CN110684759B - 重组l-门冬酰胺酶及其制备方法和用途 - Google Patents

重组l-门冬酰胺酶及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制药、生物化学和药物的适应症领域，具体涉及重组L‑门冬酰胺酶(重组L‑asp)的制备方法和在制备抗白血病药物中的应用。本发明利用改良的脉冲稀释法纯化的L‑门冬酰胺酶纯度为90.14％，产率为5.23mg/L，酶的比活性为201.21IU/mg。细胞水平的活性显示：作用48h后，L‑门冬酰胺酶对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.15IU/mL和4.65IU/mL；作用72h后，L‑asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为2.40IU/mL和2.01IU/mL。基于以上结果，本发明提供了一种高效的重组L‑asp的制备方法并且也提供了重组L‑asp在制备抗急性白血病药物中的应用。

Description

重组L-门冬酰胺酶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物制药、生物化学和药理学领域，具体涉及重组L-门冬酰胺酶及其制备方法和用途。
背景技术
重组L-门冬酰胺酶(L-asp)作为国内外临床上治疗急性白血病(ALL)最有效的药物，其药物治疗缓解率在50％以上，药物缓解期为1～9月，对急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病也有一定疗效。同时，L-asp具有缓解期短、易产生耐受性的特性，因而目前在治疗过程中多数也会与其他抗癌药物联合应用。L-asp已经上市50多年，但其副作用及较短的药物半衰期仍是限制其临床使用的重要因素。人源白蛋白(Human Serum Albumin,简称HSA)是人体含量最多的蛋白质，在体内承担很多物质的储存和运输。研究表明，白蛋白能够作为药物载体，使得药物缓慢释放从而显著提高药物的半衰期，如氨甲喋呤和阿霉素等使用白蛋白作为载体进行改造均发现药物的半衰期得到显著提高。此外，多数药物与HSA自身存在较强的亲和力，结合人体HSA含量较高的特性，对自身与HSA结合能力弱的药物使用HSA作为药物载体或许可以提高这类药物的半衰期。
本发明构建了一种新的重组L-asp并建立了重组L-asp的制备方法，对重组L-asp的性质进行了表征，重点对重组L-asp与HSA的亲和力进行检测，本发明通过蛋白质工程改造显著提高了L-asp的半衰期。
发明内容
本发明采用改良脉冲稀释法纯化重组L-门冬酰胺酶，对纯化所得蛋白采用奈氏试剂法测其酶活，动态光散射检测重组L-门冬酰胺酶粒径分布，微量热泳动检测蛋白与人源白蛋白的结合能力，CCK-8在细胞水平检测重组蛋白对淋巴癌细胞以及对正常细胞的的杀伤作用，最后对重组L-门冬酰胺酶体外血浆半衰期进行检测。
改良的脉冲稀释法纯化的重组L-门冬酰胺酶蛋白纯度为90.14％，产率为5.23mg/L，酶的比活性为201.21IU/mg。重组蛋白的平均粒径为6.25±0.16nm，且分布均匀。细胞水平的活性显示：作用48h后，L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.15IU/mL和4.65IU/mL；作用72h后，L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为2.40IU/mL和2.01IU/mL。在L-asp实验浓度范围内，作用24h、48h、72h后，L-asp对HBE细胞作用微弱、无法计算出IC50。重组L-asp蛋白与HSA的结合kd值为14.15μM，体外血浆半衰期为25h。
本发明提供了一种重组L-门冬酰胺酶的表达和纯化方法，脉冲稀释法纯化所得蛋白纯度和酶活均较高，重组蛋白粒径均一，在缓冲液中未形成积聚体，重组L-asp蛋白对淋巴癌细胞杀伤作用强，对正常细胞的细胞毒作用较弱，与HSA有一定的结合能力，体外血浆半衰期为25h。
本发明提供了一种高效的重组L-asp的表达纯化方法，所获得的重组L-asp可以用来制备治疗急性白血病的药物。
附图说明
图1重组L-asp纯化结果。
图2重组L-asp的粒径分布情况。
