CN102325881A - 用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明人进行了专门的研究并成功地构建了能够在哺乳动物宿主细胞内高水平生产源自外源基因的蛋白质的表达载体，其包含：通过改变密码子为哺乳动物中最不常用的密码子而弱化了表达的翻译弱化的二氢叶酸还原酶基因顺反子；和具有将外源基因整合进高转录活性启动子和高稳定性聚腺苷化信号之间的克隆位点的基因盒。

Description

用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用
技术领域
本发明涉及能赋予哺乳动物宿主细胞以生产高水平的源自外源基因的蛋白质能力的哺乳动物细胞表达载体。本发明的表达载体尤其适用于生产哺乳动物蛋白质，该蛋白质需要哺乳动物独有的糖基化和折叠，而当通过使用大肠杆菌或酵母菌作为宿主的基因重组来生产时很难具有足够活性。
背景技术
已经开发了大量用于生产重组蛋白的载体，并且蛋白质的表达水平在使用细菌例如大肠杆菌、真核微生物例如酵母菌和昆虫细胞作为宿主的表达体系里都很高。然而，当表达哺乳动物独有的蛋白质时，可能不会形成常规的三维结构，并且大多数时候会遇到翻译后修饰例如糖基化的问题。因而，需要建立使用哺乳动物细胞作为宿主的表达体系，但是通常来说，大多数情况下表达水平很低。此外，使用重组病毒载体的表达系统也用于动物细胞，其水平高于昆虫细胞，但是从所表达的蛋白质中移除重组病毒载体是一个很麻烦的过程，并且病毒载体自身的危险性也是不可否认的。
用哺乳动物细胞作为宿主来生产重组蛋白的实例包括组织纤溶酶原激活因子(专利文件1)、促红细胞生成素(专利文件2和非专利文件1-3)、IFN-γ(非专利文件4)和IFN-β(专利文件3和非专利文件5)。此外，还有很多关于重组生产单克隆抗体的报道(专利文件4-6和非专利文件6-8)。另外，哺乳动物细胞的高表达载体的一个实例是pNOW/CMV-AA(专利文件7)。用该载体生产共凝集素的生产水平在培养4天之后达到11.8μg/mL。但是，这些实例中的重组蛋白的生产水平都还不够。
本申请的发明涉及的现有技术文件列举如下。
[现有技术文件]
[专利文件]
[专利文件1]日本特开昭59-183693号公报
[专利文件2]日本特开2002-45191号公报
[专利文件3]日本特开平07-265084号公报
[专利文件4]日本特开平07-67648号公报
[专利文件5]日本特开平06-30788号公报
[专利文件6]日本特开平06-217786号公报
[专利文件7]日本特开平10-179169号公报
[非专利文件]
[非专利文件1]Fermentation Bioengineering，(1989)4：257页
[非专利文件2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1986)83：6465页
[非专利文件3]Biotechnology，(1988)6：67页
[非专利文件4]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1983)80：4564页
[非专利文件5]Cytotechnology，(1990)4：173页
[非专利文件6]Biotechnology，(1992)10：169页
[非专利文件7]J.Immunol.Methods，(1989)125：191页
[非专利文件8]Biotechnology，(1992)10：1455页
发明内容
哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(下文中称为CHO细胞)在药物制剂的生产中的应用，已经被证实是安全的并且现在已经成为常规技术。在使用哺乳动物细胞来生产重组蛋白时，提高生产力对降低成本、医疗保健成本控制等等来说都是非常重要的。因此，有需要通过有效基因转移来发展用于生产具有高水平生产能力的转化体的表达载体。
有效基因转移对哺乳动物细胞内重组蛋白的高水平的简易生产是必需的。有效基因转移是指不管克隆选择容易与否，获得具有高水平生产力的克隆的概率都很高。特别地，其是指活细胞克隆的数量相对于所有转化的细胞在药物选择之后相对较小，从而很容易选择具有高水平生产力的克隆。其也指出现具有高水平生产力的克隆的概率足够高，即使生产目的蛋白质的细胞的数量很小。由于可利用细胞的数量变得很大，需要更多时间和精力用于选择，并导致效率低下，并且有很高可能性会忽略潜在的具有高水平生产能力的克隆。
高水平生产能力是指重组蛋白在通过基因转移获得的转化的细胞克隆内的高表达水平，并且这被认为是主要取决于表达载体的特征和性能。已经发现基因表达的水平基于染色体位置而显著不同(Annu.Rev.Cell Biol.，6，679页，1990)，并且目标基因引入染色体上具有高转录活性的区域(在下文中，转录热点)可能增加重组蛋白质生产的水平。
本发明是鉴于上述情况而完成的。本发明的一个目的是提供能赋予哺乳动物宿主细胞以高水平生产源自外源基因的蛋白质的哺乳动物细胞表达载体。本发明的另一个目的是提供使用上述载体来生产转化体的方法和使用上述载体生产源自外源基因的蛋白质的方法。
作为致力于解决上述问题的研究的结果，本发明人成功地开发了具有这样的机制的表达载体，其中质粒DNA整合进二氢叶酸还原酶基因缺陷宿主细胞的染色体上的转录热点，并筛选在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(下文表示为HT)的培养基中生长的品系。由于二氢叶酸还原酶(DHFR)对核苷碱基的生物合成是必需的，它对所有用DNA作为遗传信息的材料的生物都是必需酶。因此，二氢叶酸还原酶基因缺陷的宿主细胞不能在不含HT(HT是核酸的一个组分)的培养基中生长。可以通过将包含目标蛋白的基因和DHFR基因的构建体引入二氢叶酸还原酶基因缺陷的宿主细胞并然后在缺HT条件下培养所述细胞，从而筛选出表达目标蛋白的细胞。与引入包含目标蛋白的基因和新霉素磷酸转移酶基因的构建体然后用G418进行筛选的方法相比，本方法允许用MTX进行基因扩增，其中MTX是DHFR抑制剂，从而更适合获得以高水平表达目标蛋白的品系。因此，构建了一种可以稳定、高水平地生产蛋白的表达载体，并完成了本发明。
更具体地，本发明提供如下：
[1]一种能够在哺乳动物宿主细胞内高水平生产源自外源基因的蛋白质的表达载体，其包含：
(a)翻译弱化的二氢叶酸还原酶基因盒(翻译弱化的DHFR基因盒)，其表达通过改变密码子为哺乳动物中最不常用的密码子而被弱化；和
(b)基因盒，包含用于将外源基因整合进高转录活性启动子和高稳定性聚腺苷化信号之间的克隆位点；
[2][1]所述的表达载体，其中将[1](a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子改变为在人类中最不常用的密码子；
[3][1]所述的表达载体，其中将[1](a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子改变为：丙氨酸为GCA，精氨酸为CGA，天冬酰胺为AAU，天冬氨酸为GAU，半胱氨酸为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸为GAA，甘氨酸为GGU，组氨酸为CAU，亮氨酸为UUA，赖氨酸为AAA，脯氨酸为CCA，苯丙氨酸为UUU，丝氨酸为UCA，苏氨酸为ACU，酪氨酸为UAU，和/或缬氨酸为GUA；
[4][1]所述的表达载体，其中[1](a)所述翻译弱化的DHFR基因盒使用具有低表达诱导活性的启动子作为启动子；
[5][1]所述的表达载体，其中所使用的低活性启动子是源自在哺乳动物细胞内几乎不表达的基因的启动子，或者增强子部分被移除的启动子；
[6][1]所述的表达载体，其中[1](a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子改变区域是所述基因盒的全长的30％或更多；
[7]一种生产能够以高水平生产源自外源基因的蛋白质的转化体的方法，其包括以下步骤：将外源基因插入至[1]-[6]任一项所述的表达载体中，并用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；
[8]一种生产源自外源基因的蛋白质的方法，其包含如下步骤：
(a)将外源基因插入至[1]-[6]任一项所述的表达载体中；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；
(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养该转化体；和
(d)从培养的转化体收集源自外源基因的蛋白质；
[9][8]的方法，其中[8]的步骤(c)中的培养使用的是化学成分确定的培养基(CD培养基)或添加有非动物基添加剂的CD培养基；
[10]一种筛选具有高水平生产源自外源基因的蛋白质的能力的转化体的方法，其包含如下步骤：
(a)将外源基因插入至[1]-[6]任一项所述的表达载体中；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；和
(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养转化体。
附图说明
图1展示了pDC 1构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；DHFR：二氢叶酸还原酶cDNA；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图2展示了pDC2构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cdDHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变整个DHFR核苷酸序列的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图3展示了pDC5构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd90DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起90个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图4展示了pDC6构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图5展示了pDC7构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起270个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图6展示了pDC1/hMBL构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hMBL：人甘露糖结合凝集素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；DHFR：二氢叶酸还原酶cDNA；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图7展示了pDC2/hMBL构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hMBL：人甘露糖结合凝集素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cdDHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变整个DHFR核苷酸序列的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图8展示了pDC 5/hMBL构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hMBL：人甘露糖结合凝集素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd90DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起90个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图9展示了pDC6/hMBL构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hMBL：人甘露糖结合凝集素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图10展示了pDC6/hMBL构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hMBL：人甘露糖结合凝集素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd270DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起270个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图11展示了pDC6/EPO构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hEPO：人促红细胞生成素cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图12展示了用本发明的pDC6/hEPO表达载体转染的CHO细胞表达的hEPO通过斑点印迹法(dot blot method)检测的示例的表格和照片。
