CN111138337B - 用于生物正交反应的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于生物正交反应的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物及其制备方法与应用。结构式如式Ⅰ所示，R表示碳原子数为1～15的烷基、碳原子数为6～15的芳基或H；X表示O或N；n为1～10之间的自然数。本发明首次提供了pH引发的反式环庚烯与四嗪的IEDDA反应，并可作为生物正交反应。本发明通过引入双环亚硝基脲衍生物—双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物作为储存和释放反式环庚烯的前体，即利用了反式环庚烯的高活性，又尽量避免了其不稳定性。本发明提供的pH引发的生物正交反应能够应用于体外蛋白标记、活细胞成像和组织的预标记成像，同时也能应用于活体动物肿瘤预标记成像。

Description

用于生物正交反应的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种用于生物正交反应的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物及其制备方 法与应用，属于化学生物学技术领域。
背景技术
自2000年Bertozzi首次将施陶丁格反应应用到化学生物学以来，许多新型的生物正交反应逐渐发展起来。从反应模式上看，现有的生物正交反应大致可分为两类：一 类是“一站式反应”(图1A))，目前已知的大多数生物正交反应都是此种类型，如施 陶丁格反应、铜催化的炔烃/叠氮[3+2]环加成以及环张力驱动的烯烃/四嗪[4+2]环加成 反应。相比之下，另一反应类型则是采用“诱发-释放-结合”模型，即在某种因素诱 导下，释放出潜在的生物正交子，继而与另一个正交子反应。此类生物正交反应的典 型代表包括：光催化诱导的四氮唑/烯烃的1,3-偶极环加成、光催化诱导的环丙烯酮/ 叠氮[3+2]环加成以及光催化诱导的邻羟基苯甲醇/乙烯醚[4+2]环加成(图1B))。虽然 这两类生物正交反应都有很好的适用性，但是第二类反应相比于第一类，有着实时可 控的特点。发展具有时空可控的生物反应一直以来都是化学生物学研究孜孜以求的目 标，但目前能满足这一要求的反应非常有限，且绝大多数都是建立在光化学转化的基 础上。光照激发虽然是一种有效的控制化学反应进程的手段，由于大多数常见的光源 (如紫外光和可见光)组织穿透性较差，并且有潜在光毒性问题，因此其在生物体中 的应用受到一定限制。由于生物正交反应的终极目标是应用于活体动物甚至人类，所 以发展能够应用于活体生物的可控性生物正交反应十分必要。
理想的生物正交反应除了要有时空可控性，还需要有较快的反应速率以及良好的生物兼容性。在目前已知的生物正交反应中，反式环辛烯(TCO)与四嗪的逆电子需 求的狄尔斯-阿尔德反应(IEDDA)具有极高的反应速率。这种类型的反应最初由Fox 教授于2008年首次报道，自此，该类生物正交反应脱颖而出，已成为目前最流行和最 有效的生物正交反应。但是，TCO及其相关类似物由于自身高张力原因，很容易在复 杂的生物体系中发生双键顺反异构而失活，使得该类型反应不能在拥有较高反应速率 的同时保持良好的生物兼容性。因此，对于化学家来说，发展新型环张力驱动的生物 正交反应并使其在高反应速率和良好生物兼容性之间实现一种平衡，仍然是一个相当 具有挑战性的任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于生物正交反应的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物及 其制备方法与应用，所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物可在pH诱导下生成反式环庚烯，然后与四嗪进行IEDDA环加成反应；本发明以亚硝基脲结构单元作为化学开关， 通过调控反应体系pH，实现生物正交反应的“开”和“关”可控性。
本发明所提供的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物，其结构式如式Ⅰ所示；
Figure BDA0002337889100000021
式Ⅰ中，R表示碳原子数为1～15烷基、碳原子数为6～15的芳基或H；
X表示O或N；
n为1～10之间的自然数。
所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物优选为式Ⅰ-1：
Figure BDA0002337889100000022
其中，X为O，R为H，n为1。
本发明还提供了所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)在催化剂的催化下，式7所示化合物与重氮乙酸乙酯经环丙烷化得到式8所 示化合物3-((苄氧基)-甲基)双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸乙酯；
Figure BDA0002337889100000023
其中，n为1～10之间的自然数；
X表示O或N；
2)在碱性条件下，式8所示化合物经水解反应得到式9所示化合物3-((苄氧基)-甲基)双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸；
Figure BDA0002337889100000031
3)在叠氮磷酸二苯酯和三乙胺的催化下，式9所示化合物经Curtius重排反应得到异氰酸酯中间体，所述异氰酸酯中间体与NH2R反应得到式10所示化合物1-(3-((苄 氧基)甲基)双环[4.1.0]庚烷基)脲；
Figure BDA0002337889100000032
其中，R表示碳原子数为1～15的烷基、碳原子数为6～15的芳基或H；
4)在钯碳的催化下，式10所示化合物经氢气还原得到式11所示化合物1-(3-(羟甲基)双环[4.1.0]庚烷基)脲；
Figure BDA0002337889100000033
5)在三乙胺的催化下，式11所示化合物与N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得 到式12所示化合物2,5-二羰基吡咯烷基-((7-脲双环[4.1.0]庚烷基)甲基)碳酸；
Figure BDA0002337889100000034
6)式12所示化合物与亚硝酸钠经亚硝基化反应得到权利要求1所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物。
上述的制备方法中，步骤1)中，所述催化剂为三氟甲磺酸酮；
所述环丙烷化可在常规条件下进行，如：式7所示化合物与所述重氮乙酸乙酯的摩尔比可为2：1，所述三氟甲磺酸酮与所述重氮乙酸乙酯的摩尔比可为0.1：1。
上述的制备方法中，步骤2)中，在氢氧化锂存在的条件下进行；在甲醇-水(体 积比4：1)的混合液中进行，可在室温下反应14小时。
上述的制备方法中，步骤3)中，所述Curtius重排反应可在反应室温搅拌半小时，然后在90℃下加热回流反应4小时；
可采用NH2R的1,4-二氧六烷溶液的形式，在冰浴下加入所述氨气。
上述的制备方法中，步骤4)中，所述还原的反应可在室温下进行，直至TLC检 测反应完全。
上述的制备方法中，步骤5)中，所述反应在氮气保护下进行，可在室温下搅拌 反应15小时。
上述的制备方法中，步骤6)中，所述亚硝基化反应在乙酸-乙酸酐的混合液(体 积比为2：1)中进行，可在0℃下反应50分钟。
本发明提供的双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物可用于基于生物正交反应的体内标 记和体外标记。
具体地，在pH值为7.0～8.0的条件下，所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物原位生成反式环庚烯衍生物，所述反式环庚烯衍生物与荧光标记的四嗪衍生物进行IEDDA 反应，并将该反应应用于生物体中，即为所述生物正交反应。