图3重组L-asp对Jurkat和Raji细胞的杀伤作用A：不同浓度下重组L-asp对Jurkat细胞的杀伤作用；B：不同浓度下重组L-asp对Raji细胞的杀伤作用；C：不同时间下重组L-asp对Jurkat和Raji细胞的杀伤作用。
图4重组L-asp对HBE细胞的细胞毒作用A：不同浓度下重组L-asp对HBE细胞的细胞毒作用；B：不同时间下重组L-asp(20IU/ml)对HBE细胞的细胞毒作用。
图5重组L-asp与HSA结合分析结果
图6重组L-asp血浆代谢结果
具体实施方式
实施例 重组L-asp的表达纯化、性质测定、活性研究和体外安全性研究
1材料和方法
1.1.1细胞、质粒和菌株
原核表达载体pET-22b，大肠杆菌克隆菌株Top10，大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)均由本实验室保存。Jurkat、HBE细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，Raji细胞由苏州大学血液中心提供。
1.1.2试剂
Tsi High-Fidelity DNA polymerase购自天津金贝斯生物科技有限公司；T4连接酶购自美国Thermo公司；限制性内切酶NdeI和XhoI购自美国Thermo公司；质粒小量提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker购自北京Transgen公司；蛋白胨、酵母提物购自英国Oxoid公司；丙烯酰胺和TEMED购自美国Bio-Rad公司；DEAE Sepharose FFF购自美国GE公司；BCA试剂盒购自上海碧云天生物；过硫酸铵(美国Sigma公司)；奈氏试剂购自上海麦克林生化科技有限公司；胎牛血清FBS、DMEM、RPIM-1640购自Wisent公司；其他分析试剂如无水乙醇甲醇等购自南京化学试剂厂；相关引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.1.3主要仪器
PCR仪购自日本Takara公司；核酸电泳仪DYY-6C购自南京普阳科学研究所；恒温摇床-I ZWY-211C购自上海智城；恒温摇床-II TCYQ购自苏州市培英实验设备有限公司；高压灭菌锅购自SANY；台式常温离心机FRESCO购自美国Thermo公司；高速离心机Avanti J-26SXP购自Beckman公司；超声波细胞破碎仪购自无锡市上佳生物科技有限公司；恒流泵BT-100购自上海沪西分析仪器厂有限公司；蛋白质紫外检测仪HD-7购自南京普阳科学仪器研究所；蛋白凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶扫描仪购自美国UVP公司；MW8-10KDa透析袋购自南京晚晴有限公司；MW 50KDa超滤管购自Millipore；酶标仪购自瑞士TECNA公司，微量热泳动仪、毛细管购自德国Nano Temper公司，酶标仪购自瑞士TECNA公司，CO2培养箱购自Thermo公司，细胞计数仪购自Invitrogen公司；细胞培养瓶购自Nunclon公司；高压灭菌锅购自Zealway公司。
1.2实验方法
1.2.1重组L-asp表达质粒的构建和表达纯化
以大肠杆菌为模板，F和R为引物配对进行PCR，得到目的片段L-asp。片段产物为950bp左右，回收所得的PCR产物。引物序列如表1。
表1.1引物(下划线标示酶切位点)
使用限制性内切酶XhoI、NdeI分别将L-asp片段和载体pET-22b进行酶切，37℃酶切2h。连接产物转化至Top10感受态细胞。将10μL连接产物加到100μL Top10感受态中，冰上放置0.5h，42℃热激90s，立即放冰上待用。加入200μL无抗生素的LB液体培养基，37℃，220r/min活化45min。吸取120μL涂布于含有氨苄抗性的LB平板上，在37℃恒温箱中过夜培养。从LB平板上挑取单克隆至3mL LB的液体培养基中，1:1000加入氨苄，37℃，220r/min活化9h，提取质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果利用Muscle程序进行序列对比。
