CN105713080B - 生物感受器的稳定用于体内应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于稳定分离的蛋白质的制剂的用途。具体而言，公开了该制剂用于在生物化学感受器中稳定受体的用途。本发明还涉及含有此类制剂的生物化学感受器。

Description

生物感受器的稳定用于体内应用
本申请是申请人于2010年10月25日提交的题为“生物感受器的稳定用于体内应用”的中国专利申请201080059122.8的分案申请。
本发明涉及制剂用于稳定分离的蛋白质的用途。具体而言，公开了该制剂用于稳定生物化学感受器中受体的用途。本发明还涉及含有此类制剂的生物化学感受器。
经常期望蛋白质的技术应用，以从干扰杂质中释放它们。使用纯化的蛋白质的重要领域是生物化学感受器。用作生物化学感受器的受体的蛋白质必须对分析物具有高亲和力。为了检测分析物与受体的结合，经常修饰受体，以使得分析物与受体之间的相互作用是可以测量的。杂质致使定向修饰困难，且经常是不可能的。因此，从天然细胞和组织中提取蛋白质并进行纯化。
然而，蛋白质的纯化具有缺点，分离的蛋白质的稳定性经常比其在天然环境中的稳定性低。加入分子伴侣、氨基酸、蛋白质(例如，BSA)、多糖或多糖衍生物经常提高分离的蛋白质的稳定性。经常地，使用低或高分子量的添加剂，以减少溶液中的自由体积(“分子拥挤”)。在这种情况下，可使用蛋白质、多糖或合成的聚合物。从现有技术看，尤其是聚乙二醇、Ficoll、葡聚糖、核糖核酸酶和牛血清白蛋白是已知的。可通过“排除体积”的效果阐明这些添加剂的效果(Chebotareva等,2004,Biochemical Effects of MolecularCrowding,Biochemistry(Moscow),69:1522-1536)。
本发明的目标因此是提供制剂，其使得分离的蛋白质的稳定得以提高。通过专利权利要求书及下文中描述的实施方案实现该目标。
本发明因此涉及细胞裂解物级分用于稳定分离的蛋白质的用途，其中通过这样的方法产生细胞裂解物级分，所述方法包括步骤：
a)从细胞中产生细胞裂解物；和
b)从所述细胞裂解物中分离出分离的蛋白质，由此获得用于稳定所述分离蛋白质的细胞裂解物级分。
优选地，从直立刀豆(Canavalia ensiformis)中产生分离的蛋白质和细胞裂解物级分。特别优选地，细胞裂解物级分含有前刀豆球蛋白(precanavalin)。优选地，分离出分离的蛋白质后，进一步加工所述细胞裂解物级分。优选地，所述分离的蛋白质是受体，非常特别优选伴刀豆球蛋白A。优选地，分离的蛋白质是生物化学感受器的组分。特别优选地，所述生物化学感受器还包含水凝胶颗粒中的葡聚糖和伴刀豆球蛋白。
通过提供稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分的方法可获得本发明使用的细胞裂解物级分，所述方法包括步骤
a)从细胞中产生所述细胞裂解物；和
b)分离出待从所述细胞裂解物中分离的蛋白质。
在该申请中，认为“细胞”表示所有的原核或真核细胞，其表达待分离的蛋白质。这包括遗传转化的细胞，其中以重组方式表达待分离的蛋白质。细胞可以原核或真核细胞培养物的单个细胞存在或以动物或植物体或真菌的组织样品形式存在。