具体地，原位生成所述反式环庚烯衍生物的反应条件如下1)或2)：
1)在NaHCO3存在的条件下，以甲醇作为溶剂；
2)在Na2CO3存在的条件下，以体积比为1：1的水与乙腈的混合液作为溶剂。
具体地，所述四嗪衍生物可采用Cy5、Cy3、BODIPY FL等进行荧光标记。
具体地，本发明双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物可用于体外蛋白标记、活细胞成像或组织成像，也可用于体内肿瘤的标记。
为了防止所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物的水解，可在pH为4.0～5.0的条件 下，将蛋白或抗体连接于所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物上。
本发明首次提供了pH引发的反式环庚烯与四嗪的IEDDA反应，并可作为生物正 交反应。本发明通过引入双环亚硝基脲衍生物(BNU)—双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍 生物作为储存和释放反式环庚烯的前体，即利用了反式环庚烯的高活性，又尽量避免 了其不稳定性。本发明所提供的生物正交反应具有如下优点，使其不同于任何现有的 生物正交反应：首先，不同于以往的光引发的生物正交反应，该生物正交反应能够不 可逆地释放反式环庚烯，而且整个释放以及标记过程都具有较快的反应速率。其次， 本发明将反式环庚烯隐藏在双环亚硝基脲前体中，该过程的释放是一个pH依赖型， 这就使得反式环庚烯的释放是一个可控可调节的过程。最后，双环亚硝基脲类化合物 可从简单易得的原料合成，只需经过几步简单反应就可大量制备，这也大大增加了该 生物正交反应的实用性。
本发明提供的pH引发的生物正交反应能够应用于体外蛋白标记、活细胞成像和组织的预标记成像，同时也能应用于活体动物肿瘤预标记成像。可见，本发明提供的 新型生物正交反应具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为已知的生物正交反应模式(图1(A))和典型的光引发的生物正交反应(图1(B))。
图2为化合物1在pH＝6.0-8.0中的一级反应速率常数kobs，其中，图2(A)-图2 (D)依次为pH＝6.0、7.0、7.2和8.0中的一级反应速率常数kobs。
图3为HPLC测得的化合物1(100μg/mL)的稳定性(pH＝4.0和5.0)。
图4为化合物1在2-巯基乙醇条件下的稳定性。
图5为Q-TOF质谱测得BSA(图5(A))和化合物12修饰的BSA的相对分子 量(图5(B))。
图6为筛选pH引发已修饰BSA标记实验的pH条件。
图7为筛选pH引发已修饰BSA标记实验的浓度条件。
图8为筛选pH引发已修饰BSA标记实验的时间条件。
图9为抗体PD-L1的特性。
图10为MC-38细胞的共聚焦显微镜成像，其中图10(a)为纯MC-38细胞，图 10(b)为未修饰抗体处理的细胞，图10(c)为pH引发剂13修饰抗体处理的细胞， 图10(d)为用四嗪-Cy5处理的细胞，图10(e)为未修饰的抗体和四嗪-Cy5处理的 细胞，图10(f)为pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝6.7)，图10(g) 为用pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝7.0)，图10(h)为pH引发 剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝7.4)，图10(i)用pH引发剂13修饰抗体 和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝8.0)。
图11为流式细胞术分析未标记或已标记的MC38细胞的荧光强度(图11(A)) 和平均荧光强度(图11(B))。
图12为pH引发剂13修饰的抗体对新鲜MC38肿瘤组织切片的预标记(pH＝7.4)。
图13为pH引发剂13修饰的抗体对小鼠体内肿瘤的预标记及成像。
图14为小鼠静脉注射化合物15(Tetrazine-Cy5)18小时后各个组织的荧光成像分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中化合物2、6以及2-巯基乙醇来源于Sigma-Aldrich公司。化合物14Tz-BODIPY购自Lumiprobe公司(美国马里兰州亨特谷，21030)。化合物 15Tetrazine-Cy5购自是从南京生物科技有限公司(中国南京)。
下述实施例中通过醋酸-醋酸钠的混合体系来分别配制pH＝4.0、5.0、6.0的缓冲溶 液。相应地，pH＝6.7、7.0、7.2、7.4、8.0的缓冲溶液通过PBS体系来配制。
如果没有特殊说明，所有反应都是在室温和标准大气压下进行的。利用铺满在平板上的硅胶(德国默克公司，60F254)和相应的混合展开剂即薄层色谱分析技术(TLC)， 来对反应情况进行实时监测，并配合紫外光(λ＝254nm)或者高锰酸钾对反应情况进行 分析。对化合物的纯化，采用的是柱色谱分析技术(硅胶60，德国默克公司， 0.040-0.063mm)，而反相柱层析用的是C18官能团化的色谱柱(12％官能团化，
Figure BDA0002337889100000063
0.040-0.063mm)。
1H NMR数据是由布鲁克先进III 400(400MHz)仪器测得。TMS化学位移值为 δH0.00或者一些NMR溶剂，如：(CD3)2CO、CDCl3、(CD3)2SO、CD3OD以及D2O化 学位移值分别为δH2.05、7.26、2.50、3.31、4.79。13C NMR数据也是根据布鲁克先进 III 400(100MHz)仪器测得，相应的氘代溶剂，如：(CD3)2CO、CDCl3、、CD3OD、 (CD3)2SO的化学位移值分别为29.8、77.16、49.0、39.5。所有的13C NMR谱图都是质 子去耦合化的。
下述实施例中所用的双环[4.1.0]庚烷的亚硝基脲衍生物1按照下述方法制备：
Figure BDA0002337889100000061
双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸乙酯(S2)：在适当催化剂(28mg,0.06mmol)催化下，利用流动泵将重氮化合物(1.4ml,12.7mmol)加入到含有S1(2.6ml,25.4mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，室温搅拌一段时间，直至重氮化合物完全反应完。反应完全后，真空 旋干反应液，过滤除去催化剂，柱层析得到纯的无色油状液体化合物S2(1.049g,49％)。 S2的NMR数据符合已知文献报道。
Figure BDA0002337889100000062
双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸(S3)：在含有S2(6.369g,37.87mmol)的甲醇-水(4：1，60ml) 混合溶液中，分批次缓慢加入一水氢氧化锂(7.940g,189.33mmol)粉末，该反应室温搅拌15小时。反应完全时，加入1N HCl酸化反应液直至pH＝1.0，然后用乙酸乙酯萃 取反应液，无水硫酸钠干燥有机相，真空旋干有机相，后在二氯甲烷-甲醇-三氟乙酸 (400：20：0.2)洗脱剂下进行柱层析分离纯化，得到纯的白色固体S3(4.921g,93％)。 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.96–1.85(m,2H),1.76–1.69(m,2H),1.67–1.64(m, 2H),1.39(t,J＝4.2Hz,1H),1.35–1.24(m,2H),1.23–1.13(m,2H).13C NMR(100MHz, CDCl3)δ181.8,25.6,23.6,22.7,20.9.HRMS(ESI)C8H11O2[M-H]+的m/z理论上为 139.0759,实际上是139.0753.
