CN113249329A - 表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株及其应用 - Google Patents

表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了表达α1结构域缺失的HLA‑G异构体标准蛋白的细胞株及其应用，所述细胞株的保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202046。所述细胞株能表达α1结构域缺失的HLA‑G异构体标准蛋白，能作为在流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA‑G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选的标准参照物。

Description

表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株及其 应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及胞外α1结构域缺失及α1α2结构域缺失的新型HLA-G异构体HLA-G-Δα1及HLA-G-Δα1α2表达载体构建及稳定表达的细胞株，可作为特定HLA-G异构体分子HLA-G-Δα1及HLA-G-Δα1α2流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选的标准参照物等应用。
背景技术
人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因由Geraghty等于1987年发现并克隆。HLA-G分子于1990年首次发现表达于母胎界面的绒毛外滋养层细胞，并于1998年首次在黑色素瘤肿瘤组织和细胞中观察到HLA-G的表达。功能研究显示，HLA-G分子能够通过多种机制调节免疫细胞的生物学功能，HLA-G分子既能直接抑制机体免疫效应细胞的免疫学功能，又能通过诱导产生调节性细胞等机制参与机体的免疫调节过程，是机体内一个重要的免疫耐受分子。HLA-G分子可通过免疫细胞表达的受体，发挥多种重要的免疫调节功能，尤其是与免疫抑制性受体免疫球蛋白样转录物-2(immunoglobulin-liketranscript-2,ILT2/LILRB1/CD85j)、免疫球蛋白样转录物-4(ILT4/LILRB2/CD85d)结合，传递抑制性信号，诱导T细胞、B细胞、NK细胞和DC等免疫细胞发生广泛的免疫抑制作用，并促进MDSCs、DC-10和M2巨噬细胞等免疫调节细胞的生成。此外，HLA-G依赖的抑制性T细胞可分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，发挥免疫抑制的功能；HLA-G依赖的致耐受性DC通过ILT4受体诱使CD4+T细胞分化成CD4+CD25+T细胞，高表达CTLA4或Foxp3及分泌IL-10细胞因子。因此，HLA-G分子是机体内一个重要的免疫耐受分子，参与母胎耐受的维持和肿瘤细胞的免疫逃逸等生理、病理过程中起重要作用。
HLA-G编码基因全长6.0kb，由8个外显子和7个内含子组成，位于人类第6号染色体短臂远侧6p21.3。在蛋白质翻译过程中，HLA-G mRNA第1外显子编码信号肽，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3结构域，第5位外显子编码跨膜区；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的HLA-G分子胞内段；由于第6外显子内含有终止密码子，第7、第8外显子不被转录。HLA-GmRNA经选择性剪接，至少可以产生7种成熟mRNA，分别编码7种不同异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)。HLA-G1是由全长HLA-G mRNA编码，结构上类似于HLA Ia抗原分子。HLA-G2缺乏α2结构域；HLA-G3缺乏α2和α3结构域；HLA-G4缺乏α3结构域；HLA-G5及HLA-G6胞外区结构域分别与HLA-G1及HLA-G2相同，但它们由含有内含子4的HLA-GmRNA编码，因内含子4中含有终止密码子，所编码的蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性HLA-G分子。编码HLA-G7的mRNA由于内含子2中含有终止密码子，胞外区仅含α1结构域及由内含子2所编码的2个氨基酸残基相连。HLA-G1～-G7异构体分子的分子量分别为39kD、31kD、23kD、30kD、37kD、27kD及16kD。
然而，由于基因选择性剪接可以形成不同的阅读框架，HLA-G可能存在更多未被鉴定的新型异构体分子。Tronik Le Roux等通过全外显子测序，发现多种HLA-G新型异构体，其中包括胞外α1结构域缺失，但含α2和α3结构域的HLA-G异构体分子(HLA-G-Δα1)；及胞外α1、α2结构域缺失，仅含α3结构域的HLA-G异构体分子(HLA-G-Δα1α2)。在不同病理状态下，尤其在肿瘤组织细胞中，HLA-G异构体表达存在广泛的异质性，不同HLA-G分子异构体的表达具有特定的临床意义。分析特定HLA-G异构体分子表达及不同HLA-G异构体分子表达谱，对于阐述特定HLA-G异构体分子的生物学功能及其临床意义具有重要意义。根据HLA-G分子与受体识别结构特点，受体ILT2、ILT4与HLA-G结合的位点位于HLA-G胞外区α3结构域。因此，HLA-G-Δα1及HLA-G-Δα1α2两种新型HLA-G异构体分子可能与受体ILT2/4结合，发挥免疫抑制效应，但其具体的生物学效应尚不明确，有待进一步研究。
目前尚无用于检测特定HLA-G异构体分子的抗体。目前已广泛应用，通过免疫组化或免疫印迹检测HLA-G分子表达的抗体4H84，其识别位点位于7种HLA-G异构体分子均具有的胞外区α1结构域，特异性上能够检测含有α1结构域的7种HLA-G异构体分子，但在免疫组化中不能区分具体特定HLA-G异构体分子的表达。同时，HLA-G1～-G7异构体分子的分子量分别为39kD、31kD、23kD、30kD、37kD、27kD及16kD，分子量相近的HLA-G异构体分子如HLA-G1(39kD)和HLA-G5(37kD)、HLA-G2(31kD)和HLA-G4(30kD)、HLA-G3(23kD)和HLA-G6(27kD)，以及分子量较小的HLA-G7(16kD)等，由于缺乏特定HLA-G异构体分子的标准参照，在免疫印迹检测中不容易区分特定HLA-G异构体分子的表达。更重要的是，在针对HLA-G异构体抗体研发过程中，HLA-G异构体抗原参照物是特异性抗体筛选的必要条件。
