv id u a lm e n te e n e s te d o c u m e n to .

T o d o s lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n e s te d o c u m e n to p u e d e n re a liz a rs e e n c u a lq u ie r o rd e n a d e c u a d o a m e n o s que s e in d ique lo c o n tra r io e n e s te d o c u m e n to o s e c o n tra d ig a c la ra m e n te p o r e l c o n te x to . El u s o d e cualquiera y d e to d o s lo s e je m p lo s , o e l le n g u a je d e e je m p lo (p o r e je m p lo , " tal como " ) p ro p o rc io n a d o e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e m e ra m e n te i lu m in a r m e jo r la p re s e n te in v e n c io n y n o p la n te a u n a lim ita c io n e n e l a lc a n c e d e la p re s e n te in v e n c io n a m e n o s que s e re iv in d ique lo c o n tra r io . N in g u n le n g u a je e n la m e m o r ia d e s c r ip t iv a d e b e in te rp re ta rs e c o m o u n a in d ic a t io n d e que c u a lq u ie r e le m e n to n o re iv in d ic a d o e s e s e n c ia l p a ra la p ra c t ic a d e la p re s e n te in v e n c io n .

L a s re a liz a c io n e s p re fe r id a s d e la p re s e n te in v e n c io n se describe n en e l p re s e n te d o c u m e n to , in c lu y e n d o el m e jo r m o d o c o n o c id o p o r lo s in v e n to re s p a ra l le v a r a c a b o la p re s e n te in v e n c io n . L a s v a r ia c io n e s d e e s ta s re a liz a c io n e s p re fe r id a s p u e d e n re s u lta r e v id e n te s p a ra lo s d e e x p e r ie n c ia o rd in a r ia e n la te c n ic a a l le e r la d e s c r ip c io n a n te r io r . L o s in v e n to re s e s p e ra n que lo s e x p e r to s e m p le e n d ic h a s v a r ia c io n e s , seg s eú an a p ro p ia d o , y lo s in v e n to re s p re te n d e n que la p re s e n te in v e n c io n p u e d a s e r p ra c t ic a d a d e m a n e ra d is t in ta a la d e s c r ita e s p e c lf ic a m e n te e n e s te d o c u m e n to .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Análogo de glucagon que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 con hasta 3 modificaciones de aminoacidos.

2. Análogo de glucagón según la reivindicación 1, con un total de hasta 2 modificaciones de aminoácidos.

3. Análogo de glucagón, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 , con un total de hasta 1 modificación de aminoacido.

4. Análogo de glucagón, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de SEQ ID NO : 28.

5. Análogo de glucagón, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que consiste en la secuencia de SEQ ID NO : 28.

6^.Composición farmacéutica que comprende el análogo de glucagon, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica, según la reivindicación 6, para su uso en la reducción de la ganancia de peso o inducción de la pérdida de peso en un sujeto en necesidad de la misma.

8. Composición farmacéutica, según cualquiera de las reivindicaciones 6 -7 , para su uso en el tratamiento de la obesidad.

9. Composición farmacéutica, según la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de diabetes.