图13展示了用本发明的pDC6/hEPO表达载体转染的CHO细胞表达的hEPO通过蛋白免疫印迹(Western blotting)检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：EPO标准样品(R&D系统，100ng)；第3道：细胞系27培养3天的上清液；第4道：细胞系36培养3天的上清液；第5道：细胞系50培养3天的上清液；第6道：细胞系60培养3天的上清液；第7道：细胞系62培养3天的上清液；第8道：细胞系67培养3天的上清液；第9道：细胞系72培养3天的上清液；第10道：细胞系77培养3天的上清液；第11道：细胞系78培养3天的上清液；第12道：细胞系82培养3天的上清液。
图14展示了pDC6/D-EPO构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；D-EPO：达依泊汀(Darbepoetin)αcDNA；PAB GH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图15展示了用本发明的pDC6/D-EPO表达载体转染的CHO细胞表达的D-EPO通过斑点印迹法检测的示例的表格和照片。
图16展示了用本发明的pDC6/D-EPO表达载体转染的CHO细胞表达的D-EPO通过蛋白免疫印迹检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：达依泊汀α(Nesp注射120μg/0.6mL塑料注射器，Kyowa Hakko Kirin Co.Ltd.，100ng)；第3道：细胞系12培养3天的上清液；第4道：细胞系12培养7天的上清液；第5道：细胞系12培养14天的上清液；第6道：细胞系23培养3天的上清液；第7道：细胞系23培养7天的上清液；第8道：细胞系23培养14天的上清液；第9道：细胞系24培养3天的上清液；第10道：细胞系24培养7天的上清液；第11道：细胞系24培养14天的上清液；第12道：细胞系30培养3天的上清液；第13道：细胞系30培养7天的上清液；第14道：细胞系33培养14天的上清液；第15道：细胞系36培养3天的上清液；第16道：细胞系36培养7天的上清液；第17道：细胞系36培养14天的上清液。
图17展示了pDC6/hG-C SF构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hG-C SF：人粒细胞集落-刺激因子(G-CSF)的cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图18展示了用本发明的pDC6/hG-C SF表达载体转染的CHO细胞表达的hG-CSF通过斑点印迹法检测的表格和照片示例。
图19展示了用本发明的pDC6/hG-CSF表达载体转染的CHO细胞表达的hG-CSF通过蛋白免疫印迹检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：人G-CSF标准样品(Humanzyme，50μg/道)；第3道：细胞系6培养3天的上清液；第4道：细胞系6培养7天的上清液；第5道：细胞系6培养14天的上清液；第6道：细胞系13培养3天的上清液；第7道：细胞系13培养7天的上清液；第8道：细胞系13培养14天的上清液；第9道：细胞系14培养3天的上清液；第10道：细胞系14培养7天的上清液；第11道：细胞系14培养14天的上清液；第12道：细胞系16培养3天的上清液；第13道：细胞系16培养7天的上清液；第14道：细胞系16培养14天的上清液；第15道：细胞系17培养3天的上清液；第16道：细胞系17培养7天的上清液；第17道：细胞系17培养14天的上清液。
图20展示了pDC6/hGM-CSF构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hGM-CSF：人粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)的cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图21展示了用本发明的pDC6/hGM-CSF表达载体转染的CHO细胞表达的hGM-CSF通过斑点印迹法检测的示例的表格和照片。
图22展示了用本发明的pDC6/hGM-CSF表达载体转染的CHO细胞表达的hGM-CSF通过蛋白免疫印迹检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：人GM-CSF标准样品(Humanzyme，5μg/道)；第3道：CHO DG44细胞培养14天的上清液；第4道：样品缓冲液；第5道：细胞系3培养3天的上清液；第6道：细胞系3培养7天的上清液；第7道：细胞系3培养14天的上清液；第8道：细胞系6培养3天的上清液；第9道：细胞系6培养7天的上清液；第10道：细胞系6培养14天的上清液；第11道：细胞系11培养3天的上清液；第12道：细胞系11培养7天的上清液；第13道：细胞系11培养14天的上清液；第14道：细胞系17培养3天的上清液；第15道：细胞系17培养7天的上清液；第16道：细胞系17培养14天的上清液；第17道：细胞系36培养3天的上清液；第18道：细胞系36培养7天的上清液；第19道：细胞系36培养14天的上清液；第20道：细胞系48培养3天的上清液；第21道：细胞系48培养7天的上清液；第22道：细胞系48培养14天的上清液。
图23展示了pDC6/hIFNα构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hIFNα：人干扰素α2b的cDNA；PABGH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图24展示了用本发明的pDC6/hIFNα表达载体转染的CHO细胞表达的hIFNα通过斑点印迹法检测的示例的表格和照片。
图25展示了用本发明的pDC6/hIFNα表达载体转染的CHO细胞表达的hIFNα通过蛋白免疫印迹检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：人IFNα标准样品(人细胞表达的IFNα2B，Cat HZ-1072，Human Zyme，IFN-α2b)；第3道：人IFNα标准样品(iLiteTM Alphabeta IFN母液(200IU/ml)，Biomonitor)；第4道：CHODG44细胞培养14天的上清液；第5道：细胞系3-8培养3天的上清液；第6道：细胞系3-8培养7天的上清液；第7道：细胞系3-8培养14天的上清液；第8道：细胞系3-14培养3天的上清液；第9道：细胞系3-14培养7天的上清液；第10道：细胞系3-14培养14天的上清液；第11道：细胞系2-12培养3天的上清液；第12道：细胞系2-12培养7天的上清液；第13道：细胞系2-12培养14天的上清液。
图26展示了pDC6/hOPN构建体，下列缩写分别表示：PCMV：巨细胞病毒启动子；INRBG：兔生长激素内含子；hOPN：人骨桥蛋白的cDNA；PAB GH：牛生长激素基因聚腺苷酸添加信号；PdSV：增强子缺失的猿病毒40启动子；cd180DHFR：翻译弱化的DHFR基因，通过改变DHFR核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子而获得；PASV：猿病毒40聚腺苷酸添加信号；和Ampr：大肠杆菌中的筛选标记(氨苄青霉素抗性)。
图27展示了用本发明的pDC6/hOPN表达载体转化的CHO细胞表达的hOPN通过蛋白免疫印迹检测的示例的照片。第1道：分子量标记；第2道：CHO DG44细胞培养14天的上清液；第3道：细胞系32培养3天的上清液；第4道：细胞系32培养7天的上清液；第5道：细胞系32培养14天的上清液。
具体实施方式
通过改变DHFR基因的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子从而彻底地弱化DHFR的表达，本发明人使得在不含HT的培养基中的筛选下即使是转化体也很难存活，转化体除非组合的质粒基因被整合进二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞的染色体中具有高表达特性的位置。
更具体地，本发明提供了用于在哺乳动物宿主细胞内诱导重组蛋白质的高水平生产的表达载体。
本发明的表达载体是通过在骨架载体上添加下述物质来构建的：
(a)翻译弱化的二氢叶酸还原酶基因盒(翻译弱化的DHFR基因盒)，其表达通过改变密码子为哺乳动物中最不常用的密码子而被削弱；和
(b)基因盒，包含用于将外源基因整合进高转录活性启动子和高稳定性聚腺苷化信号之间的克隆位点。
本发明通过改变DHFR基因的密码子为在哺乳动物中最不常用的密码子，和在DHFR基因盒(顺反子)构建体中使用具有降低的DHFR基因的表达诱导特性的启动子，从而显著地弱化了在通过基因转移转化的宿主细胞内DHFR基因的表达机制。在本发明中，“基因盒”是指具有启动子、结构基因和聚腺苷化信号(聚腺苷酸)的基本组成并通过转录/翻译而表达蛋白质的单元，它也可以包括作为插入序列的与这些序列相关的DNA序列或任何非强制选择的DNA序列。本发明的DHFR基因盒定义为“翻译弱化的DHFR基因盒”，这是因为它们的不同在于其具有完全弱化的启动子，特别是允许获取在不含HT的培养基中生长并且质粒基因被整合进转录热点的品系。
在本发明中，“哺乳动物中最不常用的密码子”是指优选，例如，人类中最不常用的密码子。所述人类中最不常用的密码子包括在Kim等的文献(Gene，199，293页，1997)中公开的密码子。所述密码子的具体实例是丙氨酸为GCA，精氨酸为CGA，天冬酰胺为AAU，天冬氨酸为GAU，半胱氨酸为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸为GAA，甘氨酸为GGU，组氨酸为CAU，亮氨酸为UUA，赖氨酸为AAA，脯氨酸为CCA，苯丙氨酸为UUU，丝氨酸为UCA，苏氨酸为ACU，酪氨酸为UAU，和/或缬氨酸为GUA，但是不限于此。
在本发明中，“弱化表达”表示在转录和/或翻译水平上减少基因表达，具体地，这可以通过改变密码子为上述“哺乳动物中最不常用的密码子”来实现。
在上述“翻译弱化的DHFR基因盒”中，密码子被改变的区域并不特别限定，但是优选地改变所述基因盒的全长的30％或更多(例如，40％或更多，50％或更多，60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，95％或更多，或100％)区域内的密码子。密码子改变区域的范围可以通过考虑所述载体的其它情况来随意地确定。
作为上述“翻译弱化的DHFR基因盒”的启动子，可以使用来自在哺乳动物细胞内通常很难表达的蛋白质的基因的启动子，或者由常规启动子通过缺失增强子而获得的启动子。更具体地，优选使用由SV40病毒抗原启动子缺失了增强子区域的启动子(Mol.Cell Biol.，6，2593页，1986)，或具有相对非常低的表达特性的启动子。
依照DHFR基因盒的特性，可以通过不含HT的培养基进行筛选来达到将质粒DNA整合进入二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞染色体的转录热点上，但是在染色体的转录热点的源自外源基因的蛋白质自身的表达必须得到强力地诱导。因此，在所述蛋白质基因插入的多克隆位点(在下文中，指MCS)中的启动子和聚腺苷化信号(在下文中，称为聚腺苷酸)将从具有最强力的表达诱导特性的那些之中进行选择。启动子的实例包括人巨细胞病毒即刻早期(hCMV MIE：Cell，41，521页，1985)启动子，人巨细胞病毒启动子与腺病毒启动子融合的CMV5启动子(Nucleic Acid Research，30，2页，2002)，和β-肌动蛋白启动子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，4831页，1987)；聚腺苷酸的实例包括源自牛生长激素的聚腺苷酸序列(DNA 5，115页，1986)。本文中，含有可以插入目标蛋白质的基因的多克隆位点的DNA片段被称为“基因表达盒”。
本发明的表达载体可以通过实施例中具体描述的表达载体来例证，但不限于此。
另外，本发明提供了生产具有高水平生产源自外源基因的蛋白质的能力和在不含HT的培养基中生长的能力的转化体的方法，包含如下步骤：将外源基因插入上述表达载体，并用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞。
具体的实例包括获得具有高蛋白质生产能力的转化体的方法，其中包括将编码待表达的蛋白质的外源基因插入本发明的表达载体的多克隆位点(在下文中，称为MCS)，然后用所述表达载体通过转染方法转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞(本文中所指的转染方法的实例包括本领域技术人员公知的方法，例如脂质体法、电穿孔法、磷酸钙法和微注射法)，然后通过在不含HT的培养基中的抗性进行筛选。
在本发明中，所述宿主细胞并不特定地限定，只要是适合于表达源自外源基因的蛋白质的细胞，但优选包括，例如，二氢叶酸还原酶基因缺失的哺乳动物细胞，更优选二氢叶酸还原酶基因缺失的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。
很多在不含HT的培养基筛选中存活的转化的细胞已经达到了相对高的蛋白质表达水平，但是为了从这些细胞中选择具有更高水平的生产能力的转化细胞，可以测定蛋白质的表达的水平。
另外，本发明提供了生产源自外源基因的蛋白质的方法，包括如下步骤：
(a)将外源基因插入本发明的表达载体；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；
(c)在不含HT的培养基中培养转化体；和
(d)从培养的转化体收集源自外源基因的蛋白质。
在本发明中，在上述步骤(c)中，展现高效率的蛋白质表达的转化体(菌落)能够通过在不含HT的培养基中培养来筛选。所筛选的转化体可以在同样的培养基中继续培养，或者在转移到另一种培养基例如用于大规模表达的培养基中后培养。
在本发明中，用于培养或移植转化体的培养基并没有特别的限制，但是例如，优选无血清培养基，并更优选CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基。
