ES2644252T3 - Estabilización de biosensores para aplicaciones in vivo - Google Patents

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ES2644252T3 ES10773290.1T ES10773290T ES2644252T3 ES 2644252 T3 ES2644252 T3 ES 2644252T3 ES 10773290 T ES10773290 T ES 10773290T ES 2644252 T3 ES2644252 T3 ES 2644252T3
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Achim Müller
Monika Knuth
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Description

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DESCRIPCION
Estabilizacion de biosensores para aplicaciones in vivo
La presente invencion hace referencia al uso de preparados para la estabilizacion de protemas aisladas. En particular se informa sobre el uso de dichos preparados para la estabilizacion de receptores en los sensores bioqmmicos. La invencion se refiere ademas a sensores bioqmmicos con dichos preparados. Un sensor bioqmmico para la determinacion de concentracion de glucosa que contiene Concanavalin A junto con dextrano en partmulas de hidrogeles fue descrito por Russell (Russell y cols., 1999, Anal. Chem., 71:3126-3132). Es tambien muy util para la aplicacion tecnica de protemas, para liberacion de las impurezas nocivas que existen en ellas. Un sector de aplicacion importante de las protemas purificadas son los sensores bioqmmicos. Las protemas, que se emplean como receptores de los sensores bioqmmicos deben tener una afinidad elevada por los analitos. Para detectar la union del analito al receptor frecuentemente se modifica el receptor, para conseguir medir la interaccion del analito y el receptor. Una modificacion de este tipo se empeora mediante impurezas y resulta imposible. Por ese motivo se extraen protemas de celulas y tejidos naturales y se purifican.
La purificacion de las protemas tiene generalmente el inconveniente de que la estabilidad de la protema aislada frecuentemente es inferior a su estabilidad en el entorno natural. El cometido de chaperonas, aminoacidos, protemas (por ejemplo, BSA), polisacaridos o derivados de polisacaridos aumenta mucho la estabilidad de las protemas aisladas. Con frecuencia se emplean aditivos de alto peso molecular o de bajo peso molecular, para disminuir el volumen libre en la solucion (“molecular crowding”). Para ello se utilizan polfmeros sinteticos, protemas y polisacaridos. Del estado de la tecnica se conocen en particular el polietilenglicol, Ficoll, dextrano, la ribonucleasa y la albumina de suero bovino. El efecto de estos aditivos puede explicarse por el efecto del “volumen excluido”(Chebotareva y cols., 2004, Biochemical Effects of Molecular Crowding, Biochemistry (Moscow), 69:15221536). Ademas la reticulacion cruzada puede incrementar la estabilidad de una protema, por ejemplo, la Concanavalina A (Kamra y cols., 1988, Biochimica et Biophysica Acta, 966:181-187). El cometido de la invencion es tambien la disposicion de los preparados, que facilitan una estabilizacion mejorada de las protemas aisladas. El cometido se resuelve mediante las formas de ejecucion que se han descrito en las reivindicaciones.
La invencion se refiere por tanto a la utilizacion de una fraccion de lisado celular para estabilizar una protema aislada, de forma que la fraccion de lisado celular se obtiene mediante un procedimiento que consta de los pasos siguientes:
a) Obtencion del lisado celular de las celulas; y
b) Separacion de la protema aislada del lisado celular, de forma que la fraccion de lisado celular se obtenga para estabilizar la protema aislada.
La protema aislada y la fraccion de lisado celular se obtienen preferiblemente del Canavalla ensiformis. La fraccion de lisado celular contiene preferiblemente precanavalina. Tras la separacion de la protema aislada se prepara preferiblemente la fraccion de lisado celular. Es preferible que la protema aislada sea un receptor, preferiblemente la Concanavalina A. Es preferible que la protema aislada sea el componente de un sensor bioqmmico. El sensor bioqmmico comprende preferiblemente dextrano y concanavalina en partmulas de hidrogel.
La fraccion del lisado celular, que se emplea conforme a la invencion, es obtenible mediante un procedimiento para preparar una fraccion de lisado celular que estabilice una protema aislada, que comprenda las etapas siguientes
a) Obtencion del lisado celular de las celulas; y
b) Separacion de la protema que se va a aislar del lisado celular
En esta solicitud de patente por “celulas” se entiende todas las celulas procariotas o eucariotas que manifiestan o expresan la protema que se va a aislar. Esto encierra geneticamente hablando celulas transformadas, en las cuales se manifiesta la protema recombinante que va a ser aislada. Las celulas pueden presentarse como celulas individuales de un cultivo celular procariota o eucariota o bien en forma de una muestra de tejido de un organismo animal o vegetal o de un hongo.