用于产生细胞裂解物的方法为本领域技术人员所熟知。可在本发明方法范围内使用所有已知的机械或非机械破碎方法破碎细胞。优选的机械破碎方法是使用旋转刀片匀浆(在动物细胞中)、Potter-Elvehjem方法、研磨细胞或组织、在研钵中用沙子磨碎、氧化铝或玻璃珠、在超声的情况下通过空化力进行细胞破碎，和通过狭窄阀门的高压挤压细胞悬浮液(例如在French Press中)。本领域技术人员知道，在机械破碎方法中，以这种方式可形成热，以至于在许多情况下需要温控，以防止蛋白质变性。优选的非机械破碎方法是细胞的反复冰冻和融化、利用低渗溶液处理细胞、在革兰氏阳性菌的情况下利用溶菌酶进行处理、利用EDTA进行处理，随后在革兰氏阴性菌的情况下与溶菌酶温育、或在酵母的情况下利用甲苯进行处理。当然，所述方法的多种要素可与另一种方法或此处未提及的其他破碎方法组合。
在破碎过程中，必须保护蛋白质免于有害影响。优选地，使用冷或特异的抑制剂，以防止蛋白酶对蛋白质的降解。为了保护巯基，优选使用还原剂，特别优选二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。为了保护免于重金属离子，优选乙二胺四乙酸(EDTA)。这也结合可激活蛋白酶的二价阳离子。为了防止蛋白质凝集，优选使用非离子型去污剂。
优选地，任选采取的破碎方法和任何保护措施不仅适合于在细胞裂解物中以活性形式存在的想要的蛋白质，还适合于所述细胞裂解物的组分，其介导蛋白质的稳定，所述蛋白质也必须不能在功能上被所选破碎方法损坏。
在其实际应用前，分离的蛋白质在许多情况下是被修饰了的。例如，用于生物化学感受器的受体经常被标记。通过共价修饰受体，例如使用荧光染料进行该标记。为了待稳定的经修饰的分离蛋白质不被细胞裂解物级分中存在的非修饰蛋白质稀释，优选从所述细胞裂解物中分离待分离的蛋白质。表述“分离待从细胞裂解物中分离的蛋白质”表示纯化想要的蛋白质。结果，存在至少一种细胞裂解物，其含有蛋白质作为分离的蛋白质。此外，单独存在至少一种细胞裂解物级分，其不含有上述蛋白质或仅含有很少量的上述蛋白质。从其天然环境，即从这样的分子中分离所述分离蛋白质，其与所述分子一起存在于细胞裂解物中。优选地，基于来自其天然环境的分子，所述分离的蛋白质以至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％，或特别优选地，至少99％(重量/重量)的纯度存在。含有分离的蛋白质的细胞裂解物级分可含有任何想要量的分子，其不来自所述蛋白质的天然环境，却是在纯化过程中或在纯化后添加进去的。其一个实例是所用缓冲液的组分。
用于从细胞裂解物中分离待分离的蛋白质的方法为本领域技术人员所知。优选方法是沉淀和差异增溶、超速离心、层析方法和电泳。
优选通过加入升高浓度的硫酸铵完成蛋白质的沉淀。根据所达到的硫酸铵浓度，以这种方法可连续沉淀出不同溶解度的蛋白质级分，并且可进行分离。同等优选的是通过使用合适的缓冲液酸化培养基来沉淀蛋白质。
超速离心基于这样的原理，在离心产生的重力场内，颗粒密度越高并且越紧密，其沉降得越快。因为足够长离心过程中建立的离心力和浮力之间的平衡，各蛋白质在容器中在浮力和离心力彼此平衡的点上积聚。使用蔗糖梯度可利于该方法。
层析分离蛋白质基于这样的原理，所述蛋白质溶解在流动相中，优选缓冲液中，移动经过静止相。以这样的方式选择相，其中来自蛋白质混合物的不同浓度的各蛋白质与固相之间的相互作用产生各蛋白质级分经过静止相的不同长度的流动时间。蛋白质与静止相怎样相互作用的方式取决于层析的类型。用于分离蛋白质的优选层析方法是大小排阻层析(基于待分离的各蛋白质的不同大小)、亲和层析(基于各蛋白质特异性结合柱材料的能力)、离子交换层析(基于多种蛋白质的不同等电点)和反相层析(基于多种蛋白质的不同疏水性)。