将测序结果正确的重组pET-22b-L-asp质粒转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，均匀涂布到含有氨苄抗生素的LB平板上，37℃恒温箱中过夜培养。挑取单克隆接种到含有浓度为50ug/ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220r/min过夜培养。次日，将过夜菌按1:100的比例接种于含有浓度为50ug/ml氨苄抗性的3mL LB液体培养基中，37℃，220r/min条件下至OD600大约为0.6时，按1:1000加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(lsopropylβ-D-Thiogalactoside,简称IPTG)，37℃下诱导表达6h。诱导表达结束后，6500rpm离心1min去除培养基，收集菌体。菌体用用PBS溶液洗涤2次后，600μL PBS溶液重悬。菌液在冰水浴条件下超声，超声条件为：功率300W，超声2s，间歇4s，5个循环。超声结束后，取样品进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察目的蛋白的表达情况。
采用改良的脉冲稀释法纯化目的蛋白。将表达菌BL21(pET-22b-L-asp)以1:100的比例接种于3mL含50μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基中，220rpm/min、37℃过夜培养。次日，将3mL菌液全部转接到1L含50μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基中，220rpm/min、37℃培养至OD600约为0.6，加入终浓度1mM IPTG，37℃恒温摇床诱导培养5h。6500rpm离心10min去除培养基，加入20mg溶菌酶，20mL Buffer I(6.06g Tris、0.37g EDTA、0.17g PMSF溶于800mL的ddH2O中，浓盐酸调节pH值至8.5后，定容至1L)重悬菌体，室温孵育2h，置于冰水浴超声，超声条件为：功率300W，超声1min，间歇1min,10个循环。4℃,12000r/min离心20min，弃除上清。沉淀中加入20mg脱氧胆酸，20mL的Buffer I重悬菌体，室温孵育2h，置于冰水浴超声，超声条件为：功率300W，超声1min，间歇1min，10个循环。4℃，12000r/min离心20min，弃除上清。沉淀用Buffer I洗涤两遍，ddH2O洗涤一遍。沉淀同1mL 50mM Tris(pH＝8.5)重悬，加入到9mL Buffer II(0.61g Tris、0.017g PMSF、24.04g尿素、138μLβ-巯基乙醇、0.058g Nacl溶于80mL ddH2O中，浓盐酸调节pH值至8.5后，定容至100mL)中，混合均匀，室温下放置1h，4℃，15000r/min离心30min，上清过0.22μM微膜，将过完微膜的上清加入到90mL Buffer III(0.61g Tris、3.00g尿素、1.74g L-Arg、0.058g Nacl溶于80mL ddH2O中，浓盐酸调节pH值至8.5后，定容至100mL)中，4℃，边搅拌边加入，加入速度为0.1mL/min。加入完毕后，4℃，15000r/min离心30min，上清至于透析袋，4℃透析液I(6.06g Tris、30.05g尿素溶于800mLddH2O中，浓盐酸调节pH值至8.5后，定容至1L)中透析12h后置换透析液II(6.06g Tris溶于800mLddH2O中，浓盐酸调节pH值至8.5后，定容至1L)，换三次透析液。透析完成的上清进行纯化。
利用软件计算重组L-asp的等电点在5-6之间，因此选用8.5作为离子交换层析缓冲液的pH。
取5mL DEAE CL-6B琼脂糖凝胶介质，加入层析柱中，使填料自然沉降30min。将层析柱、蛋白紫外吸收检测仪和恒流泵通过软管连接起来，通过恒流泵将50mM Tris(pH＝8.5)缓冲液泵入层析柱，对填料进行预平衡，平衡体积约为填料体积的5～10倍。调节紫外检测仪的透过率为100％，光吸收为0。通过恒流泵上样，用含100mM NaCl的50mM Tris-Hcl(pH＝8.5)洗去杂蛋白，含300mM Nacl的50mM Tris-Hcl(pH＝8.5)洗脱目的蛋白。以50mMTris-HCl(pH＝8.5)作为透析外液透析目的蛋白24h，除掉目的蛋白中的NaCl。收集样品，通过SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度，BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算产率。