因此，建立分别稳定表达HLA-G-Δα1(25kD)异构体分子标准蛋白的细胞株和HLA-G-Δα1α2(15kD)异构体分子标准蛋白的细胞株，作为HLA-G分子检测及特异性抗体筛选的标准参照物，在HLA-G相关基础、临床研究及抗体研发过程中具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供2种新型HLA-G异构体分子HLA-G-Δα1和HLA-G-Δα1α2稳定表达的细胞株，细胞株命名为：表达新型HLA-G异构体(α1结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1)和表达新型HLA-G异构体(α1α2结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1α2)。同时，目前尚无检测这两种新型HLA-G异构体的抗体。因此，本发明在其α3结构域末端加入HLA-G5/6异构体分子特异性抗体5A6G7的设别序列(如图1所示)，实现可以检测的目的。本发明保藏信息分别为：
表达新型HLA-G异构体(α1结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1),保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏机构地址为：中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号：CCTCC NO:C202046，保藏时间为2020年11月25日。核苷酸序列为序列表中SeqNo.1.HLA-G-Δα1核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.2.HLA-G-Δα1氨基酸序列。
表达新型HLA-G异构体(α1α2结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1α2),保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏机构地址为：中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号：CCTCC NO:C202047，保藏时间为2020年11月25日。核苷酸序列为序列表中Seq No.3.HLA-G-Δα1α2核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.4.HLA-G-Δα1α2氨基酸序列。
由K562-HLA-G-△α1及K562-HLA-G-△α1α2细胞株生产的HLA-G异构体分子重链量分别为25kD及15kD；轻链即β2微球蛋白(β2m)，分子量12kDa，由人类第15号染色体编码。稳定表达的新型HLA-G异构体分子(HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2)可作为流式细胞术、免疫印迹、细胞及组织免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等应用。
本发明细胞株的建株方法如下：采用分子生物学方法，以HLA-G5异构体编码基因为扩增模板，扩增后的目的基因与真核细胞表达质粒载体pVITRO2-mcs重组，并将其转染至HLA表达阴性的白血病细胞系K562中进行表达，通过多种分子生物学方法鉴定转染细胞系K562-HLA-G-△α1及K562-HLA-G-△α1α2新型异构体分子的表达，完成首轮初筛。初筛后的细胞株，通过有限稀释法进行细胞株的克隆化培养，复筛以确定HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2蛋白的表达量高低，挑选表达量最高的细胞株，命名为K562-HLA-G-△α1及K562-HLA-G-△α1α2，-196℃液氮保存，每1-2月复苏一管细胞检验其细胞活力。
采用传统的细胞株鉴定与分子生物学鉴定相结合的方式对筛选得到的细胞株进行鉴定。本发明采用重组质粒双酶切电泳(图2)，RT-PCR(图3)，Western blot免疫印迹法(图4)及流式细胞术(图5)等技术方法对目的基因及蛋白表达进行鉴定，整个发明过程具有操作简单，设计完整等特点。结果证明表达的K562-HLA-G-△α1及K562-HLA-G-△α1α2新型异构体分子量完全符合文献报道。
本发明建立稳定表达HLA-G-△α1的K562细胞株(保藏编号：CCTCC NO:C202046)及HLA-G-△α1α2的K562细胞株(保藏编号：CCTCC NO:C202047)，可应用于HLA-G异构体分子(HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2)流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等，具有重要应用价值(图6)。
在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。
附图说明
图1是HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体的分子结构模式图。
图2是重组质粒pVITRO2-mcs-HLA-G-△α1(A)，及pVITRO2-mcs-HLA-G-△α1α2(B)双酶切电泳结果。
图3是K562-HLA-△α1(A)及K562-HLA-△α1α2(B)RT-PCR电泳结果。
图4是K562-HLA-△α1(A)及K562-HLA-△α1α2(B)Western Blot结果。
图5是K562-HLA-△α1(A)及K562-HLA-△α1α2(B)流式细胞术结果。
图6是HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2在抗体研发筛选中作为标准蛋白
具体实施方式