在本专利申请的范围内，表述“分离的蛋白质”表示任何蛋白质，其中对其功能状态的分离具有兴趣。下文中，同义使用表述“想要的蛋白质”。本申请的上下文中，分离的蛋白质优选包含酶、受体、调节性蛋白质、转录因子、细胞骨架蛋白质、结合蛋白质和膜转运蛋白，特别优选受体。非常特别优选地，所分离的蛋白质是伴刀豆球蛋白A。在所述方法的范围内，所分离的蛋白质可作为纯的物质或部分纯化形式存在。优选地，分离的蛋白质或分离蛋白质的制剂包含低于50％、低于25％、低于10％、低于5％、低于1％、或低于0.5％的作为杂质的蛋白质或蛋白质和细胞组分。
认为“酶”表示任何蛋白质，其能够催化化学反应。在该方法中，在化学反应的上下文中，其他分子被转化还是酶自动催化起作用均不是重要的。
“受体”是任何蛋白质，其能够特异性结合分子、配体，并响应这种结合，构象改变或活性改变。也可以这样的方式化学修饰在其天然状态中对与配体的结合不显示反应的蛋白质，其中配体的结合导致蛋白质的可测量的改变。此外，通过荧光标记的受体与同样荧光标记的配体的组合，竞争性测定是可能的。在样品中缺少未标记配体的情况下，仅荧光标记的配体结合受体。两种荧光染料在空间上的接近影响了其光的发射。如果未标记的配体然后存在于样品中，那么所述未标记配体取代了来自受体的荧光标记配体，并因此改变了系统的光发射。系统光发射的改变因此取决于未标记配体的量，所述未标记配体与样品一起被引入系统并取代来自受体的标记配体。特异性结合表示所述配体比其他物质以显著更高的亲和力结合。优选地，所述配体以比其他配体高至少10倍、100倍、1000倍、10000倍或100000倍的亲和力结合。配体优选为离子、小分子、核酸(单链或双链形式的DNA或RNA)或任何长度的其他蛋白质。小分子可属于任何已知类型的分子。它们优选为脂类、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、糖、生物碱、氨基酸、生物胺、类异戊二烯或类固醇。特别优选地，小分子是糖，非常特别优选葡萄糖。特别优选地，受体是凝集素，非常特别优选伴刀豆球蛋白A。
凝集素是能够特异性结合碳水化合物结构的蛋白质。它们在动物、植物和细菌中参与许多类型的分子和细胞识别过程，并且不具有酶功能。许多凝集素被糖基基团进行了翻译后修饰。
伴刀豆球蛋白A是可结合α-D-葡萄糖和类似糖，但不与其酶促反应的凝集素。单体由237个氨基酸组成，并含有锰和钙。在中性pH下，其形成在酸性范围内分解成两个二聚体的四聚体。其以特别高的浓度出现在直立刀豆(Canavalia ensiformis)中。伴刀豆球蛋白A优选具有SEQ ID NO:3定义的氨基酸序列。
在该申请中，那些蛋白质定义为“调节蛋白”，其与其他蛋白质相互作用，并由此改变这些蛋白质的活性。结果是相互作用配偶体活性降低(抑制)或活性增加(激活)。调节子的结合配偶体优选为酶。在该情况下，调节子的结合影响对底物的亲和力或所述底物的酶促反应的速率。同样优选地，结合配偶体是受体。在该情况下，所述调节子可作为激动剂起作用，即可通过结合受体而激活受体，或所述调节子可作为拮抗剂结合受体，但在该结合过程中并不激活所述受体。另外优选地，结合配偶体是转录因子。在该情况下，调节子的结合影响转录因子修饰基因表达这部分的能力。
在该申请的上下文中，“转录因子”是这样的蛋白质，其活性由促进或抑制细胞中一个或多个基因的表达组成。
“结合蛋白”是能够特异性结合其他分子(配体)的蛋白质。特异性结合表示配体以比其他物质显著更高的亲和力结合。优选地，所述配体以比其他配体高至少10倍、100倍、1000倍、10000倍或100000倍的亲和力结合。