Los procedimientos para la obtencion de un lisado celular son bien conocidos por el experto. Las celulas pueden en el campo del metodo conforme a la invencion ser trituradas con todos los procedimientos o metodos de disgregacion mecanicos o no mecanicos conocidos. Los metodos mecanicos preferidos son la homogenizacion con medidores rotativos (en el caso de celulas animales), el metodo Potter-Elvehjem, el molido de celulas o de tejido, el triturado en un mortero con arena, oxido de aluminio o perlas de vidrio, la ruptura celular por fuerzas de cavitacion en ultrasonidos y la compresion de una suspension celular a alta presion por una estrecha valvula (por ejemplo, en una French Press). El experto sabe que en el caso de un metodo de disgregacion mecanico pueden formarse calores, de manera que en muchos casos sea necesaria una regulacion de la temperatura para evitar una desnaturalizacion de las protemas. Los metodos de disgregacion no mecanicos preferidos son el reiterado congelado e impactado de celulas, el tratamiento de las celulas con soluciones hipotonicas, el tratamiento con lisozimas en bacterias gram- positivas, el tratamiento con EDTA y la definitiva incubacion con lisozima en el caso de bacterias gram-negativas o
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bien el tratamiento con tolueno en caso de hongos. Naturalmente se pueden combinar los distintos metodos mencionados entre ellos o bien con otros metodos de disgregacion no mencionados.
Durante la disgregacion las protemas deben protegerse de las influencias nocivas. Es preferible el empleo de frio o de inhibidores espedficos para impedir la descomposicion de las protemas por la accion de las proteasas. Para proteger los grupos tiol se emplean preferiblemente medios de reduccion, en particular el ditiotreitol o el ditioeritol.
Para proteger de los iones metalicos pesados se prefiere el acido etilendiamintetracetico (EDTA). Este une tambien cationes bivalentes que pueden activar las proteasas. Para impedir o evitar la agregacion de protemas se emplean preferiblemente detergentes no ionicos.
Es preferible que el metodo de disgregacion y las medidas de proteccion pertinentes no solamente esten coordinados sino que ademas la protema deseada se presente en el lisado celular en forma activa. Los componentes del lisado celular que median en la estabilizacion de la protema, no debenan verse perjudicados en su funcionamiento por el metodo de disgregacion elegido.
En muchos casos las protemas aisladas se modifican previamente a su aplicacion practica. Asf los receptores se marcan con frecuencia para su empleo en sensores bioqmmicos. Estos marcajes se realizan mediante la modificacion covalente del receptor, por ejemplo, con colorantes fluorescentes. Para que la protema aislada modificada, que debe ser estabilizada, no sea diluida por la protema no modificada contenida en la fraccion de lisado celular, es preferible separar la protema que se va a aislar del lisado celular. El termino “separacion de la protema que se va a aislar del lisado celular” indica la purificacion de la protema deseada. Como resultado de ello existe al menos una fraccion de lisado celular que contiene la protema como protema aislada. Ademas aparte de todo ello queda al menos una fraccion de lisado celular que contiene la protema antes mencionada en un porcentaje mmimo o nulo. La protema aislada se separa de su contexto natural, es decir de las moleculas, con las cuales exisffa en un lisado celular. Preferiblemente la protema aislada se presenta al menos en un 50%, al menos en un 75%, al menos en un 80%, al menos en un 90%, al menos en un 95%, o preferiblemente al menos en un 99% (peso/peso) de pureza con respecto a las moleculas de su entorno natural. La fraccion de lisado celular que contiene la protema aislada puede contener moleculas en cualquier cantidad, que no procedan del entorno natural de la protema mencionada, sino que se anadan con la finalidad de la purificacion o tras la purificacion. Un ejemplo de ello eran los componentes del amortiguador empleado.
Los metodos para la separacion de una protema que se va a aislar del lisado celular son conocidos por el experto.
Los preferidos son la precipitacion y solubilizacion diferencial, la ultracentrifugacion, el metodo cromatografico y la electroforesis.
La precipitacion de protemas se consigue preferiblemente mediante la adicion de sulfato de amonio en concentraciones crecientes. Las fracciones protemicas de distinta solubilidad precipitan durante este procedimiento dependiendo de la concentracion de sulfato de amonio alcanzada y pueden separarse. Asimismo es preferible la precipitacion de la protema mediante la acidificacion del medio con una solucion patron adecuada.
La ultracentrifugacion se basa en el principio de que en el campo gravitacional producido por la centrifugacion las partmulas se sedimenten cuanto tanto mas rapido cuanto mas compactas y pesadas sean. Como consecuencia del equilibrio entre la fuerza centnfuga y la fuerza ascensional, que se forma durante una centrifugacion suficientemente larga, se acumulan cada una de las protemas en los puntos del recipiente, en los cuales la fuerza centnfuga y la fuerza ascensional se equilibran una con otra. La utilizacion de gradientes de sacarosa puede facilitar este proceso.
El aislamiento cromatografico de las protemas se basa en el principio de que las protemas disueltas en una fase movil, preferiblemente una solucion tampon, migran sobre una fase estacionaria. Las fases se eligen de manera que la interaccion de distinta intensidad de cada una de las protemas de la mezcla protemica conduce con la fase solida a unos tiempos de recorrido largos de cada una de las fracciones protemicas por la fase estacionaria. La forma de interaccion de las protemas y de la fase estacionaria dependera del tipo de cromatograffa.
