CN103221398B - 用于快速构建放射性核素标记探针的四嗪-反式环辛烯连接反应 - Google Patents

用于快速构建放射性核素标记探针的四嗪-反式环辛烯连接反应 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种反式环辛烯与四嗪的狄尔斯-阿尔德加合物，其中所述加合物具有标记有放射性核素的取代基。一种产生动物或人中的器官的PET或其他图像的方法包括在所述动物或人中形成所述狄尔斯-阿尔德加合物。本发明提供了适用于制备所述加合物的反式环辛烯和四嗪。

Description

用于快速构建放射性核素标记探针的四嗪-反式环辛烯连接反应
发明背景
正电子发射断层显像(PET)是利用发射正电子的放射性核素(C-11、N-13、O-15和F-18)的无创成像方法。例如，F-18PET具有许多使其具有临床吸引力的属性，包括100％正电子效率、非常高的比放射性和约110分钟的短半衰期。但是，F-18的短半衰期和氟化物的不良亲核性使得其很难将F-18合并到复杂分子中。目前，放射化学是PET领域的主要限制因素。尽管最近有一些进展，但是在反应速率、效率和选择性方面改善F-18合并仍存在挑战。
本发明人先前描述了作为一种以快速反应速率进行并且不需要催化的生物缀合方法的四嗪-反式环辛烯连接反应(ligation)(“TTCO连接反应”)(M.L.Blackman，M.Royzen和J.M.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130，13518-13519.)。使用本发明人开发的光化学流反应(photochemicalflow-reaction)由顺式环辛烯容易地制备了反式环辛烯衍生物(M.Royzen，G.P.A.Yap和J.M.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130，3760-3761)。本发明人发现，3，6-二芳基-s-四嗪为缀合物和原始材料二者提供了快速反应性和稳定性的优良组合。尤其是，已表明3，6-二(吡啶基)-s-四嗪表现出优良特性。因此，反式环辛烯与1a之间的反应快速进行(在9∶1MeOH∶水中k2为～2000M-1s-1)，并且在细胞基质和细胞溶解产物中成功进行。3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪可容易地功能化为其酰胺衍生物(1b)，从而表现出对于水的优良稳定性和生物亲核性。
因为快速反应性，所以TTCO连接反应为放射性核素与生物分子的快速缀合提供了机会，所述两种物质经常仅可以在较低浓度下获得。
发明内容
在一方面，本发明提供了反式环辛烯与四嗪的狄尔斯-阿尔德加合物(Dies-Alderadduct)，其中所述加合物具有标记有放射性核素的取代基。
在另一方面，本发明提供了一种产生动物或人中的器官的PET或其他图像的方法。所述方法包括在动物或人中形成反式环辛烯与四嗪的狄尔斯-阿尔德加合物，其中所述加合物具有标记有放射性核素的取代基。
在另一方面，本发明提供了根据结构5的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构9的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构17的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构13的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构24的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构25的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构26的化合物
在另一方面，本发明提供了根据结构27的化合物
附图说明
图1示出c(RGDyK)(12)和19F-15的细胞结合亲和力研究。
图2是用于进行氟化(～200mCi)的自动化合成模块的示意图。
图3A示出18F-41的肿瘤和主要器官摄取。
图3B示出通过microPET定量的18F-43在正常SpragueDawley裸鼠目标区域中的生物分布。
发明详述
本发明提供了一种基于TTCO连接反应产生放射性核素标记探针的极快速反应方法，所述方法采用3，6-二芳基-s-四嗪与反式环辛烯之间的狄尔斯-阿尔德反应，其中之一标记有放射性核素，例如18F。所述反应以异常快的速率进行，提供了在较低微摩尔浓度下在几秒内有效缀合的方法。使用本发明的化合物和方法可有效标记动物或人的器官用于PET或其他成像。在典型用途中，狄尔斯-阿尔德加合物与生物分子共价结合。这可通过在与生物分子反应之前来源于反式环辛烯或四嗪上存在之取代基的连接基来实现。
本发明提供了将TTCO连接反应用于标记的多种方式，正如现在将描述的。首先描述了用18F标记，然后描述了用另一些放射性核素标记。
18 F标记四嗪
本发明人将注意力集中于开发通过与氟化物离子反应用于18F合并的直接方法，最初是集中于合成18F标记四嗪(方案1)。使用18F-氟化物/穴醚(kryptofix)或18F-TBAF将硝基四嗪2a和2b转化为18F标记取代产物3的尝试得到了分解产物和仅有痕量的放射性标记产物。本发明人还将甲磺酸酯(mesylate)4与氟化物进行化合，在最成功的实验中(18F-TBAF，85℃，15分钟)，得到18F标记产物5的标记收率为～1％。
方案1.合成18F标记四嗪。尝试通过亲核取代制备3的收率低。使4氟化(18F-氟化物，MeCN，85℃，15分钟)得到5，放射化学收率仅为1％。
18 F标记反式环辛烯
以上困难促使本发明人考虑用于制备18F标记反式环辛烯的方法。为此，本发明人合成了间硝基苯磺酸酯(nosylate)8，如方案2所示。合成的关键步骤是使用流动反应器(flowreactor)将6光异构化为7，所述流动反应器通过选择性金属络合连续地移除反式异构体。参见M.Royzen，G.Yap和J.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130(12)，3760。7的主要非对映异构体继续合成8。
方案2.合成反式环辛烯间硝基苯磺酸酯8。试剂和条件：(a)NaH、α-溴乙酸，(b)CH2N2，69％，两步(c)DIBAL，78％(d)苯甲酸甲酯敏化的光异构化，并且主动移除反式异构体，AgNO3，55％。(e)NsCl，Et3N，87％。
间硝基苯磺酸酯8与TBAF有效反应得到高收率的19F-9。本文使用的作为结构名称一部分的标记19F-指示化合物未被放射性标记，而18F-指示标记。
然后优化了制备18F-9的条件(表1)。发现将间硝基苯磺酸酯8添加到乙腈(0.8mL)中[18F]-氟化物(100mCi)/四丁基碳酸氢铵(TBAB)的混合物中可得到良好收率的18F-9。本发明人在在75℃进行15分钟的反应中测定了改变8浓度的影响(表1，条目1-4)。
表1.18F标记反式环辛烯合成的优化
a使用K2CO3/K222代替TBAB，在相似条件下得到比较结果(放射化学收率70％)。
使用7.0mM8实现了最高标记收率(71％)，但是使用0.35mM8仍然得到有用的放射化学收率(18％)。对不同反应温度进行研究，发现75℃最佳(表1，条目3、5-7)。最后，本发明人在75℃下使用2mg8研究了18F标记根据时间的效率(表1，条目8-10)。虽然在进行15分钟的实验中标记收率最佳(71％)，但是在3分钟(43％)和7分钟(68％)后也得到有用的标记收率。总之，对于18F标记，条目3表现最佳。
更一般地，本发明人提供了其中O与18F之间的间隔基团是亚烷基的18F-9类似物。例如，所述亚烷基可以是C2亚烷基(如在18F-9中)，或者可以是C3至C20，更通常是C3至C10，并且最通常是C3至C5的任何亚烷基。在另一个示例性实施方案中，18F-9的类似物使用18F-CH2-苯基部分代替18F-9的18F-CH2-CH2部分。这种化合物可由相应的溴化物、氯化物、碘化物、磺酸酯等通过用18F氟化物亲核取代来制备。
本发明人还使用光化学流动反应器(M.Royzen，G.Yap和J.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130(12)，3760)来合成16——带有可功能化基团的7的类似物。化合物16与3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪(1a)在甲醇中的反应速率为k2＝22000M-1s-1，比1a与反式环辛烯在相同溶剂中的反应快18倍。在水性溶剂系统中，1a与16之间的反应甚至更快，实际上快得不能通过紫外可见光谱测量。(四嗪连接反应由于疏水作用表现出显著加速)。除了优良反应性之外，16还表现出优良稳定性，表现为在水或人血清中24小时之后或当暴露于MeOH中的5mM正丁胺或MeOH中的5mM乙硫醇24小时时无降解。化合物16可容易地转化为氨基甲酸酯衍生物，并且化合物16使用马来酰亚胺26(见下文)与半胱氨酸残基的缀合可与蛋白质硫氧还蛋白选择性缀合，该缀合物可进而参与四嗪连接反应，该反应与对于化合物16的以下示出的反应相似。
标记化合物18F-17可由化合物16使用制备标记化合物18F-19的相同一般方法来制备。
18 F标记反式环辛烯与四嗪的反应
通过已知方法，例如M.L.Blackman，M.Royzen和J.M.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130，13518-13519和R.Rossin，P.R.Verkerk，S.M.V.d.Bosch，R.C.M.Vulders，I.Verel，J.Lub和M.S.Robillard，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，3375-3378所述的方法，容易地制备了3，6-一(2-吡啶基)-s-四嗪的衍生物(例如1b)。因此，将3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪(1a)用于测试18F标记反式环辛烯9在TTCO连接反应中的效率。最初用19F-9进行了“冷(cold)”研究。缀合物19F-10立即形成，然后缓慢异构化为作为异构体混合物的1，4-二氢吡嗪19F-11(方案3，示出相应的18F化合物)。这些同位素稳定的缀合物充当用于分析与18F-9反应的共注射标准物。