认为表述“膜转运蛋白”表示使得其他分子能够通过细胞膜或促进其通过细胞膜的那些蛋白质。这些蛋白质定位在细胞膜上。
细胞骨架蛋白质是这样的蛋白质，其稳定细胞的空间结构，并与动力蛋白组合，介导细胞运动过程。细胞骨架蛋白优选为肌动蛋白、中间丝和微管。与肌动蛋白丝、微管结合的动力蛋白优选为驱动蛋白、动力蛋白和肌球蛋白。
术语“稳定”表示分离的蛋白质的结构和/或功能的维持。因为蛋白质的结构是其功能的重要前提，稳定蛋白质的结构优选导致维持蛋白质的功能。待稳定的蛋白质结构优选为蛋白质在其天然环境中，即在组织或细胞中的结构。本发明的制剂优选稳定分离蛋白质的二级、三级或四级结构。在本发明的上下文中，认为稳定表示分离蛋白质的分子的统计学显著性比例的稳定。例如，耗尽本发明的制剂后，功能分离的蛋白质的回收率优选为至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％，或特别优选至少99％。回收率因此可测定为添加本发明制剂和储存后分离的蛋白质的功能分子与分离的蛋白质分子总量的比例。优选地，为了测定回收率，在添加本发明制剂之前和之后并在稍后时间点上立即比较含有分离蛋白质的制剂的活性。此外，在相同时间点上不添加本发明制剂的情况下利用分离蛋白质的制剂进行比较。
本发明有利地可以提高分离的蛋白质，具体而言受体的稳定化。如实施例5中显示，伴刀豆球蛋白A通过来自直立刀豆种子的非结合细胞裂解物级分比通过牛血清白蛋白更好地稳定化，牛血清白蛋白在现有技术中作为蛋白质的稳定剂。稳定分离的蛋白质的本发明细胞裂解物级分的其他令人惊讶的优势是高压灭菌这些细胞裂解物级分而不损坏其活性的可能性。对于稳定分离的蛋白质的本发明细胞裂解物级分在医学领域中的应用，这是极其有利的，因为以这种方式可保证细胞裂解物级分不含有病菌。
在本发明的优选实施方案中，从刀豆(Canavalis ensiformis)的种子中产生分离的蛋白质和稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分。
在本发明特别优选的实施方案中，稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分含有前刀豆球蛋白。如果产生待分离的蛋白质的细胞不含有或不含有充足的天然形式的前刀豆球蛋白，优选以重组方式在该细胞中表达前刀豆球蛋白。同样优选向细胞裂解物中添加前刀豆球蛋白。
术语“前刀豆球蛋白”表示在刀豆(直立刀豆)的种子中含有的蛋白质。前刀豆球蛋白单体在变性条件下的凝胶电泳中显示49000道尔顿的分子量。胰蛋白酶将前刀豆球蛋白切割成各自24000和25000道尔顿分子量的两个肽。在允许这些切割产物结晶的情况下，胰蛋白酶将两个肽中更大的肽第二次切割(Campbell Smith等,1982,BiochemicalCharacterization of Canavalin,the Major Storage Protein of Jack Bean,PlantPhysiology,70:1199-1209)。优选地，刀豆球蛋白具有SEQ ID NO:2中定义的氨基酸序列。在本发明的优选实施方案中，前刀豆球蛋白具有与SEQ ID NO:2定义的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，具有SEQ ID NO:1定义的序列的多核苷酸编码前刀豆球蛋白。在实施例1中描述了用于提供来自刀豆的纯化的前刀豆球蛋白的方法。