Figure BDA0002337889100000071
1-(双环[4.1.0]庚烷基-)脲(S4)：将二氯亚砜(10ml)加入到S3(950mg,6.78mmol)中， 加热回流2小时，然后冷却到室温，真空旋干，得到黄色油状化合物。在0℃下，将 此化合物溶于乙腈(30ml)中，缓慢加入叠氮化钠(595mg,9.15mmol)，室温搅拌8小时后， 加入冰水淬灭反应，并用二氯甲烷萃取有机相，在冰浴条件下真空旋干有机相。遂将 该有机相置于无水甲苯中(30ml)，在90℃下加热2小时，后冷却至0℃，加入氨的1,4- 二氧六烷(0.4M,34ml)。然后在该反应液中加入乙酸乙酯进行重结晶，得到粗的白色固 体化合物S4(605mg,58％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.29(br s,1H,NH),5.08(br s, 2H,NH2),2.12(s,1H),1.96–1.84(m,2H),1.70–1.60(m,2H),1.27–1.19(m,2H),1.13 –1.02(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.6,34.6,22.3,21.2,19.7.HRMS(ESI) C8H15N2O[M+H]+的m/z理论上为155.1184,实际上为155.1181.
Figure BDA0002337889100000072
在0℃下，往100ml圆底烧瓶中加入S4(645mg,4,18mmol)和9ml的乙酸-乙酸酐(2:1), 称取一定量的亚硝酸钠(288.6mg,4.18mmol)并将其溶于8ml水中，然后将其溶液逐滴加入到圆底烧瓶中，反应50分钟后，加入冰水淬灭该反应，然后用二氯甲烷萃取有机 相，后真空旋干，利用柱层析分离纯化得到黄色固体化合物1(542mg,71％)。1H NMR (400MHz,CDCl3)δ6.75(br s,1H,NH2),5.38(br s,1H,NH2),2.01(t,J＝3.8Hz,1H), 1.91–1.87(m,2H),1.32–1.23(m,4H),1.20–1.08(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3) δ154.8,33.8,21.9,21.2,20.2.
实施例1、通过紫外-可见测定pH引发化合物1(双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物)的水解速率常数(pH 6.0-8.3)
通过测定化合物1置于不同pH反应条件下，在296nm波长处的吸光度的减少， 得到化合物1的诱发速率常数。所制备的化合物1的储备液存储在极其干燥的甲醇中。 而且这些储备液最好先配现用(25mM)。量取一定体积的储备液(0.2ml)置于1.8ml不同 的缓冲溶液中(pH＝6.0、7.0、7.2、8.0、8.3)。稀释完之后的化合物1的浓度为2.5mM。 在10分钟到12小时内，每隔5秒测定化合物1的吸光度。所有反应都平行测定三次。 通过Originlab9.0测定诱发化合物1的一级速率常数。
拟一级速率常数kobs：以化合物1在不同pH缓冲溶液中的吸光度随时间的变化作图，以此来测定诱发的一级速率常数kobs。用Originlab 9.0作图得到的kobs符合指数型 “单相衰减”函数(非线性回归方程)即：Y＝(Y0-plateau)*exp(-kobs*time(s))+plateau， 结果如图2所示，可以看出，化合物1在偏酸性的条件下的稳定性较好，如pH＝6.0， 而在中性或者碱性条件下的稳定性较差，如pH＝7.0～8.0(7.0、7.2或8.0)。
2)通过HPLC测定pH引发化合物1的稳定性(pH 4.0-5.0)
通过HPLC，可以测定双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲化合物1在缓冲溶液中的稳定性。化合物1首先溶解在醋酸-醋酸钠的缓冲溶液中(100μg/mL，pH＝4.0，5.0)。采用HPLC 色谱分离方法，测定化合物1(化合物1的保留时间为6.6)的峰面积在0-24小时内(0h、 4h、8h、12h、24h)随保留时间的变化情况(0-95％乙腈-水,每隔十分钟改变洗脱梯度)。 在化合物1进行稳定性测定之前(100μg/mL)，现测定化合物1分别在pH＝4和5缓冲 溶液中的保留时间，以此作为标准品。在不同的pH条件下的稳定性实验全都平行进 行三次。结果如图3所示，可以看出，体系的酸性越强，化合物1的稳定性越大，如： 化合物1在pH＝4.0的稳定性要大于pH＝5.0。
3)化合物1的稳定性测定
为了测定化合物1在生物体内的稳定性，将化合物1(5.0mg,1.0eq)和2-巯基乙醇(17mg,8eq)混合置于氘代氯仿中(0.6ml)，然后在室温下用1H-NMR监测化合物的稳定 性变化。结果如图4所示，从图中可明显看出，化合物1在亲核试剂的存在下，其稳 定性不发生变化。
实施例2、化合物1和化合物2(3,6-二吡啶-1,2,4,5-四嗪)之间的模型反应
化合物1和2进行IEDDA反应的机理如下所示：
其中各反应条件如下：
序列1：室温下，将NaHCO3(24.4mg，0.291mmol)粉末加入到包含化合物1 (26.7mg，0.145mmol)和化合物2(23.4mg，0.097mmol)的甲醇(5mL)溶液中。 NaHCO3一旦加入溶液中，就会有氮气生成，并且反应液的颜色会在30min后，由玫 红色变为淡黄色，这将表明该反应已经反应完全。之后，将反应液旋干，利用柱层析 对反应液纯化。采用甲醇和二氯甲烷混合体系(5:95)作为柱层析的洗脱剂，由此得 到黄色固体化合物5’(35.0mg,0.095mmol,98％)。