方案39与1a之间的缀合快速发生，形成缀合物10，其缓慢重排为作为部位和立体异构体混合物的11。
1a与18F-9之间的缀合在1∶1乙腈/水中进行，并在混合10秒内进行分析。在缀合之前，18F-9经HPLC纯化并容易地与未反应前体8分离。当18F-9(1mCi，2μM)与1a(浓度≥21μM)化合时，18F-9在10秒内被完全消耗，形成了放射化学收率为98％的18F-10，并伴随有18F-11(1％)(表2，条目1-2)。当18F-9的浓度降低至0.1mCi(0.2μM)时，缀合物18F-10/11仍然以优良放射化学收率形成(98％，条目3)。通过甚至更低的1a浓度也可得到有用的放射化学收率(条目4-5)。本发明人还研究了PBS缓冲液和血清基质中1a(21μM)与18F-9(1mCi，2μM)之间缀合的效率，并且发现在10秒内18F-10以定量收率形成(条目6-7)。
表2浓度对通过18F-9与3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪之间的缀合形成18F-10的影响。所有反应都在室温下进行。
a考虑到对放射性衰变速率的校正，基于轰击(～4Ci/μmol)后氟化物的比活性估计18F-9的浓度。
发现狄尔斯-阿尔德缀合物10在水中稳定，并且良性的异构化为11是唯一的副反应。因此，19F-10是缀合后立即进行1HNMR分析检测到的唯一产物。在CD3CN/H2O中，19F-10重排成19F-11在4小时后进行了11％转化，在48小时后进行了＞95％转化。在PBS缓冲液和血清基质中监测了4小时的放射性标记缀合产物的稳定性，观测到没有18F-10的降解产物。
生物分子的 18 F标记
如现在将描述的，使用基于上述TTCO连接反应方法和组合物的生物缀合可容易地对生物分子进行放射性标记。这使得在PET和其他体内应用中用于生物分子18F标记的可靠方法成为可能。在一个实施方案中，本发明提供了与具有含18F取代基的环辛烷共价结合的蛋白质或肽。
在此，本发明人报道了基于四嗪-反式环辛烯连接反应，用于成像(例如癌症成像)的18F标记PET探针的构建。
方案4
整合素αvβ3在肿瘤血管的内皮表面上调，并且与肿瘤进展和转移有关。已表明整合素αvβ3的放射性标记合成RGD拮抗剂是用于癌症成像的有效工具。虽然F-18合并到RGD模拟物中的策略在本领域中是已知的，但是它们通常包括冗长的合成步骤。因此，得到高放射化学收率并且开发可自动化的合成方案具有挑战性。现在已发现，F-18标记的RGD肽可使用四嗪-反式环辛烯连接反应来构建，从而允许通过整合素αvβ3体内表达的PET成像来进行癌症检测、患者分层(patientstratification)和治疗监测。进行其的一种方法涉及使用18F标记，如方案4所示。
如方案4所示，通过NHS酯13与肽c(RGDyK)(12)偶联容易地制备了四嗪-RGD缀合物14。为了提供LC标准，然后将四嗪-RGD缀合物14与19F-TCO(9)化合以得到作为异构体混合物的19F-15(因为最初形成的4，5-二氢哒嗪异构化为对应的1，4-二氢哒嗪)。
进行了c(RGDyK)(12)和19F-15的细胞结合亲和力研究(图1)。两种肽均以剂量依赖性方式抑制125I-锯鳞血抑肽(echistatin)与U87MG细胞(整合素αvβ3阳性人成胶质细胞瘤)的结合。c(RGDyK)和19F-四嗪-RGD的IC50值分别为(1.16±0.35)×10-7和(1.93±0.27)×10-7M，表明氟化标记对15RGD部分的整合素结合亲和力仅有很小影响。
然后研究了用18F-9标记四嗪-RGD肽的反应速率。18F-9由间硝基苯磺酸酯8合成。18F-9与四嗪-RGD的缀合在室温下进行5分钟。所述缀合是有效且高收率的：开始仅有30μg(78μM)四嗪-RGD缀合物14和2mCi(5μM)18F-反式环辛烯，通过HPLC分析5分钟后标记收率为90％。在5％EtOH存在下在PBS中评价了18F-四嗪-RGD缀合物15的稳定性。稳定性优良：如通过放射性HPLC分析判断，在孵育6小时后仍保留＞95％的示踪剂。
对于18F-四嗪-RGD缀合物15，通过将其注射到具有U87MG肿瘤的无胸腺雌性裸鼠中进行静态microPET扫描。早在30分钟的时间点上就观测到高的肿瘤积累。肿瘤摄取在注射0.5、1、2、4小时后分别为4.6±0.2％、4.4±0.6％、4.2±0.6％和2.7±0.5％ID/g。18F-15通过肝和肾二者被清除。直至注射4小时后，在腹部仍然积累有相当量的放射性，这可能是因为该系统的相对疏水性。
通过共注射10mg/kg的c(RGDyK)和18F-15还进行了阻断实验(blockingexperiment)。U87MG肿瘤中的示踪剂摄取在注射0.5、1、2、4小时后分别下降至1.4±0.2％、1.0±0.3％、0.6±0.2％和0.4±0.1％ID/g。该成功阻断表明示踪剂18F-15与整合素αvβ3特异性结合。
在另一个实施例中，18与9缀合得到缀合物19是极其快速并且极其有效的，并且缀合物19在溶液中自发氧化，形成芳香化合物20。
通过将18F标记的19注射到无胸腺裸鼠中并且在注射2小时后处死来进行19的体内代谢研究。收集主要组织并均质化。提取(CH3CN)放射性物、过滤(C18Sep-Pak柱)、蒸发并通过HPLC分析。每分钟收集级分，然后用γ-计数器测量并通过HPLC分析放射性。与化合物15相比，完整示踪剂的平均分数显著提高，这表明产生了强亲水降解产物。对于18F-19，未观测到亲水副产物。
因为在任何microPET扫描中都没有观测到可见的骨摄取，所以没有观测到18F-19的脱氟作用。18F-19在体内表现出良好的代谢稳定性，并且将18F-19注射到U87MG小鼠模型中产生了一种用于αvβ3成像的有效方法。通过阻断实验(在注射18F-19之前施用未标记的cRGD)证明了整合素αvβ3受体特异性。
在另一个实施例中，本发明人合成了二氨基四嗪21和衍生物22，可期望其表现出与反式环辛烯(如9)的快速缀合，同时提供强的体内稳定性。
在另一方面，本发明提供了用于使四嗪和反式环辛烯与蛋白质缀合的有效方法。如下所示，胺反应性的NHS-酯13可容易地转化为硫醇反应性的马来酰亚胺衍生物24。这些分子的反应官能性可用于使四嗪与蛋白质(例如，VEGF蛋白)的赖氨酸和半胱氨酸残基缀合。由5-氧代-5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)戊酸依次通过R.Rossin，P.R.Verkerk，S.M.v.d.Bosch，R.C.M.Vulders，I.Verel，J.Lub和M.S.Robillard，Angew.Chem.Int.Ed.2010，49，3375-3378的方法可制备NHS-酯13。
相似地，本发明人制备了如下所示的反式环辛烯的胺反应性(25)和硫醇反应性(26，27)双功能缀合物。通过16与4-硝基氯甲酸苯酯反应容易地得到化合物25，收率为62％。用n-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐处理25得到26，收率为32％。化合物27根据M.L.Blackman，M.Royzen和J.M.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130，13518-13519的方法来制备。
本发明人已将马来酰亚胺26和27与蛋白质(硫氧还蛋白)使用本领域已知的标准方法进行缀合，并且已表明该缀合物以高收率进行快速的四嗪连接反应。另一些蛋白质可类似地根据本发明进行缀合。如下所示，化合物33(27与硫氧还蛋白的缀合物)快速地与3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪(1a)加成，其中Trx表示硫氧还蛋白残基。
通过用胺反应性衍生物(如24或25)修饰野生型VEGF121蛋白的赖氨酸，VEGF蛋白可标记上18F。所得缀合产物(分别为29和30)可与反式环辛烯18F-17和四嗪18F-5化合，分别得到放射性标记缀合物18F-31和18F-32。
本发明的另一些示例性标记化合物包括以下化合物。
以上结果证明了基于四嗪-反式环辛烯连接反应并且使用本发明方法和组合物的用于PET或其他探针构建的有效标记方法。这些技术的主要优点在于能在低浓度下实现快速有效的生物缀合。虽然以上实施例采用具体的示例性生物分子，但是本文所述方法和组合物并不限于那些实施方案，并且任何生物分子的标记都在本发明范围内。可被标记的合适生物分子的另一些非限制性实例包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和经修饰寡核苷酸等。
使用四嗪-反式环辛烯连接反应用放射性核素标记生物分子不限于以上讨论的具体反式环辛烯和四嗪；可以使用任何放射性标记的四嗪或反式环辛烯。本发明包括用除F之外的放射性核素标记生物分子。本发明化合物的另一些合适实例包括以下化合物，其所有都可用于标记生物分子。
例如，使用124I可适用于产生PET探针，而125I和131I可适用于制备SPECT探针。
实施例
一般考虑
所有的可商购化学试剂不经过进一步纯化即可使用。使用SilacycleP60硅胶进行色谱分析。所有的湿度敏感性反应在经真空下火焰干燥并在氮气下冷却的玻璃器皿中进行。固相萃取柱体(硅胶，900mg)购买自Waters。离子交换柱体购买自ABX(德国)。
(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙酸
