CN114276449A

CN114276449A - 一种抗人抑制素α的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂、应用

Info

Publication number: CN114276449A
Application number: CN202111673468.3A
Authority: CN
Inventors: 翟晋豫; 王远利; 许鹏程; 王晓亚; 李艳娟; 吴夏梦; 常秋霜; 秦志洁; 齐华; 李三华
Original assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Current assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种抗人抑制素α(Inhibin‑α)的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂、应用。该单克隆抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4‑6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。本发明的抗人抑制素α的单克隆抗体，可以准确识别石蜡组织与冰冻组织中表达的Inhibin‑α蛋白，与进口试剂R1相比，特异性评价结果一致，抗体使用浓度低，染色效果更强，可用于免疫检测分析。该单克隆抗体对实现该类单克隆抗体国产化、降低试剂成本具有重要意义。

Description

一种抗人抑制素α的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂、应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种抗人抑制素α(Inhibin-α)的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂、应用。

背景技术

抑制素(INH)是激活素(ACT)功能的一个重要调节者，抑制素结构与激活素相关，都属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员。抑制素由α和β(βA或βB)两个亚单位通过二硫键联接形成的异二聚体糖蛋白INHA或INHB，相对分子量为32KD，这三个亚基α，βA，βB各自的碱基序列分别定位于2号染色体(α亚基和βB亚基)和7号染色体(βA亚基)。抑制素通过竞争结合激活素Ⅱ型受体来起到对抗激活素的作用，这个过程需要抑制素的共受体-β聚糖来增加抑制素的亲和力。

抑制素α主要表达在非恶性肿瘤(如粘液性瘤)中。它由卵巢粒层细胞产生，能抑制垂体促性腺激素的产生和分泌。

抗人抑制素α抗体主要用于研究生殖轴基质性肿瘤。在鉴别诊断中，主要鉴别卵巢颗粒细胞瘤和癌，以及肾上腺皮质腺瘤和肾细胞癌、嗜铬细胞瘤。目前行业内接受度较高的Inhibin-α单克隆抗体克隆号为R1。单克隆抗体R1为进口试剂，价格昂贵，这也导致本领域的相关鉴别诊断成本居高不下。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人抑制素α的单克隆抗体，与进口试剂R1相比，特异性评价一致，且在较低的抗体浓度下显示出更好的染色效果，亲和力更好。

本发明的第二个目的是提供上述抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述抗人抑制素α的单克隆抗体的免疫检测试剂。

本发明的第四个目的是提供上述抗人抑制素α的单克隆抗体的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种抗人抑制素α的单克隆抗体，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

本发明的抗人抑制素α的单克隆抗体，可以准确识别石蜡组织与冰冻组织中表达的Inhibin-α蛋白，与进口试剂R1相比，特异性评价结果一致，抗体使用浓度低，染色效果更强，可用于免疫检测分析。该单克隆抗体对实现该类单克隆抗体国产化、降低试剂成本具有重要意义。

优选地，所述抗人抑制素α的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。采用上述序列，可进一步优化使用效果。

一种抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用人抑制素α免疫原免疫兔子，采集兔外周血，收集兔外周血单个核细胞，分离出抗原特异性B淋巴细胞；

(2)针对步骤(1)得到的抗原特异性B淋巴细胞，经过培养鉴定筛选出阳性细胞孔，进而获得抗体重链、轻链基因，扩增抗体重链、轻链目的基因，经重组、表达获得兔源单克隆抗体。

本发明的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，以兔子为免疫动物，从抗原特异性B淋巴细胞中分离出单克隆抗体B57，能较好地用于免疫检测。该方法工艺步骤简单，适合获得大量工程化抗体。

优选地，步骤(1)中，所述人抑制素α免疫原为含人抑制素α的多种免疫原，包括人抑制素α，还包括MSH6、MLH1、CK19、PMS2中的一种或两种以上组合。采用多种免疫原可实现一次免疫得到多种针对不同抗原的单克隆抗体，提高单克隆抗体的开发效率。

为提高工程化抗体的表达量，优选地，步骤(2)中，在抗体重链、轻链基因的5’端均增加一段能够提高表达量的信号区，然后进行所述扩增。

进一步优选地，步骤(2)中，所述信号区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

为方便实现目的基因扩增，优选地，扩增重链目的基因的上、下游引物分别如SEQID NO：10、SEQ ID NO：11所示；扩增轻链目的基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO：12、SEQID NO：13所示。