序列2：室温下，将NaHCO3(32.6mg，0.388mmol)粉末加入到包含化合物1 (35.5mg，0.194mmol)和化合物2(23.4mg，0.097mmol)的甲醇(5mL)溶液中。 NaHCO3一旦加入溶液中，就会有氮气生成，并且反应液的颜色会在20min后，由玫 红色变为淡黄色，这将表明该反应已经反应完全。之后，将反应液旋干，利用柱层析 对反应液纯化。采用甲醇/二氯甲烷混合体系(5:95)作为柱层析的洗脱剂，由此得到 黄色固体化合物5’(35.2mg,0.096mmol,99％)。
Figure BDA0002337889100000091
Figure BDA0002337889100000092
序列3：室温下，将Na2CO3(41.1mg，0.388mmol)粉末加入到包含化合物1(35.5mg，0.194mmol)和化合物2(23.4mg，0.097mmol)的乙腈/水(1：1，5mL)溶液中。Na2CO3一旦加入溶液中，就会有氮气生成，并且反应液的颜色会在15秒后，由玫红色变为淡 黄色，这将表明该反应已经反应完全。之后，将反应液旋干，利用柱层析对反应液纯 化。采用石油醚/丙酮混合体系(2：1)作为柱层析的洗脱剂，由此得到白色固体化合 物5(30.5mg,0.095mmol,98％)。
序列4：室温下，将NaHCO3(32.6mg，0.388mmol)粉末加入到包含化合物1 (35.5mg，0.194mmol)和化合物2(23.4mg，0.097mmol)的乙腈/水(1：1，5mL) 溶液中。Na2CO3一旦加入溶液中，就会有氮气生成，并且反应液的颜色会在5min后， 由玫红色变为淡黄色，这将表明该反应已经反应完全。之后，将反应液旋干，利用柱 层析对反应液纯化。采用石油醚/丙酮混合体系(2：1)作为柱层析的洗脱剂，由此得 到白色固体化合物5(30.9mg,0.096mmol,99％)。
序列5：室温下，将化合物1(35.5mg，0.194mmol)加入到包含化合物2(23.4mg，0.097mmol)的乙腈/磷酸盐缓冲(1：2，5mL)溶液中。化合物1一旦加入溶液中， 就会有氮气生成，并且反应液的颜色会在120min后，由玫红色变为淡黄色，这将表明 该反应已经反应完全。之后，将反应液旋干，利用柱层析对反应液纯化。采用石油醚/ 丙酮混合体系(2：1)作为柱层析的洗脱剂，由此得到白色固体化合物5(30.0mg, 0.093mmol,96％)。
1,5-二甲氧基-1,4-二吡啶基-2,4a,5,6,7,8,9,9a-八氢-1H-环庚并哒嗪(5’):1HNMR (400MHz,MeOD)δ8.58(ddd,J＝4.9,1.6,0.8Hz,1H),8.52–8.46(m,1H),7.92–7.84 (m,2H),7.78(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.70–7.64(m,1H),7.37(ddd,J＝7.5,4.9,1.1Hz, 1H),7.30(ddd,J＝7.4,5.0,1.2Hz,1H),3.78–3.73(m,1H),3.35(s,1H),3.12(s,3H), 2.57(s,3H),2.47(dd,J＝10.1,7.7Hz,1H),2.10–2.02(m,1H),1.95(d,J＝13.2Hz,1H), 1.79–1.67(m,1H),1.61–1.42(m,4H),1.34–1.17(m,2H).13C NMR(100MHz,MeOD) δ160.1,157.7,153.5,149.5,149.1,138.2,138.0,124.2,124.2,123.8,122.5,88.7,80.3, 58.2,55.2,50.8,37.2,35.6,30.3,28.1,22.2.HRMS(ESI)C20H22N4O[M-CH3O+H]+的m/z 理论上为335.1872,实际上是335.1873.
5-羟基-1,4-二吡啶基-4a,5,6,7,8,9-六氢-2H-环庚并哒嗪(5):1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.64(ddd,J＝4.9,1.7,0.9Hz,1H),8.56(ddd,J＝5.0,1.7,0.9Hz,1H),8.09– 8.06(m,1H),7.92(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.88–7.83(m,1H),7.60(d,J＝7.9Hz,1H), 7.42(ddd,J＝7.6,4.9,1.1Hz,1H),7.38(ddd,J＝7.4,5.0,1.1Hz,1H),4.64(s,1H),3.89– 3.81(m,2H),2.79–2.72(m,1H),1.98(m,1H),1.93–1.85(m,3H),1.69(m,2H).13C NMR(100MHz,MeOD)δ157.0,153.6,150.4,148.6,140.6,138.9,138.5,138.4,135.0, 125.5,124.8,124.2,122.8,73.7,45.7,36.7,32.9,31.5,22.2.HRMS(ESI)C19H20N4O [M+H]+的m/z理论上为321.1715,实际上是321.1718.