在本发明的其他优选实施方案中，进一步处理稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分。
该处理优选包括添加蛋白酶抑制剂和/或通过螯合剂结合游离金属离子。此外，优选对稳定蛋白质的细胞裂解物级分灭菌。非常特别优选地，所述处理包括富集组分亚群，其特别有效地稳定细胞裂解物级分中的分离的蛋白质。同样，非常特别优选从细胞裂解物级分中分离干扰组分。使用稳定蛋白质的细胞裂解物级分的这种分离，以从所述细胞裂解物级分中去除阻止蛋白质工业应用的那些分子。为了从稳定蛋白质的细胞裂解物级分中分离分子亚群，可使用本领域技术人员已知的分离分子混合物的所有方法。优选地，使用那些分离方法，在上文中为纯化蛋白质描述了所述方法。
本发明潜在研究的上下文中，已经发现前刀豆球蛋白特别高度适合稳定分离的蛋白质。因此，稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分的进一步处理优选为富集前刀豆球蛋白。
优选通过这样的方法富集前刀豆球蛋白，所述方法包括步骤：
1.在合适的缓冲液中悬浮刀豆粉；
2.使用Superdex 200柱层析分离伴刀豆球蛋白A。前刀豆球蛋白定位在非结合级分；
3.非结合级分针对水进行透析；
4.冻干非结合级分；
5.将非结合级分与酸性沉淀缓冲液，优选50mM乙酸钠,pH 4.4混合，随后离心；
6.用蒸馏水洗涤沉淀，随后离心；
7.将剩余的沉淀用在合适的缓冲液，优选1％(重量/重量)NaCl和0.1％(重量/重量)K2HPO4,pH 7.0吸收，并离心；
8.离心后，收集上清液；
9.将离心后剩余的沉淀吸收在氯化钠溶液，优选5％(重量/重量)中，并再次离心；
10.将步骤9中获得的上清液与来自步骤8的上清液组合；
11.组合的上清液针对蒸馏水进行透析；
12.通过酸-碱提取，优选使用1N乙酸，pH 5.1沉淀浓缩前刀豆球蛋白，并在0.01NNaOH中吸收沉淀，其中在碱中吸收后的pH不高于8.0；
13.针对为随后离子交换层析提供的应用缓冲液，优选20mM Tris,100mM NaCl,pH7.2进行透析；
14.优选使用DEAE Sepharose FF柱和步骤13中提及的应用缓冲液进行离子交换层析，优选利用增加的盐梯度进行洗脱；
15.优选使用SDS-PAGE鉴定最纯级分，合并这些级分；
16.针对蒸馏水进行透析；和
17.冰冻干燥前刀豆球蛋白。
特别优选地，通过简化方法富集前刀豆球蛋白，所述方法包括步骤：
1.在合适的缓冲液中悬浮刀豆粉；
2.优选使用DEAE Sepharose FF柱进行离子交换层析，优选利用增加的盐梯度进行洗脱；
3.优选使用SDS-PAGE鉴定最纯级分，合并这些级分；
4.针对蒸馏水进行透析；和
5.冰冻干燥前刀豆球蛋白。
本发明的另一优选实施方案涉及含前刀豆球蛋白的制剂用于稳定分离的蛋白质的用途。特别优选的是上述制剂用于稳定伴刀豆球蛋白A的用途。
“含前刀豆球蛋白的制剂”优选为液体或固体形式。优选地，除了前刀豆球蛋白，所述制剂也含有来自分离的蛋白质的细胞环境的其他组分。同样优选地，所述制剂含有分子伴侣、牛血清白蛋白和/或相容的溶质。进一步优选地，所述制剂含有有机或无机缓冲液物质。抑制细菌和真菌生长的防腐剂和湿润剂也优选为本发明制剂的组分。本发明制剂干物质的前刀豆球蛋白的重量分数优选为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％。
在优选的实施方案中，以重组方式产生本发明制剂中含有的前刀豆球蛋白。