在本发明中，当从培养的转化体中收集源自外源基因的蛋白质的时候，所述蛋白质可以通过本领域技术人员所公知的方法来纯化(过滤、离心、柱纯化等等)。所述源自外源基因的蛋白质可以以与其它蛋白的融合蛋白的形式表达以便于纯化等。
此外，本发明提供筛选具有高水平生产源自外源基因的蛋白质的能力的转化体的方法，其包括如下步骤：
(a)将外源基因插入本发明的表达载体；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；和
(c)在不含HT的培养基中培养转化体。
说明书中所引用的所有现有技术文献并入此处作为参考。
实施例
[实施例1]pDC1、pDC2、pDC5、pDC6和pDC7的构建
使用本领域技术人员所公知的方法，构建了本发明的载体pDC1、pDC2、pDC5、pDC6和pDC7。骨架载体pDC 1的全部核苷酸序列展示于SEQ ID NO：1。pDC1携带位于第1784～2347个核苷酸之间野生型DHFR的cDNA(图1)。pDC2通过将pDC 1的序列的第1784～2347个核苷酸取代为SEQ ID NO：2而构建。pDC2的所述取代区域引入翻译弱化的DHFR基因，其中将DHFR的全部核苷酸序列的密码子改变为哺乳动物中最不常用的密码子(图2)。
pDC5通过将pDC1的序列的第1784～2347个核苷酸取代为SEQ ID NO：3而构建。pDC5的所述取代区域引入翻译弱化的DHFR基因，其中DHFR的核苷酸序列从5’端起90个碱基范围内的密码子被改变为哺乳动物中最不常用的密码子(图3)。
pDC6通过将pDC1的序列的第1784～2347个核苷酸取代为SEQ ID NO：4而构建。pDC6的所述取代区域引入翻译弱化的DHFR基因，其中DHFR的核苷酸序列从5’端起180个碱基范围内的密码子被改变为哺乳动物中最不常用的密码子(图4)。
pDC7通过将pDC1的序列的第1784～2347个核苷酸取代为SEQ ID NO：5而构建。pDC7的所述取代区域引入翻译弱化的DHFR基因，其中DHFR的核苷酸序列从5’端起270个碱基范围内的密码子被改变为哺乳动物中最不常用的密码子(图5)。
[实施例2]pDC1/hMBL、pDC2/hMBL、pDC5/hMBL、pDC6/hMBL和pDC7/hMBL的构建
使用本领域技术人员公知的方法，将本发明的载体pDC1、pDC2、pDC5、pDC6和pDC7的第1267～1275个核苷酸用SEQ IDNO：6的编码人甘露糖结合凝集素(MBL)的cDNA(在下文中称为hMBL)取代，从而构建pDC1/hMBL(图6)、pDC2/hMBL(图7)、pDC5/hMBL(图8)、pDC6/hMBL(图9)和pDC7/hMBL(图10)。
[实施例3]将pDC1/hMBL、pDC2/hMBL、pDC5/hMBL、pDC6/hMBL和pDC7/hMBL转染进入CHO细胞，以及用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基在不含HT的基质上进行筛选
在25cm2的培养瓶中用脂质体方法(使用LipofectamineTMLTX；Invitrogen)将10μg的pDC1/hMBL、pDC2/hMBL、pDC5/hMBL、pDC6/hMBL和pDC7/hMBL转染进入500000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中稀释。分别以浓度为1000细胞/孔和100细胞/孔将细胞平铺于5个96孔微滴定板中，一共10个板(960孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(细胞系在不含HT的培养基中生长)。从存活细胞中任意地选择可来自无HT培养基中生长的细胞系的50个系，与添加了4mM的GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转移到24孔板中，培养直到细胞填满各个孔的1/3或更多。每个系取0.4mL放置入无菌试管并在200×g下离心2分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于0.1mL新鲜培养基中(添加了4mM的GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))。对细胞进行计数之后，用培养基将细胞稀释至5.0×105个细胞/mL，然后取其0.2mL转移至新的24孔板，并在5％二氧化碳气体存在下以37℃培养细胞72小时。然后，细胞以9300×g离心2分钟，收集上清液。之后，测定培养上清液中MBL的生产水平。
[实施例4]pDC1/hMBL、pDC5/hMBL、pDC6/hMBL和pDC7/hMBL转染的细胞系的MBL生产水平的测定
通过ELISA来测定所述生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用包被缓冲液(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3，pH 9.6)稀释的1μg/mL的抗人MBL抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)包被16小时。用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭之后，将所述72小时培养上清液(1/1000到1/100000稀释)、纯化的人MBL(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)的在用于CHO细胞的无血清培养基的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中的二倍稀释系列(20～0.3125ng/mL)、具有水解液培养基(IS，日本)的IS CHO，以100μL/孔添加于平板中，所述平板在37℃下孵育1小时。此后进一步与0.1μg/mL的生物素化的人MBL单克隆抗体(获赠于日本旭川医科大学的大谷博士)一起在37℃下孵化1小时。然后以100μL/孔添加已经在37℃下孵育30分钟的VECTASTAIONElite ABC Kit STANDARD(2滴试剂A，2滴试剂B/5mL，Vector)，在37℃下反应45分钟。进一步以100μL/孔加入已经在室温下孵育30分钟的PEROXIDASE SUBSTRATE KIT TMB(2滴缓冲液，3滴TMB，2滴过氧化氢/5mL，Vector)，此后在室温下反应15分钟，再以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度。表1中展示了由ELISA方法获得的结果以及MBL生产水平的最高的三个样品。与未改变密码子的载体相比，具有最高生产水平的细胞系展现出了显著的高生产力。
[表1]
生长于不含HT的培养基中的细胞系的hMBL生产水平
[实施例5]pDC1/hMBL、pDC5/hMBL、pDC6/hMBL和pDC7/hMBL转染的细胞系的hMBL生产水平
表2展示了每个细胞系中本发明的pDC1、pDC5、pDC6和pDC7表达载体表达的hMBL的分布。
对于pDC1，在无HT的培养基中生长的50个细胞系中，28.0％生产的hMBL为0μg/mL或远低于5μg/mL。在50个系中有36个(72.0％)展示出5μg/mL或更高的生产水平。50个系中的19个(38.0％)展示出10μg/mL或更高的生产水平。50个系中的12个(24.0％)展示出15μg/mL或更高的生产水平。50个系中的2个(4.0％)展示出20μg/mL或更高的生产水平。展现最高的生产水平的细胞系在3天时间里生产了20.5μg/mL。
对于pDC 5，在无HT的培养基中生长的50个细胞系中，70.0％生产的hMBL为0μg/mL或远低于5μg/mL。在50个系中有15个(30.0％)展示出5μg/mL或更高的生产水平。50个系中的3个(6.0％)展示出10μg/mL或更高的生产水平。展现最高的生产水平的细胞系在3天时间里生产了11.8μg/mL。
对于pDC6，在50个在无HT的培养基中生长的细胞系中，34.0％生产的hMBL为0μg/mL或远低于5μg/mL。在50个系中有33个(66.0％)展示出5μg/mL或更高的生产水平。50个系中的22个(44.0％)展示出10μg/mL或更高的生产水平。50个系中的15个(30.0％)展示出15μg/mL或更高的生产水平。50个系中的7个(14.0％)展示出20μg/mL或更高的生产水平。50个系中的5个(10.0％)展示出25μg/mL或更高的生产水平。令人吃惊地，50个系中的1个(2.0％)展示出50μg/mL或更高的生产水平。展现最高的生产水平的细胞系在3天时间里生产了51.6μg/mL。
对于pDC7，在50个在无HT的培养基中生长的细胞系中，56.0％生产的hMBL为0μg/mL或远低于5μg/mL。在50个系中有22个(44.0％)展示出5μg/mL或更高的生产水平。50个系中的16个(32.0％)展示出10μg/mL或更高的生产水平。50个系中的13个(26.0％)展示出15μg/mL或更高的生产水平。50个系中的8个(16.0％)展示出20μg/mL或更高的生产水平。50个系中的6个(12.0％)展示出25μg/mL或更高的生产水平。50个系中的3个(6.0％)展示出30μg/mL或更高的生产水平。50个系中的2个(4.0％)展示出35μg/mL或更高的生产水平。令人吃惊地，50个系中的1个(2.0％)展示出45μg/mL或更高的生产水平。展现最高的生产水平的细胞系在3天时间里生产了33.2μg/mL。
与文献报道的用典型表达载体进行基因扩增之前的初期克隆的数据相比较(DNA，7，651页，1988；Biotechnology，10，1455页，1992；Biotechnology，8，662页，1990；Gene 76，19页，1989；和Biotechnology，9，64页，1991)，这是最高水平了。
通过基因扩增来筛选重组细胞通常需要6个月到1年。由于培养条件和扩增刺激试剂的浓度带来了巨大的变异性，从而用原始克隆的预扩增的表达水平与所述表达载体的初级效率相比较被认为是合适的。这显示出本发明的表达载体的效率非常高。该结果证实了本发明的载体获得了非常少的生长于无HT的培养基中细胞系的同时，使建立能够以非常高的效率生产高水平的目标蛋白的细胞系成为可能。这也证明本发明的表达载体能够非常高水平的表达蛋白质。
[表2]
生长于不含HT的培养基中的细胞系的hMBL生产水平
[实施例6]pDC6/hEPO的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：7的编码人促红细胞生成素(EPO)的cDNA(下文称为hEPO)取代，以构建pDC6/hEPO(图11)。
[实施例7]将pDC6/hEPO转染进入CHO细胞，并在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hEPO转染进入4000000个CHO细胞中(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中稀释。将细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000个细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
在存活细胞中，随意地选择在无HT的培养基中生长的82个细胞系，用斑点印迹法确认其表达。重组人EPO(RecombinantHuman EPO，Cat.287-TC，R&D systems)标准样品的二倍稀释系列(10～0.16ng/mL)和所述随意选择的82个细胞系的培养上清液各1μL加到膜上(Nytran N，ITEM NO.10416196，SCHLEICHER &SCHUELL)。室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(Peroxidase ConjugatedAffinity Purified Anti-RABBIT IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM WesternChemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。由斑点印迹法获得的图片如图12所示。
在斑点印迹法中具有最高化学发光的前十位的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS日本)一起转入24孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。每个细胞系取0.4mL放置于无菌试管中并在200×g下离心2分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于0.1mL的新鲜培养基中(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))。对细胞计数之后，用培养基稀释细胞至5×105个细胞/mL，然后取0.2mL转移至新的24孔板，在5％二氧化碳气体存在下以37℃培养72小时。然后，将细胞在9300×g下离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例8]pDC6/hEPO转染的细胞系的hEPO生产水平的测定