由上述结果可以看出，反应体系的碱性增强，非质子性溶剂的增多，都会使反应的速率加快。如：将碱性稍弱的NaHCO3溶液替换为碱性稍强的Na2CO3溶液，并将 该体系的溶剂由MeOH换为H2O/CH3CN(1:1)的混合体系，该反应的反应速率由几十 分钟缩短到15秒。
实施例3、式Ⅰ所示双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物的制备
1)制备3-((苄氧基)-甲基)双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸乙酯(化合物8)：
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000111
可按照现有方法制备化合物7。
利用流动泵将重氮乙酸乙酯(2.72ml,25.9mmol)逐滴加入到含有化合物7(10.487g, 51.8mmol)和三氟甲磺酸酮催化剂(936.7mg,2.59mmol)的无水二氯甲烷溶液中。反应完 成后，真空旋干反应液，然后在石油醚-二氯甲烷(3:1)混合洗脱剂下进行柱层析，得到 一对非对映异构体的无色油状混合物8(4.725g,32％,dr＝1.5:1)1H NMR(400MHz,CDCl3) δ7.36–7.27(m,5H),4.48–4.45(m,2H),4.10(q,J＝7.2Hz,2H),3.30–3.15(m,2H), 2.23–2.04(m,1H),2.00(d,J＝9.4Hz,1H),1.80(ddd,J＝18.2,9.2,4.7Hz,1H),1.66– 1.41(m,5H),1.36–1.22(m,5H).One of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3) δ174.7,138.6,128.4,127.6,75.4,73.1,60.3,34.3,26.9,25.7,23.4,22.9,22.2,21.5,14.4. The other one of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.7,133.7,128.4, 127.6,75.3,73.1,60.3,32.1,26.2,25.5,23.1,22.6,22.2,21.0,14.4.HRMS(ESI)C18H25O3 [M+H]+的m/z理论上为289.1804,实际上为289.1812.
2)制备3-((苄氧基)-甲基)双环[4.1.0]庚烷-7-甲酸(化合物9)
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000112
在含有化合物8(4.022g,13.95mmol)的甲醇-水(4：1，40ml)混合溶液中，分批 次缓慢加入一水氢氧化锂(2.926g,69.73mmol)粉末，该反应室温搅拌14小时。待反 应完全时，加入1N HCl酸化反应液直至pH＝1.0，然后用乙酸乙酯萃取有机相，无水 硫酸钠干燥有机相，真空旋干有机相，后在二氯甲烷-甲醇-三氟乙酸(400：20：0.2) 洗脱剂下进行柱层析分离纯化，得到纯的白色固体化合物9(3.377g,93％)。化合物9是 两个非对映异构体的混合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38–7.26(m,5H),4.49–4.45(m,2H),3.30–3.15 (m,2H),2.27–2.05(m,1H),2.04–1.98(m,1H),1.87–1.75(m,1H),1.72–1.63(m,2H), 1.60–1.42(m,3H),1.39–1.33(m,1H),1.03–0.91(m,1H).One of the diastereoisomers: 13C NMR(100MHz,CDCl3)δ181.2,138.4,128.4,127.6,75.3,73.1,34.2,26.7,26.1,25.3, 24.1,22.7,22.2.The other one of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ181.2,138.4,128.4,127.6,75.1,73.1,31.9,26.1,25.5,24.4,23.2,22.6,22.1.
3)制备1-(3-((苄氧基)甲基)双环[4.1.0]庚烷基)脲(化合物10)：
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000121
在含有化合物9(2.965g,11.39mmol)的甲苯(25ml)溶液中，逐滴依此加入叠氮磷酸 二苯酯(3.19ml,14.81mmol)以及三乙胺(2.40ml,17.09mmol)。该反应室温搅拌半小时，后在90℃下加热回流反应4小时，然后冷却至0℃，缓慢加入氨的1,4-二氧六烷溶液， 并搅拌1小时。真空旋干反应液，在二氯甲烷-甲醇(20:1)混合洗脱剂下进行柱层析， 分离纯化得到黄色油状化合物10(2.094g,67％)。化合物10是两个非对映异构体的混合 物(dr＝1.5:1，dr值是由化合物10的BnO-CH2整合比例测得，整合峰4.47(s,2H)＝1.11, 整合峰4.45(s,2H)＝0.73)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.24(m,5H),5.51(br s,1H,NH),5.28(br s,1H,NH2),5.18(br s,1H,NH2),4.47(s,2H),3.24(d,J＝6.4Hz,2H),2.46–2.19(m,1H),2.16 –2.05(m,1H),2.03–1.97(m,1H),1.89–1.69(m,1H),1.61–1.36(m,3H),1.35–1.22 (m,1H),1.17–1.03(m,2H).The minor diastereoisomer:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.36–7.24(m,5H),5.51(br s,1H,NH),5.28(br s,1H,NH2),5.18(br s,1H,NH2),4.45(s, 2H),3.17(dd,J＝6.3,1.9Hz,2H),2.46–2.19(m,1H),2.16–2.05(m,1H),2.03–1.97(m, 1H),1.89–1.69(m,1H),1.61–1.36(m,3H),1.35–1.22(m,1H),1.17–1.03(m, 2H).One of thediastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.8,138.5,128.4,127.5, 127.5,75.3,73.1,34.8,34.0,26.6,25.6,22.0,20.4,19.2.The other one of thediastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.8,138.4,128.4,127.5,127.5,75.3,73.0,34.4,32.8,25.4,24.2,21.9,20.4,18.8.HRMS(ESI)C16H23N2O2[M+H]+的m/z理论 上为275.1760,实际上是275.1753.
4)1-(3-(羟甲基)双环[4.1.0]庚烷基)脲(化合物11)
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000131
将钯碳(29.7mg)加入到含有化合物10(297.4mg,1.08mmol)的甲醇(3ml)溶液中，然 后在氢气环境下室温反应一段时间，直至TLC检测反应完全。反应完全后需过滤除去 钯碳，然后真空旋干，在二氯甲烷-甲醇(20:1)洗脱条件下进行柱层析，分离纯化得到 白色固体化合物11(196.9mg,99％)。化合物11是两个非对映异构体的混合物。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ5.49(br s,1H,NH),4.61(br s,2H,NH2),3.39–3.34 (m,1H),3.28–3.24(m,1H),2.24–2.16(m,1H),2.12–1.97(m,2H),1.80–1.69(m,1H), 1.59–1.51(m,2H),1.47–1.33(m,2H),1.19–1.11(m,2H),1.09–1.05(m,1H).One of thediastereoisomers:13C NMR(100MHz,MeOD)δ163.3,68.2,37.7,36.4,35.6,27.4, 26.4,25.0,23.2.The other one of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,MeOD)δ163.3,68.1,37.7,36.4,35.1,27.4,26.4,25.0,23.1.HRMS(ESI)C9H17N2O2[M+H]+的m/z理论 上为185.1290,实际上是185.1286.