Los metodos cromatograficos preferidos para el aislamiento de protemas son la cromatograffa de exclusion por tamano (que se basa en el distinto tamano de las protemas que se van a separar), la cromatograffa por afinidad (basada en la habilidad de cada una de las protemas de unirse espedficamente al material de la columna), la cromatograffa de intercambio ionico (basada en los distintos puntos isoelectricos de las distintas protemas) y la cromatograffa de fase inversa (basada en la distinta hidrofobicidad de las distintas protemas).
El concepto “protema aislada” define en el campo de esta solicitud de patente aquellas protemas el aislamiento en un estado funcional reporta intereses. A continuacion se emplea el concepto “protema deseada” sinonimamente. Las protemas aisladas en el sentido de la presente solicitud comprenden preferiblemente enzimas, receptores, protemas modulares, factores de transcripcion, protemas citoesqueleticas, protemas ligantes y transportadores de membrana, en particular receptores. Se prefiere especialmente la protema aislada Concanavalina A. Las protemas aisladas pueden presentarse en el campo del procedimiento como sustancias puras o parcialmente aisladas. Las protemas
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aisladas o bien los preparados de protemas aisladas comprenden preferiblemente menos de un 50%, menos de un 25%, menos de un 10%, menos de un 5%, menos de un 1% o menos de un 0,5% de protemas o bien protemas y componentes celulares como impureza.
Por “enzima” se entiende aquella protema que es capaz de catalizar una reaccion qmmica. No interviene para nada el que otras moleculas migren en el ambito de la reaccion qmmica o bien que la enzima actue autocataltticamente.
Un “receptor” es cada protema que es capaz de enlazar espedficamente una molecula, el ligando, y reaccionar ante este enlace con un cambio de conformacion o bien una modificacion de la actividad. Tambien las protemas que en su estado natural no muestran ninguna reaccion al enlace de un ligando pueden modificarse qmmicamente de manera que el enlace de un ligando conduzca a cambios medibles de la protema. Ademas mediante la combinacion de un receptor marcado con un agente fluorescente con un ligando asimismo marcado con un agente fluorescente son posibles valoraciones competitivas. En ausencia de un ligando no marcado en la muestra unicamente el ligando marcado con un agente fluorescente se enlaza al receptor. La proximidad espacial de ambos colorantes fluorescentes influye en su emision optica. Si ahora existe un ligando no marcado en una muestra, el ligando no marcado desplazara el ligando marcado con un agente fluorescente del receptor y modificara asf la emision optica del sistema. La modificacion de la emision optica del sistema depende por tanto de la cantidad de ligando no marcado que se introduzca con la muestra en el sistema y arrastre los ligandos marcados de los receptores. Un enlace espedfico significa que el ligando con afinidad significativamente superior se enlazara antes que otras sustancias. Preferiblemente el ligando con al menos 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces o 100.000 veces mayor afinidad se enlaza antes que otros ligandos. Los ligandos son preferiblemente iones, pequenas moleculas, acidos nucleicos (DNA o RNA en forma de cadena simple o doble) o bien otras protemas de cualquier longitud. Las moleculas pequenas pueden pertenecer a cualquier clase conocida de moleculas. Son preferiblemente lfpidos, acidos grasos, purinas, pirimidinas, azucares, alcaloides, aminoacidos, aminas biogenicas, isoprenoides o esteroides. Se prefiere una molecula pequena, un azucar, en particular la glucosa. Se prefiere el receptor, una lectina, en particular la Concanavalina A.
Las lectinas son protemas que son capaces de unir espedficamente estructuras de hidratos de carbono. Toman parte en multiples procesos de deteccion molecular y celular en animales, plantas y bacterias y no tienen ninguna funcion enzimatica. Muchas lectinas son modificadas por radicales glucosilo de forma postranslacional.
La Concanavalina A es una lectina que puede enlazar la a-D-glucosa y azucares similares sin que exista una reaccion enzimatica. El monomero consta de 237 aminoacidos y contiene manganeso y calcio. Para un pH neutro se forma un tetramero, que se descompone en un medio acido en dos dfmeros. Se produce en una concentracion especialmente elevada en la Canavalia ensiformis. La concanavalina A tiene preferiblemente una secuencia aminoacida definida por SEQ ID NO:3.
Como “protemas modulares” se identifican en esta solicitud aquellas protemas que interaccionan con otras protemas y de ese modo cambian la actividad de estas protemas. La consecuencia puede ser una actividad reducida del participante en la interaccion (inhibicion) o bien una actividad incrementada (activacion). El participante en el enlace del modulador es preferiblemente una enzima. En este caso el enlace del modulador influye en la afinidad por el sustrato o bien en la velocidad de la reaccion enzimatica del sustrato. Asimismo se prefiere que el participante en el enlace sea un receptor. En este caso el modulador puede actuar de forma agonista, es decir, que mediante el enlace al receptor lo active o bien el modulador puede enlazarse como antagonista al receptor, sin que por eso lo active.