一种含有上述抗人抑制素α的单克隆抗体的免疫检测试剂。

在以上单克隆抗体的基础上，可利用本领域公知技术制作免疫检测试剂。以免疫组化检测试剂为例，可添加保护蛋白(如BSA等)、防腐剂等辅料，制作成抗体工作液。

上述抗人抑制素α的单克隆抗体在免疫组化方面的应用。

经实验证实，上述抗人抑制素α的单克隆抗体尤其适用于免疫组化方面的检测，特异性与进口试剂一致，背景佳，与抗原的亲和力好，染色效果更强。

附图说明

图1为本发明实施例的抗体在乳腺组织中的免疫组化染色结果；

图2为对照抗体R1在乳腺组织中的免疫组化染色结果；

图3为本发明实施例的抗体在睾丸组织中的免疫组化染色结果；

图4为对照抗体R1在睾丸组织中的免疫组化染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。

一、抗人抑制素α的单克隆抗体的具体实施例

实施例1

本实施例的抗人抑制素α的单克隆抗体，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示轻链可变区。重链可变区包含如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，轻链可变区包含如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

二、抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法的具体实施例

实施例2

本实施例的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)兔子免疫：将5种免疫原(免疫原I、II、III、IV、V分别为MSH6、Inhibin-α、MLH1、CK19和PMS2)和免疫伴侣(CSF2蛋白；提升免疫效果)加入水溶性佐剂中，得到免疫试剂，控制免疫伴侣在免疫试剂中的浓度为50μg/mL，5种免疫原的免疫剂量均为100μg/只。然后采用免疫试剂免疫新西兰大白兔，在评估免疫效果达到预期后，对兔子进行免疫原冲击免疫，以达到调动兔子机体针对目标免疫原的B淋巴细胞快速激活。

CSF2蛋白可采用包括以下步骤的方法制得：

1)首先通过查阅Uniprot数据库，确定天然CSF2蛋白的全长基因，含启动子与终止密码子。

2)利用传统基因扩增与载体构建手段，将CSF2基因构建到pcDNA3.1等哺乳动物表达系统载体上，同时需要保证CSF2构建成功后不含其它非自身基因(例如标签蛋白基因)。

3)利用瞬转表达方法将构建测序正确的目的载体(pcDNA3.1-CSF2)转染至经WB验证无相关蛋白表达的兔肾细胞RK-13等兔源哺乳动物表达系统。利用常规WB手段检测表达水平。

4)待表达水平达到要求后，利用免疫亲和层析手段，将抗CFS2抗体偶联至纯化基质上，利用抗原抗体结合特点，将破碎及上清离心过滤的目标溶液经该方法纯化，将洗脱下来的CFS2依据等电点调保存pH，储存在PBS缓冲体系条件下分装，-80℃条件保存。

动物免疫时以腿部肌肉方式进行免疫，周期为两个月。免疫完成后，利用B(Inhibin-α)蛋白对该兔的耳缘静脉采集血液进行抗体滴度检测，以检测结果达到1×10⁵以上为合格。效价达到要求之后，对兔子进行B(Inhibin-α)免疫原冲击免疫，待第3天通过耳缘静脉采集10mL血液。

(2)兔外周血采集与PBMCs分离、B淋巴细胞分离与培养：从冲击免疫后兔子的外周血中先利用淋巴细胞分离液分离获得PBMCs细胞(即外周血单个核细胞；可利用商品化兔外周血淋巴细胞分离试剂盒实现)，随后利用B淋巴细胞表面标志物CD4、CD8、CD14、CD28、CD80进行负筛，去除T、单核等细胞，提高B淋巴细胞的丰度。

然后利用荧光染料FITC标记的山羊抗兔IgG挑选表达识别免疫原的B淋巴细胞。

再利用商品化的生物素标记试剂盒，按照说明书分别对免疫原I、II、III、IV、V进行标记，各免疫原按摩尔量1：1：1：1：1进行混合，混匀后与商品化的亲和素标记偶联荧光素(FITC)试剂，在2～8℃条件下孵育1h(期间需要晃动搅拌)，得到生物素-亲和素筛选试剂。将孵育完成的生物素-亲和素筛选试剂分装放在2～8℃条件下保存，使用时按照细胞量(1×10⁶个细胞/5μL)进行添加。利用生物素-亲和素筛选试剂再次对B淋巴细胞进行正筛，得到识别各种免疫原的B淋巴细胞群。

(3)B淋巴细胞培养上清ELISA检测：对于分选出的B淋巴细胞群进行铺板培养，按照1～2个细胞/孔铺入预先含有滋养层细胞的96板中，同时添加IL-2、IL-10细胞因子进行共培养，待培养时间达到7～14天后，分别利用5种免疫原(免疫原I、II、III、IV、V)分别进行ELISA检测，选择免疫前兔子采集的血清为阴性对照孔，以大于阴性对照孔2.1倍定义为阳性，选择阳性孔。通过该步骤可以筛选出分别针对各免疫原的抗体，一次分选培养可以得到识别多种免疫原的细胞阳性孔。