5)制备2,5-二羰基吡咯烷基-((7-脲双环[4.1.0]庚烷基)甲基)碳酸(化合物12):
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000132
将N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯粉末(221.5mg,0.864mmol)分批次加入到含有化合 物11(144.7mg,0.79mmol)以及三乙胺(0.33ml,2.36mmol)的无水乙腈(10ml)中，该反应在氮气保护下室温搅拌15小时。待反应完全后，真空旋干反应液。在DCM-MeOH(10:1) 混合体系洗脱下，柱层析分离纯化反应液，得到无色油状液体化合物12(231.0mg, 90％)。化合物12是两个非对映异构体的混合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.63(br s,1H,NH),5.29(br s,2H,NH2),4.14–4.04 (m,2H),2.69(s,4H),2.31–2.01(m,3H),1.95–1.74(m,1H),1.63–1.40(m,3H),1.26– 1.14(m,3H).One of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.0,161.8, 151.7,75.4,36.0,34.6,33.1,25.9,25.5,24.7,23.7,21.9.The other one of thediastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ168.9,161.7,151.7,75.3,35.1,34.2,31.9,25.7,25.5,24.5,23.4,21.9.HRMS(ESI)C14H20N3O6[M+H]+的m/z理论上为326.1352,实 际上是326.1343.
6)制备2,5-二羰基吡咯烷基-((7-(1-亚硝基脲)双环[4.1.0]庚烷基)甲基)碳酸(化合物 13):
反应方程式如下所示：
Figure BDA0002337889100000141
在0℃下，将化合物12(205.2mg,0.631mmol)置于25ml反应瓶中，并逐滴加入乙酸-乙酸酐的混合液(4.5ml,2:1)，然后缓慢滴加含有亚硝酸钠(43.5mg,0.631mmol)的水溶液(2ml)，在反应40分钟后，加入10ml冰水淬灭反应，并用二氯甲烷萃取有机相，然 后在DCM-MeOH(60:1)混合体系洗脱下进行柱层析分离，得到黄色固体化合物 13(129.4mg,58％)。化合物13是两个非对映异构体的混合物。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.76(br s,1H,NH2),5.39(br s,1H,NH2),4.21–4.01 (m,2H),2.84(s,4H),2.31–2.19(m,2H),2.01–1.95(m,1H),1.84–1.68(m,2H),1.56– 1.48(m,2H),1.44–1.35(m,1H),1.20–1.09(m,2H).One of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ168.7,154.5,151.7,75.4,33.9,33.2,25.5,25.2,24.4,21.4,20.5,19.3.The other one of the diastereoisomers:13C NMR(100MHz,CDCl3)δ168.7,154.5,151.7,75.3,33.4,31.7,25.5,24.6,23.1,21.0,20.3,18.8.HRMS(ESI)C14H19N4O7[M+H]+的m/z理论上为355.1254,实际上是355.1244.
实施例4、生物实验
1、双环[4.1.0]庚烷修饰BSA的体外标记实验
pH引发的IEDDA反应在体外蛋白标记的应用
以常见的牛血清蛋白(BSA)作为模型，进行体外荧光标记实验，反应方程式如 下，BSA的赖氨酸残基和化合物13连接，继而与探针14进行标记反应：
Figure BDA0002337889100000142
1.1蛋白修饰
将化合物13(即式Ⅰ所示化合物)双环[4.1.0]庚烷活性酯与牛血清蛋白(BSA)进行孵育，从而实现对BSA的标记。分别准备BSA(500μL,2mg/ml的0.1M PBS溶液， pH＝5.0，以降低亚硝基脲衍生物在修饰蛋白过程中的水解)和化合物13溶液(25 μL,280mM的DMSO溶液)，各取相应的体积，于4℃下混合孵育4小时。孵育结束后， 对该蛋白液进行透析处理，然后将修饰好的BSA继续与化合物14在室温下反应。BSA 和化合物13在4℃下孵育后，由蛋白质谱测得小分子修饰BSA的定量结果，但是由 于小分子13的不稳定性，无法直接从蛋白质谱上定量分析，所以通过测得稳定性较好 的化合物12和BSA蛋白的连接情况，来间接推测13与BSA的连接结果。HRMS(ESI+) 的空白BSA的m/z理论上为66430，实际测得为66425；BSA-3×15m/z理论上为67058， 实际测得为67053；BSA-4×15m/z理论上为67269，实际测得为67265；BSA-5×15m/z 理论上为67480，实际测得为67476；BSA-6×15m/z理论上为67691，实际测得为67686； BSA-7×15m/z理论上为67902,实际测得为67895；BSA-8×15m/z理论上为68113,实 际测得为67895。由上述结果可知，虽然化合物13性质不稳定，但是可以从相对稳定 的化合物12出发，将化合物12与BSA进行连接反应，从而由化合物12与BSA的连 接情况反推化合物13。由化合物12修饰BSA的蛋白质谱测试可知，即使在酸性条件 下，BSA与化合物12的连接效果还是较好的，化合物12连接蛋白的数目几乎平均在 6个左右。
Q-TOF质谱测得BSA和化合物12修饰的BSA，如图5所示，其中图5A)为对 照未修饰BSA；图5B)为化合物12修饰的BSA。
1.2筛选pH引发已修饰BSA标记实验的pH条件
取20μL双环[4.1.0]庚烷修饰的BSA，加入180μL的缓冲溶液 (0.2M,pH＝4.0,5.0,6.0,7.0,8.0)稀释至蛋白的终浓度为1mg/ml。空白对照BSA按照一样 的操作条件。量取化合物探针14，加入到上述蛋白液中，使其终浓度为100μM，室温 标记时间为10分钟，然后加入3,6-二(2-吡啶基)-1,2,4,5四嗪化合物2进行反应淬灭(300 当量)。然后将该反应液进行电泳分析，在荧光显色仪上观察荧光，结果如图6所示， 蛋白的上样量最终由考马斯蓝决定，由图6可以看出，随着pH值的增加，BSA的荧 光强度也逐渐增强。其中在pH＝7.0下，标记BSA的荧光强度达到最大。但是当体系 的pH值升高到8.0，BSA的荧光强度降低，表明双环亚硝基脲衍生物在pH＝8.0下稳 定性较差，所以导致荧光效率降低。