通过ELISA来测定所述生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用固相抗体溶液(D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma-Aldrich))稀释的1μg/mL的抗人EPO抗体(rhEPO MAb R6K，扶桑药品工业株式会社)包被16小时。用封闭液(4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)以1∶3的比例的混合液)封闭之后，将72小时培养上清液(1/1000～1/100000稀释)、纯化的人EPO(扶桑药品工业株式会社)的以在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(500～15.6mIU/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)的各100μL进行添加，在25℃下孵育2小时。此后进一步与0.1μg/mL的过氧化物酶标记的人EPO单克隆抗体(POD-rhEPO MAb R2C，扶桑药品工业株式会社)一起在25℃下孵化2小时。以100μL/孔提供Sure BlueTMB Microwell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表3展示了根据ELI SA获得的结果具有最高人EPO生产水平的前十位样品。显示具有最高生产水平的细胞系在3天里产生了3727±109IU/mL。该数值来自未克隆的早期细胞系，处于未经历基因扩增的时期，显示了非常高的水平，相比于文献报道的典型的促红细胞生成素水平((日本特开2002-45191；J.Microbiol.Biotechnol.2008 Jul；18(7)：1342-1351；Biotechnol.Appl.Biochem.2000Dec；32(Pt 3)：167-172；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1986Sep；83(17)：6465-6469)。这证明本发明的表达载体可以进行非常高水平的蛋白质表达。然后，进行了培养上清液中hEPO的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[表3]
Figure BPA00001423257200261
[实施例9]pDC6/hEPO转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例8获得的具有最高人EPO生产水平的10个样品的3天培养上清液用于蛋白质印迹分析。培养上清液各10μL分别与10μL的含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR ThermalCycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。然后，100ng/10μL的rhEPO(Recombinant human EPO，Cat 287-TC，R&Dsystems)的标准样品与10μL的含5％的2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔的10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后20μL热处理的样品溶液和标准样品加入至17个孔的10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：My Run，COSMO BIOCO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含有30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含有30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRY TRANSFERCELL，BIO-RAD)中，从阴极侧按顺序铺放用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(ExtraThick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、在转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中浸透的电泳后的凝胶、和用转移缓冲液(包含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPacTM HC，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL的ImmunoB lock(注册商标，Laboratory Products Division ofDainippon Sumitomo Pharama Co.，Ltd.)并在4℃下封闭18小时；在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)条件下，将10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释1000倍的Epo(H-162)兔多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology)在室温下与膜上的蛋白质反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释5000倍的过氧化物酶标记的亲和纯化的抗-兔IgG F(c)[山羊](RockLand)，在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下室温反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL的ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉30秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图13所示。检测到与标准样品相似的条带。
[实施例10]7天培养和14天培养的hEPO生产水平的测量
挑选展现高水平的EPO生产和快速生长的细胞系(编号27、36、50、78和82)进一步培养7和14天，并测量其培养上清液中的hEPO浓度。培养方法包括：测量初始细胞数目，用培养基稀释细胞以获得0.5×105细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶中，在5％二氧化碳存在的条件下37℃培养7和14天，并在9300g离心2分钟之后收集上清液。通过ELISA来测定所述生产水平。将96孔板(F96MAXI SORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用固相抗体溶液(D-PB S(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma-Aldrich))稀释的1μg/mL的抗人EPO抗体(rhEPO MAb R6K，扶桑药品工业株式会社)在4℃下包被16小时。用封闭液(4％BlockAce(大日本住友制药株式会社)与D-PB S(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，加入7天和14天培养上清液(1/1000～1/100000稀释)、纯化的人EPO(扶桑药品工业株式会社)的在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PB S(Dulbecco磷酸盐缓冲液，SigmaAldrich)混合)中的二倍稀释系列(500～15.6mIU/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育2小时。此后进一步与0.1μg/mL的过氧化物酶标记的人EPO单克隆抗体(POD-rhEPO MAb R2C，扶桑药品工业株式会社)一起在25℃下孵化2小时。以100μL/孔加入Sure Blue TMBMicrowell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表4展示了根据ELISA获得的7天和14天培养的表达水平的结果。显示具有最高生产水平的细胞系在14天里产生了31590±444IU/mL。该数值来自未克隆的早期细胞系，即，也处于未经历基因扩增的时期，相比于文献报道的典型的促红细胞生成素生产水平((日本特开2002-45191；J.Microbiol.Biotechnol.2008 Jul；18(7)：1342-1351；Biotechnol.Appl.Biochem.2000 Dec；32(Pt3)：167-172；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1986 Sep；83(17)：6465-6469)，显示了非常高的水平。通常，通过MTX的基因扩增在克隆之后进行以尝试增加生产水平；然而，基因扩增的克隆的生产水平有时候不稳定。另外，从基因扩增的重组细胞中进行筛选需要6个月到1年。在这点上，通过转染上述载体获得的细胞展示了高生产水平，以致于不需要基因扩增就可以在短时间内成功而容易地获得具有高生产水平的细胞。从而，本发明的载体显示出具有非常优越的性能。
[表4]
[实施例11]高产量hEPO生产细胞系的产生
为了产生具有更高生产能力的细胞，增加了筛选的细胞的数目，以试图产生高产量hEPO生产的细胞系。
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hEPO转染进入16000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后将细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen)中稀释。将细胞平铺于45个96孔微滴定板中，每个浓度为16000细胞/孔(4320孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
斑点印迹法用于确认所述板上的所有细胞系的表达。取所有细胞系的培养上清液各2μL加入至膜上(Nytran N，ITEMNO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。捕捉的图片用Image J(NIH)分析，并比较其发光强度。具有最高的发光强度的450个细胞系与添加了4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基一起转入24孔板，在37℃和5％二氧化碳气体存在下静置培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。
所述前450个细胞系的表达通过斑点印迹法来确认。取所有细胞系的培养上清液各2μL加入至膜上(Nytran N，ITEMNO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL的用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。捕捉的图片用Image J(NIH)分析，并比较其发光强度。具有最高的发光强度的200个细胞系与添加了4mMGluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基一起转入6孔板，在37℃和5％二氧化碳气体存在下90min-1振荡培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。
所述前200个细胞系的表达通过斑点印迹法来确认。取所有细胞系的培养上清液各2μL加入至膜上(Nytran N，ITEMNO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。捕捉的图片用Image J(NIH)分析，并比较其发光强度。具有最高的发光强度的80个细胞系与添加了4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基一起转入6孔板，在37℃和5％二氧化碳气体存在下90min-1振荡培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。然后，所述具有最高发光强度的80个细胞系与添加了4mM Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基转入6孔板的2个孔，在37℃和5％二氧化碳气体存在下90min-1振荡培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。然后，所述具有最高发光强度的80个细胞系与添加了4mMGluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基转入6孔板的6个孔，在37℃和5％二氧化碳气体存在下90min-1振荡培养直到细胞覆盖每个孔1/3或更多。
所述前80个细胞系的表达通过斑点印迹法来确认。取所有细胞系的培养上清液各2μL加入至膜上(Nytran N，ITEMNO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。捕捉的图片用Image J(NIH)分析，并比较其发光强度。对于具有最高的发光强度的40个细胞系，每个细胞系取0.4mL分别置于无菌试管中并在200×g下离心2分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于0.1mL的新鲜培养基中(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))。对所述细胞计数之后，用培养基稀释细胞至5×105个细胞/mL，然后取0.2mL转入新的24孔板中，这些细胞在37℃和5％二氧化碳气体存在下培养72小时。然后，将细胞在9300×g下离心2分钟并收集上清液。测定生产水平。
[实施例12]高产量EPO生产细胞系生产hEPO的水平的测量