用于重组制备蛋白质的方法为本领域技术人员所熟知。将编码前刀豆球蛋白的核酸序列引入使得可以在所选宿主生物中表达前刀豆球蛋白的表达载体中。为此，优选将编码前刀豆球蛋白的核酸序列置于合适的调节序列控制下。合适的调节序列是，例如用于大肠杆菌(E.coli)的lac、trp、或tac启动子，用于酵母的AOX1或GAL-1启动子，或用于植物的CaMV启动子。为了用于动物细胞，优选CMV、SV40或RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子，还有CMV增强子、SV40增强子或珠蛋白-内含子。优选的表达载体是质粒、噬菌体、逆转录病毒载体和人工染色体。用于重组制备前刀豆球蛋白的优选宿主生物是植物、原核生物和真菌，或哺乳动物。优选通过电穿孔、使用磷酸钙或氯化铷沉淀，或通过热激将质粒引入宿主细胞中。用于转化植物细胞的优选方法是轰击接种和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化。
本发明还涉及稳定分离的蛋白质的方法，所述方法包括向所述分离的蛋白质中加入含前刀豆球蛋白的本发明制剂。
向想要的蛋白质中加入含前刀豆球蛋白的本发明制剂使得可以精确施加本发明制剂。可以这种方式实现想要蛋白质的确定且可重复性的稳定化。优选地，干燥的制剂以固体加入到含有想要蛋白质的溶液中，并在其中进行溶解。同样优选地，向含有想要的蛋白质的溶液中加入本发明制剂的贮存液。特别优选将含前刀豆球蛋白的本发明制剂掺入到水凝胶颗粒中，非常特别优选掺入到藻酸盐珠子中，其中所述水凝胶颗粒也含有所述分离的蛋白质。
在本发明方法的优选实施方案中，分离的蛋白质是受体，更优选是凝集素，并更优选是伴刀豆球蛋白A。
本发明还涉及本发明细胞裂解物级分用于稳定分离的蛋白质的用途，其中所述分离的蛋白质是生物化学感受器的组分。
“生物化学感受器”含有分子，优选蛋白质，其能够以高亲和力结合待检测的物质。该蛋白质在下文中表示为“受体”。根据本发明制备的生物化学感受器含有至少一种受体，还含有在稳定受体/受体的细胞裂解物级分中存在的分子。本领域技术人员知道，生物化学感受器还含有其他分子。
分析物与受体的结合使得能够定性地，还优选定量地检测样品中的分析物。认为定性检测表示观察样品中分析物的存在或缺失。本领域技术人员知道，根据所用的感受器，定性检测具有比较低的检测极限，即所述样品必须具有确定的最小浓度的分析物，以能够确定其存在。定量检测分析物还传递了样品中分析物的量或浓度的信息。为了可测量受体与分析物之间的相互作用，优选化学修饰所用的蛋白质。特别优选通过荧光染料标记分离的蛋白质。
术语“样品”表示任何这样的液体，其中的分析物待于检测。优选血液、血浆、血清、泪液、组织液和尿，特别优选眼结膜下的组织液。同样优选的是组织样品。所述样品优选存在为从患者身体分离的样品。更优选地，所述样品存在于其天然位置中。在这种情况下，将感受器优选引入患者体内，并在样品定位的位点上直接使用。
在本发明的优选实施方案中，生物化学感受器含有伴刀豆球蛋白A作为受体。此类生物化学受体可用于测定样品中葡萄糖的浓度，因为伴刀豆球蛋白A结合葡萄糖。在该情况下，除了受体和稳定受体的细胞裂解物级分，所述生物化学感受器优选含有水凝胶。优选合成分子、生物分子或修饰的生物分子的水凝胶。优选的合成分子是聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇。优选的生物分子是明胶、鹿角菜胶、琼脂糖、直链淀粉、支链淀粉、藻酸盐、吉兰糖胶、纤维素和纤维素衍生物。特别优选聚乙烯醇和藻酸盐。如果生物化学感受器含有所述水凝胶，那么在多相中存在受体和分析物。