以下实施例提供了实现本发明的优选实施方案。本领域技术人员可以理解的是，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下面的实施例中所公开的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明。不过，本领域技术人员可以理解，在不超出本发明的构思的前提下，可以对这些具体实施方案进行多种改变，仍然能获得相似的结果。
实施例1：HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体基因克隆和pVITRO2-mcs-HLA-G重组质粒构建
以HLA-G5 mRNA为扩增模板，HLA-G-△α1编码基因扩增引物如下:
上游引物：5’-TCGAGAATTCATGAGTTCTCACACCCTCCAGT-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，上游引物在序列表中为Seq No.5的序列。
下游引物：5’-TCGACTCGAGCCACCGACCCTGTTA-3’，划线部分为XhoⅠ酶切位点，下游引物在序列表中为Seq No.6的序列。
按照以下条件进行HLA-G-△α1异构体mRNA扩增，片段大小为620bp。
以HLA-G5 mRNA为扩增模板，HLA-G-△α1α2编码基因扩增引物如下:
上游引物：5’-TCGAGAATTCATGGACCCCCCCAAGACACACGTGA-3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，上游引物在序列表中为Seq No.7的序列。
下游引物：5’-TCGACTCGAGCCACCGACCCTGTTA-3’，划线部分为XhoⅠ酶切位点，下游引物在序列表中为Seq No.8的序列。
按照以下条件进行HLA-G-△α1α2异构体mRNA扩增，片段大小为357bp。
cDNA逆转录RT-PCR反应体系：
Figure BDA0003035263990000061
Figure BDA0003035263990000071
RT-PCR程序：25℃，5min→42℃，60min→70℃，5min。
PCR反应体系：
Figure BDA0003035263990000072
PCR程序：
1. 95℃预变性5min
2. 94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸2min
3.依步骤2循环35次
4. 72℃延伸10min
含编码HLA-G-△α1、HLA-G-△α1α2基因序列的pJET1.2重组质粒构建：将PCR扩增所得的HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2基因分别克隆入pJET1.2质粒，转化至大肠杆菌XL1-Blue中扩增。提取该重组质粒，经酶切鉴定后送样测序.获得HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2基因序列与http://www.anthonynolan.org.uk基因序列比对，HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2编码基因序列与HLA-G*01:01:03序列一致。
含编码HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2基因序列的pVITRO2-mcs重组表达质粒的构建：用EcoR I和Xho I分别酶切上述步骤中得到的含内切酶位点的编码HLA-G-△α1、HLA-G-△α1α2基因片段及pVITRO2-mcs质粒，分别回收酶切后，含酶切位点的编码HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2基因片段及pVITRO2-mcs质粒酶切产物的大片段，并将两者连接，构建了表达质粒pVITRO2-mcs-HLA-G-△α1及pVITRO2-mcs-HLA-G-△α1α2。将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α扩增并提取质粒，经过EcoR I和Xho I酶切鉴定，结果表明目的基因片段已插入载体质粒，电泳结果见图2。HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2目的基因详细序列见序列表中Seq No.1核苷酸序列和Seq No.3核苷酸序列。
实施例2：稳定表达HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体的K562细胞系鉴定
采用RT-PCR鉴定转染细胞中HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体的mRNA表达：Trizol试剂分别提取各转染细胞株总mRNA后，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定未见降解，A260/280比值为2.06。取2μl总mRNA，逆转录合成cDNA第一条链。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性1min,60℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。如图3所示，RT-PCR扩增所得特异性条带均符合预期目的片段长度：HLA-G-△α1(633bp)及HLA-G-△α1α2(357bp)。结果说明HLA阴性表达的K562细胞成功表达HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体分子的编码基因。HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2编码基因详细序列见序列表中Seq No.1核苷酸序列和Seq No.3核苷酸序列。