1.2.2重组L-asp的酶活测定
采用中国药典关于重组L-asp的酶活测定方法对重组L-asp的酶活进行检测。
1.2.3重组L-asp粒径检测
动态光散射(Dynamic Light Scattering，简称DLS)测定蛋白粒径的原理是基于溶液中的微粒在不停的做无规则的热运动。一束光线通过溶液，粒子和光波的电磁场相互作用产生衍射。由于多普勒效应的作用，散射光的频率会偏离入射光的频率而产生一个分布。通过测定散射光的频谱，从而了解散射粒子的相关性质[10]。实验具体步骤如下：
1)用蛋白储存Buffer将蛋白的浓度稀释为1mg/mL。
2)取100μL的蛋白稀释液放入粒径仪的样品池中，10℃测定粒径。
实验采用一式三份测量的平均值用于分析。使用正则化拟合和瑞利球算法分析光散射数据。如果它们以质量小于样品的2％，则仅消除异常峰。
1.2.4重组L-asp对Jurkat和Raji细胞的杀伤作用
含有10％FBS的RPI 1640培养液将Jurkat、Raji细胞制备细胞悬浮液，将Jurkat、Raji细胞分别以3000个/孔、4000个/孔、5000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，过夜培养，待细胞状态良好后，加入使用培养液配置的不同浓度(20IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、1IU/mL、0.1IU/mL、0.01IU/mL、0.001IU/mL、0.0001IU/mL)的L-asp每孔100μL。同时设置只加培养液的细胞组为空白对照，每个浓度设置五个平行孔。按照细胞接种量多少的顺序分别于细胞培养箱37℃培养24h、48h、72h。另外将Jurkat、Raji细胞分别以1000个/孔、2000个/孔、3000个/孔、4000个/孔、5000个/孔、6000个/孔、7000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，过夜培养，待细胞状态良好后，入使用配液配置的L-asp，蛋白浓度5IU/mL，按照细胞接种量多少的顺序分别于37℃细胞培养箱培养6h、12h、24h、36h、48h、72后，每孔加入10μL CCK-8，37℃孵育4h，使用酶标仪检测活细胞数目，检测波长450nm，参考波长650nm。按照如下的公式计算细胞生长存活率：
1.2.5重组L-asp对HBE细胞的毒副作用
用含有10％FBS的DMEM培养液将HBE细胞制备细胞悬浮液，将HBE细胞分别以3000个/孔、4000个/孔、5000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，过夜培养，待细胞状态良好后，弃掉HBE细胞培养液原液，加入使用培养液配置的不同浓度(20IU/mL、10IU/mL、5IU/mL、1IU/mL、0.1IU/mL、0.01IU/mL、0.001IU/mL、0.0001IU/mL)的L-asp，每孔100μL。同时设置只加培养液的细胞组为空白对照，每个浓度设置五个平行孔。按照细胞接种量多少的顺序分别于细胞培养箱37℃培养24h、48h、72h。另外将HBE细胞以1000个/孔、2000个/孔、3000个/孔、4000个/孔、5000个/孔、6000个/孔、7000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，过夜培养，待细胞状态良好后，HBE细胞弃掉原液，加入使用配液配置的L-asp浓度5IU/mL，按照细胞接种量多少的顺序分别于37℃细胞培养箱培养6h、12h、24h、36h、48h、72后，每孔加入10μL CCK-8，37℃孵育4h，使用酶标仪检测活细胞数目，检测波长450nm，参考波长650nm。按照如下的公式计算细胞生长存活率：
1.2.6重组L-asp与HSA结合能力检测
分子间热量电泳(Microscale thermophoresis,简称MST)的检测原理是基于生物分子在毛细管中发生热泳动现象，从而导致相互作用的生物分子的电荷、水化层、分子大小等性质发生变化，进而引起反应体系中荧光的分布变化，再根据荧光变化检测相互作用的生物分子间的亲和情况[11]。具体方法如下：