Ademas es preferible que el participante en el enlace sea un factor de transcripcion. En este caso el enlace del modulador influye en la capacidad del factor de transcripcion en cambiar por su lado la expresion genetica.
Un “factor de transcripcion” en el sentido de esta solicitud es una protema, cuya actividad consiste en estimular la expresion de uno o varios genes en la celula o bien inhibirla.
Las “protemas de enlace” son protemas que son capaces de enlazar de forma espedfica otras moleculas (ligandos).
Enlace espedfico significa que el ligando con una afinidad notablemente superior se enlaza mas que otras sustancias. Preferiblemente el ligando con al menos 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10.000 veces o 100.000 veces mayor afinidad se enlaza antes que otros ligandos.
Por el concepto de “transportador de membrana” se entienden aquellas protemas que facilitan el paso de otras moleculas a traves de la membrana celular. Estas protemas se encuentran localizadas en la membrana celular.
Las protemas citoesqueleticas son protemas que estabilizan la estructura espacial de una celula y en combinacion con las protemas motoras facilitan los procesos de desplazamiento celular. Las protemas citoesqueleticas son preferiblemente la actina, los filamentos intermediarios y los microtubulos. Las protemas motoras asociadas a la actina, los filamentos y microtubulos son preferiblemente las quinesinas, dineinas y micosinas.
El termino “estabilizacion” define el mantenimiento de la estructura y/o el funcionamiento de una protema aislada.
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Puesto que la estructura de una protema es un requisito esencial para su funcionamiento, una estabilizacion de la estructura protemica conduce preferiblemente a un mantenimiento de la funcion de la protema. La estructura de la protema que se va a estabilizar es preferiblemente aquella estructura que tiene en su entorno natural, es decir, en el tejido o en la celula. El preparado conforme a la invencion estabiliza preferiblemente la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de la protema aislada. Por estabilizacion se entiende en el ambito de esta invencion la estabilizacion de un porcentaje significativo estadfsticamente de las moleculas de protema aislada. Asf el porcentaje de recuperacion de protema aislada funcionalmente tras la administracion del preparado conforme a la invencion es preferiblemente de al menos un 50%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o preferiblemente de al menos un 99%. La velocidad de recuperacion puede entonces determinarse como un porcentaje de moleculas funcionales de la protema aislada en la cantidad total de moleculas de la protema aislada tras la adicion del preparado conforme a la invencion y su almacenamiento. Para medir la velocidad de recuperacion se comparan preferiblemente las actividades del preparado que contiene la protema aislada directamente antes o despues de la adicion del preparado conforme a la invencion y se comparan posteriormente. Ademas se realizan comparaciones con preparados de protema aislada sin la adicion del preparado conforme a la invencion en los mismos momentos.
La presente invencion facilita preferiblemente la estabilizacion mejorada de las protemas aisladas, en particular de los receptores. Tal como muestra el ejemplo 5 la concanavalina A es estabilizada mejor por la fraccion de lisado celular no enlazante de las semillas de Canavalia ensiformis que por la albumina de suero bovino, que se conoce tecnicamente como estabilizador de las protemas. Otra ventaja sorprendente de la fraccion de lisado celular que estabiliza una protema aislada conforme a la invencion es la posibilidad de estabilizarla en un autoclave sin alterar su actividad. Para las aplicaciones de la fraccion de lisado celular que estabiliza una protema aislada conforme a la invencion en el campo de la medicina esta es una ventaja considerable puesto que asf puede garantizarse la libertad de los germenes de la fraccion del lisado celular.
En una configuracion preferida de la presente invencion se obtienen la protema aislada y la fraccion de lisado celular que estabiliza la protema aislada de la semilla de Canavalia ensiformis.
En una configuracion especialmente preferida de la presente invencion la fraccion de lisado celular que estabiliza la protema aislada contiene precanavalina. Si la celula productora de la protema que se va a aislar en su forma natural no contiene o bien no tiene suficiente precanavalina, es preferible que en esta celula la precanavalina se exprese de forma recombinante. Asimismo es preferible la adicion de precanavalina a un lisado celular.
El termino “precanavalina” indica una protema contenida en una semilla de Canavalia ensiformis. Los monomeros de precanavalina muestran en la electroforesis del gel en unas condiciones desnaturalizantes un peso molecular de 49.000 Dalton. Mediante la tripsina la precanavalina se escinde en dos peptidos de 24.000 o 25.000 Dalton de peso molecular. En las condiciones que permiten una cristalizacion de estos productos se escinde el mayor de ambos peptidos de nuevo por la accion de la tripsina (Campbell Smith y cols. 1982, Biochemical Characterization of Canavalin, the Major Storage Protein of Jack Bean, Plant Physiology, 70:1199-1209). Preferiblemente la canavalina tiene una secuencia de aminoacidos tal como se define en SEQ ID NO:2. En una configuracion preferida de la presente invencion la precanavalina presenta una identidad de secuencia de al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% respecto a la secuencia de aminoacidos definida por la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente la precanavalina viene codificada por un polinucleotido con la secuencia definida por SEQ ID NO: 1. A continuacion en el ejemplo 1 se describe un procedimiento de preparacion a partir de precanavalina purificada.