采用Western blot法鉴定转染细胞中HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2异构体的表达。该鉴定试验以含有α1结构域的HLA-G1和HLA-G5标准蛋白为为参照，通过单抗4H84(该抗体识别位点位于HLA-G分子α1结构域，可检测所有7种HLA-G异构体分子)以检测HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2是否含有α1结构域；同时，由于目前尚无检测这两种新型HLA-G异构体的抗体。因此，本发明在其α3结构域末端加入HLA-G5异构体分子特异性抗体5A6G7的设别序列，实现可以检测的目的。因此，以HLA-G5标准蛋白为参照，作为单抗5A6G7的阳线参照物，通过单抗5A6G7，实现HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2表达检测。Western blot法具体方法如下：
各取20μl上述细胞裂解物行SDS-PAGE。电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。分别加入HLA-G单抗4H84(该抗体识别位点位于HLA-G分子α1结构域，可检测所有7种HLA-G异构体分子)，及HLA-G5/6异构体分子特异性抗体5A6G7(该抗体识别位点位于HLA-G分子α3结构域末端21个氨基酸残基)。4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTM EnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。如图4所示，结果显示：HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2新型异构体分子能被抗体5A6G7识别，由于缺乏α1结构域，不能被单抗4H84识别。HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2新型异构体分子的分子量分别为25kD及15kD，分子量大小符合预期。HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2氨基酸详细序列见序列表中Seq No.2氨基酸序列和Seq No.4氨基酸序列。
采用流式细胞术鉴定转染细胞中HLA-G的蛋白表达：细胞培养至对数生长期，收集细胞，PBS洗涤后，采用PE-5A6G7抗体标记。如图5所示，流式结果显示，HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2新型HLA-G异构体分子得到稳定高表达。以此结果向中国典型培养物保藏中心保藏，保藏信息为：表达新型HLA-G异构体(α1结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1),保藏编号：CCTCC NO:C202046，保藏时间为2020年11月25日。表达新型HLA-G异构体(α1α2结构域缺失)标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G-△α1α2),保藏编号：CCTCC NO:C202047，保藏时间为2020年11月25日。
实施例3：HLA-G-△α1及HLA-G-△α1α2在抗体研发筛选中作为标准蛋白
新抗体筛选中作为标准蛋白：将HLA-G-△α1(保藏编号：CCTCC NO:C202046)及HLA-G-△α1α2(保藏编号：CCTCC NO:C202047)裂解后获得蛋白电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入新抗体1，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTM EnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。结果显示：部分新抗体细胞培养上清(如图5#18细胞株上清)能特异性识别HLA-G-△α1标准蛋白。其他细胞培养上清为非特异性识别，为判断新抗体细胞培养上清是否产生特异性抗体提供判断基础(图6)。
Figure BDA0003035263990000111
Figure BDA0003035263990000121
Figure BDA0003035263990000131
Figure BDA0003035263990000141
Figure BDA0003035263990000151
Figure BDA0003035263990000161
序列表
<110> 台州恩泽医疗中心（集团）
<120> 表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1
<400> 1
atgagttctc acaccctcca gtggatgatt ggctgcgacc tggggtccga cggtcgcctc 60
ctccgcgggt atgaacagta tgcctacgat ggcaaggatt acctcgccct gaacgaggac 120
ctgcgctcct ggaccgcagc ggacactgcg gctcagatct ccaagcgcaa gtgtgaggcg 180
gccaatgtgg ctgaacaaag gagagcctac ctggagggca cgtgcgtgga gtggctccac 240
agatacctgg agaacgggaa ggagatgctg cagcgcgcgg acccccccaa gacacacgtg 300
acccaccacc ctgtctttga ctatgaggcc accctgaggt gctgggccct gggcttctac 360
cctgcggaga tcatactgac ctggcagcgg gatggggagg accagaccca ggacgtggag 420
ctcgtggaga ccaggcctgc aggggatgga accttccaga agtgggcagc tgtggtggtg 480
ccttctggag aggagcagag atacacgtgc catgtgcagc atgaggggct gccggagccc 540
ctcatgctga gatggagtaa ggagggagat ggaggcatca tgtctgttag ggaaagcagg 600
agcctctctg aagaccttta acagggtcgg tgg 633
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213> K562-HLA-G△α1
<400> 2