在特别优选的实施方案中，生物化学感受器含有水凝胶颗粒，其中存在稳定分离的蛋白质的细胞裂解物级分、葡聚糖和伴刀豆球蛋白A。
此外，本发明涉及稳定分离的蛋白质的本发明细胞裂解物级分或含前刀豆球蛋白的制剂用于制备生物化学感受器中的用途。
本发明还提供包含分离的蛋白质和稳定所述分离的蛋白质的细胞裂解物级分的生物化学感受器，如上定义。优选地，所述生物化学感受器包含受体作为分离的蛋白质，特别优选伴刀豆球蛋白A。优选地，在水凝胶颗粒中，细胞裂解物级分与葡聚糖和分离的蛋白质，优选受体，特别优选伴刀豆球蛋白A包含在一起。
同样，本发明提供包含伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白的生物化学感受器。优选地，伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白与葡聚糖一起包含在水凝胶颗粒中。
下文示例性实施方案仅用于阐明本发明。它们不旨在以任何方式限制权利要求书的主题。
实施例
实施例1：产生刀豆的非结合级分
将300g刀豆粉(直立刀豆)悬浮在100mM缓冲液中，并过滤去除膜组分。将总共30g蛋白质应用到Superdex 200柱上，并收集了不结合柱材料的蛋白质级分。总共获得了3升非结合级分(nbF)。溶液针对水进行透析。然后进行冰冻干燥(冻干)。可将冻干的物质吸收在工作缓冲液中。
实施例2：纯化前刀豆球蛋白
从非结合级分中提取粗级分前刀豆球蛋白
8.0g透析和冰冻nbF与沉淀缓冲液(50mM乙酸钠,pH 4.4)混合，温育，然后离心。用水洗涤沉淀的沉淀物，并再次离心。将沉淀物溶解在800ml磷酸氢盐溶液(1％(w/v)NaCl+0.1％(w/v)K2HPO4,pH 7.0)中。离心后收集上清液。将沉淀物溶解在500ml的5％强度氯化钠溶液中，然后离心。盐提取液的组合上清液针对双蒸水进行透析。将透析物离心。去除沉淀物，并使用1N乙酸将上清液调整至pH 5.1，用于沉淀。沉淀批次温育过夜，并在第二天进行离心。沉淀物被吸收在50ml的0.01N NaOH中，并以存在基本上澄清溶液的方式与6ml的0.1NNaOH混合。检测pH，其不应超过pH 8.0。批次在4℃温育过夜。将酸-碱提取步骤重复一次。最后获得的碱性前刀豆球蛋白提取物针对20mM Tris缓冲液，100mM NaCl,pH 7.2进行透析。
纯化前刀豆球蛋白
通过DEAE-阴离子交换层析(DEAE Sepharose FF)纯化前刀豆球蛋白。将蛋白质应用到利用应用缓冲液(20mM Tris缓冲液,100mM NaCl,pH 7.2)平衡的柱子上，随后用缓冲液洗涤，直至280nm处的基础吸收线稳定了，然后进行洗脱(洗脱缓冲液:20mM Tris缓冲液,1M NaCl,pH 7.2)。使用0-100％的盐梯度进行洗脱。通过SDS-PAGE分析洗脱级分后，合并最纯的级分。纯化的前刀豆球蛋白针对双蒸水透析过夜，然后进行冻干。
实施例3：制备含有非结合级分(或前刀豆球蛋白)的水凝胶颗粒
将2g藻酸钠盐和8g非结合级分(或前刀豆球蛋白)在250ml锥形瓶中搅拌的情况下溶解在200g水中。在5L烧杯中，将66.2g的CaCl2.2H2O溶解在4931.3g水中。
藻酸盐/蛋白质溶液通过泵传递到双流体喷嘴中。同时，在喷嘴的第二个入口处，以这样的方式应用压缩空气，其中藻酸盐/蛋白质溶液被雾化成细液滴。气流携带液滴进入含有氯化钙溶液的超声波浴，在那里形成胶体并沉到底部。然后收集凝胶化的球，并任选地进行高压灭菌。