将氢化钠(1.14g，26.4mmol)添加到经火焰干燥的圆底烧瓶中。NaH用干燥己烷(10mL)清洗，然后轻轻倒出。添加干燥四氢呋喃(15mL)并将混合物在室温下搅拌。将四氢呋喃(10mL)中的顺式环辛烯-4-醇(P.Lombardi，ChemistryandIndustry1990，21，708)(0.834g，6.61mmol)添加到烧瓶中。将混合物搅拌并加热回流1小时。添加四氢呋喃(25mL)中的α-溴乙酸(0.919g，6.61mmol)并且使混合物回流过夜。将混合物冷却至室温，然后在旋转蒸发仪上浓缩。残余物在冰浴中冷却，添加水，然后用3MHCl酸化。水层用三份醚萃取。萃取物经MgSO4干燥并在真空下浓缩得到油。标题化合物不经过进一步纯化直接用于下一步反应。
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.83(brs，1H)，5.55-5.43(m，2H)，3.70(d，JAB＝16.7Hz1H)，3.67(d，JAB＝16.7Hz，1H)，3.19-3.14(m，1H)，2.11-2.07(m，1H)，1.99-1.84(m，2H)，1.80-1.69(m，2H)，1.67-1.53(m，2H)，1.45-1.34(m，2H)，1.19-1.08(m，1H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ174.7(C)，130.2(CH)，129.5(CH)，81.8(CH)，65.6(CH2)，34.0(CH2)，33.1(CH2)，25.8(CH2)，25.5(CH2)，22.7(CH2).
IR(液体，CHCl3，cm-1)3235，2933，2859，1733，1619，1453，1330，1162，1133，
HRMS-ESIm/z：C10H16O3Na的[M+Na]计算值，207.0997；测定值：207.0994。
(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙酸甲酯
向锥形烧瓶(Erlenmeyerflask)中按顺序装入(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙酸(1.45g，7.90mmol)和乙醚(150mL)。使用Lombardi开发的装置将重氮甲烷引入到该烧瓶中。1从而将Diazald(5.07g，23.7mmol)和乙醇(150mL)添加到配备成鼓泡到上述锥形烧瓶中的已塞紧的烧瓶中。用氮气喷射乙醇混合物，并且在两个烧瓶前放置防爆屏蔽。通过注射器将水(10mL)中的氢氧化钠(7.30g，182mmol)缓慢添加到含乙醇的烧瓶中。通过这个Lombardi烧瓶鼓入氮气直至任何一个烧瓶中都不存在黄色。反应经柱色谱使用己烷中的5％醚至30％醚作为洗脱剂纯化，得到1.08g(69％，5.47mmol)作为无色油的标题化合物。
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.61-5.45(m，2H)，3.84(d，JAB＝16.6Hz，1H)，3.84(d，JAB＝16.6Hz，1H)，3.37(appdt，J＝4.1，9.1Hz，1H)，3.29(s，3H)，2.22-2.13(m，1H)，2.05-1.78(m，5H)，1.75-1.65(m，1H)，1.60-1.46(m，2H)，1.30-1.20(m，1H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ171.0(C)，130.4(CH)，129.5(CH)，81.5(CH)，66.1(CH2)，51.0(CH3)，34.3(CH2)，33.4(CH2)，26.0(CH2)，25.8(CH2)，22.8(CH2).
IR(液体，CHCl3，cm-1)3155，3019，2978，2934，2860，1753，1440，1383，1291，1216，1129，900，722，650.
HRMS-CI(NH3)m/z：C11H22NO3的[M+NH4]计算值，216.1599；测定值216.1590。
(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇(6)
将(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙酸甲酯(2.34g，11.9mmol)和无水醚(150mL)按顺序添加到干燥圆底烧瓶中。将烧瓶冷却至-78℃。通过注射器将乙醚(30mL)中的DIBAL(9.03mL，47.6mmol)缓慢添加到烧瓶中。将反应混合物在-78℃再搅拌3小时，然后升温至0℃并再搅拌3小时。反应用Na2SO4·10H2O在0℃淬灭。在真空下浓缩混合物。反应经柱色谱使用己烷中的5％醚至30％醚作为洗脱剂纯化，得到1.55g(78％，9.31mmol)作为无色油的标题化合物。
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.61-5.48(m，2H)，3.54-3.51(m，2H)，3.22-3.15(m，3H)，2.19-2.13(m，1H)，2.03-1.92(m，3H)，1.85-1.74(m，3H)，1.68-1.62(m，1H)，1.51-1.44(m，2H)，1.25-1.20(m，1H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ130.4(CH)，129.5(CH)，80.9(CH)，69.8(CH2)，62.2(CH2)，34.5(CH2)，33.4(CH2)，26.1(CH2)，25.8(CH2)，22.9(CH2).
IR(液体，CHCl3，cm-1)3456，3011，2975，2936，2861，1650，1447，1392，1252，1100，1049，988，875.
HRMS-ESIm/z：C10H18O2Na的[M+Na]计算值，193.1204；测定值193.1205。
主要非对映异构体：
2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙醇(7)
次要非对映异构体：
2-[rel-(1R-4E-pS)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙醇(7)
在石英烧瓶中将(Z)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇(1.54g，9.31mmol)和苯甲酸甲酯(2.49g，18.6mmol)溶解于500mL的9∶1醚∶己烷。使用M.Royzen，G.Yap和J.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130(12)，3760.描述的流动装置进行光异构化。进行以下小改装：使用Biotage“SNAP柱体”柱(50g，Biotage料号FSKO-1107-0050)，并且FMI泵型号为QG400。柱中填充8.5cm硅胶，然后在上部填充浸银硅胶(16g)。该柱用9∶1醚∶己烷(250mL)冲洗。以100mL/min的流速打开泵并开始辐射。使混合物的光异构化进行6小时。该柱用9∶1醚∶己烷(250mL)冲洗，然后用压缩空气干燥。将硅胶置于锥形烧瓶中并与氢氧化铵(200mL)和二氯甲烷(200mL)搅拌5分钟。过滤硅胶，将滤液置于分液漏斗中。分离有机层，然后用二氯甲烷萃取氢氧化铵层三次。组合有机层并用水清洗两次。有机层经MgSO4干燥，过滤，然后经柱色谱用己烷中的5％醚至30％醚纯化。两种非对映异构体单独是作为无色油的0.572g(3.44mmol，37％)的2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙醇和0.275g(1.66mmol，18％)的2-[rel-(1R-4E-pS)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙醇。主要非对映异构体被7％顺式异构体污染：可归属于顺式异构体的峰5.61-5.48(m)，1.51-1.44(m)。以对于C-1次甲基的化学位移为基础指定结构，如M.Royzen，G.Yap和J.Fox，J.Am.Chem.Soc.2008，130(12)，3760所述。
次要非对映异构体的光谱特性：
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.75-5.68(m，1H)，5.44-5.36(m，1H)，3.56(m，2H)，3.31-3.29(m，1H)，3.28-3.21(m，1H)，3.16-3.11(m，1H)，2.44(brs，1H)，2.41-2-31(m，1H)，2.24-2.21(m，1H)，2.12-2.08(m，1H)，1.99-1.91(m，2H)，1.89-1.71(m，2H)，1.63-1.57(m，1H)，1.25-1.17(m，1H)，0.98-0.91(m，1H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ136.0(CH)，131.5(CH)，75.2(CH)，70.4(CH2)，62.2(CH2)，40.4(CH2)，34.9(CH2)，33.2(CH2)，30.2(CH2)，27.9(CH)
IR(液体，CHCl3，cm-1)3428，3021，2923，2859，1655，1442，1352，1215，1135，1099，1050，989，907，738
主要非对映异构体的光谱特性：
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.56-5.34(m，1H)，5.22-5.14(m，1H)，3.53-3.52(m，2H)，3.22-3.17(m，1H)，3.12-3.07(m，1H)，2.81-2.77(m，1H)，2.20-2.16(m，2H)，2.05-2.00(m，2H)，1.95-1.92(m，1H)，1.81-1.68(m，4H)，1.35-1.20(m，2H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ135.5(CH)，132.2(CH)，86.0(CH)，69.6(CH2)，62.2(CH2)，41.1(CH2)，38.0(CH2)，34.8(CH2)，33.2(CH2)，31.9(CH2).