Met Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser
1 5 10 15
Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys
20 25 30
Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala
50 55 60
Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His
65 70 75 80
Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro
85 90 95
Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu
100 105 110
Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp
115 120 125
Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr
130 135 140
Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val
145 150 155 160
Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly
165 170 175
Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly Asp Gly Gly
180 185 190
Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu Asp Leu Gln Gly
195 200 205
Arg Trp
210
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1α2
<400> 3
atggaccccc ccaagacaca cgtgacccac caccctgtct ttgactatga ggccaccctg 60
aggtgctggg ccctgggctt ctaccctgcg gagatcatac tgacctggca gcgggatggg 120
gaggaccaga cccaggacgt ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 180
cagaagtggg cagctgtggt ggtgccttct ggagaggagc agagatacac gtgccatgtg 240
cagcatgagg ggctgccgga gcccctcatg ctgagatgga gtaaggaggg agatggaggc 300
atcatgtctg ttagggaaag caggagcctc tctgaagacc tttaacaggg tcggtgg 357
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> K562-HLA-G△α1α2
<400> 4
Met Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile
20 25 30
Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu
35 40 45
Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala
50 55 60
Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val
65 70 75 80
Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu
85 90 95
Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu
100 105 110
Asp Leu Gln Gly Arg Trp
115
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1
<400> 5
tcgagaattc atgagttctc acaccctcca gt 32
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1
<400> 6
tcgactcgag ccaccgaccc tgtta 25
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1α2
<400> 7
tcgagaattc atggaccccc ccaagacaca cgtga 35
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> K562-HLA-G△α1α2
<400> 8
tcgactcgag ccaccgaccc tgtta 25

Claims (3)

1.表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202046。
2.权利要求1所述的表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株，作为表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白，将所表达的表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白作为标准参照物的应用。
3.权利要求1所述的表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白的细胞株，作为表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白，将所表达的表达α1结构域缺失的HLA-G异构体标准蛋白在流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选的标准参照物的应用。
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