利用间接ELISA检测方法对上清进行检测，以B(Inhibin-α)蛋白包被ELISA检测板筛选出分泌有目标抗体的细胞培养孔。

(4)cDNA获取、重轻链基因扩增并测序：对筛选获得的抗体细胞株孔进行细胞裂解，提取RNA并通过RT-PCR方法获得cDNA，利用PCR扩增方法对重轻链基因分别进行扩增，经测序确定序列。利用反转录试剂盒说明书进行RT-PCR操作。

在获得抗体重链、轻链目的基因之后。通过PCR扩增的方法将信号区增加到目的基因的5’上游。信号区的的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。然后设计抗体重链与轻链上下游引物进行目的基因扩增，从而在目的基因上游增加一段信号区，方便提高后期目的基因表达量。扩增重链目的基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示；扩增轻链目的基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示。

PCR扩增循环设定为：I:95℃5min；II：95℃10s；III:56℃10s；IV：72℃60s；II～IV：循环35次；72℃：5min。1％核酸电泳目的条带并切胶回收目的片段，该操作参考Axygen切胶回收试剂盒说明书要求进行操作。

(5)构建重链抗体重组质粒、轻链抗体重组质粒：扩大培养pTT5阳性DH5α菌株，进行质粒(pTT5质粒)提取及双酶切(EcoRI与BamHI)操作。质粒提取按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作要求进行。双酶切反应体系为：pTT5质粒2μg，EcoRI 1.5μL，BamHI1.5μL，Buffer 5μL，ddH2O 40μL；酶切条件为37℃水浴，酶切时间为2h。对酶切后的体系进行核酸电泳并切胶回收双酶切质粒片段，该操作参考Axygen切胶回收试剂盒说明书要求进行操作。

将目的基因片段和双酶切质粒片段利用无缝克隆试剂盒进行同源重组，该步骤参考近岸无缝克隆试剂盒(货号：NR005-01A)说明书操作要求进行。

无缝重组后转DH5α感受态细胞，涂氨苄抗性的LB平板。37℃条件下温箱培养过夜。第二日挑单克隆5个进行基因测序，对测序结果正确的扩大培养提取重轻链质粒。

(6)质粒转染：分别将经过扩大培养获得的高浓度质粒，按照PEI转染试剂操作说明书进行操作，抗体重链与轻链按照摩尔质量1：1进行预先混合，利用CHO(或293F)细胞基础培养基稀释质粒，同时等体积的该培养基稀释PEI，质粒：PEI＝1：2，W/W。转染到培养至对数生长期的CHO细胞(或293F细胞)中。待培养至48h后，经过间接ELISA方法对上清分泌的抗体滴度进行检测，确定表达量相对较高的细胞系。

(7)抗体工程化表达、纯化：对确定的细胞系进行扩大培养至500mL培养基，调整细胞生长状态至对数生长期，转染质粒并培养48～72h后，收集细胞。上清通过离心去细胞后，经过Protein G柱进行亲和层析纯化，对结合吸附获得的抗体通过pH3.0的柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，利用pH8.8的Tris-HCl溶液迅速中和到pH7.2～7.4之间。纯化得到的抗体再经过透析处理浓缩至1mg/mL浓度以上。

三、免疫检测试剂的具体实施例

实施例3

本实施例的免疫检测试剂为免疫组化检测试剂，为实施例1的单克隆抗体工作液，单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL，溶剂为TBS缓冲液，其中含有浓度为10mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)以及防腐剂Proclin-300与Proclin-950，防腐剂均按1:1000(V/V)的比例添加。

四、单克隆抗体在免疫组化应用方面的具体实施例

实施例4

在同等条件下，将实施例1的抗人抑制素α的单克隆抗体B57与进口试剂R1进行免疫组化染色，染色过程如下所示：

1、石蜡组织样本3μm切片，65℃条件下烤片2h。

2、脱蜡与水化：石蜡切片以下经以下处理：二甲苯15min-二甲苯15min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-90％乙醇5min-80％乙醇5min-70％乙醇5min，纯化水浸泡5min。

3、抗原修复：利用pH9.0的EDTA溶液加热煮沸20min，自然冷却5min后，用自来水使之冷却，液体冷却后取出切片，纯水浸泡5min，TBS冲洗浸泡5min共2次。

4、加过氧化物酶封闭剂100μL/张，室温下孵育5min，TBS冲洗浸泡5min共2次。

5、一抗孵育：加入上述抗体工作液，37℃条件下孵育30min，TBS冲洗浸泡2次，5min/次。

6、二抗孵育：先滴加100μL二抗，37℃孵育30min，TBS冲洗浸泡2次，5min/次。

7、显色：除去TBS溶液，滴加100μL DAB显色液，室温孵育5min，纯化水浸泡2次，5min/次。

8、复染：滴加100μL苏木素复染液室温孵育3min，纯化水浸泡2次，5min/次。

9、脱水透明：常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明。

10、中性树胶封片观察。

在乳腺组织中，本实施例的单克隆抗体B57与进口试剂R1的染色结果，分别如图1和图2所示。在睾丸组织中的染色结果，分别如图3和图4所示。实施例的抗体浓度为0.1μg/mL，对照抗体R1的的浓度为0.35μg/mL。