通过ELISA来测定生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXISORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用固相抗体溶液(D-PB S(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma-Aldrich))稀释的1μg/mL的抗人EPO抗体(rhEPO MAb R6K，扶桑药品工业株式会社)包被16小时。用封闭液(4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，加入72小时培养上清液(1/40000～1/1600000稀释)、纯化的人EPO(扶桑药品工业株式会社)的在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例和D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(500～15.6mIU/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育2小时。此后进一步与0.1μg/mL的过氧化物酶标记的人EPO单克隆抗体(POD-rhEPOMAb R2C，扶桑药品工业株式会社)一起在25℃下孵化2小时。以100μL/孔加入Sure Blue TMB Microwell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，655nm波长为对照。表5是根据ELISA获得的结果，展示了具有高的人EPO生产水平的前40个样品。
[表5]
Figure BPA00001423257200351
在通过重复上述筛选而产生的在无HT的培养基中生长的40个细胞系中，15％生产的hEPO为0IU/ml/3天或远低于2000IU/mL/3天。这40个细胞系中的34个(85％)生产2000IU/mL/3天或更多。这40个细胞系中的19个(47.5％)生产4000IU/mL/3天或更多。这40个细胞系中的11个(27.5％)生产6000IU/mL/3天或更多。这40个细胞系中的4个(10％)生产8000IU/mL/3天或更多。这40个细胞系中的3个(7.5％)生产10000IU/mL/3天或更多。令人吃惊地，这40个细胞系中的2个(5.0％)生产12000IU/mL/3天或更多。展现最高生产水平的细胞个在3天里产生了13744±123IU/mL的产量。该数值来自未克隆的早期细胞系，即，处于未经历基因扩增的时期，相比于文献报道的典型的促红细胞生成素生产水平((日本特开2002-45191；J.Microbiol.Biotechnol.2008Jul；18(7)：1342-1351；Biotechnol.Appl.Biochem.2000Dec；32(Pt 3)：167-172；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1986Sep；83(17)：6465-6469)，显示了非常高的水平。这证明本发明的表达载体能够以非常高的水平表达蛋白。
[实施例13]pDC6/D-EPO的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：8的达依泊汀α(D-EPO)的cDNA(下文称为D-EPO)取代，以构建pDC6/D-EPO(图14)。
[实施例14]将pDC6/D-EPO转染进入CHO细胞，在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
在25cm2的培养瓶中用脂质体方法(使用LipofectamineTMLTX；Invitrogen)将2.5μg的pDC6/D-EPO转染进入4000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)中。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中稀释。细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000个细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
在存活细胞中，随意地选择在无HT的培养基中生长的84个细胞系，用斑点印迹法确认其表达。取重组人EPO(RecombinantHuman EPO，Cat.287-TC，R & D systems)的标准样品二倍稀释系列(10～0.16ng/mL)和所述随意选择的84个细胞系的培养上清液各1μL加入至膜上(Nytran N，ITEM NO.10416196，SCHLEICHER &SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的兔多克隆抗-EPO抗体(EPO(H-162)，兔多克隆IgG，Cat.sc-7956，Santa Cruz Biotechnology)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM WesternChemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。由斑点印迹法获得的图片如图15所示。
将在斑点印迹法中观察到化学发光的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS日本)一起转入24孔板，培养直到细胞覆盖每个孔1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS日本)一起转入6孔板，培养直到细胞覆盖每个孔1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的ISCHO-CD w/水解液培养基(IS日本)一起转入T75培养瓶(BD)中，培养直到每个孔中的细胞达到1.0×106个细胞/孔或更多。
每个细胞系各取15mL放置于15mL试管中并以1100rpm离心7分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于15mL新鲜培养基中(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))。对细胞计数之后，将细胞用培养基稀释至5×105个细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶中，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养细胞14天。在培养的第3天、第7天和第14天时，分别收集每种培养液的1mL，在9300×g下离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例15]pDC6/D-EPO转染的细胞系的D-EPO生产水平的测定
通过ELISA来测定生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXISORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用固相抗体溶液(D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma-Aldrich))稀释的抗人EPO抗体(rEPO MAb R6K，扶桑药品工业株式会社)1μg/mL包被16小时。用封闭溶液(4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，加入3天、7天或14天培养上清液(1/1000～1/100000稀释)、达依泊汀α(Nesp注射120μg/0.6mL塑料注射器，KyowaHakko Kirin Co.Ltd.)在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(10～0.156ng/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育2小时。此后进一步与0.1μg/mL的过氧化物酶标记的人EPO单克隆抗体(POD-rhEPO MAb R2C，扶桑药品工业株式会社)一起在25℃下孵化2小时。以100μL/孔加入SureBlue TMB Microwell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表6是根据ELI SA获得的结果，展示了具有高D-EPO生产水平的前五位样品。显示具有最高生产水平的细胞系在3天里产生了22±0.3μg/mL、7天135±3.3μg/mL、14天170±3.7μg/mL。然后，进行了培养上清液中D-EPO的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[表6]
Figure BPA00001423257200391
[实施例16]pDC6/D-EPO转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例15获得的具有最高D-EPO生产水平的5个样品的3天、7天和14天培养上清液用于蛋白质印迹分析。取培养上清液各10μL分别与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的LaemmliSample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCRThermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。然后，将100ng/10μL达依泊汀α的标准样品(Nesp注射120μg/0.6mL塑料注射器，Kyowa Hakko Kirin Co.Ltd.)与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRaBIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔的10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后取20μL经热处理的样品溶液和标准样品置于17个孔的10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：MyRun，COSMO BIO CO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。
在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRY TRANSFERCELL，BIO-RAD)中，从阴极侧按顺序铺放用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(ExtraThick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中浸透的电泳后的凝胶、和用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPac HCTM，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL的ImmunoBlock(注册商标，Laboratory Products Division ofDainippon Sumitomo Pharama Co.，Ltd.)并在4℃下封闭18小时；在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下，取10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释1000倍的Epo(H-162)兔多克隆IgG(Santa CruzBiotechnology)在室温下与膜上的蛋白质反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释5000倍的过氧化物酶标记的亲和纯化的抗-兔IgG F(c)[山羊](Rock Land)，室温下振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL  的ImmobilonTM WesternChemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉5秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图16所示。检测到与标准样品相似的条带。
[实施例17]pDC6/hG-CSF的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：9的编码人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的cDNA(下文称为hG-CSF)取代，以构建pDC6/hG-CSF(图17)。
[实施例18]将pDC6/hG-CSF转染进入CHO细胞，在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hG-CSF转染进入4000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后将细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen)中稀释。细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
在存活细胞中，随意地选择在无HT的培养基中生长的50个细胞系，用斑点印迹法确认其表达。取重组人G-CSF(RecombinantHuman G-CSF，Cat.1001C，APOLLO)标准样品二倍稀释系列(10～0.0390625μg/mL)和所述随意选择的50个细胞系的培养上清液各2μL加入至膜上(Nytran N，ITEM NO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入0.5mg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的抗人G-CSF小鼠单克隆抗体(单克隆抗人G-CSF的抗体，Cat.MAB214，R & D)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG抗体(山羊抗-小鼠IgG(H+L)，Cat.115-036-062，Jackson)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。由斑点印迹法获得的图片如图18所示。