1)无荧光配体配制：标记16个PCR反应管，在1～16号PCR反应管中分别加入10μL50mM Tris缓冲液，使用清洁的移液枪器吸头吸取10μL的无荧光配体加入到1号反应管，吹打混匀后，吸取10μL转移至2号反应管，并混合均匀，继续依次连续梯度稀释至16号反应管。
2)荧光配体配制：将荧光配体分别稀释至2倍于待测浓度的浓度值，使用清洁的移液枪器吸头吸取10μL依次加入1～16号反应管，由低浓度反应管开始添加至高浓度反应管。
3)孵育：充分混合上述各管反应液，室温下避光孵育15min。
4)上样：倾斜PCR管，使液体虹吸至Monolith NT毛细管中，按照从高毛浓度到低浓度的顺序将毛细管装入样品托盘的管槽中。
5)MST测量：设置Monolith NT.115所需的各种参数，按照设定条件进行检测。
1.2.7重组L-asp体外血浆半衰期测定
取50IU的变体蛋白0.5mL置于2.5mL的血清中，37℃孵育，每间隔5h取出100μL，共设置14个时间点，采用奈氏试剂法检测各个时间段血清中蛋白酶活性[12]。
2结果
2.1.1重组L-asp的表达纯化
采用37℃诱导表达L-asp，目的蛋白大部分都以包涵体的形式存在。重组L-asp纯化时首先进行两步超声破碎，弃去上清以除去多数可溶性杂蛋白。随后利用4M尿素提取变性蛋白，0.5M尿素复性，再利用梯度透析的方式除去尿素。最后将不含尿素的蛋白液通过DEAE柱纯化，使用pH＝8.5的50mM Tris(含300mM Nacl)洗脱目的蛋白。其中，L-asp蛋白比活力由10.09IU/mg提高到201.21IU/mg，纯化回收率为25.98％，纯化倍数为29.30，产率为5.23mg/L,纯度为90.14％。蛋白纯化结果如图1。
2.1.2重组L-asp的酶活测定
奈氏试剂法测得重组L-asp酶的比活性为201.21IU/mg。
2.1.3重组L-asp粒径检测
DLS数据结果显示重组L-asp的平均粒径分布为6.25±0.16nm。重组L-asp的粒径分布如图2所示。
2.1.4重组L-asp对Jurkat和Raji细胞的杀伤作用
实验结果显示，在作用48h和72h后，重组L-asp能有效抑制Jurkat和Raji这两种白血病细胞的增殖，作用48h时，L-asp对Jurkat和Raji细胞的细胞半数致死浓度(IC50)分别为3.52IU/mL和2.45IU/mL；作用72h时，L-asp对Jurkat和Raji细胞的IC50分别为4.05IU/mL和2.01IU/mL。重组L-asp对Jurkat和Raji细胞的杀伤作用如图3。
2.1.5重组L-asp对HBE的细胞毒作用
试验结果显示，在L-asp作用24h、48h和72h后，在L-asp浓度(0-20IU/ml)梯度下，重组L-asp对HBE的细胞毒作用极其微弱，无法计算出半数致死剂量(图4)。
2.1.6重组L-asp与HSA结合能力检测
利用纯化得到的L-asp蛋白进行MST检测，固定荧光蛋白HSA的浓度，对重组L-asp蛋白进行梯度稀释。利用△Fnorm绘制结合曲线，得到L-asp的亲和力指数为14.15μmol.L-1。重组L-asp与HSA结合如图5。
2.1.7重组L-asp体外血浆半衰期测定
利用纯化得到的L-asp蛋白进行体外血浆半衰期检测，实验结果发现重组L-asp的体外血浆半衰期约为25h，重组L-asp的体外代谢如图6所示。
3结论
L-asp自1978年FDA首次批准临床治疗ALL以来，一直作为临床ALL治疗的首选药物。但在使用过程中发现，L-asp存在半衰期较短的缺陷。目前已有研究发现HSA能够显著提高药物的半衰期。本发明重组表达了L-asp，采用脉冲稀释法获得重组蛋白，酶活检测较高，粒径分布显示，重组蛋白在缓冲液中分布均一。CCK-8数据结果表明，重组L-asp对淋巴癌细胞具有较强的杀伤作用，对正常细胞的细胞毒作用较弱，显示了较高的安全性。MST试验显示，重组L-asp与HSA有一定的结合能力，本发明方法获得的重组L-asp能显著提高L-asp的半衰期和生物利用度。
序列表
<110> 南京吉瑞康生物科技有限公司
<120> 重组L-门冬酰胺酶及其制备方法和用途
<130> 20180706-1
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列(.)