En otra configuracion preferida de la presente invencion se prepara la fraccion de lisado celular que estabiliza una protema aislada.
Esta preparacion consiste preferiblemente en la adicion de inhibidores de proteasa y/o del compuesto libre de iones metalicos mediante quelatos. Ademas es preferible la esterilizacion de la fraccion del lisado celular que estabiliza la protema: lo mas preferible es la preparacion de los componentes que estabilizan eficazmente la protema aislada en la concentracion de una subpoblacion en la fraccion del lisado celular. Asimismo es preferible la separacion de componentes perjudiciales de la fraccion del lisado celular. Dicha separacion de la fraccion del lisado celular que estabiliza la protema se emplea para liberar o separar dichas moleculas de la mencionada fraccion del lisado celular, que impiden el uso tecnico de la protema. Para el aislamiento de una subpoblacion de moleculas de la fraccion del lisado celular que estabiliza la protema se pueden emplear todos los metodos conocidos por el experto para la separacion de mezclas moleculares. Se emplean preferiblemente los metodos de separacion que se han descrito antes para la purificacion de protemas.
En el ambito de la presente invencion se ha preparado un estudio basado en la capacidad de la precanavalina para estabilizar la protema aislada. Por ese motivo la siguiente preparacion consta de la fraccion del lisado celular que estabiliza una protema aislada, preferiblemente en la concentracion de la precanavalina.
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La precanavalina se concentra preferiblemente mediante un procedimiento que se compone de las etapas siguientes:
1. Suspension de harina de Canavalia ensiformis en la solucion tampon adecuada
2. Separacion cromatografica de la concanavalina A con una columna Superdex-200. La precanavalina se encuentra en la fraccion no enlazante;
3. Dialisis de la fraccion no enlazante frente a agua;
4. Liofilizacion de la fraccion no enlazante;
5. Mezclado de la fraccion no enlazante con tampon acido, preferiblemente acetato sodico 50mM, pH 4,4 y centrifugacion posterior;
6. Lavado del sedimento con agua destilada y posterior centrifugacion;
7. Los pellets que quedan son absorbidos en una solucion tampon adecuada, preferiblemente 1% (peso/peso) de NaCl y 0,1% (peso/peso) de K2HPO4 pH 7,0 y centrifugados;
8. Tras la centrifugacion se recoge el sobrenadante;
9. El sedimento restante tras la centrifugacion es absorbido en una solucion salina, preferiblemente del 5% (peso/peso) y de nuevo centrifugado;
10. El sobrenadante obtenido en la etapa 9 se purifica con el sobrenadante de la etapa 8;
11. Dialisis de los sobrenadantes purificados frente al agua destilada;
12. Concentracion de la precanavalina mediante una extraccion acido-base, preferiblemente por precipitacion con acido acetico 1N, pH 5,1 y absorcion del sedimento en NaOH 0,01 N, de manera que el pH no sea superior a 8,0 tras la absorcion en la base;
13. Dialisis frente a la solucion tampon prevista para la cromatograffa de intercambio ionico siguiente, preferiblemente 20mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,2;
14. Cromatograffa de intercambio ionico, preferiblemente con una columna de DEAE Sepharose FF y de la solucion tampon de aplicacion mencionada, elucion con gradientes crecientes de solucion salina;
15. Identificacion de las fracciones mas puras, preferiblemente con SDS-PAGE, purificacion de estas fracciones;
16. Dialisis frente a agua destilada; y
17. Liofilizacion de la precanavalina
La precanavalina se concentra preferiblemente mediante un procedimiento simplificado que se compone de las etapas siguientes:
1. Suspension de harina de Canavalia ensiformis en la solucion tampon adecuada
2. Cromatograffa de intercambio ionico, preferiblemente con una columna de DEAE-Sepharose FF, elucion preferiblemente con gradientes crecientes de solucion salina;
3. Identificacion de las fracciones mas puras, preferiblemente con SDS-PAGE, purificacion de estas fracciones;
4. Dialisis frente a agua destilada; y
5. Liofilizacion de la precanavalina.
Otra configuracion preferida de la presente invencion hace referencia al uso de un preparado que contiene precanavalina para la estabilizacion de una protema aislada. Es preferible el empleo del preparado antes mencionado para la estabilizacion de la concanavalina A.
Un “preparado que contiene precanavalina” se presenta preferiblemente en forma lfquida o solida. Preferiblemente el preparado contiene ademas de precanavalina otros componentes del entorno celular de la protema aislada. El preparado contiene asimismo Chaperone, albumina de suero bovino, y/o solutos compatibles. Ademas el preparado contiene preferiblemente sustancias tampon, organicas o inorganicas. Los medios conservantes que impiden el crecimiento de bacterias y hongos, y los medios de reticulacion son los preferidos como componentes del preparado conforme a la invencion. El porcentaje en peso de precanavalina en la masa seca del preparado conforme a la invencion es preferiblemente de como mmimo un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,5%.