将在斑点印迹法中观察到化学发光的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen)一起转入24孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen)一起转入6孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen)一起转入T75培养瓶(BD)中，培养直到每个孔中的细胞达到1.0×106个细胞/孔或更多。
每个细胞系各取15mL放置于15mL试管中并以1100rpm离心7分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于15mL新鲜培养基中(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的CD Opti CHO AGT培养基(Invitrogen))。对细胞计数之后，用培养基将细胞稀释至5×105个细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶中，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养细胞14天。在培养的第3天、第7天和第14天时，分别收集每种培养液的1mL，在9300×g下离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例19]pDC6/hG-C SF转染的细胞系的hG-C SF生产水平的测定
通过ELISA来测定生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXISORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用包被缓冲液(15mM，Na2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3，pH 9.6)稀释的抗人G-CSF抗体(抗人G-CSF单克隆抗体，Cat No.MAB214，R&Dsystem)0.5μg/mL包被16小时。用封闭溶液(4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，SigmaAldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，加入3天、7天或14天的培养上清液(1/10000～1/200000稀释)、重组人G-C SF(重组人G-CSF，Cat 1001C，APOLLO)的标准样品在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(5～0.078125ng/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育1小时。此后进一步与0.25μg/mL的生物素化的人G-CSF抗体(生物素化的抗人G-CSF抗体，Cat No BAF214，R&D system)一起在25℃下孵化1小时。以100μL/孔加入在25℃下孵育了30分钟的标准超敏感ABC染色试剂盒(试剂A2滴，试剂B2滴/10mL，Pro#32050，PIERCE)，并在25℃下反应30分钟。以100μL/孔加入Sure Blue TMBMicrowell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表7展示了根据ELISA获得的结果具有高的人G-CSF生产水平的前十位样品。显示具有最高生产水平的细胞系在3天里产生了34.7±1.1μg/mL、7天193.6±0.6μg/mL，14天235.5±14.8μg/mL。该数值来自未克隆的早期细胞系，即，也处于未经历基因扩增的时期，相比于文献报道的典型的G-CSF生产水平(J Biosci Bioeng.2000，89(6)：534-538；Gene 1996，Nov.21，180(1-2)：145-150；Mol Biotechnol.1997Jun，7(3)：231-240；日本特表平01-500483，显示了非常高的水平。
这证明本发明的表达载体能够以非常高的水平表达蛋白。然后，进行了培养上清液中hG-CSF的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[表7]
Figure BPA00001423257200441
[实施例20]pDC6/hG-CSF转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例19获得的具有最高人G-CSF生产水平的5个样品的3天、7天和14天培养上清液用于蛋白质印迹分析。取培养上清液各10μL分别与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的LaemmliSample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRaPCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。然后，将10μg/10μL的重组人G-CSF标准样品(recombinanthuman G-CSF，Cat 1001C，APOLLO)与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRaBIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔的10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后将20μL经热处理的样品溶液和标准样品加入至17个孔的10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：My Run，COSMO BIO CO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRYTRANSFER CELL，BIO-RAD)中，从负极侧按顺序铺放用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、经活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的电泳后的凝胶、和用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPac HCTM，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，在4℃下将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL的ImmunoBlock(注册商标，LaboratoryProducts Division of Dainippon Sumitomo Pharama Co.，Ltd.)并封闭18小时；在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，取10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了2000倍的抗人G-CSF小鼠单克隆抗体(单克隆抗人G-CSF抗体，Cat MAB214，R&D)在室温下与膜上的蛋白质反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了5000倍的过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG抗体(山羊抗-小鼠IgG(H+L)，Cat 115-036-062，Jackson)，并在室温下振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL的ImmobilonTM WesternChemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉30秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图19所示。检测到与标准样品相似的条带。
[实施例21]pDC6/hGM-CSF的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：10的编码人粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)的cDNA(下文称为hGM-CSF)取代，以构建pDC6/hGM-CSF(图20)。
[实施例22]将pDC6/hGM-C SF转染进入CHO细胞，在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hGM-CSF转染进入4000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后将细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中稀释。将细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000个细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
从存活细胞中，随意地选择在无HT的培养基中生长的48个细胞系，用斑点印迹法确认其表达。取重组人GM-CSF(Recombinant Human GM-CSF，Cat No.071-04111，Wako)标准样品的二倍稀释系列(100～0.16ng/mL)和所述随意选择的48个细胞系的培养上清液各2μL加在膜上(Nytran N，ITEMNO.10416196，SCHLEICHER & SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，在室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入1μg/mL用PBST(D-PB S，0.05％吐温20)稀释的抗人GM-CSF山羊多克隆抗体(抗人GMC SF中和抗体，Cat.AB-215-NA，R&D systems)，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-山羊IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗-山羊IgG[兔])，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。由斑点印迹法获得的图片如图21所示。
将在斑点印迹法中观察到化学发光的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入24孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入6孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的ISCHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入T75培养瓶(BD)，培养直到每个孔中的细胞达到1.0×106细胞/孔或更多。
每个细胞系取15mL放置入15mL试管中并以1100rpm离心7分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于15mL新鲜培养基(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))中。对细胞计数之后，将细胞用培养基稀释至5×105个细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶中，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养细胞14天。在培养的第3天、第7天和第14天时，分别收集1mL每种培养液，以9300×g离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例23]pDC6/hGM-CSF转染的细胞系的hGM-C SF生产水平的测定