IR(液体，CHCl3，cm-1)3449，3012，2935，2861，1647，1445，1353，1198，1096，1050，993，968，797.
HRMS-CI(NH3)m/z：C10H19O2的[M+H]计算值，171.1385；测定值171.1384。
4-硝基苯磺酸-2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙酯(8)
将三乙胺(0.21mL，1.5mmol)添加到含无水醚(5mL)的经火焰干燥的圆底烧瓶中。将新进打开的瓶中的对硝基磺酰氯(0.073g，0.33mmol)添加到烧瓶中。将混合物在室温下搅拌30分钟。将混合物冷却至0℃，添加2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙醇。将混合物在0℃搅拌5小时。将冷的混合物直接转移到硅胶柱上。使用5％醚/己烷至20％醚/己烷的梯度作为洗脱剂经快速色谱得到0.093g(87％，0.26mmol)作为白色固体的标题化合物。
在使用对硝基磺酰氯的陈年瓶的实验中，形成了20％的(R，Z)-4-硝基苯磺酸-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙酯。E-异构体可使用制备型反相HPLC(C-18，20×250cm，65％甲醇/H2O)进行分离。对于18F标记实验，将4-硝基苯磺酸-2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙酯从顺式异构体中纯化出来。
可归属于顺式异构体的1HNMR峰：5.59-5.47(m)
1HNMR(400MHz，C6D6)δ7.50(m，4H)，5.34-5.26(m，1H)，5.17-5.10(m，1H)，3.84-3.82(m，2H)，3.05-3.02(m，1H)，2.99-2.94(m，1H)，2.65-2.61(m，1H)，2.17-2.10(m，2H)，2.02-1.92(m，1H)，1.82-1.77(m，1H)，1.74-1.63(m，2H)，1.59-1.50(m，2H)，1.24-1.12(m，2H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ142.0(C，2peaks)，135.8(CH)，131.2(CH)，131.2(CH)，124.1(CH)，75.3(CH)，70.4(CH2)，65.9(CH2)，39.8(CH2)，34.7(CH2)，33.0(CH2)，30.0(CH2)，27.6(CH2).
IR(液体，CHCl3，cm-1)3105，3010，2935，1609，1536，1351，1187，1097，932，857，776，616.
HRMS-LIEDIm/z：C16H21NO6S的[M+]计算值，355.1089；测定值355.1083。
rel-(1R-4E-pR)-5-(2-氟乙氧基)环辛-1-烯(9)
向干燥圆底烧瓶中按顺序装入无水乙腈(1mL)、4-硝基苯磺酸-2-[rel-(1R-4E-pR)-环辛-4-烯-1-基氧基]乙酯(0.0037g，0.010mmol)和TBAF(0.17mmol，0.17mL的1MTHF溶液)。将反应加热至80℃并搅拌3小时。将混合物冷却并直接转移到硅胶柱上。使用戊烷至5％醚/戊烷的梯度作为洗脱剂经快速色谱得到标题化合物。色谱分离之后，在旋转蒸发仪上除去大部分溶剂。但是，该化合物由于挥发性在真空中不干燥。通过添加1HNMR标准物——均三甲苯(0.015mL，0.010mmol)估算收率为63％。在1HNMR的5.61-5.47(m)、1.55-1.47(m)处检测到可归属于顺式异构体的小峰。在13CNMR的130.4、129.5、80.9、34.5、26.0、25.8、22.9、22.7处检测到可归属于顺式异构体的小峰。
1HNMR(400MHz，C6D6)δ5.40-5.33(m，1H)，5.22-5.14(m，1H)，4.16(dt，JHF＝48Hz，JHH＝4.3Hz，2H)，3.26-3.21(m，2H)，3.19-3.13(m，1H)，2.85-2.74(m，1H)，2.21-2.14(m，2H)，2.09-1.99(m，2H)，1.83-1.67(m，4H)，1.36-1.21(m，2H).
13CNMR(100MHz，C6D6)δ135.6(CH)，132.2(CH)，86.2(CH)，83.2(d，JC-F＝169Hz，CH2)，67.5(d，JC-F＝20Hz，CH2)，67.4(CH2)，41.1(CH2)，38.0(CH2)，34.8(CH2)，33.2(CH2)，31.9(CH2).
19FNMR(376.5MHz，C6D6)δ222.3
IR(液体，CHCl3，cm-1)3095，2934，2860，1610，1445，1191，1104
HRMS-CI(NH3)m/z：C10H18OF的[M+H]计算值，173.1342；测定值173.1342。
7-(2-氟乙氧基)-1，4-二(吡啶-2-基)-4a，5，6，7，8，9，10，10a-八氢环辛[d]哒嗪(10)
向干燥圆底烧瓶中装入3，6-二(吡啶-2-基)-s-四嗪(0.005g，0.02mmol)和无水乙腈(1mL)。将混合物在室温下搅拌并将乙腈(0.5mL)中的rel-(1R-4E-pR)-5-(2-氟乙氧基)环辛-1-烯逐滴添加到烧瓶中直至持续为黄色。使用10％丙酮/己烷至60％丙酮/己烷的梯度作为洗脱剂经快速色谱得到7-(2-氟乙氧基)-1，4-二(吡啶-2-基)-4a，5，6，7，8，9，10，10a-八氢环辛[d]哒嗪和8-(2-氟乙氧基)-1，4-二(吡啶-2-基)-2，4a，5，6，7，8，9，10-八氢环辛[d]哒嗪的8：2混合物，经1HNMR所判断收率为90％。因为10重排为11在室温下发生，所以分析数据必须在10分钟内收集并且不经过色谱纯化，以尽可能减少重排产物的峰。
1HNMR(400MHz，CD3CN)δ8.73-8.72(m，2H)，8.30-8.25(m，2H)，7.97-7.86(m，2H)，7.48-7.45(m，2H)，4.68(dm，JHF＝48Hz，2H)，4.08-4.03(m，1H)，3.98-3.93(m，1H)，3.84-3.77(m，2H)，3.73-3.70(m，1H)，2.18-2.08(m，5H)，1.85-1.81(m，4H)，1.71-1.62(m，1H)
19FNMR(376.5MHz，C6D6)δ223.3
HRMS-CI(NH3)m/z：C22H26N4OF的[M+H]计算值，381.2090；测定值381.2080。
8-(2-氟乙氧基)-1，4-二(吡啶-2-基)-2，4a，5，6，7，8，9，10-八氢环辛[d]哒嗪(11)
将D2O(0.1mL)添加到乙腈d-3(1mL)中的7-(2-氟乙氧基)-1，4-二(吡啶-2-基)-4a，5，6，7，8，9，10，10a-八氢环辛[d]哒嗪中。将混合物在室温下静置48小时。经柱色谱得到标题化合物。1HNMR分析表明标题化合物的收率为97％。
可归属于脂肪族杂质的1HNMR峰：1.30，0.89。
1HNMR(400MHz，CD3CN)δ8.99(brs，1H)，8.68-8.67(m，1H)，8.59-8.57(m，1H)，8.09-8.07(m，1H)，7.90-7.86(m，1H)，7.79-7.74(m，1H)，7.65-7.63(m，1H)，7.40-7.36(m，1H)，7.31-7.28(m，1H)，4.51(dt，JHF＝48Hz，JHH＝4.1Hz2H)，4.38-4.34(m，1H)，3.75-3.57(m，3H)，2.94-2.90(m，1H)，2.31-2.27(m，1H)，1.91-1.75(m，4H)，1.68-1.60(m，3H)，1.46-1.37(m，2H)
13CNMR(100MHz，CD3CN)δ155.3(C)，152.7(C)，150.3(CH)，149.6(CH)，144.1(C)，137.8(CH)，137.1(CH)，135.7(C)，125.0(CH)，124.1(CH)，123.7(CH)，121.3(CH)，110.6(C)，84.5(d，JC-F＝165Hz，CH2)，80.0(C)，68.1(d，JC-F＝19Hz，CH2)，35.5(CH)，33.4(CH2)，31.4(CH2)，27.0(CH2)，25.4(CH2)，22.0(CH2)
19FNMR(376.5MHz，C6D6)δ223.3
IR(液体，CHCl3，cm-1)2934，2861，1708，1599，1571，1462，1361，1225，1117，1047