En una configuracion preferida, se fabrica la precanavalina recombinante contenida en el preparado conforme a la invencion.
Los metodos para la fabricacion recombinante de protema son bien conocidos por el experto. Una secuencia de acido nucleico que se encuentra codificada para la precanavalina se aplica en un vector de expresion, que facilita la expresion de la precanavalina en el organismo huesped elegido. Para ello es preferible que la secuencia de acidos nucleicos, que se codifica para la precanavalina se disponga bajo el control de una secuencia reguladora adecuada.
Las secuencias reguladoras apropiadas son, por ejemplo, la lac-, trp- o bien tac-promotor para E. coli, la AOX1 o bien GAL-1 para levaduras o el promotor CaMV para plantas. Para el empleo en celulas animales preferiblemente se destacan el promotor de CMV, SV40 o RSV (Rous Sarcoma virus) asf como el intensificador de CMV, el intensificador de SV40 o una Globin-intron. Los vectores de expresion preferidos son las plasmidos, los fagos, los
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vectores retrovirales y los cromosomas artificiales. Los organismos huesped preferidos para la fabricacion recombinante de precanavalina son las plantas, los procariotas y los hongos o bien los animales mairnferos. Los plasmidos son introducidos en la celula huesped por electroporacion, precipitacion con fosfato calcico o cloruro de rubidio o bien por choque termico. Los metodos preferidos para la transformacion de celulas vegetales son la inoculacion baKstica y la transformacion mediada por Agrobacterium tumefaciens.
La presente invencion se refiere ademas a un metodo para estabilizar una protema aislada que comprende la adicion de un preparado que contiene precanavalina conforme a la invencion a la protema aislada.
La adicion de un preparado que contiene precanavalina conforme a la invencion a la protema deseada facilita la dosificacion exacta del preparado conforme a la invencion. Asf se puede conseguir una estabilizacion definida y reproducible de la protema deseada. Es preferible anadir el preparado secado como sustancia solida a la solucion que contiene la protema deseada y allf se disuelve. Asimismo se prefiere anadir una solucion madre del preparado conforme a la invencion a la solucion que contiene la protema deseada. Es asimismo preferible el montaje del preparado que contiene precanavalina conforme a la invencion en partmulas de hidrogel, en particular en bolitas de alginato, donde las partmulas de hidrogel contienen tambien la protema aislada.
En una configuracion preferida del metodo conforme a la invencion la protema aislada es un receptor, preferiblemente una lectina, y mas en particular la concanavalina A.
La presente invencion se refiere ademas al uso de una fraccion de lisado celular que estabiliza conforme a la invencion una protema aislada, donde dicha protema aislada es un componente de un sensor bioqmmico.
Un “sensor bioqmmico” contiene una molecula, preferiblemente una protema, que es capaz de enlazar con elevada afinidad la sustancia que se va a identificar. A continuacion esta protema se conocera como “receptor”. Un sensor bioqmmico fabricado conforme a la invencion contiene al menos un receptor asf como las moleculas que estan contenidas en la fraccion de lisado celular que estabilizan el/los receptor/es. El experto sabe que un sensor bioqmmico puede contener ademas otras moleculas.
El enlace del analito al receptor facilita la deteccion cualitativa y preferiblemente la cuantitativa del analito en una muestra. Por deteccion cualitativa se entiende la constatacion de la presencia o ausencia del analito en la muestra.
El experto sabe que la deteccion cualitativa dependiente del sensor empleado tiene un lfmite de deteccion inferior, es decir, la muestra debe presentar una concentracion minima determinada de analito, para que se pueda constatar su presencia. Una deteccion cuantitativa de analito proporciona ademas informacion sobre la cantidad o la concentracion de analito en la muestra. Para hacer medible la interaccion entre receptor y analito es preferible modificar qmmicamente la protema empleada. Se prefiere en particular la modificacion de una protema aislada mediante su marcaje con colorantes fluorescentes.
El termino “muestra” define cualquier lfquido en el cual deba detectarse el analito. Se prefieren la sangre, el plasma, el suero, el lfquido lagrimal, el lfquido intersticial y la orina, preferiblemente el lfquido intersticial bajo el tejido conjuntivo del ojo. Asimismo se prefieren muestras de tejido. La muestra es preferible que provenga de la muestra aislada del cuerpo del paciente. Es mas preferible que la muestra proceda de un lugar natural. En este caso se colocara preferiblemente el sensor en el cuerpo del paciente y se introducira directamente en el lugar en el que se encuentra la muestra.
En una configuracion preferida de la invencion, el sensor bioqmmico contiene concanavalina A como receptor.