通过ELISA来测定生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXISORP Nunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用0.5μg/mL用包被缓冲液(15mM，Na2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3，pH 9.6)稀释的抗人GM-CSF抗体(小鼠抗-hGM-CSF捕获mAb，Cat No.404CE14G12，Invitrogen)包被16小时。用封闭溶液(4％的BlockAce(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，加入72小时培养上清液(1/1000～1/25000稀释)、在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与重组人GM-CSF(人细胞表达的重组人GM-CSF，Cat No.HZ-1001，HumanZyme Inc.)在D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(10～0.15625ng/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育1小时。此后进一步以0.25μg/mL的生物素化人GM-CSF抗体(小鼠抗-hGM-CSF生物素结合物，Cat No.404CE10A8，Invitrogen)在25℃下孵化1小时。以100μL/孔添加在25℃下孵育了30分钟的标准超敏感ABC染色试剂盒(试剂A2滴，试剂B2滴/10mL，Pro#32050，PIERCE)，并在25℃下反应30分钟。以100μL/孔添加Sure Blue TMBMicrowell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，再以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表8展示了根据ELI SA获得的结果具有高的人GM-CSF生产水平的前6位样品。显示具有最高生产水平的细胞系在3天里产生了33.1±0.8μg/mL、7天171.7±3.0μg/mL、14天321.7±2.1μg/mL。该数值来自未克隆的早期细胞系，即，也处于未经历基因扩增的时期，相比于文献报道的典型的GM-CSF生产水平(Journal of Biotechnology 109(2004)179-191；Biotechnol.Prog.2005，21，17-21；Eur.J.Biochem.271，907-919(2004)；J Biosci Bioeng.2002，94(3)：271-274)，显示了非常高的水平。
这证明本发明的表达载体能够以非常高的水平表达蛋白。然后，进行了培养上清液中hGM-CSF的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[表8]
Figure BPA00001423257200501
[实施例24]pDC6/hGM-CSF转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例23获得的具有最高人GM-CSF生产水平的6个样品的3天、7天和14天培养上清液用于蛋白质印迹分析。取培养上清液各10μL分别与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的LaemmliSample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRaPCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。然后，取10μg/10μL的人GM-C SF标准样品(人细胞表达的重组人GM-C SF，Cat No.HZ-1001，HumanZyme Inc.)与10μL的含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后取20μL热处理的样品溶液和标准样品添加于17个孔10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：My Run，CO SMO BIO CO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)和Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRYTRANSFER CELL，BIO-RAD)中，从负极侧按顺序铺放用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中浸透的电泳后的凝胶，和用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPac HCTM，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL  的ImmunoBlock(注册商标，Laboratory ProductsDivision of Dainippon Sumitomo Pharama Co.，Ltd.)并在4℃下封闭18小时；在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下，取10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了2000倍的抗人GM-CSF抗体(抗人GM-CSF中和抗体，Cat No.AB-215-NA，R&D systems)在室温下与膜上的蛋白质反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了5000倍的过氧化物酶标记的兔抗-山羊IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗-山羊IgG，Cat No.605-4302，Rock Land)，振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下室温反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL的ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉5秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图22所示。检测到与标准样品相似的条带，并且显示该条带的亮度随培养天数的增加而变深。
[实施例25]pDC6/hIFNα的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：11的编码人干扰素α2b(hIFNα)的cDNA(下文称为hIFNα)取代，以构建pDC6/hIFNα(图23)。
[实施例26]将pDC6/hIFNα转染进入CHO细胞，在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hIFNα转染进入4000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。根据生产商的说明书来进行基因转染。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后将细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)中稀释。将细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
从存活细胞中，随意地选择在无HT的培养基中生长的66个细胞系，用斑点印迹法确认其表达。取重组人IFNα2b(IFN-α2b(hBA-165)，Cat.sc-4624，Santa Cruz Biotechnology，和人细胞表达的IFNα2B，Cat HZ-1072，Human Zyme，IFN-α2b，Cat 5002C，APOLLO)标准样品的二倍稀释系列(10～0.16ng/mL)和所述随意选择的66个细胞系的培养上清液各2μL添加在膜上(Nytran N，ITEM NO.10416196，SCHLEICHER&SCHUELL)，室温下孵育30分钟后，室温下用4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)封闭30分钟。然后，加入1μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的抗人IFNα兔多克隆抗体(针对人干扰素α的兔多克隆抗体(PBL，Cat 31130-1))，并在室温下振荡30分钟。加入0.2μg/mL用PBST(D-PBS，0.05％吐温20)稀释的过氧化物酶标记的抗-兔IgG抗体(过氧化物酶标记的亲和纯化抗-兔IgG F8c，Cat.611-1303，Rock Land)，并振荡30分钟。加入在室温下反应了5分钟的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(2mL鲁米诺试剂，2mL双氧水，MILLIPORE，Cat.WBKLS0050，MILLIPORE)。室温下孵育5分钟，用检测器(ATTO Light-Capture，AE-6981FC，ATTO)捕捉化学发光。由斑点印迹法获得的图片如图24所示。
将在斑点印迹法中观察到化学发光的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入24孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入6孔板，培养直到细胞覆盖每个孔1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的ISCHO-CD w/水解液培养基(IS，日本)一起转入T75培养瓶(BD)，培养直到每个孔中的细胞达到1.0×106个细胞/孔或更多。
每个细胞系取15mL放置入15mL试管并以1100rpm离心7分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于15mL的新鲜培养基(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/水解液培养基(IS，日本))中。对细胞计数之后，将细胞用培养基稀释至5×105个细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养细胞14天。在培养的第3天、第7天和第14天时，分别收集1mL每种培养液，以9300×g离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例27]pDC6/hIFNα转染的细胞系的hIFNα生产水平的测定
通过ELISA来测定生产水平。在4℃下将96孔板(F96MAXISORPNunc-Immuno板，Cat.no.442404，Nunc)用0.5μg/mL用包被缓冲液(15mM，Na2CO3，35mM NaHCO3，0.05％NaN3，pH 9.6)稀释的抗人IFNα抗体(人干扰素-α的单克隆抗体，Pro.3423-3，MABTECH)包被16小时。用封闭溶液(4％的Block Ace(大日本住友制药株式会社)与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich))以1∶3的比例混合)封闭之后，添加72小时培养上清液(1/40000～1/640000稀释)、重组干扰素α-2b(注射用Intron A 1000，Schering Plough)的在抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，Sigma Aldrich)混合)中的二倍稀释系列(80～1.25IU/mL)、以及抗原抗体稀释剂(4％Block Ace(大日本住友制药株式会社)以1∶9的比例与D-PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲液，SigmaAldrich)混合)各100μL，在25℃下孵育1小时。此后进一步与0.5μg/mL的生物素化人IFNα单克隆抗体(针对人干扰素-α的单克隆抗体生物素结合物，Pro.3423-6，MABTECH)一起在25℃下孵化1小时。以100μL/孔添加在25℃下孵育了30分钟的标准超敏感ABC染色试剂盒(试剂A 2滴，试剂B 2滴/10mL，Pro#32050，PIERCE)，在25℃下反应30分钟。以100μL/孔添加Sure Blue TMBMicrowell Peroxidase底物(KPL)，然后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入1M磷酸以终止反应。用酶标仪(Model 680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。表9展示了根据ELISA获得的结果具有高的人IFNα生产水平的前3位样品。显示具有最高生产水平的细胞系在3天里产生了(56.3±5.0)×104IU/mL，7天(219.3±11.1)×104IU/mL，14天(436.5±17.1)×104IU/mL。该数值来自未克隆的早期细胞系，即，也处于未经历基因扩增的时期，相比于文献报道的典型的IFNα生产水平(J Gen Virol.1985Apr；66(Pt 4)：685-691；NucleicAcids Res.1983Feb 11；11(3)：555-573；Phil.Trans.R.Soc.Lond.B299，7-28(1982)；日本特表2003-530070)，显示了非常高的水平。
这证明本发明的表达载体能够以非常高的水平表达蛋白。然后，进行了培养上清液中hIFNα的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[表9]
Figure BPA00001423257200551