HRMS-CI(NH3)m/z：C22H26N4OF的[M+H]计算值，381.2090；测定值381.2085。
分析放射性标记材料和标准物的HPLC方法
粗产物的纯化在配备有双通道紫外吸光度检测器(Waters2487)的分析型反相高效液相色谱(HPLC)系统上使用PhenomenexC18RP(150×4.6mm，5微米)进行。流速为1mL/min，流动相开始为95％溶剂A(水中的0.1％TFA)和5％溶剂B(乙腈中的0.1％TFA)(0-2分钟)，然后是梯度流动相，至17分钟为5％溶剂A和95％溶剂B，然后在95％B下维持至22分钟。放射性通过型号为Ludlum2200的单通道辐射检测器进行检测。使用半制备型C18反相柱(PhenomenexC18)，在梯度条件下以4mL/min流速进行分离。
制备不加载体(NCA)的[18F]-氟化物([18F]-F-)
在CTI/SiemensRDS11211Mev回旋加速器中通过核反应18O(p，n)制备放射性同位素18F(t1/2＝110m)，得到18F。18O的形式为水并且同位素纯度大于95％。回旋加速器的操作和目标功能受回旋加速器计算机系统自动控制。使目标负载需要量的[18O]-水，然后用合适的束流轰击适当时间。然后将该目标从剂量校准仪中的收集瓶卸载；并在其中测量氟化物的量。然后将氟化物溶液转移至化学操作。
一般氟化方法
氟化方法(～200mCi)在如图2所示的自动化合成模块上进行。如该模块的示意图所示，两通阀V1-V6用于控制含溶剂和试剂的储液器1-6。储液器3-6与氮气或氩气气体管线(gasline)相连。储液器1与反应器通过几个控制阀相连。反应器与真空泵、气体管线和HPLC的进样口相连。将碳酸钾的溶液和KryptofixK2.2.2的溶液(或TBAB和MeCN)分别负载到储液器1和2中。储液器3、4、5和6中装满了所需的前体溶液和另一些化学品/溶液。使包含18F的目标水通过预处理的QMA柱体以捕获18F-F-。使储液器1中的K2CO3或TBAB溶液通过该柱体将18F从QMA柱体上释放并使其进入反应器。将储液器2中的Kyrptofix溶液或MeCN添加到反应器中并使全部混合物在95℃以及氮气流和真空下干燥。将储液器3中的前体溶液添加到干燥的18F离子中并在所需温度下加热。对反应混合物取样以分析，或者将其负载在HPLC上以纯化。
3-(4-(氟甲基)苯基)-s-四嗪(5)
如上所述对F-18氟化物进行干燥。根据S.A.LangJr.，B.D.Johnson，E.J.Cohen，J.Heterocycl.Chem.1975，12，1143的方法，通过由4-羟甲基苄腈(乙酸甲脒，S8，水合肼，然后NaNO2/HOAc)制备的3-(4-羟甲基)-苯基-s-四嗪的(MsCl，Et3N，CH2Cl2)甲磺酰化制备了四嗪4。将化合物4溶解于MeCN，然后使其与18F-TBAF在85℃反应15分钟。然后通过HPLC分析反应混合物。18F-5在HPLC上的洗脱时间为15.6分钟，这与标准化合物的保留时间相对应。标记收率估算为1％(未进行衰变校正)。将反应温度改变为110℃或者将溶液改变为DMSO/DMF不增加反应收率。
用于表1指示反应的一般方法。
如上所述对氟化物进行干燥。将前体8溶解于MeCN并添加到储液器3中经共沸干燥的氟化物中。将粗混合物在所需温度下加热，然后经HPLC分析。表2条目3中描述了最佳标记条件。在自动化合成中，将粗反应混合物负载到半制备型HPLC上以分离。将经纯化的样品注射到分析型HPLC。18F-9在HPLC上的洗脱时间为17.4分钟，这与标准化合物的保留时间相对应。在最佳条件下，18F-9的放射化学纯度大于98％。
用于表2所述反应的一般方法
在表2所述条件下将经HPLC纯化的18F-9与3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪(1a)混合。混合后立即通过HPLC分析该粗反应混合物。在混合10秒内进行HPLC注射。18F-10在HPLC上的洗脱时间为11.8分钟，这与标准化合物的保留时间相对应。在HPLC辐射追踪还观测到少量的异构体18F-11。可归属于18F-11异构体的峰的保留时间为12.7和13.3分钟，这与19F标准物的保留时间相对应。
放射化学
通过18O(p，n)18F核反应制备了[18F]氟化物，然后将其吸附到阴离子交换树脂柱体上。使用Kryptofix222/K2CO3溶液(1mL9∶1乙腈/水，15mgKryptofix222，3mgK2CO3)洗脱柱体，所得混合物在玻璃反应器中干燥。18F-9根据报道的方法制备并且经半制备型HPLC纯化。用18F-9标记四嗪-RGD缀合物14在DMSO/EtOH(1∶3)中进行。所得混合物用水稀释并且经半制备型HPLC纯化。将终产物18F-15浓缩并配制成盐水(0.9％，500μL)用于体内研究。
细胞系和动物模型
使U87MG人成胶质细胞瘤细胞在补加有10％胎牛血清(FBS)、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素(InvitrogenCo.)的杜氏培养基(Gibco)中生长。根据斯坦福大学机构动物保护和利用委员会(StanfordUniversityInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的方案进行动物操作。将1×107个U87MG细胞(整合素αvβ3阳性)经皮下(s.c.)注射到雌性无胸腺裸鼠的前肋中，产生U87MG异种移植模型。接种三周至四周后(肿瘤体积：100-400m3)，将小鼠(约9-10周龄，体重为20-25g)用于microPET研究。
细胞整合素受体结合测定
使用125I-锯鳞血抑肽作为整合素αvβ3特异性放射配体通过竞争性细胞结合测定来评价c(RGDyK)和19F-15的体外整合素结合亲和力和特异性。通过使用GraphPadPrism(GraphPadSoftware，Inc.)对数据进行非线性回归拟合来计算U87MG细胞的最适50％抑制浓度(IC50)值。实验用一式三份的样品进行。
microPET研究
PET扫描和图像分析使用microPETR4啮齿动物模型扫描仪(SiemensMedicalSolutions)进行。在异氟烷麻醉(1-3％)下将约2MBq的18F-15经静脉注射到每只老鼠(n＝3)中，然后在注射0.5、1、2和4小时后进行静态扫描。对于每次microPET扫描，在肿瘤、正常组织和主要器官中在经衰变校正的全身冠状图像上画出目标区域(ROI)。肿瘤内的放射性浓度(积累)由多个ROI内的平均值得到，然后转化为％ID/g。对于受体阻断实验，对左前肋上具有U87MG肿瘤的小鼠共注射18F-15和c(RGDyK)(10mg/kg)之后进行扫描。
5-氧代-((6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(13)
向干燥的3mL小瓶中按顺序装入5-氧代-((6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)戊酸(170mg，0.46mmol)、1，2N-羟基琥珀酰亚胺(75mg，0.65mmol)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(115mg，0.60mmol)。将小瓶用带有聚四氟乙烯(Teflon)隔膜的螺帽盖上。用氮气吹扫小瓶，然后通过注射器添加无水DMF(1.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌20小时。然后将混合物用CH2Cl2(5mL)稀释，离心，并轻轻倒出上清液。紫色固体在CH2Cl2(5mL)中进行三次循环的悬浮，离心，倾析，得到130mg(59％)作为紫色固体的标题化合物(130mg，59％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6，δ)：10.66(s，1H)，9.06(d，2.4Hz，1H)，8.94(m，1H)，8.64(d，J＝8.8Hz，1H)，8.60(dt，J＝7.9，1.0Hz，1H)，8.44(dd，J＝8.8，2.4Hz，1H)，8.17(dt，J＝7.9，1.7Hz，1H)，7.74(ddd，J＝7.5，4.6，1.0Hz，1H)，2.87-2.80(m，6H)，2.59(t，J＝7.6Hz，2H)，1.99(q，J＝7.6Hz，2H)；