Dichos receptores bioqmmicos se pueden emplear para determinar la concentracion de glucosa en la muestra, puesto que la glucosa se une a la concanavalina A. En este caso el sensor bioqmmico contiene preferiblemente hidrogeles ademas del receptor y la fraccion de lisado celular que estabiliza el receptor. Los hidrogeles de moleculas sinteticas, las biomoleculas o las biomoleculas modificadas son los preferidos. Las moleculas sintetica s preferidas son los poliacrilatos, las poliacrilamidas y los alcoholes de polivinilo.. Las biomoleculas preferidas son la gelatina, carragenina, agarosa, amilosa, amilopectina, alginatos, goma gellan, celulosa y derivados de celulosa. Se prefieren en particular los alcoholes de polivinilo y los alginatos. Si el sensor bioqmmico contiene dichos sensores, el receptor y el analito se presentan en una fase heterogenea.
En una configuracion especialmente preferida el sensor bioqmmico contiene partmulas de hidrogel en las cuales se encuentran dextrano, concanavalina A y la fraccion de lisado celular que estabiliza la protema aislada.
Ademas la presente invencion se refiere al uso de una fraccion de lisado celular que estabiliza la protema aislada o bien a un preparado que contiene precanavalina para fabricar un sensor bioqmmico.
La invencion dispone tambien de un sensor bioqmmico que comprende una protema aislada y una fraccion de lisado celular que estabiliza la protema aislada tal como se ha definido antes.
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Preferiblemente el sensor bioqmmico comprende un receptor como la protema aislada, en particular la concanavalina A. Se prefiere la fraccion de lisado celular junto con dextrano y la protema aislada, preferiblemente el receptor y en particular la concanavalina A en las partmulas de hidrogel.
Asimismo la invencion prepara un sensor bioqmmico que comprende concanavalina A y precanavalina. Es preferible que contenga concanavalina A y precanavalina junto con dextrano en una partmula de hidrogel.
Los siguientes ejemplos aclaran e ilustran la invencion. En ningun caso limitaran el alcance de la patente.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Obtencion de la fraccion no ligante de los frijoles espada
300 g de harina de frijol de espada (Canavalia ensiformis) se suspenden en tampon 100 mM y se filtran para separar los componentes de la membrana. EN total se aplican 30 g de protema en una columna Superdex 200 y se reune la fraccion protemica no ligada al material de la columna. En total se obtienen 3 litros de fraccion no ligada (nbF). La solucion se dializa en agua. A continuacion se lleva a cabo un liofilizado (liofilizacion). La sustancia liofilizada puede recogerse en una solucion tampon de trabajo.
Ejemplo 2: Purificacion de la precanavalina
Extraccion de una fraccion bruta de precanavalina de la fraccion no ligada
8,0 g de la fraccion no ligada liofilizada se mezclan con el tampon de precipitacion (acetato sodico 50 mM, pH 4,4), se incuban y seguidamente se centrifugan. El sedimento de la precipitacion se lava con agua y se centrifuga de nuevo. El sedimento se disuelve en 800 ml de solucion salina de bifosfato (1% p/v) NaCl + 0,1% (p/v) de K2HPO4, pH 7,0). Se recoge el sobrenadante tras la centrifugacion. El sedimento se disuelve en 500 ml de solucion salina del 5% y a continuacion se centrifuga. Los sobrenadantes purificados de las extracciones se dializan frente a agua destilada. El dializado se centrifuga. El sedimento se extrae y el sobrenadante se ajusta a pH 5,1 con acido acetico 1N para su precipitacion. El producto de la precipitacion se incuba durante la noche y al dfa siguiente se centrifuga. El sedimento es absorbido en 50 ml de NaOH 0,01N y se mezcla con 6 ml de NaOH 0,1N, se manera que se obtiene una solucion casi transparente. El valor del pH no debena ser superior a 8,0. El lote se incuba durante la noche a 4°C.Se repite de nuevo la etapa de extraccion acido-base. El extracto de precanavalina basico obtenido por ultima vez se dializa frente a una solucion tri-tampon 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2.
Purificacion de la precanavalina
La purificacion de la precanavalina se realiza por medio de una cromatograffa de intercambio anionico DEAE (DEAE Sepharose FF). La protema se aplica en la columna equilibrada con tampon de aplicacion (solucion tri-tampon 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,2), se lava con tampon hasta que la lmea de absorcion de base es estable a 280 nm, y se eluye seguidamente (tampon de elucion: solucion tri-tampon 20 mM, NaCl 1M, pH 7,2). La elucion se realiza con gradientes de solucion salina del 0-100%. Tras la analttica de las fracciones de elucion por medio de SDS-PAGE se realiza la purificacion de las fracciones mas puras. La precanavalina purificada es dializada frente a agua bidestilada y luego se liofiliza.
Ejemplo 3: Fabricacion de particulas de hidrogeles con la fraccion no ligada (o bien precanavalina)
2 g de sal sodica de acido algmico y 8 g de la fraccion no ligada (o precanavalina) se disuelven en un matraz de Erlenmeyer en 200 g de agua agitando. En un matraz de 5 litros se disuelven 66,2 g de CaChx 2 H2O en 4931,3 g de agua.