<400> 1
atgttaccca atatcaccat tttagcaacc ggcgggacca ttgccggtgg tggtgactcc 60
gcaaccaaat ctaactacac agtgggtaaa gttggcgtag aaaatctggt taatgcggtg 120
ccgcaactaa aagacattgc gaacgttaaa ggcgagcagg tagtgaatat cggctcccag 180
gacatgaacg ataatgtctg gctgacactg gcgaaaaaaa ttaacaccga ctgcgataag 240
accgacggct tcgtcattac ccacggtacc gacacgatgg aagaaactgc ttacttcctc 300
gacctgacgg tgaaatgcga caaaccggtg gtgatggtcg gcgcaatgcg tccgtccacg 360
tctatgagcg cagacggtcc attcaacctg tataacgcgg tagtgaccgc agctgataaa 420
gcctccgcca accgtggcgt gctggtagtg atgaatgaca ccgtgcttga tggccgtgac 480
gtcaccaaaa ccaacaccac cgacgtagcg accttcaagt ctgttaacta cggtcctctg 540
ggttacattc acaacggtaa gattgactac cagcgtaccc cggcacgtaa gcataccagc 600
gacacgccat tcgatgtctc taagctgaat gaactgccga aagtcggcat tgtttataac 660
tacgctaacg catccgatct tccggctaaa gcactggtag atgcgggcta tgatggcatc 720
gttagcgctg gtgtgggtaa cggcaacctg tataaatctg tgttcgacac gctggcgacc 780
gccgcgaaaa ccggtactgc agtcgtgcgt tcttcccgcg taccgacggg cgctaccact 840
caggatgccg aagtggatga tgcgaaatac ggcttcgtcg cctctggcac gctgaacccg 900
caaaaagcgc gcgttctgct gcaactggct ctgacgcaaa ccaaagatcc gcagcagatc 960
cagcagatct tcaatcagta cggtggtggt ggtagcggtg gtggtggtag cggtggtggt 1020
ggtagccagc gtctgatgga agatatttgt ctgccgcgtt ggggttgtct gtgggaagat 1080
gatttt 1086
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(.)
<400> 2
Met Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr Ala Gly Lys Val Gly
20 25 30
Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu Lys Asp Ile Ala Asn
35 40 45
Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser Gln Asp Met Asn Asp
50 55 60
Asp Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn Thr Asp Cys Asp Lys
65 70 75 80
Thr Asp Gly Phe Val Ile Ala His Gly Thr Asp Thr Met Glu Glu Thr
85 90 95
Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp Lys Pro Val Val Met
100 105 110
Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser Ala Asp Gly Pro Phe
115 120 125
Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp Lys Ala Ser Ala Asn
130 135 140
Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val Leu Asp Gly Arg Asp
145 150 155 160
Asp Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr Phe Lys Ser Val Asn
165 170 175
Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys Val Asp Tyr Gln Arg
180 185 190
Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro Phe Asp Val Ser Lys
195 200 205
Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr Asn Tyr Ala Asn Ala
210 215 220
Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala Gly Tyr Asp Gly Ile
225 230 235 240
Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr Lys Thr Val Phe Asp
245 250 255
Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Asn Gly Thr Ala Val Val Arg Ser Ser
260 265 270
Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala Glu Val Asp Asp Ala
275 280 285
Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn Pro Gln Lys Ala Arg
290 295 300
Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys Asp Pro Gln Gln Ile
305 310 315 320
Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
325

Claims (2)

1. 一种重组L-门冬酰胺酶，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种如权利要求1所述的重组L-门冬酰胺酶的制备方法，其特征为步骤如下：
(1)PCR克隆获得重组L-门冬酰胺酶的DNA序列；
(2)将重组L-门冬酰胺酶的DNA序列插入载体pET-22b并转化Top10感受态细胞，获得重组pET-22b-L-asp质粒并转化到表达菌株BL21感受态细胞中，获得表达重组L-门冬酰胺酶的质粒和菌株；
(3)培养表达重组L-门冬酰胺酶的菌株；
(4)破菌，提取蛋白，并采用改良的脉冲稀释法纯化获得重组L-门冬酰胺酶；
(5)纯化使用DEAE CL-6B琼脂糖凝胶介质，洗脱浓度为300mM Nacl， 50mM Tris-Hcl，pH＝8.5。
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Refolding and purification of recombinant L-asparaginase from inclusion bodies of E. coli into active tetrameric protein;Arun K Upadhyay et al;《Front Microbiol》;20140915;第5卷;第2页左栏第2段，材料和方法 *

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