13CNMR(100MHz，DMSO-d6，δ)：172.0(C)，170.8(C)，169.3(C)，163.5(C)，163.2(C)，151.1(CH)，150.7(C)，144.4(C)，141.7(CH)，138.9(C)，138.3(CH)，127.1(CH)，126.7(CH)，125.4(CH)，124.7(CH)，35.0(CH2)，30.0(CH2)，25.9(CH2)，20.2(CH2)；
HRMS-ESI(m/z)：[M-C4H4NO3]+(酰阳离子)：C17H14N7O2的计算值：348.1209；测定值：348.1202。
四嗪-RGD缀合物(14)
向干燥的3mL小瓶中装入13(5.2mg，0.011mmol)和12(3.4mg，0.0055mmol)。将小瓶用带有聚四氟乙烯隔膜的螺帽盖上，并且用氮气吹扫小瓶。通过注射器添加二异丙基乙胺(1.4mg，0.011mmol)的DMF(30μL)溶液，然后添加DMF(0.57mL)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。然后将混合物用甲醇(1mL)稀释，离心，轻轻倒出上清液。紫色固体在甲醇(1mL)中再进行两次循环的悬浮，离心，倾析，得到作为紫色固体的14(5.1mg，96％)。通过HPLC分析判断纯度为95％(ShimadzuC18柱，4.6mm×50mm，5微米)。HPLC分析如下进行：用包含0.1％三氟乙酸的洗脱剂在1mL/min下洗脱，最初5分钟为10％乙腈/水，接着5分钟为10％-20％乙腈/水的梯度，最终洗脱为20％乙腈/水。
HRMS-ESI(m/z)：[M-H]+：C44H54N16O10 +的计算值，967.4282；测定值：967.4305。
狄尔斯-阿尔德加合物(18F-15)
向1.5mLEppendorf管中按顺序装入DMSO(0.2mL)中的四嗪-RGD缀合物14(0.25mg)和乙腈(0.1mL)中的反式环辛烯18F-9(0.1mg)。将混合物在室温下搅拌1分钟得到18F-15。粗产物的纯化在配备有双通道紫外吸光度检测器(Waters2487)的分析型反相高效液相色谱(HPLC)系统上使用PhenomenexC18RP(150×4.6mm，5微米)进行。
HPLC分析如下进行：用包含0.1％三氟乙酸的洗脱剂在1mL/min下洗脱，最初2分钟为10％乙腈/水，接着22分钟度为5％-95％乙腈/水的梯，最终洗脱为95％乙腈/水。
对于18F-15的放射性HPLC分析使用相同条件。放射性通过型号为Ludlum2200的单通道辐射检测器进行检测。因此，将300μLEtOH中的2mCi18F-9(Li，Z.；Cai，H.；Hassink，M.；Blackman，M.L.；Brown，R.C；Conti，ES.；Fox，J.M.ChemCommun.2010，46，8043)添加到四嗪-RGD缀合物14(25+/-5μg，100μLDMSO)中，并将混合物在室温下静置1分钟。18F-15的纯化在分析型反相HPLC系统上使用上述条件进行。
HRMS-ESI(m/z)：[M-H]+：C54H71N14O11的计算值：1111.5484；测定值：1111.5510。
四嗪-RGD缀合物(18)
四嗪-RGD缀合物18根据以下顺序制备。
3-硝基-2-[4-(三氟甲基)苯甲酰]肼(38)
在0℃在N2下向圆底烧瓶中的3-硝基苯甲酰肼(1.0g，5.52mmol)和吡啶(0.9mL)的DMF(1.5mL)搅拌溶液中逐滴添加4-(三氟甲基)苯甲酰氯(1.3g，6.07mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12小时，然后转移至包含冰水的烧杯中。从溶液中沉淀出来的白色固体经过滤分离，用冷H2O清洗数次。粗品固体用丙酮重结晶纯化，得到1.6g(4.4mmol，80％)作为白色固体的38，熔点223-225℃。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz，δ)：11.0(s，1H)，10.9(s，1H)，8.76(t，J＝2.2Hz，1H)，8.47(dd，J＝8.3Hz，2.4Hz，1H)，8.37(dd，J＝7.9Hz，2.4Hz，1H)，8.13(d，J＝8.3Hz，2H)，7.94(d，J＝8.3Hz，2H)，7.87(t，J＝7.6Hz，1H).13CNMR(DMSO-d6，100MHz，δ)：164.7(u)，163.8(u)，147.9(u)，136.1(u)，133.8(dn)，133.7(u)，131.7(u)[q，2J(CF)＝35.2Hz]，130.5(dn)，128.4(dn)，126.6(dn)，125.7(dn)[q，3J(CF)＝4.0Hz]，123.9(u)[q，1J(CF)＝272.6Hz]122.2(dn).IR(neat，KBr，cm-1)3191，3022，2847，1575.1，1328.
C15H9F3N3O4的HRMS(ESI-)[M-H]计算值352.0545；测定值352.0536。
N’-(氯(4-(三氟甲基)苯基)亚甲基)-3-硝基苯甲酰亚肼基氯化物(37)
向干燥圆底烧瓶中装入38(1.0g，2.72mmol)，并将烧瓶排空并填充氮气。将无水二氯乙烷(27mL)和PCl5(1.7g，8.17mmol)添加到反应混合物中。将反应混合物回流搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温并缓慢倒入冰水中。分离有机层和水层，有机层用饱和NaHCO3清洗，经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。粗残余物使用己烷中的CH2Cl2梯度(2-8％，然后20％，40％)进行色谱分离，得到0.804g(2.00mmol，73％)作为黄色固体的37，熔点78-80℃。
1HNMR(CDCl3，400MHz，δ)：8.93(t，J＝2.0Hz，1H)，8.44(dd，J＝8.0，1.9Hz，1H)，8.38(dd，J＝8.3Hz，2.3Hz，1H)，8.23(d，J＝8.3Hz，2H)，7.71(d，J＝8.4Hz，2H)，7.66(t，J＝8.1Hz，1H).13CNMR(CDCl3，100MHz，δ)：148.4(u)，143.6(u)，142.2(u)，136.4(u)，135.1(u)，133.9(dn)，133.6(u)[q，2J(C-F)＝33.4Hz]，129.8(dn)，128.9(dn)，126.4(dn)[q，3J(CF)＝4.0Hz]，125.6(dn)，123.6(u)[q，1J(CF)＝274.0Hz]123.5(dn).IR(CHCl3，cm-1)3088，3059，1602，1537，1326.
C15H9Cl2F3N3O2：391.1441；测定值：391.1445。
3-(3-硝基苯基)-6-[4-(三氟甲基)苯基]-s-四嗪(2b)
向干燥圆底烧瓶中装入37(0.804g，2.00mmol)、CH3CN(15mL)和64％水合肼(0.097mL，2.00mmol)。烧瓶配备有回流冷凝器，在防爆屏障后将混合物加热至50℃维持1小时。添加K2CO3(0.553g，4.00mmol)，并将混合物回流搅拌24小时。将64％水合肼(0.291mL，6.00mmol)添加到混合物中，再回流1小时。将反应混合物冷却至室温。所得橙色沉淀物通过过滤分离，用冷H2O清洗并在真空下干燥。粗残余物在0℃用冰醋酸(4.0mL)稀释，然后将NaNO2(0.690g，10.0mmol)的H2O(1.1mL)溶液逐滴添加到该溶液中。反应混合物用CH2Cl2(100mL)稀释并用饱和NaHCO3反复清洗。有机溶液经MgSO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗残余物浓缩到硅胶上，使用己烷中的CH2Cl2梯度(0-30％)进行色谱分离，得到0.583g(1.68mmol，84％)作为粉色固体的2b，熔点217-219℃。
1HNMR(CDCl3，400MHz，δ)：9.54(t，J＝2.0Hz，1H)，9.01(dd，J＝7.8Hz，1.6Hz，1H)，8.81(d，J＝8.3Hz，2H)，8.51(dd，J＝8.3Hz，2.3Hz，1H)，7.89(d，J＝8.3Hz，2H)，7.84(t，J＝8.1Hz，1H).13CNMR(CDCl3，100MHz，δ)：164.7(u)，163.4(u)，147.9(u)，136.1(u)，133.8(dn)，133.7(u)，131.5[u(q，2J(C-F)＝34.5Hz)]，130.5(dn)，126.6(dn)[q，3J(CF)＝4.0Hz]，125.6(dn)，123.6(u)[q，1J(CF)＝271.5Hz]，122.2(dn).IR(CHCl3，cm-1)2932，2856，1531，1324.