1.3筛选pH引发已修饰BSA标记实验的浓度条件
取20μL双环[4.1.0]庚烷修饰的BSA，加入180μL的缓冲溶液(pH＝7.0)稀释至蛋白的终浓度为1mg/ml。空白对照BSA按照一样的操作条件。量取化合物探针14，加入 到上述蛋白液中，使其终浓度分别为10,20,40,60,80,100,200μM，室温标记时间为10 分钟，然后加入3,6-二(2-吡啶基)-1,2,4,5四嗪化合物2进行反应淬灭(300当量)。然后 将该反应液进行电泳分析，在荧光显色仪上观察荧光，结果如图7所示，蛋白的上样 量最终由考马斯蓝决定，由图7可以看出，pH引发的BSA的荧光标记过程是浓度依 赖性，随着四嗪探针浓度的增加，BSA的荧光标记效率也逐渐增强。
1.4筛选pH引发已修饰BSA标记实验的时间条件
取20μL双环[4.1.0]庚烷修饰的BSA，加入180μL的缓冲溶液(0.2M,pH＝7.0)稀释至蛋白的终浓度为1mg/ml。空白对照BSA按照一样的操作条件。量取化合物探针14， 加入到上述蛋白液中，使其终浓度为100μM，室温标记时间分别为0,1,2,5,15,30分钟， 然后加入3,6-二(2-吡啶基)-1,2,4,5四嗪化合物2进行反应淬灭(300当量)。然后将该反 应液进行电泳分析，在荧光显色仪上观察荧光，结果如图8所示，蛋白的上样量最终 由考马斯蓝决定。由图8可以看出，pH引发的BSA的荧光标记过程是时间依赖性， 随着标记反应时间的增加，BSA的荧光标记效率也逐渐增强。
2、pH引发双环[4.1.0]庚烷-四嗪的体内标记实验
原料：FreeStyleTM 293-F细胞是从美国标准菌库(美国标准菌库收集中心，位于弗吉尼亚州马纳萨斯)获得。FreeStyleTM 293表达介质是从Invitrogen公司购得。细胞 培养体积有15-1200ml不等，一次性的聚碳酸酯厄伦美厄烧瓶来自于康宁公司。
抗PD-L1抗体的表达，纯化及特性：利用Genescript合成了抗PD-L1重链或轻链 的密码子优化DNA，并将其克隆到pFUSE-Fc载体中。HEK293F细胞在浓度为5％CO2的自由泳TM293表达培养基(Gibco)中，以150rpm/37℃的转速在轨道摇床中培养。当 细胞密度达到1×106个/mL时，按照冷泉港协议修改后的协议转染质粒。简而言之,66μL 无菌1mg/ml 25-kDa线性聚乙烯亚胺(PEIs)(Polysciences)被添加到3.3ml包含33μg质 粒(22μg重链和11μg轻链)的PBS缓冲液中。将DNA/PEI混合物在室温下孵育30分 钟，然后加入到125ml摇瓶的27mL细胞培养液中。转染细胞培养4～6天。用蛋白G 层析法纯化上清液中的抗体。采用SDS-PAGE法测定抗体在还原和非还原条件下的纯 度，如图9所示，其中，抗体的纯度由SDS-PAGE在还原性和非还原性条件下测得。
抗体标记：抗PD-L1抗体(2mg/ml)溶解于醋酸-醋酸钠缓冲溶液中(pH＝5.0)，和化合物13在4℃条件下孵育6小时。将孵育完之后的抗体进行透析处理，然后将其储存 在醋酸-醋酸钠缓冲液中(pH＝5.0)。未加化合物13修饰的对照抗体同样按照相同的实验 操作进行。
细胞系，肿瘤组织及老鼠：雌性C57BL/6老鼠(6-8周)是从中国北京重要河流实验动物中心购得，并将其保存于SPF条件下。所有小鼠均在清华大学动物房(12小时亮/ 暗循环，早上7点开灯)中饲养，每组2～5只，在特定的无致病性条件下，可免费获得 食物和水。本发明使用的动物实验方案经清华大学IACUC(动物护理和使用委员会机 构)批准，并按照IACUC的指导方针执行。清华大学实验动物设施已通过AAALAC(国 际实验动物保护评估认可协会)认证。在每一项实验中，由盲法研究人员将小鼠随机分 配到每一组。所有实验所用的老鼠都没有进行药物测试，也没有事先接种疫苗。
细胞系：MC-38细胞系取自美国型培养标本，并且在杜尔贝克改良的英格尔培养基(DMEM)(Gbico)中，加入10％热灭活FBS(BioInd)、1％青霉素/链霉素(Beyotime)， 37℃和5％CO2条件下培养。从中国细胞系资源基础设施中获得Hepa1-6细胞，在添 加10％热灭活FBS(BioInd)、1％青霉素/链霉素(Beyotime)、5％CO2的在杜尔贝克改良 的英格尔培养基(DMEM)(Gbico)中培养。
肿瘤组织：MC-38肿瘤细胞(1.0x106细胞)悬浮在PBS缓冲液中(100μL)，将其皮 下注射到老鼠的侧翼。定期测量肿瘤生长，直到肿瘤长到直径8毫米。从小鼠体内分 离出MC-38异种移植瘤，用于组织切片的制备。
肿瘤接种：用异氟醚麻醉小鼠，刮腋毛。Hepa1-6肿瘤细胞(1.0x106细胞)悬浮在PBS缓冲液中(100μl)，将其皮下注射到老鼠的侧翼。定期测量肿瘤生长，直到肿瘤长 到直径8毫米。
细胞标记及活细胞成像：MC38细胞和160nM的抗PD-L1抗体或pH引发修饰的 抗PD-L1抗体的PBS缓冲溶液(pH＝6.7)在0℃下孵育40分钟，然后用PBS缓冲溶液 (pH＝6.7)洗涤两次。继而在包含10μM的四嗪-Cy5的PBS缓冲液中(pH＝6.7,7.0,7.4,8.0)， 37℃下孵育处理或未处理的细胞10分钟，进行四嗪标记。最后，所有的细胞都用 10％FBS/HBSS洗涤两次，再用赫斯特33342复染，再重新用10％FBS/HBSS洗涤两次， 然后利用共聚焦显微镜成像，如图10所示，其中图10(a)为纯MC-38细胞，图10 (b)为用未修饰抗体处理的MC-38细胞，图10(c)为用pH引发剂13修饰抗体处 理的MC-38细胞；图10(d)为用四嗪-Cy5处理的MC-38细胞，图10(e)用未修饰 的抗体和四嗪-Cy5处理的细胞，图10(f)用pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理 的细胞(pH＝6.7)，图10(g)用pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝7.0)， 图10(h)用pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝7.4)，图10(i)用 pH引发剂13修饰抗体和四嗪-Cy5处理的细胞(pH＝8.0)，由图11可以看出，随着碱性 的增加，MC-38细胞的体外标记效率也逐渐增加。