[实施例28]pDC6/hIFNα转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例27获得的具有最高人hIFNα生产水平的10个样品的3天、7天和14天培养上清液用于蛋白质印迹分析。取培养上清液各10μL分别与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的LaemmliSample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCRThermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。然后，将10μg/10μL的人IFNα标准样品(人细胞表达的IFNα2B，Cat HZ-1072，Human Zyme，IFN-α2b)和200IU/mL/10μL人IFNα标准样品(iLiteTM Alphabeta IFN储存溶液(200IU/mL)，Biomonitor)与l0μl含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal CyclerPERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后取20μL热处理的样品溶液和标准样品添加于17个孔10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：MyRun，COSMO BIO CO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRY TRANSFER CELL，BIO-RAD)中，从负极侧按顺序铺放用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中浸透的电泳后的凝胶、和用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPac HCTM，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL的ImmunoBlock(注册商标，Laboratory Products Division ofDainippon Sumitomo Pharama Co.，Ltd.)并在4℃下封闭18小时；取10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了2000倍的针对人干扰素α的兔多克隆抗体(Cat No.31130-1，PBL)在室温下与膜上的蛋白质振荡(ROTO-SHAKEGENIE，Scientific Industries)下反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了5000倍的过氧化物酶标记的亲和纯化的抗-兔IgG F(c)(山羊)(Rock Land)加入，振荡(ROTO-SHAKEGENIE，Scientific Industries)下室温反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL的ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉3秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图25所示。检测到与标准样品相似的条带。
[实施例29]pDC6/hOPN的构建
使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明的载体pDC6中的第1267～1275个核苷酸用SEQ ID NO：12的编码人骨桥蛋白(OPN)的cDNA(下文称为hOPN)取代，以构建pDC6/hOPN(图26)。
[实施例30]将pDC6/hOPN转染进入CHO细胞，在无HT的培养基中用CD培养基或添加了非动物基的添加剂的CD培养基进行筛选
用脂质体方法(使用LipofectamineTM LTX；Invitrogen)在25cm2的培养瓶中将2.5μg的pDC6/hOPN转染进入4000000个CHO细胞(CHO DG44细胞)。基因转染是根据生产商的说明书来进行的。基因转染48小时之后，进行细胞计数，然后将细胞在添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H(IS，日本)中稀释。将细胞平铺于5个96孔微滴定板中，每个浓度为4000个细胞/孔(480孔)，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养大约3周之后，观察到存活细胞(在无HT的培养基中生长的细胞系)。
通过蛋白质印迹来鉴定观察到生长的所有细胞的表达。将蛋白质印迹中观察到发光的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H(IS，日本)一起转入24孔板中，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H(IS，日本)一起转入6孔板，培养直到细胞覆盖每个孔的1/3或更多。将观察到进一步生长的细胞系与添加了4mM的GlutaMAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H(IS，日本)一起转入T75培养瓶(BD)中，培养直到每个孔中的细胞达到1.0×106个细胞/孔或更多。
每个细胞系取15mL放置于15mL试管中并以1100rpm离心7分钟。弃去上清液，将细胞悬浮于15mL的新鲜培养基(添加了4mM的Gluta MAXTM-I(Invitrogen)的IS CHO-CD w/H(IS，日本))中。对细胞计数之后，将细胞用培养基稀释至5×105细胞/mL，然后转移7.5mL至新的T75培养瓶中，在5％二氧化碳气体存在下37℃培养细胞14天。在培养的第3天、第7天和第14天时，分别收集每种培养液1mL，以9300×g离心2分钟，收集上清液。之后，测定生产水平。
[实施例31]pDC6/hOPN转染的细胞系的hOPN生产水平的测定
其生产水平的测定是由ELI SA试剂盒(人骨桥蛋白分析试剂盒，Code 27158，IBL)来实现的。向抗体板(抗人OPN(O-17)兔IgGA.P.固相)添加3天、7天和14天培养上清液(1/10～1/8000稀释)和重组人OPN标准样品的在稀释缓冲液(含1％B SA和0.05％吐温20的PBS)中的二倍稀释系列(5～320ng/mL)各100μL，在37℃下孵育1小时。然后进一步用标记的抗体(HRP-标记的抗人OPN(10A16)小鼠IgG MoAb Fab A.P.)在4℃下孵育1小时。以100μL/孔加入TMB底物溶液，之后在25℃下反应30分钟，以100μL/孔加入终止溶液(1N H2SO4)以终止反应。用酶标仪(Model680，BioRad制造)测定蛋白质浓度，在酶标仪上，测定450nm波长处的吸光度，以655nm波长为对照。细胞系32在3天生产了1.12±0.07μg/mL，7天7.40±0.24μg/mL，而14天13.75±0.03μg/mL。然后，进行了培养上清液中hOPN的蛋白质印迹以确认蛋白质表达。
[实施例32]pDC6/hOPN转染的细胞的培养上清液的蛋白质印迹
由上述实施例31获得的细胞系32的3天、7天和14天培养上清液用于蛋白质印迹分析。取培养上清液各10μL分别与10μL含5％2-巯基乙醇(Wako)的Laemmli Sample缓冲液(BIO-RAD)混合，在98℃下加热5分钟(TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL，TaKaRa BIOMEDICALS)以将其还原。将电泳缓冲液(Tris/Glycine/SDS，BIO-RAD)和17个孔10％～20％Super SepTM(Wako)置于电泳槽(DPE-1020，DAIICHI PURE CHEMICALS CO.，LTD)中，然后取20μL热处理的样品溶液和标准样品添加于17个孔10％～20％SuperTM(Wako)，然后在40mA下进行电泳55分钟(供电设备：MyRun，COSMO BIO CO.，LTD)。然后，从玻璃板上取下凝胶，在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)5分钟以浸透。在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)的同时，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)按顺序浸入8mL甲醇(Wako)中15秒、8mL的MilliQ水(MILLIPORE)中2分钟和8mL转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中5分钟以活化。在转移装置(TRANS-BLO，SD SEMI-DRY TRANSFER CELL，BIO-RAD)中，从负极侧按顺序放置用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)、活化的Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)、在转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))中浸透的电泳后凝胶、和用转移缓冲液(含30％甲醇(Wako)的Tris/Glycin缓冲液(BIO-RAD))浸透的滤纸(Extra Thick Blot Paper CriterionTM Size，BIO-RAD)，盖上盖，在80mA(PowerPac HCTM，BIO-RAD)下进行电泳一个半小时，以将分离的蛋白转移至Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)上。转移之后，将Immobilon-P转移膜(MILLIPORE)浸入8mL的ImmunoBlock(注册商标，Laboratory Products Division of DainipponSumitomo Pharama Co.，Ltd.)并在4℃下封闭18小时；取10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了2000倍的抗人OPN小鼠单克隆抗体(抗人骨桥蛋白(10A16)小鼠IgG MoAb，Cat 10011，IBL)在室温下与膜上的蛋白质在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入10mL用含0.05％吐温20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，Wako)的D-PBS(Wako)稀释了5000倍的过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG抗体(山羊抗-小鼠IgG(H+L)，Cat 115-036-062，Jackson)，在振荡(ROTO-SHAKE GENIE，Scientific Industries)下室温反应1小时。移除未结合的抗体之后，加入2mL的ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP底物(MILLIPORE)以进行化学发光，用Light-Capture ATTO Cooled CCD摄像系统(ATTO)以常规设置捕捉30秒照片。通过蛋白质印迹获得的图片如图27所示。
工业实用性
本发明可提供表达载体，该表达载体在使用二氢叶酸还原酶基因缺失的哺乳动物细胞作为宿主时能够高水平生产源自外源基因的蛋白质。此外，它们能够生产具有哺乳动物固有的翻译后修饰和高生物活性的蛋白质。因此，能够显著地降低有用蛋白质物质例如生物药物的生产成本。
此外，由于本发明的生产蛋白质的方法不使用病毒或者微生物，因此高安全性的蛋白质生产成为了可能。
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Claims (10)

1.一种能够在哺乳动物宿主细胞内高水平生产源自外源基因的蛋白质的表达载体，包含：
(a)翻译弱化的二氢叶酸还原酶基因盒(翻译弱化的DHFR基因盒)，其表达通过改变密码子为哺乳动物中最不常用的密码子而被弱化；和
(b)基因盒，包含用于将外源基因整合进高转录活性启动子和高稳定性聚腺苷化信号之间的克隆位点。
2.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子被改变为在人类中最不常用的密码子。
3.权利要求1所述的表达载体，其中将权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的密码子改变为：丙氨酸为GCA，精氨酸为CGA，天冬酰胺为AAU，天冬氨酸为GAU，半胱氨酸为UGU，谷氨酰胺为CAA，谷氨酸为GAA，甘氨酸为GGU，组氨酸为CAU，亮氨酸为UUA，赖氨酸为AAA，脯氨酸为CCA，苯丙氨酸为UUU，丝氨酸为UCA，苏氨酸为ACU，酪氨酸为UAU，和/或缬氨酸为GUA。
4.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒使用具有低表达诱导活性的启动子作为启动子。
5.权利要求4所述的表达载体，其中所使用的低活性启动子是源自在哺乳动物细胞内几乎不表达的基因的启动子、或者是去除了增强子部分的启动子。
6.权利要求1所述的表达载体，其中权利要求1(a)所述翻译弱化的DHFR基因盒的启动子改变区域是所述基因盒的全长的30％或更多。
7.一种生产能够高水平生产源自外源基因的蛋白质的转化体的方法，包含将外源基因插入到权利要求1-6任一项所述的表达载体中的步骤和用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞的步骤。
8.一种生产源自外源基因的蛋白质的方法，包含如下步骤：
(a)将外源基因插入至权利要求1-6任一项所述的表达载体中；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；
(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养转化体；和
(d)从培养的转化体收集源自外源基因的蛋白质。
9.权利要求8的生产方法，其中在权利要求8的培养步骤(c)中使用化学成分确定培养基(CD培养基)或添加了非动物基的添加剂的CD培养基。
10.一种筛选具有高水平生产外源基因的蛋白质的能力的转化体的方法，包含如下步骤：
(a)将外源基因插入至权利要求1-6任一项所述的表达载体中；
(b)用所述表达载体转化二氢叶酸还原酶基因缺失的宿主细胞；和
(c)在不含次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷的培养基中培养转化体。
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