C15H8F3N5O2的HRMS(ESI)[M-H]计算值347.0630；测定值347.0622。
3-(3-氨基苯基)-6-[4-(三氟甲基)苯基]-s-四嗪(36)
在N2下向2b(0.010g，0.029mmol)的CH3CH2OH(0.3mL)搅拌溶液中添加甲酸铵(0.006g，0.093mmol)和5％Pd/C(0.004g，0.002mmol)。将反应混合物回流20小时后冷却至室温，通过硅藻土过滤。滤液在真空下浓缩，将粗残余物浓缩到硅胶上并使用CH2Cl2中的丙酮梯度(0-6％)进行色谱分离，得到0.004g(0.013mmol，44％)作为红色固体的36，熔点214-216℃。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz，δ)：8.71(d，J＝8.3Hz，2H)，8.06(d，J＝8.8Hz，2H)，7.81(t，J＝2.0Hz，1H)，7.71(m，J＝8.3Hz，2.2Hz，1H)，7.32(t，J＝7.4Hz，1H)，6.89(dd，J＝8.5Hz，1.9Hz，1H)，5.5(m，2H).13CNMR(DMSO-d6，100MHz，δ)：163.7(u)，162.4(u)，149.6(u)，135.9(u)，132.0(u)，131.9[u(q，2J(C-F)＝34.5Hz)]，128.2(dn)，130.0(dn)，126.3(dn)[q，3J(CF)＝4.0Hz]，121.0(u)[q，1J(CF)＝273.2Hz]，118.2(dn)，115.2(dn)，112.4(dn).IR(CHCl3，cm-1)3443，3156.
C15H11F3N5的HRMS(ESI)[M+H]计算值318.0967；测定值318.0976。
5-氧代-5-(3-(6-(4-(三氟甲基)苯基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)苯基氨基)戊酸(35)
向可密封的玻璃小瓶中通入N2并装入36(0.010g，0.032mmol)、戊二酐(0.018g，0.158mmol)和无水THF(0.3mL)。盖上小瓶后将混合物在80℃搅拌1小时。将反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2和己烷碾碎并在真空下干燥，得到0.010g(0.023mmol，72％)作为粉色固体的35，熔点246-248℃。
1HNMR(DMSO-d6，400MHz，δ)：10.3(s，1H)，8.92(t，J＝1.8Hz，1H)，8.74(d，J＝8.2Hz，2H)，8.23(dd，J＝7.8Hz，1.8Hz，1H)，8.09(d，J＝8.2Hz，2H)，7.92(dd，J＝8.2Hz，2.3Hz，1H)，7.63(t，1H)，2.43(t，J＝7.1Hz，2H)，2.31(t，J＝7.4Hz，2H)，1.85(quin.，J＝7.0Hz，2H).13CNMR(DMSO-d6，100MHz，δ)：174.3(u)，171.3(u)，163.5(u)，162.6(u)，140.4(u)，135.9(u)，132.0(u)[q，2J(C-F)＝32.5Hz]，132.0(u)，130.1(dn)，128.4(dn)，126.4(dn)[q，3J(CF)＝4.0Hz]，124.2(u)[q，1J(CF)＝275.1Hz]，123.1(dn)，122.6(dn)，118.0(dn)，35.5(u)，33.1(u)，20.4(u).IR(无底物，KBr，cm-1)3307，2952，1663，1392.
C20H17F3N5O3的HRMS(ESI)[M+H]计算值431.3679；测定值431.3677。
5-氧代-5-((6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(34)
向干燥的3mL小瓶中按顺序装入5-氧代-5-((3-(6-(4-(三氟甲基)苯基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)苯基)氨基)戊酸(170mg，0.46mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(86mg，0.20mmol)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(77mg，0.40mmol)。将小瓶用带有聚四氟乙烯隔膜的螺帽盖上。用氮气吹扫小瓶，然后通过注射器添加无水DMF(1.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌34小时。然后将混合物用CH2Cl2(10mL)稀释，离心，轻轻倒出上清液。紫色固体在CH2Cl2(10mL)中进行三次循环的悬浮，离心，倾析，得到79mg(75％)作为紫色固体的标题化合物(79mg，75％)。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6，δ)：10.35(s，1H)，8.92(t，1.8Hz，1H)，8.74(d，8.4Hz，2H)，8.25(dt，J＝8.4，1.7Hz，1H)，8.09(d，J＝8.4，2H)，7.94(dt，J＝8.4，1.7Hz，1H)，7.64(t，J＝8.4Hz，1H)，2.83(s，4H)，2.81(t，J＝7.4Hz，2H)2.53(t，J＝7.4Hz，2H)，1.97(q，J＝7.4Hz，2H).
四嗪-RGD缀合物(18)
向干燥的3mL小瓶中装入34(10.6mg，0.02mmol)和12(6.2mg，0.01mmol)。将小瓶用带有聚四氟乙烯隔膜的螺帽盖上，并且用氮气吹扫小瓶。通过注射器添加二异丙基乙胺(5.2mg，0.04mmol)的DMF(110μL)溶液，然后添加DMF(390μL)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将混合物离心，然后将残余物溶解于800μLDMSO并经反相HPLC纯化，得到作为紫色固体的18(2.2mg，11％)。LCMS(m/z)：[M-H]+：C47H55F3N14O10 +的计算值，1032；测定值：1033。
四嗪-RGD缀合物(41)
环肽c(RGDyC)(39)肽靶向细胞表面上的αvβ3整合素。四嗪缀合物41由c(RGDyC)(39)根据以下顺序制备。
c(RGDyC)(39)与四嗪-马来酰亚胺24缀合形成40
该缀合根据CaiW，ZhangX，WuY，ChenX，employingathiol-reactive18F-labelingagent，N-[2-(4-18F-fluorobenzamido)ethyl]maleimide，andsynthesisofRGDpeptide-basedtracerforPETimagingofalphavbeta3integrinexpression.JNuclMed.2006；47：1172-1180的方法进行。简单来说，在室温下将100μL二甲亚砜(DMSO)中的四嗪-马来酰亚胺(200μg，0.41μmol)和500μL磷酸缓冲液中的39(200μg，0.33μmol)(PeptidesInternationalofLouisville，KY)混合在一起。将混合物在室温下搅拌5小时后，经半制备型HPLC纯化缀合物。组合收集的级分并冻干，得到作为白色粉末的终产物。得到化合物40的收率为85％。
VEGF与四嗪-马来酰亚胺缀合形成42
简单来说，在室温下将100μLDMSO中的四嗪-马来酰亚胺24(200μg，0.41μmol)和500μL磷酸缓冲液(50mM，pH6.5-7.0)中的VEGF(100μg，5.5nmol)混合在一起。将混合物在室温下搅拌5小时后，缀合物经尺寸排阻PD-10柱纯化并经Centricon过滤器(Millipore，Bedford，MA)浓缩，最终浓度使用已知浓度的未缀合VEGF作为标准根据280nm的UV吸光度进行测定。将最终浓度调节为50μg/mL以供使用。合成19F-41
根据LiZ，CaiH，HassinkM，BlackmanML，BrownRC，ContiPS等.Tetrazine-trans-cycloocteneligationfortherapidconstructionof18Flabeledprobes.ChemCommun(Camb).2010；46：8043-8045合成19F-9。在室温下将100μLDMSO中的40(100μg，92nmol)和100μLDMSO中的19F-9(200μg，0.33μmol)混合在一起。将混合物在室温下搅拌5分钟后，经半制备型HPLC纯化缀合物。组合收集的级分并冻干，得到作为白色粉末的终产物。得到19F-41的收率为92％，并且在分析型HPLC上的保留时间为15.5分钟。对于[MH]+，MALDI-TOF-MS为m/z1226.4(C57H73FN15O13S，计算分子量为1226.5)。
合成18F-41
根据LiZ，CaiH，HassinkM，BlackmanML，BrownRC，ContiPS等.Tetrazine-trans-cycloocteneligationfortherapidconstructionof18Flabeledprobes.ChemCommun(Camb).2010；46：8043-8045合成18F-9。将约50μL乙醇中的18F-9(148MBq，4mCi)添加到50μLDMSO中的40(10μg)中，然后振荡5分钟。经半制备型HPLC纯化缀合物。组合收集的级分，并且通过减压下旋转蒸发除去溶剂。将18F-41在1mLPBS中重建并通过0.22μm针筒过滤器用于体内动物实验。