细胞标记的流式细胞术分析：在添加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中，首先用30mMNaN3处理200μL 1x106细胞/mL的MC38细胞。用汉克斯平 衡盐溶液中的10％胎牛血清洗涤两次,这些细胞与160nM未经修饰的抗PD-L1或pH 引发修饰的抗PD-L1抗体的PBS缓冲溶液(pH＝6.7)，在0℃下孵育40分钟，然后用 PBS(pH＝6.7)缓冲溶液洗涤两次。继而在包含10μM的四嗪-Cy5的PBS缓冲液中(pH＝6.7,7.0,7.4,8.0)，37℃下孵育处理或未处理的细胞10分钟，进行四嗪标记。最后， 所有的细胞都用10％FBS/HBSS洗涤两次，然后用LSR-II流式细胞仪进行流式细胞术 分析。对于每个细胞群，每个复制实验都需分析10000个活细胞。数据分析使用FlowJo 软件，结果如图11所示，其中，图11(A)为流式细胞术分析未标记或已标记的MC38 细胞的荧光强度；图11(B)为平均荧光强度，Ab：抗体，Ab-M：pH引发剂修饰的 抗体；探针参照四嗪-Cy5(15)，由图11可以看出，随着pH的增加，MC-38细胞的荧 光强度也逐渐增加。
肿瘤细胞标记的组织学检查：新鲜的MC-38肿瘤活体组织切片，加入到含有 160nM未修饰抗PD-L1抗体或pH引发修饰的抗PD-L1抗体的PBS缓冲溶液中 (pH＝7.4，100μL)，在0℃下孵育30分钟，然后用相应的PBS缓冲液洗涤两次。然后 在含有10μM的四嗪-Cy5的PBS(pH＝7.4)的缓冲溶液中，加入修饰或未修饰的细胞， 在37℃下反应10分钟，进行细胞标记实验，然后用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次。 利用共聚焦显微镜观察肿瘤组织(奥林巴斯FV1000-IX81共聚焦-激光扫描显微镜)，结 果如图12所示，其中，Ab：抗体，Ab-M：pH引发剂修饰的抗体；探针参照四嗪-Cy5(15)， 由图12可以看出，pH引发的双环亚硝基脲衍生物，作为生物正交的工具，能够很好 地应用于活体组织标记及预成像。
活体小鼠体内肿瘤的预标记：将160nM含未修饰的抗PD-L1抗体或pH引发修饰 的抗PD-L1抗体的醋酸-醋酸钠(pH＝5.0,100μL)注入到患有肿瘤的活体小鼠体内。然 后，将四嗪-Cy5(100μL，10μM的无菌生理盐水溶液)注射到小鼠尾巴静脉中。在0h,0.5 h,1h,1.5h,2h和18h后，利用体内成像技术观察小鼠成像情况。18小时后，切除小 鼠组织进行体外荧光成像，结果如图13和图14所示(Ab:抗体，Ab-M:pH引发剂修 饰的抗体；探针参照四嗪-Cy5(15))。所有的照片都是在10秒的曝光时间内拍摄的， 以确保数据的一致性。
由图13和图14可以看出，pH引发的双环亚硝基脲衍生物，作为生物正交的工具，不仅可以应用于体外蛋白，细胞及活体组织的预标记及成像，甚至能成功应用于活体 小鼠的体内预标记成像。

Claims (8)

1.一种双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物，其结构式如式Ⅰ所示；
Figure FDA0002988277260000011
式Ⅰ中，R表示碳原子数为1～15的烷基、碳原子数为6～15的芳基或H
X表示O或N；
n为1～10之间的自然数。
2.权利要求1所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)在三氟甲磺酸铜催化剂的催化下，式7所示化合物与重氮乙酸乙酯经环丙烷化得到式8所示化合物；
Figure FDA0002988277260000012
其中，n为1～10之间的自然数；
X表示O或N；
2)在氢氧化锂碱性条件下，式8所示化合物经水解反应得到式9所示化合物；
Figure FDA0002988277260000013
3)在叠氮磷酸二苯酯和三乙胺的催化下，式9所示化合物经Curtius重排反应得到异氰酸酯中间体，所述异氰酸酯中间体与NH2R反应得到式10所示化合物；
Figure FDA0002988277260000014
其中，R表示碳原子数为1～15的烷基、碳原子数为6～15的芳基或H
4)在钯碳的催化下，式10所示化合物经氢气还原得到式11所示化合物；
Figure FDA0002988277260000021
5)在三乙胺的催化下，式11所示化合物与N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得到式12所示化合物；
Figure FDA0002988277260000022
6)式12所示化合物与亚硝酸钠经亚硝基化反应得到权利要求1所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物。
3.权利要求1所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物在制备基于生物正交反应的体内标记和体外标记的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在pH值为7.0～8.0的条件下，所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物原位生成反式环庚烯衍生物，所述反式环庚烯衍生物与荧光标记的四嗪衍生物进行IEDDA反应，即为所述生物正交反应。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：原位生成所述反式环庚烯衍生物的反应条件如下1)或2)：
1)在NaHCO3存在的条件下，以甲醇作为溶剂；
2)在Na2CO3存在的条件下，以体积比为1：1的水与乙腈的混合液作为溶剂。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述四嗪衍生物采用Cy5、Cy3或BODIPYFL进行荧光标记。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述体外标记为体外蛋白标记、活细胞成像或组织成像；
所述体内标记为体内肿瘤的标记。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在pH为4.0～5.0的条件下，将蛋白或抗体连接于所述双环[4.1.0]庚烷亚硝基脲衍生物上。
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