实施例4：葡萄糖感受器的体外稳定性测试
在各情况下在1ml生理缓冲液中37℃下储存葡萄糖感受器。适当的储存时间后，移动葡萄糖感受器并测定多种葡萄糖浓度下的荧光光谱。随着葡萄糖含量增加，荧光强度的改变作为葡萄糖感受器质量的量度。不同储存时间的感受器与非储存感受器比较，并测定随储存时间与葡萄糖反应中的绝对降低和百分比降低。
表1比较显示了在50到250mg/dl的生理葡萄糖范围内用非结合级分和前刀豆球蛋白稳定的感受器响应，表示为葡萄糖浓度每mg/dl增加信号变化的百分比。非结合级分和前刀豆球蛋白给出了相同的结果。
表1：稳定化葡萄糖感受器的可储存性
Figure BDA0000920851620000131
实施例5：使用多种可能的稳定剂相对于非稳定化感受器的稳定性测试的结果
表2显示了在生理条件下储存120天后的值。然而已知的稳定剂如BSA、HAS不稳定感受器系统，通过来自豆粉提取物的非结合级分实现标记的稳定化(也经过高压灭菌)。
表2：多种稳定剂的比较
Figure BDA0000920851620000141
Figure IDA0000920851650000011
Figure IDA0000920851650000021
Figure IDA0000920851650000031
Figure IDA0000920851650000041
Figure IDA0000920851650000051

Claims (8)

1.细胞裂解物级分用于维持分离的蛋白质的结构和/或功能的用途，其中通过这样的方法产生所述细胞裂解物级分，所述方法包括步骤：
a)从细胞中产生所述细胞裂解物；和
b)从所述细胞裂解物中分离出所述分离的蛋白质，具体分离方法是：将细胞裂解物悬浮在合适的缓冲液中；使用Superdex 200柱分离所述蛋白质，由此获得用于维持所述分离的蛋白质的结构和/或功能的细胞裂解物级分，
其中所述分离的蛋白质是伴刀豆球蛋白A，所述细胞裂解物级分含有前刀豆球蛋白。
2.权利要求1的用途，其中从直立刀豆产生所述分离的蛋白质和所述细胞裂解物级分。
3.权利要求1或2的用途，其中分离出所述分离的蛋白质后进一步处理所述细胞裂解物级分。
4.权利要求1或2的用途，其中所述细胞裂解物级分和所述分离的蛋白质是生物化学感受器的组分，并且所述分离的蛋白质以高亲和力结合待检测的物质。
5.权利要求4的用途，其中所述生物化学感受器还包含水凝胶颗粒中的葡聚糖和伴刀豆球蛋白。
6.含前刀豆球蛋白制剂用于稳定伴刀豆球蛋白A的用途，其中通过包含下述步骤的方法产生含前刀豆球蛋白制剂：
a)从细胞中产生所述细胞裂解物；和
b)从所述细胞裂解物中分离出所述含前刀豆球蛋白制剂，具体分离方法是：将细胞裂解物悬浮在合适的缓冲液中；使用Superdex 200柱分离所述含前刀豆球蛋白制剂。
7.用于测定样品中葡萄糖浓度的生物化学感受器，其包含以高亲和力结合待检测的物质的分离的蛋白质和细胞裂解物级分，其中所述细胞裂解物级分维持该分离的蛋白质的结构和/或功能，如权利要求1至3任何一项定义，其中所述分离的蛋白质是伴刀豆球蛋白A，所述细胞裂解物级分含有前刀豆球蛋白，并且其中所述细胞裂解物级分与水凝胶颗粒中的葡聚糖和伴刀豆球蛋白A包含在一起。
8.权利要求7的生物化学感受器，其中所述伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白与水凝胶颗粒中的葡聚糖包含在一起。
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