La solucion protemica de alginato es transportada a traves de una bomba a una manguera de dos bocas. Simultaneamente se aplica aire comprimido en una segunda entrada de la manguera, de manera que la solucion protemica de alginato es pulverizada en finas gotas. Las gotas van a parar a un bano de ultrasonidos con la solucion de cloruro de calcio por medio de la corriente de aire, donde son gelificadas y caen al suelo. Seguidamente se recogen las bolitas gelificadas y se colocan en un autoclave.
Ejemplo 4: Prueba de estabilidad in vitro de los sensores de glucosa
Los sensores de glucosa se guardan en 1 ml de tampon fisiologico a 37°C respectivamente. Tras el correspondiente periodo de almacenamiento se extrae el sensor de glucosa y se determina el espectro de fluorescencia a distintas concentraciones de glucosa. La modificacion de las intensidades de fluorescencia a medida que aumenta el contenido en glucosa es una medida de la finura y calidad del sensor de glucosa. Los sensores de distintos periodos de almacenamiento se comparan con sensores no almacenados y se determina la recepcion absoluta y porcentual de la reaccion de glucosa durante el tiempo de almacenamiento.
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La tabla 1 muestra comparativamente la respuesta del sensor de sensores estabilizados con una fraccion no aglutinada y con precanavalina en un medio de glucosa fisiologico de 50 hasta 250 mg/dl, que se expresa como un cambio porcentual de la senal por mg/dl del incremento de la concentracion de glucosa. La fraccion no enlazada y la precanavalina proporcionan resultados identicos.
Tabla 1: Capacidad de almacenamiento de sensores de glucosa estabilizados
Estabilizador
Respuesta del sensor en un medio de glucosa fisiologico entre 50 y 250 mg/dl de glucosa despues de distintos periodos de almacenamiento (cambio de la senal/mg/dl glucosa)
14 dfas 60 dfas 120 dfas
Fraccion no enlazante
0,46 0,29 0,22
Precanavalina
0,44 0,29 0,20
Ejemplo 5: Resultado de la prueba de estabilidad con distintos estabilizadores posibles respecto al sensor no estabilizado
La tabla 2 muestra valores despues de un almacenamiento de 120 dfas en unas condiciones fisiologicas. Mientras que conocidos estabilizadores como BSA, HSA no estabilizan el sistema sensorial, mediante la fraccion no aglutinada del extracto de harina de frijol (esterilizable en autoclave) se consigue una estabilizacion clara.
Tabla 2: Comparacion de distintos estabilizadores
Estabilizador
Mejona de la respuesta del sensor despues de 120 dfas de almacenamiento en comparacion con un sistema no estabilizado
HSA
2%
BSA
-3%
Fraccion no ligada
41%
Fraccion no ligada esterilizada en autoclave
27%

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Utilizacion de una fraccion de lisado celular para el mantenimiento de la estructura y/o la funcion de una protema aislada, donde la fraccion del lisado celular se consigue mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
    a) Obtencion del lisado celular a base de celulas; y
    b) Separacion de la protema aislada del lisado celular, de forma que se obtenga la fraccion del lisado celular para mantener la estructura y/o el funcionamiento de la protema aislada.
    de manera que la protema aislada sea la concanavalina A y contenga la fraccion del lisado celular precanavalina.
  2. 2. Utilizacion conforme a la reivindicacion 1, de manera que la protema aislada y la fraccion de lisado celular se obtienen de la Canavalia ensiformis.
  3. 3. Utilizacion conforme a una de las reivindicaciones 1 o 2, donde la fraccion del lisado celular se prepara tras la separacion de la protema aislada.
  4. 4. Utilizacion conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, donde la fraccion de lisado celular y la protema aislada son componentes de un sensor bioqmmico y la protema aislada se une a la sustancia que se va a detectar con elevada afinidad.
  5. 5. Utilizacion conforme a la reivindicacion 4, de manera que el sensor bioqmmico comprende ademas dextrano y concanavalina en las partmulas de hidrogel.
  6. 6. Utilizacion de un preparado que contiene precanavalina para estabilizar la concanavalina A.
  7. 7. Sensor bioqmmico para la determinacion de la concentracion de glucosa en una muestra, que comprende una protema aislada, que se une a la sustancia que se va a detectar con elevada afinidad, y una fraccion de lisado celular, de forma que la fraccion de lisado celular mantiene la estructura y/o el funcionamiento de la protema aislada, tal como se define en una de las reivindicaciones 1 hasta 3, de manera que la protema aislada es la concanavalina A y la fraccion de lisado celular contiene precanavalina, y donde la fraccion de lisado celular junto con dextrano y concanavalina A se encuentra contenida en las partmulas de hidrogel.
  8. 8. Sensor bioqmmico conforme a la reivindicacion 7, de manera que la concanavalina A y la precanavalina junto con el dextrano se encuentren contenidas en una partmula de hidrogel.
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