由以上染色结果可知，与对照抗体R1对比，B57具有较好的特异性与亲和力，抗体浓度在0.1μg/mL即可达到较强的染色效果与较佳的背景。

按上述方法比较两种抗体的检测特异性，结果如下表1所示。检测组织包括乳腺组织、睾丸组织、扁桃体、阑尾(急性坏疽性阑尾炎)、胎盘、正常脾脏、正常结肠、肝脏-中分化肝细胞癌、胰腺、肺(支气管，肺泡)、正常肾脏、甲状腺(滤泡)、混合性生殖细胞肿瘤、卵巢浆液性癌、右侧卵巢囊肿、嗜铬细胞瘤、左前臂恶性黑色素瘤、尿路上皮癌、胶质母细胞瘤、滑膜肉瘤、乳腺纤维腺瘤、孤立性纤维瘤、浆液性癌、输尿管-小细胞肿瘤、胚胎性肿瘤、梭型细胞肿瘤、弥漫型星形细胞瘤、急性化脓性阑尾炎、宫颈、胸腺、弥散性大B细胞淋巴瘤、精原细胞癌、胸腺瘤、神经鞘瘤、宫颈-鳞状细胞癌等，评价数量共87个。

表1两种抗体的组织评价统计

结果表明，两种抗体的阴阳一致性评价无显著差异(P＜0.05)。

<110> 河南赛诺特生物技术有限公司

<120> 一种抗人抑制素α的单克隆抗体及其制备方法、免疫检测试剂、应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR1

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asn

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR2

<400> 2

Ile Ser Ala Gly Gly Ser Pro

1 5

<210> 3

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VHCDR3

<400> 3

Ala Arg

1

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR1

<400> 4

Glu Glu Phe Tyr Ser Ser Asn Arg

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR2

<400> 5

Asp Ala Ser

1

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> VLCDR3

<400> 6

Gln Gln Glu Ser Thr Asp Trp Ile Thr Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 重链可变区

<400> 7

Gln Cys Gln Gln Leu Lys Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Asp Leu Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser

20 25 30

Tyr Asn Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Ser

35 40 45

Ile Ile Trp Ile Ser Ala Gly Gly Ser Pro Ile Tyr Ala Ser Trp Val

50 55 60

Asn Gly Arg Trp Thr Phe Ser Met Thr Ser Gln Thr Val Leu Ser Met

65 70 75 80

Gln Ser Leu Thr Asn Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

85 90 95

<210> 8

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 轻链可变区

<400> 8

Ala Leu Lys Gln Thr Gln Asn Pro Ser Thr Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Glu Glu Phe Tyr Ser Ser

20 25 30

Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Arg Ser Gly Thr Glu Gln Ile Leu Thr Ile Ser Asp Val

65 70 75 80

Glu Gln Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Ser Thr Asp

85 90 95

Trp Ile Thr Tyr

100

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 信号区

<400> 9

aaaccacaag acagacttgc aaaagaaggc 30

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 重链上游引物

<400> 10

gtttaaacgg atctctagcg aattcaaacc acaagacaga 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 重链下游引物

<400> 11

agaggtcgag gtcgggggat ccctatttac ccggagagcg 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 轻链上游引物

<400> 12

gtttaaacgg atctctagcg aattcaaacc acaagacaga 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 轻链下游引物

<400> 13

agaggtcgag gtcgggggat ccctagcagt cacccctatt 40

Claims

1.一种抗人抑制素α的单克隆抗体，其特征在于，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。

2.如权利要求1所述的抗人抑制素α的单克隆抗体，其特征在于，所述抗人抑制素α的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。

3.一种如权利要求1所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人抑制素α免疫原为含人抑制素α的多种免疫原，包括人抑制素α，还包括MSH6、MLH1、CK19、PMS2中的一种或两种以上组合。

5.如权利要求3或4所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在抗体重链、轻链基因的5’端均增加一段能够提高表达量的信号区，然后进行所述扩增。

6.如权利要求5所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述信号区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

7.如权利要求6所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，扩增重链目的基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示；扩增轻链目的基因的上、下游引物分别如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示。

8.一种含有如权利要求1或2所述的抗人抑制素α的单克隆抗体的免疫检测试剂。

9.如权利要求1所述的抗人抑制素α的单克隆抗体在免疫组化方面的应用。