合成18F-43
将约50μL乙醇中的18F-9(148MBq，4mCi)添加到水中的42(10μg)中，然后振荡5分钟。通过PD-10柱使用1×PBS作为洗脱剂纯化缀合物。收集级分并通过0.22μm针筒过滤器用于体内动物实验。
细胞培养
人成胶质细胞瘤细胞系U87MG细胞得自于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA)，将其在包含高葡萄糖(GIBCO，Carlsbad，CA)并且补加有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM中培养。细胞在组织培养皿中扩增并维持在37℃和5％CO2的潮湿气氛中。每隔一天更换基质。用0.05％胰蛋白酶-EDTA，0.01MPBS(pH7.4)使融合的单层脱离并且离解成单细胞悬液用于进一步的细胞培养。
microPET成像
动物操作根据南加州大学机构动物保护和利用协会(UniversityofSouthernCaliforniaInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的方案进行。对于静态microPET扫描，通过尾静脉向具有U87MG异种移植的小鼠注射3.7MBq(100μCi)18F-41(每组中n＝3)。在注射0.5、1和2小时后，使用可拆卸的盒子将小鼠用异氟烷(100％O2中5％用于感应并且2％用于维持)麻醉。在与扫描仪连接的激光束帮助下，使小鼠处于俯卧姿势并且接近扫描仪视野中心。然后得到3分钟的静态扫描。使用二维有序子集期望最大化(ordered-subsetsexpectationmaximization，OSEM)算法重新构建图像。不进行背景校正。在肿瘤中在经衰变校正的全身冠状图像上画出目标区域(ROI，对于冠状和轴向切片为5像素)。由ROI得到每像素每分钟的最大计数并使用校准常数转化为每毫升每分钟的计数。假设组织密度为1g/mL，则ROI被转化为每克每分钟的计数。每克每分钟的计数除以注射剂量确定来源于图像ROI的％ID/g值。不进行衰减校正。相似地，将18F-43注射到健康裸鼠中用于microPET研究。化学和放射化学
四嗪-马来酰亚胺与39和VEGF的缀合在pH6.5-7.0的磷酸缓冲液中平稳进行。进行40与19F-9的非放射性环化反应，将产物用于表征并且作为18F标记产物的标准物。将19F-9添加到40的溶液中之后，40的粉色立即消失，表明反应完成。19F-41的特性通过MALDI-TOF-MS确定。使用LiZ，CaiH，HassinkM，BlackmanML，BrownRC，ContiPS等.Tetrazine-trans-cycloocteneligationfortherapidconstructionof18Flabeledprobes.ChemCommun(Camb).2010；46：8043-8045所述的方案产生18F-9。18F-41和18F-43的放射标记收率表明18F-9几乎是定量捕获。经放射性HPLC测定，18F-41的放射性纯度大于95％。18F-41与18F-43的比活性估算为约3-6Ci/μmol。
microPET成像
在静脉内注射约3.7MBq(100μCi)18F-41后不同时间得到荷瘤的U87MG小鼠(n＝3/组)的代表性冠状microPET图像。在测量的所有时间点上，注射放射性示踪剂后的肿瘤全部清晰可见，并且与对侧背景形成良好对比。小鼠表现出高的腹部放射性积累。在较早时间点上在肾和膀胱中观测到18F-41的显著摄取，表明这种放射性示踪剂主要通过肾系统排出。通过在冠状图像上测量涵盖整个器官的目标区域(ROI)，在microPET扫描中实现了肿瘤和主要器官放射性积累的定量。18F-41的肿瘤和主要器官摄取如图3A所示。U87MG肿瘤中18F-41的肿瘤摄取在注射后0.5、1和2小时后分别为1.98±0.33％、1.80±0.15％和1.27±0.33％ID/g。18F-41在肌肉中的摄取随时间迅速降低，在注射后较晚时间点(2h)上提供了较好的图像对比。
在正常SpragueDawley裸鼠中评价了18F-43的生物分布。得到注射约3.7MBq(100μCi)18F-430.5和3小时后的代表性冠状microPET图像。放射性主要在肝和肾中积累。通过测量ROI的microPET定量示于图3B中。18F-43的肾摄取在注射30分钟和180分钟后分别为23.20±2.15％和16.51±1.52％ID/g。观测到肌肉摄取较低(注射0.5和3小时后为2.98±0.66％和1.59±0.57％ID/g)。
二氨基四嗪(21)
二氨基四嗪(21)如下进行制备。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6，δ)21：8.27(d，J＝8.8Hz，2H)，8.20(d，J＝2.3Hz，2H)，7.10(dd，J＝8.8，2.3Hz，2H)，6.24(s，4H).
N1-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-N5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)戊二酰胺(24)
化合物24根据以下顺序制备。
向经火焰干燥的烧瓶中添加1.78g(8.52mmol)4-(2-羟乙基)-10-氧杂-4-氮杂-三环并[5.2.1.02，6]-癸-8-烯-3，5-二酮(Willson，C.G.Macromolecules2008，41，719)。烧瓶配备有冷凝器。然后将烧瓶排空并重新充满氮气。添加甲苯(36mL)。将反应烧瓶加热至110℃并通入氮气搅拌5小时。然后将烧瓶冷却至0℃。混合物在布氏漏斗中过滤，并用乙醚(20mL)清洗。然后使收集的固体升华并收集得到28％(0.339g，2.40mmol)的1-(2-羟乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮。
1HNMR(400MHz，CD3Cl)6.74(s，2H)，3.82-3.77(m，2H)，3.74-3.70(m，2H)，2.03(brs，1H)
向经火焰干燥的圆底烧瓶中添加0.5g(3.6mmol)1-(2-羟乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮和0.7g(4.0mmol)甲基磺酸酐。将烧瓶排空并重新充满氮气。将烧瓶加热至105℃并搅拌3.5小时。将反应冷却至室温并溶解于乙酸乙酯(5mL)。将溶液倒入分液漏斗中并用碳酸钠饱和溶液(40mL)清洗四次。收集水层并用乙酸乙酯(50mL)清洗。组合有机层，经MgSO4干燥并在真空下浓缩。产物从甲基叔丁基醚中重结晶，得到43％(0.347g，1.58mmol)的甲磺酸-2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酯。
1HNMR(400MHz，CD3Cl)6.78(s，2H)，4.41(t，J＝5.23，2H)，3.90(t，J＝5.23，2H)，3.04(s，3H)
N1-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-N5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)戊二酰胺(24)
向经火焰干燥的圆底烧瓶中添加0.03g(0.065mmol，1当量)的5-氧代-5-((6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)戊酸-2，5-二氧代吡咯烷-1基酯(13)，然后添加0.02g(0.078mmol，1.2当量)的2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基铵三氟乙酸盐。将烧瓶排空并重新充满氮气。添加DMF(1mL)并搅拌混合物。将二异丙基乙胺(0.032ml，0.195mmol，3当量)逐滴添加到混合物中。将混合物在室温下搅拌24小时。反应在真空下冷凝，然后使用所需最小量的MeOH和CH2Cl2负载到硅胶柱上。然后使用CH2Cl2中的0-10％MeOH梯度运行该柱，得到48％(0.015g，0.031mmol)的N1-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)-N5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)戊二酰胺。
1HNMR(400MHz，CD3OD)δ9.06(d，J＝2.3Hz，1H)，8.92-8.88(m，1H)，8.82-8.75(m，2H)，8.51(dd，J＝8.8，2.6Hz，1H)，8.19(dt，J＝1.7，7.8Hz，1H)，7.80-7.69(m，1H)，6.84(s，2H)，5.51(s，1H)，4.60(s，2H)，3.72-3.56(m，2H)，3.42-3.36(m，2H)，2.68(s，1H)，2.53(t，J＝7.3Hz，2H)，2.27(t，J＝7.4Hz，2H)，2.08-1.90(m，2H).
虽然本文中参照一些具体实施方案阐述并描述了本发明，但是本发明并不旨在受限于所示详细说明。相反地，在不偏离本发明的情况下在权利要求等效方案的范围内可具体进行许多修改。

Claims (2)

1.一种根据结构9的反式环辛烯与3，6-二(2-吡啶基)-s-四嗪的狄尔斯-阿尔德加合物
2.根据结构9的化合物
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